מאמר שיטה

הדמיית הובלת נוזל חוט השדרה (CSF) באמצעות MRI עם חומר ניגוד דרך עירוי תוך-חדרי במכרסמים

55 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72175

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  , 
1Department of Electrical, Computer, and Systems Engineering, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Radiology, Case Western Reserve University, 4Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול של קנולציה תו-חדרית והזרקת חומר סימון המותאם למחקרי MRI עם הגברת ניגודיות דינמית (DCE-MRI) במכרסמים. הפרוטוקול מאפשר הזרקה רציפה של חומר הסימון במהלך רכישת הדמויות, ובכך מאפשר מיפוי של המוח כולו לצורך בחינת הובלת חומר הסימון ופינויו מהמוח במסגרת סשן דימות בודד ורציף.

תקציר

קניולציה תו-חדרית (ICV) מאפשרת הזרקה של סמני מעקב חיצוניים או סוכנים טיפוליים ישירות לתוך החדרי הצדיים, שהם מקור נתיב זרימת נוזל המוח והשדרה (CSF). מולקולות שהוזרקו מועברות על ידי זרימה המונית של CSF דרך מדורי החדרים אל החלל התת-עכבישי, ומשם הן חודרות לסבך המוח (brain parenchyma) via החלל הפרי-וסקולרי. עם זאת, שיטות קניולציה ICV קונבנציונליות משתמשות בדרך כלל בקניולות פרומגנטיות, שאינן תואמות לבדיקות MRI, ולכן דורשות שההזרקה תתבצע מחוץ לסורק ושהקניולה תוסר לפני הדמיה. הזמן הנדרש להעברת בעל החיים ולהכנת הדימות גורם לעיתים קרובות לאובדן השלב הראשוני, ואולי הקריטי ביותר, של מעבר סמני המעקב. כאן, אנו מתארים פרוטוקול קניולציה והזרקה ICV התואם ל-MRI עבור מכרסמים, התומך בהזרקה רציפה של סמני מעקב בתוך הסורק במהלך רכישת MRI דינמית. קו ההזרקה בנוי כולו מחומרים לא מגנטיים, מה שמאפשר רכישת תמונות ללא הפסקה בתוך סשן בודד. גישה זו מתאימה היטב למחקרי MRI דינמיים עם שימוש בחומרי ניגוד לבחינת דינמיקת CSF, הובלה גלימפטית, פינוי מומסים והזרקת תרופות תו-תקלית (intrathecal).

מבוא

המוח הוא אחד האיברים הפעילים והדינמיים ביותר מבחינה מטבולית בגוף, המייצר באופן רציף תוצרי פסולת שחייבים להיות מפונים ביעילות כדי לשמור על תפקוד עצבי תקין1. הצטברות של פסולת מטבולית היא סימן היכר של ניוון עצבי והזדקנות המוח2. המערכת הגלימפטית ממלאת תפקיד מרכזי בתהליך פינוי זה, ומסייעת בהסרה של תוצרי לוואי מטבוליים ופסולת רעילה באמצעות זרימה מסיבית של נוזל מוחי-שרירי (CSF) והחלפה של CSF עם נוזל הבין-תאי (ISF)3,4,5, תהליך המקלול על ידי תעלות המים של aquaporin-4 (AQP4) הממוקמות על רגלי הקצה של האסטרוציטים6. הבנה משמעותית של דינמיקת ה-CSF נרכשה באמצעות חקר הובלה של סמני CSF שונים. MRI עם הגברת ניגודיות דינמית (DCE-MRI) המשתמש בחומרי ניגודיות מבוססי גדוליניום (GBCAs) מתאים במיוחד להערכה של הובלת סמנים ברחבי המוח7,8. הרלוונטיות הקלינית של גישה זו הוכחה באמצעות עבודות תרגומיות בבני אדם. מתן תוך-תעלתי (intrathecal) של GBCAs ואחריו סדרת בדיקות MRI שימשו להערכת דינמיקת CSF במוח האנושי9. עבודה מאוחרת יותר הדגימה הובלת סמנים ברחבי המוח ואחריה פינוי במהלך הלילה10. גישה זו יושמה לאחרונה כדי לחשוף הובלה פרי-עורקית לקויה של סמנים בנבדקים עם קיבולת מילואים מופחתת של לחץ-נפח תוך-גולגולתי, כמו גם בחולים עם הידרוצפלוס אידיופתי עם לחץ תקין11. מחקרים אלו מבססים את ה-DCE-MRI של הובלת סמני CSF כגישה ניתנת לתרגום קליני ומניעים את הפיתוח של שיטות פרה-קליניות קפדניות וניתנות לשחזור לחקירה מכניסטית של ויסות דינמיקת CSF ופינוי פסולת.

קנולציה של הציסטרנה מגנה (intra-cisterna magna - ICM) משמשת בדרך כלל במחקרי גלימפטיקה לצורך הזרקת חומרי סימון (tracers)12עם זאת, רק כ-20% מחומרי הניגוד מבוססי הגדוליניום (GBCAs) שהגיעו באמצעות נתיב זה מובל אל תוך פהרנכימת המוח, כאשר רובו מתנקז ישירות אל עמוד השדרה או אל מערכת הלימפה8גישה זו טומנת בחובה גם סיכון לפגיעה במוחון או בגזע המוח, וקיבוע הקנולה למחקרים ארוכי טווח נותר מאתגר מבחינה טכנית. קנולציה תו-חדרית (ICV) התגלתה כחלופה חסונה יותר.13,14,15מחקר שנערך לאחרונה הדגים את השחזוריות שלו ואת יתרונותיו המרכזיים בהחדרת סמנים פלורסצנטיים, כולל קיבוע יציב של הקנולה המאפשר תנועה חופשית של בעל החיים ותומך בהזרקות חוזרות של סמנים במחקרי אורך.13.

למרות יתרונות אלו, פרוטוקולים קיימים של קנולציה של ה-ICV אינם תואמים באופן ישיר למחקרי MRI16. מכיוון שקנולציה של ה-ICV דורשת חדירה לפרונקימה של המוח, נעשה בה בדרך כלל שימוש בקנולות פרומגנטיות הגורמות לארטפקטים חמורים של סוסיבטיביות (susceptibility artifacts) בתמונות MRI. כתוצאה מכך, יש לבצע את עירוי הסמן מחוץ לסורק, כאשר את הקנולה מסירים לפני העברת החיה להדמיה. זרימת עבודה טיפוסית כוללת רכישת סריקת בסיס, הוצאת החיה לצורך קנולציה ועירוי סמן, ולאחר מכן מיקום מחדש של החיה לסריקות דינמיות עוקבות. זרימת עבודה מקוטעת זו מונעת רכישה רציפה המיוחסת לסריקת הבסיס, ומביאה לחוסר יישור עקב מיקום מחדש שעלול להטעות אנליזה קינטית ברמת הווקסל. חשוב מכך, מכיוון ששלב הספיגה המוקדם הוא בדרך כלל החלק הדינמי ביותר אך החולף ביותר של קינטיקת הסמן, ביצוע העברת החיה והגדרת הסורק במהלך חלון זמן זה מובילים לאובדן הנתונים המידעתיים ביותר.

כאן אנו מציגים פרוטוקול המטפל במגבלות אלו על ידי שילוב של קו עירוי ICV תואם MRI עם יכולת הזרקה של חומר ניגוד בתוך הסורק, המאפשרת רכישת MRI דינמית רציפה במכרסמים. גישה זו מאפשרת מיפוי כמותי של המוח כולו עבור הובלת סמן CSF במהלך סשן דימות יחיד ובלתי פסק. פרוטוקול זה מתאים היטב לחקר דינמיקת CSF בכל רחבי המוח, הובלה גלימפטית וקינטיקה של פינוי מומסים. למרות שהפרוטוקול מתואר כאן עבור חולדות בוגרות, ניתן להתאימו לעכברים באמצעות התאמות מתאימות של קואורדינטות הקנולציה ופרמטרי העירוי15.

פרוטוקול

הפרוטוקול המתואר להלן אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם (IACUC) של אוניברסיטת Case Western Reserve (A-3145-01-2023-0015), בהתאם למדריך לטיפול בבעלי חיים במעבדה ושימוש בהם ולמדיניות שירות בריאות הציבור בנושא טיפול הומני ושימוש בבעלי חיים במעבדה. הרכיבים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת קו העירוי

  1. חתוך מקטע של 30-mm של קנולה מנחושת ואורך של 2-m של צינור פוליאתילן (PE) באמצעות מספריים משוננים.
  2. תחת מיקרוסקופ, הרחב בעדינות קצה אחד של צינור ה-PE באמצעות מחט 30 G, לאחר מכן הכנס את קנולת הנחושת אל הקצה המורחב ואבטח את החיבור באמצעות דבק ציאנואקרילט. חבר את הקצה השני של צינור ה-PE למחט 30 G.
    הערה: נחושת היא חומר בעל מליטות גבוהה; יש להיזהר לא למעוך את הלומן בזמן החיתוך. הימנע מעיוות הקנולה או מניקוב הצינור במהלך ההרכבה. אורכו של צינור ה-PE צריך לאפשר הצבה של משאבת המזרקים מחוץ לשדה השולי של הסורק.
  3. מלא את מכלול הקנולה והצינור בתמיסת סמן מנוונת לגז וחבר אותו למזרק Hamilton בנפח 50 µL. עטוף את קצה המזרק בסרט איטום הברגות מפוליטטרהפלואורואתילן (PTFE) כדי למנוע דליפה. הפעל זהירות כדי להימנע מהחדרת בועות אוויר במהלך תהליך זה.
  4. התקן את מזרק ה-Hamilton על משאבת המזרקים ושאב למזרק 30 µL נוספים של תמיסת סמן.

2. הליך קנולציה

  1. שקלו את החולדה והרדימו אותה באמצעות הזרקה תוך-פריטונית של ketamine (90 mg/kg) ו-xylazine (10 mg/kg). ודאו עומק הרדמה מספק באמצעות רפלקס צביטה של בהונות. במידת הצורך, הוסיפו שליש מהמינון הראשוני ובדקו שוב לפני ההמשך.
  2. גלחו את הראש והצוואר, הסירו שיער רופף, וסטריליזרו את העור החשוף באמצעות פדים של ethanol 70%.
  3. קבעו את החולדה במכשיר סטריאוטקסי והניחו פד חימום המכוסה בנייר סופג מתחת לבעל החיים. מרחו משחה אופתלמית בשתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
  4. כווננו את תופסן האף כדי ליישר את הגולגולת. בצעו חתך בקו האמצע והסיטו את העור באמצעות ארבעה קליפסים של המוסטט כדי לחשוף את ה-bregma וה-lambda. מרחו hydrogen peroxide 3% על הגולגולת כדי לנקות שאריות של פריאוסטאום ולשפר את נראות נקודות הציון.
    הערה: יישור מדויק של הגולגולת הוא קריטי להשמה ניתנת לשחזור של הקנולה. כאמצעי בקרת איכות מעשי, השוו את הקואורדינטות המדיו-לטרליות (ML) והדורסו-ונטרליות (DV) ב-bregma וב-lambda: אם הגולגולת מיושרת כראוי, ההפרש בין שתי נקודות הציון לא יעלה על 0.2 mm בכל אחד מצירים ה-ML או ה-DV.
  5. התקינו את המקדחה החשמלית עם מקדח עדין על הזרוע הסטריאוטקסית וודאו שהזרוע נעולה היטב.
  6. מקמו את ראש המקדח ב-bregma, ולאחר מכן הזיזו אותו 0.7 mm אחורית (posterior) ו-1.4 mm לטרלית (lateral) ימינה. הורידו את המקדח עד שיבוא במגע עם פני השטח של הגולגולת ורשמו את קואורדינטת ה-DV.
  7. תחת תצפית במיקרוסקופ, התקדמו עם המקדח במרווחים של 0.1 mm. עצרו מיד עם פריצת הגולגולת (עובי גולגולת טיפוסי בחולדות בוגרות הוא 0.3–0.4 mm).
  8. החליפו את המקדח בקנולה הטעונה מראש על הזרוע הסטריאוטקסית. הפעילו את משאבת ההזרקה לזמן קצר עד שנוזל יתחיל לצאת מקצה הקנולה, כדי לאשר שנתיב הנוזלים אינו חסום.
  9. ודאו שהקנולה מותקנת בניצב לפני השטח של הגולגולת, ולאחר מכן יישרו אותה מעל חור הקידוח. התקיפו את הקנולה במהירות של 0.1 mm/s עד לעומק יעד סופי של 3.5 mm מתחת לפני השטח של הדורה (dural surface).
  10. מרחו טיפה של דבק לרקמות בממשק שבין הקנולה לגולגולת. לאחר שהדבק התקשה, סגרו את חתך הקרקפת באמצעות תפרים וכופפו בעדינות את קנולת הנחושת במקביל לפני השטח של הגולגולת כדי למנוע מגע עם סליל ה-MRI.

3. הגדרות ה-MRI ורכישה דינמית

  1. הנח את סליל שידור הנפח במרכז הגיאומטרי (isocenter) של הסורק.
  2. העבר את בעל החיים לעריסה תואמת-MRI במנח שכיבה על הבטן (prone). חבר את מערכת הניטור הפיזיולוגי, כולל חיישן הנשימה וגשש טמפרטורה רקטלי. הפעל את אמבט המים החמים במחזוריות כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב-~37 °C.
  3. שמור על הרדמה תקינה לאורך כל סשן הסריקה באמצעות איזופלוראן משלים המוגש דרך קונוס אף. התאם את ריכוז האיזופלוראן בין 0.25% ל-1.0% כדי לשמור על קצב נשימה של 50–70 breaths/min.
    הערה: הרדמה של Ketamine-xylazine שניתנה לפני ניתוח הקניולציה תספק טרנסדציה שיורית במהלך ההעברה הראשונית לעריסת ה-MRI. הֱזר את האיזופלוראן בהדרגה ונטר את קצב הנשימה באופן רציף במהלך הסריקה.
    זהירות: איזופלוראן הוא חומר נדיף המהווה סכנת שאיפה; השתמש במערכת שאיבה פעילה ומזער את חשיפת הצוות.
  4. הנח את משאבת ההזרקה מחוץ לשדה השולי של המגנט, הגדר את קצב ההזרקה ל-1 µL/min ואת משך ההזרקה ל-20 min, המקבילים לנפח הזרקה כולל של 20 µL. סדר ואבטח בזהירות את קו ההזרקה לאורך העריסה כדי למנוע מתיחה והסטה.
    זהירות: חפצים פרומגנטיים עלולים להפוך לקליעים מסוכנים כאשר הם מונחים ליד סורק MRI. שמור על כל הציוד שאינו תואם-MRI מחוץ לשדה השולי.
  5. התקן את סליל מערך השטח (surface array coil) ישירות מעל הגולגולת הגבית, כשהוא ממורכז על המוח. הנח פיסת נייר סופג קטנה בין הסליל לאתר החתך כדי לספוג כל נזילה מהפצע.
  6. הכנס את העריסה לתוך המגנט עד שהמוח נמצא במרכז הגיאומטרי. ודא שקו ההזרקה ומובילי הניטור הפיזיולוגי נשארים ללא חסימה.
  7. בצע את הגדרות הסורק הראשוניות ורכוש תמונות אנטומיות כדי לאשר הצבה מוצלחת של הקניולה.
  8. לאחר רכישת תמונות הבסיס, הפעל את משאבת ההזרקה ואת הסריקה הדינמית בו-זמנית, והמשך ברכישה למשך זמן כולל של 3 h (ראה טבלה 1 לפרטי הרכישה).

תוצאות

עמדת העבודה הניתוחית מוגדרת כדי לאפשר מיקום מדויק של המקדח לטרגוט של החדר הצדי (0.7 mm אחורית ו-1.4 mm צדית ל-bregma; איור 1A,D). קו ההזרקה מורכב מקנולה מנחושת באורך 30 mm, מקטע של 2 m של צינור PE, וממחט 30 G המחוברת למזרק Hamilton (איור 1B). אורך הצינור המורחב מאפשר להציב את משאבת המזרק מחוץ לשדה השולי של הסורק. לאחר קידוח חור ה-burr, קו ההזרקה הטעון מותקן על הזרוע הסטריאוטקסית, והקנולה מקודמת אל תוך החדר הצדי לעומק של 3.5 mm מתחת לפני השטח של הקסרה (איור 1C). לאחר קיבוע, הקנולה מכופפת במקביל לפני השטח של הגולגולת כדי למנוע מגע עם סליל ה-MRI (איור 1E).

ניתן לאשר קנולציה מוצלחת של ה-ICV באמצעות תמונות אנטומיות המציגות בבירור את מערכת הפרונטריקלים ואת נתיב הקנולה, מה שמאפשר ויזואליזציה ישירה של קצה הקנולה בתוך חלל הפרונטריקל הן בחתך סגיטלי (איור 2A) והן בחתך אקסיאלי (איור 2B). תמונות אלו מאפשרות גם להסיר מסריקות DCE-MRI בעלי חיים שבהם מיקום הקנולה היה שגוי, כולל הכנסה חלקית, כאשר הקצה מסתיים בתוך ה-corpus callosum, והכנסה עמוקה מדי, כאשר הקצה חודר לתוך התלמוס. ההתפלגות המרחבית-זמנית של הסמן בסריקות DCE-MRI עשויה לספק אישור נוסף למיקום מדויק של הקנולה, שכן מיקומים שגויים מזרים את הסמן אל פאראנכימת המוח, מה שיוצר קינטיקה שאינה עקבית עם התפשטות של סמן בתוך הפרונטריקלים.

עבור סריקות DCE-MRI, עירוי של חומרי ניגוד לתוך ה-ICV מתחיל לאחר רכישת תמונות הבסיס, ורכישת התמונות הדינמית יכולה להימשך עד 3 h או יותר (איור 2C). איור 2D מציג תמונות תלת-ממדיות מייצגות המשוקללות ל-T1 שנרכשו בנקודות זמן שונות לאחר עירוי חומר הניגוד. עד לסיום העירוי שנמשך 20-min, כבר ניתן להבחין בהגברה בתוך החדרי הצדיים (האיפסילטרליים) שבהם בוצע העירוי, בחדרים השלישי והרביעי, וב-cisterna magna, מה שמשקף התפשטות מהירה של הסמן באמצעות זרימה המונית (bulk-flow) דרך המסלול הוונטריקולרי-סב-עכבישי. הגברה של האות נצפתה גם בפארנכימה המקיפה את החדרי הצדיים האיפסילטרליים, דבר המצביע על מעבר של הסמן אל הרקמה הפרי-וונטריקולרית דרך קרום האפנדימה.

ניתן להשיג הערכה כמותית רבה יותר של הובלת חומר ניגוד באמצעות טכניקות של מיפוי פרמטרי, כגון מיפוי T1 ו-T2 באמצעות טביעת אצבע של תהודה מגנטית (MRF; איור 3). במדורים האינטרטקליים (intrathecal), T1 יורד במהירות במהלך ההזרקה, ומתפשט מהחדר הצדי האיפסילטרלי אל החדרים השלישי והרביעי, כאשר ב-cisterna magna נצפה עיכוב קל בתחילת קיצור ה-T1. חומרי ניגוד שהוזרקו ל-ICV מפגינים גם חדירה נרחבת אל פרנכימת המוח, כאשר אזורים פרי-וונטריקולריים (פרוקסימליים) מראים הפחתה מוקדמת ובולטת יותר של T1, בעוד שאזורים דיסטליים יותר מראים הפחתה מאוחרת ומעוטרת יותר של T1. באמצעות פרוטוקול סריקה של 3 שעות, ניתן להעריך גם את פינוי חומר הניגוד מפרנכימת המוח על סמך קינטיקת ההתאוששות של T1. יחד, פרוטוקול זה תומך בניטור דינמי של השלבים המרכזיים של הובלת סמן בנוזל החוט השדרה (CSF), כולל התפזרות ונטריקולרית מהירה, התפשטות אינטרטקלית, ספיגה פרנכימלית ופינוי עוקב, במסגרת סשן MRI רציף אחד.

figure-results-1
איור 1: מערך ניתוחי והרכבת קו עירוי עבור קנולציה של ה-ICV התואמת ל-MRI. (A) עמדת עבודה ניתוחית. מקדחה חשמלית ממוקמת מעל שדה הניתוח לצורך קידוח חור בור (burr-hole). (B) קו עירוי מורכב, הכולל מחט 30 G (חץ אדום), מקטע צינור פוליאתילן באורך 2 m (חץ ירוק), וקנולה מנחושת באורך 30 mm (חץ כחול). (C) קו עירוי טעון מראש המותקן על הזרוע הסטריאוטקסית להשתלת הקנולה. (D) קואורדינטות להשתלת הקנולה. (E) מראה סופית לפני הסגירה; קנולת הנחושת מכופפת במקביל לפני השטח של הגולגולת כדי למנוע מגע עם סליל ה-MRI. אנא לחץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מיקום הקנולה וניטור דינמי של מעבר חומר ניגוד לאחר עירוי ICV. (A,B) ויזואליזציה של מיקום הקנולה (חצים אדומים) בתמונות אנטומיות בחתכים סגיטליים ואקסיאליים, בהתאמה. (C) תרשים של פרוטוקול הדימות. (D) תמונות תלת-ממדיות מייצגות המשוקללות ל-T1 בנקודות זמן נבחרות בחתכים סגיטליים (למעלה), אקסיאליים (מרכז) וקורונליים (למטה). סרגי מידה, 5 mm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הערכה כמותית של מעבר סמן באמצעות טביעת אצבע של תהודה מגנטית (MRF). (A) מפות T1 (למעלה) ו-T2 (למטה) ששוחזרו מנתוני 3D MRF בנקודות זמן נבחרות לאחר עירוי ICV. סרגל קנה מידה, 5 mm. (B) מהלכי זמן ממוצעים של T1 במדורי הנוזל התת-קרומי, כולל החדר הצדי (LV) באותו צד, החדר השלישי (V3), החדר הרביעי (V4), וה-cisterna magna (CM). האזור האפור המוצל מציין את תקופת העירוי של 20-min. (C) מהלכי זמן ממוצעים של T1 ברקמת פרהנכימה פרוקסימלית ודיסטלית ל-V4 ול-LV באותו צד. מיקומי ה-ROIs עבור מהלכי הזמן מוצגים ב-(A). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: סכימות של הובלת סמן CSF לאחר עירוי ICV. (A) מבט סגיטלי המתאר עירוי של סמן via קנולת ICV ואת התפלגותו העוקבת בזרימה המסיבית (bulk-flow) דרך מערכת הפרונטריקולרית אל החלל הסוב-עכבישי (חצים אדומים), וכן את הובלתו דרך קרום האפנדימה אל פה-רנכימת המוח הסמוכה (חצים כחולים). LV: ventricle lateral; V3: ventricle third; V3v: ventral third ventricle; V4: ventricle fourth; CM: cisterna magna. (B) סכימה מוגדלת של האזור הממוסגר ב-(A) המתארת את נתיב חילוף ה-CSF-ISF. CSF חודר לפה-רנכימה לאורך החלל הפארא-עורקי, בסיוע תעלות מים מסוג aquaporin-4 (AQP4) המובעות על רגליים של אסטרוציטים (astrocytic endfeet), נע בזרימה קונבקטיבית דרך החלל הבינ-תאי, ויוצא via החלל הפארא-ורידי אל הווריד המנקז. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

פרמטריםDCE-MRI (3D FLASH)MRF בתלת-ממד
סוג רצףFLASH תלת-ממדי המשוקלל ל-T13D MRF (מערך ספירלות - stack-of-spirals)
TR / TE (מילי-שניות)20.0 / 2.710.0 / 2.0
זווית הטיה (Flip angle)10°משתנה (לוח זמנים של זוויות הטהיה משתנות)
הכנה למגנטיזציהלא נמצא תוכן לתרגום.הכנת היפוך (Inversion) או T2 (6 מתוך 8 סגמנטים)
שדה ראייה36 × 24 × 24 מ"מ³60 × 60 מ"מ² (במישור); 15 מ"מ (חוצה-מישור)
גודל המטריצה144 × 96 × 96300 × 300 (במישור); 30 (חוצה-מישור)
רזולוציה מרחבית0.25 ממ"ק איזוטרופי0.2 × 0.2 מ"מ² (במישור); 0.5 מ"מ (חוצה-מישור)
רזולוציה זמנית3 דקות/פריים7 דקות/פריים
מסלול k-spaceדקרטזימסלולי דגימה מסוג Stack-of-spirals; 48 שבבים (interleaves) לדגימה מלאה
תאוצהאף אחד (ממוצע בודד)פי 48 (24× במישור, 2× חוצה-מישורי)
הערהכל ניסויי הדימות בוצעו במערכת Bruker BioSpin של 9.4 T הפועלת על פלטפורמת ParaVision 360 v3.4. סליל נפח קוואדרטורה של 86 מ"מ שימש כמשדר, וסליל מערך שטח בעל 4 ערוצים שימש כמקלט. 

טבלה 1: פרמטרי רכישת MRI.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן משלב קניולציה של ה-ICV עם עירוי בתוך הסורק ורכישת MRI דינמית, מה שמאפשר הערכה כמותית של כל המוח עבור הובלת סומני CSF במסגרת סשן דימות יחיד. הערך, כמו גם המגבלות, של עירוי ICV מוערכים בצורה הטובה ביותר בהשוואה לעירוי ICM. עירוי ICM מונע קניולציה טרנס-פרנכימלית ולכן הוא פחות פולשני. עם זאת, מכיוון שה-cisterna magna נמצאת במרכז נתיב זרימת ה-CSF, עירוי ICM, במיוחד בקצבי עירוי גבוהים יותר, עלול להוביל להיפוך זמני של מפל הלחצים המניע את מחזור ה-CSF17. חשוב מכך, סומנים שניתנו ב-ICM מופצים במהירות למרחב הסוב-עכבישי שבזרם המורד ולאחר מכן למרחב הפרי-וסקולרי. למרות שתעלות AQP4 בקצות הרגליים של האסטרוציטים מקלות על חילוף בין CSF ל-ISF, תעלות אלו אינן חדירות ל-GBCAs בשל גודלם המולקולרי הגדול. כתוצאה מכך, סומנים שניתנו ב-ICM מראים הגברת ניגודיות מופחתת משמעותית בפרנכימה בהשוואה לעירוי ICV15, מה שהופך את עירוי ה-ICM לפחות מתאים לחקר פינוי מומסים מהמוח. עירוי ICV נותן מענה למגבלות אלו על ידי הובלת הסומנים לסביבת אתרי ייצור ה-CSF האנדוגניים13,14. יתרה מכך, מפלי הלחצים והריכוזים במהלך עירוי ICV מעדיפים הובלה ישירה של הסומנים דרך השכבה האפנדימלית13,14,15, מה שמאפשר להשתמש בסומנים אלה כסימנים לפינוי פסולת (איור 4).

מספר פרטים טכניים הם קריטיים להשגת תוצאות הניתנות לשחזור. פילוס מדויק של הגולגולת חיוני למיקוד עקבי של החדר הצדי (lateral ventricle), שכן מרווח הטעות בהחדרת הקנולה קטן מאוד בהינתן גודלו המצומצם של החדר. הרכבה של קו עירוי ללא סתימות וללא דליפות חשובה באותה מידה. בועות אוויר או חסימות חלקיות עלולות לשנות את פרופיל העירוי ולפגוע בפרשנות של הקינטיקה בשלב המוקדם; במקרה הגרוע ביותר, בועה גדולה עלולה לחסום את הקו לחלוטין, מה שיוביל לכישלון הניסוי. בעיות נפוצות במהלך הגדרת ה-MRI כוללות דליפה בחיבור שבין המזרק למחט, אותה ניתן לצמצם באמצעות סרט איטום PTFE, ומתיחה של קו העירוי במהלך הכנסתו לעריסה, דבר שניתן למנוע על ידי קיבוע הצינורית לאורך העריסה כדי למנוע משיכה או כיפוף.

קואורדינטות המטרה ועומק ההחדרה המוצגים כאן עברו אופטימיזציה עבור חולדות Wistar בנות 12 שבועות ועשויות לדרוש התאמות עבור גילאים וזנים אחרים. ניתן לבצע עירוי ICV בעכברים עם התאמות מתאימות כדי להתחשב במשקל הגוף הקטן יותר ובגודל הפרונטריקולר15. ניתן להתאים את קצב העירוי ואת הנפח הכולל בהתאם לתכונות הפיזיקו-כימיות של הסמן, כולל הגודל המולקולרי והרלקסיביות (relaxivity); עם זאת, בהתחשב בנפח הקטן של מדורי הפרונטריקולר, קצבי עירוי גבוהים יותר עלולים להעלות משמעותית את הלחץ הפרונטריקולרי ולכן יש להשתמש בהם בזהירות. בנוסף, קנולת הנחושת ששימשה במחקר הנוכחי מספקת את חוזק העמוד הדרוש כדי לחדור את הקרומי העוטפים של המוח (dura) ולחצות את הפארנכימה במעבר ישר ובודד. תכונותיה הבדליות הופכות אותה גם לקלה לכיפוף, דבר המהווה יתרון בתצורות סלילים בעלות מרחב מוגבל18. החימום המושרה על ידי RF הוא מינימלי בהינתן האורך הקצר של הקנולה המוחדרת. עם זאת, פירוק מוגזם של נחושת עלול לשחרר יוני נחושת חופשיים הגורמים לרעילות עצבית; לכן, קנולת נחושת אינה מתאימה ככל הנראה להשתלה כרונית. עבור תצורות סלילים שיכולות להכיל קנולה בולטת, קטטרי סיליקה או PEEK מספקים חוזק מכני מספיק להחדרה תוך הימנעות מחששות רעילות אלו14,19,20.

חומר הניגודיות שנעשה בו שימוש כאן (Gd-DOTA) הוא בעל משקל מולקולרי של 558.65 Da, הגדול פי כמה ממוסים מטבוליים אנדוגניים כגון לקטט (90 Da) וגלוקוז (180 Da), אך קטן בהרבה מאגרגטים גדולים יותר מבוססי חלבון הרלוונטיים לניוון עצבי, כגון מונומרים של amyloid-β (~4.5 kDa) או tau (~45–65 kDa). עובדה זו הופכת את ה-GBCAs למדדים סבירים לקינטיקה של פינוי מוסים של מולקולות קטנות, אך אין להשליך את הממצאים באופן ישיר על פינוי של מוסים מקרו-מולקולריים גדולים יותר. יתרה מכך, מכיוון שתעלות מים מסוג AQP4 אינן חדירות ל-GBCAs, לא ניתן להשליך את הממצאים באופן ישיר על חילוף בין ה-CSF ל-ISF המתווך על ידי AQP4s.

במחקר הנוכחי, מיד לאחר הליך הקנולציה נערך סשן דימות במטרה להדגים את ההיתכנות. ראוי לציין כי השתלת קנולה עלולה לעורר תגובה דלקתית שעלולה לדכא את התפקוד הגלימפטי13, ותקופת המתנה של 24 שעות תאפשר את התאוששות התפקוד הגלימפטי לרמות הבסיס21. על חוקרים לקחת גורם זה בחשבון בעת תכנון מחקרים שמטרתם לבחון את התפקוד הגלימפטי. יתרה מכך, מחקר קודם דיווח כי זרימת CSF פנימה גבוהה יותר תחת הרדמה ב-ketamine/xylazine מאשר תחת הרדמה ב-isoflurane18. בהתאם לכך, הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-ketamine/xylazine לצורך ההשראה הראשונית. עם זאת, מנה בודדת של ketamine/xylazine אינה מספיקה כדי לשמור על הרדמה יציבה לאורך כל משך פרוטוקול הקנולציה והדימות המשולב. משטר ההרדמה שנעשה בו שימוש כאן הותאם ממחקר קודם שבו נעשה שימוש ב-dexmedetomidine עם מינון נמוך של isoflurane22. הוא מייצג פשרה בין שמירה על יציבות פיזיולוגית לאורך פרוטוקול ממושך לבין מזעור הדיכוי של התפקוד הגלימפטי הקשור להרדמה.

למרות היתרונות, להזרקה תוך-חדרית (ICV) יש מספר מגבלות. בהינתן הנפח הקטן של נוזל המוח והשדרה (CSF) הגולגולתי (~300 µL)23, ניתן להזריק נפח מוגבל בלבד של סמנים. יתרה מכך, קצב ההזרקה (1 µL/min) דומה לקצב ייצור ה-CSF (~1.6 µL/min)23,24; לכן, צפויה עלייה חולפת בלחץ החדרי במהלך ההזרקה. הפחתה של נפח ההזרקה או של קצבה עשויה להקל חלקית על בעיה זו; עם זאת, נפח סמן קטן יותר עלול לפגוע ברגישות הגילוי, בעוד שקצב הזרקה איטי יותר מאריך את זמן ההזרקה הכולל מבלי להפחית לחלוטין את העלייה בלחץ. לפיכך, נדרשת זהירות בעת פרשנות דינמיקת הובלת הסמנים במהלך תקופת ההזרקה, אם כי מגבלה זו אינה מונעת אפיון מהימן של שלבי ההפצה והפינוי העוקבים. יחד, פרוטוקול הזרקה ICV תואם-MRI זה מציע פלטפורמה מעשית וגמישה ללכידת מהלך הזמן המלא של הובלת סמני CSF in vivo, ובכך פותח נתיבים חדשים לחקר דינמיקת ה-CSF, פינוי מומסים והשיבוש שלהם במצב מחלה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי ה-National Institutes of Health תחת מספרי המענקים R01NS124206 ו-RF1AG094791. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-National Institutes of Health. איור 4 נוצר באמצעות BioRender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחט תת-עורית 30 G באורך 1 אינץ' עם חיבור פלסטיק (Plastic Hub)אקסל26439
50 µL, מזרק אטום לגז, קצה Luer (LT)Hamilton80901
פינצטה אנטומית צרהFine Science Tools11003-12
נוזל חוט שדרה מלאכותיTOCRIS3525
Attane Isofluran 1000 mg/gScanVet55226
צינור נימי נחושת בקוטר חיצוני 0.32 מ"מ × קוטר פנימי 0.16 מ"מNippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd.C1220-11-109
תפס נחושתIEUYOFEBA 1801
מקלון צמר גפןפוריטנית868-WCS
Dotarem (gadoterate meglumine) להזרקה, 0.5 mmol/mLGuerbetNDC 67684-2001-1
מקדחהForedomדגם SR
מקדחFine Science Tools19007-05
מחזיק מקדחStoelting51630
פינצטות רפואיות של DumontFine Science Tools11252-00, 11253-20
משחה לעיןרוגביNDC 0536
מערכת E-Z Anesthesia EZ-7000 ClassicE-Z SystemsEZ-7000
פינצטות גרפה (Graefe Forceps)Fine Science Tools11052-10,11152-10
משטח חימוםBraintree Scientific5381
ערכה לצריבה בטמפרטורה גבוההFine Science Tools18010-00
Ketaminol Vet 100 mg/mL (קטמין)Intervet International BV511519
ערכה לדבק סיליקון KWIK-SIL, רעילות נמוכהWorld Precision InstrumentsKWIK-SIL
מחט 5/8 אינץ', לשימוש חד-פעמי, סטרילית, 26 GBD305115
צינור פוליאתילן בקוטר חיצוני 0.61 מ"מ × קוטר פנימי 0.28 מ"מScandidactSKU252
Rompin Vet 20 מג/מ"ל (קסילזין)KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH148999
להבי סקלפלFine Science Tools10023-00
מספרייםFine Science Tools91460-11, 14007-14
שפכטלFine Science Tools10090-13
מסגרת סטריאוטקסיתStoelting51600U
מחזיק מחטים כירורגיAgnTho’s12502-12
משאבת מזרקמערכת משאבות New EraNE-4000
Xylocain 20 mg/mL (לידוקאין)AstraZeneca158543

מקורות

  1. Balasubramanian V. Brain power. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118:e2107022118.
  2. Mattson MP, Arumugam TV. Hallmarks of brain aging: adaptive and pathological modification by metabolic states. Cell Metab. 2018;27:1176-1199.
  3. Iliff JJ, Wang M, Liao Y, Plogg BA, Peng W, Gundersen GA, et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 2012;4. doi:10.1126/scitranslmed.3003748.
  4. Nedergaard M. Garbage truck of the brain. Science. 2013;340:1529-1530.
  5. Benveniste H, Lee H, Volkow ND. The glymphatic pathway: waste removal from the CNS via. cerebrospinal fluid transport. Neuroscientist. 2017;23:454-465.
  6. Mestre H, Hablitz LM, Xavier AL, Feng W, Zou W, Pu T, et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 2018;7:e40070.
  7. Iliff JJ, Lee H, Yu M, Feng T, Logan J, Nedergaard M, et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J Clin Invest. 2013;123:1299-1309.
  8. Benveniste H, Lee H, Ozturk B, Chen X, Koundal S, Vaska P, et al. Glymphatic cerebrospinal fluid and solute transport quantified by MRI and PET imaging. Neuroscience. 2021;474:63-79.
  9. Eide PK, Ringstad G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: a possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiol Open. 2015;4:2058460115609635.
  10. Ringstad G, Valnes LM, Dale AM, Pripp AH, Vatnehol SAS, Emblem KE, et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 2018;3:e121537.
  11. Eide PK, Ringstad G. Functional analysis of the human perivascular subarachnoid space. Nat Commun. 2024;15:2001.
  12. Xavier ALR, Hauglund NL, von Holstein-Rathlou S, Li Q, Sanggaard S, Lou N, et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. 2018;(135):57378.
  13. Gahn-Martinez D, Giannetto MJ, Chang E, Beam N, Tobin P, Plá V, et al. Chronic intraventricular cannulation for the study of glymphatic transport. eNeuro. 2025;12:ENEURO.0537-24.2025.
  14. Decker Y, Müller A, Proulx ST. Contrast agent clearance dynamics and diffusion in the mouse brain after ventricular administration. Adv Sci (Weinh). 2025;12:2501502.
  15. Zhu Y, Zhu J, Ni C, Chen A, Li L, Gao Y, et al. Impact of infusion conditions and anesthesia on CSF tracer dynamics in mouse brain. Fluids Barriers CNS. 2026;23:23.
  16. DeVos SL, Miller TM. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. 2013;(75):50326.
  17. Ding G, Chopp M, Li L, Zhang L, Davoodi-Bojd E, Li Q, et al. MRI investigation of glymphatic responses to Gd-DTPA infusion rates. J Neurosci Res. 2018;96:1876-1886.
  18. Stanton EH, Persson NDÅ, Gomolka RS, Lilius T, Sigurðsson B, Lee H, et al. Mapping of CSF transport using high spatiotemporal resolution dynamic contrast-enhanced MRI in mice: effect of anesthesia. Magn Reson Med. 2021;85:3326-3342.
  19. Berger ML, Reither H, Schmid RW, Lassmann H. Manufacture and use of fused silica cannulas for intracerebral injections in freely moving rats. J Neurosci Methods. 1989;27:225-234.
  20. Zhang J, Tian W, Chen J, Yu J, Zhang J, Chen J. The application of polyetheretherketone (PEEK) implants in cranioplasty. Brain Res Bull. 2019;153:143-149.
  21. Plá V, Bork P, Harnpramukkul A, Olveda G, Ladrón-de-Guevara A, Giannetto MJ, et al. A real-time in vivo. clearance assay for quantification of glymphatic efflux. Cell Rep. 2022;40:111320.
  22. Benveniste H, Lee H, Ding F, Sun Q, Al-Bizri E, Makaryus R, et al. Anesthesia with dexmedetomidine and low-dose isoflurane increases solute transport via. the glymphatic pathway in rat brain when compared with high-dose isoflurane. Anesthesiology. 2017;127:976-988.
  23. Chiu C, Miller MC, Caralopoulos IN, Worden MS, Brinker T, Gordon ZN, et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 2012;9:3.
  24. Karimy JK, Kahle KT, Kurland DB, Yu E, Gerzanich V, Simard JM. A novel method to study cerebrospinal fluid dynamics in rats. J Neurosci Methods. 2015;241:78-84.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MRI עם שימוש בחומר ניגודדימות מוח של מכרסמיםהובלת CSFקניולציה תואמת-MRIהובלה גלימפטיתפינוי מומסיםרכישת MRI דינמיתהולכת תרופות תוך-טתיקה

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.