הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השתלת מוח תוך-מוחית יילודה להחלפת מיקרוגליה וניתוח שושלת בחיים

142 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72119

⸱

28 ביולי 2026

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מאפשר השתלה תוך-מוחית יעילה של אוכלוסיות מיקרוגליות מוגדרות, ותומך בהשתלה וניתוח ארוכי טווח חזקים של שושלת המיקרוגליה ואינטגרציה ב-vivo בין מקורות תורמים ומודלים של מקבלים.

תקציר

החלפת מיקרוגליה באמצעות השתלת תאי מיאלואיד הפכה לגישה ניסויית מבטיחה לחקר תהליכים נוירולוגיים ומחלות. עם זאת, אסטרטגיות השתלה קיימות מוגבלות לעיתים קרובות בשל השתלה לא יעילה, הסתמכות על התניה מבוססת הקרנה, או גמישות מוגבלת בין מערכות תורם ומקבל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול השתלה תוך-מוחית יילודים להכנסת אוכלוסיות מיקרוגליה מטוהרות (Hoxb8 ומיקרוגליה שאינה Hoxb8) למוח העכבר המתפתח. שיטה זו מאפשרת השתלת תאי תורם יעילים ואינטגרציה בתוך הפרנכימה של המוח בתנאים פיזיולוגיים מתירים יותר. חשוב לציין שהפרוטוקול תואם למספר מקורות תורמים, כולל אבות המטופואטיים עובריים ומיקרוגליה שמקורם במוח לאחר הלידה, וניתן ליישמו על מודלים נפרדים של מקבל עם מיקרוגליה אנדוגנית מופחתת או נעדרת, כולל עכברים מותנים חסרי Csf1r ועכברים מסוג Csf1r ΔFIRE. תאי תורם מטוהרים באמצעות מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה ומועברים דו-צדדית למוח עכברים יילודים באמצעות מיקרופיפטות זכוכית ללידה יעילה וזעיר-פולשנית. עכברים מקבלים מזדקנים כדי לאפשר לתאי תורם להתרחב ולהתמלא בנישת המיקרוגליה, והתוצאות מוערכות באמצעות ניתוח היסטולוגי של התפוצצות תאי התורם והביטוי של הסמנים. גישה זו מספקת פלטפורמה חזקה וניתנת להרחבה לחקר אונטוגניה של מיקרוגליה ואינטגרציה ב-vivo בהקשרים ניסיוניים מגוונים.

מבוא

החלפת מיקרוגליה באמצעות השתלת תאי מיאלואידים הפכה לאסטרטגיה עוצמתית לחקירת ביולוגיית המיקרוגליה וכפרדיגמה טיפולית פוטנציאלית למחלות נוירולוגיות. בשנים האחרונות, התחום התקדם לאסטרטגיות המסוגלות להחלפת מיקרוגליה נרחבתבמערכת העצבים המרכזית. מחקרים עדכניים הראו כי מקרופאגים ופרוגניטורים שמקורם בתורמים יכולים להחדיר את המוח, לאמץ תוכניות שעתוק דמויות מיקרוגליה, ובמקרים מסוימים לשפר פנוטיפים הקשורים למחלה 2,3,4,5,6,7,8. ממצאים אלו תומכים ברעיון שהחלפת מקרופאגים מוחית יכולה לשמש לחקר ואולי לשנות תהליכי מחלה נוירולוגיים.

אתגר מרכזי בהשתלת מיקרוגליה הוא השגת השתלה חזקה תוך מזעור בלבולים ניסיוניים. אסטרטגיות החלפה מבוססות רבות על פרדיגמות הקרנה, כימותרפיה או מיקרוגליות כדי ליצור נישה שניתן להשתלטעליה 6,9,10,11,12,13. למרות יעילותן, גישות אלו עלולות לגרום להזדקנות מיקרוגליה, לשבש את מחסום הדם-מוח ולשנות אותות דלקתיים, שכל אלה עלולים להקשות על פרשנות התנהגות תאי התורם 9,14. עבודות עדכניות יותר החלו לחקור גישות בלתי תלויות בהתניה או הפחתת רעילות להחלפת מיקרוגליה 5,8,15.

תזמון התפתחותי הוא גורם חשוב להצלחת השתלות. המוח הנאונטלי מספק סביבה מתירה התומכת בהרחבת תאי תורם ואינטגרציה ארוכת טווח, ככל הנראה בשל הפחתת מחסומים מבניים והקמת נישה של מיקרוגליה אנדוגנית. מחקרי השתלות עדכניים שהשתמשו בלידה מוקדמת לאחר הלידה (P0–P5) מראים השתלה פרנכימלית חזקה ורכישת זהות דמוית מיקרוגליה, מה שמדגיש את חשיבות ההקשר ההתפתחותי להחלפה יעילה 7,8,16,17.

מיקרוגליות Hoxb8 מספקות מערכת אינפורמטיבית במיוחד לחקר תרומות ייחודיות לביולוגיה של מיקרוגליה. תאים אלו נוצרים מאבות המטופואטיים עובריים ומייצגים תת-קבוצה מוגדרת של מיקרוגליה פרנכימלית, עם השלכות התנהגותיות כאשר הם לא מתפקדים 17,18,19,20,21. עבודות עדכניות עם אבות ראשוניים של Hoxb8 ומערכות אב מיקרוגליות וקולטני אסטרוגן (ER)-Hoxb8 מראה כי תאים אלו ניתנים להתרחב, למניפולציה גנטית ולהשתלב בהצלחה במוח, שם הם מאמצים פרופילים ותפקודיים דמויי מיקרוגליה 7,8,17. התקדמויות אלו מדגישות עוד יותר את השימושיות של גישות השתלות לניתוח שושלת המיקרוגליה וההטרוגניות.

כאן, אנו מתארים פלטפורמת השתלות תוך-מוחית יילודים שמותאמת לגמישות בין מערכות תורם ומקבל. בניגוד לגישות התלויות בהקרנה או בהתניה מערכתית, שיטה זו עושה שימוש בלידה תוך-מוחית דו-צדדית ישירה לעכברים יילודים, ומאפשרת מיקום תאי תורם בסביבה מוחית מתירה התפתחותית תוך מזעור הפרעות מערכתיות. הטכניקה תואמת למספר מקורות תורמים, כולל אבות המטופואטיים עובריים ומיקרוגליה שמקורה במוח לאחר הלידה, וניתן ליישם אותה על מודלים נפרדים של מקבל עם מיקרוגליה אנדוגנית מופחתת או נעדרת. יתרון מעשי משמעותי הוא שהגולגולת הדקה של הנאונטל מאפשרת הזרקה ידנית מהירה עם מיקרופיפטות זכוכית, מה שמבטל את הצורך בקידוח או קיבוע סטריאוטקסי ועדיין משיג השררה רחבה בפרנכימלים.

יחד, גישה זו מספקת מערכת חזקה, גמישה וניתנת להרחבה לחקר אונטוגניה, הטרוגניות ואינטגרציה ב-in vivo בהקשרים ניסיוניים מגוונים. דבר זה מציב את השתלת התינוקות הפנימית כחלופה משלימה ומבוקרת ניסויים לאסטרטגיות החלפת מיקרוגליה מערכתית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות והניסויים במחקר זה בוצעו על עכברים. ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) באוניברסיטת יוטה, Public Health Service Assurance #D16-00018 (A3031-01).

1. הכנת זוגות רבייה לתורם ומקבל

  1. הניחו זוגות מגדלים באותו כלוב בערב כדי להתחיל הזדווגות מתוזמנת.
  2. בדקו את הנקבות בכל בוקר לנוכחות פקק וגינלי כדי לאשר הזדווגות מוצלחת.
  3. הסירו נקבות סתומות מהזכרים והשאירו אותן בנפרד עד ללידה, שנמשכת כ-18–20 ימים.
  4. לטפל בעדינות באמהות בהריון במשך 5 דקות ביום במשך 7–10 ימים לפני הלידה כדי להפחית לחץ הקשור לטיפול ביילודים.
  5. חשפו את הסכרים למטוש כותנה המכיל ריח בטדין במהלך מפגשי הטיפול היומיים כדי להפחית את הלחץ האימהי כאשר הגורים מוחזרים לאחר הניתוח.
  6. הכינו כלובים נקיים עם חומרי קינון לנקבות בהריון לפני הלידה הצפויה.

2. איסוף ועיבוד מוחות יילודים

  1. המית עכברים תורמים יילודים (P0–P4) באמצעות מנת יתר של איזופלוראן באמצעות צנצנת פעמון או תא סגור דומה המצויד ברצפה מזויפת למניעת מגע ישיר עם ההרדמה.
  2. ברגע שהנשימה מפסיקה ומאומת היעדר רפלקסיות, יש לערוף את הראש מיד.
  3. קצור את כל המוח, כולל המוחון והפקעות הריחניות. שים מוחות ב-3 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת 1× קר של הנקס (HBSS) בצלחת פטרי מפלסטיק על קרח.
  4. באמצעות סכינים סטריליים ומלקחיים, טחנו את המוח לכ-1–2 מ"מ 3 חתיכות.
  5. העבר את רקמת המוח המפוצצת (מוח אחד לכל צינור דיסוציאציה של הרקמה) לצינורות ניתוק רקמות המכילות תגובות עיכול אנזימטיות המסופקות על ידי מערכת הפרידה של הרקמות העצביות, בהתאם לפרוטוקול המומלץ על ידי היצרן.
  6. הניחו את הצינורות במכשיר דיסוציאציה מכני עם יכולת חימום ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפי תוכנית ניתוק רקמות עצביות המומלצת על ידי היצרן.
  7. מסנני תאים של 70 מיקרון מוקדמים עם 400 מיקרוליטר של 1× HBSS.
  8. העבר את הרקמה המנותקת דרך המסננות המושרפות מראש שמונחות מעל צינור קוני בגודל 50 מ"ל על קרח.
  9. שטוף את הצינורות עם 10 מ"ל של 1× HBSS ועבר דרך מסננים כדי להבטיח התאוששות מקסימלית מהתאים.
  10. להשליך מסננים ולסובב תאים בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנטנט.
  11. החזירו את התאים ל-1 מ"ל של בופר פירוק תאי דם אדומים במים סטריליים וטהורים במיוחד לכל דגימה ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  12. כבה את תגובת הליזה עם 10 מ"ל של 1× HBSS/1% BSA/5% FBS.
  13. להשליך מסננים ולסובב תאים בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט.
  14. קבעו את מספר התאים באמצעות המוסיטומטר. טווח תפוקת התאים הטיפוסי הוא 3.2–4.0 × 106 לפני המיון.
  15. השעתי תאים ב-5% FBS ב-1× HBSS בריכוז הרצוי לצביעת נוגדנים במורד הזרם.

3. צביעת נוגדנים תאיים למיון FACS של אוכלוסיות מיקרוגליה

  1. החזירו תאים ל-1 מ"ל של בופר צביעה (5% FBS ב-1× HBSS) המכילים נוגדן חוסם קולטני Fc (טוהר CD16/32, 1:2000) ודגרו תאים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. סובבו את התאים בטמפרטורה של 240 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט.
  3. לדוג תאים עם נוגדנים פלואורסצנטיים עם נוגדנים מצומדים (CD45 APC, 1:160; CD11b Alex Fluor 700, 1:160) ב-1 מ"ל של בופר צביעה למשך 30 דקות על קרח בחושך.
  4. סובבו את התאים בטמפרטורה של 240 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט.
  5. הוסף צבע חיוני (למשל, 3 מיקרומום DAPI ב-1× HBSS) כדי להוציא תאים מתים.
  6. לבצע מיון FACS באמצעות מיון תאים מהיר המצויד בלייזרים מתאימים לזיהוי DAPI, GFP, tdTomato, CD45-APC ו-CD11b-Alexa Fluor 700.
  7. השתמש בזיר של 100 מיקרון עם לחץ מעטפת נמוך כשאפשר כדי למקסם את החיוניות של התא. שמור את צינורות איסוף הדגימות והתאים הממוינים על קרח לאורך כל התהליך.
  8. השתמשו בתאים לא צבועים בבקרות פיצוי בצבע יחיד, ובבקרות פלואורסצנציה מינוס אחד בעת הצורך כדי להגדיר מתחים, פיצוי ושערים.
  9. תאי שער ראשונים לפי שטח פיזור קדמי לעומת שטח פיזור צדדי כדי להוציא פסולת.
  10. סינגלטים של שערים משתמשים בגובה פיזור צד לעומת רוחב פיזור צדדי.
  11. הוצא תאים מתים על ידי גייטינג לתאי DAPI⁻.
  12. מסינגלטים חיים, שער ב-CD45נמוך CD11b⁺ מיקרוגליה.
  13. בתוך שער המיקרוגליההנמוך CD11b⁺, השתמשו ב-GFP וב-tdTomato פלואורסצנציה להפרדת אוכלוסיות מיקרוגליה תורמים (מיקרוגליה Hoxb8 : DAPI⁻ CD45low CD11b⁺ tdTomato⁺ GFP⁺, מיקרוגליה לא-Hoxb8 : DAPI⁻ CD45נמוך CD11b⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. מיין כל אוכלוסייה לצינורות איסוף סטריליים המכילים 1x HBSS קר.
  15. לאחר המיון, יש לנתח מחדש אליקו קטן של תאים ממוינים כדי לאשר טוהר וחיוניות לפני ההשתלה.
  16. לאסוף תאים ממוינים ב-HBSS 1× סטרילי ולשמר אותם על קרח בחושך עד להשתלה.
    הערה: התפוקה הטיפוסית למיקרוגליה Hoxb8 נעה בין 3.70–4.60 x 104 תאים ומיקרוגליה שאינה Hoxb8 בין 1.10–1.14 x 105 תאים למוח יילוד (P0–P4), אם כי התפוקה עשויה להשתנות בהתאם לגיל, הגנוטיפ ויעילות עיבוד הרקמות. השתלת תאים חיים טוהרים בהקדם האפשרי, רצוי תוך 60 דקות מהמיון של התאים.

4. איסוף ועיבוד אבות המטופואטיים בכבד העוברי

  1. המית סכרים בהריון באמצעות 5% איזופלוראן המועבר בחמצן באמצעות אידוי מדויק עד שהנשימה מפסיקה ואישור היעדר רפלקסים.
  2. לאחר מנת יתר של איזופלורן, יש לבצע שיטה פיזית משנית באמצעות פריקה צווארית כדי להבטיח מוות, בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים.
  3. הסר את קרני הרחם מהעכברים ההריוניים והניח אותן במים קרים של 3 מ"ל של 1× HBSS בצלחות פטרי מפלסטיק (60 מ"מ × 15 מ"מ).
  4. נתח עוברי E12.5 מהרחם והכנס במים קרים טריים של 3 מ"ל 1× HBSS בצלחות פטרי מפלסטיק.
  5. נתח כבד עוברי עם מלקחיים דקים ומניח אותם ב-3 מ"ל HBSS קר 1× המכיל 5% FBS בצלחות פטרי.
  6. הפרדה מכנית של רקמת כבד עוברית באמצעות מחט של 26 גרם ומזרק של 3 מ"ל.
  7. סובבו את התאים בטמפרטורה של 240 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט.
  8. שטוף תאים עם 1× HBSS.
  9. העבירו את מתליית התא דרך מסננת תא בגודל 80 מיקרון.
  10. דגרו תאים ב-20 מיקרוליטר של בופר פירוק תאי דם אדומים (0.15 מיליון אמוניום כלוריד, 1 מ"מ KHCO3) למשך 5 דקות, ולאחר מכן מוסיפים 13 מ"ל של 1× HBSS לצורך הקפאה.
  11. המשך דגירה במשך 5 דקות לבדיקת תאי דם אדומים.
  12. סובבו את התאים בטמפרטורה של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

5. צביעת נוגדנים לתאים למיון FACS של תאי אב המטופואטיים

  1. דגרו תאי כבד עוברי עם נוגדנים פלואורסצנטיים (Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50; ערכת PE-Cy7, 1:100) ב-5% FBS/1% BSA ב-1× HBSS ל-30 דקות על הקרח בחושך.
  2. שטפו תאים עם 1× HBSS וסובבו למטה ב-240 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף צבע חיוני (למשל, 3 מיקרומום DAPI ב-1× HBSS) כדי להוציא תאים מתים.
  4. בצע מיון FACS באמצעות מיון תאים מהיר המצויד בלייזרים ומסננים מתאימים לזיהוי DAPI, Ter119 PerCP-Cy5.5, Kit PE-Cy7, tdTomato, וזיהוי GFP.
  5. השתמש בזיר של 100 מיקרון עם לחץ מעטפת נמוך כשאפשר כדי למקסם את החיוניות של התא. שמור את צינורות איסוף הדגימות והתאים הממוינים על קרח לאורך כל התהליך.
  6. השתמשו בתאים לא צבועים בבקרות פיצוי בצבע יחיד, ובבקרות פלואורסצנציה מינוס אחד בעת הצורך כדי להגדיר מתחים, פיצוי ושערים.
  7. תאי שער ראשונים משתמשים באזור הפיזור הקדמי לעומת שטח פיזור צדדי כדי להוציא פסולת.
  8. סינגלטים של שערים המשתמשים בגובה פיזור קדמי לעומת רוחב פיזור קדמתי, ואחריו גובה פיזור צד לעומת רוחב פיזור צדדי.
  9. הוצא תאים מתים על ידי גייטינג לתאי DAPI⁻.
  10. מסינגלטים חיים, יש להוציא תאי שושלת אריתרואידים על ידי גייטינג על תאי Ter119⁻.
  11. בתוך אוכלוסיית Ter119⁻, שער על תאי אב המטופואטייםגבוהים של Kit.
  12. בתוך האוכלוסייההגבוהה של ערכת DAPI⁻ Ter119⁻, בודדו אבות חיוביים לקו Hoxb8 על ידי גייטינג על תאי tdTomato⁺.
  13. אם קו התורם נושא גם את מדווח Cx3cr1-GFP, השתמש בפלואורסצנציה של GFP כדי לוודא שאוכלוסיית הקדמון של הכבד העוברי הממוינה נמוכה ב-GFP⁻ או GFPבשלב זה, מה שמבדיל בין תאי אב לתאי המיאלואידים המבדילים את Cx3cr1.
  14. מיין את ה-DAPI⁻ Ter119⁻ Kithigh tdTomato⁺ GFP- הסופית לצינורות איסוף סטריליים המכילים 1× HBSS קר.
  15. לאחר המיון, יש לנתח מחדש אליקו קטן של תאים ממוינים כדי לאשר טוהר וחיוניות לפני ההשתלה.
  16. לאסוף תאים ממוינים ב-HBSS 1× סטרילי ולשמר אותם על קרח בחושך עד להשתלה.
    הערה: התפוקה הטיפוסית נעה בין כ-5.0–7.0 × 104 אבות המטופואטיים של Hoxb8 לכל הכנת כבד עוברי E12.5, בהתאם לגודל העובר וליעילות המיון. השתלת תאים חיים מטוהרים בהקדם האפשרי, רצוי תוך 60 דקות מהמיון.

6. הכנת מחטי הזרקה

  1. טעין נימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.58 מ"מ, עם פילמנט) לתוך מושך מיקרופיפטות.
  2. משיכת נימים באמצעות תוכנית משיכה דו-שורתית שמותאמת ליצירת מחטים ארוכות ומחודדות המתאימות להשתלת עור מוחי יילודה.
    1. הגדרות טיפוסיות כוללות: חום = 645, משיכה = 30, מהירות = 120, עיכוב = כיבוי ולחץ = 200. אופטימיזציה של ההגדרות הסופיות לסוג הזכוכית הספציפי, תנאי הסביבה וכיול המושך. לאחר מכן, גוזמים את המחטים המתקבלות ומעגלים אותן כדי ליצור קוטר קצה חיצוני סופי של כ-30 מיקרון.
  3. הנח את המחטים המושכות על שתי רצועות פלסטלינה בתוך צלחת פטרי פלסטיק גדולה כדי להגן על הקצוות מפני נזק לפני החיתוך וההטיה.
  4. מניחים את המחט שנמשכה מתחת למיקרוסקופ סטריאו ניתוח בהגדלה של כ-10×–20× ותמכו בה באמצעות תומך רך.
    הערה: הגדלה גבוהה יותר (20×–40×) עשויה לשמש במהלך בדיקת הקצה כדי לוודא את יצירת הטיפר הנכונה ולזהות פגמים לפני החיתוך והשיפוע.
  5. השתמש בלהב סכין סטרילי כדי לגזור את קצה המחט ולקבל קוטר חיצוני של כ-30 מיקרון.
  6. אבטח את המחט החתוכה במחזיק מיקרוגריינדר.
  7. כוון את זווית הזווית ל-30°–35°.
  8. הדלק את המטחנה והתאורה.
  9. אפשר למים מזוקקים לטפטף על אבן הטחינה בקצב קבוע של בערך טיפה אחת כל 4–5 שניות.
  10. הביאו את קצה המחט במגע עדין עם אבן הטחינה המסתובבת עד שנוצר קצה משופע.
  11. מדוד את הקוטר החיצוני של הקצה המשופע באמצעות מכשיר מדידת קצה כאשר הוא זמין.
  12. בחרו מחטים בקוטר חיצוני קרוב ל-30 מיקרון להשתלה.
  13. מלאו את המחט בבופר סטרילי ושחררו בעדינות נוזל כדי לוודא שהקצה פתוח וללא חסימה.

7. הכנת מכשיר ההזרקה

  1. הרכיבו פיפטה ידנית הנשלטת בפה המורכבת מצינורות גמישים, פיה, פילטר בקו ומחזיק נימים.
    הערה: מסנן אינליין משולב במערכת הפיפפטינג הנשלטת על ידי הפה כדי למנוע זיהום.
  2. סמן את המחט כל 2 מ"מ (עד 2 סימנים לכל מחט). כל 2 מ"מ מתייחס ל~2 מיקרוליטר.
  3. הכנס את מחט הזרקת הזכוכית המוכנה ~1.5 ס"מ לתוך מחזיק הקפילרי וודא שהמערכת בטוחה ואטומה לאוויר.
  4. הפעילו יניקה עדינה דרך הפיה כדי לוודא זרימת אוויר לא מופרעת והתנגדות נכונה.
  5. ודאו שהמערכת מאפשרת שליטה חלקה בשאיפה ובהזרקה לפני טעינת תאי תורם.
  6. מילאו מחדש את מחט הזרקת הזכוכית עם מתלה תא תורם מוכן (סה"כ 4.5 מיקרוליטר) באמצעות קצה פיפטה דק.
    הערה: ודא שלא יישארו בועות אוויר במחט לפני תחילת ההשתלה. השתמש במחט אחת לכל עכבר.

8. הרדמה של מקבלי יילודים והכנה לתחום הכירורגי

  1. ממקם את העכבר התינוק במצב שכיבה על שולחן הניתוח וגרם להרדמה באמצעות איזופלורן של 2.0%–5.0% המועבר בחמצן באמצעות מאדה מדויק.
  2. הניחו את אף העכבר בתוך קונוס אף כדי לשמור על אספקה רציפה של איזופלוראן וחמצן לאורך כל ההליך.
  3. יש להקדיש בערך דקה לאינסטזיה תוך מעקב אחר הנשימה.
  4. נגעו בעדינות בגפיים ווודאו היעדר רפלקס גמילה כדי לוודא הרדמה מספקת.
  5. לאחר השגת מישור הרדמה מתאים, יש להוריד את ריכוז האיזופלורן ל-0.5%–2.0% לצורך תחזוקה ולהמשיך בהרדמה עד 10 דקות במהלך הליך ההשתלה.
  6. שמרו על הטמפרטורות של כ-38 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום המונחת מתחת לשולחן הניתוח.
  7. נקה את אזור אתר ההזרקה בראש באמצעות החלפות מתחלפות של בטדין ואתנול 70% עם מטליות כותנה סטריליות.
  8. מרח שכבה אחרונה של בטאדין ומאפשר לעור להתייבש לפני ההזרקה.
    אזהרה: איזופלוראן הוא חומר הרדמה מסוכן. השתמשו במערכות הרדמה מתאימות ודאגו לאוורור מתאים בחדר, בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות.

9. ביצוע השתלות תוך-מוחיות יילודים

  1. ייצוב בעדינות את הראש באמצעות אצבעות מכוסות כפפות או תמיכה רכה כדי למזער תנועה במהלך ההזרקה.
    הערה: העכברים המקבלים מושתלים בין P1 ל-P4.
  2. זהה אתרי הזרקה דו-צדדית בתל האלנצפלון הדורסלי הקדמי (אזור הקורטקס הפרונטלי העתידי), כ-1–2 מ"מ לרוחב לקו האמצע הסגיטלי ומיד בזנב לפקעות הריח. מקמו את אתרי ההזרקה באופן סימטרי בכל חצי כדור תוך הימנעות מכלי דם גלויים על פני השטח.
    הערה: בשל הגולגולת הדקה והגודל הקטן של עכברים יילודים, ההזרקות מתבצעות באמצעות נקודות ציון אנטומיות חזותיות במקום קואורדינטות סטריאוטקסיות.
  3. בדקו את הגולגולת באופן ויזואלי והימנעו מהחדרת המחט בקרבת כלי דם גלויים.
  4. קדם בעדינות את המיקרופיפטה הזכוכית המשופעת דרך העור והגולגולת המתפתחת.
  5. הכוון את המחט כ-1–2 מ"מ מתחת לפני הגולגולת אל חצי הכדור הקדמי.
  6. להעביר תאי תורם באמצעות לחץ ידני מבוקר דרך מכשיר הפיפטה הנשלט בפה.
    הערה: בעת השתלת אבות המטופואטיים מטוהרים או מיקרוגליה ניאונטלית, הזרקו 2–3 מיקרוליטר להמיספרה, כלומר כ-2.5 ×-10-4 תאים בכל הזרקה. זה מספק כ-5 ×-10-4 תאים לכל מוח עכבר.
  7. למשוך לאט את המיקרופיפטה מהמוח כדי למזער את הריפלוקס של התאים שהוזרקו ולהפחית נזק לרקמות.
  8. בצע הזרקה נגדית.
    הערה: השתמש במחט אחת לכל עכבר כדי למנוע זיהום צולב בין העכברים.

10. יילודים שהושתלו בהחלמה

  1. מניחים כל גור על כרית חימום מיד לאחר ההליך.
  2. עקבו אחרי הגורים עד שצבע הגוף התקין, התנועה הספונטנית והפעילות הכללית יחזרו.
    הערה: זמן ההתאוששות נע בין 5 דקות ל-10 דקות.
  3. החזירו גורים לסם.
  4. שפשפו כל גור היטב עם מצעים לכלוב ביתי וחומרי קינון.
  5. החזירו את הגורים לכלוב עם האם.
  6. לאשר שהסמ אוסף ומקבל את הגורים שהוחזרו.

11. מעקב אחרי הבריאות לאחר הניתוח

  1. צפו בגורים מדי יום במשך 10 דקות בשלושת הימים הראשונים לאחר ההשתלה.
  2. הערך את הגורים לפעילות רגילה, התנהגות יניקה ואינטראקציה עם האם.
    הערה: אין להפריע לכלובי עכברים בזמן זה. זה יכול להעלות את העומס על הסכר.
  3. המשיכו לעקוב אחרי הגורים כל יומיים עד לגמילה לאחר תקופת 3 הימים הראשונים.
  4. העריכו גורים להתפתחות תקינה, התנהגות האכלה, רמת פעילות וטיפול אימהי.
  5. למדוד ולרשום את משקל הגוף מדי יום בתקופה המוקדמת שלאחר הניתוח.
  6. העריכו את הגורים לסימנים של מצוקה, יציבה לא תקינה, עייפות או הפרעה בהאכלה.
  7. לבצע המתת חסד הומנית במידת הצורך בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים.
    1. בעכברים יילודים, יש לבצע המתת חסד באמצעות מנת יתר של איזופלוראן באמצעות צנצנת פעמון או תא סגור דומה המצויד ברצפה מזויפת למניעת מגע ישיר עם ההרדמה. ברגע שהנשימה מפסיקה ומאומת היעדר רפלקסיות, יש לערוף את הראש מיד.
    2. בעכברים בוגרים, יש לבצע המתת חסד באמצעות 5% איזופלוראן המועבר בחמצן באמצעות אידוי מדויק עד שהנשימה מפסיקה ואישור היעדר רפלקסיה, ואחריה ניתוק צוואר הרחם כשיטה הפיזית המשנית להבטחת המוות.
      הערה: בעלי חיים שהראו תמותה לאחר ניתוח או היעדר השתלת תאי תורם ניתנת לזיהוי בנקודת הקצה הניסויית, הוצאו מהניתוח. הקלה לאחר הניתוח לא ניתנה משום שהשתלת תוך-מוח יילודים נחשבה למינימלית פולשנית.

12. איסוף רקמות מוח לצורך קריוסגרציה וצביעת אימונופלואורסצנציה

  1. הסר את המוח בזהירות והכן אותו לניתוח חתך קפוא.
  2. לעבד רקמת מוח לאחר הלידה לקריוסקציה ולחתוך חתכים קורונליים באמצעות קריוסטט לפי ההליכים שתוארו קודם.
    הערה: עבור כל עכבר מנותחים 9–12 חתכים קורונליים החוצים את הקורטקס הסומטוסנסורי.
  3. התקן חלקים על שקופיות מיקרוסקופ ואחסן אותם בטמפרטורה של מינוס 20°C עד לצביעה.
  4. דגרו חתכים קצרים בבופר חדירות המכיל 0.2% טריטון X-100 ו-1% נתרן דאוקסיכולאט.
  5. הכינו נוגדנים ראשוניים (תרנגול נגד GFP, 1:500; נוגדן אנטי-tdעגבניות לחזיר ניסיון, 1:250; ארנב אנטי-Iba1; 1:500) מדולל בבופר דילול נוגדנים מתאים.
  6. דגרו חתכי רקמה עם נוגדנים ראשוניים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  7. שטפו חלקים עם תמיסת מלח עם בופר פוספט כדי להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים.
  8. דגרו חתכים עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור (אנטי-ארנב לעזים Alexa Fluor 647, 1:500; אנטי-חזיר עזים Alexa Fluor 555, 1:500; אנטי-עוף עזים Alexa Fluor 488, 1:500) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך.
  9. מקטעי נגד-צבע עם DAPI כדי להמחיש גרעיני תאים.
  10. התקן מקטעים באמצעות מדיום הרכבה אנטי-פייד ומרח כיסוי זכוכית.

13. רכישת תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות

  1. לצלם תמונות פלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במטרות של 10× או 20× מטרות.
  2. רכוש תמונות ברזולוציה של 512 × 512 או 1024 × 1024 פיקסלים באמצעות מהירויות סריקה של 200–400 הרץ.
  3. אספו חתכים אופטיים עם מרווחי z-step של 2–5 מיקרון דרך הרקמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השתלה תוך-מוחית יילודה של אוכלוסיות מיקרוגליה מטוהרות מביאה להישרדות ארוכת טווח ולהשתלה נרחבת של תאים שמקורם בתורם בתוך הפרנכימת המוח של המקבל. אוכלוסיות מיקרוגליה של תורמים מטוהרים בודדו באמצעות מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה באמצעות מדווחי שושלת פלואורסצנטיים (מיקרוגליה Hoxb8 : tdTomato⁺ GFP⁺; מיקרוגליה שאינה Hoxb8 : tdTomato⁻ GFP⁺) לפני ההשתלה (איור 1A). לאחר השתלת תוך-מוחית יילודה, תאים שמקורם בתורמים שרדו לטווח ארוך והפגינו השתלה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השתלה תוך-מוחית יילודה של אבות מיקרוגליאליים מטוהרים או תת-אוכלוסיות מיקרוגליאליות מוגדרות מספקת גישה איתנה לשחזור מחלקת המיקרוגליה ב-vivo ולבחינת תכונות ייחודיות של שושלת של מקרופאגים במוח. שיטה זו מאפשרת בנייה מחדש סלקטיבית באמצעות תאי תורם מוגדרים גנטית, ומאפשרת הערכה ישירה של השתלת תאי תורם והבשלות בסביבת המוח.

יתרון מרכזי של אסטרטגיה זו הוא התאימות שלה למספר מקורות תורמים ומערכות מקבלים. במחקר זה ובעבודתנו הקודמת 8,17...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 MH093595) (M.R.C.), קרן משפחת דאוטן, ומתקן הזרימה הציטומטרית של אוניברסיטת יוטה. עכברי Csf1rΔFIRE נוצרו על ידי ד"ר בן שו מאוניברסיטת יוטה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bell jarVariousN/Aמשמש להמתת חיות ניסוי
Borosilicate glass capillaries with
filament		Sutter InstrumentBF100-78-15משמש למחטי הזרקה
Bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichA8806משמש להכנת מאגר PB. מותגים שונים זמינים. זה שרשום כאן הוא רק דוגמה.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222תאי מיאלואידיים
CD45 APCBioLegend103112תאי מערכת דם
Cell strainers (70 µm)Falcon352350משמש ליצירת השעיה של תא בודד. מותגים שונים זמינים. זה שרשום כאן הוא רק דוגמה.
Chicken anti-GFP antibodyAves LabsGFP-1020צביעת אימונופלואורסצנטית
c-Kit PE-Cy7 antibodyBioLegend105814מבשרי תאי דם
Confocal microscopeLeicaTCS SP5משמש להדמיית פלואורסצנציה
Conical tubes (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301עיבוד רקמות/תאים. מותגים שונים זמינים. זה שרשום כאן הוא רק דוגמה.
Cryostat machineLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/יצירת חתכי רקמות קפואים. מותגים שונים זמינים. זה שרשום כאן הוא רק דוגמה.
DAPI nuclear stainThermo Fisher ScientificD1306משמש לחיות ו
צביעת גרעין
Dissecting microscopeLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/משמש לחיתוך והכנת מחטי הזרקה. מותגים שונים זמינים. זה שרשום כאן הוא רק דוגמה.
FACSAria Flow Cytometer SorterBD BioscienceFACSAria טיהור תאים
Fc block (purified CD16/32)Biolegend101302חוסם קישור נוגדנים לא רצוי לתאי עכבר המבטאים קולטני Fc
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlמשמש במאגרים להכנת תאים. מותגים שונים זמינים. זה שרשום כאן הוא רק דוגמה.
Flexible tubing for mouth pipetteVariousN/Aמרכיב של מכשיר הזרקה ידני
Flow cytometry analysis softwareFlowJov10.8.1משמש לניתוח נתוני FACS
Flow cytometry cell sorterBD BiosciencesFACSAriaמשמש לטיהור תאים
gentleMACS Octo Dissociator with
heaters		Miltenyi Biotec130-096-427משמש להפרדה של רקמות מוח
Goat anti-chicken Alexa Fluor 488
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-11039נוגדן משני
Goat anti-guinea pig Alexa Fluor
555 secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-21428נוגדן משני
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 647
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-21245נוגדן משני
Goat anti-rat Alexa Fluor 647
secondary antibody		Thermo Fisher ScientificA-48265נוגדן משני
Guinea pig anti-tdTomato antibodyFrontier InstituteAB_2631185צביעת אימונופלואורסצנטית
Hanks’ balanced salt solution
(HBSS)		Gibco14175-079משמש במהלך הכנת תאים
HemocytometerVariousN/Aספירת תאים
Inline filter for mouth pipetteVariousN/Aמניעת זיהום
MicrogrinderNarishigeEG-400משמש לחידוד מחטי הזרקה מזכוכית
Micropipette pullerSutter InstrumentP-1000משמש ליצירת מחטי הזרקה דקות
Mouth pipette mouthpieceVariousN/Aמשמש לשליטה ידנית של
ההזרקה
Neural Tissue Dissociation Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628משמש להפרדה אנזימטית של רקמות מוח
Petri dishesThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022משמש לאחסון מחטים משוכללות או קצירת רקמות. מותגים שונים זמינים. זה שרשום כאן הוא רק דוגמה.
Rabbit anti-Iba1 antibodyWako019-19741סמן מיקרוגליה
Rabbit anti-TMEM119 antibodyAbcam209064סמן ספציפי למיקרוגליה
Rat anti-CD206 antibodyBioLegend141712משמש לזיהוי אוכלוסיות מקרופאגים
Rat anti-P2RY12 antibodyBioLegend848002סמן מיקרוגליה
Razor blades/scalpelsVariousN/Aמשמש לחיתוך קצות מחטים או
קצירת רקמות
RBC lysis bufferChemCruzsc-296258משמש להסרת תאי דם אדומים
Stereotaxic apparatusKopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com/

מקורות

  1. Rao Y, Bai Y, Li X, Du B, Peng B. The evolution of microglia replacement: A new paradigm for CNS disease therapy. Cell Stem Cell. 2025;32(12):1807-1832.
  2. Wu J, et al. Microglia replacement halts the progression of microgliopathy in mice and humans. Science. 2025;389(6756):eadr1015.
  3. Capotondo A, et al. Intracerebroventricular delivery of hematopoietic progenitors results in rapid and robust engraftment of microglia-like cells. Sci Adv. 2017;3(12):e1701211.
  4. Shibuya Y, et al. Treatment of a genetic brain disease by CNS-wide microglia replacement. Sci Transl Med. 2022;14(636):eabl9945.
  5. Mishra P, et al. Rescue of Alzheimer’s disease phenotype in a mouse model by transplantation of wild-type hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Rep. 2023;42(8):112956.
  6. Colella P, et al. CNS-wide repopulation by hematopoietic-derived microglia-like cells corrects progranulin deficiency in mice. Nat Commun. 2024;15(1):5654.
  7. Nemec KM, et al. Microglia replacement by ER-Hoxb8 conditionally immortalized macrophages provides insight into Aicardi-Goutières syndrome neuropathology. eLife. 2026;14:RP102900.
  8. Van Deren DA, et al. Defective Hoxb8 microglia are causative for both chronic anxiety and pathological overgrooming in mice. Mol Psychiatry. 2026;31(2):915-928.
  9. Sailor KA, et al. Hematopoietic stem cell transplantation chemotherapy causes microglia senescence and peripheral macrophage engraftment in the brain. Nat Med. 2022;28(3):517-527.
  10. Priller J, et al. Targeting gene-modified hematopoietic cells to the central nervous system: Use of green fluorescent protein uncovers microglial engraftment. Nat Med. 2001;7(12):1356-1361.
  11. Elmore MRP, et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 2014;82(2):380-397.
  12. Wilkinson FL, et al. Busulfan conditioning enhances engraftment of hematopoietic donor-derived cells in the brain compared with irradiation. Mol Ther. 2013;21(4):868-876.
  13. Mildner A, et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat Neurosci. 2007;10(12):1544-1553.
  14. Monje ML, Mizumatsu S, Fike JR, Palmer TD. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat Med. 2002;8(9):955-962.
  15. Lombroso SI, et al. Microglia replacement by peripheral delivery of CSF1R inhibitor-resistant hematopoietic cells. Mol Ther. 2026;34(2):850-866.
  16. Bennett FC, et al. A combination of ontogeny and CNS environment establishes microglial identity. Neuron. 2018;98(6):1170-1183.e8.
  17. De S, et al. Two distinct ontogenies confer heterogeneity to mouse brain microglia. Development. 2018;145(13):dev152306.
  18. Van Deren DA, et al. Defining the Hoxb8 cell lineage during murine definitive hematopoiesis. Development. 2022;149(8):dev200200.
  19. Nagarajan N, Capecchi MR. Optogenetic stimulation of mouse Hoxb8 microglia in specific regions of the brain induces anxiety, grooming, or both. Mol Psychiatry. 2024;29(6):1726-1740.
  20. Tränkner D, et al. A microglia sublineage protects from sex-linked anxiety symptoms and obsessive compulsion. Cell Rep. 2019;29(4):791-799.e3.
  21. Chen SK, et al. Hematopoietic origin of pathological grooming in Hoxb8 mutant mice. Cell. 2010;141(5):775-785.
  22. Foran DR, Peterson AC. Myelin acquisition in the central nervous system of the mouse revealed by an MBP-Lac Z transgene. J Neurosci. 1992;12(12):4890-4897.
  23. Dangata YY, Kaufman MH. Myelinogenesis in the optic nerve of (C57BL CBA) F1 hybrid mice: A morphometric analysis. Eur J Morphol. 1997;35(1):3-18.
  24. Rojo R, et al. Deletion of a Csf1r enhancer selectively impacts CSF1R expression and development of tissue macrophage populations. Nat Commun. 2019;10(1):3215.
  25. Askew K, et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 2017;18(2):391-405.
  26. Lund H, et al. Competitive repopulation of an empty microglial niche yields functionally distinct subsets of microglia-like cells. Nat Commun. 2018;9(1):4845.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

233233Hoxb8Hoxb8
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.