מחטי מיקרו-פיזור משופרות על פני השטח של רמאן המגיבות לחמצון אדום למעקב אחר תגובות דיקור בחולדות עם פגיעה בסבילות לגלוקוז

סיכום

מחקר מודל עכברוש חקרני זה מציג מיקרו-מחט פעילה עם פיזור רמן משופר על פני שטח (SERS) לצורך התערבות סימולטנית בדיקור ומעקב רטורי של מדדי SERS הקשורים ליכולת חמצונית מקומית ופוטנציאל רדוקס בעכברים עם פגיעה בסבילות לגלוקוז.

תקציר

פגיעה בסבילות לגלוקוז (IGT) קשורה להפרעה בהומאוסטזיס רדוקס ולעלייה בלחץ חמצוני, אך מעקב דינמי בחיים אחר שינויים הקשורים לרדוקס במהלך התערבות דיקור סיני נותר מאתגר מבחינה טכנית. מחקר זה פיתח מערכת מיקרו-מחט פעילה עם פיזור רמאן (SERS) הרגישה ל-Redox, לצורך התערבות סימולטנית בדיקור סיני ומעקב יחסי של מדדי SERS הקשורים לפוטנציאל החמצון (OC) ו-RP (RP) בחולדות עם IGT. גשושי SERS רגישים לחמצון ורדוקס הוכנו על ידי פונקציונליזציה של ננו-קליפות זהב (GNS) עם p-פנילנדיאמין (p-PDA) לתגובה ל-OC ואנתראקינון לתגובה ל-RP, בהתאמה. הגשושים הועמסו לשני חריצים חרוטים על מחטי דיקור לבניית מיקרו-מחטים הפעילים ב-SERS. במחקר חקר זה נעשה שימוש בזכרים זכרים ללא פתוגנים ספציפיים מסוג Sprague–Dawley. שלוש חולדות שימשו כביקורת נורמלית, ו-20 חולדות קיבלו תזונה עתירה בשומן וקיבלו סטרפטוזוטוצין (STZ) לגרימת IGT. לאחר הסקר, 18 חולדות זכאיות ל-IGT חולקו לקבוצות דיאטה עתירה שומן ודיאטה נורמלית, כאשר 9 חולדות בכל קבוצת דיאטה. כל קבוצת דיאטה חולקה עוד יותר לסיבוב נקודות דיקור, סיבוב אתר ללא דיקור, ותת-קבוצות של סיבוב מיקום ישיר בנקודת דיקור, עם 3 חולדות בכל תת-קבוצה. הדקירה בוצעה פעמיים ביום במשך 7 ימים רצופים, ונרשמו רמות סוכר בצום (FPG), 2 שעות גלוקוז לאחר הארוחה (2hPG), ומדדי SERS הקשורים ל-OC ו-RP. התוצאות הראו כי דקירה בנקודות דיקור סיני עם סיבוב הייתה קשורה לערכי FPG ו-2hPG נמוכים יותר ולשינויים במדדי SERS הקשורים ל-OC ו-RP במודל IGT זה. מכיוון שעקומות כיול חיצוניות, מבחני מתח חמצוני ביוכימיים עצמאיים, בדיקות חליפת חמצון ובדיקות תאימות ביולוגית לא נכללו, יש לפרש את יחסי SERS כאינדקסים אופטיים יחסיים הקשורים לחמצון אדום ולא כריכוזים ביוכימיים מוחלטים או ערכי פוטנציאל רדוקס מוחלט. ממצאים אלו תומכים בהיתכנות של מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS כפלטפורמה חקרנית פרה-קלינית לשילוב התערבות דיקור עם מעקב SERS לפי יחס מקומי בעכברי IGT.

מבוא

פגיעה בסבילות לגלוקוז (IGT), ירידה ביכולת הגוף לסבול גלוקוז, מייצגת שלב מעבר בין רמת סוכר תקינה בדם לסוכרת¹. לכן, IGT הוא אות אזהרה מוקדמת מרכזי ושלב הפיך בהתפתחות סוכרת סוג^{2 2}. נתונים קליניים מראים שכ-30% מהאוכלוסייה עם IGT יתקדמו לסוכרת סוג 2 בתוך 5–10 שנים³; עם זאת, עם התערבות מהירה, ניתן להוריד אחוז זה לפחות מ-10%⁴.

IGT הוא תהליך דינמי ומורכב, וסביבה מתמשכת עם רמות גלוקוז גבוהות היא טריגר מרכזי להפרעות מטבוליזם חמצוני. כאשר הגוף נמצא במצב ממושך של היפרגליקמיה, שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית פועלת באופן לא תקין, וקצב ייצור מיני החמצן הפעיל עולה ב-30–50%, מה שמגביר ישירות את כוח החמצון בגוף⁶; במקביל, רמות סוכר גבוהות מעכבות את פעילות האנזימים המרכזיים, כגון גלוטתיון רדוקטאז, ומונעות ממערכת נוגדי החמצון להסיר מינים עודפים של חמצן פעיל בזמן ומפריעות עוד יותר לאיזון בין חמצון להפחתת. בנוסף, IGT מלווה בשינויים פתולוגיים, כולל עמידות לאינסולין ופגיעה קלה בתפקוד תאי β, מה שמוביל למגוון תגובות ביולוגיות וביוכימיות ^7,8. יחד עם התפתחות מצב החמצון האדום, שינויים אלה מחמירים עוד יותר את ההפרעה במטבוליזם של הגלוקוז ומגבירים את הסיכון הפוטנציאלי לסיבוכי סוכרת, כולל רטינופתיה, נפרופתיה^ומחלות לב וכלי ^דם. לכן, ניטור קיבולת חמצונית (OC) ופוטנציאל חימצון רדוקסיטיבי (RP) אצל יחידים או מודלים של בעלי חיים עם IGT צריך לשפר את הבנתנו את המנגנונים שמאחורי התפתחות IGT ולהנחות את עיצוב אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות.

לדיקור סיני היסטוריה של יותר מ-3,000 שנה והראה יעילות קלינית טובה בטיפול במחלות רבות¹¹. יתרה מזאת, מחקרים ניסיוניים רבים בבעלי חיים הראו כי דיקור סיני מפעיל השפעות חיוביות בוויסות מצבי לחץ חמצוני במודלים של בעלי חיים, על ידי חיזוק מערכת האנזימים נוגדי החמצון והפחתת פרוקסידציה של שומנים¹². כפרקטיקה רפואית סינית מסורתית, דיקור סיני הראה גם יתרונות משמעותיים בטיפול בסוכרת וב-IGT. נקודות דיקור גואניואן (CV4) וסאנינג'יאו (SP6) דווחו כמפעילות את מסלול SIRT1/PGC-1α בשריר השלד, ובכך מקלות את עמידות האינסולין של עכברים סוכרתיים להשמנה¹³. יתרה מזאת, נקודות דיקור טיאנשו (ST25) מווסתות את פעילות הנוירונים המעכבים את הגלוקוז הממוקמים באזור ההיפותלמוס הלטרלי ותורמות לויסות חילוף החומרים של הגליקוליפידים¹⁴. עם זאת, רוב המחקרים על מנגנוני הדיקור התוך-כלי התמקדו בעיקר במערכות הנוירומודולטוריות, האימונומודולטוריות ומערכת העיכול, שבהן דיקור עשוי להשפיע על מטבוליזם הגלוקוז באמצעות ויסות תפקוד אוטונומי או לווסת בעקיפין את רמות הגלוקוז בדם על ידי שיפור איזון הפלורה המעיים^15,16. המנגנון הספציפי של השפעת הדיקור בטיפול ב-IGT והשפעותיו על לחץ חמצוני חסר מחקר מעמיק ותמיכה בנתונים ניסיוניים.

פיזור רמאן משופר על פני השטח (SERS) מספק רגישות וספציפיות גבוהות, המאפשרים זיהוי מגוון רחב של אנליטים. ננו-פרובי SERS המבוססים על ננו-סיבים אופטיים¹⁷, ממברנות כיטוזן¹⁸, ומחקרים קודמים הראו כי מחטי דיקור¹⁹ יכולות לשמש לזיהוי סמנים ביולוגיים, נוירוטרנסמיטרים והיבטים נוספים של ביוכימיה תאית ב-vivo. מחטי דיקור, במיוחד, מהוות כלים מבטיחים לבדיקות רקמות עמוקות, המאפשרים ניטור מינימלי פולשני במקום ואחריו ניתוח אקס ויבו. דיקור, כשיטה טיפולית מבוססת, יש לה מגוון רחב מאוד של יישומים קליניים. מחקרים עדכניים הראו שסיבים אופטיים מופעלים על ידי SERS, תחבושות פצעים ומכשירי מיקרו-מחט יכולים לתמוך במעקב במקום או באופן מינימלי פולשני של אותות הקשורים לחמצון אדום בסביבות ביולוגיות רלוונטיות^20,21. במקביל, מחטי דיקור אקטיביות ב-SERS ומערכות מיקרו-מחט קשורות הפכו לנושאים מבטיחים לשילוב יכולת החישה עם התערבות רקמה¹⁹, מה שמוביל למיקרו-מחטים פעילות ב-SERS עם יכולת זיהוי SERS ב-in vivo ובתנאי SERS במבחנה.

המחקר הנוכחי מתבסס על אסטרטגיית מחטים מיקרו-פעילה ב-SERS שדווחה בעבר לזיהוי אותות הקשורים לפוטנציאל חמצון ופוטנציאל חמצון במודלים של לחץ מונע גלוקוז. עם זאת, העבודה הנוכחית שונה מהמחקר הקודם הן בהקשר הביולוגי והן במטרת הניסוי. באופן ספציפי, מחקר זה מיישם את פלטפורמת המחט המיקרו-פעילה של SERS על מודל חולדה של פגיעה בסבילות הגלוקוז ומשלב מעקב מקומי של SERS עם התערבות בדיקור סיני. המחקר הנוכחי משווה עוד נקודות דיקור לאתרים סמוכים שאינם דיקור, מעריך מניפולציות שונות של דקירות, ומנטר את מדדי SERS הקשורים לחמצון אדום במהלך תקופת התערבות בת 7 ימים. בהשוואה לסיבים אופטיים מבוססי SERS, תחבושות פצעים ומחטים מיקרו-פעילות ב-SERS שתוכננו בעיקר לזיהוי ביוכימי חד-אתר או יחיד, הפלטפורמה הנוכחית מספקת שתי התקדמות. ראשית, גשושים מגיבים ל-OC ו-RP משולבים בשני חריצים חרוטים עצמאיים על מחט דיקור אחת, המאפשרים ניטור בו-זמני של פרמטרי רדוקס משלימים במקביל. שנית, מחט הדיקור משמשת לא רק כנושאת גלאי SERS אלא גם כמכשיר טיפולי, המאפשר לבצע ניטור רדוקס במהלך התערבות בדיקור ולא לאחר הטיפול. כפי שמוצג באיור 1, לאחר שהמיקרו-מחטים הוכנסו לרקמות, נוצרים פצעים זעירים, והגלאים בשני החריצים מגיבים עם רקמות, מה שמאפשר להן לזהות רמות של OC ו-RP ב-vivo. מטרת המחקר הייתה להשתמש במחטים המיקרו-פעילות ב-SERS כדי לבחון שינויים ב-OC וב-RP בעכברים עם IGT ולקבוע את השפעות הדיקור התואם לנקודות דיקור בבעלי חיים אלו, ובכך להשיג תובנות חשובות לגבי מנגנון השפעות הדיקור בטיפול ב-IGT והקשר בין רדוקס למצבים היפרגליקמיים חריגים.

פרוטוקול

בעלי חיים ודגמים של IGT

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המכון למחקר סוז'ואו של אוניברסיטת דרום-מזרח (אישור מס' SEU-IACUC-20250318007) ובוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. העכברים נאספו והוחזקו בתנאי SPF (SPF) בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך. בהליכים שדרשו הרדמה, חולדות הורדמו באמצעות איזופלוראן שסופק בחמצן דרך תא השראה ונשמרו באמצעות קונוס אף. איזופלוראן שימש ב-3% לאינדוקציה ו-1% לתחזוקה, כאשר הריכוז הותאם בהתאם לקצב הנשימה ולתגובה הפרוצדורלית.

עומק ההרדמה המתאים אושר לפני דקירה או הזרקה בשל אובדן הרפלקס המתיישר והיעדר תגובה לצביטת האצבעות. במהלך ההרדמה, נבדקו דפוסי הנשימה, מיקום הגוף וההתאוששות, והחיות הונחו על כרית חימום לשמירת טמפרטורת הגוף. בעלי חיים היו מאוחסנים ב-2 בכל כלוב עם גישה חופשית למזון ולמים, אלא אם כן נדרשה צום לבדיקת סוכר. לאחר ההגעה, העכברים הסתגלו למשך שבוע לפני הכנסת המודלים. רווחת בעלי החיים נבדקה מדי יום, כולל פעילות כללית, טיפוח, צריכת מזון, משקל גוף, מצב אתר ההזרקה וההחלמה לאחר הרדמה. בסיום המחקר, חולדות הושמתו בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר. המתת חסד בוצעה באמצעות שאיפת CO₂ במילוי הדרגתי, ולאחר מכן אישור המוות באמצעות שיטת ניתוק צוואר הרחם. בעלי חיים שעמדו בקריטריונים של נקודת סיום אנושית, כולל ירידה חמורת במשקל, חוסר תנועה מתמשך, נשימה לא תקינה, חוסר יכולת לאכול או לשתות או מצוקה חמורה, הושמתו מיד במקום להישמר עד לנקודת הסיום המתוכננת. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי ספרג–דולי זכרים בדרגת חסרי פתוגנים ספציפיים במשקל 200 ± 20 גרם. לאחר שבוע של הסתגלות, חולקו החולדות באקראי לשתי קבוצות: שלושת העכברים בקבוצה הרגילה קיבלו אוכל רגיל, בעוד ש-20 החולדות בקבוצת המודל קיבלו אוכל עשיר בשומן (50% צ'או בסיסי + 10% שומן + 25% סוכרוז + 15% אבקת חלמון) במשך 3 שבועות. בעלי החיים בקבוצת המודל קיבלו הזרקה תוך-חוצפית של 20 מ"ג/ק"ג של תמיסת STZ של 2% (ממוססת ב-0.1 מול/ליטר, pH 4.4 בופר ציטראט) למשך 12 שעות, לאחר 12 שעות צום ללא הגבלת מים. אלו בקבוצה התקינה קיבלו הזרקה תוך-פריטוניאלית של המינון המתאים של תמיסת בופר ציטראט לאחר שקיבלו אוכל תקין. בדיקת סבילות לגלוקוז תוך-פריטוניאלי (IPGTT) בוצעה שבוע לאחר מכן. חומרים וציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

רמת סוכר בצום (FPG) נמדדה על ידי איסוף דם מקצה הזנב של חולדות בכל קבוצה לאחר 12 שעות צום ללא הגבלת מים, ו-2 שעות גלוקוז בדם לאחר הארוחה (2hPG) נרשמו לאחר הזרקה תוך-פריטונלית של 20% דקסטרוז 2 גרם לק"ג. בקבוצה התקינה, טווח ה-FPG היה 5.1–6.6 mmol/L, וטווח גלוקוז של 2hPG היה 7.3–9.4 mmol/L, לעומת FPG של ≤7.0 mmol/L וטווח של 2hPG של 10–16 mmol/L בקבוצת המודל. מבין 20 העכברים שהוקצו לאינדוקציה במודל IGT, 18 עמדו בקריטריוני IGT שהוגדרו מראש לאחר IPGTT ונכללו בניסוי ההתערבות הבא. שני חולדות הוצאו משום שערכי FPG או 2hPG שלהם היו מחוץ לטווח IGT שהוגדר מראש. 18 העכברים הזכאים חולקו באקראי לקבוצת תזונה עתירת שומן וקבוצת תזונה נורמלית, עם 9 חולדות בכל קבוצה. כל קבוצת דיאטה חולקה עוד לשלוש תת-קבוצות: סיבוב נקודות דיקור, סיבוב אתר ללא דיקור, והחדרה ישירה בנקודת דיקור, עם שלושה חולדות בכל תת-קבוצה. זהו מחקר פיתוח שיטה חקרני שנועד להעריך את היתכנות השילוב של התערבות דיקור עם מעקב רטורי מבוסס SERS במודל עכברוש IGT פרה-קליני. לא בוצע חישוב סטטיסטי פורמלי של עוצמה. גודל תת-הקבוצה של שלושה חולדות נבחר על בסיס היתכנות, מחקרים ראשוניים של SERS-מיקרו-מחטים, ועקרון הפחתת בעלי חיים. החולדות חולקו באקראי על ידי הניסוי; לא בוצעו הסתרה פורמלית של הקצאה ועיוורון.

פרוטוקולי הטיפול בדיקור סיני נבדקו בהתייחס להנחיות פרקטיקה קלינית מבוססת ראיות לרפואה הסינית המסורתית, ולהיתכנות ניסויים בבעלי חיים²². נקודות הדיקור שנבחרו היו ג'ונגוואן (RN12/CV12), שואייפן (RN9/CV9), יינג'יאו (RN7/CV7), טיאנשו הדו-צדדי (ST25), שואידאו דו-צדדי (ST28), ודו-צדדי זוסאנלי (ST36). RN12, RN9 ו-RN7 היו ממוקמים בקו האמצע הקדמי וטופלו כנקודות אמצע יחידות, בעוד ש-ST25, ST28 ו-ST36 טופלו דו-צדדית. זיווגי נקודות הדיקור התבססו על אלו ששימשו לטיפול קליני ב-IGT²³. ההתאמה התבססה על הספרות^24,25, תוך שימוש בשיטה הדיכוטומית. בעכברים, נקודות דיקור היו ממוקמות לפי נקודות ציון אנטומיות והמרה פרופורציונלית ממיקומי נקודות דיקור אנושיות סטנדרטיות. נקודות ה-RN/CV בבטן זוהו לאורך הקו האמצעי הקדמי באמצעות תהליך הזיפואיד, הטבור וסימפיזית הערווה כסימני דרך אנטומיים. ST25 סומן דו-צדדית ברמת הטבור, ו-ST28 סומן דו-צדדית באזור הבטן התחתונה באותו מרחק צידי מהקו האמצעי הקדמי. ST36 זוהה בגפה האחורית הקדמית באזור הקדמי של הטיביאליס, לטרלי לפקעת השוקה. אתרי השוואה סמוכים ללא דיקור סיני סומנו במרחק של 5 מ"מ לרוחב לנקודות האקווריום המתאימות ומחוץ לקו המרידיאן המוכר, תוך הימנעות מכלי דם נראים לעין, צלקות ואתרי ניקוב קודמים. לפני הדקירה, חולדות הורדמו באיזופלוראן בהתאם לפרוטוקול החי המאושר והונחו על השכיבה על כרית חימום. עור הבטן והגפה האחורית מעל כל אתר יעד גולח וחוטא ב-75% אתנול. מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS הוכנסו בערך בניצב לעור לעומק של כ-10 מ"מ. בקבוצות סיבוב נקודות הדיקור, מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS הוכנסו לנקודות האקוורט שנבחרו וסובבו בעדינות דו-כיווני במהלך תקופת החזקה של 20 דקות. עבור קבוצות שאינן אתרי דיקור, אותו הליך בוצע באתרי השוואה ללא דיקור באורך 5 מ"מ סמוכים. בקבוצות ההחדרה הישירה, מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS הוכנסו לנקודות הדיסיון והוחזקו למשך 20 דקות ללא סיבוב. כל הליכי הדירה בוצעו על ידי אותו מפעיל מיומן כדי למזער את השונות בין המפעילים.

הדקירה בוצעה פעמיים ביום, ב-10:00 וב-15:00, במשך 7 ימים רצופים. לפני כל הליך, נמדד FPG לאחר 8 שעות צום ללא הגבלת מים. לאחר כל הליך הדקירה, נרשמו תגובות OC ו-RP. ביום השביעי, לאחר טיפול בדיקור, בוצע IPGTT ונרשמו ערכי 2hPG.

אזהרות

סטרפטוזוטוצין מסוכן ויש לטפל בו כחומר כימי רעיל. הכינו את תמיסת הסטרפטוזוטוצין במכסה אדים כימי או בארון בטיחות ביולוגית מוסמך, תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות ניטריל, משקפי מגן ומסכה. יש לטפל במזרקים, מחטים, מגבונים, מצעים, כלובים ופסולת הקשורה לבעלי חיים בהתאם לנהלים מוסדיים לטיפול בפסולת ביולוגית וכימית מסוכנת. יש להשליך מיד מחטים ומזרקים משומשים למיכלי חדים עמידים לדקירה, ללא כיסוי מחדש.

ייצור מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS לזיהוי OC ו-RP

מחטי דיקור סיני הוכנו כפי שדווח קודם^{לכן 26}. מחטי מיקרו-פעילות ב-SERS יוצרו באמצעות אותו סוג של מחטי דיקור נירוסטה מסחריות (0.25 מ"מ × 26 מ"מ) לאורך כל המחקר. המחטים הוכנסו בערך בניצב לעור לעומק של 10 מ"מ. בקבוצות סיבוב, סיבוב ידני דו-כיווני בוצע בעדינות ובעקביות במשך 20 דקות במהלך תקופת ההחזקה על ידי אותו מפעיל מיומן. המניפולציה לא נשלטה על ידי מכשירים; לכן, תדירות הסיבוב המדויקת והמשרעת לא נמדדו. מגבלה זו הוכרה בדיון.

בהתחלה, המחטים הושרו בתמיסת PMMA של 20% (ללא ז) ב-MMA, ולאחר מכן ייבשו בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במשך יום אחד. לאחר מכן, נוצרו שתי שקעים מקבילים בגודל אחיד ובעלי צורה ועומק דומים בשכבת ההגנה של PMMA (במרחק 5 מ"מ) באמצעות להב סכין מלאכה קטן שנוקה; לאחר מכן, המחטים טבלו בחומצה גופרתית בעומק 0.5 מטר, ששימשה כאלקטרוליט במשך 10 שניות לעבור חריטה אלקטרוכימית במתח של 12 וולט, וכך נוצרו שני חריצים כמעט מעגליים באתרי הניקוד. שלישית, לאחר שטיפה בשלוש הזדמנויות, המחטים טבלו בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות בתמיסת אתנול המכילה 0.1 mol L⁻¹ MPTES ו-0.3 mol L⁻¹ APTES, ובכך העניקה פונקציונליות סולפידריל למשטחים החריציים. רביעית, הציפוי הוסר על ידי טבילת המחט לתוך MMA. מחטים מיקרו-פעילות עם פוטנציאל רדוקס עם SERS הוכנו על בסיס שיטה שדווחה קודם^{לכן 27}. מצע ה-SERS נספג על אחד החריצים החרוטים של כל מחט דיקור, ולאחר מכן הוטבלו המיקרו-מחטים הפעילים ב-SERS בתמיסת p-PDA מימית בריכוז של 1 ×-^10-4 מול/ליטר למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מה שהוביל למחטים מיקרו-פעילות עם חמצון. סובסטרטים של SERS המבוססים על ננו-קליפות זהב סונתזו כפי שתואר^{קודם 28}. בעבודה הנוכחית, מחטים אלו נטפטו אל החריץ השני של כל מחט דיקור, ואז נותרו להתייבש באופן טבעי. זה הניב מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS עם תגובת OC ו-RP.

הערכה מחוץ לחיים של OC ותגובת RP למחטים מיקרו-פעילות ב-SERS

תגובות ה-OC וה-RP הוערכו על ידי החדרת מחטי המיקרו-פעילות ב-SERS לרקמת ex vivo . כדי לבדוק את תגובתות הגשוש החיצוני לשינויים חמצניים, נרשמו ספקטרום SERS של p-PDA לפני ואחרי החמצון. ספקטרום של גשושי SERS רדוקס נרכשו גם בתמיסת_{NaBH 4} עם הפחתת חזקה ותמיסת HAuCl₄ מחמצנת בעוצמה. הסלקטיביות של גלאי ה-OC הוערכה באמצעות סוכנים מפזרים, כולל 1 × ^10-4 M FeSO₄, 1 × ^10-4 M Na₂SO₄, ו-1 × ^10-4 M חומצה אסקורבית, וכן סוכנים מחמצנים, כולל 1 × ^10-4 M CuSO₄, 1 × ^10-4 M H₂O₂, 1 × ^10-4 M FeCl₃, ו-1 × ^10-4 M HAuCl₄. כל התמיסות הוכנו ב-20 mM PBS (pH 7.4), והגלאים הוגדרו עם כל תמיסה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עמידות המחטים המיקרו-פעילות ב-SERS הוערכה על ידי רישום תגובות OC לפני ואחרי תגובה עם 1 × ^10-4 mol/L FeCl₃ בטמפרטורת החדר. בדיקות אקס ויבו ובדיקות מבוססות פתרון שימשו לאישור תגובתיות הגשוש בתנאים מבוקרים. עם זאת, הם אינם משחזרים במלואם את המורכבות של מיקרו-סביבת הרקמות ב-in vivo , שבה שונות מקומית ב-pH, ספיגת חלבונים, רכיבי מטריצה חוץ-תאית וחומרים ביולוגיים אחרים עשויים להשפיע על אותות SERS. לכן, קריאות ה-OC וה-RP ב-in vivo פורשו כמדדי SERS יחסיים הקשורים לחמצון אדום ולא כמדידות ביוכימיות בלתי תלויי מטריצה.

זיהוי OC ו-RP באתרים של דיקור סיני וללא דיקור

כדי להעריך את ביצועי ה-OC וה-RP בנקודות דיקור סיני ונקודות שאינן דיקור, הוכנסו מחטי המיקרו-פעילות ל-SERS לחולדות בריאות בנקודות הדיקור ST36 ו-RN12, ובעומק של כ-10 מ"מ לאורך זמן זה.

השפעות סיבוב המחטים על זיהוי OC ו-RP

כדי להעריך את התגובה של גשושי ה-OC וה-RP בטכניקות דקירה שונות, הוכנסו מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS לנקודות הדיקור ST36 ו-RN12 ו-5 מ"מ סמוכות לנקודות אלו בחולדות בריאות לעומק של כ-10 מ"מ. בכל נקודת דיקור, מחט אחת סובבה, בעוד שהמחט הסמוכה לנקודה לא סובבה, ולהפך (מחט סמוכה לנקודת דיקור סיני סובבה, בעוד שהמחט המקבילה בנקודת הדיקור לא סובבה). אותות SERS מהגשושים נאספו באותו זמן החדרה לכל מחט.

שינויים ב-OC וב-RP אצל חולדות עם IGT ביחס לנקודות דיקור, סיבוב מחטים ותנאי תזונה

כדי להעריך את השפעות נקודות הדיקור, סיבוב המחטים ותנאי התזונה על OC ו-RP של חולדות עם IGT, חולדות בקבוצת הדיאטה עתירת השומן חולקו באקראי לשלוש קבוצות (A1, A2 ו-A3; שלושה חולדות בכל קבוצה), כמו גם אלו שבקבוצת התזונה התקינה (קבוצות B1, B2 ו-B3; שלוש חולדות בכל קבוצה). לחולדות בקבוצות A1 ו-B1, מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS הוכנסו לנקודות דיקור לאחר ההרדמה וסובבו במשך 20 דקות; אותו הליך בוצע עבור חולדות בקבוצות A2 ו-B2, פרט לכך שהמחטים המיקרו-הוכנסו 5 מ"מ סמוך לנקודות הדיקור. בעכברים ב-A3 ו-B3, המחטים המיקרו-פעילות ב-SERS הוכנסו לנקודות דיקור בעכברים ללא סיבוב; המחטים נשארו במקום למשך 20 דקות. הדקירה בוצעה פעמיים ביום, בשעה 10:00 ו-15:00, במשך 7 ימים. לפני כל פרוצדורה יומית, מד סוכר שימש לרישום ערכי FPG לכל קבוצת חולדות (לאחר צום אך ללא הגבלת מים למשך 8 שעות). לאחר כל יום של דקירות, תגובות OC ו-RP נמדדו ונרשמו. ביום השביעי, לאחר הדיקור, בוצע IPGTT על כל קבוצת חולדות, ונרשמו ערכי 2hPG.

אפיון ומדידה

המורפולוגיה של מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS נבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM). ספקטרום SERS נרכש בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, באמצעות ספקטרומטר רמאן שהוגדר עם מטרה לטווח עבודה ארוך של 50× (NA: 0.5) ולייזר בקוטר 785 ננומטר. לכל המדידות, זמן הרכישה היה 10 שניות, ומערכת רמאן הופעלה בהגדרת הספק לייזר נומינלית של 600 מיקרווואט באותה תצורה אופטית. עוצמת הלייזר בפועל שהועברה על פני הרקמה לא נמדדה ישירות במחקר זה. לכן, ספקטרום ה-SERS שימש להשוואות יחסיות בין קבוצות תחת הגדרות רכישה זהות, ולא הוסקו מסקנות לגבי בטיחות פוטותרמית מוחלטת של הרקמות. יחסי העוצמה של שני גשושי SERS חושבו בגישה הבאה: יחס העוצמה ב-1450 ס"מ⁻¹ ליחס של 1500 ס"מ−1 ליחס של 1500 ס"מ⁻¹ הוגדר כאינדיקטור ל-OC (I₁₄₅₀ ס"מ⁻¹/I₁₅₀₀ ס"מ⁻¹), לאחר חיסור העוצמה ב-1700 ס"מ⁻¹ (כרקע) מכל אחד משני הפסגות, בהתאמה, כמו בדיווחים קודמים, ¹⁷; ובשימוש_{ב-I 1606} ס"מ⁻¹/I₁₆₆₆ ס"מ⁻¹ כאינדיקטור ל-RP, הפחתה העוצמה ב-1700 ס"מ⁻¹ (כרקע) מכל אחד משני הפסגות, בהתאמה. הערכים המחושבים_{I 1450} ס^"מ−1/I₁₅₀₀ ס"מ⁻¹ ו-I₁₆₀₆ ס"מ−1/I₁₆₆₆ ס"מ⁻¹ נותחו כאינדקסטרים יחסיים שמקורם ב-SERS של תגובות הקשורות ל-OC ו-RP, בהתאמה. יחסים אלו שימשו להשוואת שינויים בין קבוצות ונקודות זמן תחת הגדרות רכישה זהות.

לא נקבעה עקומת כיול חיצונית במחקר הנוכחי להמרת יחסים אלו לריכוזים מוחלטים של מינים חמצוניים או לערכי פוטנציאל רדוקסיט אלקטרוכימיים מוחלטים. כל ספקטרום נרשם פעמיים בחמש נקודות שונות על גשושית SERS בשלוש דגימות משוחזרות. Origin שימש לעיבוד נתונים וליצירת תרשימים. כדי למזער שונות הקשורה לרכישה, הוחל על כל הקבוצות, אותו אורך גל לייזר, יעד, זמן רכישה, הגדרת עוצמת לייזר ועיבוד ספקטרלי. השפעות פוטותרמיות או פוטוכימיות הנגרמות על ידי הקרנת לייזר לא נמדדו באופן עצמאי ומוכרות כמגבלה. הנתונים הסטטיסטיים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). גודל המדגם והמבחן הסטטיסטי ששימש לכל ניסוי או לוח איור מוגדרים באגדות האיורים המתאימים. בניסויי אימות גלאי ex vivo שימשו בדשא SERS או במחט מיקרו-מוכנה באופן עצמאי כיחידת ניתוח. לניתוחי גלוקוז דם ומדדי SERS ב-in vivo , נעשה שימוש בעכבר כיחידת ניתוח ביולוגית. ספקטרום שנאספו ממספר נקודות על אותו גשוש טופלו כמדידות טכניות וממוצעו לפני ניתוח ברמת הקבוצה. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת SPSS. השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחנים סטטיסטיים שצוינו באגדות האיורים המתאימים. מדידות סוכר בדם בצום סדרתי ומדד SERS במהלך תקופת ההתערבות של 7 ימים פורשו כמגמות אורך חקרניות בשל גודל תת-הקבוצה הקטנה, ולא יושם מודל פורמלי של מדידות חזרות או השפעות מעורבות. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

תוצאות

ייצור מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS לזיהוי OC ו-RP

כדי לזהות שינויים ב-OC וב-RP, יוצרו מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS המכילות את הגשושים המתאימים. תמונות SEM מייצגות אישרו את המבנה הדו-חריצי של המחטים המיקרו-פעילות ב-SERS. איור 2A מציג את גוף מחט הדיקור עם שני חריצים חרוטים, איור 2B מציג חריץ טעון ב-GNS, ואיור 2C מציג תצוגה מורחבת של GNS המפוזר בתוך החריץ. תמונות אלו אישרו כי החריצים החרוטים יכולים לשמש כאתרי טעינה מקומיים עבור גשושי SERS המגיבים ל-OC ו-RP. יחס עוצמות השיא I₁₄₅₀ ס"מ⁻¹/I₁₅₀₀ ס"מ⁻¹ שימש לייצוג מידת החמצון של p-PDA. איור 3A מציג ספקטרום SERS של p-PDA לפני ואחרי אינטראקציה עם 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃, בעוד שאיור 3B מציג ספקטרום עבור גלאי החמצון הרדוקסי בתמיסות מימיות של 1 × 10⁻³ M NaBH4 ו-1 × 10-4 M HAuCl₄. תגובת הגשוש ה-RP הובאה כיחס עוצמה שיא (I₁₆₀₆ ס"^מ-1/I₁₆₆₆ ס"^מ-1), שירד עם עלייה ב-RP.

כדי להעריך את הסלקטיביות של הגלאי המגיב לקיבולת החמצון, נמדד יחס I₁₄₅₀ ס"מ⁻¹/I₁₅₀₀ ס"מ-1 לאחר חשיפה לסוכנים מפחיתים ומחמצנים שונים. מדידות גלאי עצמאיות בוצעו עם n = 3 לכל קבוצה, וגלאי SERS או מחט מיקרו-מוכנה באופן עצמאי שימשו כיחידת ניתוח (איור 3C). בהשוואה לקבוצת CK (מבחן Kruskal–Wallis ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דאן), החומרים המפחיתים FeSO₄ ו-Na₂SO₄ לא שינו משמעותית את יחס I₁₄₅₀ ס"מ⁻¹/_{I 1500} ס"מ⁻¹ (p > 0.05). חומצה אסקורבית (AA, p < 0.001) גם יצרה יחס מוגבר בתנאי הבדיקה הנוכחיים, למרות שנכללה כסוכן מפחית. לכן, תגובת ה-AA פורשה בזהירות כתגובה ספקטרלית ספציפית לבדיקה מבוססת תמיסה זו ולא כהוכחה להתנהגות מחמצנת. לעומת זאת, מגיבים מחמצנים או קשורים לחמצון הגדילו את היחס במידה משתנה. היחס עלה לאחר החשיפה ל-CuSO₄ (p < 0.0001), H₂O₂ (p < 0.0001), FeCl₃ (p < 0.0001) ו-HAuCl₄ (p < 0.0001). כדי להעריך את יציבות הגשוש ה-OC בטמפרטורת החדר, נרכשו ספקטרום SERS במרווחי שעה במשך 6 שעות לפני תגובת הגלאי עם 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃ (איור 3D). וחושבו יחסי I₁₄₅₀ ס"מ⁻¹/I₁₅₀₀ ס"מ-1 המקבילים. לאחר ספיחת הגששים, הערך ההתחלתי נשאר יציב בסביבות 0.20 ± 0.02, כמו גם בתגובה עם FeCl₃ בסביבות 0.9 ± 0.10, במהלך תקופת 6 השעות. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-p-PDA על GNS יציב באוויר.

תגובות OC ו-RP בנקודות דיקור סיני וללא דיקור סיני

מחקרים קודמים,²⁹ , הראו כי הגשוש החיצוני משיג את תגובתו המרבית 10 דקות לאחר ההחדרה. איורים 4A ו-B ממחישים את תגובת מחטי המיקרו-פעילות ב-SERS בעכברים בריאים המונחים בנקודות הדיקור ST36 ו-RN12, וכן באלו הממוקמים במרחק 5 מ"מ סמוך לנקודות, למשך 10 דקות. לניסויים אלו, n = 3 חולדות לכל קבוצה, וספקטרום שנאסף מנקודות שונות על אותו גלאי טופלו כרפליקציות טכניות והוערכו בממוצע לפני ניתוח ברמת הקבוצה. המיקרו-מחטים הפעילות ב-SERS הגיבו ביעילות לשינויים ב-OC וב-RP ב-vivo, ללא הבדל משמעותי ב-OC וב-RP בקבוצת נקודות הדיקור ביחס לקבוצת הנקודות הלא-דיקוריות (מבחן t-מדגימות עצמאיות, p > 0.05).

כדי לקבוע עוד יותר את השפעות סיבוב המחטים על ה-OC וה-RP המקומיים ב-vivo, הוכנסו מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS לחולדות בריאות בנקודות הדיקור ST36 ו-RN12, ו-5 מ"מ מעבר לנקודות אלו, לעומק של 10 מ"מ. במהלך תמרון הסיבוב בכל נקודת דיקור, המחט הסמוכה לנקודה נפתחה, ולהפך, ותועדו שינויים בערכי OC ו-RP בנקודת הדקירה (איורים 4C–F). לא היו שינויים משמעותיים ב-OC וב-RP בהתאם לשאלה האם הסיבוב בוצע בנקודות דיקור סיני או בנקודות שאינן דיקור בחולדות בריאות, וגם לא הייתה השפעה של סיבוב בנקודה סמוכה (p > 0.05).

שינויים ב-OC וב-RP בעכברים עם IGT הקשורים לדיקור, סיבוב מחטים ותנאי תזונה

כדי לאשר את הקמת מודל העכברוש המוצלח של IGT, נרשמו ערכי FPG ו-2hPG באמצעות מבחן IPGTT בעכברי מודל וביקורת, בהתאמה. קבוצת הביקורת כללה n = 3 חולדות, וקבוצת המודל כללה n = 18 חולדות שעמדו בקריטריונים שהוגדרו מראש לסבילות לקויה בגלוקוז. חולדות המודל הראו רמות סוכר גבוהות יותר בצום מאשר חולדות הביקורת (6.92 mmol/L לעומת 5.54 mmol/L; בדיקת Mann–Whitney U, p < 0.01) וגלוקוז דם גבוה יותר ב-2 שעות לאחר הארוחה מאשר חולדות ביקורת (11.52 mmol/L לעומת 7.92 mmol/L; מבחן Mann–Whitney U, עמוד < 0.001) (איור 5), המצביע על השראה מוצלחת של IGT בבעלי החיים המודגמים.

כדי לאמת את השפעות השילוב של נקודות דיקור, סיבוב מחטים ותנאי תזונה על חולדות IGT, נבחר סט טיפוסי של זוגות נקודות דיקור. 18 חולדות המודל הזכאים חולקו לאחר מכן לקבוצות דיאטה עתירה בשומן ודיאטה נורמלית, כאשר n = 9 חולדות לכל קבוצת דיאטה. כל קבוצת תזונה חולקה לשלוש תת-קבוצות התערבות: סיבוב נקודות דיקור, סיבוב אתר ללא דיקור, והחדרה ישירה לנקודת דיקור, כאשר n = 3 חולדות לכל תת-קבוצה. ערכי FPG נרשמו לפני כל יום דקירה (איורים 6A–C), וערכי 2hPG (איור 6D) נמדדו לאחר 7 ימי דקירה באמצעות בדיקת IPGTT בכל קבוצה. במאגר נתונים חקרני זה, לא נצפה הבדל ברור ב-FPG או ב-2hPG בין קבוצות מודל הדיאטה עתיר השומן לדיאטה נורמלית לאחר דקירה בנקודות דיקור. השוואות בין דיקור בנקודת דיקור לבין דיקור לא במיקום דיקור סיני הצביעו על כך שסיבוב נקודות דיקור היה קשור לערכי גלוקוז בדם נמוכים יותר בתנאים הניסיוניים הנוכחיים (בדיקות t דגימות עצמאיות, p < 0.05). מכיוון שגודל תת-הקבוצה היה קטן ולא ניתן היה להפריד סטטיסטית את התזונה, מיקום נקודת האקספינה ומניפולציית הסיבוב, ממצאים אלו פורשו כתצפיות ראשוניות של מודל בעלי חיים.

שינויים במדדי SERS הקשורים לקיבולת חמצונית ושל פוטנציאל רדוקציה נבדקו במהלך שבוע של התערבות דיקור סיני בעכברי IGT. לניתוחים אלו, n = 3 חולדות נכללו לכל תת-קבוצה, וכל עכברוש טופל כיחידת ניתוח ביולוגית. בחולדות עתירות שומן, מדד ה-SERS הקשור לקיבולת החמצונית ירד עם הזמן בקבוצות סיבוב נקודות הדיקור וסיבוב ישיר לנקודת הדיקור, בעוד שבקבוצת הסיבוב ללא מיקום דיקור סיני נשאר גבוה יחסית (איור 7A). מדד ה-SERS הקשור לפוטנציאל רדוקס עלה עם הזמן בקבוצות סיבוב נקודות דיקור וסיבוב ישיר לנקודת הדיקור, בעוד שקבוצת סיבוב אתר הלא דיקור הראתה עלייה חלשה יחסית (איור 7B). מגמות דומות נצפו בעכברי IGT עם תזונה רגילה. מדד ה-SERS הקשור לקיבולת החמצונית ירד עם הזמן בקבוצות סיבוב נקודות הדיקור ובהחדרה ישירה לנקודת הדיקור, עם שינוי קטן יותר בקבוצת הסיבוב שאינו אתר דיקור (איור 7C). מדד ה-SERS הקשור לפוטנציאל רדוקס עלה עם הזמן בקבוצות סיבוב נקודות דיקור וכניסה ישירה לנקודת הדיקור, בעוד שקבוצת הסיבוב הלא-דיקורי נותרה נמוכה יחסית (איור 7D).

כדי להשוות עוד את תנאי התזונה תחת אותה שליטה בדיקור, הושוו תת-הקבוצות של סיבוב נקודות הדיקור מקבוצות הדיאטה עתירה השומן והדיאטה הנורמלית. בהשוואה זו, מדד ה-SERS הקשור לקיבוצי חמצון ירד עם הזמן בשני מצבי התזונה, עם ירידה גדולה יותר שנצפתה בתת-הקבוצה של סיבוב נקודות דיקור דיקור דיקור רגיל ביום השביעי (איור 7E). מדד ה-SERS הקשור לפוטנציאל רדוקס עלה עם הזמן בשני תנאי הדיאטה, עם ערך גבוה יותר ביום השביעי בתת-הקבוצה של סיבוב נקודות דיקור דיני רגיל (איור 7F). ממצאים אלו מצביעים על כך שסיבוב נקודות דיקור ונרמול תזונה היו קשורים לשינויים במדדי SERS הקשורים לחמצון רדוקסי מקומי בעכברי IGT. מכיוון שכל תת-קבוצה כללה רק שלושה חולדות ולא בוצעו בדיקות עומס חמצוני ביוכימיות עצמאיות, יש לפרש תוצאות אלו כתצפיות חקרניות במודלים של בעלי חיים ולא כראיות ביוכימיות חד-משמעיות לשיפור בלחץ חמצוני.

זמינות נתונים:

כל הנתונים הגולמיים המספריים המשמשים ליצירת איורים וניתוח סטטיסטי, כולל מדידות סוכר בדם, ערכי יחס שמקורם ב-SERS, ונתוני מקור לפאנלים כמותיים, אורגנו והועלו בטבלה משלימה 1. לניסויי ניטור רציפים שנוצרים ישירות על ידי המכשיר האנליטי, הערכים המיוצאים והפלטים המייצגים שנוצרו על ידי המכשיר המשמשים להערכת ביצועי הגשוש נכללים בקובץ המשלים 1.

איור 1: תהליך עבודה מתודולוגי להתערבות דיקור סיני ומעקב מקומי של SERS ביחס מדורג באמצעות מחט מיקרו-פעילה ב-SERS עם חריץ כפול. הסכימה ממחישה החדרת המחט המיקרו-פעילה בשתי חריצים ב-SERS לנקודת דיקור סיני או לאתר סמוך שאינו דיקור, ואחריה רכישת ספקטרלית של רמאן. המחברים יצרו את הדמות הזו באמצעות תוכנת WPS, ואין צורך ברישיון זכויות יוצרים. קיצורים: SERS = פיזור רמאן מוגבר על פני השטח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: תמונות SEM מייצגות של מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS. (א) גוף מחט דיקור סיני עם שני חריצים; מוט סולם = 200 מיקרון; הגדלה = 77×. (B) חריץ משולב עם GNS; פס קנה מידה = 20 מיקרון; הגדלה = 1,000×. (ג) תמונה מוגדלת של החריץ ב-B; פס סולם = 2 מיקרון; הגדלה = 30,000×. קיצורים: SEM = מיקרוסקופ אלקטרונים סורק; GNS = ננו-קליפות זהב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: אפיון של גשושי SERS מגיבים ל-OC ו-RP. (א) ספקטרום מנורמל של p-PDA לפני ואחרי אינטראקציה עם FeCl₃. (B) ספקטרום SERS מנורמלים של גשושי RP בפתרונות של NaBH₄ ו-HAuCl₄, בהתאמה. (C) יחס I₁₄₅₀ ס^"מ−1/I₁₅₀₀ ס"מ⁻¹ עבור גלאי OC בתמיסות שונות של חמצון וחיזור. n=3 מדידות גלאי עצמאיות לכל קבוצה. מבחן קרוסקל–ווליס ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דאן מול קבוצת CK. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). (D) הערכת יציבות של שש שעות של הגשוש המגיב ל-OC לפני ואחרי תגובה עם FeCl₃. קיצורים: SERS = פיזור רמאן משופר על פני השטח; CK = בדיקת בקרה; p-PDA = p-פנילנדיאמין; AA = חומצה אסקורבית. עמוד < 0.001, ****p < 0.0001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: מדדי SERS הקשורים ל-OC ו-RP שנמדדו בשיטות דיקור שונות באתרים של דיקור סיני ולא דיקור בחולדות בריאות. (א) מדד SERS הקשור ל-OC לאחר החדרה ישירה בנקודות דיקור סיני ובאתרים סמוכים שאינם דיקור. (B) מדד SERS הקשור ל-RP לאחר החדרה ישירה בנקודות דיקור סיני ובאתרים סמוכים שאינם דיקור. (ג) מדד SERS הקשור ל-OC לאחר החדרה ישירה באתרים שאינם דיקור סיני וסיבוב מחט בנקודות דיקור. (D) מדד SERS הקשור ל-RP לאחר החדרה ישירה באתרים שאינם דיקור וסיבוב מחט בנקודות דיקור. (ה) מדד SERS הקשור ל-OC לאחר החדרה ישירה בנקודות דיקור וסיבוב מחט באתרים סמוכים שאינם דיקור. (F) מדד SERS הקשור ל-RP לאחר החדרה ישירה בנקודות דיקור וסיבוב מחט באתרים סמוכים שאינם דיקור. OC חושב_{כ-I 1450 ס"}^מ-1/I_{1500 ס"}^מ-1, ו-RP חושב_{כ-I 1606 ס"}^מ-1/I_{1666 ס"}^מ-1. n=3 לכל קבוצה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. לא נצפו הבדלים מובהקים בין ההשוואות הזוגיות. קיצורים: OC = קיבולת חמצון; RP = פוטנציאל רדוקס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: ערכי FPG ו-2hPG לפי מבחן IPGTT בעכברי מודל ושליטה (CK). FPG ו-2hPG נמדדו כדי לאמת את הקמת מודל העכברים עם סבילות לקויה לגלוקוז. n = 3 חולדות בקבוצת הביקורת ו-n = 18 חולדות בקבוצת המודל. הניתוח הסטטיסטי בוצע במבחן Mann–Whitney U, והתוצאות מוצגות כממוצע ± SEM. **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: ערכי FPG ו-2hPG עבור חולדות IGT במהלך הליכי דיקור . (A) ערכי FPG לקבוצה המקבלת דיקור סיני עם סיבוב מחט בנקודות דיקור והכנסת מחט ישירה בנקודות דיקור (n = 3 לכל קבוצה). (B) ערכי FPG לקבוצה שמקבלת דקירה עם סיבוב בנקודות דיקור סיני ונקודות שאינן דיקור (n = 3 לכל קבוצה). (C) ערכי FPG עבור קבוצות דיאטה עתירת שומן ודיאטה רגילה (n = 3 לכל קבוצה). (D) יום 7 ערכי 2hPG בעכברים עם דיאטה עתירת שומן וחולדות דיאטה רגילה תחת תנאי סיבוב נקודות דיקור, סיבוב אתר ללא דיקור סיני, והכנסה ישירה בנקודות דיקור. (n = 3 לכל קבוצה). התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM. השוואות נקודות קצה מתוכננות בפאנל D נותחו באמצעות מבחן t דו-זנבי לא מזווג. *עמוד < 0.05. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: שינויים ב-OC וב-RP של חולדות בכל קבוצה במהלך שבוע של דיקור. (א) שינויים ב-OC בעכברי IGT בתזונה עתירה שומן. (ב) שינויים ב-RP בעכברי IGT בתזונה עתירה שומן. (ג) שינויים ב-OC בעכברי IGT בתזונה רגילה. (ד) שינויים ב-RP בעכברי IGT תזונתיים רגילים. (ה) השוואת מדד SERS הקשור ל-OC בין מצב תזונה עתירת שומן למצב תזונה רגילה בתוך תת-הקבוצה של סיבוב נקודות הדיקור; (ו) השוואת מדד SERS הקשור ל-RP בין מצבים של תזונה עתירת שומן למצב תזונה רגילה בתוך תת-הקבוצה של סיבוב נקודות הדיקור. n = 3 חולדות לכל תת-קבוצה. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SEM. מדידות סדרתיות פורשו כמגמות אורך חקרניות. קיצורים: OC = קיבולת חמצון; RP = פוטנציאל רדוקס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קובץ משלים 1: פלטים מייצגים שנוצרו על ידי מכשירים להערכת תגובת חקירה. קובץ זה מכיל פלטי ניטור רציף מייצגים שנוצרים ישירות על ידי המכשיר האנליטי ומשמשים להערכת ביצועי תגובת הגשושים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 1: טבלת נתונים גולמיים לניתוחים כמותיים. קובץ זה מכיל את נתוני המקור המספריים המשמשים ליצירת נתונים וניתוח סטטיסטי, כולל מדידות סוכר בדם, ערכי יחס שמקורם ב-SERS, ונתוני לוחות איור כמותיים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

פגיעה בסבילות לגלוקוז מייצגת שלב מעבר הפיך לפני סוכרת סוג 2 והיא קשורה קשר הדוק לחוסר איזון מטבולי, עמידות לאינסולין ולדיסרגולציה הקשורה ללחץ חמצוני. התערבות באורח החיים ואסטרטגיות טיפוליות מוקדמות אחרות יכולות להפחית את הסיכון להתפתחות מפגיעה בסבילות הגלוקוז לסוכרת, אך כלים למעקב דינמי אחר תגובות ביוכימיות מקומיות במהלך ההתערבות מוגבלים³⁰. דווח כי דיקור סיני משפיע על מטבוליזם הגלוקוז ועל מסלולים הקשורים ללחץ חמצוני במחקרים ניסיוניים וקליניים. עם זאת, רוב המחקרים המכניסטיים של דיקור סיני מסתמכים על מדידות דם או רקמות בקצה הנקודה, ומעט מאוד שיטות מאפשרות מעקב מינימלי פולשני אחר תגובות מקומיות הקשורות לחמצון אדום במהלך התערבות בדיקור. ניסויים קליניים קודמים של טיפולים ל-IGT אישרו כי הסיכון לסוכרת יכול להיות מופחת במידה רבה באמצעות התערבויות באורח החיים, כולל שינויים בתזונה, הפחתת מסת הגוף והגברת^{הפעילות} הגופנית. דיקור סיני הוכח כיעיל בשיפור מדדי המטבוליזם של הגלוקוז ובהורדת צום ו-2hPG. לכן, הבהרת הקשר בין דיקור, רדוקס ו-IGT עשויה לספק גישות להפוך את IGT או להתערבות בהתקדמותה, ובכך להפחית את שכיחות הסוכרת, וכן לספק תובנות לפתולוגיה של IGT ולמנגנונים העומדים מאחורי התפתחותו.

המחקר הנוכחי מציע פלטפורמת מיקרו-מחט אקטיבית עם חריץ כפול, רגישה לחמצון רדוקסי, משופרת על פני שטח עם פיזור רמן, לשילוב התערבות דיקור עם מעקב מקומי של SERS במודל חולדה של פגיעה בסבילות לגלוקוז. במערכת זו, שני חריצים חרוטים על מחט דיקור אחת שימשו לנשיאת גשושים מגיבים לקיבולת חמצונית ומגיבות לפוטנציאל רדוקס. עיצוב זה אפשר למחט הדיקור לפעול לא רק ככלי התערבות אלא גם כנושא חישה לקריאות אופטיות מקומיות הקשורות לחמצון אדום. התוצאות הראו כי דקירה בנקודות דיקור סיני עם סיבוב הייתה קשורה לרמות רמות סוכר בצום ולערכי 2hPG נמוכים יותר, וכן לשינויים במדדי SERS הקשורים לקיבוצי חמצון ופוטנציאל רדוקוז בעכברים עם סבילות לקויה לגלוקוז. ממצאים אלו תומכים בהיתכנות השימוש במחטים מיקרו-פעילות ב-SERS לחקירת תגובות מקומיות הקשורות לחמצון אדום במהלך התערבות בדיקור. בסך הכול, התוצאות מצביעות על כך שדיקור בנקודות דיקור סיני עם סיבוב היה קשור לערכי FPG ו-2hPG נמוכים יותר ולשינויים במדדי SERS הקשורים ל-OC ו-RP בעכברי IGT. ממצאים אלו תומכים בהיתכנות השימוש במחטים מיקרו-פעילות ב-SERS למעקב אחר תגובות אופטיות מקומיות הקשורות לחמצון אדום במהלך התערבות בדיקור. עם זאת, מאחר שלא בוצעו בדיקות מתח חמצוני ביוכימיות סטנדרטיות, ניתוח חליפת פרוב-ליצ'ינג ובדיקות תאימות רקמה, השינויים שנצפו במדד SERS אינם צריכים להתפרש כהוכחה ביוכימית חד-משמעית לשיפור במאמצי חמצון.

ניתן להשתמש בכמה גישות חלופיות כדי לחקור את אותה השערה. בדיקות ביוכימיות סטנדרטיות למתח חמצוני, כולל מדידות של מיני חמצן תגובתי, מלונדיאלדהיד, סופראוקסיד דיסמוטאז, קטלאז, גלוטתיון פרוקסידאז ויחס גלוטתיון/גלוטתיון דיסולפיד, יכולות לשמש לאימות האם שינויים במדדים שמקורם ב-SERS תואמים לסמנים ביולוגיים קונבנציונליים של מאמץ חמצוני^32,33. גשושי רדוקס אלקטרוכימיים, חיישני רדוקס מבוססי פלואורסצנציה, בדיקות כימילומינסנציה, מיקרודיאליזה ואחריה ניתוח ביוכימי, ואימות אימונוהיסטוכימי או היסטולוגי מבוסס רקמות עשויים גם הם לספק מידע משלים. שילוב של חישה מיקרו-מחטים פעילה ב-SERS עם גישות עצמאיות אלו יסייע לקבוע האם השינויים האופטיים שנצפו משקפים שינויים ביוכימיים ספציפיים ברדוקס או בתגובות רקמתיות מקומיות רחבות יותר לדקירה ולמצב מטבולי³⁴.

היישומים הפוטנציאליים של שיטה זו חורגים מעבר למודל הנוכחי של סבילות גלוקוז לקויה. מכיוון שחוסר איזון חמצן אדום מעורב במחלות מטבוליות, פגיעות ברקמות, דלקות ותיקון פצעים, מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS עשויות לספק כלי פרה-קליני שימושי למעקב אחר תגובות מקומיות הקשורות לחמצון אדום במודלים הקשורים לסוכרת, מחקרי ריפוי פצעים, מודלים של מחלות דלקתיות וסביבות התערבות זעיר-פולשניות נוספות³⁵. במחקרי דיקור, הפלטפורמה עשויה להיות שימושית להשוואת נקודות דיקור, אתרים שאינם דיקור, מניפולציות שונות של דקירות ולוחות זמנים שונים של התערבות בדיקור. עם זאת, יישומים אלו נשארים חקרניים ודורשים אימות טכני וביולוגי נוסף.

יש לציין מספר מגבלות. ראשית, קריאות ה-OC וה-RP חושבו כאינדקסים רציומטריים שמקורם ב-SERS ולא כויללו מול ריכוזי מין חמצוני סטנדרטיים או ערכי פוטנציאל רדוקס אלקטרוכימיים מוחלטים. לכן, יש לפרש את התוצאות הנוכחיות כתגובות אופטיות יחסיות הקשורות לחמצון אדום בתנאי רכישה זהים, ולא כמדידות ביוכימיות מוחלטות. שנית, המיקרו-סביבה הביולוגית של הרקמה עשויה להכניס מקורות נוספים לשונות אות, כולל שינויים מקומיים ב-pH, ספיגת חלבונים, רכיבי מטריצה חוץ-תאית ואפקטים נוספים של מטריצות. גורמים אלו לא הוערכו במלואם במדיות המכילות סרום או במדיה המחקה רקמות. שלישית, עוצמת הלייזר בפועל שהועברה לפני השטח של הרקמה והשינוי המקומי בטמפרטורה במהלך רכישת ראמן לא נמדדו ישירות; לכן, לא ניתן לשלול לחלוטין השפעות פוטותרמיות או פוטוכימיות. רביעית, השחזוריות ברמת האצווה של גיאומטריית חריץ ועומסי גלאי לא הוערכה כמותית באמצעות הדמיית SEM מרובת מחטים או ניתוח יעילות עומס. לבסוף, לא בוצעו אימות ביוכימי עצמאי, ניתוח חליפת פרוב ובדיקות תאימות ביולוגית מקומיות. מחקרים עתידיים צריכים לקבוע עקומות כיול במטריצות ביולוגיות רלוונטיות, לקשר בין מדדי SERS לבדיקות סטנדרטיות של לחץ חמצוני וחמצון רדוקס, לכמת דליפת פרובים, להעריך תאימות רקמה מקומית לאחר החדרה חוזרת, ולאמת את המכשיר בקבוצות בעלי חיים גדולות יותר. מחטים מיקרו-פעילות ב-SERS עשויות לספק פלטפורמה שימושית לשילוב התערבות דיקור סיני עם מעקב SERS יחסי של מדדים מקומיים הקשורים לחמצון במודל IGT פרה-קליני. נדרשים כיול נוסף, אימות ביוכימי, הערכת חליפת פרוב ומחקרי תאימות ביולוגית לפני שניתן לטעון למעקב כמותי מוחלט או יישום תרגומי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
חומצה אסקורבית	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
מד סוכר בדם	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
רצועות בדיקת סוכר בדם	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
סולפט נחושת (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
אלכוהול אתיל (≥99.7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
סולפט ברזל (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
גלוקוז (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
מי חמצן (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
כלוריד ברזל (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
מתיל מתאקרילט (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
ספקטרומטר ראמן מיקרו	Renishaw	InVia Raman Microscope
p-פנילנדיאמין (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
פולימתיל מתאקרילט (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק	Zeiss	ULTRA Plus
נתרן בורוהידריד (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
נתרן סולפיט (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
מחטי אקופונקטורה מנירוסטה	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
תוכנת ניתוח סטטיסטי	International Business Machines Corporation	Version 2021
סטרפטוזוטוצין (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
חומצה טטרכלורוזולטית (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
תוכנת SPSS	International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA	version 26.0
חולדות	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Specific-pathogen-free male Sprague-Dawley
מזון בסיסי	Anuokang Biotech.	SY10001
חזיר	MCE	HY-W127601
סוכרוז	MCE	HY-B1779
אבקת חלמון ביצה	MCE	HY-B2235B
חומצת לימון מונו-הידראט	Sigma-Aldrich	C1909
טריסודיום ציטראט די-הידראט	Sigma-Aldrich	S4641
מאגר ציטראט	beyotime	P0086
מלח חומצת הזרחן	beyotime	ST448-1L
איזופלורן	Bioss	D54468
מערכת הרדמה באיזופלורן לבעלי חיים קטנים	RWD Life Science	R500
תא אינדוקציה וחרוט אף	RWD Life Science	R500compatible accessories
משטח חימום	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
75% אתנול	Boyu Bio.	YB60401
תא סיום חיים בגז CO2	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365