אינטראקציה בין תרופות בין יוגנול לרפגיליניד בסוכרת סוג 2 ומנגנון הפוטנציאל שלה

סיכום

מחקר זה נועד לבחון אינטראקציות אפשריות בין תרופות לתרופות בין אאוגנול (EUG) לרפגליניד (RPG) אצל חולים עם סוכרת סוג 2 (T2DM).

תקציר

מחקר זה חקר את האינטראקציה הפוטנציאלית בין תרופה לתרופה (DDI) בין אאוגנול (EUG) לרפגליניד (RPG) בסוכרת סוג 2 (T2DM). מודל חולדות עם סוכרת סוג 2 הוקם באמצעות דיאטה עתירת שומן וסטרפטוזוטוצין (STZ). קבוצת המנה היחידה קיבלה 0.4 מ"ג/ק"ג RPG, וקבוצות המתן המשותפות טופלו מראש ב-EUG (50, 100, 150 מ"ג/ק"ג) במשך שבעה ימים לפני קבלת מנה אחת של RPG (0.4 מ"ג/ק"ג). הפרמטרים של רמת הסוכר בדם והפרמקוקינטיקה של RPG הוערכו בדגימות הפלזמה של חולדות. השפעת EUG על יציבות מטבולית RPG ופעילות ציטוכרום P3A (CYP3A) הוערכה במיקרוסומי כבד של חולדות (RLM). בחולדות עם סוכרת סוג 2, טיפול ב-RPG הראה אפקט היפוגליקמי, שהוחזק עוד יותר על ידי מתן משותף של EUG באופן תלוי במינון (p < 0.001). מתן משותף של EUG השפיע על הפרמקוקינטיקה של RPG על ידי הגדלת השטח מתחת לעקומה (AUC, עלייה ב-88.64%, 164.59%, ו-244.72% לעומת RPG יחיד, p < 0.001), ריכוז מקסימלי בפלזמה (_{C מקסימלי}, עלייה ב-18.61%, 53.58%, ו-77.63% לעומת RPG יחיד, p < 0.01), ריכוז מרבי (T_{מקסימלי}, 1.0 שעות למתן משותף EUG לעומת 0.5 שעות ל-RPG יחיד), מחצית חיים (_חצי, ממושך 33.86%, 49.61%, ו-88.19% לעומת RPG יחיד, p < 0.01), זמן שמירה ממוצע (MRT, ממושך 17.62%, 26.42%, 44.04% לעומת RPG יחיד, p < 0.001), והפחתת שיעור הניקוי (Clz/F, ירידה של 48.92%, 63.31%, ו-74.10% לעומת RPG יחיד, p < 0.001) באופן תלוי במינון. Invitro מחקר RLM, EUG שיפר את היציבות המטבולית של RPG על ידי הארכת מחצית החיים (44.09 ± 3.25 דקות) והפחתת הפינוי הפנימי (30.55 ± 3.69 מיקרוליטר/דקה/מ"ג חלבון). EUG גם עיכב את פעילות CYP3A עם IC₅₀ של 7.90 ± 1.79 מיקרומון. מתן משותף של EUG קידם את ההשפעה ההיפוגליקמית של RPG על ידי הגברת החשיפה המערכתית ל-RPG בעכברי T2DM, ייתכן על ידי שיפור היציבות המטבולית של RPG ועיכוב פעילות CYP3A.

מבוא

סוכרת סוג 2 (T2DM) היא הפרעה מטבולית כרונית המאופיינת בעמידות לאינסולין או ביעילות אינסולין מופחתת, המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם¹. אינטראקציות מורכבות עם רגישות גנטית וגורמי אורח חיים מעורבות ב-T2DM, מה שמוביל לפגיעה בספיגת הגלוקוז, גלוקונאוגנזה כבדית מופרזת ודלקת כרונית בדרגה נמוכה². סוכרת סוג 2 יכולה להוביל לסיבוכים חמורים אם מטפלים בה בצורה לא נכונה, כולל מחלות לב וכלי דם, מחלות כליה, רטינופתיה ונוירופתיה, המשפיעות משמעותית על איכות החיים של המטופלים ומגבירות^{את שיעור} התמותה. הטיפולים התרופתיים הנוכחיים ל-T2DM כוללים מטפורמין, תרופות סולפונילאוריאה, אגוניסטים לקולטני GLP-1, ומעכבי DPP-4,^ועוד. רפגליניד (RPG) הוא סוג אחד של מגליטיניד קצר-טווח הפועל על ידי גירוי הפרשת אינסולין ויש לו מאפיין של גמישות במינון⁴. בהשוואה לסולפונילוריאות, גלינידים מציעים שליטה טובה יותר על היפרגליקמיה לאחר הארוחה, מפחיתים את הסיכון לתופעות לוואי מסוימות כמו היפוגליקמיה, ומציגים פרופיל בטיחות נוח יותר, במיוחד אצל חולים עם אי ספיקת כליות ^5,6. RPG נספג במהירות לאחר מתן דרך הפה, ומגיע לריכוזי פלזמה שיא בדרך כלל תוך 30–60 דקות, ומחצית החיים הקצרה שלו גורמת לגירוי קצר של שחרור אינסולין. קלינית, RPG משמש או כמונותרפיה או בשילוב עם תרופות אנטי-היפרגליקמיות אחרות דרך הפה לאופטימיזציה של שליטה גליקמית⁷. עם זאת, היישום הקליני שלו מוגבל בשל זמינות ביולוגית אורלית נמוכה (כ-56%), חילוף חומרים מהיר בכבד, וסיכון פוטנציאלי להיפוגליקמיה 8,9,10,11,12,13,14. חסרונות אלו מדגישים את הצורך באסטרטגיית טיפול מקיפה.

אוגנול (EUG), הידוע כימית בשם 4-אליל-2-מתוקסיפנול, הוא תרכובת אורגנית עם נוסחה כימית C₁₀H₁₂O₂¹⁵. EUG הוא נוזל חסר צבע עד צהוב בהיר והוא תרכובת פנולית פעילה הנמצאת בעיקר בציפורן (Eugenia caryophyllata Thunb.) ובצמחים ארומטיים אחרים¹⁶. תשומת לב רבה זכתה ל-EUG בשל תכונותיו הפרמקולוגיות השונות, כולל נוגדי חמצון, אנטי-דלקתיים, אנטי-בקטריאליים, משככי כאבים ופעילויות אנטי-גידוליות 17,18,19. מחקרים עדכניים הראו כי EUG הראה את הערך הפוטנציאלי כטיפול משלים ל-T2DM, שכן ראיות ניסיוניות הן במבחנה והן ב-in-vivo מצביעות על כך ש-EUG משפר את רגישות האינסולין, מקדם קליטת גלוקוז ברקמות היקפיות, מעכב גלוקונאוגנזה כבדית ומגן על תפקוד תאי β בלבלב ^20,21. מדדים מרובי פנים אלו, בשילוב עם רעילות נמוכה^{יחסית 22}, מציבים את EUG כמועמד תרופתי טבעי מבטיח מאוד שיכול להשלים את החסרונות של תרופות קליניות מסורתיות ולהקל על סיבוכים הקשורים ל-T2DM באמצעות מנגנון סינרגטי.

אנזימי הציטוכרום P450 (P450s) ממלאים תפקיד מרכזי בתהליך חילוף החומרים של התרופות ומתווך אינטראקציות תרופות-תרופות (DDIs) על ידי השראת או עיכוב תת-סוגים מסוימים, דבר החשוב ביותר לטיפול תרופתי בטוח ויעיל²³. ראוי לציין כי RPG עובר בעיקר מטבוליזם בכבד על ידי CYP2C8 ו-CYP3A4^24,25. כאשר ניתן במשותף עם קוורצטין (QCT), QCT משפר את הזמינות הביולוגית בתוך ה-vivo של RPG על ידי עיכוב מעבר ראשון כבדי ומטבוליזם מערכתי באמצעות CYP450s²⁶. דווח גם כי EUG מדכא את פעילותם של CYP450s, כולל 1A2, 2C9, 2D6 ו-3A4, באופן תלוי בריכוז, מה שמעיד על אינטראקציות פוטנציאליות כאשר EUG ניתן יחד עם תרופות המבוססות על ידי אנזימים^{אלו 27}. למרות הפוטנציאל המבטיח של EUG כטיפול משלים ל-T2DM והרגישות הידועה של RPG ל-DDI בתיווך CYP, עדיין לא ברור האם EUG משנה את החשיפה המערכתית, את היציבות המטבולית או את המטבוליזם המתווך על ידי CYP3A של RPG. בהינתן שגם EUG וגם RPG צפויים להיות ניתנים במשותף בפרקטיקה קלינית או בסביבות תוספי תזונה, היעדר נתוני DDI ביניהם מהווה סיכון פוטנציאלי לשינויים לא מכוונים בריכוזי הפלזמה של RPG. שינויים כאלה עלולים להוביל לירידה ביעילות הטיפולית או לעלייה בסיכון להיפוגליקמיה. לכן, פער הראיות הזה מהווה מכשול משמעותי לשילוב רציונלי ובטוח בין מוצרים טבעיים לתרופות אנטי-סוכרתיות קונבנציונליות. לכן, חיוני להעריך באופן שיטתי את השפעת EUG על הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של RPG ולהבהיר את המנגנון המטבולי הבסיסי, עם דגש מיוחד על פעילות CYP3A. בהתחשב בראיות הנ"ל, ניתן לשער כי EUG עשוי להשפיע על חילוף החומרים של RPG על ידי שינוי פעילות CYP450. זהו המחקר הראשון שחוקר את האינטראקציה בין EUG–RPG בסביבה של T2DM. הממצאים צפויים למלא פער ידע קריטי ולספק בסיס מכני לאופטימיזציה של ניהול משותף בטוח של EUG ו-RPG בניהול T2DM. אם נלקח בחשבון מתן משותף, יש לשקול את הפוטנציאל לחשיפה מוגברת ל-RPG, ויש לעקוב אחר סימני היפוגליקמיה, במיוחד כאשר נלקחים EUG במינונים גבוהים או כתוסף מרוכז. בנוסף, אף על פי שחולדות מבטאות איזופורמי CYP3A המקבילים פונקציונלית ל-CYP3A4 האנושי, הערכה ישירה של ממצאים כמותיים לבני אדם דורשת זהירות בשל הבדלים בין מינים בביטוי אנזימים ובפעילות קטליטית.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה של ג'ילין (תאריך: 2024.11.21/מס' 2024112) בהתאם להנחיות ARRIVE²⁸. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. תנאי מגורים לבעלי חיים

זכרים של חולדות ספרג-דולי (200–250 גרם) הוחזקו בחדר בעלי חיים במעבדה בתנאים הבאים: טמפרטורה: 22 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 40–60%, ומחזור אור/חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית למזון ומים לאפשר שבוע של הסתגלות^29.30.

2. מידול, טיפול ועיבוד דגימות של בעלי חיים

גודל המדגם נקבע בהתבסס על ניתוח עוצמה באמצעות מבחן F (G*Power 3.1.9.7). בוצע ניתוח הספק מראש עם גודל אפקט של 0.6, רמת α של 0.05, והספק רצוי של 0.8, מה שהניב גודל מדגם כולל של 55. חישוב זה הצביע על כך שלפחות 9 חולדות נדרשות בכל קבוצה. לכן, נעשה שימוש בעשרה חולדות לכל קבוצה, והשיגו עוצמה ממשית של 0.86.

לפני שהוקם מודל T2DM, כל העכברים היו בצום של 12 שעות. לאחר מכן הם חולקו באקראי לשתי קבוצות: קבוצת הביקורת (n = 10) וקבוצת T2DM (n = 50). הקמת מודל העכברושים T2DM בוצעה לפי השיטה שדווחה קודם^{לכן ב-31}. בקיצור, חולדות בקבוצת T2DM קיבלו תזונה עתירת שומן (עם תכולת שומן של 60%) במשך 4 שבועות רצופים, ולאחר מכן קיבלו הזרקה תוך-צפונית אחת של 30 מ"ג/ק"ג של STZ מומס בבופר ציטראט סטרילי (pH 4.4). שלושה ימים לאחר הזרקת STZ, נמדדה רמת הסוכר בווריד הזנב של החולדות באמצעות מד סוכר בדם, וחולדות עם ריכוז סוכר בדם מעל 16.7 mmol/L נחשבו כמי שהצליחו לבסס את ה-T2DM. בקבוצת הביקורת, העכברים קיבלו תזונה תקינה וקיבלו זריקות תוך-פריטונאליות של 0.9% תמיסת מלח תקינה באותו פרק זמן כמו קבוצת T2DM.

חולדות T2DM חולקו לארבע קבוצות עם 10 חולדות בכל קבוצה: קבוצת T2DM + RPG (RPG יחיד), קבוצת T2DM + RPG + EUG (50 mg/kg) (co-RPG+EUG 50 mg/kg), קבוצת T2DM + RPG + EUG (100 mg/kg) (co-RPG+EUG 100 mg/kg), וקבוצת T2DM + RPG + EUG (150 mg/kg) (co-RPG+EUG 150 mg/kg). לאחר צום של 12 שעות, חולדות בקבוצת ה-RPG היחידה קיבלו דרך הפה 0.4 מ"ג/ק"ג RPG (תלוי במי מלח רגילים) באמצעות מחט גבאג'²⁶. חולדות בקבוצות co-RPG+EUG קיבלו אוראלית 50, 100 ו-150 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, פעם ביום במשך שבעה ימים רצופים, וביום השמיני, לאחר תקופת צום נוספת של 12 שעות, קבוצת הטיפול המשותפת קיבלה בנוסף 0.4 מ"ג/ק"ג RPG באמצעות ניתוח תוך-קיבה. בהמשך, נבדקו פרמטרי סוכר בדם באמצעות דגימות דם שנאספו מהווריד הזנב.

לצורך ניתוח פרמקוקינטי, דגימת הדם (0.2 מ"ל) נאספה מקלקסוס הוורידי האחורי של העכברים אל צינורות המיקרוצנטריפוגה ההפאריניים בנקודות זמן שונות (0.25 שעות, 0.5 שעות, 1 שעות, 2 שעות, 4 שעות, 6 שעות ו-8 שעות לאחר המנה). לאחר האיסוף, הדגימות עברו צנטריפוגה (1500 × גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס) כדי להפריד את הפלזמה (צהוב בהיר, שקוף), שנשמרה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. דגימות הפלזמה נותחו לאחר מכן לריכוז RPG באמצעות שיטת HPLC שתוארה בשלב 4.

3. מחקר מטבוליזם במיקרוזומי כבד חולדה מאוחדים

כדי לחקור את המנגנון שמאחורי השינויים הפרמקוקינטיים ב-in-vivo , הוערכה השפעת EUG על היציבות המטבולית של RPG ופעילות CYP3A ב-RLM. RPG (3 מיקרומון) דוגר עם או בלי EUG בבופר PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנפח כולל של 200 מיקרוליטר, כולל RLM (0.5 מ"ג/מ"ל חלבון מיקרוסומלי) ומערכת רגנרציה של NADPH (1.3 מ"מ NADP, 3.54 מ"מ גלוקוז 6-פוספט, 0.4 U/mL גלוקוז 6-פוספט דה-הידרוגנאז, ו-3.3 מ"מ מ"מ MgCl₂). לאחר פרה-אינקובציה של 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא NADPH, התחילה התגובה על ידי הוספת מערכת ההתחדשות של NADPH. התערובת נדגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים רועד. בנקודות זמן דגירה שונות (0 דקות, 5 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 45 דקות, 60 דקות), נאספו דגימות של 30 מיקרוליטר והועברו לצינור מיקרוצנטריפוגה עם אצטוניטריל קר כקרח לסיום התגובה. הדגימות עברו צנטריפוגה (12000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס) כדי לקבל את הסופרנטנט (נקי). הסופרנטנטים שהתקבלו נותחו לאחר מכן לריכוז RPG באמצעות אותה שיטת HPLC שתוארה בשלב 4.

4. ניתוח HPLC

ריכוז ה-RPG בפלזמה (משלב 2) ובדגירות מיקרוזומליות (משלב 3) נותח באמצעות שיטת HPLC שדווחה על ידי קים ואח' ²⁶. שלבי הפעולה הספציפיים הם כדלקמן: דגימות (120 מיקרוליטר) מעורבבות עם 300 מיקרוליטר אצטוניטריל המכיל קטוקונאזול (תקן פנימי, 100 ng/mL) להשגת משקעים חלבונים. לאחר מכן, התערובת עברה מערבולת וצנטריפוגה בטמפרטורה של 15,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט הועבר לצינור צנטריפוגה מיקרוטור והתאדה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של חנקן. השאריות לאחר הייבוש הומסו מחדש בפאזה ניידת של 50 מיקרוליטר, ואז הועברו מערבולת וצנטריפוגה. לאחר מכן, 40 מיקרוליטר של הסופרנטנט הוזרקו לעמוד ה-HPLC (250 מ"מ × 4.6 מ"מ, גודל חלקיקים 5 מיקרון). העמוד הוחלף בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במצב שחרור איזוקרטי עם בופר פוספט של 10 מ"מ (pH 6.0) ואצטוניטריל (יחס נפח 46.4:53.6), עם קצב זרימה של 1 מ"ל לדקה. האלואנט נוטר באמצעות גלאי פלואורסצנציה עם אורך גל עירור של 240 ננומטר.

5. ניתוח סטטיסטי

תוכנת ניתוח פרמקוקינטי שימשה לחישוב פרמטרים פרמקוקינטיים, כולל AUC,_{C max}, T_max, t_1/2, MRT ופינוי. תוכנות ניתוח סטטיסטי וגרפים שימשו ליצירת איורים וניתוח נתונים. כל הנתונים הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ±. ההבדלים בין הקבוצות נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני (להשוואות רמות גלוקוז) או ANOVA דו-כיווני (להשוואות פרמטרים פרמקוקינטיים), לפי הצורך, ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי להשוואות מרובות. השפעת EUG על פעילות CYP3A הוערכה באמצעות ניתוח רגרסיה לא ליניארית. ערך p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

מחצית החיים של EUG על יציבות מטבולית RPG ב-RLM חושבה על ידי:
t_1/2 (מינימום) = 0.693 לליטה(C_t/C₀ × 100).

קצב ניקוי פנימי (μL/min/mg חלבון) = v × 0.693/t_1/2;
v (μL/mg) = נפח דגירה/ריכוז חלבון.

תוצאות

EUG קידם את ההשפעה ההיפוגליקמית של RPG בעכברי T2DM
רמת הסוכר בדם בחולדות בקבוצת T2DM עלתה (p < 0.001, רווח בר-סמך 95%: -13.90~-11.32) בהשוואה לקבוצת הביקורת, מה שמעיד על ההובלה המוצלחת של מודל T2DM (איור 1A). מתן RPG יחיד דיכא את רמת הסוכר בדם בעכברי T2DM (p < 0.001, רווח בר-סמך 95%: 5.26~7.84). מתן משותף של RPG ו-EUG הפחית עוד יותר את רמת הגלוקוז בעכברי T2DM בהתאם למינון EUG (p < 0.001, רווח בר-סמך 95% ל-EUG 50...

דיון

T2DM היא מחלה מטבולית כרונית שדורשת טיפול ממושך, ומטופלים לעיתים קרובות נדרשים לקחת מספר תרופות בשל מחלות רקע כמו מחלות לב וכלי דם^ומחלת כליות. הסיכון ל-DDI עולה משמעותית עם מתן משותף של התרופה, שכן הוא עלול להשפיע על ספיגה, מטבוליזם או יעילות של תרופות היפוגליקמיות, מה שעלול להוביל לסיכונים חריפים כמו תרדמת היפוגליקמית ורמות סוכר לא מבוקרות^{בדם 33}. היא עלולה גם להחמיר נזק לאיברים ולהאיץ את התקדמות הסיבוכים³⁴. לכן, הער...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אצטוניטריל	Merck, גרמניה	34851	≥99.9%
עמוד כרומטוגרפיה	Phenomenex, ארה"ב	00G-4041-E0	250 מ"מ × 4.6 מ"מ, גודל חלקיק 5 μמ
DAS	בייג'ינג בוז'יין, סין	-	3.0
EUG	MUST ביו-טכנולוגיה, סין	A0074	טוהר ≥99%
GraphPad Prism	GraphPad Software, ארה"ב	-	9.0.0
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים	Shimadzu Corporation, יפן	228-45147-42	RF-20A
קטוקונזול	Merck, גרמניה	K1003	טוהר 99.0-101.0%
חולדות ספרג דאולי מזכר	מרכז בעלי חיים בשנחאי, סין	-	200–250 גרם
NADPH	Merck, גרמניה	10107824001	97% (משקל יבש)
מד גלוקוז בדם OneTouch Ultra2	Life Scan Inc., ארה"ב	https://shop.onetouch.com/onetouch-sup-reg-sup-ultra-sup-reg-sup-2-meter/product/OTSUS05_0019	-
PBS	Merck, גרמניה	P4474	ph 7.4
RLM	Merck, גרמניה	M9066	-
RPG	Merck, גרמניה	R9028	טוהר ≥98%
STZ	Merck, גרמניה	S0130	≥98% (HPLC)
EUG, אוגנול; RPG, רפגליניד; RLM, מיקרוזומים מכבד עכברוש; NADPH, β-ניקוטינאמיד אדנין דינקלקטופן פוספט; STZ, סטרפטוזוטוצין; PBS, מלח זרחן מאוזן בחומצה פוספטית.