מחקר זה משלב נתוני טרנסקריפטומיקה של דלקת ריאות פדיאטרית מהמאגרים הציבוריים, ריצוף RNA של תאים בודדים מריאות עכברים, סריקת תרכובות המופקות מ-Paeonia, עגינה מולקולרית (molecular docking) וסימולציות של דינמיקה מולקולרית, במטרה לזהות מטרות דלקתיות הקשורות לנויטרופילים ואינטראקציות חזויות של קטכין לצורך תיקוף עתידי.
מאמר מחקר
השפעות של קטכין המופק מ-Paeonia על דלקת הקשורה לנויטרופילים בדלקת ריאות
במאמר זה
סיכום
תקציר
דלקת ריאות בילדים מלווה לעיתים קרובות בתגובות דלקתיות מוגברות ובחוסר ויסות חיסוני, העלולים להוביל לתוצאות קליניות חמורות. קטכין (Catechin) הפגין פעילות אנטי-דלקתית במספר מצבים מחליים, אך תפקידו והמנגנונים המולקולריים שלו בדלקת ריאות נותרו לא ברורים. נתוני bulk RNA-sequencing ציבוריים מדלקת ריאות בילדים (GSE261482) ונתוני single-cell RNA-sequencing ציבוריים מריאות של עכברים ממודל ניסויי של דלקת ריאות (GSE295484) נותחו באמצעות weighted gene co-expression network analysis, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, אנוטציה של סוגי תאים וניתוח העשרה של קבוצות גנים (gene set enrichment analysis). אינטראקציות בין קטכין לבין חלבונים נבחרים הוערכו באמצעות סימולציות של molecular docking ודינמיקה מולקולרית. זוהה מודול גנים מרכזי הקשור למאפיינים של דלקת ריאות, וסוננו 18 גנים מועמדים, שהיו מועשרים בעיקר במסלולים דלקתיים ובמסלולים הקשורים למערכת החיסון. ניתוח תאים בודדים הראה כי גנים אלו היו מועשרים בעיקר בנייטרופילים ובמקרופגים אלבולריים, עם עלייה בשיעור הנייטרופילים בתנאי דלקת. MMP9, PYGL ו-GADD45A נבחרו כגנים מועמדים. סימולציות של docking ודינמיקה תמכו באינטראקציות יציבות שנחזו בין קטכין לבין חלבונים נבחרים אלו. קטכין עשוי להיות קשור למסלולים דלקתיים הקשורים לדלקת ריאות על ידי ויסות מסלולים הקשורים לנייטרופילים ואינטראקציה עם חלבונים מרכזיים הקשורים למערכת החיסון. מחקר זה מספק מבט ברמת המערכת על פעולתו של קטכין בדלקת ריאות ומדגיש מטרות פוטנציאליות לאימות ניסויי נוסף.
מבוא
דלקת ריאות היא מחלה נשימתית שכיחה ובעלת פוטנציאל לחומרה בקרב ילדים, הנגרמת בעיקר על ידי גורמים זיהומיים כגון Mycoplasma pneumoniae. היא מהווה מרכיב מרכזי בדלקת ריאות שנרכשה בקהילה וקשורה לתחלואה משמעותית עקב תגובות דלקתיות מוגברות ושיבוש במערכת החיסון1,2. עדויות גוברות מצביעות על כך שציטוקינים דלקתיים, כולל TNF-α ו-IL-6, ממלאים תפקידים קריטיים בהתקדמות המחלה על ידי קידום גיוס תאי חיסון, פגיעה ברקמות וליקוי בתפקוד הריאות3. למרות התקדמות בטיפולים אנטימיקרוביאליים, המנגנונים המולקולריים המניעים את הדלקת בדלקת ריאות בילדים עדיין אינם מובנים במלואם4.
פלאונואידים משכו תשומת לב ניכרת בשל תכונותיהם נוגדות הדלקת ונוגדות החמצון5. דווח כי קטכין, פוליפנול המופיע באופן טבעי ונמצא רבות בתה ובמזונות מ nguồn צמחי, מפחית עקה חמצונית ותגובות דלקתיות במודלים שונים של מחלות6. מחקרים קודמים הדגימו כי קטכין יכול לדכא רצפי איתות פרו-דלקתיים, כולל נתיבי MAPK ו-NF-κB, ולהסדיר את ביטויC cytokines, ובכך להקל על דלקת ועל תפקוד מטבולי לקוי7. עם זאת, מרבית המחקרים הקיימים מתמקדים במחלות מטבוליות או קרדיווסקולריות, בעוד שתפקידו של קטכין במחלות דלקתיות של מערכת הנשימה, ובמיוחד בדלקת ריאות, נותר לא נחקר דיו. בנוסף, המטרות המולקולריות והמנגנונים העומדים בבסיס ההגנה המתווכת על ידי קטכין בדלקת ריאות נותרו לא ברורים.
מחקר זה נועד לחקור את המנגנונים המולקולריים הפוטנציאליים של catechin בדלקת ריאות. ההשערה הייתה כי catechin יכול להאיט תגובות דלקתיות על ידי אינטראקציה עם חלבונים מרכזיים ומסלולי איתות המעורבים בבקרת חיסונית. כדי לבחון השערה זו, שולבו ניתוחים של פרמקולוגיית רשת, עגינה מולקולרית (molecular docking), סימולציית דינמיקה מולקולרית וניתוחי רצף RNA של תא בודד (single-cell RNA sequencing), במטרה לזהות באופן שיטתי גנים מועמדים ולהעריך את האינטראקציות שלהם עם catechin. התפלגות תאי החיסון ותבניות ביטוי הגנים נותחו בהמשך כדי לבחון את תפקידם של נิวטרופילים ומקרופגים בהתקדמות המחלה.
התוצאות הראו קשירה חזויה יציבה בין catechin לבין חלבונים נבחרים, כולל PYGL, MMP9 ו-GADD45A, ושמירה על יציבות מבנית לאורך סימולציות של דינמיקה מולקולרית. בנוסף, ניתוח של תאים בודדים חשף שינויים משמעותיים בפרופורציות של תאי מערכת החיסון, ובמיוחד בנייטרופילים, תחת תנאי דלקת. ממצאים אלו מרמזים כי catechin עשוי להיות קשור למנגנוני אנטי-דלקתיים המערבים תפקוד של תאי חיסון ומסלולי איתות מרכזיים. מחקר זה מספק מבט ברמת המערכת על מנגנונים פוטנציאליים הקשורים ל-catechin בדלקת ריאות, ותומך בתיקוף נוסף של catechin כתרכובת מועמדת למחקר של מחלות דלקתיות של מערכת הנשמה.
פרוטוקול
מחקר זה כלל ניתוח משני של מערכי נתונים מזוהים שאינם מזוהים (de-identified) וזמינים לציבור ממאגר הנתונים Gene Expression Omnibus. לא גויסו, נאספו או נוצרו עבור מחקר זה משתתפים אנושיים חדשים, ניסויי בעלי חיים או דגימות קליניות. האישור האתי והסכמה מדעת עבור מערכי הנתונים המקוריים היו באחריותם של המחקרים המקוריים שיצרו את הנתונים. לפיכך, לא נדרש אישור נוסף מוועדת אתיקה עבור הניתוח המשני הנוכחי.
איסוף נתונים ועיבוד מקדים
נתוני רצף RNA בכמות גדולה (RNA-seq) התקבלו ממאגר הנתונים Gene Expression Omnibus (GEO) מספר GSE2614828. מטריצת הביטוי ששימשה במחקר זה הכילה 177 דגימות דם מלא, כולל 139 דגימות של דלקת ריאות בילדים ו-38 דגימות של קבוצת ביקורת בריאה. המידע המטא-נתוני הזמין כלל מין, סיווג אתיולוגי, סוג מבחנה האיסוף, סבב (batch) ומצב מחלה. דגימות דלקת ריאות סווגו כבקטריאליות ודאיות (DB), ויראליות ודאיות (DV), בקטריאליות סבירות (PB), ויראליות סבירות (PV) או לא ידועות (U), בהתאם לסיווג במאגר הנתונים המקורי.
נתוני רצף RNA של תא בודד (scRNA-seq) התקבלו ממאגר הנתונים GSE2954849 של GEO, אשר הופקו מרקמות ריאה של עכברים מסוג C57BL/6 wild-type במודל ניסויי של דלקת ריאות. מאגר הנתונים כלל עכברים ניאונטליים (PND05) ועכברים גדלים (PND12) שנחשפו לאוויר חדר, PBS, או E. coli ונאספו 48 שעות או 96 שעות לאחר השאיפה.
ניתוח רשת ביטוי גנים משותף משוקלל (WGCNA)
לבניית רשת הביטוי המשותף, מטריצת הביטוי סוננה תחילה כדי להסיר גנים בעלי ביטוי נמוך. לאחר הסרת הגנים בעלי הביטוי הנמוך, הוערכה השונות באמצעות סטיית חציונית מוחלטת (MAD). 5,000 הגנים בעלי ערכי ה-MAD הגבוהים ביותר הועברו לניתוח רשת ביטוי גנים משותף משוקלל (WGCNA) בתוכנת R. הוחל ערך סף רך (soft-thresholding power) של 15, מכיוון שזה עמד בקריטריון הטופולוגיה חסרת הקנה מידה של R2> 0.8. סף זה שימש לבניית מטריצת הסמיכות המשוקללת, שטרנספורמציה לאחר מכן למטריצת חפיפה טופולוגית (TOM). לאחר מכן זוהו מודולי גנים מעץ הצבירה ההיררכי המבוסס על ה-TOM. כדי לזהות מודולים הקשורים למאפיינים של דלקת ריאות, חושבו גנים-עצמיים (eigengenes) של המודולים ונבחנו להערכת המתאם עם מצב המחלה והאטיולוגיה.
ניתוח ביטוי דיפרנציאלי
קבוצות הדלקת הריאות ובקרת הבריאים הושוו באמצעות חבילת ה-R שנקראת limma כדי לזהות גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי. תיקון לבדיקות מרובות בוצע באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg. גנים נשמרו כגנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי רק כאשר שני הספים הושגו: |log2 fold change| > 1 וערך p מתוקנן (adjusted p-value) < 0.05.
זיהוי תרכובות פעילות המופקות מ-Paeonia וחיזוי מטרות
כדי לזהות באופן שיטתי תרכובות ביו-אקטיביות ב-Paeonia ואת מטרותיהן הביולוגיות הפוטנציאליות, נעשה שימוש באסטרטגיה של אינטגרציה של מספר מאגרי נתונים כדי להבטיח אמינות ומקיפות, בהתאם למסגרות מבוססות של פרמקולוגיה רשתית. ראשית, תרכובות פעילות של Paeonia נשלפו ממאגר הנתונים של פרמקולוגיה מערכתית של רפואה סינית מסורתית (TCMSP, https://tcmsp-e.com) וממאגרי נתונים ציבוריים אחרים, כולל ETCM ומקורות ספרותיים. תרכובות סוננו על בסיס פרמטרים פרמקוקינטיים, כולל זמינות ביולוגית דרך הפה (OB ≥ 30%) ודמיון לתרופות (DL ≥ 0.18), כדי לזהות רכיבים ביו-אקטיביים מועמדים.
מטרות חלבון פוטנציאליות נחזו באמצעות גישות משלימות מבוססות ליגנדים. SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch) שימש לזיהוי מטרות אנושיות סבירות על ידי השוואת מבני תרכובות עם ליגנדים בעלי פעילות ידועה, ורק תחזיות עם הסתברות של ≥ 0.1 נשמרו. כדי להרחיב את כיסוי המטרות, נעשה שימוש גם בגישת Similarity Ensemble Approach (SEA, http://sea.bkslab.org) לסריקת קשרי off-target אפשריים על פני משפחות חלבונים, כולל אינטראקציות שלא נקלטו בתחזיות מטרה קנוניות. כדי להשלים עוד את התחזיות מבוססות הליגנדים, נעשה שימוש בשרת PharmMapper (http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/) למיפוי פארמקופור ריברסי (reverse pharmacophore mapping) מול מאגר חלבונים אנושי מקיף, ונבחרו מטרות עם normalized fit scores ≥ 0.7. בנוסף, אינטראקציות בין תרכובות למטרות שתוקפו ניסיוני נאספו ממאגרי מידע ציבוריים, כולל DrugBank ו-BindingDB, כדי לשפר את מהימנות זיהוי המטרות. כל המטרות שנחזו סטנדרטו לאחר מכן לסמלי גנים רשמיים באמצעות מאגר UniProt (https://www.uniprot.org), כאשר האורגניזם הוגבל ל-"Homo sapiens." רשומות כפולות הוסרו כדי להבטיח את דיוק הנתונים. קבוצת המטרות המשולבת הוגדרה כאיחוד של כל המטרות שנחזו ואלו שתוקפו עבור Paeonia, המייצג את הבסיס המולקולרי הפוטנציאלי להשפעות הפארמקולוגיות שלו. מכיוון ש-catechin זוהה כאחד התרכובות הפעילות המופקות מ-Paeonia ובעל פעילות נוגדת דלקת מתועדת היטב, הוא נבחר כתרכובת המייצגת לסימולציות עגינה מולקולרית (molecular docking) ודינמיקה מולקולרית (molecular dynamics) בהמשך.
ניתוח העשרה תפקודי
העשרה תפקודית הוערכה עבור תהליכים ביולוגיים של Gene Ontology (GO) ומסלולים של Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) באמצעות חבילת ה-R בשם clusterProfiler. מונחים מועשרים נשמרו כאשר שיעור התגליות השגויות (FDR) היה < 0.05.
ניתוח רצף RNA של תא בודד וניתוחים המשכיים
נתוני רצף RNA של תא בודד עובדו באמצעות Seurat. המטריצה המעובדת GSE295484 שימשה לניתוחים המשכיים, ולא הוחל סינון נוסף ברמת התא לאחר ייבואה. המטריצה המעובדת הכילה 90,883 תאים ו-26,511 גנים. עבור גרפי בקרת האיכות נעשה שימוש בספי סף של 200 ו-8,000 גנים מזוהים לתא ו-1.4% קריאות מיטוכונדריאליות. הנתונים עברו נורמליזציה, סקיילינג (scaling), וניתוח רכיבים ראשיים (PCA). לאחר מכן בוצעה אשגור (clustering) של תאים, ובשימוש ב-UMAP (uniform manifold approximation and projection) הוצגו אוכלוסיות התאים במרחב בעל ממד מופחת. זהויות התאים נקבעו על פי גני סימון (marker genes) קנוניים. גני הסימון זוהו באמצעות FindAllMarkers עם הפרמטרים only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, ו-logfc.threshold = 0.25.
כדי להעריך את הפעילות של קבוצות גנים מועמדות ברמת התא הבודד, בוצע ניתוח AUCell באמצעות חבילת ה-R AUCell. התאים דורגו בהתאם לביטוי של חתימות גנים שהוגדרו מראש, ותבניות ההעשרה הוצגו באופן חזותי על גרפי UMAP. עבור GSE295484, חושבו הפרופורציות של אוכלוסיות תאי חיסון, כולל מקרופאגים אלבולאריים ונויטרופילים, בקבוצות של אוויר חדר, PBS ו-E. coli בנקודות זמן של 48 h ו-96 h לאחר השאיפה. הבדלים בין הקבוצות נבחנו באמצעות מבחנים סטטיסטיים לא-פרמטריים. גנים מסמנים של נויטרופילים זוהו מתוך מערך הנתונים של התא הבודד והושוו עם הגנים המועמדים שזוהו קודם לכן, כדי להפיק גנים מרכזיים הקשורים לנויטרופילים עבור ניתוחים נוספים.
עגינה מולקולרית (Molecular docking)
עגינה מולקולרית בוצעה באמצעות AutoDock Vina, כאשר הכנת הרספטור והליגנד בוצעה באמצעות AutoDock Tools. מבני הגביש של חלבוני המטרה הופקו ממאגר החלבונים (PDB), כולל GADD45A (PDB ID: 2KG4), MMP9 (PDB ID: 6ESM), ו-PYGL (PDB ID: 3DDS). מבני החלבונים עובדו לפני העגינה על ידי מחיקת מולקולות מים וליגנדים שהתגבשו יחד. לאחר מכן נוספו אטומי מימן פולריים, והוקצו מטעני Gasteiger.
את המבנה התלת-ממדי של ה-catechin ניתן היה להשיג מ-PubChem והוא הוכן ב-AutoDock Tools. לאחר מכן נעשה שימוש ב-AutoDock Vina כדי לבצע עגינה (docking) של catechin עם כל חלבון מטרה ולהעריך את זיקת הקשירה והדפוס האינטראקטיבי החזויים. פרמטרי תיבת רשת העגינה היו כדלקמן: GADD45A-catechin, center_x = 0.131, center_y = -0.002, center_z = -0.018, size_x = 47.25, size_y = 47.25, size_z = 47.25; MMP9-catechin, center_x = -0.434, center_y = 43.036, center_z = 14.868, size_x = 47.25, size_y = 47.25, size_z = 47.25; PYGL-catechin, center_x = 88.408, center_y = -80.795, center_z = 105.959, size_x = 100.45, size_y = 100.45, size_z = 100.45.
סימולציית דינמיקה מולקולרית
עבור רכיבי החלבון נעשה שימוש בשדה הכוחות AMBER14SB. פרמטרי הליגנד הופקו באמצעות שדה הכוחות GAFF2 דרך sobtop_1.0 (dev3.1), והוקצו מטעני RESP. נעשה שימוש במים מסוג TIP3P כדי לסולבט כל קומפלקס של חלבון-ליגנד בתוך תיבת סימולציה קובייתית. הוספת יוני Na⁺ ו-Cl⁻ סייעה בניטרול המערכת ובהגעה לריכוז יוני של 0.15 M. עבור אינטראקציות אלקטרוסטטיות ארוכות-טווח נעשה שימוש בשיטת particle mesh Ewald (PME) עם cutoff של 1 nm. אילוצי קשרים הוחלו באמצעות אלגוריתם LINCS. כדי להסיר התנגשויות סטריות, בוצע מינימום אנרגיה בשיטות steepest-descent ו-conjugate-gradient.
לאחר השיווי, בוצעו סימולציות MD של ייצור בתנאי NPT בטמפרטורה של 310 K ובלחץ של 1 bar, בבקרה של תרמוסטט Nosé–Hoover וברוסטט Parrinello–Rahman. כל סימולציה הריצה למשך 100 ns עם צעד זמן של 2 fs.
ניתוח סטטיסטי
כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת R. ניתוחי מתאם בוצעו בשיטות Pearson או Spearman לפי הצורך. השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחנים לא פרמטריים, כולל מבחן Kruskal–Wallis. ערך p-value < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.
תוצאות
זיהוי מודול גנים מרכזי הקשור לדלקת ריאות בילדים באמצעות WGCNA
כדי לזהות מודולים של גנים הקשורים לדלקת ריאות בילדים, בוצע ניתוח WGCNA על נתוני טרנסקריפטומיקה של דם מלא ממטופלים עם דלקת ריאות ומביקרות בריאות. ניתוח מקבץ דגימות (Sample clustering) לא חשף ערכים חריגים בולטים, מה שמעיד על איכות נתונים טובה להמשך הניתוח (איור 1A). PCA הדגימה בנוסף מגמה של הפרדה ברורה בין קבוצת דלקת הריאות לקבוצה הבריאה, דבר המצביע על פרופילים טרנסקריפטומיים נבדלים בין המצבים (איור 1B). לצורך בניית רשת נטולת קשקשת (scale-free network), דורגו הגנים לפי סטיית הביניים המוחלטת (median absolute deviation), נבחרו 5,000 הגנים המובילים לבניית הרשת, והסף הרך (soft-thresholding power) נקבע ל-15 בהתבסס על קריטריון מדד התאמה של טופולוגיה נטולת קשקשת (R2 > 0.8) תוך שמירה על קישוריות ממוצעת נמוכה יחסית (איור 1C). באמצעות סף זה, מקבץ היררכי זיהה מספר מודולי גנים בעלי דפוסי ביטוי נבדלים (איור 1D). ניתוח הקשר בין מודולים לתכונות (Module–trait relationship) גילה כי מספר מודולים נמצאו במתאם משמעותי עם פנוטיפים קליניים. בולט במיוחד המודול הכחול, שהראה מתאם חזק הן עם מצב המחלה (דלקת ריאות לעומת בריא) והן עם הסיווג האטיולוגי, מה שמרמז על תפקידו הפוטנציאלי בהתקדמות המחלה ובתגובת המאכסן (איור 1E).
בנוסף, ניתוח תרשים פיזור של חברות במודול לעומת מובהקות גנים בתוך המודול הכחול הדגים מתאם חיובי חזק (cor = 0.6, p = 2.1e−35), המצביע על כך שגנים בעלי קישוריות גבוהה בתוך המודול היו קשורים באופן חזק גם לתכונה הקלינית (איור 1F).
הקשר של המודול הכחול לאטיולוגיה של דלקת ריאות חיידקית
כדי לחקור לעומק הבדלים בביטוי גנים בין אטיולוגיות שונות של דלקת ריאות, בוצע ניתוח WGCNA באמצעות מספר סיווגים קליניים, כולל קבוצות ביקורת (C), חיידקית ודאית (DB), נגיפית ודאית (DV), חיידקית סבירה (PB), נגיפית סבירה (PV), וקבוצה לא ידועה (U). ניתוח של הקשר בין מודולים לתכונות גילה כי מספר מודולים הראו מתאמים משמעותיים עם תתי-סוגים אטיולוגיים ספציפיים. באופן בולט, המודול הכחול הראה את המתאם החיובי החזק ביותר עם קבוצת ה-DB, מה שמרמז על מעורבות פוטנציאלית שלו בתגובות מאכסן הספציפיות לזיהום חיידקי (איור 2A).
דנדרוגרמת קיבץ הגנים והשיוך של המודולים התואם איששו עוד יותר את חסונו של בניית המודולים ואת ההפרדה הברורה של קיבצי הגנים (איור 2B). בתוך המודול הכחול, ניתוח של חברות במודול לעומת מובהקות הגנים הדגים מתאם חיובי מובהק (cor = 0.41, p = 7.8e−14), מה שמרמז שגנים בעלי קישוריות גבוהה בתוך מודול זה היו קשורים באופן חזק גם לתכונה האטיולוגית (איור 2C).
בנוסף, השוואה של ביטוי ה-module eigengene בין קבוצות אתילוגיות שונות חשפה הבדלים משמעותיים במודול הכחול (מבחן Kruskal–Wallis, p = 1.5e−13). באופן ספציפי, המודול הכחול הראה ביטוי מוגבר בקבוצות הדלקת ריאות חיידקית, ובמיוחד בתת-קבוצת ה-DB, בהשוואה לקטגוריות אתילוגיות אחרות (איור 2D).
שמונה עשר פניונית (Paeonia)גנים מועמדים הקשורים לתרכובות נגזרות המקושרים לדלקת ריאות בילדים, שזוהו באמצעות ניתוח אינטגרציה
לזיהוי גנים מועמדים הקשורים לדלקת ריאות בילדים ופוטנציאל Paeoniaביחס למטרות הקשורות ל-, בוצע תחילה ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בין חולי דלקת ריאות לבקרות בריאות. באמצעות קריטריונים אלה, זוהו 1,110 גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEGs) בין דגימות של דלקת ריאות לדגימות ביקורת בריאות, כולל 524 גנים בעלי ביטוי מוגבר (upregulated) ו-586 גנים בעלי ביטוי מופחת (downregulated). 524 הגנים בעלי הביטוי המוגבר מופיעים ב- טבלה משלימה S1 (ראו גם איור 3A). כדי לזקק עוד יותר גנים מרכזיים, בוצע חיתוך בין גנים מביעי-הבדל (DEGs) הקשורים לדלקת ריאות לבין גנים הקשורים לפנוטיפ של DB ומטרות חזויות של פאונויה (Paeonia)ניתוח אינטגרטיבי זה העלה 18 גנים חופפים, מה שמרמז על תפקידם הפוטנציאלי בהתקדמות המחלה וב- Paeoniaתגובות הקשורות ל- (איור 3B).
רשת אינטראקציות בין תרכובות למטרות נבנתה כדי להמחיש את הקשרים בין רכיבים פעילים של Paeonia והגנים המועמדים שזוהו, מה שחשף קישוריות נרחבת בין תרכובות למטרות (טבלה משלימה S2 ו- איור 3Cכדי לבחון את התפקודים הביולוגיים של 18 גנים אלו, בוצעו ניתוחי העשרה תפקודיים. העשרת תהליכים ביולוגיים של GO קישרה את הגנים המועמדים בעיקר לתפקודים חיסוניים ודלקתיים, כולל ויסות תגובה דלקתית, תגובה להורמוני פפטיד, ויסות חיובי של מטבוליזם של מיני חמצן רבטיביים, וויסות של איתות המתווך על ידי אינטרפרון מסוג II (איור 3D). ניתוח KEGG הראה עוד כי הגנים היו מועשרים במסלולים הקשורים לדלקת ולמערכת החיסון, כגון IL-17 ו-NF-κמסלולי סיגנלינג של B, כמו גם מסלולים מטבוליים ומסלולים הקשורים למערכת האנדוקרינית, כולל סיגנלינג של גלוקגון וביוסינתזה של הורמונים סטרואידיים (איור 3D).
העשרה של גנים מועמדים בנאטרופילים ובמקרופאגים אלבולריים בניתוח טרנסקריפטומי של תא בודד
כדי לבחון את ההפצה התאית של גנים מועמדים בהקשר של דלקת ריאות ניסויית, נותח מאגר נתוני scRNA-seq של ריאת עכבר GSE295484. בוצע ניתוח בקרת איכות להערכת מהימנות הנתונים. ההפניות של מספר הגנים שזוהו, ספירות UMI, ואחוזי הגנים המיטוכונדריאליים והריבוזומליים העידו על איכות גבוהה כללית של נתוני התא הבודד במטריצה המעובדת (איור 4A). תרשימי פיזור הראו את ספי המקור עבור זיהוי גנים ותוכן מיטוכונדריאלי ששימשו להצגה חזותית של בקרת האיכות (איור 4B).
לאחר נורמליזציה והפחתת ממדים, התאים קובצו והוצגו ויזואלית באמצעות UMAP. זוהו אוכלוסיות תאים נפרדות, הכוללות נויטרופילים, מקרופאגים אלבולריים, מונוציטים, תאי אפיתל וסוגים אחרים של תאי חיסון וסטרומה, מה שמעיד על ההטרוגניות התאית של מיקרו-סביבת הריאה במהלך דלקת ריאות (איור 4C). כדי להעריך את הפעילות של 18 הגנים המועמדים ברמת התא הבודד, בוצע ניתוח AUCell. התוצאות הראו כי חתימת הגנים הייתה מועשרת בעיקר בנויטרופילים ובמקרופאגים אלבולריים, כפי שמעידים ציוני AUC גבוהים יותר באוכלוסיות תאים אלו (איור 4D).
גנים דלקתיים הקשורים למטרות של תרכובות המופקות מ-Paeonia במודל של דלקת ריאות חיידקית בעכברים
כדי לחקור יותר לעומק את הדינמיקה של תאי מערכת החיסון במודל הניסויי לדלקת ריאות בעכברים, נותחו הפרופורציות של מקרופאגים אלבולהריים ונויטרופילים בקבוצות של אוויר חדר, PBS, ו- E. coli בנקודות זמן של 48 שעות ו-96 שעות לאחר השאיפה. ב-48 שעות, מקרופאגים אלבולהריים הראו ירידה ניכרת תחת זיהום ב- E. coli בהשוואה לתנאי אוויר ו-PBS, בעוד שנויטרופילים הראו עלייה משמעותית בפרופורציית התאים (איור 5A). מגמה דומה נצפתה ב-96 שעות, כאשר פרופורציות הנויטרופילים נותרו גבוהות בתגובה לגירוי ב- E. coli, בעוד שמקרופאגים אלבולהריים הראו רמות נמוכות יותר יחסית. תוצאות אלו מעידות על התרחבות בולטת של נויטרופילים במהלך זיהום חיידקי. כדי לבחון את המאפיינים התפקודיים של הנויטרופילים, זוהו גנים מסמנים לנויטרופילים ובוצע ניתוח העשרה תפקודי. העשראת KEGG קשרה את הגנים המסמנים לנויטרופילים לאיתות דלקתי, כולל מסלולי TNF, MAPK וקולטני לקטין מסוג C (איור 5B). מונחי תהליך ביולוגי של GO התרכזו גם הם בפונקציות של תגובה חיסונית, כגון הגירה של לוקוציטים, היצמדות בין-תאית של לוקוציטים, ויסות חיובי של תגובת הגנה ותגובה למולקולות ממקור חיידקי (איור 5B). כדי לזהות גנים מרכזיים המקשרים בין פעילות נויטרופילים, דלקת ריאות ומטרות של Paeonia, בוצע חיתוך של הגנים המסמנים לנויטרופילים עם 18 הגנים המועמדים שזוהו בעבר. ניתוח זה הניב שלושה גנים חופפים: MMP9, PYGL, ו- GADD45A (טבלה נספחת S3 ו-איור 5C). לבסוף, ויזואליזציה של ביטוי גנים ברמת התא הבודד הראתה כי שלושה גנים אלו התבטאו בעיקר באוכלוסיות של נויטרופילים (איור 5D), מה שמעניק תמיכה נוספת לתפקידם הפוטנציאלי בתגובות דלקתיות המתווכות על ידי נויטרופילים.
זיקת קישור חזויה של catechin לחלבונים נבחרים בסימולציית docking מולקולרית
כדי להעריך באופן מעמיק יותר אינטראקציות פוטנציאליות בין catechin לחלבונים, בוצע ניתוח docking מולקולרי בין החלבונים הנבחרים (MMP9, PYGL ו-GADD45A) לבין catechin, תרכובת פעילה המופקת מ-Paeonia. מבני הגביש של GADD45A, MMP9 ו-PYGL התקבלו ממאגר ה-Protein Data Bank, והמבנה התלת-ממדי של catechin נשלף ממאגר הנתונים PubChem. תוצאות ה-docking הצביעו על כך ש-catechin יכול להיקשר לאתרים בכל שלושת החלבונים הנבחרים, עם אנרגיות קישור של −6.3 kcal/mol עבור GADD45A, −7.6 kcal/mol עבור MMP9, ו-−8.0 kcal/mol עבור PYGL (איור 6). מבין חלבונים נבחרים אלו, catechin הפגין את זיקת הקישור החזויה החזקה ביותר עם PYGL, ואחריו MMP9 ו-GADD45A, מה שמרמז על אינטראקציה מועדפת פוטנציאלית עם חלבון הקשור למטבוליזם.
ברמה המולקולרית, קטכין (catechin) יצר מספר קשרי מימן ואינטראקציות הידרופוביות עם שאריות חומצות אמינו מרכזיות בכל חלבון. ב-GADD45A, קטכין הגיב עם שאריות כגון GLN33 ו-TRP135. ב-MMP9, נצפה קשר מימני יציב עם שאריות הכוללות את GLN227, TYR248 ו-HIS236. בדומה לכך, ב-PYGL, קטכין יצר מספר קשרי מימן עם שאריות כגון LYS554 ו-ASN631, דבר שתרם ליציבות הקישור. בנוסף לקשרי מימן, ניתוח האינטראקציות חשף כוחות ואן דר ואלס ואינטראקציות הקשורות ל-π, המעידות על דפוס קישור רב-אופני המגביר את היציבות של קומפלקסי הליגנד-חלבון שנחזו. יחד, תוצאות אלו מרמזות כי קטכין יכול ליצור קומפלקסים חזויים יציבים עם MMP9, PYGL ו-GADD45A. עם זאת, הרלוונטיות הטיפולית של אינטראקציות אלו דורשת תיקוף ניסיוני נוסף.
אינטראקציות יציבות חזויות בין catechin לבין חלבונים נבחרים
על בסיס תנוחות העגינה שהתקבלו בעגינה מולקולרית (molecular docking), בוצעו סימולציות דינמיקה מולקולרית של 100 ns כדי להעריך באופן מעמיק יותר את היציבות של קומפלקסי ה-catechin-protein. ניתוח RMSD הראה כי שלושת קומפלקסי החלבון-ליגנד הגיעו לשיווי משקל במהלך תקופת הסימולציה. ביניהם, קומפלקסי ה-PYGL–catechin וה-MMP9–catechin הראו תנודות RMSD יציבות יחסית, בעוד שקומפלקס ה-GADD45A–catechin הראה תנודות גבוהות מעט יותר אך נשאר בטווח מקובל (איור 7A). ניתוח Rg הצביע על כך שכל הקומפלקסים שמרו על דחיסות מבנית יציבה לאורך כל הסימולציה, עם שינוי מינימלי לאורך זמן (איור 7B). באופן דומה, ניתוח SASA הדגים רמות חשיפה יציבות עבור כל הקומפלקסים, מה שתומך עוד יותר ביציבותם המבנית (איור 7C). ניתוח קשרי מימן חשף אינטראקציות עקביות בין catechin לבין החלבונים הנבחרים. קומפלקס ה-PYGL–catechin שמר על מספר גבוה יותר של קשרי מימן לאורך זמן בהשוואה ל-MMP9 ו-GADD45A, מה שמרמז על אינטראקציות קישור חזקות ויציבות יותר (איור 7D).
הגמישות ברמת השאריות הוערכה באמצעות RMSF. התוצאות הראו כי רוב השאריות הפגינו תנודה נמוכה, כאשר רק אזורים בודדים הראו גמישות גבוהה יותר, מה שמעיד על כך שקישור הליגנד לא גרם לחוסר יציבות מבני משמעותי בחלבונים (איור 7E). במכלול, ממצאים אלו מרמזים כי קטכין יוצר קומפלקסים חזויים יציבים עם MMP9, PYGL ו-GADD45A, כאשר היציבות החזקה ביותר נצפתה באינטראקציה בין PYGL לקטכין. תוצאות אלו תומכות באינטראקציות חזויות יציבות בין קטכין לבין החלבונים שנבחרו, ומספקות ראיה חישובית להמשך תיקוף ניסיוני.
זמינות נתונים:
במחקר זה נותחו מאגרי נתונים הזמינים לציבור. מאגר נתוני ה-bulk RNA-seq זמין ב-Gene Expression Omnibus (GEO) תחת מספר גישה GSE261482 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE261482), ומאגר נתוני ה-scRNA-seq של ריאות עכבר זמין תחת מספר גישה GSE295484 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE295484). תוצרי עיבוד ששימשו במאמר מסופקים כ-Supplementary Table S1, Supplementary Table S2, ו-Supplementary Table S3.
איור 1. בניית WGCNA וזיהוי מודולים הקשורים למחלה (A) ביצוע קיסום דגימות על בסיס פרופילי ביטוי גנים, כאשר הערות המאפיינים התואמות מוצגות מתחת לדנדרוגרמה. (B>) ניתוח רכיבים ראשיים המראה את התפלגות הדגימות לאורך שני הרכיבים הראשיים הראשונים. (C>) הערכת עוצמת סף-הריכוך באמצעות מדד התאמה של טופולוגיה חסרת-קנה מידה וקישוריות ממוצעת. (D>) גנים קוצמו על פי חפיפה טופולוגית, והקצאות למודולים מסומנות באמצעות צבעים. (E>) מתאמי ה-eigengene של המודולים עם מאפיינים קליניים מוצגים כמפת חום. (F>) הקשר בין שייכות למודול לבין מובהקות גנים מוצג עבור גנים במודול הכחול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. ניתוח WGCNA המבוסס על אתיולוגיה של דלקת ריאות. (A) מוצגים מתאמי eigengene של מודולים עבור קבוצות אתיולוגיה, כולל ביקורת, חיידקית ודאית, ויראלית ודאית, חיידקית סבירה, ויראלית סבירה ולא ידועה. (B) מודולי גנים הוקצו מדנדרוגרמה של אשכולות המבוססת על חפיפה טופולוגית. (C) חברות במודול (Module membership) ומובהקות גנים (gene significance) מוצגים עבור המודול הכחול. (D) ביטוי ה-eigengene של המודול הכחול מושווה בין קבוצות האתיולוגיה. קיצורים: WGCNA = weighted gene co-expression network analysis; C = ביקורת; DB = חיידקית ודאית; DV = ויראלית ודאית; PB = חיידקית סבירה; PV = ויראלית סבירה; U = לא ידועה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. זיהוי ואנליזה פונקציונלית של גנים מועמדים. (A) תרשים Volcano המציג גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי בין דגימות של דלקת ריאות לדגימות ביקורת. (B) תרשים ונ (Venn) המראה את החפיפה בין גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEGs) של דלקת ריאות, גנים הקשורים בוודאות לחיידקים וגנים מטרה של Paeonia. (C) רשת אינטראקציה בין תרכובות למטרות בין רכיבים פעילים של Paeonia לבין גנים מועמדים. (D) תרשימי עמודות המראים העשרה של תהליכים ביולוגיים לפי Gene Ontology (משמאל) והעשרה של מסלולי KEGG (מימין) עבור הגנים החופפים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. ניתוח טרנסקריפטומי של תא בודד בדלקת ריאות. (A) תרשימי כינור (Violin plots) המסכמים מדדי בקרת איכות, כולל nCount_RNA, nFeature_RNA, אחוז גנים מיטוכונדריאליים ואחוז גנים ריבוזומליים. (B) תרשימי פיזור המראים את הקשרים בין ספירות UMI, מספר הגנים שזוהו לתא ואחוז הגנים המיטוכונדריאליים. (C) ויזואליזציית UMAP של אשכולי תאים המסומנים לפי סוגי תאים. (D) תרשים UMAP המציג ציוני AUCell עבור חתימת הגנים המועמדת בתאים בודדים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. דינמיקה של נויטרופילים וזיהוי גנים מרכזיים. (A) תרשימי קופסה המראים את פרופורציות התאים של מקרופאגים אלבולהריים ונויטרופילים בתנאים שונים (אוויר, PBS, ו-E. coli) לאחר 48 שעות ו-96 שעות. (B) תרשימי עמודות המראים העשרה של מסלולי KEGG (משמאל) והעשרה של תהליכים ביולוגיים של GO (מימין) עבור גני סימון של נויטרופילים. (C) דיאגרמת ונ המראית את החפיפה בין גני סימון של נויטרופילים למטרות משותפות של דלקת ריאות חיידקית ו-Paeonia. (D) תרשימי UMAP המראים את דפוסי הביטוי של MMP9, PYGL, ו-GADD45A באוכלוסיות תאים שונות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. עגינה מולקולרית (Molecular docking) של catechin עם חלבונים נבחרים. מבנים תלת-ממדיים של קומפלקסים של חלבון-ליגנד המראים את הקישור של catechin ל-GADD45A (למעלה), MMP9 (באמצע) ו-PYGL (למטה). פאנלים מוגדלים מראים את אזורי הקישור ומגעים עם שאריות חומצות אמינו מרכזיות. הדיאגרמות הדו-ממדיות מציגות קשרי מימן ואינטראקציות אחרות בין catechin לבין החלבונים הנבחרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7. סימולציות דינמיקה מולקולרית של קומפלקסים של חלבון–ליגנד. (A) סטיית השורש הממוצעת של הקומפלקסים במהלך הסימולציה. (B) שינויים ברדיוס הגירציה לאורך זמן. (C) שטח פנים נגיש לממס במהלך הסימולציה. (D) מספר קשרי המימן בין catechin לחלבוני המטרה לאורך זמן. (E) תנודה של השורש הממוצע של שאריות חלבון בכל קומפלקס. קיצורים: RMSD = סטיית השורש הממוצעת; Rg = רדיוס הגירציה; SASA = שטח פנים נגיש לממס; RMSF = תנודה של השורש הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה נלווית S1. גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי מוגבר בדגימות של דלקת ריאות בילדים לעומת דגימות ביקורת בריאות, כולל סמלי גנים, שינויי קיפול ב-log2, ערכי P, ערכי P מתוקננים וסטטיסטיקות limma קשורות. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
טבלה נלווית S2. טבלת אינטראקציות בין תרכובות של Paeonia למטרות ששימשה לניתוח רשתות, כולל מזהי תרכובות, שמות תרכובות וגנים מטרה קשורים. אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה נלווית S3. טבלת גנים מסמנים של תאים בודדים מ-GSE295484, הכוללת ערכי P-values, ממוצע של log2 fold changes, אחוזי ביטוי, ערכי P-values מתוקננים, הערות של מקבצי תאים וסמלי גנים. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
דלקת ריאות היא סיבה מרכזית למחלה ולמוות של תינוקות וילדים צעירים ברחבי העולם, המטילה נטל משמעותי על בריאות הציבור1. הפתוגנזה של דלקת ריאות בילדים היא מורכבת ואורחת תהליכים מקושרים מרובים, כולל תגובות דלקתיות מופרזות, עקה חמצונית ושיבוש של מסלולים חיסוניים ומטבוליים2,10,11. מחקרים קודמים העלו כי הפעלה בלתי מבוקרת של תאי מערכת החיסון המולדת, ובמיוחד נויטרופילים ומקרופאגים, תורמת לפגיעה ברקמת הריאה באמצעות שחרור של ציטוקינים פרו-דלקתיים, אנזימים פרוטאוליטיים ומין רדיקליים של חמצן (ROS)12. למרות התקדמות בטיפולים אנטימיקרוביאליים ותומכים, אסטרטגיות יעילות המכוונות למנגנונים מולקולריים בסיסיים אלה נותרו מוגבלות. לפיכך, לזיהוי של חומרים טיפוליים חדשים המסוגלים לווסת את הדלקת ולהשיב את ההומיאוסטזיס החיסוני ישנה חשיבות רבה.
פיטוכימיקלים, ובמיוחד קטכינים, זכו לתשומת לב גוברת בשל תכונותיהם המתועדות היטב כנוגדי דלקת, נוגדי חמצון ומודולטורים חיסוניים13,14,15. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים שבאמצעותם הקטכין מפעיל את השפעותיו המגינות בדלקת ריאות נותרו במידה רבה לא ברורים. מחקר זה בחן באופן שיטתי מנגנונים פוטנציאליים הקשורים לקטכין בדלקת ריאות בילדים, תוך שימוש בגישה אינטגרטיבית המשלבת טרנסקריפטומיקה, ריצוף RNA של תא בודד, עגינה מולקולרית וסימולציות דינמיקה מולקולרית.
בהתאם להשערה הראשונית, התוצאות הדגימו כי המודול הכחול שזוהה על ידי WGCNA היה קשור באופן מובהק הן למצב המחלה והן לסיווג האטיולוגי, מה שמרמז כי מודול זה מייצג תוכנית שעתוק ליבבית המעורבת בדלקת ריאות בילדים. אינטגרציה נוספת של ניתוח ביטוי דיפרנציאלי וחיזוי מטרות של Paeonia חשפה 18 גנים חופפים, שהיו מועשרים במסלולים הקשורים למערכת החיסון, כולל תגובה דלקתית, חילוף חומרים של מיני חמצן רב-פעילים ואיתות אינטרפרון מסוג II16,17. ממצאים אלו תומכים עוד יותר בתפיסה שתגובות חיסוניות לא מווסתות ועקה חמצונית הם מנועים מרכזיים של התקדמות המחלה.
ניתוח רצף RNA של תא בודד (Single-cell RNA sequencing) חשף עוד כי קבוצת הגנים המועמדת הייתה מועשרת בעיקר בנייטרופילים ובמקרופאגים אלבולאריים, מה שמדגיש את התפקיד המרכזי של תאי מערכת החיסון המולדת בהתקדמות הדלקת ריאתית (pneumonia). שיעור הנייטרופילים עלה באופן משמעותי תחת גירוי של E. coli, במיוחד בנקודות הזמן של 48 h ו-96 h, מה שמעיד על הפעלה מתמשכת במהלך דלקת חריפה, דבר העולה בקנה אחד עם תפקידם הכפול בפינוי פתוגנים ובגרימת נזק לרקמות באמצעות מתווכים דלקתיים ו-ROS18. ניתוח נוסף זיהה שלושה גנים מרכזיים—MMP9, PYGL, ו-GADD45A—כקשרים פוטנציאליים בין תגובות חיסוניות, ויסות מטבולי ומעקה תאי. בעוד ש-MMP9 מעורב בעיצוב מחדש של המטריקס extracellular והסנפילטרציה דלקתית19, ו-GADD45A מווסת תגובות למעקה ולמערכת החיסון, PYGL מצביע על תפקיד של תכנון מטבולי מחדש (metabolic reprogramming) בהפעלה חיסונית20,21. סימולציות של עגינה מולקולרית (Molecular docking) ודינמיקה הצביעו על קישור חזוי ויציב של catechin לחלבונים נבחרים אלו, נתמך על ידי אנגיות קישור נוחות ופרופילי RMSD, Rg, ו-SASA יציבים, לצד קשרי מימן מתמשכים וערכי RMSF נמוכים. ממצאים אלו מרמזים כי catechin עשוי להיות קשור למטרות דלקתיות ומטבוליות אלו, אך השפעות רגולטוריות ישירות דורשות תיקוף ניסיוני נוסף22.
בנוסף להשפעותיו נוגדות הדלקת, ייתכן שקטכין (catechin) ממלא גם תפקידים מגנים על ידי ויסות עקה חמצונית ומאזן מטבולי. העשרה של מסלולים הקשורים ל-ROS מרמזת כי קטכין עשוי להקל על נזק חמצוני על ידי הגברת הקיבולת הנוגדת חמצון, ממצא העולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים על תכונותיהם נוגדות החמצון של קטכינים. יתרה מכך, מעורבותם של אנזימים מטבוליים כגון PYGL מדגישה תפקיד פוטנציאלי של קטכין בויסות אימונו-מטבוליזם, מושג מתהווה במחלות דלקתיות.
יש להכיר במספר מגבלות של מחקר זה. ראשית, מחקר זה התבסס בעיקר על מערכי נתונים טרנסקריפטומיים הזמינים לציבור ועל ניתוחים חישוביים, והמנגנונים שנחזו טרם תוקפו ניסיונית. אף על פי שסימולציות של עגינה מולקולרית (molecular docking) ודינמיקה מולקולרית הצביעו על אינטראקציות יציבות בין catechin לבין חלבוני המטרה המועמדים, ממצאים אלו אינם מוכיחים עיכוב תפקודי, הפעלה או יעילות טיפולית. נדרשים בדיקות ביוכימיות נוספות, ניסויים תאיים ומחקרי in vivo כדי לתקף את ההשפעות הרגולטוריות של catechin על MMP9, PYGL ו-GADD45A, וכדי לקבוע את הרלוונטיות הטיפולית שלו בדלקת ריאות. שנית, המידע הקליני הזמין עבור מערך הנתונים של דלקת ריאות בילדים היה מוגבל. מערך הנתונים GSE261482 סיפק נתונים טרנסקריפטומיים של דם מלא מחולי דלקת ריאות ילדים ומביקרות בריאות, יחד עם מטא-נתונים הכוללים מין, סיווג אטיולוגי, סוג מבחנה, סבב (batch) ומצב מחלה.
עם זאת, משתנים קליניים מפורטים, כולל גיל אישי, חומרת הדלקת בריאות, סטטוס הטיפול בזמן הדגימה ומידע אחר על מהלך המחלה, לא היו זמינים במלואם במטא-דאטה של GEO ששימש במחקר זה. לפיכך, לא ניתן היה לבצע ניתוחים מרובדים נוספים לפי חומרה קלינית, שלב טיפולי או תת-קבוצת גיל. שלישית, מערכי הנתונים של bulk RNA-seq ושל single-cell RNA-seq נגזרו מהקשרים ביולוגיים שונים. GSE261482 הופק מדגימות דם מלא של מטופלים פדיאטריים, בעוד ש-GSE295484 הופק מרקמות ריאה של עכברים מסוג C57BL/6 wild-type במודל ניסויי של דלקת ריאות. לפיכך, יש לפרש את תוצאות ה-single-cell כראיות תומכות בהקשר התאי עבור אוכלוסיות של תאי דלקת והפצה של גנים מועמדים, ולא כתיקוף ישיר בדלקת ריאות פדיאטרית בבני אדם. בנוסף, מודל דלקת הריאות בעכברים המושרה על ידי E. coli אינו מייצג באופן מלא את האטיולוגיות ההטרוגניות של דלקת ריאות פדיאטרית, הכוללות סיבות חיידקיות, ויראליות, סיכוי לחיידקית, סיכוי לויראלית וסיבות לא ידועות.
לבסוף, הבחירה ב-MMP9, PYGL ו-GADD45A התבססה על סריקה ביו-אינפורמטית אינטגרטיבית ועל רלוונטיות ביולוגית ידועה, אך תפקידיהם המדויקים בדלקת הקשורה לנויטרופילים ובבקרה המתווכת על ידי catechin טרם אומתו. נדרשים מחקרים עתידיים המשתמשים בקוהורטות קליניות פדיאטריות, במאגרי נתונים של תאים בודדים מבני אדם, בבדיקות תפקודיות ספציפיות למטרה ובמודלים ניסיוניים של דלקת ריאות כדי לתקף ממצאים אלו ולהבהיר את הפוטנציאל התרגומי של catechin.
לסיכום, מחקר זה מצביע על כך ש-catechin עשוי להיות קשור לתגובות דלקתיות הקשורות לנויטרופילים ולגנים נבחרים המעורבים בבקרה חיסונית, בעקה חמצונית ובמסלולים מטבוליים בדלקת ריאות. באמצעות ניתוח אינטגרטיבי של bulk RNA sequencing, single-cell RNA sequencing, docking מולקולרי וסימולציות של דינמיקה מולקולרית, מחקר זה זיהה מודול גנים הקשור למחלה ובחר ב-MMP9, PYGL ו-GADD45A לצורך ניתוחי docking וסימולציה של catechin. העשרה של הגנים המועמדים בנויטרופילים ובמקרופאגים אלבולריים, יחד עם האינטראקציות היציבות שנחזו בין catechin לבין החלבונים הנבחרים, תומכת במנגנון פוטנציאלי הדורש תיקוף ניסויי נוסף. באופן כללי, ממצאים אלו מספקים פרספקטיבה ברמת המערכת על מנגנונים פוטנציאליים הקשורים ל-catechin בדלקת ריאות, אך נדרשים מחקרים ניסויים וקליניים נוספים כדי לתקף תצפיות אלו ולהבהיר את הרלוונטיות הטיפולית שלהן.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שדה הכוחות AMBER14SB סוג: שדה כוחות | שדה כוחות של חלבונים עבור סימולציות דינמיקה מולקולרית | ||
| חבילת ה-R AUCell סוג: חבילת R | דירוג פעילות של קבוצות גנים ברמה של תא בודד | ||
| AutoDock Tools סוג: תוכנה | הכנת קולטן וליגנד | ||
| AutoDock Vina סוג: תוכנה | עגינה מולקולרית | ||
| BindingDB סוג: מאגר נתונים | BindingDB | אינטראקציות בין תרכובות למטרות המאומתות ניסויית; כתובת URL/גרסה לא סופקו בכתב היד | |
| חבילת ה-R clusterProfiler סוג: חבילת R | ניתוח העשרה של GO ו-KEGG | ||
| DrugBank סוג: מאגר נתונים | DrugBank | אינטראקציות בין תרכובות למטרות המוכחות ניסויית; כתובת URL/גרסה לא סופקו בכתב היד | |
| מאגר הנתונים ETCM סוג: מאגר נתונים | ETCM | סריקת תרכובות פעילות של Paeonia; כתובת URL/גרסה לא סופקו בכתב היד | |
| שדה הכוחות GAFF2 סוג: שדה כוחות | שדה כוחות של ליגנד עבור סימולציות דינמיקה מולקולרית | ||
| GROMACS 2022 סוג: תוכנה | GROMACS | סימולציית דינמיקה מולקולרית | |
| GSE261482 סוג: מאגר נתונים ציבורי של bulk RNA-seq | Gene Expression Omnibus (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE261482 | נתוני ביטוי בדם מלא של ילדים עם דלקת ריאות ובקרה בריאה |
| GSE295484 סוג: מאגר נתונים ציבורי של scRNA-seq | Gene Expression Omnibus (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE295484 | נתוני ריצוף RNA של תא בודד מריאת עכבר ממודל ניסויי של דלקת ריאות |
| חבילת ה-R limma סוג: חבילת R | ניתוח ביטוי דיפרנציאלי | ||
| שרת PharmMapper סוג: מאגר נתונים/כלי | PharmMapper | http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/ | מיפוי פארמקופור הפוך |
| מאגר נתוני החלבונים (Protein Data Bank - PDB) סוג: מאגר נתונים | מאגר נתוני החלבונים (Protein Data Bank) | מבני חלבונים עבור GADD45A (2KG4), MMP9 (6ESM) ו-PYGL (3DDS) | |
| מאגר הנתונים PubChem סוג: מאגר נתונים | PubChem | מבנה תלת-ממדי של קטכין | |
| תוכנת R סוג: תוכנה | פרויקט R | ניתוחים סטטיסטיים | |
| חבילת ה-R Seurat סוג: חבילת R | בקרת איכות, נרמול, צבירה (clustering), ויזואליזציה באמצעות UMAP ואנוטציה של תאים בריצוף RNA של תא בודד (Single-cell RNA sequencing) | ||
| גישת אנסמבל הדמיון (SEA) סוג: מאגר נתונים/כלי | SEA | http://sea.bkslab.org | חיזוי אינטראקציות פוטנציאליות חוץ-מטרה |
| sobtop_1.0 (dev3.1) סוג: תוכנה | יצירת פרמטרים לליגנד | ||
| SwissTargetPrediction סוג: מאגר נתונים/כלי | SwissTargetPrediction | http://www.swisstargetprediction.ch | חיזוי מטרה של תרכובת |
| מודל המים TIP3P סוג: מודל מים | סולבציה (ממס) של קומפלקסים של חלבון-ליגנד | ||
| מאגר המידע לפארמקולוגיה של מערכות ברפואה סינית מסורתית (TCMSP) סוג: מאגר נתונים | TCMSP | https://tcmsp-e.com | סריקת תרכובות פעילות מ-Paeonia |
| מאגר המידע UniProt סוג: מאגר נתונים | UniProt | https://www.uniprot.org | סטנדרטיזציה של סמלי גנים |
| חבילת ה-R שנקראת WGCNA סוג: חבילת R | ניתוח רשתות ביטוי גנים משותף משוקלל |
מקורות
- Chen L, Chen Y, Huang J, Zhang J. LncRNA LINC00707 serves as a sponge of miR-382-5p to alleviate lipopolysaccharide (LPS)-induced WI-38 cell injury through upregulating NKAP in infantile pneumonia. Autoimmunity. 2022;55(5):328-38.
- Li S et al. miRNA-302e attenuates inflammation in infantile pneumonia through the RelA/BRD4/NF-κB signaling pathway. Int J Mol Med. 2019;44(1):47-56.
- Kennedy II DE et al. Contribution of Puma to inflammatory resolution during early pneumococcal pneumonia. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12:886901.
- Wang C et al. Suppressing neutrophil itaconate production attenuates Mycoplasma pneumoniae pneumonia. PLoS Pathog. 2024;20(11):e1012614.
- Shen N et al. Plant flavonoids: classification, distribution, biosynthesis, and antioxidant activity. Food Chem. 2022;383:132531.
- Peng X, McClements DJ, Liu X, Liu F. EGCG-based nanoparticles: synthesis, properties, and applications. Crit Rev Food Sci Nutr. 2025;65(12):2177-98.
- Li T et al. Synergistic anti-inflammatory effects of quercetin and catechin via inhibiting activation of TLR4-MyD88-mediated NF-κB and MAPK signaling pathways. Phytother Res. 2019;33(3):756-67.
- Viz-Lasheras S et al. A diagnostic host-specific transcriptome response for Mycoplasma pneumoniae pneumonia to guide pediatric patient treatment. Nat Commun. 2025;16(1):673.
- Michki SN et al. Age-dependent immune responses and resident cell dynamics in young mice following pneumonia. iScience. 2026;29(1):114219.
- Jin M et al. Catechin-functionalized cationic lipopolymer based multicomponent nanomicelles for lung-targeting delivery. Adv Mater. 2024;36(17):e2302985.
- Shin-Ya M et al. Effects of tea, catechins and catechin derivatives on Omicron subvariants of SARS-CoV-2. Sci Rep. 2023;13(1):16577.
- Zheng Q, Li J, Yang L. Systematic investigation of catechin/cyclodextrin encapsulated polymeric nanospheres for the treatment and nursing care of pediatric pneumonia-causing human pathogens. Microb Pathog. 2025;205:107524.
- Zhang Y et al. Anti-inflammatory effect of chlorogenic acid in Klebsiella pneumoniae-induced pneumonia by inactivating the p38MAPK pathway. Int J Med Microbiol. 2023;313(2):151576.
- Gleeson K, Reynolds HY. Life-threatening pneumonia. Clin Chest Med. 1994;15(3):581-602.
- Ross SM. Resveratrol: the anti-inflammatory effects of a phytochemical compound on pneumonia, respiratory syncytial virus, and severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV-2). Holist Nurs Pract. 2023;37(2):110-2.
- Hu H et al. Hybrid biomimetic membrane coated particles-mediated bacterial ferroptosis for acute MRSA pneumonia. ACS Nano. 2023;17(12):11692-712.
- Dong L et al. A ROS-responsive nanoprodrug-engineered phage biotherapy for precision treatment of multidrug-resistant Gram-negative bacterial pneumonia. J Control Release. 2025;382:113708.
- Wiegman CH et al. Oxidative stress in ozone-induced chronic lung inflammation and emphysema: a facet of chronic obstructive pulmonary disease. Front Immunol. 2020;11:1957.
- Jiang T et al. Dual role of Baimao-Longdan-Congrong-Fang in inhibiting Staphylococcus aureus virulence factors and regulating TNF-α/TNFR1/NF-κB/MMP9 axis. Phytomedicine. 2025;139:156477.
- Zhang H et al. The attenuated Mycoplasma bovis strain promotes apoptosis of bovine macrophages by upregulation of CHOP expression. Front Microbiol. 2022;13:925209.
- Borella R et al. Metabolic reprograming shapes neutrophil functions in severe COVID-19. Eur J Immunol. 2022;52(3):484-502.
- Xu Y et al. Exosomal miR-155-5p drives widespread macrophage M1 polarization in hypervirulent Klebsiella pneumoniae-induced acute lung injury via the MSK1/p38-MAPK axis. Cell Mol Biol Lett. 2023;28(1):92.