מאמר שיטה

גילוי אנטיגנים של תאי חיסון תוך-גידוליים במודל של תאי גליובלסטומה דמויי תאי גזע במערכת חיסונית תקינה באמצעות אימונוהיסטוכימיה מבוססת סובסטרט

71 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72193

⸱

21 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

המחקר מספק תהליך עבודה מפורט וניתן לשחזור של אימונוהיסטוכימיה מבוססת-מצע לזיהוי עקבי של אנטיגנים בודדים או כפולים בחתכי רקמת גידול המופקים מתאי גזע של גליובלסטומה וקיבעו בפורמלין וטמנו בפראפין (FFPE). הפרוטוקול תומך בזיהוי של סממנים חיסוניים ותומוריים שונים תוך מענה לאתגרים טכניים, עם פוטנציאל לשימוש במודלים אחרים של גידולים.

תקציר

גליובלסטומה (GBM) היא הגידול השפיר הראשוני השכיח והקטלני ביותר במוח, עבורו אין טיפולים יעילים. היא מאופיינת במיקרו-סביבה גידולית דיכאית למערכת החיסון באופן עמוק, המונעת בחלקה על ידי תאי גליובלסטומה דמויי תאי גזע (GSCs) העמידים לטיפול. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים ניתנים לשחזור של אימונוהיסטוכימיה (IHC) בעלת צבע בודד או בצבע כפול המבוססת על תשתית, לזיהוי אנטיגנים פנימיים ועל פני השטח של תאי חיסון החודרים לגידול בחתכי גידול מוח מקובעים בפורמלין ומוטמעים בפרפין (FFPE). גידולי המוח הופקו מ-GSCs של עכברים, אשר הוטמעו באופן אורתוטופי בעכברים בעלי מערכת חיסון תקינה. זרימת העבודה של IHC בצבע בודד משתמשת במערכת זיהוי כרומוגנית המבוססת על חמאתית חזרית פרוקסידאז (HRP) להדמיה של אנטיגנים בודדים של תאי חיסון, בעוד שזרימת העבודה של IHC בצבע כפול משתמשת באסטרטגיית צביעה רצפית המבוססת על פוספטאז אלקלי (AP) לזיהוי סימולטני של שני אנטיגנים של תאי חיסון בתוך אותו חתך רקמה, כולל זרימות עבודה המשתמשות בנוגדנים ראשוניים ממקור מאכסן זהה. שיטות אלו מספקות מסגרת מעשית וניתנת לשחזור לניתוח כרומוגני של אנטיגנים הקשורים לתאי חיסון החודרים לגידול ברקמות GBM, ועשויות להיות ניתנות להסתגלות למודלים פרה-קליניים אחרים של גידולים ופוטנציאלית לדגימות FFPE אנושיות.

מבוא

גליובלסטומה (GBM) היא גידול מוחי ממאיר ראשוני, אגרסיבי, פולשני מאוד והטרוגני, הקשור לשיעורי הישרדות נמוכים של מטופלים למרות טיפולי התקן הנוכחיים1. מאפיין מכריע של GBM הוא מיקרו-סביבת הגידול (TME) המדכאת את מערכת החיסון באופן עמוק, דבר התורם לעמידות לאסטרטגיות של אימונותרפיה2,3. מספר מנגנונים מניעים את דיכוי מערכת החיסון ב-GBM, כולל הפחתה בחדירה של תאי T אפקטורים והשראה של תפקוד לקוי ותשישות של תאי T4. בנוסף, תאים דמויי גזע של GBM (GSCs), תת-אוכלוסייה של תאי GBM, מקדמים עוד יותר את ההחלקה מהמערכת החיסונית על ידי שמירה על TME אימונולוגית "קרה", המאופיינת בפעילות חיסונית ציטוטוקסית מוגבלת5. מאפיינים אלו מדגישים את החשיבות של אפיון מדויק של אוכלוסיות תאי חיסון החודרים לגידול ומצבם התפקודי בתוך ה-TME של GBM.

אימונוהיסטוכימיה (IHC) נותרת אחת השיטות הנפוצות ביותר להערכת חדירת תאי מערכת החיסון לרקמות גידול, כיוון שהיא משמרת את ארכיטקטורת הרקמה תוך שהיא מאפשרת ויזואליזציה, לוקליזציה והערכה חצי-כמותית של סמנים תאיים in situ6,7,8,9,10,11,12. מחקרי אימונוהיסטוכימיה ופרופיל חיסוני קודמים קידמו באופן משמעותי את הבנתנו לגבי הנוף החיסוני של GBM וזיהו אוכלוסיות של תאי חיסון הקשורות להתקדמות הגידול ולתגובה טיפולית12,13,14,15,16. IHC כרומוגנית בצבע בודד שימושית במיוחד לזיהוי סממני חיסון בודדים בחתכי רקמה מקובעים בפורמלין ומוטמעים בפרפין (FFPE)12,13,15,17,18,19,20. לעומת זאת, IHC כרומוגנית דו-צבעית מאפשרת ויזואליזציה סימולטנית של שני סממנים באותו חתך רקמה, ובכך מקלה על הערכת הפנוטיפ התאי, השגשוג או מצב ההפעלה12,19,21.

למרות התקדמויות אלו, פרוטוקולים מעשיים וסטנדרטיים של IHC כרומוגני מבוססי-סובסטרט, הישימים למודלים של GBM שנגזרו מ-GSC בעלי מערכת חיסון תקינה, נותרו מוגבלים. יתרה מכך, IHC כרומוגני נותר מאתגר יותר ב-GBM מאשר בגידולים מוצקים רבים אחרים בשל חדירת תאי חיסון דלילה והטרוגנית, הטרוגניות תוך-גידולית נרחבת, ו-TME מורכב ומדכא חיסון מאוד, המקשים על ויזואליזציה ופרשנות מדויקות של אוכלוסיות תאיות מרובות בתוך אותו נתח רקמה2,3,4. IHC כרומוגני כפול מציב אתגרים טכניים נוספים, במיוחד כאשר שני הנוגדנים הראשוניים הופקו מאותו מין מאכסן, מה שדורש אופטימיזציה קפדנית של תאימות הנוגדנים, אסטרטגיית צביעה רצפית לזיהוי סימולטני של שני אנטיגנים בתוך אותו נתח רקמה, ובחירה של סובסטרט כרומוגני כדי להבטיח הבחנה ברורה בין הסמנים תחת מיקרוסקופיית אור.

כאן, אנו מתארים פרוטוקולי IHC בעלי מצע (substrate-based) בעלי צבע יחיד או כפול, ניתנים לשחזור, המזהים בהצלחה אנטיגנים ייצוגיים על פני השטח ובתוך התא הקשורים לתאי חיסון חודרים לגידול במודל GBM אורתוטופי של 005 GSC בעכברים בעלי מערכת חיסון תקינה22,23,24. ניתן להתאים פרוטוקולי IHC כרומוגניים מבוססי-מצע אלו גם למודלים פרה-קליניים אחרים של גידולים, וייתכן שגם לדגימות גידולים אנושיות מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפראפין (FFPE). רקמות מוח של עכברים שנאספו קובעו בפורמלין ניטרלי מנוטרל בריכוז 10% למשך לילה (~12 h) לפני עיבוד רקמה שגרתי והטמעה בפראפין, כפי שתוכאר בעבר19. בלוקי FFPE נחתכו (בעובי של 5 µm19) על גבי למסלייד זכוכית טעונים חיובית ואוחסנו בטמפרטורת החדר עד לשימוש. IHC בצבע יחיד משתמש במערכת זיהוי כרומוגנית המבוססת על חרשית פראוקסידאז (HRP) עם 3,3′-diaminobenzidine (DAB) כמצע ליצירת אות חום לצורך ויזואליזציה של אנטיגנים בודדים תחת מיקרוסקופ אור. תהליך עבודה זה מתאים לזיהוי של אנטיגנים הקשורים לממברנה ואנטיגנים תוך-תאיים בחתכי רקמת FFPE.

שימוש ב-IHC דו-צבעי מאפשר זיהוי סימולטני של שני אנטיגנים בתוך אותו נתח רקמה, אך דורש אופטימיזציה נוספת כדי להבטיח תאימות בין הנוגדנים והפרדה ברורה של האותים הכרומוגניים. צביעת IHC דו-צבעית היא פשוטה יחסית כאשר הנוגדנים הראשוניים הופקו ממיני מאכסן שונים, מה שמאפשר שימוש בנוגדנים משניים ספציפיים למין. עם זאת, זיהוי סימולטני הופך למאתגר יותר מבחינה טכנית כאשר שני הנוגדנים הראשוניים מקורם מאותו מין מאכסן. כדי להתמודד עם אתגר זה, תהליך העבודה של ה-IHC הדו-צבעי המתואר כאן מעסיק אסטרטגיית צביעה כרומוגנית סדרתית מבוססת alkaline phosphatase (AP), המשתמשת בתסמינים (substrates) נפרדים כדי לאפשר הבחנה ויזואלית ברורה בין שני אותות האנטיגנים תחת מיקרוסקופ אור.

שני זרימות העבודה כוללות שלבי הסרת פראפין מהרקמה (deparaffinization), רהידרציה, חשיפת אנטיגנים (antigen retrieval), חסימה (blocking), צביעה, דהידרציה, שקיפות (clearing) והטמעה (mounting). הכנת הרכיבים קריטית לאיכות הצביעה וליכולת השחזור שלה (ראו Supplementary File 1). באופן דומה, דילולים מתאימים של נוגדים ראשוניים הם קריטיים להצלחת פרוטוקול הצביעה; הדילול מבוצע מיד לפני השימוש ב-2.5% סרום סוס או עיזים נורמלי, בהתאם למין המארח של הנוגד השני המתאים (ראו Table 1). רשימה של נוגדים שניים ספציפיים למינים המשמשים לצביעה בצבע בודד או בצבע כפול מוצגת גם ב-Table 2. IHC בצבע בודד משתמש ברכיבי שקיפות והטמעה מבוססי קסילן (xylene), בעוד ש-IHC בצבע כפול דורש חלופות ללא קסילן (למשל, Histo-Clear), מכיוון שהסובסטרט מסיס חלקית בקסילן (ראו את רשימת הסובסטרטים ב-Table 3).

פרוטוקול

פרוטוקול זה בוצע בהתאם לכל ההנחיות הרגולטוריות והמוסדיות הרלוונטיות, כולל אלו של הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם (IACUC) (מספרי פרוטוקול IACUC: 2004N000067 ו-LA24-0045).

הערה: מספר שלבים בפרוטוקולי IHC של צבע יחיד או שני צבעים כוללים ריאגנטים דליקים, כולל אתנול וחומרי הבהרה של רקמות. בהתאם לכך, יש לבצע הליכים הכוללים כימיקלים דליקים, כולל הסרת פראפין (deparaffinization), רהידרציה, דהידרציה, הבהרה והרכבה, בתוך מנדף כימי מאושר תוך שימוש בנהלי בטיחות מעבדתיים מתאימים. יש להכין ולאחסן ריאגנטים דליקים במכלי זכוכית עם פקק הברגה המסומנים כראוי, בתוך ארונות אחסון ייעודיים לחומרים דליקים, בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. החומרים ונפחי הריאגנטים מותאמים לעיבוד של קבוצה של עד 48 סליידים למיקרוסקופ (שתי רשתות צביעה, 24 סליידים לרשת), אם כי ניתן להתאים את זרימת העבודה בקלות בהתאם לצרכים הניסיוניים.

1. IHC בצבע יחיד עבור חתכי גידול מוחי בקיבוע FFPE

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר IHC חד-צבעי מבוסס-סובסטרט לזיהוי אנטיגנים מייצגים על פני השטח ובתוך התא בחתכים של גידולי מוח בשימור FFPE, שהופקו ממודל ה-005 GSC האורתוטופי.

  1. הסרת פראפין (20 דקות):
    1. הניחו את השקופיות במעמד שקופיות מ-polyoxymethylene (POM) וטבלו את מעמד השקופיות במכלי צביעה, תחילה ב-Xylene I ולאחר מכן ב-Xylene II, כל אחד למשך 10 דקות תחת מנדף כימיים. ודאו שחתכי הרקמה נשארים טבולים לחלוטין ב-xylene במהלך הסרת הפראפין.
      זהירות: בצעו שלב זה תחת מנדף כימיים עם ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל חלוק מעבדה, משקפי מגן, מסכת פנים וכפפות. אין לאפשר לחתכים להתייבש בשלב זה או בכל אחד מהשלבים הבאים, שכן הדבר עלול לגרום לנזק לרקמה ולאובדן של החתכים. אחסנו תמיסות xylene במכלי זכוכית אטומים והשתמשו בהן שוב אם הן נראות נקיות.
  2. הידראציה הדרגתית (15 דקות):
    1. בצעו הידראציה לחתכים באופן רצופי באתנול 100%, 90% ו-70% למשך 5 דקות כל אחד. לשם כך, טבלו את השקופיות באתנול 100% במכל הצביעה למשך 5 דקות (לאחר מכן החזירו את האתנול 100% לבקבוק הזכוכית לשימוש חוזר), לאחר מכן באתנול 90% למשך 5 דקות (החזירו לבקבוק), ולבסוף באתנול 70% למשך 5 דקות (החזירו לבקבוק).
      זהירות: בצעו שלב זה תחת מנדף כימיים והשתמשו ב-PPE כפי שפורט בשלב 1.1. ניתן להשתמש שוב בתמיסות אתנול אלו בניסויים שונים אם הן מאוחסנות במכלי זכוכית אטומים, ובתנאי שהן נראות נקיות.
  3. שטיפה במים (5 דקות):
    1. הניחו את השקופיות במים מזוקקים למשך 5 דקות, ובכך מסתיים תהליך ההידראציה.
      הערה: תוך כדי ביצוע שלב זה, הכינו 600 mL (עבור מעמד שקופיות אחד) עד 800 mL (עבור שני מעמדי שקופיות) של תמיסת באפר לשחזור אנטיגן 1× (באפר סודיום ציטראט 10 mM) בכלי זכוכית למיקרוגל בנפח 2 L, בהתאם להוראות המופיעות בסבב קובץ נספח 1 (Supplementary File 1).
  4. שחזור אנטיגן (~20 דקות):
    1. כסו את כלי ה-2 L המכיל את באפר שחזור האנטיגן סודיום ציטראט 10 mM שהוכן טרי בניילון נצמד למניעת אידוי מוגבר במהלך החימום המקדים והחימום הממושך במיקרוגל.
    2. צרו מספר חורים בניילון הנצמד כדי למנוע מהבאפר להישפך כתוצאה מלחץ עודף שנוצר במהלך הרתחת חתכי הרקמה.
      הערה: השתמשו ב-PPE כפי שפורט בשלב 1.1.
    3. חממו מראש את תמיסת באפר שחזור האנטיגן סודיום ציטראט 10 mM שהוכנה טרי למשך 3 דקות. הניחו את מעמד השקופיות עם חתכי הרקמה שעברו הידראציה לתוך תמיסת שחזור האנטיגן שחוממה מראש.
    4. לאחר מכן חממו במיקרוגל את חתכי הרקמה למשך 15 דקות בהספק המיקרוגל הגבוה ביותר (למשל, P10), תוך ניטור זהיר של הכלי כדי לוודא שהחתכים נשארים טבולים ואינם מתייבשים עקב אידוי.
      הערה: לחלופין, ניתן לבצע שחזור אנטיגן באמבט צביעה מפלסטיק הממוקם בתוך סיר אידוי למשך כ-15 דקות, המספק שיטת חימום עדינה יותר עם פחות צורך בניטור. באפר סודיום ציטראט (10 mM, pH 6.0) תוקף בהצלחה ושימש כבאפר לשחזור אנטיגן עבור כל הנוגדנים הראשוניים המפורטים ב טבלה 1. בהתאם לנוגדן הראשוני ולהמלצות היצרן, עשויים להידרש באפרים אחרים, כגון EDTA או Tris-EDTA, עבור נוגדנים שלא הוערכו במחקר זה. 
  5. קירור (10–20 דקות):
    1. הוציאו את הכלי מהמיקרוגל, הניחו אותו על משטח העבודה ואפשרו לו להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. כדי להאיץ את הקירור, הניחו את הכלי במים זורמים קרים מאוד למשך כ-10 דקות.
      זהירות: הכלי יהיה לוהט מאוד; השתמשו בכפפות עמידות לחום או במלקחי כלי זכוכית כדי לטפל בו. השתמשו ב-PPE כפי שפורט בשלב 1.1.
  6. שטיפה ב-Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) (~10 דקות):
    1. הוציאו את מעמד השקופיות מהכלי וטבלו את השקופיות בתמיסת 1× DPBS במכל הצביעה.
    2. שטפו את החתכים פעמיים ב-1× DPBS למשך 5 דקות כל פעם, תוך שימוש בשטיפות סטטיות עדינות כדי למנוע התנתקות של הרקמה.
  7. מחסום הידרופובי (<1 דקה לשקופית):
    1. במהלך השטיפה ב-DPBS (שלב 1.6), הוציאו בזהירות כל שקופית בנפרד, נגבו בעדינות מסביב לחתך הרקמה בעזרת מגבונים נטולי סיבים (למשל, Kim Wipes), תוך הימנעות ממגע עם הרקמה עצמה.
    2. השתמשו במחסום הידרופובי, כגון עט peroxidase-anti-peroxidase (PAP), כדי לצייר מחסום דוחה נוזלים מסביב לכל חתך רקמה, ולאחר מכן החזירו את השקופית לתמיסת השטיפה DPBS במכל הצביעה. חזרו על שלבים אלו עבור כל השקופיות.
      הערה: מחסום הידרופובי מסביב לרקמה מונע נזילה של ריאגנטים בין חתכים ומסייע בשימור הנוגדנים על הרקמה.
  8. חסימה של פראוקסידאז אנדוגני (5 דקות):
    1. שפכו את ה-1× DPBS ממכל הצביעה, ולאחר מכן הוסיפו תמיסת 3% H₂O₂, תוך וידוא שהשקופיות או חתכי הרקמה טבולים לחלוטין למשך 5 דקות.
      הערה: אינקובציה ממושכת ב-3% H₂O₂ עלולה לגרום לנזק לרקמה. חסימת פעילות פראוקסידאז אנדוגנית היא שלב קריטי למניעת רקע הנגרם מפראוקסידאז פנימי במהלך פיתוח הצבע. השתמשו ב-PPE כפי שפורט בשלב 1.1.
  9. שטיפה ב-DPBS (~12 דקות):
    1. שפכו את תמיסת ה-3% H₂O₂, ושטפו שוב את השקופיות ב-1× DPBS פעמיים למשך 5 דקות כל פעם.
    2. לאחר השטיפה השנייה, הוציאו את השקופיות ממעמד השקופיות, הניחו אותן שטוח במבנה לח (humidified chamber), והוסיפו מים מזוקקים לקצוות המבנה הלח.
    3. אל תתנו לחתכים להתייבש, ועברו מיד לשלב החסימה בשלב 1.10.
      הערה: כל מבנה לח המופיע בטבלת החומרים (Table of Materials) כולל מקום ויכול להכיל 30 שקופיות.
  10. חסימה בסרום (~70 דקות):
    1. הוסיפו 50 µL של תמיסת 5% bovine serum albumin (BSA) לכל חתך והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, תוך שמירה על מכסה המבנה הלח סגור למניעת אידוי של באפר החסימה מחתכי הרקמה.
    2. לאחר 30 דקות, הקישו בעדינות את השקופיות על מגבונים נטולי סיבים המונחים על משטח העבודה כדי להסיר את ה-BSA.
    3. לאחר מכן, הוסיפו 2.5% נורמל סרום מסוס או מעז (טיפה אחת לכל חתך), בהתאם למין המארח של הנוגדן המשני, והדגירו את החתכים למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר עם מכסה המבנה הלח סגור; הקישו בעדינות את השקופיות על נייר סופג או מגבונים נטולי סיבים כדי להסיר את הסרום, ועברו מיד לשלב 1.11.
      הערה: אל תתנו לחתכים להתייבש. הכינו את הנוגדנים הראשוניים המדוללים בבאפר החסימה המתאים (ראו טבלה 1) לקראת סוף שלב החסימה כדי שיהיו מוכנים לשימוש בשלב 1.11 עם סיום החסימה.
  11. אינקובציה עם נוגדן ראשוני (~16 שעות):
    1. מרחו כ-50 µL של נוגדנים ראשוניים, מדוללים באופן אופטימלי בבאפר החסימה המתאים (ראו טבלה 1), על חתכי הרקמה והדגירו למשך לילה (~16 שעות) ב-4 °C במבנה לח.
      הערה: ודאו שהאזורים הייעודיים במבנה הלח מלאים במים מזוקקים כדי לשמור על הלחות במבנה במהלך הלילה. בנוסף, נקטו אמצעים להבטיח שהאזורים/תאים הייעודיים לשקופיות הרקמה אינם מלאים במים מזוקקים, שכן הדבר עלול לגרום להצפה של חתכי הרקמה.
  12. שטיפה ב-DPBS (0.1% Tween 20) (~18–20 דקות):
    1. הניחו מעמד שקופיות במכל צביעה ומלאו אותו בבאפר שטיפה (1× DPBS, 0.1% Tween 20).
    2. לאחר אינקובציה של לילה, הוציאו את השקופיות מהמבנה הלח, הסילו את הנוגדנים הראשוניים על ידי הקשה עדינה של השקופיות על נייר סופג, ולאחר מכן הניחו את השקופיות במעמד שקופיות טבול בבאפר שטיפה (1× DPBS, 0.1% Tween 20) במכל צביעה, ושפכו את באפר השטיפה.
    3. לאחר מכן, שטפו את החתכים ב-1× DPBS (0.1% Tween 20) שלוש פעמים, 5 דקות בכל פעם, ולאחר מכן הוציאו את השקופיות ממעמד השקופיות והניחו אותן שטוח במבנה הלח, ועברו מיד לשלב 1.13.
      הערה: ניתן להאריך כל זמן שטיפה ל-10–15 דקות אם נראה כי צביעת הרקע גבוהה לאחר פיתוח הצבע בשלב 1.15. השטיפה צריכה להיות עדינה וסטטית (ללא נדנוד או ניעור) כדי למנוע התנתקות של הרקמה מהשקופיות.
  13. אינקובציה עם נוגדן משני (~32–35 דקות):
    1. הוסיפו טיפה אחת לחתך של הנוגדן המשני המתאים המצומד ל-HRP (anti-rabbit או anti-rat IgG, לפי הצורך; ראו טבלה 2) והדגירו את חתכי הרקמה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם מכסה המבנה הלח סגור.
      הערה: ניתן לדלל את הנוגדן המשני ביחס של 1:1 ב-PBS כדי להפחית את הרקע בשלב 1.15.
  14. שטיפה ב-DPBS (0.1% Tween 20) (~18–20 דקות):
    1. לאחר האינקובציה עם הנוגדן המשני, הוציאו את השקופיות מהמבנה הלח והקישו בעדינות את השקופיות על נייר סופג כדי להסיר את הנוגדנים המשניים.
    2. לאחר מכן, הניחו את השקופיות במעמד שקופיות טבול בבאפר שטיפה (1× DPBS עם 0.1% Tween 20) בתוך מכל צביעה לשטיפה קצרה, ושפכו את באפר השטיפה.
    3. לאחר מכן, שטפו את חתכי הרקמה שלוש פעמים עם 1× DPBS (0.1% Tween 20) למשך 5 דקות כל פעם.
      1. לפני תחילת שלב פיתוח הכרומוגן (כלומר, שלב 1.15), הניחו מעמד שקופיות נפרד במכל צביעה מלא במים מזוקקים, כשלב מקדימ לעבור לשלב 1.16, כדי לעצור את התגובה הכרומוגנית.
      2. במהלך השטיפה האחרונה, הכינו טרי תמיסת עבודה של DAB (טיפה אחת של כרומוגן לכל 1 mL של סובסטרט; ראו סבב קובץ נספח 1 (Supplementary File 1)).
  15. פיתוח כרומוגן (30 שניות–5 דקות):
    1. לאחר השטיפה השלישית בשלב 1.14, הוציאו את השקופיות ממעמד השקופיות והניחו אותן שטוח על משטח העבודה בעל רקע לבן.
    2. מרחו 50 µL של תמיסת עבודה של DAB לכל חתך ועקבו ויזואלית אחר התפתחות הצבע החום על רקע לבן או תחת מיקרוסקופ אור.
      הערה: השתמשו ב-PPE כפי שפורט בשלב 1.1. שימוש בנייר סופג לבן מסייע בוויזואליזציה של התפתחות הצבע החום בשלב הכרומוגן של DAB. פיתוח הצבע עשוי לקחת 20–60 שניות עבור חלק מהסמנים ו-2–5 דקות עבור אחרים (ראו פרטים בשלב 1.16).
  16. עצירת התגובה (1–2 דקות):
    1. ברגע שמופיע אות הצבע החום הרצוי בשלב 1.15, עצרו מיד את התגובה על ידי טבילת השקופית במכל של מים מזוקקים שהוכן בשלב 1.14.3.1.
    2. השאירו את השקופיות נשטפות במים מזוקקים למשך דקה אחת. שפכו את המים המזוקקים, ועברו לשלב 1.17 (צביעה נגדית).
      הערה: השקופיות יכולות להישאר במים מזוקקים עד שעה אחת מבלי להשפיע על הצביעה. הזמן הנדרש לפיתוח הצבע קובע מתי להתחיל את שלב עצירת התגובה. בנוסף, אם ישנם 2–3 סמנים (כגון CD3, CD4, CD8 או אחרים) על אותה שקופית (כפי שקורה במחקר זה), זמני התגובה עשויים להשתנות; לדוגמה, במערכת המתוארת כאן, פיתוח הצבע לוקח בדרך כלל כ-30 שניות עבור תאי CD8+, 1–3 דקות עבור תאי CD3+ או CD4+, או זמן רב יותר (3–5 דקות) עבור תאי Granzyme B+ ו-Ki67+. בשל ההבדלים בתזמון פיתוח הצבע, לא ניתן לטבול את כל השקופית במים מזוקקים כדי לעצור את התגובה. במקום זאת, עצרו כל תגובה בנפרד עבור כל חתך על ידי הוספת 200–300 µL של מים מזוקקים ישירות על כל חתך.
  17. צביעה נגדית (<1 דקה):
    1. כדי להגביר את הניגודיות עם הצביעה החומה, הוסיפו המטוקסילין מדולל (1:3 במים מזוקקים) למכל הצביעה, וודאו שהשקופיות נשארות טבולות בהמטוקסילין המדולל למשך כ-10–20 שניות.
      הערה: אם רקע ה-DAB חזק, בצעו צביעה נגדית למשך זמן ארוך יותר (עד דקה) או השתמשו בהמטוקסילין לא מדולל לזמן קצר.
  18. שטיפה במים מהברז (6 דקות):
    1. שפכו את ההמטוקסילין ממכל הצביעה והחזירו אותו לבקבוק הזכוכית לשימוש חוזר.
    2. שטפו את השקופיות במים מהברז למשך דקה אחת, ולאחר מכן שטפו במים זורמים לאט מהברז למשך 5 דקות, כאשר החתכים פונים הרחק מזרימת המים הישירה. שפכו את המים מהברז ועברו לשלב 1.19.
      הערה: השלבים הנותרים עד להרכבה מבוצעים תחת מנדף כימיים.
  19. דהידראציה הדרגתית (15–17 דקות):
    1. טבלו את השקופיות באתנול 70% במכל הצביעה למשך 5 דקות (לאחר מכן החזירו את האתנול 70% לבקבוק הזכוכית לשימוש חוזר), לאחר מכן באתנול 90% למשך 5 דקות (החזירו לבקבוק), ולבסוף באתנול 100% למשך 5 דקות (החזירו לבקבוק).
    2. עברו לשלב 1.20.
      הערה: בצעו שלב זה תחת מנדף כימיים. אותן תמיסות אתנול משלב 1.2 משמשות בשלב דהידראציה זה וניתן להשתמש בהן שוב פעמים רבות אם הן נראות נקיות.
  20. הבהרה (Clearing):
    1. השתמשו באותן תמיסות Xylene I ו-II ששימשו להסרת פראפין (שלב 1.1) כדי לנקות את חתכי הרקמה/שקופיות.
    2. תחילה, טבלו את השקופיות בתמיסת Xylene I במכל הצביעה למשך 10 דקות (לאחר מכן החזירו את Xylene I לבקבוק הזכוכית לשימוש חוזר) ולאחר מכן בתמיסת Xylene II למשך 10 דקות נוספות.
    3. השאירו את השקופיות ב-Xylene II עד לסיום ההרכבה (כלומר, שלב 1.21).
      הערה: לעולם אל תתנו לחתכים להתייבש במהלך שלב זה, שכן חתכים יבשים הופכים לשבירים; לכן, במידת הצורך, ניתן להשאיר את החתכים ב-Xylene II זמן רב יותר לצורך הרכבה.
  21. הרכבה (Mounting):
    1. הוציאו את השקופיות אחת אחת מ-Xylene II והניחו אותן שטוח תחת מנדף כימיים. הניחו טיפה אחת של חומר הרכבה מבוסס Xylene על כיסוי זכוכית (coverslip) בגודל מתאים, ולאחר מכן הניחו את כיסוי הזכוכית על השקופית, כאשר חומר ההרכבה פונה לחתכי הרקמה.
    2. לחצו בעדינות על כיסוי הזכוכית בעזרת האגודל כדי לפרוס את חומר ההרכבה באופן שווה על פני כל שלושת החתכים ולהסיר בועות אוויר.
      הערה: כיסוי זכוכית של 24 × 50 מ"מ נדרש לכיסוי שלושה חתכים על שקופית; כיסוי של 24 × 40 מ"מ לשני חתכים; וכיסוי של 24 × 24 מ"ם לחתך אחד. חשוב להשלים את ההרכבה תוך 30 שניות לשקופית מכיוון שחומר ההרכבה עלול להתייבש במהירות בשל זרימת האוויר הקבועה במנדף, מה שגורם ל-Xylene II להתאדות במהירות מהשקופית ולהפוך את החתכים לשבירים.
  22. ייבוש באוויר ומיקרוסקופיית אור:
    1. ייבשו את השקופיות באוויר במנדף למשך לפחות שעתיים לפני הערכה ודימות באמצעות מיקרוסקופ אור. לאחר הייבוש, אחסנו את השקופיות המורכבות בקופסאות שקופיות בטמפרטורת החדר למשך שנים.

2. IHC דו-צבעי לחתכים של גידולי מוח מקובעי FFPE

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר זרימת עבודה של IHC כרומוגנית דו-צבעית מבוססת-סובסטרט לזיהוי סימולטני של שני אנטיגנים בתוך אותו חיתוך של גידול מוחי בשימור FFPE. בהשוואה ל-IHC בצבע יחיד, זרימת העבודה הדו-צבעית דורשת זמן רב יותר כיוון שהיא כוללת מחזורי צביעה עוקבים עם דגירה נפרדת של נוגדנים ראשוניים, כולל שלבי דגירה למשך לילה עבור כל סבב צביעה. עם זאת, זרימת עבודה מורחבת זו מאפשרת זיהוי אמין וסימולטני של אנטיגנים בתוך אותו חיתוך רקמה, תוך שימור מורפולוגיית הרקמה ושמירה על הפרדה ברורה של האות הכרומוגני תחת מיקרוסקופ אור.

  1. הסרת פראפין (20 דקות):
    1. בצעו את אותו תהליך הסרת פראפין כפי שפורט לעיל עבור IHC בצבע יחיד בשלב 1.1 בתוך מנדף כימיים, אך השתמשו בחומרי הבהרה שאינם מבוססי קסילן (למשל, Histo-Clear I ו-Histo-Clear II במקום קסילן).
      זהירות: השתמשו בציוד מגן אישי (PPE) כפי שבשלב 1.1 ובצעו שלב זה תחת מנדף כימיים. Histo-Clear מומלץ כיוון שהכרומוגן מסיס חלקית בקסילן, ועיבוד נטול קסילן מסייע בשימור עוצמת הצביעה במהלך IHC בשני צבעים. אין לאפשר לחתכים להתייבש. ניתן להשתמש שוב בתמיסות הבהרה אלו אם הן מאוחסנות במכלי זכוכית אטומים ונראות נקיות.
  2. הידרציה הדרגתית (15 דקות):
    1. בדומה ל-IHC בצבע יחיד כפי שפורט בשלב 1.2. ביצעו הידרציה לחתכים באופן רציתי עם ירידה הדרגתית בריכוז האתנול (100%, 90%, ו-70%) למשך 5 דקות בכל שלב.
      ​הערה: כאן נעשה שימוש בסט נפרד של אתנול מדורג נטול קסילן, שכן האתנול המדורג ששימש ל-IHC בצבע יחיד בשלב 1.2 עשוי להיות מזוהם ב-Xylene II.
  3. שטיפה במים (5 דקות):
    1. בדומה ל-IHC בצבע יחיד בשלב 1.3; הניחו את השקופיות במים מזוקקים למשך 5 דקות להשלמת תהליך ההידרציה.
      ​הערה: בדומה לשלב 1.3; הכינו את תמיסת השחזור של האנטיגן במהלך פרק זמן זה של 5 דקות.
  4. שחזור אנטיגן (~20 דקות): בצעו את אותו הליך שחזור אנטיגן כפי שפורט עבור IHC בצבע יחיד בשלב 1.4.
  5. קירור (10–20 דקות): בצעו את אותו תהליך קירור כפי שתואר עבור IHC בצבע יחיד בשלב 1.5.
  6. שטיפה ב-DPBS (10 דקות): בצעו את תהליך שטיפת תמיסת שחזור האנטיגן כפי שפורט עבור IHC בצבע יחיד בשלב 1.6.
  7. מחסום הידרופובי (<1 דקה לשקופית):
    1. במהלך השטיפה ב-DPBS בשלב 2.6, צרו מחסום הידרופובי מסביב לחתכי הרקמה בהתאם לאותו תהליך/פרוטוקול שבשלב 1.7.
    2. השתמשו בעט למחסום הידרופובי כדי לצייר מחסום דוחה-נוזלים מסביב לכל חתך רקמה, ולאחר מכן החזירו את השקופית לתמיסת השטיפה DPBS במכל הצביעה. חזרו על שלבים אלו עבור כל השקופיות.
  8. חסימת פוספטאז אלקלי (5 דקות):
    1. לאחר השלמת המחסומים ההידרופוביים בכל חתכי הרקמה, הוציאו את השקופיות ממכל הצביעה, הניחו אותן שטוחות בתא לח, הוסיפו טיפה אחת של תמיסה לחסימת פוספטאז אלקלי אנדוגני (למשל, BLOXALL) לכל חתך, והדגירו את החתכים למשך 5 דקות. המשיכו מיד לשלב 2.9.
      ​הערה: מכיוון שבפרוטוקול IHC בשני צבעים נעשה שימוש בנוגדנים משניים המשורשרים ל-AP, חיוני לחסום את פעילות הפוספטאז האלקלי האנדוגני כדי להפחית את אות הרקע במהלך פיתוח הצבע האדום או הכחול. תמיסת החסימה BLOXALL משמשת כאן כדי לעכב פוספטאז אלקלי אנדוגני. היא מעכבת גם פראוקסידאז אנדוגני, ולכן ניתן להשתמש בתמיסת חסימה זו גם בפרוטוקול IHC בצבע יחיד לחסימת פעילות פראוקסידאז אנדוגנית, במקום תמיסת 3% H₂O₂.
  9. שטיפה ב-DPBS (10 דקות):
    1. שטפו את השקופיות בתמיסת 1× DPBS במכל הצביעה פעמיים, למשך 5 דקות כל פעם.
    2. לאחר השטיפה השנייה, הוציאו את השקופיות ממכל הצביעה, הניחו אותן שטוחות בתא לח, והוסיפו מים מזוקקים לדפנות התא הלח.
      הערה: אל תתנו לחתכים להתייבש, לכן המשיכו מיד לחסימת קישור לא ספציפי של אנטיגן-נוגדן בשלב 2.10.
  10. חסימה בסרום (~70 דקות):
    1. בצעו את אותו תהליך חסימה בסרום כפי שמופיע בפרוטוקול IHC בצבע יחיד בשלב 1.10.
      1. ראשית, חסמו באמצעות באפר חסימה אוניברסלי (5% BSA; 50 µL לחתך) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן באמצעות 2.5% סרום סוס נורמלי (טיפה אחת לחתך), התואם למין המארח של הנוגדן המשני anti-rabbit IgG המשורשר ל-AP, למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר כאשר מכסה התא הלח סגור.
      2. לאחר פרק זמן זה, הקישו בעדינות את השקופיות על נייר סופג כדי להסיר את הסרום, והמשיכו לשלב 2.11.
        הערה: הכינו את הנוגדן הראשוני I (ראו טבלה 1) במהלך הדקות האחרונות של שלב החסימה, כפי שמתואר בשלב 1.10.
  11. אינקובציה עם נוגדן ראשוני I (~16 שעות):
    1. בצעו את אותו תהליך אינקובציה עם הנוגדן הראשוני כפי שבשלב 1.11. לדוגמה, הוסיפו ~50 µL של נוגדן rabbit anti-CD3, מדולל 1:100 בסרום סוס נורמלי 2.5% (ראו טבלה 1), לכל חתך רקמה.
    2. הדגירו למשך הלילה (~16 שעות) ב-4 °C בתא לח.
  12. שטיפה ב-DPBS (0.1% Tween 20) (~18–20 דקות):
    1. בצעו את אותו הליך שטיפה (3 שלבי שטיפה, 5 דקות כל אחד) כפי שפורט עבור פרוטוקול IHC בצבע יחיד בשלב 1.12.
    2. לאחר השטיפה השלישית, הניחו את השקופיות שטוחות בתוך התא הלח. המשיכו מיד לשלב 2.13.
      הערה: אותן הערות כפי שבשלב 1.12, לדוגמה, ניתן להאריך כל זמן שטיפה ל-10–15 דקות, והשטיפה צריכה להיות עדינה וסטטית. אל תתנו לחתכים להתייבש.
  13. אינקובציה עם נוגדן משני I (~32–35 דקות):
    1. הוסיפו טיפה אחת לחתך של נוגדן משני AP-conjugated anti-rabbit IgG (ראו טבלה 2) והדגירו את חתכי הרקמה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כאשר מכסה התא הלח סגור.
      הערה: ניתן לדלל את הנוגדן המשני 1:1 ב-PBS כדי להפחית את הרקע בשלב 2.15.
  14. שטיפה ב-DPBS (0.1% Tween 20) (~18–20 דקות):
    1. בצעו את אותו הליך שטיפה עם 1× DPBS/0.1% Tween 20, כפי שבשלב 1.14.
    2. הערה: במהלך שלב השטיפה האחרון, הכינו טרי תמיסת עבודה של סובסטרט (5 mL, כפי שמומלץ; ראו טבלה 3) בהתאם להוראות היצרן (ראו הכנת ריאגנטים ב-קובץ משלים 1).
  15. פיתוח צבע אדום (12–15 דקות):
    1. לאחר השלמת שלב 2.14, הניחו את השקופיות שטוחות על משטח העבודה עם רקע לבן, כגון נייר סופג לבן, כפי שמתואר בשלב 1.15.
    2. ערבבו היטב את תמיסת העבודה של הסובסטרט האדום שהוכנה טרי, ולאחר מכן הוסיפו 50 µL לכל חתך רקמה (השליכו כל תמיסה שנותרה).
    3. הדגירו את חתכי הרקמה בטמפרטורת החדר עד להופעת הצבע האדום, תוך בדיקה תקופתית כל 2–3 דקות מול רקע לבן או תחת מיקרוסקופ אור.
      הערה: הזמן הנדרש לפיתוח הצבע האדום משתנה בין סמנים ויכול להימשך 20–30 דקות. עם זאת, לצביעה של תאי CD3+ בחתכי גידול מוחי 005 עם מערכת גילוי AP, פיתוח הצבע האדום מתרחש בדרך כלל תוך 12–15 דקות.
  16. שטיפה בבאפר (5 דקות):
    1. ברגע שמופיע אות הצבע האדום הרצוי בשלב 2.15, שטפו את החתכים ב-1× DPBS/0.1% Tween 20 למשך 5 דקות במכל צביעה.
    2. במהלך זמן שטיפה זה, הכינו טרי את הנוגדן הראשוני II בבאפר חסימה מתאים (למשל, נוגדן rabbit anti-Ki67 מדולל 1:100 בסרום סוס נורמלי 2.5%; ראו טבלה 1).
      הערה: בניגוד לשטיפה במים מזוקקים המשמשת ב-IHC בצבע יחיד (שלב 1.16), נעשה שימוש ב-DPBS/0.1% Tween 20 כאן לא רק כדי לעצור את התגובה אלא גם כדי לשטוף ביסודיות כרומוגן עודף ולהכין את הדגימה למחזור הצביעה השני.
  17. אינקובציה עם נוגדן ראשוני II (~16 שעות):
    1. הכניסו את השקופיות לתא לח והוסיפו ~50 µL של נוגדן rabbit anti-Ki67 שהוכן טרי לכל חתך רקמה. הדגירו למשך הלילה (~16 שעות) ב-4 °C.
  18. שטיפה ב-DPBS (0.1% Tween 20) (~18–20 דקות):
    1. בצעו את אותו הליך כפי שבשלב 1.12.
    2. לאחר השטיפה השלישית, הוציאו את השקופיות ממכל הצביעה והניחו אותן שטוחות בתא הלח. המשיכו מיד לשלב 2.19.
  19. אינקובציה עם נוגדן משני II (~32–35 דקות):
    1. בצעו את אותו הליך כפי שבשלב 2.13. הוסיפו טיפה אחת לחתך של AP-conjugated anti-rabbit IgG (ראו טבלה 2) והדגירו את חתכי הרקמה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כאשר מכסה התא הלח סגור.
  20. שטיפה ב-DPBS (0.1% Tween 20) (~18–20 דקות):
    1. בצעו את אותו הליך שטיפה עם 1× DPBS/0.1% Tween 20, כפי שבשלב 1.14.
      הערה: במהלך שלב השטיפה האחרון, הכינו טרי תמיסת עבודה של סובסטרט (5 mL, כפי שמומלץ; ראו טבלה 3) בהתאם להוראות היצרן (ראו הכנת ריאגנטים ב-קובץ משלים 1).
  21. פיתוח צבע כחול (10–12 דקות):
    1. לאחר השלמת שלב 2.20, הניחו את השקופיות שטוחות על משטח העבודה עם רקע לבן.
    2. ערבבו היטב את תמיסת העבודה של הסובסטרט הכחול שהוכנה טרי, ולאחר מכן הוסיפו 50 µL לכל חתך רקמה (השליכו כל תמיסה שנותרה).
    3. הדגירו את חתכי הרקמה בטמפרטורת החדר עד להופעת הצבע הכחול, תוך בדיקה תקופתית כל 2–3 דקות מול רקע לבן או תחת מיקרוסקופ אור.
      הערה: בדומה לפיתוח הצבע האדום בשלב 2.15, הזמן הנדרש לפיתוח הצבע הכחול יכול להימשך 20–30 דקות. עם זאת, לצביעה של תאי Ki67+ בחתכי גידול מוחי 005 עם מערכת גילוי AP, הצבע הכחול מתפתח תוך 10–12 דקות.
  22. שטיפה בבאפר (5 דקות):
    1. ברגע שמופיע אות הצבע הכחול הרצוי בשלב 2.21, טבלו את החתכים ב-1× DPBS/0.1% Tween 20 למשך 5 דקות במכל צביעה. השליכו את תמיסת השטיפה.
  23. שטיפה במים (1 דקה): שטפו את החתכים במים מזוקקים למשך 1 דקה. השליכו את המים המזוקקים לאחר השטיפה.
  24. דהידרציה הדרגתית (15–17 דקות):
    1. טבלו את השקופיות באתנול 70% במכל הצביעה למשך 5 דקות (לאחר מכן החזירו את האתנול 70% לבקבוק הזכוכית לשימוש חוזר), לאחר מכן באתנול 90% למשך 5 דקות (ואז החזירו לבקבוק), ולבסוף באתנול 100% למשך 5 דקות (ואז החזירו לבקבוק).
    2. חזרו על כל שלב במנדף. המשיכו לשלב 2.25.
      הערה: אותן תמיסות אתנול (נטולות קסילן) משלב 2.2 משמשות בשלב דהידרציה זה וניתן להשתמש בהן שוב פעמים רבות אם הן נראות נקיות.
  25. הבהרה ללא קסילן:
    1. השתמשו באותן תמיסות נטולות קסילן (כלומר, Histo-Clear) ששימשו בשלב 2.1 כדי לנקות את חתכי הרקמה/שקופיות.
      1. ראשית, טבלו את השקופיות בתמיסה נטולת קסילן I במכל הצביעה למשך 10 דקות (לאחר מכן החזירו את התמיסה נטולת קסילן I לבקבוק הזכוכית לשימוש חוזר) ולאחר מכן בתמיסה נטולת קסילן II למשך 10 דקות נוספות.
      2. השאירו את השקופיות בתמיסה נטולת קסילן II עד לסיום ההשמה (כלומר, שלב 2.26).
        הערה: ניתן להשאיר את החתכים בתמיסה נטולת קסילן II למשך זמן רב יותר, במידת הצורך, לצורך השמה.
        זהירות: השתמשו בציוד מגן אישי (PPE) כפי שבשלב 1.1 ובצעו שלב זה תחת מנדף כימיים.
  26. השמה ללא קסילן:
    1. הוציאו את השקופיות אחת אחת מהתמיסה נטולת קסילן II והניחו אותן שטוחות במנדף. הניחו טיפה אחת של מדיום השמה נטול קסילן על כיסוי זכוכית (coverslip) בגודל מתאים, ולאחר מכן הניחו את כיסוי הזכוכית על השקופית, כאשר מדיום ההשמה פונה לחתכי הרקמה.
    2. לחצו בעדינות על כיסוי הזכוכית עם האגודל כדי לפרוס את מדיום ההשמה באופן שווה על פני כל שלושת החתכים ולהוציא בועות אוויר.
      הערה: השלימו את ההשמה תוך 30 שניות לשקופית, שכן מדיום ההשמה עלול להתייבש במהירות. השתמשו בציוד מגן אישי (PPE) כפי שבשלב 1.1 ובצעו שלב זה תחת מנדף כימיים.
  27. ייבוש באוויר ומיקרוסקופיה של אור: ייבשו את השקופיות באוויר במנדף למשך לפחות שעתיים לפני הערכה והדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור. לאחר הייבוש, ניתן לאחסן את השקופיות המושמות בקופסאות שקופיות בטמפרטורת החדר למשך שנים.

תוצאות

ביצוע IHC בצבע יחיד באמצעות מערכת זיהוי כרומוגנית מבוססת HRP הניב צביעה ברורה וניתנת לשחזור בחתכים של גידולי מוח FFPE 005. תמונות מייצגות של צביעת אנטיגנים על פני השטח מוצגות ב-איור 1, המדגימות זיהוי מוצלח של סממני תאי T (CD3, CD4, CD8), סממני מקרופאגים הקשורים לגידול (TAM) (CD68, F4/80), ומולקולת נקודת הבקרה החיסונית programmed death ligand 1 (PD-L1). בכל המקרים, צביעה חיובית נצפתה כאות כרומוגני חום מובחן תוך שימוש ב-DAB ככרומוגן, עם שמירה על מורפולוגיית הרקמה וצביעת רקע מינימלית, מה שמעיד על כך שפרוטוקול ה-IHC בצבע יחיד תואם לאנטיגנים מגוונים הקשורים לממברנה.

השמישות של פרוטוקול ה-IHC בצבע יחיד לזיהוי אנטיגנים תוך-תאיים מודגמת ב-איור 2. תמונות צביעה מייצגות מראות זיהוי מוצלח של סמנים תוך-תאיים שעתוקיים, סיגנלינג, פרוליפרטיביים, ציטוטוקסיים ואפופטוטיים, הכוללים את T-bet, FoxP3, phosphorylated STAT1 (pSTAT1), Ki67, granzyme B, ו-cleaved caspase-3. בדומה לצביעת אנטיגנים על פני השטח, זיהוי סמנים תוך-תאיים הניב אותות כרומוגניים חומים וברורים תוך שימור מבנה הרקמה, עם צביעת רקע לא ספציפית מינימלית (איור 2), מה שמוכיח כי הפרוטוקול מתאים לזיהוי אנטיגנים הן על פני השטח והן בתוך התא.

פרוטוקול ה-IHC הדו-צבעי שימש בהצלחה לזיהוי סימולטני של שני אנטיגנים בתוך אותו נתח רקמה, תוך שימוש באסטרטגיית זיהוי כרומוגנית רצפית המבוססת על פוספטאזה עיורית (AP). כפי שמוצג ב-איור 3, צביעה משולבת של CD3(red)/Ki67(blue) ושל pSTAT1(red)/CD68(blue), המעידים בהתאמה על תאי T שגשוגיים ומקרופאגים דמויי-M119, הניבה אותות כרומוגניים שניתן להבחין ביניהם בבירור תחת מיקרוסקופ אור, מה שמעיד על זיהוי סימולטני יעיל של שני אנטיגנים עם הפרדה צבעית ברורה באמצעות זרימת העבודה של הצביעה הרצפית. כדי להדגים עוד יותר את הרב-גוניות של גישת הצביעה הדו-צבעית זו, אותו פרוטוקול יושם בהצלחה לזיהוי משותף של סמן נוירונלי (NeuN באדום) וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP בכחול) בנתחי גידול מוחי שהופקו מגידולי 005 GSC המבטאים GFP (איור 4). קולוקליזציה של GFP ו-NeuN מעידה ככל הנראה על כך ש-005 GSCs מבדילים לפנוטיפים בוגרים המבטאים את הסמן הנוירונלי NeuN21.

התמונות באיור 1, איור 2 ואיור 3 הן מייצגות של ארבעה גידולים בלתי תלויים, כאשר לכל גידול נלקח נתח אחד עבור כל האנטיגנים של תאי חיסון שנצבעו, למעט תמונת F4/80 המייצגת שני גידולים בלתי תלויים, ותמונת PD-L1 המייצגת שלושה גידולים בלתי תלויים, עם שני נתחים הן עבור F4/80 והן עבור PD-L1. התמונה באיור 4 מייצגת נתח גידול בודד. מכיוון שפרוטוקול ה-dual-IHC שימש לצביעה עקיפה של שני אנטיגנים (למשל, CD3+ ו-Ki67+, או CD68+ ו-pSTAT1+) באותו נתח רקמה לאורך שני עד ארבעה גידולים בלתי תלויים, ואומת עוד על ידי צביעה משותפת של תאי GFP+ ו-NeuN+, תוצאות אלו תומכות ביישום הניתן לשחזור של פרוטוקול ה-dual-IHC. באופן דומה, פרוטוקול ה-single-IHC יושם בהצלחה על 12 אנטיגנים של תאי חיסון בלתי תלויים, מה שמעיד על ישימותו הרחבה תחת תנאי הצביעה המתוארים כאן.

יחד, תוצאות מייצגות אלו מדגימות כי פרוטוקולי ה-IHC החד-צבעי והדו-צבעי מבוססי התססית המתוארים מספקים שיטות מעשיות הניתנות לשחזור לזיהוי מגוון רחב של אנטיגנים על פני השטח ובתוך התא ברקמות FFPE של GBM.

אימונוהיסטוכימיה של סמני חיסון CD3, CD4, CD8, CD68, F4/80, PD-L1, תמונות מיקרוסקופ.
איור 1: אימונוהיסטוכימיה (IHC) בצבע יחיד לאנטיגנים של פני השטח. צביעת IHC בצבע יחיד (חום) המבוססת על סובסטרט לאנטיגנים של פני השטח עבור תאי T חודרי גידול (CD3+, CD4+, ו-CD8+), מקרופאגים הקשורים לגידול (CD68+ ו-F4/80+), ומולקולת נקודת בקרה חיסונית programmed death ligand 1 (PD-L1+) באמצעות מערכת זיהוי המבוססת על חזרת חזרת חזרת פרוקסידאז (HRP) בחתכים של GBM בעכברים שנגזרו מתאי גstם דמויי גליובלסטומה (GBM) (ראה פרטים בסעיף 1 של הפרוטוקול). מוצגות תמונות IHC מייצגות (הגדלה של 10× עבור CD3, CD4 ו-CD8; הגדלה של 20× עבור CD68, F4/80 ו-PD-L1). תאים חיוביים צבועים בחום. סרגלי קנה מידה = 100 μμm. אנא לחץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

סממני אימונוהיסטוכימיה T-bet, FoxP3, p-STAT1, Ki67, GranB, CC3 בחתכי רקמה.
איור 2: אימונוהיסטוכימיה (IHC) בצבע יחיד עבור אנטיגנים תוך-תאיים. צביעת IHC בצבע יחיד (חום) מבוססת סובסטרט של סממנים תוך-תאיים לשעתוק (T-bet+ ו-FoxP3+), איתות (pSTAT1+), פרוליפרציה (Ki67+), ציטוטוקסיות (granzyme B+, GranB) ואפופטוזיס (cleaved caspase-3+, CC3) בחתכי גידול מוחי, תוך שימוש במערכת זיהוי המבוססת על חזרית הפרוקסידאז (HRP) בחתכי GBM של עכבר שנגזרו מתאי גליובלסטומה (GBM) דמויי תאי גזע (GSC) (ראה פרטים בסעיף 1 של הפרוטוקול). מוצגות תמונות IHC מייצגות (הגדלה של 10× עבור FoxP3, GranB ו-CC3; הגדלה של 20× עבור T-bet, pSTAT1 ו-Ki67). תאים חיוביים נצבעים בחום. סרגי קנה מידה = 100 μμm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה מורחבת של איור זה.

ניתוח היסטולוגי, סמני CD3/Ki67 ו-pSTAT1/CD68, תמונת מיקרוסקופיה, מחקר שגשוג תאים.
איור 3: אימונוהיסטוכימיה (IHC) דו-צבעית עבור לימפוציטים חודרי גידול (TILs) שגשוגיים ומקרופגים משוירי גידול (TAMs) דמויי M1. צביעת IHC דו-צבעית (אדום/כחול) מבוססת סובסטרט של תאי T שגשוגיים חודרי גידול CD3+(אדום)/Ki67+(כחול) ומקרופגים דמויי M1 pSTAT1+(אדום)/CD68+(כחול) באמצעות מערכת זיהוי מבוססת פוספטאז אלקלי (AP) בחתכים של GBM בעכברים שנגזרו מתאי גליובלסטומה (GBM) דמויי תאי גזע (GSC) (ראה פרטים בסעיף 2 של הפרוטוקול). מוצגות תמונות IHC מייצגות (הגדלה של 20×). בתמונה העליונה, תאים CD3+ צבועים באדום, תאים Ki67+ צבועים בכחול, ומספר תאים עם קולוקליזציה מסומנים בחצים שחורים. באופן דומה, בתמונה התחתונה, תאים pSTAT1+ צבועים באדום, תאים CD68+ צבועים בכחול, ומספר תאים עם קולוקליזציה מסומנים בחצים שחורים. סרגי קנה מידה = 100 μμm. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.

רקמה צבועה ב-NeuN/GFP, גידול לעומת לא-גידול, תמונת מיקרוסקופיה, ניתוח דיפרנציאציה תאית.
איור 4: אימונוהיסטוכימיה (IHC) בשני צבעים לתאי עצב ולתאי גליובלסטומה דמויי תאי גזע (GSCs) חיוביים לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP+). צביעת IHC דו-צבעית (אדום/כחול) מבוססת תשתית של NeuN+(אדום)/GFP+(כחול) באמצעות מערכת גילוי מבוססת alkaline phosphatase (AP) בחתכים של GBM בעכברים שנגזרו מתאי גליובלסטומה (GBM) דמויי תאי גזע (GSC) (ראו פרטים בסעיף 2 של הפרוטוקול). מוצגת תמונת IHC מייצגת (הגדלה של 20×). תאים NeuN+ (סמן עצבי) צבועים באדום, תאים GFP+ (מבוטאים על ידי 005 GSCs) צבועים בכחול, ומספר תאים עם קולוקליזציה מסומנים בחצים שחורים. סרגל קנה מידה = 100 μμm. נא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

נוגדן ראשוני נגדמספר קטלוגיספקדילול עבודהבפר עם דילולמין המארחמשני מתאים 
CD3eab5690Abcam1:100סרום מסוסארנבAnti-rabbit IgG
CD4 14-9766-80eBioscience1:200סרום עיזיםחולדהAnti-rat IgG
CD68ab125212Abcam1:100סרום סוסיםארנבAnti-rabbit IgG
CD8a 14-0808-80eBioscience1:100סרום עיזיםחולדהAnti-rat IgG
caspase-3 מפוצל9661CST1:100סרום סוסארנבAnti-rabbit IgG
F4/80ab111101Abcam1:100סרום סוסיםארנבAnti-rabbit IgG
FoxP3ab54501* Abcam1:450סרום סוסארנבAnti-rabbit IgG
GFPab183734Abcam1:200סרום סוסארנבAnti-rabbit IgG
גרנזים Bab4059Abcam1:150סרום סוסיםארנבנוגדן נגד IgG של ארנב
Ki67ab16667Abcam1:100סרום סוסארנבAnti-rabbit IgG
NeuN24307CST1:400סרום סוסיםארנבAnti-rabbit IgG
PD-L1ab205921Abcam1:400סרום סוסארנבAnti-rabbit IgG
pSTAT19167CST1:100סרום סוסארנבAnti-rabbit IgG
T-betab91109Abcam1:100סרום של סוסעכברAnti-mouse IgG

טבלה 1: רשימת נוגדנים ראשוניים. נוגדנים ראשוניים ששימשו במחקר זה, יחד עם מקורותיהם, דילולות עבודה אופטימליות, באפרי דילול מומלצים, מיני המארח, ונוגדנים משניים מתאימים לצביעה אימונוהיסטוכימית בצבע יחיד או בשני צבעים.

נוגדן משני מצומדמספר קטלוגימין המארחטיפה/חתךספק
HRP anti-rat IgGMP-7444-15Goatטיפה אחת (ללא דילול)Vector Laboratories
HRP anti-rabbit IgGMP-7401Horse
HRP anti-mouse IgGMP-7402-15Horse
AP anti-rat IgGMP-5404-15Goat
AP anti-rabbit IgGMP-5401Horse

טבלה 2: רשימת נוגדנים שניוניים. ריאגנטים לגילוי שניוני שעברו אופטימיזציה עבור פרוטוקולי IHC בצבע יחיד או בשני צבעים, כולל צמידים אנזימטיים (HRP או AP), מין המארח, נפח יישום מומלץ ומידע על הספק.

מצעאנזים גילויהרכב התמיסה המאזנת (Buffer)הכנת ריאגנטיםזמן הדגרההערות
Vector Blueאלקלהיפוספטאז (Alkaline phosphatase)100 mM Tris-HCl, pH 8.2–8.5, 0.1% Tween 202 טיפות (80 µL) ריאגנט 1 + 2 טיפות (80 µL) ריאגנט 2 + 2 טיפות (45 µL) ריאגנט 320–30 דקותלצביעה כחולה ב-IHC כפול; ממיס באופן חלקי בקסילן; מומלץ להשתמש בריאגנטים ובתוכני קיבוע ללא קסילן
Vector Redפוספטאז אלקלי 100 mM Tris-HCl, pH 8.2–8.5, 0.1% Tween 202 טיפות (80 µL) ריאגנט 1 + 2 טיפות (80 µL) ריאגנט 2 + 2 טיפות (80 µL) ריאגנט 320–30 דקותעבור צביעה כפולה של IHC באדום
DAB peroxidase מחרשית בופר סובסטרט המסופק על ידי היצרןטיפה אחת של כרומוגן המוספת ל-1 מ"ל של סובסטרט DABמשתנה (ראו שלב 2.16)יוצר צביעה חומה; קרצינוגני, יש לטפל בהתאם להנחיות הבטיחות

טבלה 3: רשימת מצעים כרומוגניים. טבלה זו מסכמת את המצעים הכרומוגניים המשמשים ל-IHC בצבע יחיד או בשני צבעים, כולל אנזימי גילוי תואמים, הכנה ופורמולציה, זמני דגירה והמלצות קריטיות לטיפול לצורך פיתוח אופטימלי של האות הכרומוגני.

קובץ נספח 1: הכנת ריאגנטים, תמיסות באפר ומצעים. קובץ זה מסכם את ההכנה, האחסון ודגשים קריטיים לטיפול בכל הריאגנטים, תמיסות הבאפר, תמיסות החסימה והמצעים הכרומוגניים המשמשים בפרוטוקולים של אימונוהיסטוכימיה בצבע יחיד או בשני צבעים.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

מחקר זה מתאר זרימת עבודה מפורטת וניתנת לשחזור של IHC כרומוגני מבוסס-מצע לזיהוי של צבע אחד או שניים של אנטיגנים על פני השטח ובתוך התא ברקמות גידולי מוח בשימור FFPE, שהופקו ממודל GSC אורטוטופי. המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה מתודולוגית, לביסוס פרוטוקול מעשי שלב-אחרי-שלב לזיהוי כרומוגני אמין של אנטיגנים ברקמות GBM עם מערכת חיסונית תקינה.

IHC כרומוגנית נותרת שיטה נפוצה להערכת סממנים תאיים ברקמות FFPE מכיוון שהיא משמרת את ארכיטקטורת הרקמה תוך שהיא מאפשרת לוקליזציה מרחבית של אנטיגנים בתוך ה-TME15,16. צביעה כרומוגנית הניתנת לשחזור דורשת אופטימיזציה קפדנית של פרמטרים טכניים מרובים, כולל חשיפה מחדש של האנטיגן (antigen retrieval), תנאי חסימה, ריכוז הנוגדנים, זמן פיתוח הכרומוגן וטיפול ברקמה במהלך הצביעה וההטמעה. סטיות קטנות בשלבים אלה עלולות להוביל לאובדן רקמה, עוצמת אות חלשה, צביעת רקע מוגברת או שימור מורפולוגי לקוי. פרוטוקול זה נותן מענה לאתגרים טכניים נפוצים על ידי אספקת הנחיות פרוצדורליות מפורטות לשיפור עקביות הצביעה והיכולת לשחזר אותה.

בשימוש בזרימת העבודה של IHC בצבע יחיד, צביעה מייצגת הדגימה זיהוי מוצלח של מגוון רחב של אנטיגנים הקשורים לממברנה ואנטיגנים תוך-תאיים, כולל סממני תאי T, סממנים הקשורים למקרופאגים, מולקולות נקודות בקרה חיסוניות, חלבוני איתות, סממני פרוליפרציה ואנטיגנים הקשורים לאפופטוזיס. תוצאות מייצגות אלו מדגימות את ישימות הפרוטוקול לזיהוי מחלקות אנטיגנים מגוונות ברקמות FFPE GBM תוך שימוש במערכת זיהוי כרומוגנית סטנדרטית מבוססת HRP.

אתגר טכני נפוץ ב-IHC כרומוגני כפול הוא גילוי סימולטני של שני אנטיגנים כאשר שני הנוגדנים הראשוניים הופקו מאותו מין מאכסן, דבר שעלול לסבך את התאימות בין הנוגדנים ואת הבחנה באותות. כדי לטפל בכך, ביססנו תהליך עבודה של צביעה דו-גונית רצפית המבוססת על AP, תוך שימוש בתסריתי כרומוגנים נבדלים המאפשרים הפרדה חזותית ברורה של אותות האנטיגן תחת מיקרוסקופ אור.

צביעה משותפת נציגה של CD3/Ki67 ושל pSTAT1/CD68 הדגימה זיהוי אנטיגנים סימולטני מוצלח בתוך אותו נתח רקמה. יישום נוסף של סבב עבודה זה לצביעה משותפת של NeuN/GFP תומך עוד יותר ברב-גוניות של הפרוטוקול הדו-צבעי הרצפי מעבר לניתוח סממנים חיסוניים. ניתן לכמת צביעת IHC דו-צבעית באמצעות דירוג ידני או ניתוח תמונה דיגיטלי. מדדים נפוצים כוללים את המספר או האחוז של תאים חיוביים בודדים ותאים חיוביים כפולים, כמו גם את התפלגותם בתוך הגידול. בעת שימוש בניתוח דיגיטלי, מומלץ להשתמש בסף (thresholding) ובבחירת אזורים עקביים כדי להבטיח תוצאות הדירות.

כדי להשיג תוצאות צביעה מהימנות בפרוטוקול IHC של צבע יחיד, יש לכלול ביקורת שלילית ללא הנוגדן הראשוני. ביקורת זו לא אמורה להפיק אות כרומוגני במהלך פיתוח הסובסטרט (שלב 1.15), ובכך לאשר את הספציפיות של הליך הצביעה. עבור פרוטוקול IHC דו-צבעי, מומלץ להוסיף ביקורות שליליות נוספות על ידי השמטת הנוגדן הראשוני I (שלב 2.11), הנוגדן הראשוני II (שלב 2.17), או שני הנוגדים הראשוניים. מכיוון ששני הנוגדים הראשוניים מקוריים מאותו מין מאכסן, ביקורות אלו מוודאות שהנוגדן המשני השני נגד ארנב (שלב 2.19) אינו מזהה שאריות של נוגדן ראשוני ממחזור הצביעה הראשון, ומסייעות לשלול זליגה או אות כרומוגני לא ספציפי.

אף על פי שהתמונות המייצגות המוצגות בפרוטוקול זה מדגימות תוצאות צביעה אופטימליות, משתמשים עשויים להיתקל לעיתים בתוצאות תת-אופטימליות, כולל אות כרומוגני חלש או חסר, צביעת רקע מוגברת, צביעה לא אחידה לאורך נתח הרקמה, או יחס אות לרעש נמוך. תוצאות אלו קשורות בדרך כלל לשחזור אנטיגן לא מספק, ריכוז נוגדנים תת-אופטימלי, חסימה (blocking) לא מספקת, פיתוח יתר של הסובסטרט הכרומוגני, או התייבשות הרקמה במהלך תהליך הצביעה. ניתן בדרך כלל לזהות בעיות אלו באמצעות השוואה לביקורות חיוביות ושליליות מתאימות, ולתקנן על ידי אופטימיזציה של תנאי שחזור האנטיגן, דילול הנוגדנים, שלבי החסימה, נהלי השטיפה וזמני הדגרת הכרומוגן, כפי שמתואר לאורך הפרוטוקול.

מגבלה אחת של מחקר זה היא שהישימות של IHC בצבע בודד או בשני צבעים הודגמה באמצעות חתכי רקמה נבחרים מאותו מודל גידול, במקום להישמר באופן שיטתי על פני מספר מודלים של גידולים או שלבים שונים בהתקדמות הגידול. עם זאת, מגבלה זו אינה משפיעה על מטרתו העיקרית של מחקר זה, שהייתה לבסס ולתעד זרימת עבודה מתודולוגית הניתנת לשחזור עבור IHC כרומוגנית בצבע בודד או בשני צבעים המבוססת על סובסטרט. בהשוואה לאימונופלואורסצנציה, IHC כרומוגנית תואמת למיקרוסקופיית שדה בהיר שגרתית, משמרת טוב יותר את מורפולוגיית הרקמה ומושפעת פחות מאוטו-פלואורסצנציה של הרקמה. למרות שהפרוטוקול עבר אופטימיזציה כאן עבור מודל GBM ממקור GSC אורתוטופי עם מערכת חיסונית תקינה, הוא עשוי להיות ניתן להתאמה למודלים פרה-קליניים אחרים של גידולים, ועם אופטימיזציה ספציפית לסמנים, גם לדגימות גידול אנושיות בשימור FFPE. שילוב עם פתולוגיה דיגיטלית ופלטפורמות לניתוח תמונות עשוי להרחיב עוד יותר את תועלתו עבור ניתוחים חצי-כמותיים מבוססי רקמה.

גילויים

S.D.R. הוא ממציא שותף בפטנטים הנוגעים לווירוסים אונקוליטיים של הרפס סימפלקס, הנמצאים בבעלותה ובניהולה של אוניברסיטת ג'ורג'טאון ובית החולים הכללי של מסצ'וסטס, אשר קיבלו תמלוגים מ-Amgen ומ-Acti\Vec Inc., ושימש כיועץ וקיבל שכר טרחה מ-Replimune, Cellinta, ו-Greenfire Bio, ושכר טרחה ומניות מ-EG 427. שאר המחברים מצהירים כי כתב יד זה הוכן בהיעדר כל קשר מסחרי או פיננסי שעלול להיחשב כניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

D.S. קיבל תמיכה חלקית מקרן של המכללה למדע וטכנולוגיה באוניברסיטת North Carolina Agricultural and Technical State (NCA&T), ממענק מלגת סגל (GRADS-4C) ב-NCA&T, וממענק של ה-NIH (1R16NS147983-01). באופן דומה, S.D.R. קיבל תמיכה חלקית מכיסא Thomas A. Pappas למדעי העצבים, בעוד ש-R.H.N. קיבל תמיכה חלקית ממענק NIH (1R35GM153737). אנו מודים לד"ר Inder Verma ולד"ר Yasushi Soda על אספקת ה-005 GSCs.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוקי זכוכית 2 L CorningCORN1395-2Lמשמשים להכנה ולאחסון של 10× DPBS, 1× DPBS, מים מזוקקים ובופר נתרן ציטראט
ביכר זכוכית Pyrex בנפח 2 L Corning1000-2Lמשמש לשחזור אנטיגנים באמצעות מיקרוגל בבופר נתרן ציטראט (נפח עבודה של 600–800 mL)
סרום סוס נורמלי 2.5% או סרום עיזים נורמלימסופקים כשהם מוכנים יחד עם הנוגדנים המשניים מ-Vector Laboratories. משמשים לחסימה ספציפית למין ולדילול נוגדנים בהתאם למין המארח של הנוגדן המשני (anti-rabbit או anti-rat IgG) כדי למזער קישור לא ספציפי וצביעת רקע
מי חמצן 30% (H2O2)Fisher ScientificBP2633500
בקבוקי זכוכית 500 mLVWR InternationalVWRU10754-818משמשים להכנה ולאחסון של ריאגנטים דליקים עבור IHC בצבע יחיד וריאגנטים נטולי כסילן (xylene-free) עבור IHC דו-צבעי
נייר סופג לשולחן עבודה עם Kimwipesמשמש במהלך הליכי הצביעה להסרת עודפי נוגדנים או תמיסת שטיפה מחתכי רקמה לפני דגירה רצופה, כדי למזער מעבר של ריאגנטים וזיהום צולב
Anti-CD3eAbcamab5690
Anti-CD4 eBioscience14-9766-80
Anti-CD68Abcamab125212
Anti-CD8a eBioscience14-0808-80
Anti-Cleaved caspase-3CST9661
Anti-F4/80Abcamab111101
Anti-FoxP3Abcamab54501
Anti-GFPAbcamab183734
Anti-Granzyme BAbcamab4059
Anti-Ki67Abcamab16667
Anti-NeuNCST24307
Anti-PD-L1Abcamab205921
Anti-pSTAT1CST9167
Anti-T-betAbcamab91109
AP anti-rabbit IgGVector LaboratoriesMP-5401
AP anti-rat IgGVector LaboratoriesMP-5404-15
תמיסת חסימה BLOXALLVector LaboratoriesSP-6000-100משמשת בעיקר ב-IHC דו-צבעי כדי לעכב פעילות אנדוגנית של פראוקסידאז ופוספטאז אלקלי
אלבומין משרת בקר (BSA)Bioworld22070007-2משמש להכנת בופר חסימה אוניברסלי 5% להפחתת קישור לא ספציפי
תווך הרכבה קבוע Cytoseal 60 Electron Microscopy Sciences18006תווך הרכבה תואם כסילן המשמש ל-IHC בצבע יחיד
מצע וכרומוגן DABDAKOK346811-2משמש לגילוי כרומוגני בצבע יחיד מבוסס HRP. יש להכין מיד לפני השימוש על ידי הוספת טיפה אחת של כרומוגן ל-1 mL של מצע DAB בהתאם להוראות היצרן’. יש להשליך תמיסות עבודה שאינן בשימוש לאחר ההכנה. DAB הוא קרצינוגן פוטנציאלי ויש לטפל בו בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית והבטיחות הכימית של המוסד
מים מזוקקיםמשמשים להכנת ריאגנטים, שטיפות והכנת בופרים. ניתן להשתמש גם במים אולטרה-טהורים או במים מסוג Milli-Q
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) Corning55-031-PC
אתנול, 200 proof Decon Labs2701
לשוניות מיקרוסקופ Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15לשוניות זכוכית מיקרוסקופיות טעונות חיובית עבור חתכי רקמה
כיסויי זכוכיתCorning or Milipore Sigmaיש לבחור גדלים מתאימים בהתאם למספר חתכי הרקמה ללשונית. גדלים נפוצים כוללים: 24 mm × 24 mm (חתך רקמה בודד), 24 mm × 40 mm (שני חתכי רקמה), 24 mm × 50 mm (שלושה חתכי רקמה)
המטוקסיליןFisher Scientific220-102
Histo-Clear (1 L)Electron Microscopy Sciences64111-01חומר הבהרה נטול כסילן המשמש ל-IHC דו-צבעי. הכין שני בקבוקי 500 mL המסומנים כ-Histo-Clear I ו-Histo-Clear II
HRP anti-mouse IgGVector LaboratoriesMP-7402-15
HRP anti-rabbit IgGVector LaboratoriesMP-7401
HRP anti-rat IgGVector LaboratoriesMP-7444-15
תאי לחות Stellar ScientificHS-120879עבור דגירה של חתכי רקמה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים
עט מחסום הידרופובי (עט PAP)Vector LaboratoriesH-4000משמש ליצירת מחסום דוחה מים סביב חתכי הרקמה כדי לשמר נוגדנים וריאגנטים במהלך הדגירה ולמנוע זיהום צולב בין מספר חתכי רקמה על אותה לשונית
KimwipesKimtech Science34155משמשים להסרה עדינה של שאריות ריאגנטים ובופר שטיפה מחתכי רקמה
מערבל מגנטי IKAI-10001529להכנת תמיסות אם של נתרן ציטראט ו-DPBS
תנור מיקרוגלPanasonic (Model: NN-L931BF)SN: 6H61050036קיבולת של 2.2 רגל מעוקבת. נדרש לשחזור אנטיגנים באמצעות חום בביכר זכוכית של 2 L
מיקרוסקופ אור Nikon NikonSN: 707798Nikon Eclipse Ci-L sn: 707798, Sola light engine 5M5-LCR-VA sn: 11787, Software: NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00, Cameras: Nikon DS-Fi3 sn: 110865 (color) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (B/W)
מד pH VWR International77619-152לכוונון pH של בופר שחזור האנטיגנים
ניילון נצמדFisher Scientific01810משמש לכיסוי רופף של בופר שחזור האנטיגנים במהלך חימום במיקרוגל כדי למזער אידוי ולמנוע התייבשות של הרקמה
מעמדי לשוניות פוליאוקסימתילן (POM) MopecSP234תואמים למכלי הצביעה לעיל; כל מעמד מחזיק עד 24 לשוניות מיקרוסקופ
מאזניים מדויקים Mettler Toledo30697420לשקילת אבקת נתרן ציטראט ו-DPBS
מקררThermo ScientificTSG3005CAלאחסון ריאגנטים ונוגדנים רגישים לטמפרטורה
קופסאות אחסון ללשוניותFisher Scientific22-267294
מכלי/צלוחיות צביעה MopecSP233כל מכל מקליט מעמד צביעה אחד של 24 לשוניות
מגנטים למערבל Fisher Scientific14-512-128להכנת תמיסות אם של נתרן ציטראט ו-DPBS
Tri-sodium citrate dihydrate Thermo Scientific ChemicalsAA3643936
Tween 20 Thermo ScientificAAJ20605AP
תווך הרכבה קבוע VectaMount PT Vector LaboratoriesH-5600-60תווך הרכבה קבוע נטול כסילן המשמש ל-IHC דו-צבעי
ערכה למצע פוספטאז אלקלי Vector Blue Vector LaboratoriesSK-5300משמשת לפיתוח אות כרומוגני כחול במהלך IHC דו-צבעי מבוסס AP. מכיוון ש-Vector Blue מסיס חלקית בכסילן, יש להשתמש בחומרי הבהרה ובתווכי הרכבה נטולי כסילן עבור תהליכי צביעה דו-צבעיים
ערכה למצע פוספטאז אלקלי Vector RedVector LaboratoriesSK-5100משמשת לפיתוח אות כרומוגני אדום במהלך IHC דו-צבעי מבוסס AP
כסילן (1 L) StatLab8400-1משמש כחומר להסרת פאראפין ולהבהרה עבור IHC בצבע יחיד. הכין שני בקבוקי 500 mL המסומנים כ-Xylene I ו-Xylene II

מקורות

  1. Sipos D, et al. Glioblastoma: Clinical presentation, multidisciplinary management, and long-term outcomes. Cancers (Basel). 2025;17(1):146.
  2. Himes BT, et al. Immunosuppression in glioblastoma: Current understanding and therapeutic implications. Front Oncol. 2021;11:770561.
  3. Lin H, et al. Understanding the immunosuppressive microenvironment of glioma: mechanistic insights and clinical perspectives. J Hematol Oncol. 2024;17(1):31.
  4. Puviindran BJ, et al. Within and beyond the tumor: Mechanisms of glioblastoma-induced immunosuppression. Neurooncol Adv. 2025;7(Suppl 4):iv4-iv18.
  5. He J, Yan X, Hu S. Glioma stem cells: drivers of tumor progression and recurrence. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):293.
  6. Dharmapuri S, et al. Multiplexed immunohistochemical analysis of the immune microenvironment of biliary tract cancers pre- & post-neoadjuvant chemotherapy: case series. Ann Transl Med. 2024;12(4):78.
  7. Hatogai K, et al. Comprehensive immunohistochemical analysis of tumor microenvironment immune status in esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(30):47252-64.
  8. Liu X, et al. Spatial heterogeneity of infiltrating immune cells in the tumor microenvironment of non-small cell lung cancer. Transl Oncol. 2024;50:102143.
  9. Kazama A, et al. Tumor-infiltrating immune cell status predicts successful response to immune checkpoint inhibitors in renal cell carcinoma. Sci Rep. 2022;12(1):20386.
  10. Park DH, Kim YZ. Simple analysis using immunohistochemical staining for tumor-infiltrating lymphocytes in brain metastasis of small cell lung cancer. J Neurointensive Care. 2024;7(2):49-55.
  11. Bogajewska-Rylko E, et al. When is immunohistochemistry useful in assessing tumor necrotic tissue? Anticancer Res. 2021;41(1):197-201.
  12. Saha D, Rabkin SD. Immunohistochemistry for tumor-infiltrating immune cells after oncolytic virotherapy. Methods Mol Biol. 2020;2058:179-90.
  13. Saha D, et al. combinatorial effects of VEGFR kinase inhibitor Axitinib and oncolytic virotherapy in mouse and human glioblastoma stem-like cell models. Clin Cancer Res. 2018;24(14):3409-22.
  14. Li M, et al. Characterization and oncolytic virus targeting of FAP-expressing tumor-associated pericytes in glioblastoma. Acta Neuropathol Commun. 2020;8(1):221.
  15. Bommareddy PK, et al. Oncolytic herpes simplex virus expressing IL-2 controls glioblastoma growth and improves survival. J Immunother Cancer. 2024;12(4):e008880.
  16. Chernov A, Chutko A, Alaverdian D, Kashuro V, Galimova E. Chemotherapy sensitivity of primary glioblastoma cells and immunohistochemical markers to predict survival of patients with glioblastoma. Clin Transl Oncol. 2026;28(3):974-85.
  17. Saha D, Rabkin SD, Martuza RL. Temozolomide antagonizes oncolytic immunovirotherapy in glioblastoma. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000345.
  18. Jahan N, Talat H, Alonso A, Saha D, Curry WT. Triple combination immunotherapy with GVAX, anti-PD-1 monoclonal antibody, and agonist anti-OX40 monoclonal antibody is highly effective against murine intracranial glioma. Oncoimmunology. 2019;8(5):e1577108.
  19. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Macrophage polarization contributes to glioblastoma eradication by combination immunovirotherapy and immune checkpoint blockade. Cancer Cell. 2017;32(2):253-67.e5.
  20. Lu L, Saha D, Martuza RL, Rabkin SD, Wakimoto H. Single agent efficacy of the VEGFR kinase inhibitor axitinib in preclinical models of glioblastoma. J Neurooncol. 2015;121(1):91-100.
  21. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Oncolytic herpes simplex virus immunovirotherapy in combination with immune checkpoint blockade to treat glioblastoma. Immunotherapy. 2018;10(9):779-86.
  22. Marumoto T, et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 2009;15(1):110-6.
  23. Cheema TA, et al. Multifaceted oncolytic virus therapy for glioblastoma in an immunocompetent cancer stem cell model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(29):12006-11.
  24. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Curing glioblastoma: oncolytic HSV-IL12 and checkpoint blockade. Oncoscience. 2017;4(7-8):67-9.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גליובלסטומה גזעייםמיקרו-סביבת הגידולפרוטוקול אימונוהיסטוכימיהזיהוי כרומוגניIHC דו-צבעיגידול מוחי FFPEתאי חיסון חודרי גידולהשתלה אורטוטופיתצביעת פוספטאז אלקלי

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.