הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

חלבון דמוי-Wings Apart אנושי כסמן ביולוגי לאבחנה מסירומית בסרטן צוואר הרחם: ניתוח ביואינפורמטיקה אינטגרטיבי עם תיקוף סרומי

72 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72194

⸱

21 באוגוסט 2026

 ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Shaanxi Provincial People's Hospital

במאמר זה

סיכום

מחקר זה בוחן את חלבון hWAPL (human wings apart-like) כסמן ביולוגי אבחנתי בסרום לסרטן צוואר הרחם באמצעות אנליזה ביו-אינפורמטית אינטגרטיבית ותיקוף בסרום, ומראה כי שילוב של hWAPL בסרום עם אנטיגן לסרטן תאים קשקיים (squamous cell carcinoma antigen) משפר את ביצועי האבחון.

תקציר

סרטן צוואר הרחם נותר איום מרכזי על בריאותן של נשים ברחבי העולם, וסממנים ביולוגיים (biomarkers) מהימנים בנסיוב עבור גילוי מוקדם וסיווג טיפולי נותרים מוגבלים. חלבון human wings-apart-like (hWAPL) היה מעורב בקרצינוגנזה של צוואר הרחם, אך ערכו האבחנתי והקליני לא הובהר במלואו. כדי למלא פער זה, מחקר זה שילב מאגרי נתונים מולטי-אומיים ציבוריים, כולל The Cancer Genome Atlas, GEPIA2, ה-Human Protein Atlas ונתוני טרנסקריפטומיקה של תאי בודד, כדי לאפיין את ביטוי hWAPL, קשרים קליניו-פתולוגיים, חדירה חיסונית, רשתות ביטוי משותף, מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות ותחזיות לרגישות לתרופות. ממצאים אלו הוערכו בקוהורט נסיוב בלתי תלוי ממרכז אחד, שכלל 89 מטופלות עם קרצינומה של תאי קשקש בצוואר הרחם המאובחנת היסטולוגית ו-89 נשים בריאות כביקורת. נמדדו רמות של hWAPL ונסיוב של squamous cell carcinoma antigen (SCC), והביצועים האבחנתיים הוערכו באמצעות ניתוח עקומת מאפייני תגובה (ROC). In silico, hWAPL היה בעל ביטוי מוגבר באופן נרחב במספר גידולים ממאירים, ובמיוחד בסרטן צוואר הרחם, היה מועשר בתאים אפיתליאליים ממאירים ובמונוציטים/מקרופגים, והיה קשור למרווח קצר יותר ללא התקדמות המחלה, לתחזית של רגישות מופחתת ל-cisplatin, paclitaxel ו-5-fluorouracil, ולתחזית של רגישות למעכבי MCL-1 ו-Wee1. בקוהורט הנסיוב, רמות ה-hWAPL היו גבוהות משמעותית במטופלות מאשר בביקורות והבדיקה הבדילה סרטן צוואר הרחם עם שטח תחת העקומה (AUC) של 0.961, מה שעולה על SCC לבדו. שילוב של hWAPL עם SCC שיפר עוד יותר את הביצועים האבחנתיים (שטח תחת העקומה, 0.974; רגישות, 93.3%; סגוליות, 95.5%). ממצאים אלו מרמזים כי hWAPL בנסיוב הוא סמן ביולוגי אבחנתי פוטנציאלי חדש לקרצינומה של תאי קשקש בצוואר הרחם, שביצועיו משתפרים באמצעות SCC, בעוד שהקשרים שנצפו עם עמידות כימותרפית ועיצוב מחדש של המיקרו-סביבה החיסונית מהווים בסיס להשערות ודורשים אישור ניסיוני.

מבוא

סרטן צוואר הרחם מדורג כממאירות הרביעית בשכיחותה וכגורם המוביל הרביעי לתמותה מסרטן בקרב נשים ברחבי העולם, עם כ-660,000 אבחונות חדשות ו-350,000 מקרי מוות שנרשמו בשנת 20221. נטל מחלה זה פוגע באופן לא פרופורציונלי במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית, שבהן תוכניות סריקה שיטתיות נותרו בלתי מספיקות2. בעוד שחיסון נגד HPV ובדיקות פאפ (Pap smear) הפחיתו בהצלחה את שיעורי השכיחות במספר רב של סביבות בעלות הכנסה גבוהה, גישות אבחוניות נוכחיות מציגות מגבלות ניכרות. בדיקת HPV DNA מדגימה סגוליות (specificity) תת-אופטימלית, והפרשנות הציטולוגית היא סובייקטיבית ומשתנה במהותה. חסר זה מדגיש את הצורך הדחוף בסמני סרום (biomarkers) חדשניים, אובייקטיביים ופולשניים במינימום, כדי להרחיב את המסגרות האבחוניות הקיימות.

אנטיגן קרצינומה של תאי קשקש (SCC-Ag) משמש כסמן ביולוגי סרולוגי עיקרי לקרצינומה של תאי קשקש בצוואר הרחם, תת-סוג היסטולוגי המהווה כ-85–90% מכל מקרי סרטן צוואר הרחם3. סקירה שיטתית ומטא-אנליזה הצביעו על כך שרמות גבוהות של SCC-Ag לפני טיפול בקרצינומה של תאי קשקש קשורות להישרדות כוללת ולהישרדות ללא התקדמות מחלה גרועות במידה ניכרת4. בהקשר של מעקב אחר הישחויות, SCC-Ag מראה רגישות של 78.9% וסגוליות של 91.2% עבור קרצינומה של תאי קשקש4. עם זאת, התועלת של SCC-Ag לגילוי מוקדם היא מוגבלת, שכן רמות מוגברות נצפו רק ב-28–88% מהאנשים שאובחנו עם סרטן צוואר הרחם מסוג תאי קשקש5. יתרה מכך, גידולים רבים בשלבים מוקדמים אינם מציגים ריכוזי SCC-Ag מוגברים, וסמן ביולוגי זה אינו רלוונטי לווריאנטים היסטולוגים שאינם תאי קשקש3. כתוצאה מכך, גילוי סמנים ביולוגיים חדשים בסרום המציעים רגישות אבחנתית משופרת, במיוחד לסרטן צוואר הרחם בשלבים מוקדמים, מהווה סדרה של עדיפויות קליניות משמעותיות שטרם נפתרו.

מעבר ל-SCC-Ag, נבחנו מספר סממנים מאובחנים (circulating markers) אחרים בסרטן צוואר הרחם, כולל anitgen carcinoembryonic, antigen הסרטן CA-125, פרגמנט של cytokeratin-19 (CYFRA 21-1), ולאחרונה, DNA של גידול במחזור הדם ו-HPV cell-free DNA. עם זאת, בפועל, סממנים אלו מוגבלים עקב רגישות נמוכה למחלה בשלבים מוקדמים, ספציפיות דלה להיסטולוגיה של תאי קשקש (squamous) השולטת בסרטן צוואר הרחם, או דרישה לפלטפורמות מולקולריות ייעודיות שאינן זמינות עדיין באופן נרחב. מצב זה מותיר מקום ניכר לסממן חלבוני שיהיה both מקושר מנגנונית לקרצינוגנזה של צוואר הרחם וניתן למדידה באמצעות בדיקת אימונו-סביי (immunoassay) שגרתית.

הגן האנושי wings apart-like (hWAPL), המכונה גם WAPL, מקודד לגורם לשחרור קוהסין (cohesin release factor), החיוני להפרדה תקינה של כרומטידות אחיות במהלך חלוקה מיטוטית6. hWAPL, שזוהה לראשונה על ידי Oikawa et al., אופיין כגן אנושי חדש שביטויו מונחה על ידי האונקו-פרוטאינים E6 ו-E7 של HPV. הוא מראה ביטוי חזק בקרצינומות של צוואר הרחם, בעוד שביטוי מינימלי בלבד נצפה ברקמות נורמליות ונאופלסטיות אחרות7. מחקרים נוספים חשפו כי רמות ה-mRNA של hWAPL גבוהות באופן מובהק בקרצינומה של צוואר הרחם ביחס לאפית צוואר רחם שפירה, כאשר הביטוי עולה בתיאום עם הדרגה של נאופלזיה תוך-אפית של צוואר הרחם (CIN)8,9. מהבחינה המכנית, ביטוי-יתר לא מווסת של WAPL משבש תהליכים מיטוטיים וציטוקינטיים, ובכך מעודד חוסר יציבות כרומוזומלית ומסייע להתקדמות הגידול10. בנוסף, WAPL תורם באופן משמעותי לתומוריגנזה ולבקרת התקדמות מחזור התא. מספר איזופורמים של WAPL הנובעים משחלוף חלופית (alternative splicing) זוהו בדגימות שונות של אפית צוואר הרחם, מה שמדגיש את הגיוון המולקולרי שלו11. בנוסף למעורבותו המוכרת בהתפתחות סרטן צוואר הרחם, ראיות גוברות מדגישות את התועלת האבחנתית של hWAPL בנגעים של צוואר הרחם. יתרה מזאת, השתקה (knockdown) של hWAPL באמצעות TAT הפחיתה את ביטוי HPV E6, דיכאה פלישה גידולית ויצירת מושבות בתאי גזע של סרטן צוואר הרחם, והחלישה באופן משמעותי את צמיחת הגידול במודלים של עכברי nude12. ממצאים אלו מרמזים כי hWAPL משמש כסמן לשגשוג תאי גזע של סרטן צוואר הרחם ומהווה מטרה טיפולית פוטנציאלית רלוונטית12.

בעוד שתוצאות אלו מעודדות, מספר שאלות חשובות נותרו ללא מענה. ראשית, היכולת של hWAPL בסרום להבדיל בין חוליות סרטן צוואר הרחם לבין אנשים בריאים, והביצועים שלו ביחס ל-SCC, שהוא סמן ביולוגי מבוסס, או בשילוב איתו, לא נבחנו באוכלוסיית מחקר מבוקרת באופן קפדני. שנית, הקשר בין רמות hWAPL בסרום לבין סטטוס זיהום ב-HPV, כמו גם מאפיינים קליניקה-פתולוגיים מרכזיים כגון שלב קליני, דרגה היסטולוגית וגרורות בקשרי לימפה, עדיין אינו ברור. שלישית, טרם נבדק האם hWAPL ו-SCC מספקים ערך משלים לצורכי אבחנה.

אף על פי ש-hWAPL נחקר ברמות הרקמה והתא, אף מחקר קודם לא קבע אם ניתן למדוד את החלבון במחזור הדם או אם מדידה מבוססת סרום יכולה להבדיל בין סרטן צוואר הרחם לבין קבוצת ביקורת; זהו הפער הידע הספציפי שהמחקר הנוכחי מבקש למלא. בהתבסס על דיווחים קודמים מבוססי רקמה, ולא כחזרה עליהם, שילבנו סקר ביואינפורמטיקה אינטגרטיבי של hWAPL, תוך שימוש בנתונים מ-The Cancer Genome Atlas וממאגרים ציבוריים אחרים, עם ההערכה הראשונה מבוססת סרום של החלבון בקוהורט עצמאי במרכז יחיד, שהכיל 89 מטופלות עם קרצינומה של תאי קשקש בצוואר הרחם ו-89 נשים בריאות כביקורת. המטרה העיקרית הייתה לקבוע את הביצועים האבחנתיים של hWAPL בסרום, שנמדדו כשטח תחת עקומת האפיון של המקלט (ROC), לצורך הבחנה בין קרצינומה של תאי קשקש בצוואר הרחם לבין ביקורות בריאות, הן באופן עצמאי והן בשילוב עם SCC-Ag; מדד התוצאה העיקרי היה לפיכך השטח תחת העקומה, כאשר הרגישות והסגוליות בסף Youden האופטימלי שימשו כמדדים משניים. מטרות משניות היו לאפיין את הקשר של hWAPL בסרום עם סטטוס HPV ומאפיינים קלינו-פתולוגיים אחרים, ולהפיק היפותזות מכניסטיות בנוגע להקשר הביולוגי של hWAPL באמצעות הניתוחים הביואינפורמטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת ההגנה על נסייני אדם (IRB) של בית החולים המחוזי שאןשי (מספר אישור 2024-R055) ונערך בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל משתתף לפני דגימת דם. כל דגימות הדם והסרום האנושיות נאספו, טופלו ואוחסנו בהתאם להנחיות המוסדיות של המחלקה לרפואה מעבדתית.

כל דגימות דם ורידי וסרום טופלו כחומר ביולוגי שעלול להיות זיהומי. עיבוד הדגימות בוצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (biosafety level 2) על ידי כוח אדם מיומן שהשתמש בציוד מיגון אישי מתאים. כלי פלסטיק חד-פעמיים, טיפים של פיפטות ומיקרו-פלטות משומשות שבאו במגע עם חומר ביולוגי עברו עיקור באוטוקלאב או נאספו כפסולת ביו-סיכונית והושלכו דרך ערוץ פסולת הרפואית המורשה של המוסד, בהתאם לתקנות המקומיות.

סקירת תכנון המחקר:
זרימת העבודה של מחקר זה מסוכמת בסכימה של תכנון המחקר (Supplementary Figure S1) ומחולקת לשני זרועות משלימות. בזרוע ה-in silico, נערכה אנליזה של מאגרי נתונים ציבוריים של תמלול (transcriptomic), תאים בודדים, חלבונים, מודיפיקציות לאחר תרגום, מערכת החיסון ורגישות לתרופות, במטרה לאפיין את ההקשר הביולוגי של hWAPL ולהעלות היפותזות מכניסטיות. בזרוע הניסויית, נמדדו serum hWAPL ו-SCC-Ag בקוהורט עצמאי ממרכז רפואי יחיד, וביצועיהם האבחנתיים, כביגוד נפרד ובשילוב, הוערכו באמצעות אנליזת עקומי ROC (receiver operating characteristic) ורגרסיה לוגיסטית. שתי הזרועות שולבו רק בשלב הפרשנות, כאשר זרוע הסרום סיפקה את התיקוף הניסויי היחיד.

פרופיל ביטוי גנים של סרטן צוואר הרחם מסוג קרצינומה של תאי קשקש וסרטנים אחרים
נתוני ריצוף RNA מתוך The Cancer Genome Atlas (TCGA) הושגו באמצעות ה-UCSC Xena Browser. לכל מאגרי המידע הציבוריים וכלי הרשת ששימשו במחקר זה ניגשנו בין ספטמבר לאוקטובר 2025, והגרסאות הספציפיות ותאריכי הגישה מפורטות ב-טבלת החומרים. רמות הביטוי של WAPL, שכומי הן כfragments per kilobase of transcript per million mapped reads (FPKM), עברו טרנספורמציית log₂ עם תוספת של pseudocount של 1. ערכים שונו אלו שימשו לביצוע ניתוחים השוואתיים בין רקמות ממאירות לדגימות נורמליות סמוכות תואמות במספר סוגי סרטנים. לצורך החקירה הממוקדת של ממאירות צוואר הרחם, בודדו נתוני ביטוי של WAPL ספציפיים לקרצינומה של תאי קשקש ואדנוקרצינומה אנדו-צווארית של צוואר הרחם (CESC). פרופיל הביטוי בדגימות גידולים אלו הוצג ויזואלית לאחר מכן והושווה לרמות הביטוי ברקמות בקרה של אפיתל נורמלי בצוואר הרחם.

ניתוח של איזופורמים של תמלילי WAPL
פרופילי הביטוי של איזופורמים של תמלילי WAPL נבחנו באמצעות מאגר הנתונים GEPIA2. איזופורמים ספציפיים הוגדרו על ידי מזהי התמלילים המתאימים שלהם ב-Ensembl (ENST). רמות הביטוי חושבו כערך הלוגריתם בבסיס 2 של תמלילים למיליון פלוס אחת [log₂(TPM+1)] והוצגו גרפית כתרשימי כינור (violin plots).

ניתוח רצף RNA של תא בודד
מערכת הנתונים של scRNA-seq שמספרה GSE168652 הופקה ממאגר Gene Expression Omnibus (GEO). עיבוד מקדמי של נתונים, הערכת איכות, נרמול ואשכול (clustering) בוצעו באמצעות פלטפורמת scCancerExplorer. תאים שהביעו פחות מ-200 גנים וגנים שזוהו בפחות משלושה תאים הוסרו בסינון. הנרמול בוצע בשיטת Log-Normalize עם מקדם קנה מידה (scaling factor) של 10,000.

2,000 הגנים בעלי השונות הגבוהה ביותר זוהו באמצעות טרנספורמציה למייצבי שונות (variance-stabilizing transformation) ושימשו לאחר מכן לניתוח רכיבים ראשיים (PCA). להפחתת ממדיות הוחל שימוש ב-Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) על בסיס 30 הרכיבים הראשיים הראשונים. אשכולה (Clustering) מבוססת גרף בוצע באמצעות אלגוריזם Louvain ברזולוציה של 0.8. אשכולות התאים סווגו על פי גנים מסמנים (marker genes) מובהקים. רמות הביטוי של WAPL נמדדו באוכלוסיות תאים שונות, ושלבי מחזור התא נקבעו באמצעות שיטת CellCycleScoring.

ניתוח ביטוי חלבונים ומודיפיקציות לאחר תרגום
הביטוי וההתפלגות התת-תאית של WAPL ב-CSCC הוערכו באמצעות מאגר הנתונים Human Protein Atlas. אתרי מודיפיקציה לאחר תרגום (PTM) זוהו באמצעות PhosphoSitePlus. יתרה מכך, קשרים פוטנציאליים בין רמות הביטוי של WAPL לבין גנים המעורבים בתהליכי מודיפיקציה של חלבונים, ובסגול AKT1, AKT2, KAT2B, EP300, USP7 ו-KAT5, בתוך CSCC, נחקרו באמצעות כלי Xiantao Academic13,14,15,16,17.

רשת ביטוי משותף ואנליזת העשרה תפקודית
נתוני רצף ה-RNA עבור TCGA-CSCC, שעובדו באמצעות מתאם STAR ונורמלו למספר תמלילים למיליון (TPM), הושגו מפורטל Genomic Data Commons (GDC). כדי לזהות גנים המובעים במשותף עם WAPL, הוחל סף סינון המבוסס על מקדם מתאם פירסון מוחלט הגבוה מ-0.6 ורמת מובהקות סטטיסטית של P < 0.05.

על מנת לחקור את התפקודים הביולוגיים הקשורים ל-WAPL, בוצע תחילה ניתוח ביטוי דיפרנציאלי לאחר חלוקת החולים לקבוצות של ביטוי WAPL גבוה ונמוך, תוך שימוש בערך הביטוי החציוני כנקודת חיתוך. גנים עם ביטוי דיפרנציאלי זוהו באמצעות פלטפורמת Xiantao Academic והועמדו לאחר מכן לניתוח העשרה של Gene Ontology, כולל קטגוריות של תהליך ביולוגי, רכיב תאי ותפקוד מולקולרי, יחד עם ניתוח מסלולים של Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. באופן בלתי תלוי, נבחנו קשרי אינטראקציה של חלבונים המערבים את WAPL באמצעות STRING, ורשת האינטראקציות שהתקבלה שוחזרה ונבחנה ב-Cytoscape.

ניתוח העשרה של קבוצות גנים (GSEA) בוצע באמצעות מאגרי המידע Reactome, WikiPathways ו-KEGG, כאשר קריטריוני הסינון נקבעו על מדד העשרה מנורמל מוחלט (|NES|) > 1 ושיעור גילוי שגוי (FDR) < 0.25.

ניתוח חדירה חיסונית
הכליםB החישובים TIMER 2.0 ו-xCell שימשו לניתוח נתונים טרנסקריפטומיים מקבוצת ה-TCGA-CESC, ובכך אפשרו הערכה כמותית של מצב החדירה עבור 24 אוכלוסיות נבדלות של תאי מערכת החיסון.

חיזוי רגישות לתרופות
חיזויים של רגישות לתרופות הופקו ממאגר ה-GDSC2 באמצעות חבילת ה-R שנקראת oncoPredict. ריכוז העכבה החצאי-מקסימלי (IC50) חושב עבור פאנל של 86 תרכובות כימותרפיוטיות.

ניתוח הישרדות ואבחנה
עקומי הישרדות כוללת (OS) ומרווח ללא התקדמות (PFI) נבנו באמצעות פלטפורמת הניתוח של Xiantao, כאשר קבוצות המטופלים חולקו לשתי קבוצות על בסיס רמת הביטוי החציונית של WAPL. המשמעות הפרוגנוסטית של המשתנים הוערכה באמצעות מודלים של רגרסיית סיכונים פרופורציונלית של Cox, הן בניתוח חד-משתני והן בניתוח רב-משתני. כדי להעריך את היכולת האבחנתית של WAPL ו-SCC (SERPINB3) בהבחנה בין CSCC לבין רקמה נורמלית סמוכה, הוחל ניתוח עקומות מאפיין תגובה (ROC) על נתונים טרנסקריפטומיים, המבוטאים כמספר טרנסקריפטים למיליון (TPM), שהופקו מ-The Cancer Genome Atlas.

איסוף דגימות סרום ו-ELISA
מחקר זה קיבל אישור מוועדה לאתיקה במחקר אנושי (IRB) של בית החולים המחוזי שאנשי (מספר אישור 2024-R055) ובוצע בהתאם להצהרת הלסינקי. סך כולל של 89 דגימות סרום התקבלו ממטופלות עם CSCC שהוכח היסטופתולוגית, לצד 89 נשויות בריאות כביקורת, שהותאמו מבחינת גיל. הגיל החציוני היה 54 שנים, בטווח של 31–77 שנים, בקבוצת ה-CSCC, ו-41 שנים, בטווח של 30–52 שנים, בקבוצת הביקורת. כל מקרי סרטן צוואר הרחם אובחנו לאחרונה והיו נאיביים לטיפול במועד איסוף הדם; הדגימות נלקחו לפני תחילת כל ניתוח, כימותרפיה או רדיותרפיה. נציין כי למרות ששתי הקבוצות נלקחו מהסביבה הקלינית דומה, הגיל החציוני השתנה ב-13 שנים. הבדל זה נבחן ישירות בפרק התוצאות ובניתוח רגישות ייעודי המתואם לגיל, והוא מוכר כמגבלה בפרק הדיון.

דם ורידי נאסף למבחנות ללא נוגדי קרישה, הושאר להיקרש בטמפרטורת החדר למשך 10–20 min, ולאחר מכן הופרד בצנטריפוגה ב-2,000–3,000 × g למשך 20 min. הסרום הופרד בתוך שעה מהאיסוף, חולק למכסות (aliquots) באופן מיידי ואושרש ב-−20 °C; פרק הזמן בין הדקירה הוורידית להקפאה לא עלה על 2 h עבור אף דגימה. המכסות עברו מחזור הקפאה-הפשרה בודד לפני האנליזה, וכל המדידות הושלמו בתוך שלושה חודשים מהאחסון. הסרום שהתקבל חולק למכסות ונשמר ב-−20 °C. דגימות המולטיות או ליפמיות הוצאו מהאנליזה.

כימות רמות חלבון hWAPL בסרום בוצע באמצעות ערכה מסחרית של ספיחה חיסונית מקישור אנזימטי (ELISA), המבוססת על עיקרון "סנדוויץ'" של נוגדויות כפולות. בקצרה, הן סטנדרטי הכיול והן דגימות הבדיקה חולקו בשכפולים לבארי microplate מצופים מראש בנוגדן לכידה ספציפי ל-hWAPL, ולאחריהם דגירה של 30 min בטמפרטורה של 37 °C. לאחר סדרת שלבי שטיפה להסרת חומרים שאינם קשורים, הוסף נוגדן זיהוי המסומן ב-horseradish peroxidase (HRP) המכוון ל-hWAPL, והוא דגור תחת תנאים זהים.

לאחר שטיפה נוספת, תמיסו תת-מצע כרומוגניות A ו-B בנפח של 50 µL כל אחת בכל באר, והן הושארו להתפתח בחשכה בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 min. תמיסת עצירה (50 µL) הוספה כדי להפסיק את התגובה האנזימטית. הצפיפות האופטית נמדדה באורך גל ראשי של 450 nm, עם קריאת ייחוס ב-630 nm, בתוך 15 min מהפסקת התגובה. עקומת סטנדרט נבנתה באמצעות כיליורים בדילול סדרתי בטווח ריכוזים של 10–450 pg/mL. ריכוז ה-hWAPL עבור כל דגימה לא ידוע הופק באמצעות אינטרפולציה מעקומת סטנדרט זו והותאם לכל דילול פרה-אנליטי. הבדיקה בוצעה בהחלט לפי הוראות היצרן. על פי מפרטי היצרן, טווח הגילוי העובד של הערכה הוא 10–450 pg/mL. הדגימות נבדקו בדילול סופי של 5-fold, ודגימות שהצפיפות האופטית שלהן עלתה מזו של הכיליור הגבוה ביותר דוללו באופן נוסף ונבדקו שוב, תוך החלת מקדם הדילול הכולל במהלך חישוב הערכים חזרה. הביצועים האנליטיים אומתו במטריקס סרום לפני הרצת דגימות המחקר: מאגר סרום בריכוז גבוה בדילול סדרתי הראה לינאריות מקובלת לאורך טווח הכיול, ואחוזי התאוששות (spike recovery) של הכיליור הרקומביננטי בשלושה מאגרי סרום היו בטווח מקובל, בהתאם למבנה ה-double-antibody sandwich של הערכה. הגבול התחתון של הכמות (LLQ) תאם לכיליור הנמוך ביותר (10 pg/mL). אנו מדגישים כי הערכה זו מסומנת על ידי היצרן לשימוש למחקר בלבד ואינה מכשיר אבחון in vitro המקבל תיקוף קליני; לפיכך, יש לפרש את הריכוזים המוחלטים ואת ערך הסף (cutoff) הנגזר מהם כספציפיים לפלטפורמה וכזמניים, כפי שנדון להלן.

במקביל, רמות SCC-Ag בסרום נקבעו באמצעות פלטפורמת Abbott Alinity i באמצעות בדיקת חיסון של חלקיקים מיקרוסקופיים עם פליטה כימית (CMIA), עם גבול ייחוס עליון של 1.5 ng/mL. כל ההליכים האנליטיים בוצעו בכפילות על ידי צוות מעבדה שהיה עיוור למצב המחלה ולכל המשתנים הקליניים, כולל השלב הקליני, הדרגה ההיסטולוגית ומצב ה-HPV. מקדמי השונות, הן בין-בדיקתיים (inter-assay) והן תוך-בדיקתיים (intra-assay), עבור המתודולוגיות שבהן נעשה שימוש נשמרו מתחת ל-10%.

ניתוח סטטיסטי
מאחר שריכוזי hWAPL בסרום לא עמדו בהנחת הנורמליות לפי מבחן Shapiro–Wilk (כל ה-P < 0.05), ניתוחים המשכיים בוצעו באמצעות שיטות לא-פרמטריות. לפיכך, משתנים רציפים מוצגים כחציונים עם טווחי בין-רבעוניים (IQRs). הבדלים בין שתי קבוצות בלתי תלויות הוערכו באמצעות מבחן Mann–Whitney U, בעוד שהשוואות בין שלוש קבוצות או יותר בוצעו באמצעות מבחן Kruskal–Wallis H. מתאמים בין משתנים הוערכו באמצעות ניתוח מתאם דרגות של Spearman עבור נתונים רציפים או סודרים, ומקדם מתאם point-biserial עבור משתנים בינאריים, כגון מצב זיהום ב-HPV. תוצאות הישרדות הושוו באמצעות מבחן log-rank, ויחסי סיכון (hazard ratios) עם רווחי סמך של 95% נאמדו מתוך מודלים של רגרסיית סיכונים פרופורציונליים של Cox.

הביצועים האבחנתיים הוערכו באמצעות ניתוח עקומות ROC, כאשר ערך הסף האופטימלי עבור כל סמן ביולוגי נקבע על ידי מקסום מדד Youden. הבדלים בשטח תחת העקומה (AUC) נבחנו באמצעות שיטת DeLong. כדי לבחון את התועלת האבחנתית המשולבת, נבנה מודל רגרסיה לוגיסטית בינארית שבו מצב המחלה (CSCC = 1; ביקורת = 0) שימש כמשתנה התלוי, ו-hWAPL בנסיוב ואנטיגן SCC שימשו כמנבאים בלתי תלויים. ההסתברויות החזויות שהתקבלו נשמרו כציון מורכב לצורך ניתוח ROC המשכי.

רגישות דיפרנציאלית לתרופות בין קבוצות WAPL-high ו-WAPL-low הוערכה באמצעות חבילת limma, תוך יישום ספי שער של adjusted P < 0.05 ו- |log₂ fold change| > 0.3. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-P-value דו-זנבי < 0.05. כל הניתוחים בוצעו באמצעות SPSS, R, או הכלים המקוונים שצוינו. חבילות ה-R ששימשו למחקר כללו את survival, survminer, pROC, ggplot2, oncoPredict, ו-limma. עבור כל ניתוחי הממדים הגבוהים שבהם נבחנו היפותזות רבות בו-זמנית, דהיינו השוואות הפן-סרטן (pan-cancer), סריקת הביטוי המשותף (co-expression), ניתוחי הביטוי הדיפרנציאלי והעשרה תפקודית, וניתוח הרגישות לתרופות, ערכי ה-P-values הותאמו להשוואות מרובות באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg false discovery rate, וערכי P-values מתוקננים מדווחים במקומות המתאימים; המתאמים הזוגיים בין hWAPL לבין גנים בודדים או פракציות של תאי מערכת החיסון מדווחות עם P-values נומינליים, ותוצאות מתאם אלו נחשבות כמייצרות היפותזות ולא כמאששות. מכיוון שמספר קטן של שדות קליניקו-פתולוגיים בקוהורט הציבורי לא הושלמו במלואם, מקרים עם נתונים חסרים הוצאו מהניתוח המתאים על בסיס זוגי במקום שיושלמו (imputation), ומספר המקרים שניתן להערכה מופיע עבור כל משתנה ב- Table 1. כדי להתייחס להבדלי הגיל בין קוהורט הסרום, בוצע ניתוח רגישות באמצעות רגרסיה לוגיסטית בינארית מותאמת לגיל, וחושב מתאם ספירמן (Spearman correlation) בין hWAPL בסרום לבין הגיל בתוך כל קבוצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עלייה רחבה בביטוי של hWAPL במגוון גידולים ממאירים בבני אדם, ובמיוחד ברקמות של סרטן צוואר הרחם
ניתוח פאן-סרטני (Pan-cancer) של מאגרי נתונים מ-TCGA גילה כי WAPL מראה ביטוי מוגבר באופן משמעותי ברוב הגידולים המוצקים בהשוואה לרקמות הנורמליות התואמות להם (איור 1A). באופן בולט, hWAPL היה בעל ביטוי יתר משמעותי בקרצינומה של תאי קשקשת בצוואר הרחם ובאדנוקרצינומה אנדו-צווארית (CESC) מבין 21 סוגי סרטן אחרים, כולל קרצינומה פולשנית של השד (BRCA), אדנוקרצינומה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניתוח רחב-סרטני (pan-cancer) שביצענו לנתוני TCGA גילה כי ביטוי WAPL מוגבר באופן ניכר ברוב הגידולים המוצקים בהשוואה לרקמות נורמליות, כאשר העלייה החזקה ביותר נצפתה ב-CESC. תצפית זו תואמת ממצאים קודמים לפיהם mRNA של hWAPL מובע בעיקר בסרטן צוואר הרחם, עם ביטוי מינימלי ברקמות נורמליות וממאירות אחרות7. Oikawa וחב' אפיינו בתחילה את hWAPL כגן חדש המעורב בהתפתחות סרטן צוואר הרחם, והדגימו את תכונותיו האונקוגניות ואת הקשרו לסרטן צוואר הרחם9. הממצאים שלנו מרח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

המחברים ברצונם להודות לכל המשתתפים ולצוות הקליני שהיו מעורבים במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר הבסיסי במדעי הטבע של מחוז Shaanxi (מענק מספר 2021JM-552).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Abbott GmbH, ויסבאדן, גרמניהמכיוון שלא סופק טקסט מקור לתרגום, נא לספק את התוכן באנגלית שברצונך לתרגם לעברית. אשמח לסייע בתרגום מקצועי ומדויק של התכנים המדעיים והחינוכיים עבור JoVE.משמש לזיהוי SCC-Ag
Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., שנזן, סיןדגם RT-3100משמש לשטיפת פלטות
מפעל המכשור המדעי שנגחאי אנטינג, שנגחאי, סיןצנטריפוגה במהירות נמוכה מדגם TLXY-IICמשמש לצנטריפוגציה של דגימות סרום
קונסורציום Cytoscapeגרסה 3.9.1משמש לוויזואליזציה של רשתות; ויזואליזציה של רשתות
המכון הלאומי לסרטןhttps://portal.gdc.cancer.gov; נגש באוקטובר 2025שימש לשליפת נתוני TPM מיושרים באמצעות STAR מתוך TCGA-CSCC; RRID:SCR_014514
פלטפורמה מקוונת/מאגר נתוניםלא רלוונטימשמש לניבוי רגישות לתרופות; נתוני ייחוס של רגישות לתרופות
המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (National Center for Biotechnology Information)GPL24676 Illumina NovaSeq 6000 (Homo sapiens)משמש לאחזור מאגרי נתונים של רצף RNA של תא בודד; מאגר נתונים של single-cell RNA-seq
פלטפורמה מקוונתלא רלוונטימשמש לאנליזה של איסופורמים של תמלילים וביטוי גנים; אנליזה של איסופורמים של תמלילים ושל ביטוי
חבילת Rגרסה 3.4.4משמש להדמיית נתונים
פלטפורמה מקוונת/מאגר נתוניםלא רלוונטימשמש לניתוח ביטוי חלבונים ולמיקום תת-תאי; ביטוי ומיקום חלבונים
Shanghai Fusheng Biotechnology Co., Ltd.A977261-96TA977261-96T; ELISA מסוג כריך נוגדנים כפול; טווח זיהוי 10-450 pg/mL; לשימוש מחקרי בלבד (www.affandi-e.com)
חבילת Rגרסה 3.54.0משמש לניתוח דיפרנציאלי
Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., שנג'ן, סיןדגם RT-6100משמש למדידת צפיפות אופטית
חבילת Rגרסה 0.2משמש לבדיקת רגישות לתרופות (IC50חיזוי; RRID:SCR_023220
פלטפורמה מקוונת/מאגר נתוניםלא רלוונטימשמש לניתוח מודיפיקציות לאחר תרגום; ניתוח אתרים של מודיפיקציות לאחר תרגום
חבילת Rגרסה 1.18.0משמש לניתוח עקומת ROC
R Foundation for Statistical Computingגרסה 4.2.1משמש לניתוח סטטיסטי וניתוח ביואינפורמטיקה; ניתוח סטטיסטי וביואינפורמטיקה
Abbott GmbH, ויסבאדן, גרמניהסימוכין 09P3374משמש לכימות SCC-Ag בסרום
פלטפורמה מקוונתלא רלוונטימשמש לניתוח רצף RNA של תא בודד (single-cell RNA sequencing)
Sanli Medical Technology Development Co., Ltd., ליויאנג, חנאן, סיןלא סופק טקסט לתרגום. נא לספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם לעברית.משמש לאיסוף דם ורידי
IBM Corp.גרסה 26.0משמש לניתוח סטטיסטי; ניתוח סטטיסטי
קונסורציום STRINGגרסה 11.5משמש לניתוח רשתות אינטראקציה בין חלבונים; רשתות אינטראקציה בין חלבונים
חבילת Rגרסה 3.4משמש לניתוח הישרדות
חבילת Rגרסה 0.4.9משמש להצגת עקומות הישרדות
המכון הלאומי לסרטןhttps://www.cancer.gov/tcga; נגישה באוקטובר 2025RRID:SCR_003193; נתוני טרנסקריפטומיקה של סרטן
פלטפורמה מקוונתhttp://timer.cistrome.org; נגישה באוקטובר 2025RRID:SCR_018737; ניתוח חדירה חיסונית
דפדפן UCSC Xenahttps://xenabrowser.net; נגישה באוקטובר 2025משמש לאחזור נתונים מ-TCGA; אחזור נתונים מ-TCGA
פלטפורמה/כלי מקווןגרסה 1.0משמש להערכת חדירה של תאי מערכת החיסון
פלטפורמה מקוונתhttps://www.xiantaoxueshu.com; נגישה באוקטובר 2025משמש לאנליזות של ביטוי דיפרנציאלי, קורלציה, הישרדות ואבחנה

מקורות

  1. Bray F, et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2024;74(3):229-63.
  2. Sung H, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-49.
  3. Gadducci A, Tana R, Cosio S, Genazzani AR. The serum assay of tumour markers in the prognostic evaluation, treatment monitoring, and follow-up of patients with cervical cancer: a review of the literature. Crit Rev Oncol Hematol. 2008;66(1):10-20.
  4. Liu Z, Shi H. Prognostic role of squamous cell carcinoma antigen in cervical cancer: a meta-analysis. Dis Markers. 2019;2019:6710352.
  5. Tony V, et al. Role of squamous cell carcinoma antigen in prognostication, monitoring of treatment response, and surveillance of locally advanced cervical carcinoma. J Cancer Res Ther. 2023;19(5):1236-40.
  6. Sekhar PS, et al. A bird's-eye view of the wings apart-like protein in cell biology and implications for disease and therapeutics. OMICS. 2025;29(10):476-85.
  7. Oikawa K, et al. Expression of a novel human gene, human wings apart-like (hWAPL), is associated with cervical carcinogenesis and tumor progression. Cancer Res. 2004;64(10):3545-9.
  8. Kuroda M, et al. The human papillomavirus E6 and E7 inducible oncogene, hWAPL, exhibits potential as a therapeutic target. Br J Cancer. 2005;92(2):290-3.
  9. Lu X, Cui J, Fu M, Wang W. Human wings apart-like gene is specifically overexpressed in cervical cancer. Oncol Lett. 2016;12(1):171-6.
  10. Ohbayashi T, et al. Unscheduled overexpression of human WAPL promotes chromosomal instability. Biochem Biophys Res Commun. 2007;356(3):699-704.
  11. Oikawa K, et al. Expression of various types of alternatively spliced WAPL transcripts in human cervical epithelia. Gene. 2008;423(1):57-62.
  12. Gong P, et al. TAT-mediated si-hWAPL inhibits the invasion and metastasis of cervical cancer stem cells. Exp Ther Med. 2017;14(6):5452-8.
  13. Zhao Y, et al. Expression and clinical significance of FANCI gene in pan-cancer: a comprehensive analysis based on multi-omics data. Front Genet. 2025;16:1542888.
  14. Guo Q, et al. Integrated pan-cancer analysis and experimental verification of the roles of tropomyosin 4 in gastric cancer. Front Immunol. 2023;14:1148056.
  15. Zhao JW, et al. The role of the mitochondrial ribosomal protein family in detecting hepatocellular carcinoma and predicting prognosis, immune features, and drug sensitivity. Clin Transl Oncol. 2024;26(2):496-514.
  16. Chen N, Luan Y. Specific expression and common potential therapeutic drugs in different brain regions of major depressive disorder patients: bioinformatics analysis. J Affect Disord. 2025;382:478-87.
  17. Shi H, et al. Identification of hub genes for psoriasis and thyroid cancer using bioinformatics analysis. Discov Oncol. 2025;16(1):1460.
  18. Kumagai K, et al. WAPL induces cervical intraepithelial neoplasia modulated with estrogen signaling without HPV E6/E7. Oncogene. 2021;40(21):3695-706.
  19. Haarhuis JHI, et al. WAPL-mediated removal of cohesin protects against segregation errors and aneuploidy. Curr Biol. 2013;23(20):2071-7.
  20. Nunobiki O, Sano D, Hata S, Okunugi N. Clinical significance of hWAPL polymorphisms in the risk of cervical carcinogenesis. Hum Cell. 2018;31(2):149-53.
  21. Benedict B, et al. WAPL-dependent repair of damaged DNA replication forks underlies oncogene-induced loss of sister chromatid cohesion. Dev Cell. 2020;52(6):683-98.e7.
  22. van Schie JJM, de Lange J. The interplay of cohesin and the replisome at processive and stressed DNA replication forks. Cells. 2021;10(12):3455.
  23. Hirai H, et al. Small-molecule inhibition of Wee1 kinase by MK-1775 selectively sensitizes p53-deficient tumor cells to DNA-damaging agents. Mol Cancer Ther. 2009;8(11):2992-3000.
  24. Hirai H, et al. MK-1775, a small molecule Wee1 inhibitor, enhances anti-tumor efficacy of various DNA-damaging agents, including 5-fluorouracil. Cancer Biol Ther. 2010;9(7):514-22.
  25. Bridges KA, et al. MK-1775, a novel Wee1 kinase inhibitor, radiosensitizes p53-defective human tumor cells. Clin Cancer Res. 2011;17(17):5638-48.
  26. Swiecki M, Colonna M. The multifaceted biology of plasmacytoid dendritic cells. Nat Rev Immunol. 2015;15(8):471-85.
  27. Reizis B. Plasmacytoid dendritic cells: development, regulation, and function. Immunity. 2019;50(1):37-50.
  28. Del Prete A, et al. Dendritic cell subsets in cancer immunity and tumor antigen sensing. Cell Mol Immunol. 2023;20(5):432-47.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

סממן ביולוגי בנסיובחלבון hWAPLחדירה חיסוניתרשתות ביטוי משותףרגישות לתרופותקרצינומה של תאי קשקשתעקומת מאפייני הפעלה של מקלט
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.