מאמר מחקר

רגישות למעכבי ציקלין-תלויות קינאז 4/6 המתווכת על ידי LINC01871 בסרטן השד האנושי

35 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72156

⸱

8 בספטמבר 2026

 ,  ,  , 
1Department of Breast Surgery, Clinical Oncology School of Fujian Medical University, Fujian Cancer Hospital

במאמר זה

סיכום

ניתוחים ביו-אינפורמטיים וניסויים משולבים זיהו את LINC01871 כמנבא פוטנציאלי לרגישות למעכבי cyclin-dependent kinase 4/6, והראו כי ביטוי יתר של LINC01871 מדכא את השגשוג של סרטן השד ומקושר להפחתה באותות NF-κB.

תקציר

סרטן השד נותר הסרטן המאובחן השכיח ביותר בקרב נשים, ועמידות למעכבי cyclin-dependent kinase 4 and 6 (CDK4/6) מגבילה את יעילות הטיפול לטווח ארוך. מחקר זה נועד לזהות RNAs ארוכים לא מקודדים (lncRNAs) הקשורים לרגישות חזויה למעכבי CDK4/6 ולבחון את תפקודיהם הביולוגיים בסרטן השד. נתונים טרנסקריפטומיים מ-The Cancer Genome Atlas (TCGA) ונתוני רגישות לתרופות ממאגר הנתונים Genomics of Drug Sensitivity in Cancer 2 (GDSC2) שולבו, והרגישות לתרופות נחזתה באמצעות אלגוריתם oncoPredict. lncRNAs מועמדים זוהו באמצעות ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, ניתוח רשת ביטוי גנים משוקלל (weighted gene co-expression network analysis), ניתוח פרוגנוסטי ולמידת מכונה. התפקודיים הביולוגיים של LINC01871 הוערכו לאחר מכן באמצעות ניסויי in vitro ו-in vivo. שבעים ושני lncRNAs הקשורים לרגישות חזויה ל-ribociclib ול-palbociclib זוהו, ושישה lncRNAs ליבה נבחרו. LINC01871 הראה את ביצועי ההבחנה הגבוהים ביותר עבור רגישות חזויה לתרופות. ביטוי יתר של LINC01871 היה קשור להגברת הרגישות של תאי סרטן השד ל-ribociclib ול-palbociclib, עיכוב של התרבות תאים, קידום אפופטוזיס ודיכוי של סיגנלינג nuclear factor kappa B (NF-κB). ניתוח טרנסקריפטומי של תא בודד הדגים ביטוי גבוה של LINC01871 בתאי T ובתאי natural killer (NK), בעוד שניתוחי חדירה חיסונית מבוססי טרנסקריפטום הראו כי ביטוי גבוה של LINC01871 קשור להגברת החדירה החיסונית. ממצאים אלה מזהים את LINC01871 כסמן ביולוגי מועמד לרגישות למעכבי CDK4/6 ומדגימים את השפעותיו כמדכא גידולים בסרטן השד. נדרשים מחקרים קליניים ומכניסטיים נוספים כדי לתקף את ערכו הניבויי ואת הרלוונטיות הטיפולית שלו.

מבוא

סרטן השד נותר גורם מרכזי לתמותה מסרטן בקרב נשים ברחבי העולם, למרות התקדמות מתמדת בניהולו הקליני1,2. הטיפול התרחב בהדרגה מעבר לטיפול אנדוקרי וכימותרפיה כדי לשלב גישות ממוקדות מולקולרית3. בין אלה, מעכבים של cyclin-dependent kinases 4 and 6 (CDK4/6), כגון ribociclib, palbociclib ו-abemaciclib, הניבו יתרונות קליניים משמעותיים בסרטן השד חיובי לקולטן אסטרוגן ו/או חיובי לקולטן פרוגסטרון4,5,6. עם זאת, טיפול ממושך עלול להיות מלווה בעמידות נרכשת, המגבילה את עמידות התועלת הטיפולית7.

עיכוב של CDK4/6 פועל בעיקר דרך ציר הבקרה של מחזור התא Rb–E2F. עיכוב של פעילות CDK4/6–cyclin D מפחית את הפספורילציה של חלבון ה-retinoblastoma (Rb), ובכך מאפשר ל-Rb בהיפופספורילציה לרסן את השעתוק התלוי ב-E2F, וכתוצאה מכך לקדם עצירה בשלב G1 ולהגביל את התפשטות תאי הגידול8. למרות שסומנו מספר מנגנונים התורמים לעמידות למעכבי CDK4/6, הם אינם מסבירים באופן מלא את ההבדלים בתגובה לטיפול. מנגנונים אלו כוללים הפעלה חריגה של מסלול ה-phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin (PI3K/AKT/mTOR) וביטוי מוגבר של קומפלקסי cyclin–CDK9,10. ראוי לציין כי מרכיבים של מסלול ה-PI3K/AKT/mTOR מהווים בעצמם מטרות טיפוליות במחלה בשלבים מתקדמים11. יחד, תצפיות אלו מעידות כי נותרו גורמים מולקולריים נוספים לרגישות ועמידות למעכבי CDK4/6 שטרם זוהו. הרלוונטיות הקלינית של סממנים חזויים (predictive biomarkers) מודגמת באסטרטגיות מתהוות המודרכות על ידי סממנים עבור סרטן שד גרורתי HR-positive. ניתוח סדרתי של DNA של גידול במחזור הדם (ctDNA), למשל, יכול לזהות את הופעתן של מוטציות ב-ESR1 במהלך טיפול מבוסס מעכבי CDK4/6. מחקרי PADA-1 ו-SERENA-6 הראו כי זיהוי מולקולרי כזה יכול להנחות שינוי מוקדם בטיפול ההורמונלי תוך שמירה על עיכוב CDK4/612,13. עם זאת, מוטציות ב-ESR1 מייצגות רק גורם אחד לתגובה הטיפולית ואינן יכולות להסביר את כל המקרים של רגישות או עמידות. למגבלה זו יש רלוונטיות קלינית גוברת מכיוון שחולות עם סרטן שד גרורתי HR-positive/HER2-negative שחלה התקדמות במחלה במהלך טיפול מבוסס מעכבי CDK4/6, עומדות כעת בפני מספר אפשרויות טיפוליות המשך, כולל מפרקי קולטני אסטרוגן סלקטיביים בנטילה פהית (oral selective estrogen receptor degraders), מעכבי מסלול PI3K/AKT, ותצמידי נוגדן-תרופה (antibody–drug conjugates). לכן, זיהוי סממנים מועמדים נוספים הקשורים לרגישות דיפרנציאלית למעכבי CDK4/6 עשוי לסייע בהבחנה בין חולות בעלות סבירות גבוהה יותר להפיק תועלת מטיפולים אלו לבין אלו שעשויות להזדקק להתאמת טיפול מוקדמת יותר.

RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs) הם תמלילי RNA ללא יכולת קידוד לחלבון, המשתתפים בבקרת תהליכים ביולוגיים רבים. מספר lncRNAs נקשרו להתקדמות הסרטן ולתגובה לטיפול. בקרצינומה של תאי קשקש בפה, דווח כי LOC100506114 מקדם פרוליפרציה ונדידה באמצעות אינטראקציה עם גורם השעתוק RUNX ובקרת ביטוי של גנים במורד המסלול14. בסרטן השד, HISLA נקשר להגברת הגליקוליזה ולהגברת עמידות לאפופטוזיס15, בעוד LINC02568 תורם לעמידות אנדוקרינית באמצעות בקרה על ESR1 ו-CA1216. למרות המעורבות המוכרת של lncRNAs בביולוגיה של הסרטן, הקשר שלהם לעמידות למעכבי CDK4/6 עדיין אינו מאופיין דיו. במחקר זה, נעשה שימוש באסטרטגיה משולבת של מולטי-אומיקה ולמידת מכונה כדי לזהות lncRNAs הקשורים לרגישות חזויה לריבוסיקליב (ribociclib) ולפאלבוסיקליב (palbociclib), ומהם עלה LINC01871 כמועמד פוטנציאלי. בהמשך, בחנו את הקשר של LINC01871 לרגישות לשני החומרים והערכנו את השפעתו על פרוליפרציה של תאי סרטן השד באמצעות גישות ניסיוניות in vitro ו-in vivo.

פרוטוקול

All procedures involving animals were performed under institutional animal-welfare requirements and received approval from the Animal Ethical and Welfare Committee of Fujian Cancer Hospital & Fujian Medical University Cancer Hospital (Approval No. SQ2021-159-01).

רכישת נתונים
פרופילי תמלול מסוג bulk הורדו מ-TCGA בינואר 2025 והומרו לערכי transcripts per million (TPM) לפני ביצוע ניתוחים המשכיים. נתונים של ריצוף RNA של תא בודד (Single-cell RNA-sequencing) הושגו מ-Gene Expression Omnibus (GEO), תוך שימוש במערך הנתונים GSE161529.

הערכת רגישות לתרופות ribociclib ו-palbociclib
נתוני GDSC2 שימשו לאימון מודל חיזוי התגובה לתרופה, ופרופילים טרנסקריפטומיים מ-TCGA-BRCA שימשו כסט נתונים לבדיקה. מידע קליני הנדרש לניתוח תתי-הקבוצות נשלף ממאגר הנתונים TCGA Pan-Cancer Atlas Clinical with Follow-up. נבחנו ארבעה משתנים קליניים: מצב ER (breast_carcinoma_estrogen_receptor_status), מצב PR (breast_carcinoma_progesterone_receptor_status), מצב HER2 שנקבע באמצעות IHC (lab_proc_her2_neu_immunohistochemistry_receptor_status), ומצב HER2 שנקבע באמצעות FISH (lab_procedure_her2_neu_in_situ_hybrid_outcome_type). גידול סווג כ-HR-חיובי אם ER או PR סומנו כ-"Positive". גידול סווג כ-HER2-שלילי כאשר לפחות אחת מתוצאות HER2 IHC או FISH הייתה שלילית ואף אחת מהבדיקות לא הניבה תוצאה חיובית. מקרים שבהם לא ניתן היה לקבוע באופן חד-משמעי את מצב ה-HR או ה-HER2 הוצאו מהניתוח. על פי קריטריונים אלו, 601 חולים זוהו כ-HR-חיוביים/HER2-שליליים. מתוכם, ל-599 היו רשומות תואמות הן במאגר הנתונים הקליני של Pan-Cancer והן במטריצת הביטוי של TCGA-BRCA, והם נכללו בניתוח תתי-הקבוצות. ערכי IC₅₀ של ribociclib ו-palbociclib הוערכו באמצעות חבילת ה-R ‏oncoPredict (גרסה 1.2) תוך שימוש בפרמטרים ברירת המחדל. תרשימי פיזור שנוצרו באמצעות ggplot2 שימשו להצגת התהלה של ערכי IC₅₀ החזויים בקרב החולים. חולים שנמצאו ב-25% העליונים של ערכי IC₅₀ החזויים הוגדרו כעמידים, בעוד שאלו שנמצאו ב-25% התחתונים הוגדרו כרגישים.

זיהוי גנים הקשורים לעמידות למעכבי CDK4/6
ביטוי דיפרנציאלי בין הקבוצות שסווגו כרגישות וכעמידות הוערך באמצעות חבילת limma, ותבניות ביטוי הגנים שהתקבלו הוצגו כגרפי volcano באמצעות ggplot2. לאחר מכן בוצע ניתוח רשת ביטוי משותף משוקלל של גנים (WGCNA) בעזרת חבילת WGCNA כדי לזהות מודולי ביטוי הקשורים לעמידות לשני מעכבי ה-CDK4/6. גנים המשותפים לארבעה סטים של נתונים שהתקבלו זוהו והוצגו באמצעות חבילת VennDiagram. הגנים המשותפים הוערכו לאחר מכן בניתוח הישרדות קפלאן-מייר (Kaplan–Meier) ובניתוח רגרסיה חד-משתנית של קוكس (Cox) באמצעות חבילות survival ו-survminer, כאשר עקומות הישרדות תואמות הופקו לצורך ויזואליזציה. גנים שהגיעו למובהקות סטטיסטית בשני ניתוחי ההישרדות הוכנסו לרגרסיית LASSO באמצעות חבילת glmnet כדי לבחור גורמי פרוגנוזה מרכזיים. יכולתם של הגנים שנבחרו להבחין בין עמידות חזויה לתרופה הוערכה באמצעות ניתוח ROC בעזרת pROC, כאשר הביצועים נמדדו לפי השטח תחת עקומת ה-ROC. ערכי ה-AUC עבור התרופות השונות הושוו גרפית באמצעות גרפי עמודות שהופקו עם ggplot2.

ניתוח גן בודד של LINC01871
ביטוי LINC01871 הושווה תחילה בין רקמות גידול לרקמות נורמליות באמצעות ניתוח ביטוי דיפרנציאלי. הקשר הפרוגנוסטי שלו במספר סוגי סרטן נבדק לאחר מכן באמצעות ניתוח הישרדות של Kaplan–Meier ורגרסיית Cox חד-משתנית תוך שימוש בחבילות ה-R בשם survival ו-survminer. הבדלים בביטוי LINC01871 בין קבוצות קליניקו-פתולוגיות הוערכו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum והוצגו כתרשימי קופסה באמצעות ggpubr. עבור ניתוח רצף RNA של תא בודד, עיבוד מקדים של נתונים וניתוחים המשכיים בוצעו באמצעות Seurat. שונות בין סבבים (inter-batch variation) תוקנה באמצעות Harmony עם הגדרות הפרמטרים ברירת המחדל. לאחר תיקון הסבבים, אשכולות התאים שהתקבלו יוצגו בהטמעת UMAP. לאחר מכן, זהויות התאים הוקצו באופן אוטומטי באמצעות SingleR תוך שימוש בפרופילים טרנסקריפטומיים של ייחוס.

ניתוח העשרה פונקציונלית
גנים שהראו ביטוי דיפרנציאלי בין הקבוצות עם רמות גבוהות ונמוכות של LINC01871 נקבעו באמצעות חבילת limma. במקביל, נעשה שימוש בניתוח מתאם פירסון (Pearson correlation analysis) כדי לזהות mRNAs שרמות הביטוי שלהם היו במתאם עם ביטוי LINC01871. לאחר מכן בוצעו ניתוחי העשרה של GO ו-KEGG באמצעות clusterProfiler. פרופילי ההעשרה שהתקבלו הוצגו כתרשימי עמודות ותרשימי בועות שנוצרו באמצעות ggplot2.

ניתוח חדירה חיסונית
חדירת תאי מערכת החיסון אופיינה בתחילה באמצעות CIBERSORT עם מטריצת החתימה LM22, אשר יושמה כדי להעריך את ההתפלגות היחסית של 22 אוכלוסיות של תאי חיסון. הבדלים בהערכות אלו בין הקבוצות עם ביטוי גבוה ונמוך של LINC01871 הוצגו חזותית באמצעות ggpubr. לאחר מכן חושבו עבור דגימות בודדות ציוני Stromal, immune ו-ESTIMATE באמצעות חבילת estimate והוצגו כגרפי כינור (violin plots). בנוסף, בוצע ניתוח העשרה של קבוצות גנים לדגימה בודדת (ssGSEA) באמצעות חבילת GSVA כדי להעריך את השכיחות היחסית של אוכלוסיות תאי חיסון בכל דגימה. הבדלים בהערכות החדירה החיסונית שהתקבלו בין שתי קבוצות הביטוי של LINC01871 הוערכו והוצגו חזותית באמצעות ggpubr.

תרבית תאים
במחקר זה נעשה שימוש בקווי התאים MDA-MB-231, MCF-10A ו-HEK293T. תאי MDA-MB-231 ותאי HEK293T גודלו ב-DMEM המכיל 10% fetal bovine serum, בעוד שתאי MCF-10A תוחזקו במצע שנוסח במיוחד עבור קו תאים זה. התרביות נשמרו בטמפרטורה של 37°C בתנאים לחים עם 5% CO₂. כדי ליצור תאים עם ביטוי יתר של LINC01871, קונסטרקט ביטוי יתר של LINC01871 ופלסמידי אריזה לנטיביריאליים הועברו יחד (co-transfected) לתאי HEK293T לצורך ייצור לנטיביריון. לאחר מכן נאסף העל-נוזל (supernatant) המכיל את הווירוס והוא שימש לטרנסדוקציה של תאי MDA-MB-231. תאים שעברו טרנסדוקציה נבחרו באמצעות 1 μg/mL puromycin. הן תאי הבקרה מסוג wild-type והן התאים שעברו טרנסדוקציה הועמדו לטיפול ב-puromycin, ותהליך הבחירה הופסק לאחר 3–4 ימים, לאחר שכל תאי הבקרה מסוג wild-type מתו.

תגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR)
RNA תאי בודד בודד באמצעות ריאגנט RNAiso Plus, וריכוזי ה-RNA הותאמו לרמות שוות לפני השעתוק ההפוך. DNA משלים (cDNA) הופק באמצעות ערכה לשעתוק הפוך בהתאם לפרוטוקול היצרן. הגברת ה-RT-qPCR החלה בדנטורציה ב-95°C למשך 30 s ואחריה 40 מחזורים שכללו 95°C למשך 5 s, 60°C למשך 30 s, ו-72°C למשך 30 s. שפע התמלילים נקבע בשיטת 2−ΔΔCt תוך שימוש ב-GAPDH לצורך נורמליזציה. רצפי הפריימרים ששימשו לאנליזה מפורטים ב-Supplementary Table 1.

בדיקות תרבייה של תאים וציטוטוקסיות
להערכת הציטוטוקסיות של התרופה, זרעו 8,000 תאים למערכת (well) בלוחות 96-well והניחו להם לגדול במשך 24 h. לאחר מכן, הוחלף מצע התרבית במצע טרי המכיל את ריכוזי התרופה המצוינים, ולאחריו דגירה נוספת של 24 h. לאחר מכן הוסף ריאגנט CCK-8, והלוחות נשמרו בחושך למשך 2 h לפני שנספגה הבליעה ב-450 nm. מדידות אלו שימשו לבניית עקומות תגובה-מנה של התרופה ולקביעת ערכי IC₅₀. למדידות תרבייה (proliferation), הוכנו תאים בצפיפות של 1,000 cells/mL, ו-100 μL של ת сусפנזיית התאים הוספו לכל מערכת בלוח 96-well. מדידות CCK-8 בוצעו במרווחי זמן של 24 h. בכל נקודת זמן, הוסף הריאגנט והלוחות דגרו בחושך למשך 2 h לפני שמדדו את הבליעה ב-450 nm להערכת תרביית התאים.

בדיקת הרכבת מושבות
עבור ניסויי הרכבת מושבות, נזרעו 1,000 תאים לכל באר בלוחיות 6 בארות, כאשר שלוש חזרות נכללו עבור כל קבוצה ניסויית. התאים הוחזקו למשך 1–2 שבועות כדי לאפשר התפתחות נראית של מושבות. לאחר מכן נשפך המצע, והתאים קובעו ב-4% paraformaldehyde, נשטפו ב-PBS, וצבעו לאחר מכן ב-1% crystal violet.

בדיקת התמזגות של 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine
תאים מכל קבוצה ניסויית נזרעו בלוחות של 12 בארות ונשמרו למשך לילה. למחרת, התאים נחשפו לתמיסת העבודה של EdU למשך 2 h. לאחר קיבוע וחדירה (permeabilization), בוצע סימון EdU, ולאחר מכן צביעת נגד של הגרעין באמצעות Hoechst. לאחר מכן נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לרכישת תמונות להערכת ההתמזגות של EdU.

Western blot
תאים עוברו לליזיס בבופר RIPA בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז כדי להפיק חלבון כולל. ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות BCA assay. לאחר הוספת loading buffer, דגימות החלבון עברו דנטורציה ב-95°C והפרדה ב-SDS–PAGE לפני העברה לממברנות PVDF. הממברנות עברו חסימה (blocking) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן דגרו עם הנוגדנים הראשוניים המוגדרים ב-4°C למשך לילה (Supplementary Table 2). לאחר שלושה שטיפות ב-TBST, הוספו הנוגדנים המשניים המתאימים למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. אותיות החלבון זוהו באמצעות chemiluminescence משופר (ECL) ולאחר מכן צולמו. GAPDH או β-actin שימשו כבקרת טעינה (loading control).

ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה
להערכת מחזור התא, התאים נאספו באמצעות טריפסינציה, נשטפו ב-PBS וקובעו למשך לילה באתנול 70% ב-4°C. התאים הקבועים נשטפו שוב ב-PBS והודגרו עם ריאגנט לגילוי מחזור התא לפני המדידה בציטומטריית זרימה. להערכת אפופטוזה, התאים שנאספו נשטפו ב-PBS והושעו במסיי גילוי (binding buffer). תרחיף התאים נצבע ב-Annexin V ובפרופידיום יודיד (PI) למשך 10–15 דקות בטמפרטורת החדר בתנאים מוגני אור. לאחר מכן בוצעה ציטומטריית זרימה כדי לכמת את אוכלוסיות התאים האפופטוטיים.

מודלים של קסנוגרפט בעכברים
ניסויי in vivo נערכו באמצעות עכברים חסרי חיסון מדגם NOD/ShiLtJGpt בני חמישה שבועות. בעלי החיים הוחזקו במתקן נטול פתוגנים ספציפיים (SPF) במחזור אור/חושך של 12 שעות, כאשר לא יותר מארבעה בעלי חיים שוכנו בכל כלוב. לפני השתלת תאי הגידול, העכברים הורדמו באמצעות איסופלורן בשאיפה. לאחר אישור הרדמה נאותה, חולקו בעלי החיים לשתי קבוצות וקיבלו הזרקות לרפידת השומן הבטנית של תאי MDA-MB-231 של ביקורת או תאי MDA-MB-231 עם ביטוי יתר של LINC01871. צמיחת הגידול הוגדרה כתוצאה העיקרית. ממדי הגידול נמדדו באמצעות קליפר במרווחים של 3–4 ימים. נפח הגידול נקבע לפי הנוסחה V = ( L x W2 ) / 2', כאשר L מייצג את קוטר הגידול הארוך ביותר ו-W את הקצר ביותר, כאשר הנפח מבוטא ב-mm3. המחקר הופסק לפני שגידול כלשהו הגיע לקוטר מקסימלי של 1.5 cm או לנפח של 2,000 mm3. בנקודת הסיום של הניסוי, העכברים הורדמו באיסופלורן, ופריקה של חוליות הצוואר בוצעה רק לאחר אישור הרדמה עמוקה. בעלי חיים הורדמו לפני מועד הסיום המתוכנן אם נצפו סימנים משמעותיים למצוקה, כולל רפיון, ירידה במשקל, תנוחת גב כפופה או חוסר יכולת לאכול או לשתות. עם סיום המחקר, הגידולים הוסרו ולאחר מכן נשקלו וצולמו.

ניתוח סטטיסטי
ניתוחי הנתונים בוצעו באמצעות GraphPad Prism גרסה 10.3.1 ו-R גרסה 4.3.1. השיטה הסטטיסטית שיושמה לכל השוואה נבחרה בהתאם למערך המחקר ולהתפלגות הנתונים המתאימים. בהתאם לצורך, הניתוחים כללו מבחן t של Student, מבחן t למדגמים מזווגים, מבחן סימני הדירוג של Wilcoxon, מבחן Mann–Whitney U, ניתוח שונות (ANOVA) חד-כיווני או דו-כיווני, ניתוח Kaplan–Meier עם מבחן log-rank, רגרסיית סיכונים פרופורציונלית של Cox חד-משתנית, וניתוח מתאם של Pearson או Spearman. מובהקות סטטיסטית הוגדרה באמצעות ערך P דו-זנבי <0.05.

תוצאות

LINC01871 קשור באופן הדוק לרגישות ל-Ribociclib ול-Palbociclib
ערכי IC50 חזויים עבור ribociclib ו-palbociclib נאמדו עבור מטופלים בקוהורט TCGA-BRCA באמצעות נתוני GDSC2 וסודרו בסדר עולה. מטופלים שנמצאו ברבעון הנמוך ביותר של ערכי IC50 החזויים שויכו לקבוצת הרגישים, בעוד שאלה שנמצאו ברבעון הגבוה ביותר שויכו לקבוצת העמידים (איור 1A,B). השוואה בין קבוצות אלו זיהתה lncRNAs בעלי ביטוי דיפרנציאלי עבור כל תרופה (איור משלים 1A,B). ניתוח WGCNA זיהה בנוסף מודולי lncRNA הקשורים באופן מובהק לרגישות חזויה ל-ribociclib ול-palbociclib (איור 1C,D; איור משלים 1C,D). אינטגרציה של ארבעת מאגרי הגנים שהתקבלו הניבה 62 lncRNAs משותפים (איור 1E), מתוכם 18 היו קשורים באופן מובהק לפרוגנוזה הן בניתוחי רגרסיית Cox חד-משתנית והן בניתוחי הישרדות Kaplan–Meier. לאחר מכן הוחלה רגרסיית LASSO כדי לזקק עוד יותר את קבוצה זו, מה שהוביל לשישה lncRNAs רלוונטיים פרוגנוסטית: ANKRD44-AS1, AC083837.1, AC242842.1, DBH-AS1, LINC00926 ו-LINC01871 (איור 1F,G; איור משלים 2A). יכולתם להבחין בין עמידות חזויה לתרופות הושוות לאחר מכן באמצעות ניתוח AUC. מבין ששת המועמדים, LINC01871 הניב את ממוצע ה-AUC הגבוה ביותר עבור ribociclib ו-palbociclib (איור 1H–J; איור משלים 2B,C).

figure-results-1
איור 1זיהוי של RNA לא מקודד ארוך (lncRNAs) הקשור לרגישות חזויה לריבוסיקליב (ribociclib) ולפאלבוסיקליב (palbociclib). 
(A,B) התפלגות הריכוז העיכוב החצי-מקסימלי (IC₅₀) החזוי50(A) ערכים עבור פאלבוציקליב (palbociclib) ו-(B) ריבוציקליב (ribociclib) בקוהורט הסרטן הפולשני של השד מתוך מאגר הנתונים The Cancer Genome Atlas breast invasive carcinoma (TCGA-BRCA), כפי שהוערכו באמצעות מאגר הנתונים Genomics of Drug Sensitivity in Cancer 2 (GDSC2). (C,D) ניתוח רשת ביטוי גנים משותף משוקלל (WGCNA) המראה קשרי מודול-תכונה עבור פאלבוציקליב (C) וריבוציקליב (D). (E) תרשים ונ (Venn) הממחיש גנים משותפים בין קבוצות הגנים בעלי הביטוי השונה לבין קבוצות הגנים שהופקו מ-WGCNA והקושרות לשתי התרופות. (F,G) רגרסיית LASSO (Least absolute shrinkage and selection operator) לבחירת RNA לא מקודד ארוך (lncRNA) בעל רלוונטיות פרוגנוסטית. (H) השוואת ערכי השטח תחת העקום (AUC) של עקומי מאפייני תפקודי המקלט (ROC) עבור ששת ה-lncRNAs שנבחרו על ידי LASSO. (I,J) עקומי ROC המעריכים את יכולתו של LINC01871 להבחין בין רגישות חזויה לריבוציקליב (I) ולפאלבוציקליב (J). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ביטוי יתר של LINC01871 הגביר את הרגישות לתרופות בתאי סרטן השד
במסגרת קוהורט TCGA-BRCA, ביטוי גבוה יותר של LINC01871 היה קשור לערכי IC50 חזויים נמוכים יותר הן עבור ribociclib והן עבור palbociclib (איור 2A,B). קשר זה נבחן לעומק בתת-קבוצה הרלוונטית קלינית של HR-positive/HER2-negative (n = 599). בתת-קבוצה זו, ערכי IC50 החזויים עבור שני הסוכנים היו נמוכים באופן משמעותי בקרב מטופלים עם ביטוי גבוה של LINC01871 מאשר בקרב אלה עם ביטוי נמוך. יתרה מכך, ביטוי LINC01871 נמצא במתאם הפוך עם ערכי IC50 החזויים של ribociclib ו-palbociclib (איור משלים 3A,B). הקשר החישוביי נבחן לאחר מכן באופן ניסויי. בדיקות ציטוטוקסיות הדגימו רגישות גבוהה יותר ל-ribociclib ול-palbociclib בתאי סרטן השד עם ביטוי יתר של LINC01871 מאשר בתאי ביקורת של וקטור (איור 2C,D). זרימה ציטומטרית (Flow cytometry) הראתה שיעור גבוה יותר של תאים בשלב G1 ושיעור נמוך יותר בשלב S בעקבות ביטוי יתר של LINC01871, באופן העולה בקנה אחד עם הגברה של מעצר בשלב G1 (איור 2E). בבדיקות להיווצרות מושבות, ריכוזים עולים של ribociclib או palbociclib הפחיתו באופן הדרגתי את היווצרות המושבות (איור 2F,G). בריכוזי תרופה שקולים, היכולת להיווצרות מושבות הייתה נמוכה באופן משמעותי בתאים עם ביטוי יתר של LINC01871 מאשר בתאי ביקורת של וקטור. ניתוח Western blot חשף בנוסף רמות נמוכות יותר של CDK4, CDK6 ו-cyclin D1, בליווי הפחתה של פוספורילציה של RB, בתאים עם ביטוי יתר של LINC01871 (איור 2H). שינויים מולקולריים אלו תאמו את המעצר המוגבר בשלב G1 שנצפה בעקבות ביטוי יתר של LINC01871.

figure-results-2
איור 2הקשר בין ביטוי יתר של LINC01871 לרגישות למעכבי קינזה תלויה-ציקלין 4/6 בתאי סרטן השד.  (A,B) רגישות חזויה ל-palbociclib (A) ול-ribociclib (B) בהתאם לביטוי נמוך או גבוה של LINC01871. (C,D) עקומות תגובה למינון תרופה עבור palbociclib (C) ו-ribociclib (D) בתאי בקרה-וקטור ובתאים עם ביטוי יתר של LINC01871, עם ריכוז העיכוב החציוני (IC50(E) הערכה באמצעות ציטומטריה של זרימה של התפלגות מחזור התאים בתאי בקרה (וקטור) ובתאים עם ביטוי יתר של LINC01871. (F,G) יצירת מושבות לאחר טיפול בריכוזים עולים של palbociclib (F) ו-ribociclib (G). (H) הערכה באמצעות Western blot של cyclin-dependent kinase 4 (CDK4), cyclin-dependent kinase 6 (CDK6), cyclin D1 (CCND1), חלבון retinoblastoma (RB) ו-RB מאושרף (p-RB), עם β-actin שימש כביקורת טעינה. OE-LINC01871, ביטוי יתר של LINC01871; ns, לא מובהק. כל הניסויים בוצעו באופן עצמאי בשלוש חזרות. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. ריכוז מעכב חציוני50 הערכים נקבעו באמצעות רגרסיה לא ליניארית. נתוני התפלגות מחזור התא ויצירת מושבות נותחו באמצעות ANOVA דו-כיווני. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ו-****P < 0.0001; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לחולים עם ביטוי גבוה של LINC01871 הייתה נטייה לתוצאות קליניות טובות יותר
הקשר הפרוגנוסטי של LINC01871 נבדק בהמשך בקוהורט TCGA-BRCA. ניתוחי קפלן-מייר (Kaplan–Meier) העידו כי ביטוי גבוה יותר של LINC01871 היה קשור באופן כללי להישרדות כוללת ארוכה יותר ולמרווח ללא התקדמות המחלה (איור 3A; איור משלים 3C). השוואות של דגימות מזווגות ולא מזווגות חשפו גם ביטוי נמוך משמעותית של LINC01871 ברקמות גידול בהשוואה לרקמות נורמליות (איור 3B,C). לאחר מכן בחנו את הקשר בין ביטוי LINC01871 למאפיינים קליני פתולוגיים. ביטוי נמוך יותר של LINC01871 נטה להיות קשור לגודל גידול גדול יותר, ונצפה בחולים שדווחו כנפטרים בהשוואה לאלו שדווחו כחיים (איור 3D,E). בקרב חולים שקיבלו רדיותרפיה, ניתוח תתי-קבוצות הראה תוצאות הישרדות טובות משמעותית יותר בקרב אלו עם ביטוי גבוה של LINC01871 (איור משלים 3D). בהמשך פותח נומוגרם פרוגנוסטי המשלב את ביטוי LINC01871 יחד עם מספר מאפיינים קליניים (איור משלים 3E). ניתוח כיול הראה התאמה הדוקה בין הסבירויות להישרדות שהוערכו על ידי הנומוגרם לבין התוצאות שנצפו (איור משלים 3F).

figure-results-3
איור 3ביטוי LINC01871, קשרים פרוגנוסטיים ודיכוי של פרוליפרציה של סרטן השד. 
(A) ניתוח קפלן-מייר (Kaplan–Meier) של הישרדות כוללת, בחלוקה לפי ביטוי LINC01871. (B,C) ניתוחים מזווגים (B) ובלתי מזווגים (C) המשווים את ביטוי LINC01871 בין רקמות נורמליות לרקמות גידול. (D,E) ביטוי LINC01871 ביחס לקטגוריית T של הגידול (D) ולמצב הישרדות (E). (F) השוואה של ביטוי LINC01871 יחסי בין תאי MCF-10A לתאי MDA-MB-231. (G) אישור של ביטוי יתר של LINC01871 בתאי MDA-MB-231 באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR). (H–J) הערכת שגשוג תאים באמצעות מבחן Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (H), מבחן יצירת מושבות (I), ו-5-ethynyl-2′בדיקת שילוב 5-דאוקסיורידין (EdU) (J). סרגל הקנה בפאנל J מייצג 100 μm(K) מראה, נפח ומשקל של גידול קסנוגראפט (Xenograft) בקבוצות הביקורת של הווקטור ובקבוצות עם ביטוי-יתר של LINC01871. TPM, מספר תמלילים למיליון; OE-LINC01871, ביטוי-יתר של LINC01871. הישרדות כוללת הוערכה באמצעות ניתוח קפלאן-מייר (Kaplan–Meier) עם מבחן log-rank. השוואות จับוּגות (Paired) בין רקמות גידול לרקמות נורמליות הוערכו באמצעות מבחן סימני הדירוג של וילקוקסון (Wilcoxon signed-rank test). עבור שאר ההשוואות בין שתי קבוצות, נבחר מבחן t של Student לא מזווג או מבחן Mann–Whitney U לאחר הערכת נורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילק (Shapiro–Wilk). מדידות CCK-8 נותחו באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני (two-way ANOVA). ניסויי in vitro כללו שלושה שחזורים ביולוגיים עצמאיים, בעוד שניסויי הקסנוגראפט כללו שלושה עכברים בכל קבוצה. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ו-****P < 0.0001; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מורחבת של איור זה.

ביטוי יתר של LINC01871 מדכא פרוליפרציה של תאי גידול וקשור להפחתה באותות של NF-κB
השפעה העכבה של LINC01871 על פרוליפרציה של תאי גידול נבדקה בהמשך באמצעות מודלים in vitro ו-in vivo. הביטוי של LINC01871 היה גבוה משמעותית בשורת תאי אפיתל רגילים של השד מאשר בשורת תאי סרטן השד (איור 3F). הקמה מוצלחת של מודל ביטוי יתר של LINC01871 אומתה באמצעות RT-qPCR, שהראה עלייה ניכרת בביטוי LINC01871 ביחס לקבוצת ביקורת הווקטור (איור 3G). בדיקות CCK-8 חשפו לאחר מכן ירידה משמעותית ביכולת הפרוליפרטיבית של תאים עם ביטוי יתר של LINC01871 (איור 3H). בהתאמה לממצא זה, ביטוי יתר של LINC01871 הפחית את היכולת ליצירת מושבות (איור 3I) והפחית את שיעור התאים החיוביים ל-EdU (איור 3J). במודל קסנוגרפט, גידולים שהתפתחו מתאים עם ביטוי יתר של LINC01871 היו קטנים משמעותית מאלו שהתפתחו מתאי ביקורת וקטור (איור 3K).

כדי לבחון מנגנונים פוטנציאליים העומדים בבסיס השפעות אלו, בוצעו ניתוחי העשרה פונקציונלית באמצעות שתי קבוצות גנים: גנים המבטאים ביטוי דיפרנציאלי בין קבוצות עם ביטוי גבוה ונמוך של LINC01871, וגנים שזוהו כבעלי ביטוי משותף עם LINC01871 בניתוח מתאם פירסון (Pearson). ניתוח GO של קבוצות גנים אלו חשף קשרים למספר פונקציות הקשורות למערכת החיסון, כולל קישור לקולטן T, קישור לקומפלקס חלבוני של MHC (major histocompatibility complex), ויסות חיובי של הפעלת לוקוציטים ופעילות קולטני מערכת החיסון (איור 4A,C). ניתוח KEGG זיהה באופן דומה מסלולים הקשורים למערכת החיסון, כולל סיגנל קולטן T, ומסלול PD-L1 (programmed death-ligand 1) ונקודת הבקרה PD-1 (programmed cell death protein 1) בסרטן. העשרה נצפתה גם עבור מסלולי השיגנל של JAK-STAT (Janus kinase/signal transducer and activator of transcription) ו-NF-κB (איור 4B,D). מכיוון שסיגנל NF-κB זוהה בשני ניתוחי ההעשרה, נבדקה פעילותו בהמשך באמצעות western blotting. פוספורילציה של P65 הייתה נמוכה באופן ניכר בתאים עם ביטוי יתר של LINC01871 מאשר בקבוצת הביקורת (איור 4E), ממצא העקבי עם הפעלה מופחתת של מסלול NF-κB. כמו כן הוערך הקשר בין ביטוי יתר של LINC01871 לאפופטוזיס. Western blotting הראה ביטוי מוגבר של החלבון הפרו-אפופטוטי Bax וביטוי מופחת של החלבון האנטי-אפופטוטי Bcl-2 בעקבות ביטוי יתר של LINC01871 (איור 4F). זרימה ציטומטרית (Flow cytometry) חשפה בנוסף שיעור גבוה משמעותית של תאים אפופטוטיים בקבוצת ביטוי היתר של LINC01871 מאשר בקבוצת ביקורת הווקטור (איור 4G).

figure-results-4
איור 4הקשר בין LINC01871 לבין שפנולת nuclear factor kappa B ואפופטוזיס. 
(A,B) ניתוחי העשרה של Gene Ontology (GO) (A) ושל Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (B) לגנים המראים ביטוי דיפרנציאלי בין הקבוצות עם הביטוי הגבוה והנמוך של LINC01871. (C,D) ניתוחי העשרה של GO (C) ו-KEGG (D) לגנים בעלי ביטוי משותף (co-expressed) עם LINC01871. (E) הערכה באמצעות Western blot של הגורם הגרעיני kappa B (NF-κ(B) חלבוני המסלול P65 ו-P65 זירחון (p-P65), כאשר glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) שימש כביקורת טעינה. (F) הערכת Western blot של החלבונים הקשורים לאפופטוזיס B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) ו-Bcl-2-associated X protein (Bax), באמצעות β-actin כביקורת טעינה. (G) הערכה וכמותיות של אפופטוזה באמצעות ציטומטריית זרימה בתאים עם וקטור-ביקורת ובתאים עם ביטוי יתר של LINC01871. כל הניסויים במעבדה (in vitro) כללו שלושה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות. תמונות ה-western blot המוצגות הן מייצגות של שלושה ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). השוואות בין תאי בקרה וקטורית לבין תאים המבטאים באופן יתר את LINC01871 בוצעו באמצעות מבחן Student למדגמים בלתי זוגיים ת-מבחן או מבחן Mann–Whitney U לאחר הערכת נורמליות באמצעות מבחן Shapiro–Wilk. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ו-****P < 0.0001; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

ניתוח Pan-Cancer של LINC01871
בהינתן התכונות המדכאות גידולים המקושרות ל-LINC01871 בסרטן השד, הרחבנו את הניתוח למספר סוגי סרטן כדי לאפיין את ביטויו ואת הקשרי הפרוגנוזה שלו. ביטוי דיפרנציאלי של LINC01871 נצפה במספר גידולים ממאירים בנוסף לסרטן השד (איור 5A). באדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD), קרצינומה של תאי כלייה צלולים (KIRC), קרצינומה פפילרית של תאי כלייה (KIRP), קרצינומה של תאי קשקש של הריאה (LUSC) וקרצינומה של בלוטת התריס (THCA), זוהו הבדלים משמעותיים בין רקמות גידול לרקמות נורמליות הן בהשוואות צמדיות והן בהשוואות שאינן צמדיות (איור 5B). ניתוחי הישרדות זיהו בנוסף קשרים פרוגנוסטים משמעותיים עבור LINC01871 בקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSC), KIRC, גליומה בדרגה נמוכה במוח (LGG), אדנוקרצינומה של החלחולת (READ), מלאנומה עורית (SKCM), קרצינומה של אנדומטריון גוף הרחם (UCEC), קרצינומה אורותליאלית של השלפוחית (BLCA), קרצינומה של תאי כבד (LIHC) ואדנוקרצינומה של הערמונית (PRAD) (איור 5C–E).

figure-results-5
איור 5ניתוחי ביטוי ופרוגנוזה של LINC01871 במגוון סוגי סרטן. 
(A,B) השוואה של ביטוי LINC01871 בין רקמות גידול לרקמות נורמליות במספר סוגי סרטן באמצעות אנליזות לא זוגיות (A) וזוגיות (B). (C–E) קשרים פרוגנוסטיים של LINC01871 המראים יחסי סיכון (hazard ratios) בטרנספורמציית לוגריתם עבור הישרדות כוללת (C), הישרדות ספציפית למחלה (D), ומרווח ללא התקדמות המחלה (E). HR, יחס סיכון; TPM, תמלילים למיליון; ns, לא מובהק. קיצורי סוגי הסרטן מבוססים על המינומנקלטורה של The Cancer Genome Atlas. נתונים לא זוגיים של גידול מול נורמלי הוערכו באמצעות מבחן Mann–Whitney U (A), בעוד שנתונים זוגיים של גידול מול נורמלי הוערכו באמצעות מבחן Wilcoxon signed-rank (B). קשרים עם הישרדות כוללת, הישרדות ספציפית למחלה ומרווח ללא התקדמות המחלה נבחנו באמצעות רגרסיית Cox למסכנות פרופורציונליות חד-משתנית (C–E). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ו-****P < 0.0001; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מתאם בין ביטוי LINC01871 לבין חדירת תאי מערכת החיסון
בשלב הבא אפיינו את ההפצה התאית של LINC01871 באמצעות נתוני ריצוף RNA של תא בודד (single-cell RNA-sequencing) מדגימות של סרטן השד (GSE161529). לאחר בקרת איכות, תיקון אפקטים של סדרות (batch effects), צבירה (clustering) ואנוטציה של סוגי תאים, האוכלוסיות שזוהו כללו תאים אפיתליאליים, תאי T מסוג CD8⁺, תאי T, מקרופאגים, פיברובלסטים, תאי חולש טבעיים (NK) ותאי B (איור 6A). מבין אוכלוסיות אלו, ביטוי LINC01871 היה הבולט ביותר בתאי T ובתאי NK (איור 6B,C). לכן, בחנו לעומק את הקשר בין LINC01871 לבין המיקרו-סביבה החיסונית באמצעות הערכות חדירה המבוססות על טרנסקריפטום. ניתוח CIBERSORT הצביע על כך שבקבוצה עם ביטוי גבוה של LINC01871 היו שיעורים מוערכים גבוהים יותר של מספר אוכלוסיות חיסוניות, כולל תאי T מסוג CD8⁺, תאי NK ומקרופאגים מסוג M1, לצד שיעורים מוערכים נמוכים יותר של תאי T רגולטוריים (Tregs) ומקרופאגים מסוג M2 (איור 6D). באופן דומה, ציוני חיסון שהופקו באמצעות ESTIMATE היו גבוהים יותר בדגימות עם ביטוי גבוה של LINC01871 (איור 6E). ניתוח באמצעות ssGSEA המבוסס על גנים מסמנים של תאי מערכת החיסון שדווחו בעבר הניב תבניות עקביות באופן כללי (איור 6F). הרחבת ניתוח זה על פני סוגים שונים של סרטן הראתה מתאמים משמעותיים בין ביטוי LINC01871 לבין השפעה מוערכת של אוכלוסיות תאי חיסון מרובות (איור 6G).

figure-results-6
איור 6ניתוחי ביטוי ברמה של תא בודד וסינון חדירה חיסונית של LINC01871. 
(A) ייצוג Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) של אוכלוסיות תאים מסומנות שזוהו מנתוני ריצוף RNA של תא בודד (single-cell RNA-sequencing). (B) תרשים מאפיינים (feature plot) של UMAP המתאר את התפלגות הביטוי של LINC01871 בין אוכלוסיות התאים המסומנות. (C) תרשים נקודות (Dot plot) המציג את פרופורציית התאים המבטאים LINC01871 ואת ממוצע הביטוי המנורמל עבור כל סוג תא. (D) פרופורציות יחסיות של 22 אוכלוסיות תאי חיסון בקבוצות עם ביטוי נמוך וגבוה של LINC01871, כפי שהוערכו באמצעות Cell-type Identification by Estimating Relative Subsets of RNA Transcripts (CIBERSORT). (E) ציוני סביבה מיקרו-גידולית (tumor microenvironment), חיסונית וסטרומלית שנגזרו באמצעות Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumour tissues using Expression data (ESTIMATE). (F) ציונים הקשורים למערכת החיסון שהתקבלו באמצעות ניתוח העשרה של קבוצות גנים לדגימה בודדת (ssGSEA) בקבוצות עם ביטוי נמוך וגבוה של LINC01871. (G) קשרי פאן-סרטן (Pan-cancer) בין ביטוי LINC01871 לבין חדירת תאי חיסון, כפי שהוערכו באמצעות ssGSEA. NK, תאי קטל natürliche; TME, סביבה מיקרו-גידולית. קיצורי סוגי הסרטן מבוססים על הנומנקלטורה של The Cancer Genome Atlas. הבדלים בין הקבוצות עם ביטוי נמוך וגבוה של LINC01871 הוערכו באמצעות מבחן Mann–Whitney U (D–F). קשרי פאן-סרטן בין ביטוי LINC01871 לבין חדירת תאי חיסון הוערכו באמצעות ניתוח מתאם ספירמן (G). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ו-****P < 0.0001; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

זמינות נתונים:
מערכי הנתונים שנותחו במחקר זה זמינים לציבור ב-The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov) וב-Gene Expression Omnibus (GEO; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). מערכי הנתונים ששימשו למחקר כוללים את קוהורט TCGA-BRCA ואת GSE161529 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). איורי השלמה 1–3 מספקים ניתוחים ביו-אינפורמטיים ופרוגנוסטיים נוספים. טבלת השלמה 1 מפרטת את רצפי הפריימרים ששימשו ל-reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), ו-טבלת השלמה 2 מפרטת את הנוגדנים הראשוניים והמשניים ששימשו לניתוח western blot. סקריפטי ה-R ששימשו לניתוחים הביו-אינפורמטיים והסטטיסטיים מסופקים כ-קובץ השלמה 1.

איור משלים 1. זיהוי גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי ומודולים של רשת ביטוי משותף של גנים משוקללת (WGCNA) הקשורים לרגישות חזויה למעכבי CDK4/6. 
(A,B) תרשימי געש (Volcano plots) המראים גנים עם ביטוי דיפרנציאלי בין הקבוצות החזויות כעמידות והחזויות כרגישות לריבוסיקליב (A) ולפלבוסיקליב (B). (C,D) דנדרוגרמות של אשכולות שהופקו באמצעות WGCNA, המראות אשכולית גנים והקצאה למודולים עבור ריבוסיקליב (C) ופלבוסיקליב (D). גנים עם ביטוי דיפרנציאלי הוגדרו ככאלו בעלי ערך מוחלט של לוג2 שינוי שכיחות (fold change) של $\ge 0.5$ וערך מותאם P ערך של <0.05. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2. ביצועים פרוגנוסטיים וחיזוי של חמישה מועמדים נוספים ל-lncRNAs.
(A) ניתוחי הישרדות של קפלן-מייר עבור חמישה מועמדים נוספים ל-lncRNAs שזוהו באמצעות רגרסיית LASSO. (B,C) ניתוחי עקומות מאפיין תגובה של מקלט (ROC) המראים את הביצועים האבחנתיים של חמשת ה-lncRNAs הללו לחיזוי עמידות ל-ribociclib (B) ול-palbociclib (C). ניתוחים תואמים עבור LINC01871 מוצגים באיורים 1 ו-3. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 3. הערכה פרוגנוסטית של LINC01871 בסרטן השד.
(A) ערכי ריכוז עיכוב חציוני מקסימלי (IC50) חזויים עבור ribociclib ו-palbociclib בקבוצות עם ביטוי גבוה ונמוך של LINC01871 בתוך תת-הקבוצה החיובית לקולטן הורמונלי/שלילית לגורם גדילה אפידרמלי אנושי 2 (HR-positive/HER2-negative). (B) ניתוחי מתאם Spearman בין ביטוי LINC01871 לערכי IC50 חזויים עבור ribociclib ו-palbociclib בתת-הקבוצה HR-positive/HER2-negative. (C) ניתוח הישרדות קפלן-מאייר של מרווח ללא התקדמות (PFI) בהתאם לביטוי LINC01871. (D) ניתוח הישרדות קפלן-מאייר של חולים שקיבלו רדיותרפיה, בחלוקה לפי ביטוי LINC01871. (E) נומוגרמה המשלבת את ביטוי LINC01871 ומאפיינים קליניקו-פתולוגיים לחיזוי הישרדות כוללת בעקבת TCGA-BRCA הכוללת. (F) עקומות כיול המעריכות את ההתאמה בין הסתברויות הישרדות חזויות ונצפות עבור הנומוגרמה בטווח של 1, 3 ו-5 שנים. השוואות בלוח A נותחו באמצעות מבחן Mann–Whitney U, ומתאמים בלוח B הוערכו באמצעות ניתוח מתאם Spearman. IC50, ריכוז עיכוב חציוני מקסימלי; PFI, מרווח ללא התקדמות; HR, קולטן הורמונלי; HER2, גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ו- ****P < 0.0001; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נספחת 1. רצפי פריימרים ששימשו לתגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR).
רצפי פריימרים קדמיים ואחוריים (5′→3′) ששימשו לניתוח RT-qPCR של LINC01871 ושל הגן הייחוס האנדוגני GAPDH. אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה נלווית 2. נוגדנים ראשוניים ומשניים ששימשו לניתוח western blot.
נוגדנים ראשוניים ומשניים ששימשו לניתוח western blot, כולל החלבון המטרה או ספיציפיות הנוגדן, הספק, מספר קטלוגי, מין המארח, מהילול עבודה ומזהה משאבי מחקר (RRID). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1. סקריפטים של R ששימשו לניתוחים ביו-אינפורמטיים וסטטיסטיים.
קובץ משלים זה מכיל את סקריפטים של R ששימשו ליצירת הניתוחים הביו-אינפורמטיים והאיורים המוצגים במחקר זה, כולל ניתוח טרנסקריפטומי, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, ניתוח רשת ביטוי גנים משותף משוקלל (WGCNA), רגרסיית LASSO (least absolute shrinkage and selection operator), ניתוח הישרדות, ניתוח ROC (receiver operating characteristic), ניתוח העשרה פונקציונלית, ניתוח חדירה חיסונית, ניתוח ריצוף RNA של תא בודד ויצירת איורים. סקריפטים בודדים תואמים לאיורים הראשיים ולאיורים המשלימים המוצגים בכתב היד. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

הבנה גוברת של ביולוגיית הסרטן הובילה לזיהוי של מטרות טיפוליות חדשות ולביסוס של טיפולים ממוקדים כמרכיב חשוב בטיפול בסרטן17. עם זאת, התפתחות של עמידות לטיפול ממשיכה להגביל את יעילותם לטווח ארוך. במחקר זה, שילוב של ניתוחי מולטי-אומיקס עם גישות של למידה חישובית (machine learning) זיהה את LINC01871 כמועמד הקשור לרגישות חוזה לריבוסיקליב (ribociclib) ולפאלבוסיקליב (palbociclib). ניתוחים ניסיוניים הראו עוד שביטוי יתר של LINC01871 הגביר את הרגישות לשני הסוכנים in vitro ודיכא את השגשוג של תאי סרטן השד במודלים מבוססי תאים ובמודלים של קסנוגרפט (xenograft). השפעות אלו לוו בירידה בפעילות של מסלול NF-κB, דבר המרמז על קשר פוטנציאלי בין LINC01871 למסלול איתות זה. תצפיות אלו עשויות להיות רלוונטיות לשימוש הגובר בביו-מרקרים כדי להנחות החלטות טיפוליות במהלך טיפול המבוסס על מעכבי CDK4/6. עם זאת, הראיות התומכות ב-LINC01871 שונות מהותית מאלו הזמינות עבור גישות מבוססות ביו-מרקרים מבוססות. לדוגמה, ניטור של מוטציות ב-ESR1 ב-DNA של גידולים במחזור הדם עבר הערכה פרוספקטיבית כאסטרטגיה להתאמת טיפול אנדוקריני. לעומת זאת, LINC01871 נותר ביו-מרקר מועמד ואין לראות בו בשלב זה כמתאים לקבלת החלטות קליניות. הבחנה זו חשובה במיוחד כיוון שאפשרויות הטיפול לאחר התקדמות במחלה תחת טיפול מבוסס מעכבי CDK4/6 בסרטן שד גרורתי HR-חיובי/HER2-שלילי כוללות כעת מפרקי קולטני אסטרוגן סלקטיביים (selective estrogen receptor degraders) במתן פה, מעכבי מסלול PI3K/AKT, ותרופות מצומדות לנוגדנים (antibody–drug conjugates)18,19. בתוך נוף טיפולי מתפתח זה, ביו-מרקרים המסוגלים להבחין בהבדלים ברגישות למעכבי CDK4/6 עשויים לסייע בסטרטפיקציה של הטיפול. למרות שממצאינו תומכים בקשר בין LINC01871 לרגישות לריבוסיקליב ולפאלבוסיקליב, הראיות נובעות כעת מהערכות חישוביות של רגישות לתרופות יחד עם ניסויי in vitro. לפיכך, יידרשו קהליי מחקר פרוספקטיביים עם תיעוד של חשיפה למעכבי CDK4/6 ותוצאות קליניות כדי לקבוע האם ל-LINC01871 יש ערך ניבואי בחולים.

התועלת הטיפולית של מעכבי CDK4/6 בסרטן השדי החיובי לקולטנים של אסטרוגן ו-/או פרוגסטרון הוכחה במספר ניסויים קליניים4,5,6. פוטנציאל התועלת שלהם בסרטן שדיים טריפל-נגטיביב עורר אף הוא חקירה20,21. לדוגמה, Yang ואחרים מצאו כי targeting סימולטני של CDK4/6 ו-CDK7 עיכב את התרבות תאי סרטן שדיים טריפל-נגטיביב22. מחקרים אחרים זיהו שינויים מולקולריים שעשויים לשנות את התגובה לעכבי CDK4/6. דווח כי עיכוב של GPX4 מגביר את הרגישות ל-palbociclib הן בסרטן שדיים חיובי לקולטן אסטרוגן והן בסרטן שדיים טריפל-נגטיביב23, בעוד ש-C9orf142 נקשר לעמידות למעכבי CDK4/6 בסרטן שדיים טריפל-נגטיביב20. לעומת זאת, דווח כי עיכוב של ACAA1 מגביר את רגישות תאי סרטן השדיים למעכבי CDK4/624. חלק ניכר מהעבודות הקיימות על הגורמים המולקולריים לתגובה למעכבי CDK4/6 התמקד בגנים מקודדי חלבון, מה שהשאיר את תרומתם של lncRNAs פחות מאופיינת. ממצאינו מרחיבים תחום זה על ידי זיהוי LINC01871 כ-RNA לא מקודד פוטנציאלי הקשור לתגובה למעכבי CDK4/6. בדיקות ציטוטוקסיות ובדיקות יצירת מושבות, יחד עם הערכה בציטומטריית זרימה וניתוח של חלבונים הקשורים למחזור התא, קישרו באופן עקבי בין ביטוי יתר של LINC01871 לרגישות גבוהה יותר ל-ribociclib ו-palbociclib. בדיקות התרבות נפרדות ומודל קסנוגרפט תמכו עוד בקשר מעכב בין ביטוי יתר של LINC01871 לבין צמיחת סרטן השדיים.

כדי לחקור את המנגנונים שעשויים לעמוד בבסיס תצפיות אלו, בחנו את הפרופילים התפקודיים של גנים שהתבטאו באופן דיפרנציאלי בין הקבוצות עם רמות גבוהות ונמוכות של LINC01871, ושל גנים בעלי ביטוי משותף עם LINC01871. ניתוחי GO ו-KEGG קישרו את שני סטים של הגנים לתהליכים הקשורים למערכת החיסון ולאיתות NF-κB. ממצא זה רלוונטי לוויסות מחזור התא כיוון שדווח בעבר כי איתות NF-κB מעלה את הביטוי של cyclin D ובכך מקדם את התקדמות מחזור התא25,26. Zhou וחב' הראו עוד כי NF-κB יכול להקיים אינטראקציה עם מקדם CDK6 ולעורר את תמלול CDK627. תיאור של קשר הדדי (Crosstalk) בין NF-κB לנתיב PI3K/AKT/mTOR הופיע אף הוא בספרות28, ונתיב אחרון זה מעורב בעמידות למעכבי CDK4/611. יחד, תצפיות אלו מספקות רציונל לבחינת פעילות NF-κB בהקשר של LINC01871. בהלימה לתוצאות ההעשרה, תאים עם ביטוי יתר של LINC01871 הפגינו פוספורילציה נמוכה יותר של P65. עם זאת, נתונים אלו מבססים קשר ולא מנגנון רגולטורי ישיר, ולאופן שבו LINC01871 משפיע על איתות NF-κB נותר להי Determined.

המיקרו-סביבה החיסונית מהווה גורם פוטנציאלי נוסף לתגובה למעכבי CDK4/6. לדוגמה, דווח כי תאי γδ T מסייעים ליצירת עמידות באמצעות השפעות המתווכות על ידי מקרופאגים CX3CR1⁺29. לואו ושות' הבחינו בחדירה רבה יותר של תאי CD8⁺ T ותאי NK בגידולים של מטופלים שפיתחו עמידות למעכבי CDK4/6 בנקודות זמן מאוחרות יותר30. ניתוח התאים הבודדים שביצענו הראה כי ביטוי של LINC01871 היה בולט יותר בתאי T ובתאי NK מאשר בתאים אפיתליאליים. ניתוחים משלימים מבוססי טרנסקריפטומה קשרו ביטוי גבוה יותר של LINC01871 להערכת חדירה גבוהה יותר של תאי CD8⁺ T, מקרופאגי M1 ותאי NK, ולהערכת חדירה נמוכה יותר של מקרופאגי M2 ותאי Tregs. תאי CD8⁺ T, מקרופאגי M1 ותאי NK נקשרו לפעילות חיסונית אנטי-גידולית, בעוד שמקרופאגי M2 נקשרו לתפקודי קידום גידולים31,32,33,34. יחד, תוצאותינו מרמזות כי ביטוי גבוה יותר של LINC01871 עשוי להיות קשור למיקרו-סביבת גידול פעילה יותר מבחינה חיסונית. עם זאת, פרשנות זו נשארת ראשונית, כיוון שהערכות התאים החיסוניים הוסקו מפרופילים טרנסקריפטומיים ולא נמדדו ישירות, ומחקרים תפקודיים יהיו נחוצים כדי לקבוע אם ל-LINC01871 יש תפקיד בעיצוב המיקרו-סביבה החיסונית.

יש להכיר מספר מגבלות בעת פירוש ממצאים אלה. ראשית, LINC01871 זוהה באמצעות ניתוח מולטי-אומיקס אינטגרטיבי שבו התגובה לסמים הוסקה באופן חישובי ולא הושגה מחולים שקיבלו מעכבי CDK4/6. למרות שניסויים ישירים in vitro הראו רגישות גבוהה יותר ל-palbociclib ו-ribociclib בעקבות ביטוי יתר של LINC01871, תוצאות אלו אינן מבססות את ערכו החזוי בחולים. לפיכך, יידרשו קהילות עצמאיות עם חשיפה מתועדת למעכבי CDK4/6 ונתוני תגובה קלינית כדי להעריך את LINC01871 כסמן ביולוגי חזוי. שנית, ניתוח הגילוי בוצע בתחילה על פני כל קהילת TCGA-BRCA, המקיפה תתי-סוגים הטרוגניים קלינית של סרטן השד. הקשר בין LINC01871 לרגישות לסמים החזויה נצפה גם בתת-הקבוצה HR-positive/HER2-negative; עם זאת, נדרש אישור באוכלוסיות HR-positive/HER2-negative שטופלו קלינית. שלישית, ניתוחי התגובה לסמים שלנו הוגבלו ל-palbociclib ו-ribociclib מכיוון שנתוני תגובה מקבילים ל-abemaciclib לא היו זמינים במערך הנתונים GDSC2 ששימש למחקר זה. לכן, נותר לא ידוע אם הקשר שנצפה חל גם על abemaciclib. רביעי, למרות ההשפעות המדכאות גידולים שנצפו בניסויי תאים ובניסויי xenograft, הקשר המולקולרי בין LINC01871 לסיגנלינג של NF-κB לא הוכח. הפחתה ב-phosphorylation של P65 לבתה ביטוי יתר של LINC01871, אך המכניזם האחראי לקשר זה דורש חקירה נוספת. באופן דומה, התצפיות הקשורות למערכת החיסון נגזרו בעיקר מניתוחים חישוביים מבוססי טרנסקריפטום ויש לפרשן כקשרים ולא כראיה לכך ש-LINC01871 מווסת באופן ישיר את המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול. לבסוף, עמידות למעכבי CDK4/6 כוללת תהליכים ביולוגיים מרובים, וסביר ש-LINC01871 לא יסביר את מלוא המורכבות של התגובה לטיפול. לכן, חקירות עתידיות צריכות לשלב קהילות ספציפיות לתת-סוגים, הערכה של abemaciclib, תיקוף ניסיוני של הקשרים הקשורים למערכת החיסון, מחקרים מכניסטיים של הקשר בין LINC01871 לסיגנלינג של NF-κB, והערכה קלינית פרוספקטיבית כדי לקבוע האם ל-LINC01871 יש תועלת כסמן ביולוגי חזוי.

גילויים

ניגוד עניינים:
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז פוג'יאן (Grant No. 2022J011056). המחברים מודים ל-The Cancer Genome Atlas (TCGA) ול-Gene Expression Omnibus (GEO) על אספקת מאגרי הנתונים הזמינים לציבור ששימשו במחקר זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחטי מזריקה G25BeyotimeFS802-30 יחידותמחטי מזרק חד-פעמיות המשמשות עבור מסיח הפה והחלשה מוקדמת רשות של הרצועה הפרודונטלית
תמיסת פאראפורמאלדהיד 4%SolarbioP1110תמיסת פראפורמאלדהיד 4% המשמשת לקיבוע דגימות
75% אתנולחנות המכשירים הרפואיים של Ouseמכיוון שלא סופק טקסט מקור לתרגום, אנא ספק את התוכן באנגלית שברצונך לתרגם לעברית.אתנול בדרגה רפואית בריכוז 75% המשמש לחיטוי משטחים
עכברי C57BL/6Charles River213עכברי C57BL/6 זכרים בני 8 שבועות במשקל 22–29 גרם
קרפרופן (Carprofen)SolarbioC5350משכך כאבים לאחר ניתוח שניתן תת-עורית במינון של 5 מג/ק"ג
כדורי צמר גפןOuning Medical Devicesלא רלוונטיכדורי צמר סטריליים המשמשים לניקוי פומי ולהומיסטזיס
CTAn v1.18.4.0+SkyScanמכיוון שלא סופק טקסט מקור לתרגום, אנא ספק את התוכן באנגלית שברצונך לתרגם לעברית.תוכנה המשמשת ל μCT ניתוח תמונות
DataViewer v1.5.6.2SkyScanלא רלוונטיתוכנה המשמשת לצפייה ולייצוא של שחזורים μCT תמונות
כיסויי אצבעותמשרד LeSuMEKU-1/2/3Bכיסויי אצבע המשמשים להגנה על האגודל במהלך שליפה
לוח קצףDongguan Lijianglong Industrial Co., Ltd.לא רלוונטילוח קצף המשמש כפלטפורמת עבודה וקיבוע
תזונת ג'לReadyDietechJ10001תזונה לאחר ניתוח שתסופק על רצפת הכלוב למשך 3 ימים, במידה ויש להשתמש בה
GraphPad Prism v10.1.2GraphPadRRID: SCR_002798תוכנה המשמשת לניתוח סטטיסטי וליצירת גרפים
פנס ראשמפעל ציוד המיגון Bazhou Pengenלא רלוונטיפנס ראש המשמש להארת השדה הכירורגי
משטח חימוםShijiazhuang Jianuan Electrical Appliances Co., Ltd.לא רלוונטיפד חימום שחומם מראש לטמפרטורה של בערך 38 °C להחלמה לאחר ניתוח
פנטום הידרוקסיאפטיטQRMQRM-70127פנטום כיול המשמש להמרת ערכי ניחות ב-CT לצפיפות מינרלית של העצם
מכשיר הגדלהOlympus CorporationSZX10מכשיר המשמש לבדיקת קצות הפינצטה המשוננים ושל חור העקירה תחת הגדלה
מסכהחנות המתמחות במכשור רפואי של Senlunלא רלוונטימסכה כירורגית
סורק מיקרו-computed tomography (מיקרו-CT)Bruker SkyScanSkyScan 1276μCT סורק ששימש במתח של 80 kV, 500 μAו- 10 μm רזולוציית ווקסל
Mimics Research v21.0MaterialiseRRID: SCR_015802תוכנה המשמשת לשחזור תלת-ממדי
פנטוברביטל נתרןSigma-AldrichP3761מלח נתרבנטובארביטל המשמש כתמיסת הרדמה בריכוז של 1%
תמיסת סלין עם בופר פוספטSolarbioP1010אבקת תמיסת סלין בבופר פוספט 0.01 M, pH 7.2–7.4
תמיסת חיטוי פובידון- יוד (Povidone-iodine)סניף הדגל של בית המרקחת Belkonלא רלוונטיתמיסת פובידון- יוד המשמשת לחיטוי הבטן
גומיותמפעל מוצרי הגומי Foshan Puliלא רלוונטיגומיות המשמשות להרכבת פותח הפה
תמיסת מלחThermo FisherBR0053Gטבליות מלח המשמשות להכנת תמיסא לניקוי פומי
תזונת תבואה סטנדרטיתJiangsu Xietong Pharmaceutical and Biotechnology Engineering Co., Ltd.XTC01WC-001מזון סטנדרטי המשמש לדיור שגרתי, אשר הועשן לצורך האכלה לאחר ניתוח
סטריליזטור קיטורמתקן מוסדילא רלוונטיציוד המשמש לעיקור של הפינצטה המשוננת ושל תמיסת המלח
מקלוני צמר סטרילייםחנות המכשור הרפואי Kangbailaiמכיוון שלא סופק טקסט למקור, אין תוכן לתרגום. אנא ספק את הטקסט באנגלית המיועד לתרגום.מקלוני צמר סטריליים לשימוש חד-פעמי
כפפות סטריליותחנות למכשור רפואי מתמחה Senlunלא רלוונטיכפפות לטקס סטריליות
בד לא ארוג סטריליחנות האנג'ואו של Shandong Xinhua Infection Control Suppliesלא רלוונטיבד לא רקומ סטרילי המשמש לכיסוי משטח הניתוח ומסדית החממה
כובע ניתוח סטריליחנות המכשירים הרפואיים המתמחה של Senlunלא רלוונטיכיפה כירורגית סטרילית
בגדי ניתוחחנות למכשור רפואי מתמחה Senlunלא רלוונטיבגדי התערבות כירורגיים נקיים הנלבשים במהלך הפרוצדורה
סרט דביקThermo Fisher15947סרט דביק המשמש לקיבוע גפיו של העכבר
פינצטה אופתלמית עם שינייםBeyotimeFS229פינצטה אופתלמית בעלת שיניים המשמשת כפינצטה דנטלית
משחה עינית ווטרינריתDechra Veterinary Products143-16משחה עינית המיושמת לאחר הרדמה למניעת התייבשות הקרנית

מקורות

  1. Bray F, et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2024;74(3):229-63.
  2. Xiong X, et al. Breast cancer: Pathogenesis and treatments. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):49.
  3. Ye F, et al. Advancements in clinical aspects of targeted therapy and immunotherapy in breast cancer. Mol Cancer. 2023;22(1):105.
  4. Johnston SRD, et al. Abemaciclib plus endocrine therapy for hormone receptor-positive, HER2-negative, node-positive, high-risk early breast cancer (monarchE): Results from a preplanned interim analysis of a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol. 2023;24(1):77-90.
  5. Slamon D, et al. Ribociclib plus endocrine therapy in early breast cancer. N Engl J Med. 2024;390(12):1080-91.
  6. Finn RS, et al. The cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib in combination with letrozole versus letrozole alone as first-line treatment of oestrogen receptor-positive, HER2-negative, advanced breast cancer (PALOMA-1/TRIO-18): A randomised phase 2 study. Lancet Oncol. 2015;16(1):25-35.
  7. Morrison L, Loibl S, Turner NC. The CDK4/6 inhibitor revolution-a game-changing era for breast cancer treatment. Nat Rev Clin Oncol. 2024;21(2):89-105.
  8. Guo Z, et al. Cyclin-dependent kinase 4 and 6 inhibitors in breast cancer treatment. Oncogene. 2025;44(17):1135-52.
  9. Vora SR, et al. CDK4/6 inhibitors sensitize PIK3CA-mutant breast cancer to PI3K inhibitors. Cancer Cell. 2014;26(1):136-49.
  10. Foffano L, et al. Cyclin-dependent kinase 4 and 6 inhibitors (CDK4/6i): Mechanisms of resistance and where to find them. Breast. 2025;79:103863.
  11. Hao C, et al. PI3K/AKT/mTOR inhibitors for hormone receptor-positive advanced breast cancer. Cancer Treat Rev. 2025;132:102861.
  12. Bidard FC, et al. Switch to fulvestrant and palbociclib versus no switch in advanced breast cancer with rising ESR1 mutation during aromatase inhibitor and palbociclib therapy (PADA-1): A randomised, open-label, multicentre, phase 3 trial. Lancet Oncol. 2022;23(11):1367-77.
  13. Bidard FC, et al. First-line camizestrant for emerging ESR1-mutated advanced breast cancer. N Engl J Med. 2025;393(6):569-80.
  14. Zhang D, et al. Cancer-associated fibroblasts promote tumor progression by lncRNA-mediated RUNX2/GDF10 signaling in oral squamous cell carcinoma. Mol Oncol. 2022;16(3):780-94.
  15. Chen F, et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nat Cell Biol. 2019;21(4):498-510.
  16. Chen X, et al. Estrogen-induced lncRNA LINC02568 promotes estrogen receptor-positive breast cancer development and drug resistance through both in trans and in cis mechanisms. Adv Sci (Weinh). 2023;10(25):e2206663.
  17. Huang R, Zhou PK. DNA damage repair: Historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):254.
  18. Güren AK, et al. Post-CDK4/6 inhibitor treatment landscape in metastatic hormone receptor-positive breast cancer: A narrative review. Expert Rev Anticancer Ther. 2026;26(4):425-35.
  19. Güren AK, et al. Efficacy and safety of sacituzumab govitecan in hormone receptor-positive metastatic breast cancer: A systematic review and meta-analysis. J Oncol Pharm Pract. 2026. doi:10.1177/10781552261462434.
  20. Liao L, et al. C9orf142 transcriptionally activates MTBP to drive progression and resistance to CDK4/6 inhibitors in triple-negative breast cancer. Clin Transl Med. 2023;13(11):e1480.
  21. Zhu X, et al. Efficacy and mechanism of the combination of PARP and CDK4/6 inhibitors in the treatment of triple-negative breast cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2021;40(1):122.
  22. Yang Y, et al. Dual inhibition of CDK4/6 and CDK7 suppresses triple-negative breast cancer progression via epigenetic modulation of SREBP1-regulated cholesterol metabolism. Adv Sci (Weinh). 2025;12(5):e2413103.
  23. Herrera-Abreu MT, et al. Inhibition of GPX4 enhances CDK4/6 inhibitor and endocrine therapy activity in breast cancer. Nat Commun. 2024;15(1):9550.
  24. Peng WT, et al. Inhibition of ACAA1 restrains proliferation and potentiates the response to CDK4/6 inhibitors in triple-negative breast cancer. Cancer Res. 2023;83(10):1711-24.
  25. Joyce D, et al. NF-κB and cell-cycle regulation: The cyclin connection. Cytokine Growth Factor Rev. 2001;12(1):73-90.
  26. Iwanaga R, et al. Activation of the cyclin D2 and CDK6 genes through NF-κB is critical for cell-cycle progression induced by HTLV-I Tax. Oncogene. 2008;27(42):5635-42.
  27. Zhou B, et al. Bortezomib suppresses self-renewal and leukemogenesis of leukemia stem cells by NF-κB-dependent inhibition of CDK6 in MLL-rearranged myeloid leukemia. J Cell Mol Med. 2021;25(6):3124-35.
  28. Yu M, et al. Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via the PI3K/AKT/NF-κB pathway. Biomed Pharmacother. 2017;90:677-85.
  29. Petroni G, et al. IL-17A-secreting γδ T cells promote resistance to CDK4/CDK6 inhibitors in HR-positive/HER2-negative breast cancer via CX3CR1-positive macrophages. Nat Cancer. 2025;6(10):1656-75.
  30. Luo L, et al. Single-cell RNA sequencing identifies molecular biomarkers predicting late progression to CDK4/6 inhibition in patients with HR-positive/HER2-negative metastatic breast cancer. Mol Cancer. 2025;24(1):48.
  31. Komuro H, et al. Single-cell sequencing of CD8-positive tumor-infiltrating lymphocytes revealed the nature of exhausted T cells recognizing neoantigens and cancer/testis antigens in non-small cell lung cancer. J Immunother Cancer. 2023;11(8):e007180.
  32. Rafei H, et al. CREM is a regulatory checkpoint of CAR and IL-15 signalling in NK cells. Nature. 2025;643(8073):1076-86.
  33. Van Elsas MJ, et al. Immunotherapy-activated T cells recruit and skew late-stage activated M1-like macrophages that are critical for therapeutic efficacy. Cancer Cell. 2024;42(6):1032-50.e1010.
  34. Yang J, et al. STK11 coordinates IL-4 signaling with metabolic reprogramming to control M2 macrophage polarization and antitumor immunity. Sci Adv. 2025;11(39):eadx5495.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CDK4 6RNAJocelynNF Kappa B
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.