ייצוב חלבון וחלבון—עיבוי RNA בהידרוג'לים אגרוזיים בעלי התכה נמוכה למדידות ביופיזיקליות כמותיות

סיכום

כאן אנו מציגים שיטה חזקה לשיתוק פיזי של עיבוי נוזל-נוזל מופרד בפאזה בתוך מטריצת אגרוז הידרוג'ל נקבובית ובעלת התכה נמוכה, מבלי להפריע לדינמיקת הנוזל הפנימית שלהם. הגישה ממזערת את השקיעת טיפות, התלכדות וארטיפקטים של הרטבת משטחים, ומאפשרת הדמיה שכפולה וניתוח ביופיזי כמותי לאורך שעות.

תקציר

עיבויים ביומולקולריים הנוצרים מהפרדת פאזה נוזלית-נוזלית מוכרים יותר ויותר כיחידות ארגוניות בסיסיות של התא, עם תפקידים הנעים מעיבוד RNA ועד להרכבת גרגירי מתח. שיקום חוץ גופני של עיבויים כאלה באמצעות חלבונים ו-RNA מטוהרים מספק מערכות מודל, אך טיפות נוזליות גסות, משקעות ומתפשטות על פני השטח לאורך זמן, מה שמכניס שונות משמעותית למדידות כמותיות לאורך מסגרות ניסוי. הטמעת עיבויים אלה בתוך הידרוג'ל דליל, שקוף אופטית וכימי אינרטי — כאן מאגרוז מותך נמוך (LMA) ב-0.3–1.0% w/v — מייצבת את הטיפות בתלת-ממד, ומאפשרת שימוש בשיטות עם זמני מדידה ארוכים יותר או מערכות ניסוי עם מדידות חזרתיות. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט, שלב אחר שלב, להכנת מלאי LMA, היווצרות טיפות והטמעה, ומספק דוגמאות לקריאות ביופיזיקליות ספציפיות במורד הזרם. אנו גם מראים כי תכונות טיפות ספציפיות, כגון דיפוזיה מולקולרית, נשמרות לאחר הטמעת LMA במערכות המייצגות שנבדקו. מכיוון שהשיטה תואמת למיקרוסקופיה קונפוקלית, רחבת שדה או סופר-רזולוציה, התאוששות פלואורסצנציה לאחר הלבנת פוטו, או ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית, בין היתר, היא יכולה לתמוך באפיון כמותי של עיבויים ביומולקולריים הרלוונטיים לבריאות ומחלות.

מבוא

הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) מניעה את היווצרות אברונים חסרי ממברנה וקונדנסטים ביומולקולריים בתאים, כולל גרגירי מאמץ, גופי P וגרעין 1,2,3,4,5. עיבויים אלו מרכזים חלבונים וחומצות גרעין ספציפיות תוך שמירה על חילוף מהיר עם הציטופלזמה או הנוקלאופלזמה שמסביב – סימן היכר של התנהגות נוזלית 1,2,3,4,5. חוסר ויסות של LLPS נקשר למחלות שונות, כגון הפרעות ניווניות נוירודגנרטיביות ^3,6,7, והוא גם מעורב בשכפול של מספר וירוסים, כמו SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12.

שיקום מעבים במבחנה באמצעות חלבונים מטוהרים ו-RNA בתנאי בופר מוגדרים הפך לגישה יסודית לחקר מנגנוני LLPS ^3,4. עם זאת, טיפות במבחנה או על משטח זכוכית רגישות לשלושה ממצאים עיקריים: (i) שקיעה כבידתית, שגורמת לטיפות להצטבר בתחתית; (ii) התלכדות, שבה הטיפות מתמזגות עם הזמן למבנים קטנים וגדולים יותר; ו-(iii) הרטבה על פני השטח, שבה טיפות מתפשטות וסופגות חלקית על הכיסוי. תופעות אלו מפחיתות את השחזוריות של מדידות כמותיות ומקשים על מעקב אחר טיפות בודדות במידות הפיזיולוגיות^{הרלוונטיות} שלהן. תופעות אלו מגבילות עוד יותר את השימוש בשיטות שדורשות זמני מדידה ארוכים של דקות עד שעות (למשל, ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית [NMR] או טכניקות מיקרוסקופיה ברזולוציה על-גבוהה כמו STORM) ואוסרות מדידות חוזרות לאורך טווחי זמן ממושכים.

קיבוע פיזי בתוך רשת הידרוג'ל מטפל בכל שלושת הממצאים בו-זמנית. אגרוז יוצר ג'ל משולב פיזית בטמפרטורות מתחת ל-34–38 מעלות צלזיוס. בריכוזים של 0.3–1.0% w/v, גודל הרשת של האגרוז גדול מספיק כדי להכיל טיפות בקנה מידה מיקרומטר שלמים, תוך שמירה על נקבובי מספיק כדי לא להפריע לדינמיקה המולקולרית התוך-טיפה¹³. בנוסף, הנקבוביות של מטריצת האגרוז מאפשרת דיפוזיה של מקרומולקולות ומולקולות קטנות פנימה והחוצה מהטיפות הטבועות. למערכות רגישות במיוחד לטמפרטורה הכוללות חלבונים עם דומיינים מקופלים או לפי הפרדת פאזה בטמפרטורת תמיסה קריטית עליונה/נמוכה (UCST/LCST), ניתן להשתמש באגרוז עם התכה נמוכה (LMA) עם נקודת ג'לינג של 26–30 מעלות צלזיוס. גישות חלופיות נגד רטבות, כמו פסיבציה על פני השטח, יכולות להפחית את ההיצמדות של העיבוי וכך להרטבות, אך לעיתים דורשות הכנה מיוחדת ואינן מונעות שקיעת טיפות או התלכדויות. לעומת זאת, הטמעת אגרוזות מספקת שיטה פשוטה ונגישה לקיבוע מרחבי של עיבויים. חשוב לציין, האגרוז אומת כי אינו מפריע למצב הקונפורמציה של המיזוג בסרקומה (FUS) וחלבונים אחרים הקשרים ל-RNA בעת יצירת טיפות עד לריכוזי אגרוז של 1.0% w/^{v 13}. פרוטוקול זה מתקן את גישת ההטמעה של אגרוז לשימוש כללי עם מערכות רבות של חלבונים או RNA מפרידות פאזה, ומספק הנחיות שלב אחר שלב להכנת תגובות והכנת דגימה.

פרוטוקול

1. הכנת ציר האגרוז

חשוב: הכינו את מאגר האגרוז באותו בופר שבו נעשה שימוש בדגימות המופרדות בפאזה (להלן "בופר טיפות") כדי למנוע אי-התאמה בבופר¹⁴. דוגמה: דגימת הנוקלאוקפסיד מוכנה בבופר A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2), שיש להשתמש בו גם להכנת מאגר האגרוז.
הערה: תנאי הניסוי הסופיים, כולל אך לא מוגבל להרכב הבופר, ריכוז החלבונים, השימוש בתוספים ונפחי דגימה סופיים, תלויים במידה רבה במערכת הביולוגית הספציפית הנחקרת וביישום הספציפי במורד הזרם. באופן דומה, פרמטרי רכישה, הגדרת המכשירים וניתוח הנתונים תלויים מאוד בדגימה ובניסוי הספציפי. לדוגמה, הכנת הנוקלאוקפסיד SARS-CoV-2 עם פולי(A) מתוארת באיור 1A (מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית).

1. שקלו את הכמות המתאימה של LMA או אגרוז רגיל לצינור של 1.5 מ"ל המכיל בופר טיפות. דוגמה: למלאי של 2% ללא חוץ, המיס 20 מ"ג אגרוז ב-1 מ"ל של בופר A.
   הערה: ריכוז האגרוז הסופי צריך להיות 1–2% w/v, בהתאם לריכוז הסופי הרצוי של האגרוז בדגימה. חריגה מ-2% w/v אינה מומלצת כי זה נעשה קשה יותר ויותר לבצע פיפט. חתכו את הקצה הצר של קצה הפיפטה כדי להקל על פיפטינג, במיוחד באחוזי אגרוז גבוהים. עיינו בסעיף הדיון כדי לקבוע אם נדרש LMA או אגרוז רגיל לדגימות.
2. חממו את האגרוז לטמפרטורה של 80–90 מעלות צלזיוס בבלוק חימום או באמבט מים וממיסים את האגרוז במלואו באמצעות מערבולת (כ-10 דקות).
   אזהרה: אגרוז מותך חם. תטפל בזהירות.
3. איזון את מאגר האגרוזות ל-37 מעלות צלזיוס (LMA) או 55 מעלות צלזיוס (אגרוז רגיל) בבלוק חימום או באמבט מים. ודאו שהתמיסה נשארת צלולה ונוזלית בטמפרטורה זו. בדוק את טמפרטורת ציר האגרוז עם מדחום במידת הצורך.
   נקודת הפסקה: ניתן לשמור על מלאי אגרוז מותכים חמים למשך 30–60 דקות.
   חימום האגרוז באמבט מים מומלץ בחום כדי להבטיח חימום הומוגני יותר ולשמור על טמפרטורת היעד בדיוק מספק. זה חשוב במיוחד בעבודה עם LMA, שכן סטיות קטנות בטמפרטורה עלולות לגרום לג'לציה מוקדמת.
4. לאחר הכנת הדגימה (סעיף 2), יש לאחסן את שאריות האגרוז בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס. עקבו אחרי השלבים 1.2 ו-1.3 למעלה כדי להמיס מחדש ולאזן מחדש את מאגר האגרוז לפני השימוש.
   הערה: אנו ממליצים להשאיר את ציר האגרוז למשך מקסימום של שבועיים בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס, ולחשוף אותו ליותר מ-2–3 מחזורי התכה/התכה. השתמש בשיטות ייצור טובות כדי למנוע זיהום. יש להשליך את המלאי מוקדם יותר אם הם לא נמסים מחדש או מתקשבים מחדש, או אם מתרחש זיהום גלוי.

2. הכנת דוגמאות

1. חממו מראש את כל החומרים שבאים במגע ישיר עם האגרוז (למשל, קצות פיפטות, צינורות, שקופיות מיקרוסקופיה) לטמפרטורה של כ-37 מעלות צלזיוס על ידי הנחתם על בלוק החימום או בדוגמה למשך 2–3 דקות.
2. הכינו את מלאי האגרוזים כפי שמפורט בסעיף 1.
3. הכינו בופר טיפות, רכיבים מפרידים פאזה (למשל, מלאי חלבון או RNA), וכל תוסף אחר (כגון חומרי צפיפה, צבעים) לדגימות בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי. איזון לטמפרטורת החדר (RT). דוגמה: בופר A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2), מלאי חלבון נוקלאוקפסיד (60 מיקרומון, בבופר A), מלאי poly(A) (30 מיקרומטר, בבופר A).
   הערה: לצורך שיקום פלואורסצנציה לאחר הלבנת פוטו-(FRAP), מיקרוסקופ פלואורסצנציה קונפוקלי, או מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), הוסף חלק קטן של חלבון או RNA מסומנים פלואורסצנטית למאגרי החלבון או ה-RNA, בהתאמה (מומלץ: <חלק מסומן 5%).
4. חשב את נפחי בופר הטיפות, מאגר האגרוז, רכיבי הפרדת פאזה (למשל, חלבון או RNA רלוונטי), וכל תוספים משלימים (למשל, סוכני צפיפה) הנדרשים לדגימה. דוגמה: 6 מיקרוליטר של בופר A, 5 מיקרוליטר של 2% אגרוז (סופית 0.5%), 5 מיקרוליטר של חלבון נוקלאוקפסיד (15 מיקרומולר אחרונים), 4 מיקרוליטר פוליאקפסיד (6 מיקרומולר סופי). כרך סופי 20 מיקרוליטר.
   הערה: למרות שהנפחים הנפוצים תלויים מאוד בצלחת, צינור, לוח או כלי אחר ששימשו לניסוי, הם 150 מיקרוליטר לצינור NMR בקוטר 3 מ"מ, 20 מיקרוליטר למיקרוסקופיה או ניסויי FRAP בשקופית מיקרוסקופית 6 ערוצים, ו-20–30 מיקרוליטר לניסויי STORM בשקופיות מיקרוסקופ של 18 בארות (ראו טבלת החומרים).
   1. כערכי התחלה, יש להשתמש ב-0.3–0.5% w/v אגרוז סופי לבדיקות ביופיזיקליות סטנדרטיות, וב-0.8–1.0% w/v לייצוב ארוך טווח (למשל, ניסויי הזדקנות).
      הערה: לייצוב ואחסון ממושכים של דגימות יש לנקוט צעדים למניעת התייבשות דגימות (למשל, אטימת מיכל הדגימה, אחסון בתא לח והוספת מחסום אידוי) ולהבטיח שהרכב הבופר וה-pH יישארו יציבים במהלך דגירות ממושכות.
   2. לדגימות NMR, הוסף 5% v/v D2O סופי לדגימה לצורך נעילה.
      הערה: ריכוז כל שאר הרכיבים ונפח הדגימה הכולל תלויים במידה רבה ביישום הספציפי ובמבנה הניסוי.
5. הוסף את נפחי הבופר, רכיבים מפרידים פאזה, ציר אגרוז ותוספים לצינור מחומם מראש בנפח 1.5 מ"ל.
   הערה: אנו ממליצים להוסיף קודם את הבופר והאגרוז, ואחר כך להוסיף תוספים משלימים. אנו ממליצים להוסיף את רכיבי הפרדת הפאזה האחרונים כדי להפעיל את היווצרות העיבוי. עם זאת, סדר הערבוב האופטימלי תלוי במערכת ויש לקבוע אותו מראש. דבר זה רלוונטי במיוחד למערכות שבהן סטויכיומטריה וסדר החיבור יכולים להשפיע באופן משמעותי על גודל הטיפות או על חלוקת האזור. דוגמה: סדר הערבוב של דגימת הנוקלאוקפסיד הוא ראשון בופר A, מלאי אגרוז שני, חלבון נוקלאוקפסיד שלישי, ואחרון poly(A), תוך שימוש בנפחים שצוינו בשלב 2.4. בדגימה זו, LLPS מופעל על ידי הוספת poly(A). במערכות שבהן LLPS מייצר עכירות נראית לעין, עכירות יכולה לשמש כמדד איכותני לבקרת איכות; עם זאת, זמן ההתחלה והנראות תלויים במערכת, והיעדר עכירות מיידית אינו מעיד בפני עצמו על כשל בפרוטוקול.
   1. השאירו את הצינור בבלוק החימום או באמבט המים בזמן שאתם עולים ויורדים כמה פעמים. הימנעו מהחדרת בועות אוויר.
      הערה: בעוד שהאגרוז עדיין נוזלי, הטיפות יכולות להתמזג. לכן, שינוי זמן הדגירה על בלוק החימום או באמבט מים לפני תחילת הג'לציה יכול להיות כלי שימושי לחקירת טיפות בגדלים שונים. אפיון קינטיקת צמיחת הטיפות בהיעדר אגרוז לפני בחירת מרווח הזמן לפני הדגירה מאפשר לחוקרים למקד באופן שכפולי טווח גודל טיפות מסוים.
6. לדגימות מיקרוסקופיה / FRAP:
   1. השתמשו בפיפטה רגילה כדי להעביר במהירות את הדגימה אל או אל שקופית המיקרוסקופיה המועדפת (למשל, סלייד מיקרוסקופיה ערוצית עם תחתית כיסוי).
   2. אפשר ג'לציה ב-RT למשך 5–10 דקות (ראו הערה בסעיף הדיון).
      הערה: אל תזיז את שקופית המיקרוסקופיה בתקופה זו. הגן על דגימות פלואורסנט מאור.
   3. למדוד את הדגימה לפי הפרוטוקול הסטנדרטי. דוגמה: מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב, מטרת שמן APO ב-100x 1.45 plan, אורך גל עירור 561 ננומטר לצבע Cy3, רכישה של 100 מילישניות בעוצמת לייזר 30% (Cy3) ו-50 מילישניות בעוצמת אור 6% (שדה בהיר). ל-FRAP: אזור ההלבנה 1/10^מקוטר הטיפה ממוקם במרכז הטיפה, 25 מסגרות פרה-אקונומיקה (רכישה ללא עיכוב), 60 פריימים לאחר ההלבנה (נלקחו במרווחים של 1 שנייה), פולס לייזר להלבנה 15 מילישניות בעוצמת לייזר של 70%. לנתח את שחזור ה-FRAP באמצעות נרמול בקנה מידה מלא בתוכנות גישה פתוחה; יש לדווח על פרמטרי התאמה קינטית רק אם בוצעה התאמה.
7. לדגימות STORM:
   1. השתמש בפיפטה רגילה כדי להעביר במהירות את הדגימה למחסנית STORM המועדפת (למשל, סלייד תא עם 18 בארים עם תחתית כיסוי). חלק את הדגימה כטיפה.
   2. אפשר ג'לציה ב-RT למשך 5–10 דקות (ראו הערה בסעיף הדיון).
      הערה: אל תזיז את שקופית המיקרוסקופיה בתקופה זו. הגן על דגימות פלואורסנט מאור.
   3. מלאו את כל הבאר בבופר STORM. אטום את הבאר לפי הפרוטוקול הסטנדרטי.
   4. יש לאזן את הדגימה לפחות לשעה עד שעתיים לפני המדידה כדי לאפשר לבופר STORM להשתלב אל תוך ההידרוג'ל של האגרוז.
      הערה: דיפוזיה מוצלחת של בופר STORM אל תוך הדגימה ניתנת לאימות בקלות אם הצבעים הפלואורסצנטיים מהבהבים במהלך רכישת STORM. בהתאם למפרטי המדגם, ייתכן שיהיה צורך בזמני איזון ארוכים יותר.
   5. מדוד את הדגימה לפי הפרוטוקול הסטנדרטי. דוגמה: מיקרוסקופ הפוך Ti2, SR אפוכרומט TIRF 100x 1.49 שמן אובייקטיבי, תאורה דקה עם נטייה גבוהה. רכישת 20,000 פריימים לדגימה, שדה ראייה 64 x 64 פיקסלים, זמן חשיפה של 10 מילישניות עם לייזר 647 ננומטר של 125 mW לצבע Cy5, ושימוש בלייזר 20 mW 405 ננומטר לסיוע במעבר מהמצב האפל ארוך החיים למצב היסוד. התמונות עובדו באמצעות הערכת סבירות מקסימלית עם התאמת ריבוי מפיצים. בוצעה תיקון סטייה, ורק נקודות נתונים עם דיוק לוקליזציה של 25 ננומטר ומעלה נכללו בוויזואליזציה הסופית. התמונות הסופיות מופקות באמצעות שיטת היסטוגרמות ממוצעות בהגדלה של פי 20 (פיקסל אחד = 8 ננומטר בתמונה הסופית).
8. לדגימות NMR:
   1. השתמש בפיפטה זכוכית ארוכה ודקה (מחוממת מראש) כדי להעביר במהירות את הדגימה לצינור ה-NMR. תחלק את הדגימה בתחתית הצינור.
   2. אפשר ג'לציה ב-RT למשך 5–10 דקות (ראו הערה בסעיף הדיון).
      הערה: אל תנער את צינור ה-NMR בתקופה זו.
   3. מדוד את הדגימה לפי הפרוטוקול הסטנדרטי. דוגמה: עוצמת שדה של NMR 750 MHz עם גלאי טמפרטורת חדר PATXI, צינור 3 מ"מ, רכישה ב-25 מעלות צלזיוס, רצף פולסים סטנדרטי (stebpgp1s19) לניסויי דיפוזיה (DOSY), פרמטרים: 4,096 נקודות עם 32 סריקות, עוצמת שיפוע 2–95%, זמן דיפוזיה 0.08 שנייה, פולס גרדיאנט 12 מילישניות, עיכוב הרפיה (d1) 5 שניות.

תוצאות

הפרוטוקול יושם על עיבויים שנוצרו על ידי תחום N-טרמינל של FUS (FUS NTD) או על ידי חלבון נוקלאוקפסיד SARS-CoV-2 (N) עם RNA פוליא(A) או s2m כדוגמאות מייצגות לטיפות חלבון בלבד ושל RNA חלבון. כדי להעריך האם אגרוז משפיע באופן ניכר על היווצרות קונדנסט בתנאים שנבדקו, יצרנו טיפות עם חלבון N ופולי(A) בנוכחות ובהיעדר 0.5% עם LMA ל-V. מכיוון ש-LMA מתקשה לאחר כ-5 דקות ב-RT, תיעדנו תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות בנקודת זמן זו וראינו כי הטיפות היו בגודל דומה בשני המקרים (איור 1A,B). כדי להדגים את ההשפעה המניעתית של אגרוז על הרטבת טיפות והיתוך של טיפות, צילמנו סט נוסף של תמונות 60 דקות לאחר הכנת הדגימה. בעוד שהטיפות הטבועות באגרוז לא השתנו בגודלן, עיבוי בהיעדר LMA הראה עלייה דרסטית בגודל עקב היתוך והרטבת פני השטח (איור 1A,B). בעוד שהטמענו את הטיפות יחסית מוקדם לאחר הגרעין, ניתן להטמיע טיפות בגדלים שונים על ידי שינוי זמן הדגירה. למרות שהטיפות הוטמעו באגרוז הידרוג'ל, הדינמיקה הנמדדת של העיבוי לא השתנתה באופן ניכר. התאוששות מ-FRAP ולכן דיפוזיה לכאורה של טיפות היו דומים מאוד עם ובלי LMA בדגימה (איור 1C). יתרה מזאת, ניסויים קודמים בספקטרוסקופיית NMR מסודרת דיפוזיה (DOSY) עם עיבוי של FUS NTD הראו כי קצבי הדיפוזיה לא הושפעו באופן ניכר מריכוז אגרוז, לפחות בטווח של 0.25–1% w/v (איור 1D) (מותאם מ-Emmanouilidis ואח' ¹³). תוצאות אלו מראות כי אגרוז הידרוג'ל מתאים ללכידת עיבוי מופרד בפאזה במרחב ובזמן, ומאפשר מדידות חוזרות לאורך טווחי זמן ארוכים.

בעוד שמדידות מיקרוסקופיה ו-FRAP הן מהירות יחסית לרישום (שניות עד דקות), ישנם ניסויים שדורשים מספר דקות (למשל, STORM, 1D ¹H NMR) ואפילו שעות (למשל, 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR) כדי לקבל. לניסויים כאלה, חיוני שהטיפות יישארו נייחות לאורך כל הרכישה ולא יסקעו לאורך זמן. כאן, אנו מראים שייצבנו טיפות Rna של N חלבון + s2m ב-LMA למשך זמן מספק כדי לצלם תמונות STORM (איור 1E). יתרה מזאת, ספקטרום NMR של טיפות FUS NTD בנוכחות ובהיעדר אגרוז היו בעלי רוחב קו דומה, מה שמרמז על חוסר אינטראקציה ניתנת לזיהוי בין הידרוג'לים של אגרוז לחלבון בתנאים אלו (איור 1F) (מותאם מ-Emmanouilidis ואח' ¹³). לעומת זאת, ספקטרום של עיבוי משובצים באגרוז הראו עוצמת אות גבוהה יותר, ככל הנראה בגלל טיפות לא מיוצבות ששקעו בצינור ה-NMR במהלך הרכישה ולכן לא היו זמינות עוד למדידה (איור 1F) (מותאם מ-Emmanouilidis ואחרים^). לסיכום, ייצוב קונדנסטים באגרוז הידרוג'לים לא רק מאפשר ניסויים במסלול זמן אלא גם מאפשר שימוש במתודולוגיות עם זמני רכישה מוארכים, תוך שמירה על תכונות הטיפות הנמדדות במערכות המייצגות שנבדקו.

איור 1: ייצוב קונדנסאט באמצעות הטמעת אגרוז מבלי להפריע באופן ניכר לתכונות הטיפות הנמדדות. (A) מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של חלבון נוקלאוקפסיד 15 מיקרומולר עם 6 מיקרומום Cy3-poly(A) (5% מסומן) בבופר A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2) בנוכחות (+ אגרוז) או היעדר (ללא אגרוז) של 0.5% w/v LMA. התמונות צולמו 5 דקות או 60 דקות לאחר ערבוב / הטמעת אגרוז. התמונות מייצגות 7 תמונות שנרכשו ב-n = 2 ניסויים עצמאיים. פס סולם = 5 מיקרומטר. (B) כימות רדיוסי הטיפות של העיבוי המוצגים ב-(A). הנתונים מוצגים כ-boxgraphs (קופסה = טווח בין-רבעוני, קו מרכז = חציון, שפמים = טווח הנתונים שנותרו, נקודה = חריגים). רדיוס ממוצע ± סטיית תקן (sd) ומספר הטיפות שנותחו בכל מצב מוצגים ישירות בגרף. הנתונים עוקבים אחרי התפלגות נורמלית. טיפות בודדות לא טופלו כרפליקים ביולוגיים עצמאיים לצורך הסקה סטטיסטית. לא בוצעה בדיקה סטטיסטית; ההתפלגויות מוצגות באופן תיאורי. (C) FRAP של הטיפות המוצגות ב-(A) בנקודת זמן 5 דקות. פוטו-בליצה בוצעה באמצעות לייזר 561 ננומטר (Cy3). הנתונים מראים את העוצמה המנורמלת (ממוצע ± sd של n = 3 שכפולים בלתי תלויים לכל תנאי), שמתקבלת על ידי נרמול האות המולבן לערכי קדם-ההלבנה, שטח לא מולבן של אותו דגימה, ופלואורסצנציה ברקע. (D) אות DOSY לא מוחלש של חלבון 200 מיקרומו fus ntd בבופר B (30 mM HEPES, 200 mM KCl, 600 mM אוריאה, pH 7.3) בנוכחות של 0.25, 0.5, או 1.0% w/v אגרוז רגיל. N = 1. (ה) מיקרוסקופיה פלואורסצנציונית קונפוקלית ותמונות STORM של חלבון נוקלאוקפסיד Cy5 בגודל 15 מיקרומולר (5% מסומן) עם RNA ויראלי s2m של 6 מיקרומולר בבופר A המכיל 0.5% w/v LMA. מייצג n = 3 ניסויים עצמאיים. פס קנה מידה = 1 מיקרון בשתי התמונות. (F) ספקטרום 1D ¹H NMR (שמאל) וספקטרום hsqc NMR דו-ממדי [¹⁵N ¹H] HSQC NMR (מימין) של 200 מיקרומטר FOS NTD בבופר B בנוכחות או היעדר 0.5% w/v אגרוז רגיל. N = 1. הפאנלים (D) ו-(F) משוכפלים מ-Emmanouilidis ואחרים. ¹³ אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של האיור.

דיון

ההצלחה של הטמעת אגורוזים של קונדנסטים ביומולקולריים תלויה במספר גורמים. ראשית, יש לשמור על אגרוז בטמפרטורות גבוהות מספיק כדי למנוע ג'לציה מוקדמת, ובאותו זמן נמוכות מספיק כדי לא להפריע למבנים או אינטראקציות ביומולקולריות. לאגרוז עם התכה נמוכה יש נקודת ג'ל של 26–30 מעלות צלזיוס ונקודת התכה של 60–65 מעלות צלזיוס, בעוד שאגרוז רגיל בעל נקודת ג'לינג של 34–38 מעלות צלזיוס ונקודת התכה של 90–95 מעלות צלזיוס. שנית, ערבוב מהיר והעברה לכלי התגובה הסופי (למשל, צינור NMR) הם קריטיים, שכן סטיות קטנות בתזמון או בטמפרטורה עלולות להוביל להטמעה לא אחידה ובכך לפגיעה בשחזוריות.

למרות נקודות קריטיות אלו, השיטה ניתנת להתאמה בקלות לצרכים ניסיוניים שונים. במערכות הפרדת פאזה עם חלבונים לא מסודרים באופן מהותי או מערכות שאינן נוטות לדנאטורציה חום, ניתן להשתמש באגרוז רגיל במקום LMA כדי לחסוך בעלויות. בעת הכנת דגימות המכילות חלבונים עם דומיינים מקופלים, או כל מולקולה רגישה לטמפרטורה (ביו-)מולקולה אחרת הנוטה לדנאטורציה של חום, יש להשתמש ב-LMA למניעת דנאטורציה. ניתן להכין דגימת בקרה עם חום בלבד/ללא אגרוז כדי להפריד בין השפעות הטמעת האגרוז להשפעות התחממות דגימה חולפת. כדי להפחית את הסיכון להשפעות הדנאטורציה התלויות בטמפרטורה, אגרוז בעל התכה נמוכה מתאים במיוחד לדגימות רגישות לטמפרטורה, בעוד שניתן לכוון את ריכוז האגרוז כדי להתאים את גודל הרשת ואת מידת הכליאה המכאנית. למדידות דיפוזיה רגישות מאוד, כמו שיטת NMR שפותחה לאחרונה בשם LLPS REDIFINE ^15,16, ריכוז האגרוז הנמוך ביותר שמונע שקיעה הוא בדרך כלל מועדף, בדרך כלל 0.3–0.5% w/v. בניסויים בבגרות הדורשים שבועות עד חודשים של יציבות, 0.8–1% w/v עדיפים. פרמטרים אלו צריכים להיות מותאמים כדי להבטיח ייצוב אפקטיבי מבלי לשנות באופן גלוי את מורפולוגיית או דינמיקת העיבוי, ותמיד יש להתאים אותם למערכת הספציפית. אימות זה דורש השוואה בין דגימות עם ובלי הטמעת אגרוז (ובתנאים זהים אחרים) או השוואה בין ריכוזי אגרוזים שונים (כדי להוציא השפעות רשת תלויות בריכוז), לדוגמה, שימוש במיקרוסקופיה להערכת מורפולוגיית הטיפות, FRAP להערכת דיפוזיה, או כל שיטה אחרת המתאימה להערכת תכונות הטיפות החשובות לחוקר.

זמן הג'לציה הוא שיקול חשוב נוסף. הזמן שלוקח לאגרוז להתגבשות תלוי במספר גורמים, כגון סוג הבופר, pH, ריכוז האגרוז הסופי, טמפרטורת התחלה, והאם נעשה שימוש באגרוז עם התכה נמוכה או רגילה. בדרך כלל, האגרוז מתייצב תוך 5–10 דקות. הג'לציה של האגרוז יכולה לשמש כאינדיקציה לג'לציה של הדגימה. באופן דומה, שינוי זמני קדם-הדגירה לפני הטמעת האגרוז מאפשר אפיון שחזורי של גדלי טיפות שונים. בחירת בופר היא גם קריטית¹⁴. חשוב מאוד שהאגרוז יוכנה באותו בופר שבו משתמשים להכנת הדגימות כדי למנוע אי-התאמה בין הבופר. הבופר צריך להיות כזה שבו המערכת ידועה כמתפצלת בפאזה.

יש לקחת בחשבון את רגישות הטמפרטורה עבור כל מערכת. רבות ממערכות הפרדת פאזה מציגות התנהגות פאזה תרמו-הפיכה, הידועה כ-LLPS מסוג UCST/LCST. לכן, יש לאמת חשיפה קצרה לטמפרטורות מעט גבוהות במהלך ערבוב אגרוזות כדי לוודא שהיא לא מפריעה להתנהגות הפאזה או לתכונות הטיפה הנמדדת. אם מתעוררות בעיות, ניתן בדרך כלל לטפל בהן על ידי שיפור תנאי הטמפרטורה, מזעור זמן הטיפול או התאמת ריכוז האגרוז. לדוגמה, למרות שמלאי ה-LMA מחומם באופן אידיאלי ל-37°C, מלאי LMA עדיין יישארו נזילים ב-33–35°C.

פתרון תקלות חשוב כי מצבי כשל שונים עשויים להתרחש בהתאם לדגימה ולמערכת הניסוי. אם הטיפות מתמוססות בערבוב עם אגרוז, ייתכן שזה נגרם מחום יתר של LMA או מחוסר התאמה בבופר. במקרה זה, יש לשמור את מלאי ה-LMA בדיוק או כמה מעלות מתחת לטמפרטורת היעד, ולהכין אותו בבופר זהה לחלבון/RNA הרלוונטי. אם מתרחשת ג'לציה מוקדמת בקצה הפיפטה, ייתכן שזה נובע מה-LMA קר מדי או שהקצוות לא מחוממים מראש. כדי למנוע זאת, יש לחמם את הקצוות והצינורות מראש ל-37 מעלות צלזיוס, המפעיל צריך לפעול במהירות, ולשמור את בלוק החימום בטמפרטורת היעד. אם מתרחשים רטבות, התלכדות או שקיעה לאורך זמן, ייתכן שהג'ל דליל מדי או ג'לציה לא אחידה. במקרה זה, ניתן להעלות את ריכוז ה-LMA, ויש להבטיח אפילו ג'לציה בטמפרטורת החדר. אם תמיסת האגרוז מכילה חלקיקים נראים לעין, ייתכן שזה נובע מהמסה לא שלמה של אגרוזה. במקרה זה, יש לחמם את האגרוז עד שהוא שקוף לחלוטין ולערבב אותו היטב לפני השימוש (למשל, מערבוב). אם נוצרות בועות אוויר במהלך ערבוב או פיפטינג, הן עלולות להפריע להדמיה ולהוביל להתפלגות לא אחידה של עיבוי. כדי למזער היווצרות בועות, יש לערבב בעדינות את התמיסות על ידי פיפסת איטית למעלה ולמטה. אם נצפית ג'לציה הטרוגנית או התפלגות קונדנסט לא אחידה, ייתכן שזה נובע מערבוב לא מספק או גרדיאנטים מקומיים של טמפרטורה במהלך הג'לציה. במקרה זה, יש לשמור דגימות על בלוק החימום (או באמבט המים) עד שכל הרכיבים מוספים, מעורבבים מיד אך בעדינות, ומאפשרים להם להתגבשות בתנאי טמפרטורה אחידים. יש להימנע ממרדי טמפרטורה תלולים; מומלץ להתגבשות בטמפרטורת החדר (ויש להימנע מהתמצקות במקרר). בניסויים ארוכי טווח, אידוי הדגימה עשוי לשנות את ריכוזי המומסים ואת תכונות העיבוי. כדי למזער אידוי, יש לאטום את הדגימות כראוי ולשמור עליהן בסביבה מבוקרת לחות ככל האפשר.

בניגוד לשיטות כמו קיבוע פאראפורמלדהיד, הטמעת אגרוז אינה מקבעת דגימות כימית. לכן, עיבויים נשארים דינמיים, מה שמועיל למחקרים פונקציונליים אך מגביל את האחסון לטווח ארוך. למסגרות זמן ניסיוניות מורחבות, יש לנקוט אמצעי זהירות למניעת אידוי ושינויים בבופר, כגון שינויי pH. בנוסף, למרות שאגרוז בדרך כלל בעלת אינטראקציה נמוכה במבחנים אלו, יש לקחת בחשבון השפעות עקיפות אפשריות על דיפוזיה או על הסביבה המקומית. אם יש חשד לאינטראקציות בין אגרוז לביומולקולה, כגון קישור לא ספציפי של החלבון לאגרוז, ניתן לשקול מטריצות הידרוג'ל חלופיות כמו פוליאתילן גליקול דיאקרילט (PEG-DA), עם גודל רשת ונקבוביות תואמים. היעדר אינטראקציות צריך להיות מאומת על ידי מדידת FRAP בנוכחות ובהיעדר המטריצה.

בנוסף לקיבוע כימיקלי, אסטרטגיות פסיבציה של פני שטח כגון משטחים מצופים ב-BSA, PEG או סורפקטנט ושכבות ביליפידיות נתמכות משמשות לעיתים קרובות להפחתת היצמדות והרטיבות של קונדנסט. בעוד שגישות אלו ממזערות אינטראקציות שטחיות, הן אינן מונעות תנועת עיבוי, שקיעה או היתוך עיבוי. לכן, הטמעת אגרוז משלימה את השיטות הללו בכך שהיא מספקת קיבוע פיזי תוך שמירה על דינמיקת העיבוי, מה שהופך אותה לשימושית במיוחד בניסויים ממושכים, הדמיה תלת-ממדית ומדידות כמותיות הדורשות מיקום דגימה יציב. לכן, בחירת השיטה צריכה להיות מונחית על ידי המטרה הניסויית.

בסך הכול, הידרוג'לים אגרוזים מספקים אמצעי פשוט אך יעיל לייצוב עיבוי בשלושה ממדים. דבר זה מונע רטיבות והיתוך של טיפות מבלי להפריע באופן ברור לתכונות הפנימיות הנמדדות במערכות המייצגות שנבדקו, מה שמאפשר ניסויים וטכניקות במסלול הזמן הדורשים זמני רכישה ארוכים, כמו ספקטרוסקופיית NMR¹⁵. למרות ששיטה זו עשויה שלא להתאים לכל מערכות הפרדת פאזה ממספר סיבות, השיטה המוצגת כאן מתאימה לחקר מספר עיבויים ביומולקולריים ויכולה להיות שימושית במיוחד לחקר תהליכי בשלה הרלוונטיים למנגנוני מחלות ניווניות¹⁷.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 mL tubes	any brand is OK	N/A
18-well chamber slides	ibidi	81816	for STORM
agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	molecular biology grade
agarose, ultra pure	Invitrogen	16500500
channel slides	ibidi	80606	for microscopy
confocal microscope	Nikon	N/A
Cy5-dye, NHS chemistry	Jena Biosciences	FP-201-CY5	for labeling protein
D2O (deuterium oxide)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM buffer	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD protein	N/A	N/A	expressed recombinantly in our lab, as described in ref 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
heating block or water bath	any brand is OK	N/A	any make or model will do
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
image analysis software	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NMR spectrometer	Bruker	N/A	750 MHz, PATXI room-temperature probe, see ref 13 for more details (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
NMR tube	Bruker	N/A	3 mm, glass
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	any brand is OK	N/A
pCp-Cy3-dye	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	for labelling RNA
poly(A) RNA	N/A	N/A	in-house in vitro transcribed in our lab, length approx 50 nucleotides, as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
s2m RNA	N/A	N/A	in-house in vitro transcribed in our lab, length 45 nucleotides, sequence: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
SARS-CoV-2 nucleocapsid protein	N/A	N/A	expressed recombinantly in our lab, as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
software for plotting (e.g. R)	R-Project	Version 4.2.1	https://www.r-project.org/
STORM microscope	Nikon N-STORM	N/A
ThunderSTORM plugin	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
tips for the used pipettes	any brand is OK	N/A
TopSpin	Bruker	Version 3.2 and 4.1
urea	Sigma-Aldrich	U5128