מאמר מחקר

השפעות של Qi-fu-yin על שיפור ליקויים קוגניטיביים והפחתת הזדקנות תאית במוחות של עכברי 5xFAD

29 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72118

⸱

8 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מעריך את הטיפול ב-Qi-fu-yin (QFY) בעכברי 5xFAD. הממצאים מראים כי מתן QFY קשור לשיפור בביצועי הלמידה והזיכרון, להפחתה של שיקעי Aβ במוח והפחתת הזדקנות תאית, ולבלימה של נזק מבני סינפטי בקליפת המוח.

תקציר

על אף שהמנגנון של Qi-fu-yin (QFY), מרשם של רפואה סינית מסורתית, עדיין אינו מובן במלואו, הוא הפגין פוטנציאל טיפולי במחלת אלצהיימר (AD). מחקר זה נועד לבחון את הקשר בין טיפול ב-QFY לבין ליקוי קוגניטיבי בעכברי 5xFAD. השתמשנו במבחני כוח אחיזה,  הליכה, בניית קן, תיבת מעבר (shuttle box), מבוך המים של מוריס ו-ELISA כדי להעריך את הרמות של חלבון Amyloid-β 1-42 (Aβ1-42), Aβ1-40, Growth-associated protein 43 (GAP-43), Synaptophysin (SYN), ו-Postsynaptic density protein 95 (PSD-95) במוחות של עכברי 5xFAD. ניתוח ציטוקינים בשיטת Luminex שימש לכימות רמות של פנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות (SASP) בקורטקס. כמות ה-Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal), שיקע Aβ וקוצים דנדריטיים במוחות בעלי החיים נמדדו באמצעות צביעת SA-β-Gal, אימונוהיסטוכימיה וצביעת Golgi-Cox, בהתאמה. טיפול ב-QFY הפחית באופן דרמטי את נטל פלאקי ה-Aβ בקורטקס והוריד את ביטוי p21 בעכברי 5xFAD, על פי בדיקות אימונופלואורסצנציה. בעכברי 5xFAD, טיפול ב-QFY שיפר באופן ניכר את ביצועי הלמידה והזיכרון, הקל את ההזדקנות, והעלה את כמויות החלבונים GAP-43, PSD-95 ו-SYN בקורטקס של העכברים. בעקבות הטיפול ב-QFY, נרשמה ירידה משמעותית בפלאקים של Aβ ובפעילות SA-β-Gal במוח, וכן ברמות Aβ1-42 וביחס Aβ1-42/Aβ1-40 בהיפוקמפוס. הרמות של IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A ו-IFN-γ פחתו במידה ניכרת בקורטקס של עכברי 5xFAD. ניתוחי PCA ומתאם פירסון הדגימו קשר שלילי חזק בין ציטוקיני SASP לבין רמות חלבוני סינפסה. ממצאים אלו מצביעים על קשר בין טיפול ב-QFY לבין שיפור בירידה קוגניטיבית הקשורה לגיל ובפנוטיפים של הזדקנות תאית בעכברי 5xFAD, לצד הפחתה של נזק מבני סינפטי. ממצאים אלו תומכים בבחינה נוספת של QFY כמועמד טיפולי פוטנציאלי למחלת אלצהיימר.

מבוא

מחלת אלצהיימר (AD)1 היא הצורה השכיחה ביותר של דמנציה, והיא מאופיינת בחלבון עמילואיד-β (Aβ), בחלבון טאו היפר-פוספורילי (P-Tau), באובדן סינפטי ובדלקת כרונית. לתרופות הזמינות כיום לטיפול ב-AD יש מספר תופעות לוואי, והן אינן מסוגלות לעצור את התקדמות המחלה2,3,4,5.

הזדקנות תאית (Senescence), המתבטאת כשיבושים בכל רחבי האורגניזם בסביבות מיקרו-סלולריות ובינאישיות ולא כשינויים מקומיים הספציפיים לאיבר, היא גורם סיכון מרכזי בפתוגנזה של AD. דה-רגולציה סיסטמית זו מבדילה את התקדמות ה-AD ממודלים של פתולוגיה ברקמה בודדת, על ידי שינוי יסודי של מנגנוני הומאוסטזיס במערכות ביולוגיות שונות6,7. למרות שהזדקנות תאית משמשת בתחילה כמנגנון בקרה הומאוסטטי, הצטברות של תאים מזדקנים גורמת בסופו של דבר לניוון הדרגתי של הרקמה ולשרשראות דלקתיות מתמשכות, המשבשות באופן יסודי את ההומאוסטזיס הפיזיולוגי8. הדלקת הנובעת מכך עלולה לפגוע בסינפסים ולפגום בתפקוד הקוגניטיבי9,10.

הזקנה התאית (Cellular senescence) היא תגובת דחק תאית מורכבת המאופיינת בקיצור טלומרים, עצירה קבועה של מחזור התא ופעילות הפרשה משתנה11. סימני היכר נוספים כוללים מורפולוגיה תאית מוגדלת ושטוחה, צביעה חיובית ל-β-galactosidase הקשורה להזקנה (SA-β-Gal), הצטברות ליפופוסין והפרשה של גורמי SASP12. תהליך היווצרות הזיכרון מושפע מהירידה הבולטת ברמות של חלבונים הקשורים לפלסטיות סינפטית של אקסונים ודנדריטים, המתרחשת בעקבות הזקנה תאית13,14. מכיוון שפלסטיות סינפטית חיונית ללמידה ולזיכרון, הפרעות בחלבוני סינפסה תורמות לירידה קוגניטיבית. חלבונים אלו כוללים את GAP-43, SYN ו-PSD-95. ללא ספק, התפקוד הסינפטי מושפע מהפחתה במספר הדנדריטים ומחריגות תפקודיות במוחם של קשישים15.

QFY is a traditional Chinese medicine formula derived from Jing Yue Quan Shu. It is composed of Panax ginseng C.A.Mey (Araliaceae), Polygala tenuifolia Willd (Polygalaceae), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex Fisch. & C. A. Mey (Orobanchaceae), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Apiaceae), Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. (Fabaceae), Atractylodes macrocephala Koidz (Asteraceae), Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F. Chou (Rhamnaceae). Research has demonstrated that QFY significantly ameliorates cognitive dysfunction in rats with diabetes-induced brain injury16. Our previous study found that QFY could improve cognitive learning and memory functions impairment in 5xFAD and APP/PS1 mice. In addition, QFY demonstrated high safety in non-clinical studies, and no obvious acute, subacute, or long-term toxic reactions were observed17,18,19. Analysis of the clinical therapeutic effect of QFY showed that AD patients experienced a significant increase in their capacity for activities of daily living and MMSE scores after QFY treatment20. Following three consecutive days of QFY administration in male Sprague-Dawley rats, ten prototype QFY-derived components, including butylidenephthalide, butylphthalide, 20(S)-ginsenoside Rh1, 20(R)-ginsenoside Rh1, and zingibroside R1, were detected in cerebrospinal fluid21,22. However, the therapeutic mechanism of QFY in AD is still unclear. In this study, we investigated the association between QFY treatment, cellular senescence, and AD-related pathological changes in 5xFAD mice.

אף על פי שמחקרים קודמים הדגימו את ההשפעות הנוירופרוטקטיביות של QFY במודלים של AD, ה- מעורבות ספציפית של הזדקנות תאית בתיווך של השפעות אלו נותר בלתי נחקר. יתרה מכך, השאלה האם QFY מעניק יתרונות קוגניטיביים באמצעות שימור סינפטי הקשור להזדקנות תאית (senescence), ולא רק באמצעות עמילואיד-β הפחתה, נושא שטרם נבחן. על כן, המחקר הנוכחי תוכנן לבדוק האם טיפול ב-QFY מפחית הזדקנות תאית, והאם הפחתה זו קשורה לשיפור בפלסטיקויות הסינפטית בעכברי 5xFAD.

פרוטוקול

כל ניסויי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לרווחת בעלי חיים ניסויים של האוניברסיטה לרפואה סינית מסורתית בשאנדונג (SDUTCM20221101001).

תרופות

אבקת קרם יבש של גרנולת QFY הוכנה ונבדקה על ידי מרכז המחקר והפיתוח Houpu של Lunan Pharmaceutical. Donepezil ו-Memantine נרכשו מ-Shanghai Yuanye Technology. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים מסוג 5xFAD עם טווח משקל גוף ראשוני של 19–27 g. מינון ה-QFY נגזר מהמינון הקליני האנושי של 43 g/d, המקביל ל-16.297 g/d לאחר התאמה לאבקת קרם יבש של גרנולת QFY. המינון הבינוני לניסוי הנוכחי חושב על בסיס המינון הקליני האנושי (16.297 g/70 kg x 9.1 = 2.11861 g/kg/d). המינון הגבוה נקבע כפי שניים מהמינון הבינוני (4.24 g/kg/d), והמינון הנמוך כמחצית מהמינון הבינוני (1.06 g/kg/d). כל תמיסאות התרופות ה diberikan בנפח של 0.1 mL לכל 10 g של משקל גוף.

עבור הביקורת החיובית, נעשה שימוש במתן משולב של donepezil ו-memantine hydrochloride. המינונים נקבעו בהתבסס על מינוני היישום הקליני הנוכחיים שלהם (10 mg/d ו-20 mg/d, בהתאמה) ועל נתונים קודמים מקבוצת המחקר שלנו, מה שהוביל למשטר של donepezil במינון 1.0 mg/kg/d בתוספת memantine במינון 2.8 mg/kg/d, ובסך הכל מינון משולב של 3.8 mg/kg/d. הריכוז הסופי של תערובת ה-donepezil–memantine הוכן בריכוז של 0.38 mg/mL, שחושב כ-3.8 mg/kg חלקי נפח מתן של 0.1 mL לכל 10 g ממשקל הגוף.

תמיסות QFY במינונים נמוך, בינוני וגבוה הוכנו באופן הבא: 5.3 g, 10.6 g ו-21.2 g של אבקת QFY יבשה הוכנסו כל אחת לכלי בכור של 100 mL נפרד, ערבבו עם 30 mL של מים מזוקקים תוך כדי בחישה יסודית, הועברו למשחורות, ונשלימו לנפח סופי של 50 mL באמצעות מים מזוקקים, מה שהניב ריכוזי מס סופיים של 0.106 g/mL, 0.212 g/mL ו-0.424 g/mL, בהתאמה. עבור ביקורת חיובית, 5 mg של donepezil ו-14 mg של memantine הומסו במים מזוקקים ונשלימו לנפח סופי של 50 mL. בעלי החיים בכל קבוצה קיבלו את תמיסת התרופה המתאימה פעם ביום באמצעות הזנה דרך הקיבה (oral gavage).

בעלי חיים

עכברים טרנסגניים מסוג 5xFAD [B6. Cg-Tg (APPSwFlLon, PSEN1* M146L* L286V)6799Vas/Mmjax] גודלו במעבדה. בעלי החיים הוחזקו כולם בסביבת SPF באוניברסיטת שנדונג לרפואה סינית מסורתית, בטמפרטורה של 22–24 oC, לחות של 50–60%, ומחזור אור-חושך של 12 שעות. מזון ומים סופקו לבעלי החיים בכל עת.

בגיל 2.5 חודשים, עכברי 5xFAD זכרים חולקו באופן אקראי לחמש קבוצות: 5xFAD ללא טיפול, donepezil פלוס memantine, QFY במינון נמוך, QFY במינון בינוני ו-QFY במינון גבוה. עכברים זכרים מסוג wild-type (WT) מאותה שגרת גיל ומרחב לידה שימשו כקבוצת הבקרה WT. הטיפולים הוענקו פעם ביום במשך 220 ימים. (איור 1).

מבחנים התנהגותיים

בדיקת כוח לחיצה

חוזק השרירים השלדיים של הגפה הקדמית בעכברים נמדד באמצעות מד כוח אחיזה23. במהלך הניסוי, מכשיר הבדיקה מוקם באופן אופקי, תוך הבטחה שהעכבר יישאר במקביל למשטח השולחן. לאחר הפעלת המכשיר, העכבר הונח בעדינות על לוח האחיזה. כאשר העכבר אחז בלוח באופן בטוח, זנבו נמשך לאחור בכוח שווה עד לשחרור האחיזה על ידי העכבר. כוח האחיזה המקסימלי תועד. מדידה זו חזרה שלוש פעמים, והממוצע של ערכים אלו שימש לקביעת כוח האחיזה של העכבר.

בדיקת הליכה

את סדירות ההליכה של העכברים מדדו באמצעות מערכת CatWalk XT. הניסוי חולק לתקופת אימון ותקופת בדיקה24. יום אחד לפני כן, הועברו העכברים הניסויים לחדר הניסויים כדי לאפשר להם להסתגל לסביבה החדשה. במהלך תקופת האימון, העכברים הוצבו בנקודת ההתחלה וריצו לאורך התעלה עד לנקודת הסיום. כל עכבר אומן שלוש פעמים ביום. לאחר 3 ימי אימון (עד שכל עכבר היה מסוגל לעבור במהירות דרך התעלה), הוחזרו העכברים לכלוב. תקופת הבדיקה הייתה זהה לתקופת האימון, ותוכנת המחשב ניתחה באופן אוטומטי כל מסלול תנועה. נקודות ירוקות הוצגו אם המסלול היה תקין, נקודות כתומות סימנו מסלול שאינו תקין, ולפחות שלוש נקודות ירוקות נחשבו לתקינות עבור כל עכבר, אשר נותחו באמצעות תוכנת CatWalkXT 10.0.

מבחן קופסת המעבר (Shuttle box test)

מבחן תיבת המעבר (shuttle box test) שימש להערכת יכולת הימנעות פעילה מותנית בעכברים25. המכשור כלל תיבת מעבר (18 cm x 18 cm) שהוצבה בתוך תא בידוד אקוסטי.  הניסוי כלל תקופת למידה של 4 ימים ולאחריה תקופת מבחן של יום אחד.  בכל יום למידה, העכברים נחשפו לתקופת הסתגלות של 120 s בתיבת המעבר לפני תחילת האימון. כל ניסוי החל בגירוי מותנה במשך 6 s (צליל של 70 dB בתדר 1000 Hz בשילוב עם אור בעוצמה של 500 lux), ואחריו ניתן שוק חשמלי לרגליים של 0.3 mA למשך 3 s דרך רצפת רשת, והסתיים במרווח של 12 s בין ניסוי לניסוי. אם העכבר עבר לתא הנגדי במהלך הגירוי המותנה, השוק הושמט והתגובה נרשמה כהימנעות פעילה. אם העכבר לא עבר במהלך הגירוי המותנה אך עבר במהלך השוק החשמלי, הדבר נרשם כתגובת הימנעות פסיבית. אם העכבר לא עבר כלל במהלך הניסוי, הדבר נרשם כ כישלון בבריחה. האימון חזר על עצמו במשך 4 ימים רצופים עם 30 ניסיונות ליום. במהלך תקופת המבחן (יום 5), השוק החשמלי הושמט בעוד שכל שאר הפרמטרים נותרו ללא שינוי ביחס לתקופת הלמידה. מספר תגובות ההימנעות הפעילה נרשם כמדד העיקרי ללמידה ולזיכרון.

מבוך מים של מוריס

מבחן מבוך המים של מוריס שימש להערכת יכולות הלמידה המרחבית והזיכרון של חיות הניסוי26. הניסוי בוצע במיכל שקוטרו היה 120 cm ועומקו 50 cm. המיכל מולא במים לבנים עכורים, והטמפרטורה נשמרה על 21 °C. פלטפורמה בקוטר של 10 cm הותקנה 1 cm מתחת לפני המים באחד הרביעים. רמזים חזותיים הוצבו מסביב לבריכה כנקודות ציון מרחביות עבור העכברים. תהליך הלמידה נערך לאורך ארבעה ימים רצופים, כאשר הסשן של כל יום התחיל באחד משלושה רביעים. מיקומי ההתחלה השתנו באופן פסאודו-אקראי בין ארבע נקודות השורייח. בכל ניסוי, הפרוצדורה הסתיימה כאשר החיה הגיעה בהצלחה לפלטפורמה. נקבע משך ניסוי מקסימלי של 60 s; אם החיה נכשלה באיתור הפלטפורמה בפרק זמן זה, היא הונחתה בזהירות אל הפלטפורמה. לאחר ההגעה לפלטפורמה, ניתנה לחיה הפסקה קצרה של 10 s לפני שהוחזרה לכלוב ביתה. לאחר סיום תקופת הלמידה, מתחילה תקופת המבחן לאחר 24 h. ביום החמישי, העכברים ממוקמים מהרביע הנגדי לפלטפורמה. נרשמו זמן השהייה עד למציאת הפלטפורמה (escape latency) של תקופת המבחן, זמן התנועה ברביע המטרה ומספר החציות של אזור הפלטפורמה המקורי מתחת למים.

מבחן קינון מושבות

הפעילות היומית של בעלי החיים בניסוי הוערכה באמצעות מבחן קינון של מושבה27הניסוי נמשך 24 שעות, עם שלושה בעלי חיים בכל קבוצה. לאחר מתן התרופה באותו היום, הוכנו כלובים חדשים שרופדו ב-6 גרם נייר רך לקינון, וצולמו תמונות בנקודות זמן של 6, 12 ו-24 שעות. בסיום הניסוי, הנייר היה מפוזר ברחבי הכלוב ולא נצפה נשיכה: נקודה אחת. פיסות הנייר היו מקובצות לצד הכלוב, אך באופן רופף, ללא קן גבוש וללא קרע או קיפול ברורים: 2 נקודות. פיסות הנייר היו אסופות ומקופלות לקן גבוש אך שטוח יחסית, ללא קרע ברור: 3 נקודות. קן עמוק עם נייר קרוע באופן נרחב קיבל ציון של 4.  בסיום הניסוי, ה- רקמה ללא קרעים (המוגדרים כחלקי נייר במשקל >0.1 גרם שלא נקרעו או נטמעו בתוך הקן) נאספו בזהירות, יובשו באוויר ונשקלו באמצעות מאזניים אלקטרוניים (דיוק: 0.01 גרם). 

דגימה ואיסוף דגימות

אספנו דגימות רק מקבוצות ה-WT, 5xFAD ו-QFY (2.12 g/kg/d). לאחר חנק באמצעות CO2 , נכרתו הראשים, ההמיספירה הימנית נפתחה במהירות כדי להפריד את ההיפוקמפוס והקורטקס, נשטפו בתמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS), והונחו בתוך מבחנות קפואות בנפח 1.5 mL בחנקן נוזלי. הדגימות נשמרו בטמפרטורה של -80 oC לצורך בדיקות ביוכימיות. ההמיספירה השמאלית קובעה באמצעות טבילה ב-4% פאראפורמאלדהיד למשך 24 שעות, הותששה על ידי טבילה באתנול מוחלט, הוטמעה בשעוות פאראפין, נחתכה לפרוסות בעובי 5 µm, ועברה דה-פאראפיניזציה לצורך זיהוי אימונוהיסטוכימי.

בדיקה אימונוסורבנטית מקושרת אנזים (ELISA)

ביצעו בדיקות ELISA כדי לכמת את רמות חלבוני המטרה ברקמות מוח. תכני Aβ1–40 ו-Aβ1–42 בהומוגנאטים של ההיפוקמפוס נמדדו באמצעות ערכות מסחריות, בעוד שרמות קורטיקליות של GAP-43, PSD-95 ו-SYN נקבעו באמצעות ערכות שסופקו על ידי Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry. כל ההליכים בוצעו בקפידה בהתאם לפרוטוקולים של היצרנים. סדרות סטנדרט הוכנו באמצעות דילול סדרתי לפי הוראות הערכה. פריסת המיקרופלטה כללה בארות ריקות (blank), בארות סטנדרט, בארות של דגימות 5xFAD, בארות של דגימות שעובדו ב-QFY (במינון 2.12 g/kg/d), ובארות של סוג בר (wild-type). לפני הטענה, כל הדגימות דוללו פי שניים עם המדלל המסופק. תסמינים הוספו כאשר קצה הפ pipette מוחזק בניצב לתחתית הבאר, ולאחר מכן ערבבו בעדינות כדי להבטיח ערבוב יסודי.

לאחר איטום הפלטה, בוצעה דגירה ראשונית ב-37 °C למשך 30 min. במהלך פרק זמן זה, הוכנ בופר שטיפה על ידי דילול תמיסת המלאי המרוכזת במים אולטרה-טהורים ביחס של 1:29 (1 mL תמיסה מרוכזת ל-29 mL מים). עם סיום הדגירה, הוסר סרט האיטום, הנוזל נשפך והפלטה יובשה בנייר סופג. לאחר מכן, כל באר מולאה ב-200 µL של בופר שטיפה, הושארה למשך 30 s ואז רוקנה; מחזור זה חזר על עצמו 5 פעמים. לאחר מכן, נוסף רכיב מסומן באנזים (50 µL) לכל הבארים למעט הבקראות הריקות, והפלטה נאטמה שוב ודגרה ב-37 °C למשך 30 min, ולאחריה בוצע שלב שטיפה זהה של חמישה מחזורים.

לפיתוח הצבע, הוספו 50 µL של תמיסת כרומוגן A לכל באר, ולאחריהם 50 µL של תמיסת כרומוגן B, תוך ערבוב עדין לאחר כל הוספה. הפלטה דגרה ב-37 °C בחשכה למשך 10 min. התגובה האנזימטית הופסקה על ידי הוספת 50 µL של תמיסת עצירה (stop solution) לכל באר, אשר המירה באופן מיידי את הצבע הכחול לצהוב. הבליעה (צפיפות אופטית) נמדדה ב-450 nm באמצעות קורא מיקרופלטות, כאשר בארות ריקות (blank) שימשו כייחוס; כל הקריאות התקבלו בתוך 15 min לאחר הפסקת התגובה.

Luminex

רמות קורטיקליות של גורמי SASP נמדדו באמצעות ערכת Bio‑Plex Pro Mouse Cytokine 23‑plex Assay, כאשר כל הפרוצדורות בוצעו בהתאם להוראות היצרן. ריאגנטים הוצאו מאחסון ב-4 °C והושארו להגיע לטמפרטורת החדר למשך 30 min לפני השימוש. תמיסות סטנדרט עובריות דוללו בסדרה כדי ליצור עקומת סטנדרט בעלת שבע נקודות, בתוספת באר ריקה אחת, בהתאם לפרוטוקול הערכה. חרוזי מגנט עורבבו מראש ודוללו לריכוז העבודה המומלץ; נוגדני זיהוי הוכנו כתמיסות עבודה; וריכז באפר השטיפה דולל ל-1x עם מים דה-יוניים. קונג'וגט PE‑streptavidin דולל אף הוא ל-1x באמצעות באפר הדילול שסופק.

עבור הבדיקה, 50 µL של תרחיף חרוצים, סטנדרטים, בקרות איכות ודגימות רקמה מדוללות (5.6 µg/µL) הוספו ברצף לבארות הייעודיות בהתאם לסידור הפלטה. לאחר מכן, הפלטה נסגרה והודגרה למשך הלילה ב-4 °C עם ניעור אורביטלי ב-800 rpm. לאחר הדגרה, החרוצים נשטפו שלוש פעמים עם 200 µL של בופר שטיפה לכל בארה. לאחר מכן, 50 µL של נוגדן זיהוי שהוכן הוספו לכל בארה, והפלטה הודגרה בטמפרטורת החדר למשך 1 h עם ניעור ב-800 rpm. לאחר שלושה מחזורי שטיפה נוספים, הוספו 50 µL של תמיסת עבודה של PE‑streptavidin, והפלטה הודגרה למשך 30 min נוספים בטמפרטורת החדר תחת אותם תנאי ניעור. בוצע שלב שטיפה סופי (שלוש פעמים עם 200 µL בופר שטיפה), ולאחר מכן הוספו 150 µL של בופר שטיפה לכל בארה, והפלטה נוערה בטמפרטורת החדר למשך 2 min ב-800 rpm לפני הקריאה במכשיר ה-Bio‑Plex.

צביעת SA-β-Gal ואימונוהיסטוכימיה

צביעת SA-β-Gal בוצעה בהתאם לערכה לצביעת Senescence β-Galactosidase. לאחר צביעת SA-β-Gal, נסשכרו החתכים לשחזור אנטיגן על ידי חימום בבופר ציטראט (pH 6.0). פעילות פראוקסידאז אנדוגנית נחסמה על ידי דגירה של החתכים בתמיסה לחסימת פראוקסידאז למשך 10 min בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את החתכים עם נוגדן rabbit monoclonal anti‑Aβ₁-₄₂ (1:400) ב-4 °C למשך לילה. לאחר שטיפה, דגרו את החתכים עם נוגדן משני anti‑rabbit/mouse IgG למשך 20 min בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה נוספת, הוצגה האימונוריאקטיביות באמצעות DAB למשך 2 min. לבסוף, החתכים עברו דהידרציה, הבהרה והרכבה עם שרף ניטרלי לבחינה מיקרוסקופית.

אימונופלורסנציה

עבור צביעה אימונופלורסצנטית, חתכים פראפין עברו דה-פראפיניזציה ב-xylene (3 פעמים ל-15 דקות) והרטבה מחדש באמצעות סדרת אתנול מדורגת (100%, 95%, ו-75%; פעמיים ל-5 דקות כל אחת). שחזור אנטיגן בוצע על ידי טבילת החתכים בבופר sodium citrate בריכוז 1x בטמפרטורה של 95 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן קירור הדרגתי לטמפרטורת החדר. לאחר שלושה שטיפות עם phosphate-buffered saline עם Tween 20 (PBST) (5 דקות כל אחת), החתכים עברו פרמיאביליזציה וחסימה עם 10% normal goat serum המכיל 0.3% Triton X‑100 למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החתכים דגרו עם נוגדנים ראשוניים נגד p21/CIP1/CDKN1A (1:200) ו-Aβ₁‑₄₂ (1:400) בטמפרטורה של 37 °C למשך 2 שעות. בעקבות ארבעה שטיפות עם PBST (5 דקות כל אחת), החתכים דגרו עם נוגדנים שניוניים המשולבים עם Alexa Fluor ותואמים למין (1:500) בטמפרטורה של 37 °C למשך 2 שעות בחושך. לאחר שטיפה נוספת (4 פעמים ל-5 דקות ב-PBST), החתכים הוטבעו עם תג המטבעה antifade המכיל DAPI וצולמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטי.

צביעת Golgi-Cox

צביעת Golgi‑Cox בוצעה באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. תמיסות A ו-B ערבוב 24 שעות לפני הניסוי. לאחר ההמתת העכברים, רקמות המוח הוצאו במהירות, נשטפו ב-PBS והוטבלו בתערובת של תמיסות A ו-B. הרקמות הוכשרו בטמפרטורת החדר בחושך למשך 6 שעות, ולאחר מכן תמיסת ההספגה הוחלפה בתמיסה רעננה והאינקובציה נמשכה למשך שבועיים נוספים בטמפרטורת החדר בחושך (לפחות 2 mL של תמיסת הספגה לכל רקמת מוח). לאחר מכן הועברו הרקמות לתמיסה C והוכשרו למשך 24 שעות, לאחר מכן התמיסה הוחלפה בתמיסה C רעננה והאינקובציה נמשכה למשך 7 ימים נוספים בטמפרטורת החדר בחושך. רקמות המוח נחתכו בעובי של 100 µm באמצעות ויברטום. החתכים הועמדו על שקופיות מצופות ג'לטין והושארו לייבוש בטמפרטורת החדר למשך 3 ימים. השקופיות נשטפו פעמיים במים מזוקקים (5 דקות כל פעם), ולאחר מכן הוטבלו בתערובת של תמיסה D, תמיסה E ומים מזוקקים (יחס של 1:1:2) למשך 15 דקות. לאחר שני שטיפות נוספות במים מזוקקים (5 דקות כל פעם), החתכים עברו דהידרציה באמצעות תמיסות אתנול בריכוזים מדורגים (50%, 75% ו-95%; 5 דקות כל פעם), ולאחריהן ארבעה שטיפות באתנול מוחלט (4 דקות כל פעם) ושלוש שטיפות בקסילן (5 דקות כל פעם). לבסוף, החתכים כוסו בזכוכית כיסוי עם חומר העמדה. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ, וצפיפות הקוצים הדנדריטיים כמתה באמצעות ImageJ.

ניתוח סטטיסטי

כל התוצאות דווחו כממוצע ± SD. הנתונים נותחו וgrads using GraphPad Prism 8.1.0. מבחן t של Student שימש להשוואה בין שתי קבוצות. להשוואות הכוללות מספר קבוצות, נעשה שימוש ב-ANOVA חד-כיווני, כאשר השוואות זוגיות בוצעו באמצעות מבחן Dunnett. מובהקות סטטיסטית נקבעה ל- p < 0.05.

ניתוחים רב-משתנים וניתוחי מתאם

ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) בוצע באמצעות GraphPad Prism 8.0.1 כדי להמחיש ויזואלית את ההקבצה לפי קבוצות של גורמי SASP (‏IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A, IFN-γ, CCL3, CCL4, ו-CCL5) בקרב קבוצות ה-WT, ה-5xFAD וה-QFY (‏2.12 g/kg/day) (n = 8 לכל קבוצה). תרשים הניקוד (score plot) הופק על בסיס שני הרכיבים הראשיים הראשונים. לא בוצע טרנספורמציה של נתונים לפני ה-PCA. ניתוח מתאם פירסון נערך כדי להעריך קשרים ליניאריים בין גורמי SASP לבין חלבונים סינפטיים (PSD-95, GAP-43, ו-SYN), וכן בין Aβ₁₋₄₀, Aβ₁₋₄₂, ויחס ה-Aβ₁₋₄₂/Aβ₁₋₄₀. הניתוח בוצע באמצעות GraphPad Prism, עם סף מובהקות דו-זנבי של p < 0.05. מטריצות מתאם ומפת חום (heatmap) הופקו כדי להמחיש ויזואלית את עוצמתם וכיוונם של הקשרים.

תוצאות

מתן QFY משפר למידה וזיכרון בעכברי 5xFAD

לאחר מתן QFY, נערך מבחן תיבת מעבר (shuttle box test) כדי להעריך את תגובת ההימנעות האקטיבית המותנית של עכברים (איור 2A–C). התוצאות הראו כי מספר מקרי ההימנעות האקטיבית בימים 1-4 (איור 2A, p < 0.05), השטח תחת העקומה (AUC) של הימנעות אקטיבית (איור 2B, p < 0.01) במהלך תקופת הלמידה, ומספר מקרי ההימנעות האקטיבית (איור 2C, p < 0.05) במהלך תקופת הבדיקה, היו נמוכים באופן מובהק בעכברי 5xFAD בהשוואה לעכברי WT. מתן donepezil ו-memantine הגדיל באופן מובהק את מספר מקרי ההימנעות האקטיבית ביום 2 במהלך תקופת הלמידה בעכברי 5xFAD (איור 2A, p < 0.05). מתן QFY הגדיל באופן מובהק את מספר מקרי ההימנעות האקטיבית בימים 3 ו-4 (איור 2A, p < 0.05), את ה-AUC של הימנעות אקטיבית (איור 2B, p < 0.01 בקבוצת המינון הגבוה של QFY) במהלך תקופת הלמידה, ואת מספר מקרי ההימנעות האקטיבית (איור 2C, p < 0.05 בקבוצת המינון הנמוך של QFY) במהלך תקופת הבדיקה. נתונים אלו מעידים כי היכולת לבצע תגובת הימנעות אקטיבית הייתה פגועה בעכברי 5xFAD, בעוד שמתן QFY שיפר אותה.

השתמשנו במבוך המים של מוריס כדי להעריך למידה מרחבית וזיכרון בעכברים. התוצאות הראו (Figure 2D–I) כי זמן ההגעה למסלול המילוט ביום הראשון (Figure 2D, p < 0.05) וה-AUC של זמן ההגעה למסלול המילוט (Figure 2E, p < 0.01) במהלך תקופת הלמידה, וכן זמן ההגעה למסלול המילוט בתקופת הבדיקה (Figure 2F, p < 0.05) היו גבוהים באופן ניכר בעכברי 5xFAD בהשוואה לעכברי WT; מספר החציות של הפלטפורמה (Figure 2H, p < 0.05) פחת באופן משמעותי בעכברי 5xFAD בהשוואה לעכברי WT. מתן donepezil ו-memantine הפחית באופן משמעותי את ה-AUC של זמן ההגעה למסלול המילוט במהלך תקופת הלמידה (Figure 2E, p < 0.05) ובמהלך תקופת הבדיקה (Figure 2F, p < 0.01). טיפול ב-QFY הפחית באופן משמעותי את ה-AUC של זמן ההגעה למסלול המילוט במהלך תקופת הלמידה (Figure 2E, p < 0.05 בקבוצות QFY במינון נמוך ומינון גבוה, p < 0.01 בקבוצת QFY במינון בינוני) ואת זמן ההגעה למסלול המילוט (Figure 2F, p < 0.01 בשלוש קבוצות ה-QFY) במהלך תקופת הבדיקה, וכן האריך באופן ניכר את הזמן ברביע המטרה (Figure 2G, p < 0.05 בקבוצת QFY במינון נמוך) והגדיל את מספר החציות (Figure 2H, p < 0.05 ב-QFY במינון נמוך). תוצאות אלו מעידות על פגמים בלמידה מרחבית ובזיכרון בעכברי 5xFAD וכי טיפול ב-QFY שיפר פגמים אלו.

מתן QFY מקל על ההזדקנות בעכברי 5xFAD

לאחר מתן QFY, נעשה שימוש בבדיקות הליכה, כוח אחיזה ובדיקות קינון מושבתיות כדי להעריך את ההזדקנות של העכברים. התוצאות (איור 3A) הראו כי בהשוואה לעכברי WT, משך הריצה, השונות המקסימלית בריצה ומדד הסדירות של רצף הצעדים פחתו באופן משמעותי בעכברי 5xFAD (p < 0.05). מהירות ריצה ממוצעת (איור 3A, p < 0.05), מדד העמידה של הגפה הקדמית הימנית (RF) (איור 3A, p < 0.01), מדד העמידה של הגפה האחורית השמאלית (LH) (איור 3A, p < 0.05), מגע מקסימלי של RF (איור 3A, p < 0.01), מהירות תנופה של הגפה האחורית הימנית (RH) (איור 3A, p < 0.05), מהירות תנופה של LH (איור 3A, p < 0.01) ומחזור העבודה (duty cycle) (איור 3A, p < 0.05) ב-5xFAD עלו באופן משמעותי. טיפול ב-donepezil וב-memantine העלה את ה-RH, את מדד העמידה של הגפה הקדמית השמאלית (LF) (איור 3A, p < 0.05) והפחית את מחזור העבודה של LH (איור 3A, p < 0.01), וכן הפחית את העמידה הכפולה הראשונית של RH (איור 3A, p < 0.05) ואת העמידה הכפולה הסופית של LH (איור 3A, p < 0.01) בעכברי 5xFAD. מתן QFY הפחית את מחזור העבודה של LH (איור 3A, p < 0.05 בקבוצת המינון הנמוך של QFY ו- p < 0.01 בקבוצת המינון הבינוני), את העמידה הכפולה הראשונית של RH (איור 3A, p < 0.05 בקבוצות המינון הנמוך והגבוה של QFY, ו- p < 0.01 בקבוצת המינון הבינוני של QFY) ואת העמידה הכפולה הסופית של LH (איור 3A, p < 0.05 בקבוצת המינון הנמוך של QFY, ו- p < 0.01 בקבוצות המינון הבינוני והגבוה של QFY), וכן העלה את משך הריצה (איור 3A, p < 0.05 בקבוצות המינון הנמוך והבינוני של QFY), את השונות המקסימלית בריצה (איור 3A, p < 0.05 בקבוצות המינון הנמוך והבינוני של QFY), את מדד הסדירות של רצף הצעדים (איור 3A, p < 0.01 בקבוצות המינון הנמוך והבינוני של QFY), את מדד העמידה של LF (איור 3A, p < 0.05 בקבוצת המינון הנמוך של QFY) ואת מדד העמידה של LH (איור 3A, p < 0.05 בקבוצת המינון הנמוך של QFY) בעכברי 5xFAD. תוצאות אלו מעידות כי עכברי 5xFAD הפגינו הליכה לא תקינה, אשר טיפול ב-QFY שיקם.

לאחר מתן QFY, נערך מבחן כוח אחיזה להערכת כוח הגפיים הקדמיות. הנתונים הניסויים (איור 3B) מראים כי כוח הגפיים הקדמיות של עכברי 5xFAD היה חלש באופן מובהק מזה של עכברי WT (p < 0.01). מתן donepezil ו-memantine (איור 3B, p < 0.01), ו-QFY (איור 3B, p < 0.01, בקבוצות המינון הנמוך והגבוה של QFY) העלו באופן מובהק את כוח האחיזה של עכברי 5xFAD. מחקרים אלו מרמזים כי כוח הגפיים הקדמיות בעכברי 5xFAD שופר באמצעות טיפול ב-QFY.

תוצאות מבחן בניית הקן הראו (איור 3C–G) שציון בניית הקן של עכברי 5xFAD היה נמוך באופן מובהק מזה של עכברי WT בנקודות הזמן 6 שעות (איור 3C, p < 0.05), 12 שעות ו-24 שעות לאחר תחילת בניית הקן (איור 3DE, p < 0.01), ומשקל הרקמה שלא נקרעה היה גבוה באופן מובהק אצל עכברי 5xFAD (איור 3F, p < 0.01). מתן donepezil ו-memantine הפחית בלבד את משקל הרקמה שלא נקרעה (איור 3F, p < 0.01). הטיפול ב-QFY העלה את ציוני בניית הקן ב-12 שעות (איור 3D; QFY p < 0.05 בקבוצת המינון הבינוני של QFY) וב-24 שעות (איור 3E; QFY p < 0.05 בקבוצות המינון הנמוך והבינוני של QFY). יתרה מכך, משקל הרקמה שלא נקרעה היה נמוך באופן מובהק בקבוצות המינון הנמוך והבינוני של QFY (איור 3F, p < 0.01) ובקבוצת המינון הגבוה של QFY (איור 3F, p < 0.05). תוצאות אלו מצביעות על כך שטיפול ב-QFY שיפר את הפעילות היומית בעכברי 5xFAD.

טיפול ב-QFY מפחית את הנזק למבנה הסינפטי בקליפת המוח של עכברי 5xFAD

לאחר טיפול ב-QFY, נאסף קורטקס מוחי מעכברים כדי למדוד את רמות החלבון של GAP-43, PSD-95 ו-SYN באמצעות ELISA. התוצאות (איור 4A–C) הראו כי התכנים של GAP-43 (איור 4A, p < 0.05), PSD-95 (איור 4B, p < 0.01) ו-SYN (איור 4C, p < 0.01) בקורטקס המוחי של עכברי 5xFAD היו נמוכים משמעותית מאלו של עכברי WT. תכולת החלבון של GAP-43 (איור 4A, p < 0.05), PSD-95 (איור 4B, p < 0.01) ו-SYN (איור 4C, p < 0.01) עלתה באופן משמעותי לאחר הטיפול ב-QFY. תוצאות צביעת Golgi-Cox (איור 4D) הראו כי אורך הדנדריטים בקורטקס המוחי של עכברי 5xFAD היה קצר יותר (איור 4G, p < 0.05) מזה של עכברי WT. הטיפול ב-QFY נטה להעלות את האורך, המספר והצפיפות של קוצי הדנדריטים.

טיפול ב-QFY הפחית את שיקוע ה-Aβ ואת ההזדקנות התאית במוחות של עכברי 5xFAD

שקיעת Aβ והזדקנות תאית ממלאות תפקידים חשובים בפתוגנזה של AD. השתמשנו בשילוב של צביעת SA-β-Gal ואימונוהיסטוכימיה של Aβ כדי להעריך קו-לוקליזציה בין SA-β-Gal לבין פלאקים של Aβ. התוצאה הראתה כי הייתה כמות גדולה של אגרגציה של SA-β-Gal ושקיעת פלאקים של Aβ בקליפת המוח של עכברי 5xFAD (איור 5A), בעוד שרק מספר קטן של אגרגציות SA-β-Gal ושקיעות פלאקים של Aβ נמצאו לאחר טיפול ב-QFY (איור 5A). בנוסף, נצפתה קו-לוקליזציה של SA-β-Gal ופלאקים של Aβ.

בדיקות אימונופלואורסצנציה גילו כי מוחות של עכברי 5xFAD עמוסים מאוד הן בפלאקים של Aβ והן בתאים חיוביים ל-p21 (איור 5B,C). מתן QFY צמצם באופן משמעותי את פלאקי Aβ בקורטקס והפחית את ביטוי ה-p21 בבעלי חיים אלו (איור 5B,C). תוצאות ה-ELISA הראו כי בהשוואה לעכברי WT, תכולת ה-Aβ1-42 והיחס בין Aβ1-42/ AΒ1-40 היו מוגברים באופן משמעותי בהיפוקמפוס של עכברי 5xFAD (איור 5D,F, p < 0.01), בעוד שהטיפול ב-QFY הפחית אותם באופן ניכר (איור 5D, p < 0.01; איור 5F, p < 0.05, בהתאמה).

תאים מזקינים (senescent cells) מפרישים בדרך כלל כמויות גדולות של גורמי SASP. תוצאות ניתוח ה-Luminex הראו כי הרמות של IL-1α (איור 5G, p < 0.05), IL-1β (איור 5H, p < 0.01), IL-17A (איור 5J, p < 0.05), CCL3 (איור 5K, p < 0.01), CCL4 (איור 5L, p < 0.01), CCL5 (איור 5M, p < 0.01) ו-IFN-γ (איור 5N, p < 0.01) עלו באופן משמעותי בקליפה המוחית של עכברי 5xFAD. טיפול ב-QFY הפחית באופן משמעותי את רמות ה-IL-1α (איור 5G, p < 0.05), IL-1β (איור 5H, p < 0.05), IL-6 (איור 5I, p < 0.05), IL-17A (איור 5J, p < 0.05), ו-IFN-γ (איור 5N, p < 0.01) בקליפה המוחית.

נתונים אלה מעידים כי הופיעה זקנה תאית במוחם של עכברי 5xFAD, בעוד שהטיפול ב-QFY הפחית את הזקנה התאית בעכברי 5xFAD.

השפעות של QFY על שיפור לקויות קוגניטיביות והפחתת הזדקנות של תאי מוח בעכברי 5xFAD, בהלימה לנזק סינפטי

ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) בוצע כדי להעריך את פרופילי הביטוי הכלליים של SASP (IL‑1α, IL‑1β, IL‑6, IL‑17A, CCL3, CCL4, CCL5, ו-IFN‑γ) בין קבוצות ה-WT, ה-5xFAD והקבוצות שטופלו ב-QFY (איור 6A). שני הרכיבים הראשיים הראשונים הסבירו 44.11% ו-23.46% מהשונות הכוללת, בהתאמה. כפי שמוצג בתרשים הציונים של ה-PCA (איור 6A), קבוצת ה-WT הופרדה בבירור מקבוצת ה-5xFAD. באופן בולט, הקבוצה שטופלה ב-QFY הראתה מיקום ביניים, כאשר היא התקבלה באופן קרוב יותר לקבוצת ה-WT מאשר לקבוצת ה-5xFAD, מה שמרמז על נורמליזציה חלקית של פרופיל ה-SASP לאחר טיפול ב-QFY. ניתוח סטטיסטי של ציוני PC1 (איור 6B) העלה כי קבוצת ה-5xFAD הראתה ערכי PC1 גבוהים באופן מובהק מקבוצת ה-WT. ציוני PC2 (איור 6C) הראו אף הם הבדלים מובהקים בין קבוצות ה-5xFAD וה-WT. ניתוח תרשים העומסים (Loading plot) (איור 6D) הצביע על כך ש-IL‑1α, IL‑1β ו-IFN‑γ היו התורמים המרכזיים ל-PC1, בעוד ש-IL‑6 ו-CCL3 תרמו באופן משמעותי יותר ל-PC2.

ביצענו ניתוחי מתאם של פירסון (Pearson correlation) בין IL-1α, IL-1β, ו-IFN-γ ואת תכולות ה-PSD-95, ה-GAP-43 וה-SYN בקורטקס, כמו גם את תכולות ה-Aβ1-40 ו-Aβ1-42 ויחס ה-Aβ1-42/Aβ1-40 בהיפוקמפוס, ופיתחו מפות חום (heatmaps) כדי להמחיש את יחסי הגומלין בין חלבון הקשור לסינפסה לבין תפקוד ה-SASP. IL-1α, IL-1β, ו-IFN-γ רמות המתואמות באופן חיובי עם תכני Aβ1-40 ו-Aβ1-42 והמכפלה של Aβ1-42/Aβ1-40 (איור 6E, p < (0.05), והיה במתאם שלילי עם תכולת חלבון ה-SYN. רמות ה-IL-1α ו-IFN-γ היו במתאם שלילי עם תכולת חלבון GAP-43 ו-IL-1β היה במתאם שלילי עם חלבון PSD-95 (איור 6E, p < 0.05). נתונים אלה מרמזים כי IL-1α, IL-1β, ו-IFN-γ הם גורמים מרכזיים לתפקוד סינפטי לקוי.

זמינות נתונים:

כל הנתונים הגולמיים התומכים בממצאי מחקר זה הופקדו ב-Figshare וניתן לגשת אליהם באמצעות קישור סקירה פרטי: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33208029.

figure-results-1
איור 1: תרשים סכמטי של ההליך הניסויי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מתן QFY משפר את ביצועי הלמידה והזיכרון בעכברי 5xFAD. (A–C) מבחן תיבת מעבר (Shuttle box test): (A) מספר תגובות הימנעות פעילה במהלך תקופת הלמידה. (B) שטח תחת העקומה (AUC) לתגובות הימנעות פעילה במהלך תקופת הלמידה. (C) מספר תגובות הימנעות פעילה במהלך תקופת הבדיקה. (D–I) מבחן מבוך המים של מוריס: (D) זמן השהייה עד למציאת מוצא (Escape latency) במהלך תקופת הלמידה. (E) AUC לזמן השהייה עד למציאת מוצא במהלך תקופת הלמידה. (F) זמן השהייה עד למציאת מוצא במהלך תקופת הבדיקה. (G) זמן השהייה ברביעת המטרה. (H) מספר חציות של הפלטפורמה. (I) מסלולי תנועה במהלך תקופת הבדיקה. ממוצע ± SD, n = 11–20 לקבוצה, כאשר ה-n המדויק מצוין בכל עמודה. * = p < 0.05, vs WT, Student`s t-test; # = p < 0.05, ## = p < 0.01, vs 5xFAD; One-way ANOVA ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Dunnett. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: השפעות מתן QFY על מדדים תפקודיים הקשורים להזדקנות בעכברי 5xFAD. (A) מפת חום של ההליכה. סולם הצבעים מבוסס על נורמליזציית Z-score לאורך השורות, כאשר אדום מציין ערכים מעל ממוצע הקבוצה, כחול מציין ערכים מתחת לממוצע הקבוצה, ולבן מייצג את רמת הממוצע. (B) מבחן כוח אחיזה. (C–G) מבחן בניית קן: (C) ציון בניית קן לאחר 6 h, (D) ציון בניית קן לאחר 12 h. (E) ציון בניית קן לאחר 24 h. (F) משקל רקמה לא קרועה. (G) תמונות מייצגות של קנים לאחר 24 h. Mean ± SD, n = 3 לכל קבוצה, כאשר ה-n המדויק מצוין בכל עמודה. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, vs WT, Student`s t-test; # = p < 0.05, ## = p < 0.01, vs 5x FAD, One-way ANOVA ולאחריו Dunnett's multiple comparisons test. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: QFY מפחית שינויים מבניים סינפטיים בקורטקס המוחי של עכברי 5xFAD. (A) תכולת GAP-43 בקורטקס. (B) תכולת PSD-95 בקורטקס. (C) תכולת SYN בקורטקס. (D) צביעת Golgi-Cox. (E) מספר קוצי דנדריטים. (F) צפיפות קוצי דנדריטים. (G) אורך דנדריטים. ממוצע ± SD, n = 3–14 לקבוצה, כאשר ה-n המדויק מצוין בכל עמודה. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, مقابل WT, Student`s t-test; # = p < 0.05, ## = p < 0.01, مقابل 5xFAD, Student`s t-test. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: QFY הפחית את שיקוע ה-Aβ ואת הזקנה התאית במוחות של עכברי 5xFAD. (A) צביעה משולבת של SA-β-Gal ואימונוהיסטוכימיה של Aβ; SA-β-Gal (ירוק, חץ כחול), Aβ (חום, חץ אדום), SA-β-Gal + Aβ (חץ צהוב), n = 3, סרגל קנה מידה = 10 µm, עדשה 20x. (B) תמונות אימונופלואורסצנציה המראות Aβ בקליפת המוח לאחר טיפול ב-QFY, n = 3, סרגל קנה מידה = 50 µm, עדשה 40x. (C) תמונות אימונופלואורסצנציה המראות p21 בקליפת המוח לאחר טיפול ב-QFY. n = 1, סרגל קנה מידה = 50 µm, עדשה 40x. (D–F) ELISA. (D) תכולת Aβ1-42 בהיפוקמפוס. (E) תכולת Aβ1-40 בהיפוקמפוס. (F) יחס Aβ1-42/ Aβ1-40. (G–N) ניתוח ציטוקינים בשיטת Luminex. (G) תכולת IL-1α בקליפת המוח. (H) תכולת IL-1β בקליפת המוח. (I) תכולת IL-6 בקליפת המוח. (J) תכולת IL-17A בקליפת המוח. (K) תכולת CCL3 בקליפת המוח. (L) תכולת CCL4 בקליפת המוח. (M) תכולת CCL5 בקליפת המוח. (N) תכולת IFN-γ בקליפת המוח. ממוצע ± SD, n = 8–14 לכל קבוצה, כאשר ה-n המדויק מצוין בכל עמודה. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, לעומת WT, מבחן t של Student; # = p < 0.05 ## = p < 0.01, לעומת 5xFAD, מבחן t של Student. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
Figure 6: Principal component and correlation analyses of SASP factors, synaptic proteins, and Aβ levels in 5xFAD mice following QFY treatment. (A–D) Principal component analysis (PCA) of SASP factors. (A) PCA score plot. (B) PC1 scores. (C) PC2 scores. (D) PCA loading plot. (E) Heatmap generated from the correlation analysis between the SASP and PSD-95, GAP-43, SYN, Aβ1-40, Aβ1-42, and the ratio of Aβ1-42/Aβ1-40. Colors closer to red indicate higher R-values, while colors closer to white indicate lower R-values. Mean ± SD; n = 8 per group. * = p < 0.05, ** = p < 0.01,vs WT; ## = p < 0.01, vs 5xFAD, & = p < 0.05, && = p < 0.01, indicates a significant correlation. Pearson correlation analysis was used to assess associations between variables. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-7
איור 7: מודל מוצע להשפעות של QFY על ירידה קוגניטיבית תלוית גיל ועל פנוטיפים הקשורים להזדקנות תאית בעכברי 5xFAD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

פלסטיקה סינפטית עצבית ממלאת תפקיד מרכזי בתפקוד קוגניטיבי. במוחם של חולי AD, משקעי Aβ מתפשטים באזורים שונים, וגורמים ישירות לנזק מבני סינפטי, לאובדן סינפסות מעוררות ולהידרדרות קוגניטיבית28. GAP-43 (חלבון ממברנה פרה-סינפטי)29, PSD-95 (חלבון פיגום הממוקם בממברנה הפוסט-סינפטית)30, ו-SYN (פוספו-חלבון הקשור לשקים סינפטיים)31 ממלאים תפקיד חשוב בפלסטיקה של המבנה הסינפטי ובפתוגנזה של AD32. המחקר הנוכחי מצא כי טיפול ב-QFY שיפר למידה וזיכרון, הפחית את נטל פלאקי Aβ, ושקם את המבנה הסינפטי על ידי הגדלת מספר הקוצים הדנדריטיים ורמות החלבון של GAP-43, PSD-95 ו-SYN במוחם של עכברי 5xFAD.

הזדקנות היא גורם סיכון מכריע בהתפתחות AD ומעודדת ייצור Aβ. סימני ההיכר של ההזדקנות כוללים ירידה בחוזק השרירים, חוסר יציבות בהליכה ופגיעה בפעולות בסיסיות של התפקוד היומיומי33,34. דווח כי הזדקנות תאית (cellular senescence), המאופיינת על ידי SA-β-Gal, קשורה להזדקנות ולהופעת מחלות תלויות גיל, כגון AD11,35. סילוק סלקטיבי של תאים מזדקנים מאריך את תוחלת החיים הבריאה ומעכב מחלות תלויות גיל36. הסרה של תאים מזדקנים באמצעות גישות גנטיות או פרמקולוגיות הפחיתה את השקעת ה-Aβ ושיפרה את תפקודי הלמידה והזיכרון בעכברי מודל של AD37. טיפול משולב ב-Dasatinib ו-Quercetin (D+Q) מפחית את הזדקנות תאי progenitor של אוליגודנדרוציטים, מקל על נוירו-דלקת, מפחית את פעילות ה-SA-β-Gal ואת פלטות Aβ, ומונע הצטברות Aβ וליקוי קוגניטיבי בעכברי APP/PS137. טיפול ב-Memantine הפחית באופן משמעותי את פעילות ה-SA-β-Gal במוחות של עכברי SAMP8 ושיפר את הלמידה והזיכרון המרחבי; אפקט דומה נצפה בשילוב של memantine ו-donepezil38. המחקר הנוכחי מצא כי טיפול ב-QFY שיפר את ההליכה, חיזק את שרירי הגפיים הקדמיות ושיפר את היכולות בפעולות בסיסיות של התפקוד היומיומי, במיוחד על ידי הפחתת הזדקנות תאית, כפי שהודגם על ידי צביעת SA-β-Gal במוחות של עכברי 5xFAD.

חולי AD ומודלים של בעלי חיים מראים שניהם אסטרוציטים, מיקרוגליה, תאי אנדותל ונוירונים נזקנים (senescent)39,40. הפרשת SASP, הכוללת כימוקינים וציטוקינים דלקתיים, היא מאפיין ייחודי של נשקות תאית (cellular senescence); הפרשת SASP מוגברת עלולה להוביל לדלקת כרונית, הגורמת לנזק רקמתי ונשקות תאית41. הפרשה רציפה של SASP, כולל IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL1 ואחרים, מקדמת דלקת כרונית, נשקות פאראקרינית של תאים נורמליים, שינויים במטבוליזם התאי ובבקרת אפיגנטית, וייצור רציף של Aβ42,43,44,45. הרמות של IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A ו-IFN-γ מועלות באופן משמעותי במוחות של חולי AD ובמודלים של AD46. מחקרים הראו ש-D+Q יכול לעכב את הפרשת גורמים דלקתיים, כולל IL-1α ו-IFN-γ, ולהפחית את פלאקי Aβ ואת פעילות SA-β-Gal בעכברי APP/PS137. המחקר מצא ש-QFY הפחית את הביטוי של מספר גורמי SASP, כולל IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A ו-IFN-γ, ובכך הנמיך את הפנוטיפ הדלקתי הנזקן.

p21 שייך למשפחת ה-CIP/KIP של מעכבי קינאז תלוי-ציקלין ופועל כמעכב ראשוני של קומפלקסים של cyclin-CDK2/4, ובכך אוכף עצירה של G1/G2 כאשר מתרחשים עקה תאית, נזק ל-DNA והזדקנות. עלייה מתמשכת בשפע של p21 מפורשת באופן נרחב ככניסה לתוכנית סנצנציה (הזדקנות תאית) יציבה47,48. נתונים עולים כי עכברים מסוג 5xFAD נושאים עומס גבוה באופן חריג של p21 במוח, אשר מופחת באופן ניכר לאחר טיפול משולב ב-D+Q49. בהתאמה לכך, המחקר הנוכחי מצא כי מתן QFY הפחית באופן משמעותי את פלאקים של Aβ בקורטקס והפחית את ביטוי p21 בבעלי חיים אלה.

בסיכומה, ממצאים אלו מצביעים על קשר בין טיפול ב-QFY לבין שיפורים בירידה קוגניטיבית תלוית-גיל ובפנוטיפים של הזדקנות תאית בעכברי 5xFAD, לצד הפחתה של נזקים מבניים בסינפסות (איור 7).

יש להכיר במספר מגבלות של מחקר זה. ראשית, נעשה שימוש בעכברי 5xFAD זכרים בלבד, וטרם נקבע אם ההשפעות שנצפו תלויות במין. שנית, אף על פי שהנתונים הנוכחיים מדגימים קשרים חזקים בין פנוטיפים מופחתים הקשורים להזדקנות תאית (senescence) לבין שיפור קוגניטיבי, לא ביצענו ניסויי התערבות מכניסטיים ישירים כדי לבסס סיבתיות. שלישית, הרלוונטיות התרגומית של הממצאים למחלת AD בבני אדם מוגבלת בשל הבדלים בין מינים ומחסור בנתונים פרמקוקינטיים קליניים. מחקרים עתידיים שישלבו בעלי חיים נקבות, התערבויות ספציפיות להזדקנות תאית וניסויים קליניים מתוכננים היטב, נחוצים כדי להרחיב את הממצאים.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (82205078, 82374062), הקרן למדעים טבעיים של מחוז שאנדונג (ZR2026MS1293, ZR2021QH157), פרויקט המדע והטכנולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית של מחוז שאנדונג (M20251730), פרויקטים של מדע וטכנולוגיה של האזור האוטונומי טיבט, סין (XZ202601ZY0167), ותוכנית ההכוונה לחדשנות טכנולוגית של מחוז שאנדונג (קרן פיתוח מדע וטכנולוגיה מקומית בהנחיית הממשלה המרכזית) (YDZX2023137), במסגרת הפרויקט שכותרתו 'פיתוח ומחקר תעשייתי של קפסולות Tongli עם ציפוי מעי כתרופה סינית מסורתית חדשה מסוג Class 1'.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תרופות
דונפזילShanghai Yuanye Technologylot.J15HB188725
ממנטיןShanghai Yuanye Technologyסדרה J21HB189391
צ'י-פו-ין (Qi-fu-yin)מרכז המחקר והפיתוח Houpu של Lunan Pharmaceuticalסדרה 2209001
מבחנים התנהגותיים
CatWalk XTNoldusתוכנת CatWalkXT 10.0
מדד כוח לחיצת ידBileadbiosciBLD-ZL-20
מבוך המים של מוריסShanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd120 ס"מ
תיבת מעבר (Shuttle box)Shanghai Xinruan Information Technology Co., LtdXR-XC404
נוגדנים
Anti-Aβ1-42 נוגדןAbcamמספר קטלוגי ab201061#
נוגדן Anti-p21/CIP1/CDKN1ANovus Biologicalsמספר קטלוגי NBP3-15661
ערכות בדיקה
Aβ1-40 ערכה ל-ELISAThermo Fisher Scientificמספר קטלוגי KHB3482
Aβ1-42 ערכת ELISAThermo Fisher Scientificמספר קטלוגי KHB3442
ערכה לבדיקת Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plexR&מערכות Dמספר קטלוגי LXLBM23-1
ערכה לביצוע ELISA עבור GAP-43תעשיית בדיקות סמיך-אנזים (ELISA) בגיאנגסומס' קH MM-47506M1
ערכת צביעת גולג'י-קוקס (Golgi-Cox staining kit)BeiJing Biolead Biology Sci & טק קו (Tech Co)מספר קטלוג PK401
ערכה לבדיקת ELISA ל-PSD-95תעשיית בדיקות סריקת אנזימים (Enzyme Immunoassay) בג'יאנגסוקט"ל MM-45953M1
הזדקנות תאית β-ערכה לצביעת גלקטוסידאזBeyotimeמספר קטלוגי C0602#
ערכה לבדיקת ELISA של סינפטופיזין (SYN)תעשיית הבדיקות האימונו-אנזימטיות של ג'יאנגסומספר קטלוגי MM-46504M1
כימיקלים & ריאגנטים
נוגדן משני אנטי-rabbit ואנטי-mouse IgGסטרטרמספר קטלוגי S0C1001#
כרומוגן DABחומר התנעהמספר קטלוגי S0C1001
תוכנה
CatWalk XTNoldus Information Technologyגרסה 10.0
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)גרסה 1.53

מקורות

  1. Joe E, Ringman JM. Cognitive symptoms of Alzheimer's disease: clinical management and prevention. BMJ. 2019;367:l6217.
  2. Scheff SW, et al. Synaptic alterations in CA1 in mild Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Neurology. 2007;68(18):1501-8.
  3. Muralidar S, et al. Role of tau protein in Alzheimer's disease: the prime pathological player. Int J Biol Macromol. 2020;163:1599-617.
  4. Hardy JA, Higgins GA. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 1992;256(5054):184-5.
  5. Calsolaro V, Edison P. Neuroinflammation in Alzheimer's disease: current evidence and future directions. Alzheimers Dement. 2016;12(6):719-32.
  6. Campisi J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 2005;120(4):513-22.
  7. Yao R. An in-silico assessment suggests the potential effects of goji (fruit of Lycium barbarum L.) against aging-related diseases. Food Med Homol. 2025;2(2):9420036.
  8. Campisi J, d'Adda di Fagagna F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(9):729-40.
  9. Salminen A, Kaarniranta K, Kauppinen A. ER stress activates immunosuppressive network: implications for aging and Alzheimer's disease. J Mol Med (Berl). 2020;98(5):633-50.
  10. Mirabella F, et al. Prenatal interleukin 6 elevation increases glutamatergic synapse density and disrupts hippocampal connectivity in offspring. Immunity. 2021;54(11):2611-31.e8.
  11. Baker DJ, Petersen RC. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. J Clin Invest. 2018;128(4):1208-16.
  12. Lucas V, Cavadas C, Aveleira CA, Hook V. Cellular senescence: from mechanisms to current biomarkers and senotherapies. Pharmacol Rev. 2023;75(4):675-713.
  13. Bloss EB, et al. Evidence for reduced experience-dependent dendritic spine plasticity in the aging prefrontal cortex. J Neurosci. 2011;31(21):7831-9.
  14. Ye XS, et al. The food and medicine homologous Chinese medicine from Leguminosae species: a comprehensive review on bioactive constituents with neuroprotective effects on nervous system. Food Med Homol. 2025;2(2):9420033.
  15. Dickstein DL, Weaver CM, Luebke JI, Hof PR. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 2013;251:21-32.
  16. Wang SY, et al. Qifu-Yin attenuates AGEs-induced Alzheimer-like pathophysiological changes through the RAGE/NF-kappaB pathway. Chin J Nat Med. 2014;12(12):920-8.
  17. Yang X, et al. Qi-fu-yin attenuated cognitive disorders in 5xFAD mice of Alzheimer's disease animal model by regulating immunity. Front Neurol. 2023;14:1183764.
  18. Xiao QY, et al. Effects of Qi-Fu-Yin on aging of APP/PS1 transgenic mice by regulating the intestinal microbiome. Front Cell Infect Microbiol. 2023;12:1048513.
  19. Chen K, et al. Safety and toxicity of Qi-Fu Yin, a classical traditional Chinese medicine prescription: a nonclinical research. J Appl Toxicol. 2025;45(9):1811-38.
  20. Wang L, Qiao P, Yue L, Sun R. Is Qi Fu Yin effective in clinical treatment of dementia? A meta-analysis of 697 patients. Medicine (Baltimore). 2021;100(5):e24526.
  21. Li H, et al. Identification of chemical components of Qi-Fu-Yin and its prototype components and metabolites in rat plasma and cerebrospinal fluid via UPLC-Q-TOF-MS. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:1995766.
  22. Lei X, et al. Integrating network pharmacology and component analysis to study the potential mechanisms of Qi-Fu-Yin Decoction in treating Alzheimer's disease. Drug Des Devel Ther. 2023;17:2841-58. doi:10.2147/DDDT.S402624.
  23. Takeshita H, et al. Modified forelimb grip strength test detects aging-associated physiological decline in skeletal muscle function in male mice. Sci Rep. 2017;7:42323.
  24. Caggiano V, et al. Midbrain circuits that set locomotor speed and gait selection. Nature. 2018;553(7689):455-60.
  25. Ehret B, et al. Population-level coding of avoidance learning in medial prefrontal cortex. Nat Neurosci. 2024;27(9):1805-15.
  26. Curdt N, et al. Search strategy analysis of Tg4-42 Alzheimer mice in the Morris water maze reveals early spatial navigation deficits. Sci Rep. 2022;12:5451.
  27. Deacon RMJ. Assessing nest building in mice. Nat Protoc. 2006;1(3):1117-9.
  28. Tu S, Okamoto SI, Lipton SA, Xu H. Oligomeric Aβ-induced synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 2014;9:48.
  29. Benowitz LI, Routtenberg A. GAP-43: an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity. Trends Neurosci. 1997;20(2):84-91.
  30. Dore K, et al. PSD-95 protects synapses from β-amyloid. Cell Rep. 2021;35(9):109194.
  31. Kokotos AC, et al. Synaptophysin sustains presynaptic performance by preserving vesicular synaptobrevin-II levels. J Neurochem. 2019;151(1):28-37.
  32. Martin SB, et al. Synaptophysin and Synaptojanin-1 in Down syndrome are differentially affected by Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 2014;42(3):767-75.
  33. Namioka N, et al. Oxidative stress and inflammation are associated with physical frailty in patients with Alzheimer's disease. Geriatr Gerontol Int. 2016;17(6):913-8.
  34. Kojima G, Liljas A, Iliffe S, Walters K. Prevalence of frailty in mild to moderate Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Curr Alzheimer Res. 2017;14(12):1256-63.
  35. Dimri GP, et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(20):9363-7.
  36. Baker DJ, et al. Naturally occurring p16Ink4a-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 2016;530(7589):184-9.
  37. Zhang P, et al. Senolytic therapy alleviates Abeta-associated oligodendrocyte progenitor cell senescence and cognitive deficits in an Alzheimer's disease model. Nat Neurosci. 2019;22(5):719-28.
  38. Ota H, Ogawa S, Ouchi Y, Akishita M. Protective effects of NMDA receptor antagonist, memantine, against senescence of PC12 cells: a possible role of nNOS and combined effects with donepezil. Exp Gerontol. 2015;72:109-16.
  39. Herdy JR, et al. Increased post-mitotic senescence in aged human neurons is a pathological feature of Alzheimer's disease. Cell Stem Cell. 2022;29(12):1637-52.e6.
  40. Hu Y, et al. Replicative senescence dictates the emergence of disease-associated microglia and contributes to Abeta pathology. Cell Rep. 2021;35(10):109228.
  41. Tchkonia T, et al. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. J Clin Invest. 2013;123(3):966-72.
  42. Guerrero A, De Strooper B, Arancibia-Cárcamo IL. Cellular senescence at the crossroads of inflammation and Alzheimer's disease. Trends Neurosci. 2021;44(9):714-27.
  43. Acosta JC, et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 2013;15(8):978-90.
  44. Wang B, Han J, Elisseeff JH, Demaria M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024;25(12):958-78.
  45. Gaikwad S, Senapati S, Haque MA, Kayed R. Senescence, brain inflammation, and oligomeric tau drive cognitive decline in Alzheimer's disease: evidence from clinical and preclinical studies. Alzheimers Dement. 2024;20(1):709-27.
  46. Si Z, Sun L, Wang X. Evidence and perspectives of cell senescence in neurodegenerative diseases. Biomed Pharmacother. 2021;137:111327.
  47. Chen X, et al. Senescence-like changes induced by expression of p21Waf1/Cip1 in NIH3T3 cell line. Cell Res. 2002;12(3-4):229-33.
  48. Engeland K. Cell cycle regulation: p53-p21-RB signaling. Cell Death Differ. 2022;29(5):946-60.
  49. Choi I, et al. Autophagy enables microglia to engage amyloid plaques and prevents microglial senescence. Nat Cell Biol. 2023;25(7):963-74.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

5xFAD
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.