פרוטוקול אופטימלי למודל של היצרות מסתם אבי העורקים בהשראת תיל גלישה בעכברים

Yaoyu Zhang; Jing Zhou; Yanjiani Xu; Shuang Liu; Fangyang Huang; Jialiang Zhang; Mao Chen

doi:10.3791/72218

מאמר שיטה

פרוטוקול אופטימלי למודל של היצרות מסתם אבי העורקים בהשראת תיל גלישה בעכברים

DOI:

10.3791/72218

⸱

21 באוגוסט 2026

Yaoyu Zhang^*¹^,²^,³ , Jing Zhou^*¹^,²^,³ , Yanjiani Xu^*¹^,²^,³ , Shuang Liu¹^,²^,³ , Fangyang Huang¹^,²^,³ , Jialiang Zhang¹^,²^,³ , Mao Chen¹^,²^,³

¹Laboratory of Cardiac Structure and Function, Institute of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, ²Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, ³Cardiac Structure and Function Research Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט מודל אופטימלי של היצרות מסתם אביאלי המושרה על ידי תיל תומך (guidewire) בעכברי C57BL/6. פלטפורמת תמיכה וסקולרית מותאמת אישית שהודפסה בתלת-ממד מאפשרת שליטה מדויקת בדימום, מה שמוביל לשיעור הישרדות של 95% לאחר 24 שעות (19/20) ושיעור הצלחה כולל של המודל של 90% לאחר 4 שבועות (18/20).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היצרות מסתם אביאלי (AVS) היא מחלה קרדיווסקולרית מרכזית עם שכיחות עולה באוכלוסיות מזדקנות, אך המחסור ברקמות מסתמים חולות מגביל משמעותית מחקרים מכניסטיים ופיתוח טיפולי. פרוטוקול זה מבסס ומבצע אופטימיזציה למודל עכברים רב-שחזור של AVS על ידי שיפור שיטת הפגיעה במסתם המושרית על ידי תיל (guidewire) של Honda, באמצעות ניהול מבוקר של דימומים. עכברים זכרים ונקבות מסוג C57BL/6 עוברים פגיעה במסתם האביאלי המושרית על ידי תיל; הפרוערה שופרה באמצעות פלטפורמת תמיכה וסקולרית המודפסת בתלת-ממד, המשיגה שליטה מדויקת בדימום במהלך ההכנסה וההוצאה של התיל. מדדי התוצאה כוללים הישרדות לאחר 24 h, הערכה אקו-קרדיוגרפית לאחר 4 שבועות, ותיקוף היסטופתולוגי. הפרוטוקול האופטימלי משיג שיעור הישרדות של 95% לאחר 24 h (19 מתוך 20 בעלי חיים); בקרב השורדים, 94.7% (18 מתוך 19) עומדים בקריטריון ההצלחה ההמודינמי שהוגדר מראש לאחר 4 שבועות, מהביא לשיעור הצלחה כולל של המודל של 90% (18 מתוך 20 בעלי חיים), כפי שאושר על ידי אקו-קרדיוגרפיה ואנליזה היסטולוגית. מודל סטנדרטי זה מספק פלטפורמה אמינה וניתנת לשחזור לחקר מנגנונים של דגנרציה של המסתם ולהערכת התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות מסתמי הלב נותרות נטל בריאותי משמעותי הן במדינות מפותחות והן במדינות מתפתחות, כאשר השכיחות עולה במקביל להזדקנות האוכלוסייה¹. למרות שהשתלת מסתם אאורטלי דרך קטטר (TAVI) שינתה את הטיפול בסטנוזיס אאורטלי חמור²^,³, המנגנונים התאיים והמולקולריים המניעים את דגנרציית המסתם עדיין אינם מובנים במלואם, ולא קיים טיפול פרמקולוגי מאושר להאטה או להבטלה של התקדמות המחלה⁴^,⁵. מכשול מרכזי במחקר של מחלות מסתמיים הוא הזמינות המוגבלת של רקמה חולה לצורך חקירה⁶^,⁷. קשה להשיג דגימות של מסתם אאורטלי אנושי בכמות מספקת, ומודלים של בעלי חיים המשחזרים באופן מהימן שינויים פתולוגיים במסתם היו נדירים באותה מידה⁸. פער זה הניע מאמצים מתמשכים לפיתוח מודלים של בעלי חיים המשחזרים את המאפיינים ההמודינמיים וההיסטולוגיים של סטנוזיס של המסתם האאורטלי (AVS).

גישות תזונתיות קונבנציונליות, כגון האכלה ממושכת בתזונה עשירה בשומן בעכברי ApoE⁻/⁻, דורשות 20–24 שבועות ומניבות שיעורי הצלחה נמוכים, כאשר רק מיעוט מהבעלי החיים מפתחים פנוטיפ סטנוטי מובהק⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². מודל הפגיעה במסתם המושרה על ידי תיל תג (guidewire), שתואר על ידי Honda et al., טיפל ברבים מהחסרונות הללו על ידי גרימה לפגיעה מכנית בעליכות המסתם דרך גישה לעורק הת carotid¹³. הטכניקה המקורית כוללת דיסקציה של עורק ה-carotid, העברת תיל תג רטרוגרדי למסביב למסתם האאורטלי, שריטות חוזרות של העליכות וסיבוב התיל — דבר המייצר שינויים המודינמיים מהירים תוך ימים ספורים ופנוטיפ סטנוטי יציב עד לשבוע 4¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. בשל מהירותה היחסית וישירותה, שיטת Honda אומצה באופן נרחב במחקרי מסתמים מהעת האחרונה. עם זאת, נותרו מספר פערים משמעותיים. פרטי הפרוצדורה המלאים לא תועדו באופן מלא בספרות, חסרה סטנדרטיזציה בין מעבדות, ותפקידו של השליטה בדימום — גורם מרכזי לתחלואה פרי-אופרטיבית במודל זה — מעולם לא נבחן באופן שיטתי. חוסר עקביות זה מפחית את השחזוריות ומגביל את היכולת להעברה לקליניקה.

הועלתה ההשערה כי אופטימיזציה שיטתית של השליטה בדימום עשויה לשפר באופן משמעותי את ההישרדות הפרי-אופרטיבית ואת מהימנות המודל. פרוטוקול זה מציג גישה מזוקקת וסטנדרטית המבוססת על שיטת Honda, באמצעות הצגת פלטפורמת תמיכה וסקולרית מותאמת אישית המודפסת בתלת-ממד. המכשיר מאפשר מתיחה לונגיטודית ניתנת לכיוונון של העורק הקרוטידי, ובכך מספק המוסטזיס זמני מלא במהלך הכנסה והוצאה של תיל חוט (guidewire) מבלי למעוך את כלי הדם. באמצעות גישה זו, הפרוטוקול המותאם השיג שיעור הישרדות של 95% למשך 24 h (19 מתוך 20 בעלי חיים); בקרב השורדים, 94.7% (18 מתוך 19) עמדו בקריטריון ההצלחה ההמודינמי שהוגדר מראש לאחר 4 שבועות, מה שהביא לשיעור הצלחה כולל של המודל של 90% (18 מתוך 20 בעלי חיים). תיעוד פרוצדורלי שלב-אחר-שלב מסופק כדי להקל על השחזור במעבדות שונות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הפעולות בניסויים בבעלי חיים המתוארות בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם למדריך לטיפול בבעלי חיים במעבדה (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם (IACUC) של בית החולים West China (פרוטוקול מס' 20240311055). לאורך כל הניסוי נעשה שימוש בעכברים זכרים מסוג C57BL/6 (בני 8–10 שבועות; משקל של כ-22–25 g) ובעכברים נקבות מסוג C57BL/6 (בני 8–10 שבועות; משקל של כ-18–20 g). כל החומרים, הריאגנטים, המכשירים, התוכנות והמכשירים המותאמים שנעשה בהם שימוש בפרוטוקול זה, כולל פלטפורמת התמיכה בכלי הדם שהודפסה בתלת-ממד, מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה טרום-ניתוחית וחתך כירורגי

הרדם את העכבר באמצעות איזופלורן (3% להשראה, 1.5–2% לתחזוקה) המאודה ב-100% חמצן. ודא עומק הרדמה מספק על ידי בדיקת היעדר רפלקסים של נסיגת כף הרגל (צביטה בבהונות).
זהירות: איזופלורן הוא חומר הרדמה נדיף. השתמש בו עם מערכת שאיבה פעילה או באזור מאוורר היטב, לבש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים ופעל לפי נהלי הבטיחות המוסדיים.
מרח משחה אופתלמית בשתי העיניים. הנח את העכבר במצב שכיבה על גב (supine) על פלטפורמה כירורגית עם ויסות טמפרטורה השומרת על 37 °C.
הכן את השדה הכירורגי על ידי הסרת שיער מהאזור הצווארי הקדמי באמצעות קרם להסרת שיער כימית.
חטא את העור בשלושה מחזורים לסירוגין של פובידון-יוד (או כלורהקסידין) ואלכוהול 70% (או סליין סטרילי חמים), וסיים במרכיב האנטיספטי.
בצע חדירה תת-עורית של לידוקאין 0.5% לאורך קו החתך המתוכנן לצורך אלגזיה מקומית מוקדמת.
לאחר מכן, בצע חתך עורי אורכי בקו האמצע (בקירוב 1.0–1.5 cm) בחלקו הקדמי של הצוואר, במיקום מעט מימין לקו האמצע של הקנה, באמצעות מיקרו-מספריים.
זהירות: מיקרו-מספריים, מחטים, תלי תנאים (guidewires) וחפצים חדים אחרים עלולים לגרום לפציעה. טפל בהם בזהירות והשלך חפצים חדים משומשים למכלי איסוף מאושרים לחפצים חדים.

2. בידוד כלי הדם והנחת תפרים

תחת מיקרוסקופ סטריאולוגי כירורגי, חשוף את העורק התהומי המשותף הימני (RCCA) באמצעות דיסקציה קהה דרך שכבות הפסציה והשרירים שמעליו. הפר בעדינות את ה-RCCA מהעצב התועה הסמוך וממרקמת החיבור שסביבו, תוך הקפדה להימנע מגירוי מכני של העצב התועה.
הערה: שמור על בלוטות הרוק ועל הרקמות החשופות לחות באמצעות סליין סטרילי חמים לאורך כל ההליך כדי למנוע התייבשות.
בצע ליגציה קבועה לקצה הדיסטלי של ה-RCCA באמצעות תפר משי 6-0 שנקשר כקשר מאובטח שאינו מחליק.
מקם קשר מSurvived (slipknot) רפוי של תפר משי 6-0 סביב המקטע הפרוקסימלי של ה-RCCA, והשאר אותו לא מהודק לשימוש מאוחר יותר במהלך הכנסת תיל ההובלה (guidewire).

3. יישום הפלטפורמה וביצוע ארטריוטומיה

הערה: לפני הניתוח, יש לעקר את הפלטפורמה המודפסת בתלת-ממד באמצעות גז ethylene oxide (EtO), ולאחר מכן לבצע אוורור מספק, ולעקר את כל כלי הניתוח המתכתיים באמצעות אוטוקלאב.

אזהרה: אתילן תחמוצת (Ethylene oxide) הוא רעיל, דליק ומסרטן. יש להשתמש בעיקור ב-EtO רק במתקנים מאושרים, לאפשר אוורור מספק, ולפעול לפי נהלי הטיפול בפסולת של המוסד.

הכנס בזהירות את פלטפורמת התמיכה הווסקולרית המודפסת בתלת-ממד מתחת למקטע המבודד של ה-RCCA, כאשר קודקוד ה-V ההפוך ממוקם ישירות מתחת לכלי הדם.
כוונן לאט את הפלטפורמה כדי להגביר את המתיחה האורכית של ה-RCCA על ידי השחלת התפרים שהוצבו מראש לתוך חריצי צד גבוהים יותר באופן הדרגתי.
הערה: קודקוד ה-V ההפוך תוכנן בזווית של 120° כדי להתאים לעקמומיות של כלי הדם מבלי למעוך את הדופן. הפסק את הגברת המתיחה בנקודה המדויקת שבה פעימות העורקים אינן ניתנות עוד לזיהוי חזותי. נקודת סיום חזותית קריטית זו מבטיחה המוסטזיס זמני ללא פגיעה מוגברת בכלי הדם.
בצע ארטריוטומיה רוחבית קטנה (בערך מחצית מהיקף כלי הדם) במקטע ה-RCCA המיוצב באמצעות מיקרו-מספריים. דימום מינימלי או ללא דימום כלל אמורים להתרחש אם המתיחה הוגדרה נכון.

4. הכנסת תיל תניין ופגיעה במסתם

תחת תצפית מיקרוסקופית, הכניסו את תיל ההובלה (guidewire) (קוטר 0.014 inch / 0.36 mm) אל תוך הלומן העורקי דרך הפרטומיה הרוחבית (transverse arteriotomy) בכיוון רטרוגרדי לעבר שורש האורטה.
הערה: קליבר זה הוא הסטנדרט במודלים מפורסמים של פגיעה באמצעות תיל הובלה, והוא מקارب את קוטר הלומן של ה-RCCA בעכברים (~0.4–0.5 mm), מה שנותן יחס של תיל-כלי דם של כ-0.7–0.9.
זהירות: תיל ההובלה עלול לנקב כלי דם או רקמות סובבות. התקדמו איתו לאט תחת תצפית והשליכו תيلي הובלה משומשים כפסולת חדה או כפסולת כירורגית מזוהמת.
הדקו את קשר המהלקה (slipknot) הפרוקסימלי שהוצב מראש סביב כלי הדם ותיל ההובלה כדי להשיג המוסטזיס מלא באתר ההחדרה. לאחר שהקשר מאובטח, הסירו בזהירות את הפלטפורמה המודפסת בתלת-ממד מתחת לכלי הדם.
הערה: אם מופיע דימום בלתי צפוי במהלך ההחדרה, או אם קוטר תיל ההובלה יוצר חיכוך מופרז, מיקמו מחדש את הפלטפורמה באופן זמני כדי לסייע בהמוסטזיס, או הפחיתו מעט את מתיחת הפלטפורמה כדי לאפשר ללומן של כלי הדם להתרחב לפני ניסיון ההחדרה החוזר.
הקישו את תיל ההובלה בזהירות בכיוון רטרוגרדי דרך ה-RCCA, מעבר לקשת האורטה, ולקראת המסתם האורטלי. תחת הנחיה אקו-קרדיוגרפית בזמן אמת, ודאו שקצה תיל ההובלה חצה את המסתם האורטלי ונכנס לחדר השמאלי.
כאשר קשר המהלקה הפרוקסימלי מהודק לחלוטין לשמירה על המוסטזיס, בצעו את הפגיעה המכנית במסתם על ידי ביצוע 100 תנועות דחיפה-משיכה (הלוך ושוב) דרך המסתם האורטלי, ולאחריהן 100 תנועות סיבוב של תיל ההובלה כנגד עלעות המסתם.
הערה: 100 תנועות דחיפה-משיכה ו-100 תנועות סיבוב נקבעו באמצעות אופטימיזציה נרחבת במעבדה כמספרים המאזנים בצורה הטובה ביותר את זמן הפרוצדורה עם השראה מהימנה של סטנוזיס משמעותית מבחינה המודינמית.

5. הוצאת תיל המנחה וסגירת הפצע

עם השלמת הפגיעה במסתם, הוצאו באיטיות את תיל ההובלה מהכלי.
המירו מיד את קשר ההחלקה הפרוקסימלי לקשר קבוע שאינו מחליק כדי ללגט את ה-RCCA הפרוקסימלי ולמנוע דימום לאחר הפרוצדורה.
סגרו את חיתוך העור באמצעות תפרים קטועים של ניילון 5-0 או סגורי פצעים כירורגיים.
אין להעניק תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות (NSAIDs) לאחר הניתוח. אין להעניק אנטיביוטיקה פרי-אופרטיבית, שכן הפרוצדורה מבוצעת בתנאים אספטיים.
העבירו את החיה לכלוב התאוששות נקי ומחומם ועקבו אחריה באופן רציף עד להשבה מלאה של יכולת התנועה.

6. הערכה אקו-קרדיוגרפית של המודינמיקה התוצקתית של המסתמים

בצעו הערכות אקו-קרדיוגרפיות בכל העכברים ששרדו 4 שבועות לאחר הניתוח כדי להעריך את חומרת ההיצרות של מסתם אבי העורקים.
הסיכו הרדמה על ידי הנחת בעל החיים בתא השראה עם 3% isoflurane ב-100% חמצן. ודאו את עומק ההרדמה על ידי בדיקת אובדן רפלקס נסיגת הכף. הסתרו את דופן החזה הקדמית באמצעות קרם להסרת שיער כימית. מרחו משחה עינית בשתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
העבירו את העכבר המורדם לפלטפורמת דימות בוויסות טמפרטורה בתנוחת גב (supine).
קבעו את הכפות לאלקטרודות אקג (ECG) שטח לצורך ניטור רציף של קצב הלב. כווננו את ריכוז ה-isoflurane (בדרך כלל 1.0–1.5%) כדי לשמור על קצב לב פיזיולוגי יציב של 450–550 beats per min.
נקו את דופן החזה הקדמית ומרחו שכבה נדיבה של ג'ל צימוד אקוסטי שחומם מראש.
רכישת דימויי B-mode
1. באמצעות מערכת אולטרסאונד Vevo 3100 עם מתמר MX550D (40 MHz), לחצו על בקר ה-B-Mode כדי להתחיל בדימוי דו-ממדי חי.
2. מקמו את המתמר במיקום פאראסטרנלי שמאלי כדי לקבל מבט פאראסטרנלי לאורך הציר של החדר השמאלי, מסתם אבי העורקים ואבי העורקים העולה. הגדירו באופן אופטימלי את העומק, הרוחב וה-2D gain.
רכישת M-mode ומדידת החדר השמאלי
1. ממבט הציר הארוך הפאראסטרנלי, לחצו על בקר ה-M-Mode. מקמו את קו הדגימה לרוחב החדר השמאלי בגובה השריר הפפילרי.
2. לחצו על Start כדי להתחיל את הרכישה. לאחר שהתקבל עקבה יציבה המקיפה לפחות שלושה מחזורי לב, לחצו על Save.
3. בתוכנת Vevo LAB, השתמשו בכלי ה-LV Trace כדי לשרטט את האנדוקרדיום בסוף הדיאסטולה ובסוף הסיסטולה, ורשמו את הממדים הפנימיים של החדר השמאלי, עובי הדופן הקדמית והאחורית (LVAWd, LVPWd), ומסת החדר השמאלי.
מקמו מחדש והטו את המתמר כדי לרכוש מבט ייעודי של קשת אבי העורקים.
הערה: השגת מבט ספציפי זה של קשת אבי העורקים חיונית למדידות מדויקות של מהירות זרימה חוצת-מסתם, שכן היא מבטיחה יישור אופטימלי של אלומת האולטרסאונד עם כיוון זרימת הדם דרך מסתם אבי העורקים.
הערכת Color Doppler
1. ממבט קשת אבי העורקים, לחצו על בקר ה-Color. מקמו את תיבת הצבע מעל מסתם אבי העורקים ומעל החלק הפרוקסימלי של אבי העורקים העולה.
2. כווננו את סולם הצבע וה-gain כך שהסילון הסיסטולי יוצג בבירור ללא aliasing. לחצו על Start, ולאחר מכן על Save.
מדידת מהירות ב-Pulsed-wave Doppler
1. לחצו על בקר ה-PW Doppler. מקמו את שער נפח-הדגימה בנקודה הצרה ביותר של הסילון (vena contracta), ובצעו תיקון זווית (<60°).
2. לחצו על Start כדי להתחיל את העקבה הספקטרלית; לאחר שהוקלטו לפחות שלושה מחזורי לב, לחצו על Save. בתוכנת Vevo LAB, מדדו את מהירות השיא חוצת-המסתם באמצעות כלי ה-Peak Velocity, תוך חישוב ממוצע של לפחות שלושה מחזורים.

7. עיבוד היסטולוגי וצביעה של שורש האורטה

בעקבות הערכה אקו-קרדיוגרפית, יש לאשר הרדמה עמוקה על ידי וידוא היעדר מוחלט של רפלקס נסיגת כף הרגל. בצעו נתיקה של צווארו (cervical dislocation) כשיטת ההמתה המשנית, בהתאם להנחיות AVMA להמתה של בעלי חיים (מהדורת 2020) ופרוטוקולים מאושרים מוסדית.
זהירות: גופות של בעלי חיים, רקמות שהוצאו וחומרים מזוהמים בדם הם פסולת ביולוגית/בעלי חיים. השליכו אותם בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגית ותקנות מתקני בעלי חיים מוסדיים.
בצעו תורקוטומיה (thoracotomy) באמצעות מספרי מיקרו כירורגיים כדי לחשוף את הלב.
החדירו מחט פרפוזיה לקודקוד (apex) של הפרוקי השמאלי ושטפו את מחזור הדם המערכתי בתמיסת פוספט מושבית (PBS) סטרילית קרה. פרפוזיה מוצלחת תתבטא בהבהרה של הכבד והריאות.
הוציאו את הלב השלם ושקיעו אותו ב-4% paraformaldehyde (PFA) בטמפרטורת החדר למשך 24 h לפחות כדי להבטיח קיבוע מלא.
זהירות: Paraformaldehyde הוא רעיל ומגרה. יש לטפל ב-4% PFA תחת מנדף כימי עם ציוד מיגון אישי (PPE) מתאים ולהשליך פסולת PFA כפסולת כימית מסוכנת.
העבירו את הרקמה המקובעת למעבד רקמות אוטומטי לצורך התייבשות רצופית דרך סדרת אתנול מדורגת, ולאחריה הבהרה באמצעות xylene וחדירה של שעוות פראפין ב-65 °C.
זהירות: Xylene הוא דליק ורעיל, ופראפין חם עלול לגרום לכוויות. טפלו ב-xylene תחת מנדף או במעבד מאושר והשליכו פסולת המכילה xylene כפסולת כימית מסוכנת.
טמנו את הלבבות המעובדים בבלוקים של פראפין.
הערה: אוריינטציה נכונה של הלב בזמן הטמינה היא קריטית. מקמו את הלב כך שיאפשר חיתוך רוחבי דרך שורש האביון (aortic root) בגובה שלושת עלולות השסתום.
באמצעות מיקרוטום סיבובי, גזרו חיתוכים רצופים ברוחב 4–5 µm דרך מישור השסתום האאורטלי, תוך הבטחה שכל שלוש העלולות נכללות. העבירו את החיתוכים לשקופיות זכוכית ושמרו בטמפרטורת החדר.
בצעו צביעת Hematoxylin and Eosin (H&E) על שקופיות נבחרות כדי להעריך מורפולוגיה של הרקמה, רמיodeling מבני ועובי של עלולות השסתום.
בצעו צביעת Von Kossa על חיתוכים רצופים סמוכים כדי לזהות ולכמת הסמנה קלקית (dystrophic calcification), המזוהה כמשקעי מינרלים בצבע חום כהה עד שחור בתוך עלולות השסתום.

8. הליך ניתוח דמה (Sham)

הערה: סעיף זה מתאר את הליך בקרת השם (Sham). עכברי השם עוברים את אותה הרדמה, הכנת עור, חשיפת כלי דם, ארטריוטומיה והחדרת תיל תני guiding wire רטרוגרדית כפי שנעשה בקבוצת פגיעת התיל באורטה (AWI); תיל התני מוקדם עד לרמה הסופרא-וולבולרית (מעל השסתום) אך אינו עובר דרך מסתם האורטה, ולא מבוצעת פגיעה מכנית במסתם.

הרדימו את העכבר והכינו את שטח הניתוח כפי שמתואר בשלבים 1.1 עד 1.5.
תחת תצפית במיקרוסקופ סטריאו, חשפו את ה-RCCA באמצעות דיסקציה קהה כפי שמתואר בשלב 2.1.
בצעו ליגציה קבועה לקצה הדיסטלי של ה-RCCA באמצעות תפר משי 6-0 והניחו קשר מתיחה (slipknot) רופף פרוקסימלית (כפי שמוסבר בשלבים 2.2–2.3).
בצעו ארטריוטומיה רוחבית והחדירו את תיל ההובלה (guidewire) כפי שמתואר בשלבים 3.1–4.2.
הובילו את תיל ההובלה בכיוון רטרוגרדי עד לרמה הסופראוולבולרית של אבי העורקים העולה תחת הנחיה של אקו-קרדיוגרפיה, תוך אישור שקצה תיל ההובלה לא חוצה את המסתם האאורטלי.
הערה: אל תבצעו את תנועות הדחיפה-משיכה או תנועות הסיבוב הגורמות לפגיעה במסתם המתוארות בשלב 4.4. שלפו את תיל ההובלה ובצעו מיד ליגציה ל-RCCA הפרוקסימלי כפי שמתואר בשלבים 5.1–5.2.
סגרו את חתך העור באמצעות תפרי ניילון 5-0 מקוטעים או סגורי פצעים.
הערה: בדומה לקבוצת ה-AWI, אלגזיה תוך-ניתוחית ניתנת על ידי חלחול מקומי של לידוקאין (שלב 1.5). העבירו את בעל החיים לכלוב התאוששות מחומם ועקבו אחריו עד להשבה מלאה של יכולת הניידות.
הכפיפו עכברי Sham למעקב לאחר ניתוח, להערכה אקו-קרדיוגרפית לאחר 4 שבועות ולעיבוד היסטולוגי זהים לאלו של קבוצת ה-AWI.

9. ניתוח סטטיסטי ותכנון המחקר

במהלך המחקר, 20 עכברים (10 זכרים, 10 נקבות) הוכפפו להליך AWI, ו-6 עכברי C57BL/6 (3 זכרים, 3 נקבות) הוכפפו להליך Sham.
מדדו את מהירות השיא התראסוולבולרית (הקריטריון המגדיר את הצלחת המודל) בכל החיות ששרדו (19 AWI, 6 Sham).
נתחו מדדים אקו-לבביים והיסטולוגיים מפורטים בתת-קבוצה מוגדרת מראש ומאוזנת מבחינת מין של 6 עכברי AWI (3 זכרים, 3 נקבות).
ודאו שכל המדידות האקו-לבביות וההיסטולוגיות מבוצעות על ידי חוקרים שאינם מודעים להקצאת הקבוצות (blinded).
בחנו את נורמליות הנתונים באמצעות מבחן Shapiro-Wilk לפני ביצוע בדיקות פרמטריות. השוו בין שתי קבוצות בלתי תלויות (AWI לעומת Sham) באמצעות מבחן t של Student דו-זנבי למדגמים בלתי זוגיים.
נתחו והציגו את נתוני ההישרדות באמצעות שיטת Kaplan-Meier.
בצעו את כל הניתוחים בתוכנת GraphPad Prism. הציגו את הנתונים כממוצע ± SEM, כאשר p < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח פלטפורמה בהדפסה תלת-ממדית לבקרת דימום

כדי לטפל בדימום פרי-אופרטיבי – מקור התחלואה והתמותה העיקרי במודל AVS קונבנציונלי המושרה על ידי תיל תומך (guidewire) – תוכננה פלטפורמת תמיכה כלי-דם בהדפסת תלת-ממד (איור 1). הפלטפורמה יוצרה בשיטת הדפסת סטריאוליתוגרפיה (SLA) משרף פוטו-פולימרי תואם ביולוגית (USP Class VI / ISO 10993-compliant), בעובי מבני של 1.07 מ"מ. לאחר ההדפסה, החלקים נשטפו באיזופרופיל אלכוהול להסרת שרף שלא התממש, ועברו פוסט-קיור (post-cured) תחת אור אולטרה-סגול. קובץ התכנון המלא (.stp) מסופק על מנת שניתן יהיה לשחזר את הפלטפורמה במערכות SLA סטנדרטיות. הפלטפורמה כוללת משטח אפקלי בצורת V הפוכה עם זווית שיא של 120° (איור 1A–B), אשר תואם לעקמומיות של העורק התרדימי המשותף הימני המבודד מבלי לגרום לדחיסת דופן מוגברת. חריצי צד מדורגים מרובים (איור 1C–D) מאפשר למפעיל להדק את התפרים שהוצבו מראש ולהפעיל מתיחה אורכית ניתנת לכיוונון על כלי הדם. המתיחה מוגברת באופן הדרגתי עד שפעימות העורקים אינן נראות יותר – נקודת סיום חזותית המעידה על המוסטזיס זמנית נאותה. גישה זו מספקת שדה כירורגי יציב לצורך ביצוע הארטריוטומיה והחדרת תיל הניווט, תוך מניעת פגיעת מעיכה מופרזת לדופן כלי הדם.

אישור תוך-ניתוחי של מיקום תיל התג

מיקום נכון של תיל ההובלה (guidewire) אומת בשני שלבים במהלך הפרוצדורה. ראשית, תחת ויזואליזציה ישירה במיקרוסקופ סטריאו, נצפה תיל ההובלה נכנס ללומן של ה-RCCA דרך הפתח הרוחבי בעורק (transverse arteriotomy) בכיוון רטרוגרדי (איור 2A). שנית, הדמיית אקו-לב בזמן אמת אישרה כי קצה תיל ההובלה חצה את מסתם האאורטה ונכנס לחדר השמאלי. הדמיית B-mode זיהתה את תיל ההובלה כארטיפקט ליניארי היפראקווגני החוצה את מישור מסתם האאורטה (איור 2B). הדמיית Doppler צבעוני הדגימה זרימה טורבולנטית מקומית בגובה מסתם האאורטה, מה שסיפק אישור נוסף למיקום תיל ההובלה מעבר לעליכסוני המסתם (איור 2C; סרטון משלים 1).

הישרדות פרי-אופרטיבית ושיעור הצלחת המודל

שילוב הפלטפורמה בעלת המתיחות הניתנת לכיוונון בזרימת העבודה הניתוחית הוביל לשיעורי הישרדות מוקדמים גבוהים. ניתוח Kaplan-Meier הראה שיעור הישרדות של 95% ב-24 h לאחר הניתוח (19 מתוך 20 עכברים; איור 3A). בדיקה לאחר המוות של השורד היחיד שלא שרד לא העלתה ראיות לדימום משמעותי, נזק מבני או איסכמיה לבבית, מה שמרמז כי המוות נבע מסיבוכים הקשורים להרדמה ולא מטראומה ניתוחית. הצלחת המודל לאחר 4 שבועות הוערכה באמצעות קריטריון שהוגדר מראש: מהירות שיא של זרימה טרנסוולבולרית העולה על 2,000 mm/s, יחד עם ממצאים היסטולוגיים תומכים. מתוך 19 בעלי החיים ששרדו, 18 (94.7%) עמדו בסף זה, מה שהביא לשיעור הצלחה כולל של המודל של 90% בכלל הקוהורט (18 מתוך 20 עכברים; איור 3B). התוצאות היו דומות בין המינים: ההישרדות לאחר 24 h הייתה 9 מתוך 10 בזכרים ו-10 מתוך 10 בנקבות, ושיעור הצלחת המודל לאחר 4 שבועות היה 9 מתוך 10 (90%) בשני המינים; מקרה המוות הפרי-אופרטיבי היחיד היה זכר (קשור להרדמה), ומקרה הכישלון היחיד של המודל היה נקבה ששרדה.

אישור אקו-קרדיוגרפי של היצרות מסתם אבי העורקים

בדיקת אקו-לב טרנס-טורקית ארבעה שבועות לאחר הניתוח אישרה שינויים המודינמיים התואמים להיצרות אבortic חמורה בקבוצת ה-AWI. ערכי אקו-לב כמותיים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM); פרמטרים תפקודיים של עיצוב מחדש של החדר השמאלי נותחו ב-6 עכברי Sham ו-6 עכברי AWI, בעוד שמהירות השיא הטרנס-וולבולרית נמדדה בכל עכברי ה-AWI ששרדו ובביקורת ה-Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). מקדם הפליטה של החדר השמאלי היה נמוך במעט בקבוצת ה-AWI מאשר בביקורת ה-Sham לאחר ארבעה שבועות (56.21 ± 1.15% לעומת 61.57 ± 2.12%; p = 0.0503; איור 3C), הבדל שלא הגיע למשמעות סטטיסטית. רישומי דופלר עם גל פולס הראו עלייה ניכרת במהירות הסילון הטרנס-וולבולרי בקבוצת ה-AWI, שהגיעה ל-2740.89 ± 104.10 mm/s, בהשוואה ל-988.00 ± 126.24 mm/s בקבוצת ביקורת ה-Sham (איור 3D). ניתוח כמותי אישר עלייה משמעותית ביותר במהירות שיא של הסילון הטרנס-וולבולרי בקבוצת ה-AWI ביחס לביקורת ה-Sham (p < 0.0001; איור 3E). בהתאם לשלב מוקדם של הסתגלות לעומס לחץ, קבוצת ה-AWI הראתה עיצוב מחדש קונצנטרי של החדר השמאלי: עובי הדופן הקדמית הדיאסטולית עלה באופן משמעותי (LVAWd 1.14 ± 0.02 לעומת 0.96 ± 0.03 mm; p = 0.0016; איור 3F), בעוד שעובי הדופן האחורית הדיאסטולית ומסת החדר השמאלי היו גבוהים יותר אך לא הגיעו למשמעות סטטיסטית (LVPWd 1.01 ± 0.12 לעומת 0.76 ± 0.02 mm, p = 0.0650, איור 3G; LV mass 124.51 ± 10.63 לעומת 104.47 ± 2.45 mg, p = 0.0961, איור 3H).

תיקוף היסטופתולוגי של עיצוב מחדש והסתיידות של המסתמים

בדיקה היסטולוגית של שורשי האאורטה איששה את הממצאים האקו-קרדיוגרפיים. ערכים היסטולוגיים כמותיים מוצגים כממוצע ± SEM ונולאו ב-6 עכברי Sham ו-6 עכברי AWI. צביעת H&E בקבוצת ה-AWI חשפה עיבוי בולט של עלוני השסתום וחוסר ארגון מבני, מאפיינים שהיו חסרים בבישורי ה-Sham (איור 3I). מורפומטריה כמותית איששה עלייה משמעותית בעובי הממוצע של עלון השסתום בקבוצת ה-AWI בהשוואה לקבוצת ה-Sham (p < 0.0001; איור 3J). צביעת Von Kossa הדגימה הסתיידות דיסטרופית נרחבת בתוך עלוני השסתום המעובים של קבוצת ה-AWI, שזוהו כפיקודים מינרליים בצבע חום כהה עד שחור. בבישורי ה-Sham נצפתה שקיעה מינרלית זניחה (איור 3K). ניתוח תמונות כמותי חשף עלייה משמעותית בשטח ההסתיידות הכולל (µm²) בקבוצת ה-AWI ביחס לבישורי ה-Sham (p < 0.0001; איור 3L).

figure-results-1
איור 1: תכנון פלטפורמת התמיכה הווסקולרית המודפסת בתלת-ממד המוצגת בארבעה מבטים. (A) מבט אלכסוני קדמי-שמאלי. (B) מבט אלכסוני אחורי-ימני. (C) מבט פרופיל צדי של הגאומטריה האורכית הכללית של הפלטפורמה. (D) מבט בזווית המדגיש את אזור הקודקוד בצורת V הפוכה. תוויות רכיבים: 110, גוף הפלטפורמה; 120, זרועות צדיות; 121, מגרעות צדיות מדורגות; 130, קצה תפעולי; 140, קודקוד הכנסה בצורת V הפוכה; 150, משטח תמיכה במגע עם כלי הדם; 160, שיפוע מעבר בין מגרעות סמוכות; 190, העורק התהומי המשותף הימני (RCCA). הפלטפורמה מיוצרת משרף פוטופולימר ביו-תואם (עובי מבני: 1.07 mm). שרטוט המבנה התלת-ממדי הופק על ידי המחברים מקובץ תכנון ה-CAD המקורי (.stp) של פלטפורמת התמיכה הווסקולרית באמצעות FreeCAD, תוכנה חופשית וקוד פתוח לוויזואליזציה ומידול CAD. לא הותאם שום שרטוט זכויות יוצרים או פרסום של צד שלישי. קובץ תכנון ה-CAD המקורי זמין כקובץ משלים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אישור תוך-ניתוחי ואקו-קרדיוגרפי של מיקום תיל התנחוי (guidewire). (A) תצלום תוך-ניתוחי המראה החדרת רטרוגרדית של תיל התנחוי (חץ) דרך arteriotomy רוחבית אל תוך לומן העורק הקרוטיד המשותף הימני (RCCA) תחת ויזואליזציה סטריאומיקרוסקופית ישירה. (B) תמונת אקו-קרדיוגרפיה במצב B-mode המראה את תיל התנחוי (המזוהה כארטיפקט ליניארי היפראקווגני; חץ) חוצה את המסתם האאורטלי ונכנס לחדר השמאלי. (C) תמונת אקו-קרדיוגרפיה ב-Color Doppler המדגימה זרימה טורבולנטית מקומית בגובה המסתם האאורטלי, המאשרת את מיקום תיל התנחוי חוצה עלי המסתם. ויזואליזציה של זרימה טרנס-ולבולרית ב-Color Doppler בזמן אמת במהלך מיקום תיל התנחוי מוצגת ב-סרטון משלים 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תוצאות הישרדות, המודינמיקה, רה-מודלינג ונטיקה של החדרים ותוצאות היסטופתולוגיות של מודל פגיעת תיל אאורטלית (AWI) מותאם. (A) עקומת הישרדות Kaplan-Meier ל-24 h של עכברי AWI (n = 20). (B) הצלחת המודל (אדום) לעומת כישלון (שחור) בקבוצת AWI לאחר 4 שבועות (n = 20); הצלחה הוגדרה כמהירות שיא טרנס-וולבולרית > 2,000 mm/s. (C) מקדם פליטה (EF; p = 0.0503). (D) דוגמאות לאקו-קרדיוגרמות Doppler בשיטת גל פולס (PW) מעכבר Sham (שמאל) ועכבר AWI (ימין). (E) מהירות שיא טרנס-וולבולרית (n = 19 AWI, n = 6 Sham; p < 0.0001). (F) עובי הדופן הקדמי של החדר השמאלי בדיאסטולה (LVAWd; p = 0.0016). (G) עובי הדופן האחורי של החדר השמאלי בדיאסטולה (LVPWd; p = 0.0650). (H) מסת החדר השמאלי (p = 0.0961). (I) דוגמאות לחתכים של שורש האאורטה בצביעת HE (Sham, שמאל; AWI, ימין). (J) עובי עלה מסתם האאורטה (p < 0.0001). (K) דוגמאות לחתכים של שורש האאורטה בצביעת Von Kossa (Sham, שמאל; AWI, ימין). (L) שטח כולל של שקיעת סידן (µm²; p < 0.0001). סרגי קנה מידה = 500 µm. בכל הגרפים הכמותיים, העמודות מייצגות ערכי ממוצע וסרגי השגיאה מייצגות שגיאה סטנדרטית של הממוצע (SEM). השוואות כמותיות בין קבוצות Sham ו-AWI בפאנלים C, E–H, J ו-L בוצעו באמצעות מבחן t של Student דו-זנבי ללא צימוד. נתונים כמותיים הם מקבוצות Sham ו-AWI (n = 6 לכל קבוצה), למעט מהירות שיא טרנס-וולבולרית בפאנל E, שנמדדה בכל עכברי AWI ששרדו ובביקורת Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון משלים 1: הדמיית Color Doppler אקו-קרדיוגרפית של זרימת דם טרנס-וולבולרית במהלך מיקום תיל התערבות (guidewire). הסרטון מדגים הדמיית Color Doppler בזמן אמת בגובה המסתם האאורטלי במהלך הליך AWI, ומראה זרימה טורבולנטית מקומית המושרית על ידי מיקום תיל ההתערבות דרך עליכסורי המסתם. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של מודל בעלי חיים יציב ובטוח של היצרות מסוע (aortic stenosis). מאפיין של גישה זו הוא פלטפורמה עזר המקלה על החדרת תיל תניד (guidewire) לעורק התריס השיתופי (common carotid artery). הפלטפורמה מיוצרת באמצעות הדפסת סטריאוליתוגרפיה (SLA) משרף פוטופולימר תואם ביולוגית (עובי מבני של 1.07 mm) וכוללת משטח קודקודי בצורת V הפוכה עם זווית קודקוד של 120°; קובץ התכנון המלא זמין באופן חופשי כקובץ .stp משלים. התקן זה מבטיח כניסה חלקה של התיל התניד, שולט באופן אובייקטיבי על איבוד דם פרי-אופרטיבי, ובכך שומר על הישרדותם של עכברי המודל בטווח הקצר והארוך. מאז התיאור המקורי, המודל המושרה על ידי תיל תניד עבר דיוק ואפיון נוספים, כולל וריאציות של חומרות מדורגות המכווננות את עוצמת הפגיעה כדי לייצר היצרות קלה עד חמורה¹⁷, ודיווחים אחרונים המתעדים סיבוכים פרי-אופרטיביים¹⁸; הפרוטוקול הנוכחי נשען על גוף עבודות זה על ידי התייחסות שיטתית לדימום פרי-אופרטיבי.

מספר שלבים בפרוטוקול זה הם קריטיים להשראה מוצלחת של המודל ודורשים תשומת לב מיוחדת. ראשית, יש לכייל במדויק את מידת המתיחה האורכית המופעלת באמצעות הפלטפורמה המודפסת בתלת-ממד: יש להגביר את המתיחה רק עד שהדופק העורקי הופך לבלתי מורגש באופן חזותי. מתיחה לא מספקת מובילה לדימום מתמשך במהלך הארטריוטומיה, בעוד שמתיחה מופרזת מסכנת את האנדותל ומעלה את הסיכון לקרע של כלי הדם. שנית, יש להדק את קשר ההחלקה הפרוקסימלי בצורה מאובטחת סביב כלי הדם וסביב תיל המוליך לפני הסרת הפלטפורמה; הסרה מוקדמת של הפלטפורמה כאשר קשר ההחלקה אינו מאובטח כראוי היא הסיבה השכיחה ביותר לדימום במהלך הפרוצדורה. שלישית, חיוני לאשר את כניסת תיל המוליך לחדר השמאלי תחת הדרכה של אקו-קרדיוגרפיה. ללא שלב אימות זה, המנתח אינו יכול להיות בטוח שתיל המוליך ממוקם נכונה במסתם האורטות, ופגיעה חלקית תביא לכישלון של המודל.

ניתן לצפות למספר סיבוכים נפוצים ולנהל אותם. אם מתרחש דימום במהלך הכנסת תיל הגרירה (guidewire), יש למקם מחדש את הפלטפורמה מתחת לכלי הדם כדי להשיג המוסטזיס זמנית לפני ההמשך. בבעלי חיים עם עורקי תרדמה (carotid arteries) בקליבר קטן יותר, הפחתה קלה של מתיחת הפלטפורמה עשויה להרחיב את לומן כלי הדם כדי לאפשר את הכנסת תיל הגרירה. למודל זה מספר מגבלות שיש לקחת בחשבון בעת פירוש התוצאות. הפגיעה המכנית על ידי התיל גורמת לפגיעה מכנית ודלקתית חריפה של המסתם, השונה מהתהליך הניווני הכרוני המונע על ידי ליפידים המאפיין היצרות אאורטלית כישכית (calcific aortic stenosis) בבני אדם¹⁷^,¹⁹^,²⁰^,²¹. כתוצאה מכך, המאפיינים ההיסטולוגיים — בעוד שהם משחזרים את העיבוי של עלוני המסתם וההסמכה הכישכית הדיסטרופית — עשויים שלא לשחזר במלואם את כל האירועים המולקולריים של המחלה בבני אדם. הפרוטוקול פותח ותוקף הן בעכברים זכרים והן בנקבות מזן C57BL/6 בגיל 8–10 שבועות; עם זאת, התאימות לזנים אחרים או לבעלי חיים מבוגרים דורשת תיקוף עצמאי. הבדלים תלוי-מין בקוטר עורק התרדמה ובאנטומיה של הלב עשויים להשפיע על הקושי הניתוחי ועל התוצאות ההמודינמיות; חוקרים מוזמנים לדווח על מין כמשתנה ביולוגי בניתוחים המשלימים²². בנוסף, ליגציה קבועה של עורק התרדמה המשותף הימני היא חלק בלתי נפרד מההליך, ואף על פי שמעגל ויליס (Circle of Willis) מספק פרפוזיה מוחית קולטרלית בעכברים ולא נצפו ליקויים נוירולוגיים גלויים, לא ניתן לשלול השפעות קוגניטיביות או צרברו-וסקולריות עדינות. לא בוצעו בדיקות אקו-לב בקו הבסיס (לפני ההליך); קבוצת השאם (sham group) המקבילה שימשה כביקורת לתפקוד תקין של המסתם, ומומלץ לבצע סריקת בסיס במידת האפשר כדי לאפשר השוואה בתוך אותו בעל חיים ולסנן מומומות ספונטניות נדירות של המסתם האאורטלי שדווחו בעכברי C57BL/6 (כ-0.3% בזנים שלא עברו שינוי). אי-ספיקה אאורטלית לא הוערכה באופן שיטתי במחקר זה; השכיחות של אי-ספיקה אאורטלית המושרית על ידי פגיעה והקשר שלה לחומרת ההיצרות מצדיקים הערכה ייעודית ויידונו בעבודות עתידיות.

יש לשקול גם חסרונות פוטנציאליים של הפלטפורמה. המכשיר עלול לגרום לגירוי מכני של מבנים סמוכים, כולל עצב הוואגוס העובר לצד העורקי הת carotid; סיכון זה ממועט הודות לקצוות המעוגלים והקהים של הפלטפורמה, לקודקוד של 120° המתאים לכלי הדם, ולזמן היישום הקצר; לא נצפו במחקר זה הפרעות נשימה או סיבוכים גלויים אחרים המיוחסים למכשיר. בהשוואה לגישות חלופיות מקובלות, פרוטוקול אופטימלי זה מציע מספר יתרונות מעשיים. מודלים תזונתיים בעכברי ApoE⁻/⁻ דורשים 20–24 שבועות של האכלה בשומן גבוה ומשיגים פנוטיפים סטנוטיים משתנים, כאשר בעלי חיים רבים אינם מפתחים מחלה בעלת משמעות המודינמית. הפרוטוקול הנוכחי מייצר פנוטיפ סטנוטי עקבי בתוך 4 שבועות, עם שיעור הצלחה כולל של 90% (18 מתוך 20 בעלי חיים). בהשוואה לשיטת תיל ההובלה (guidewire) המקורית של Honda, ההתקדמות העיקרית של פרוטוקול זה היא השליטה הסיסטמטית בדימום פרי-אופרטיבי באמצעות הפלטפורמה המודפסת בתלת-ממד.

דימום במהלך השחלת תיל guidewire זוהה כסיבוך של הטכניקה המקורית, אך לא טופל כראוי. בניסיון רטרוספקטיבי של אותה מעבדה עם הפרוצדורה הקונבנציונלית (לפני השימוש בפלטפורמה) (יותר מ-400 מקרים), דימום תוך-ניתוחי משמעותי התרחש בכ-40% מהמקרים, עם שיעור תמותה לאחר דימום של כ-60% ושיעור הישרדות של כ-75% לאחר 24 שעות, כאשר הדימום — בעיקר באתר הגישה לעורק התקרבי (carotid)— היה הגורם לכמעט כל מקרי המוות הפרי-אופרטיביים. ממצא זה עולה בקנה אחד עם Qian et al., שזיהו דימום באתר דקירת העורק התקרבי כגורם המרכזי למוות פרי-אופרטיבי במודל זה. באמצעות בקרה על איבוד הדם, הפלטפורמה המודפסת בתלת-ממד העלתה את שיעור ההישרדות ל-95% לאחר 24 שעות, ללא מקרי מוות המיוחסים לדימום בקבוצה הנוכחית. מכיוון שהדימום אינו מהווה עוד את המגבלה המרכזית, ניתן לשנות את עצימות הפגיעה המכנית כדי ליצור חומרה מדורגת של הסטנוזיס. ליכולת כיוון זו יש רלווניות תרגומית (translational) ישירה: עבור תרפיה מועמדת בעלת גודל אפקט צנוע, עשויה להיות נחוצה פגיעה בסיסית חמורה יותר כדי לחשוף הבדלים הקשורים לטיפול, שאחרת היו נבלעים במודל קל יותר.

מודל זה מתאים היטב למספר קטגוריות של מחקרים המשכיים. מכיוון שהפנוטיפ הסטנוטי מתפתח בלוח זמנים מוגדר וניתן לשחזור, הוא יכול לשמש כפלטפורמה להערכה פרה-קלינית של טיפולים פרמקולוגיים מועמדים שמטרתם להאט את הסמטריפיקציה או הפיברוזיס של המסתם²³. המודל תואם גם לגישות גנטיות: ניתן להחיל את הפרוטוקול על עכברים טרנסגניים או knockout על רקע של C57BL/6 כדי לבחון את התרומה של מסלולי איתות ספציפיים להתקדמות מחלת המסתם. בנוסף, נקודת הסיום לאחר 4 שבועות מספקת חלון מעשי לניטור אקו-קרדיוגרפי סדרתי של התפתחות המחלה או התגובה לטיפול. את קבצי התכנון של הפלטפורמה המודפסת בתלת-ממד ניתן לשתף באופן חופשי כקובץ .stp נלווה, וסטנדרטיזציה של מכשיר זה בין מעבדות צפויה לשפר עוד יותר את השחזוריות בין אתרים שונים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים פיננסיים או קונפליקטים של אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט הלאומי המרכזי למדע וטכנולוגיה למחלות כרוניות לא מדבקות (2026ZD0554300); הקרן הלאומית למדעים טבעיים של סין (U23A20395, 82170375, 82500455); הקרן הלאומית למדעים טבעיים של מחוז סיצ'ואן (2026NSFSC0552); קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות מרכזיות; פרויקטים של מדע וטכנולוגיה של האזור האוטונומי טיבט, סין (XZ202501ZY0120); ופרויקט '1.3·5' של בית החולים ווסט צ'יינה, אוניברסיטת סיצ'ואן (ZYGD23021, 23HXFH009). המחברים מודים ל-Qipu Feng (מרכז לניסויים בבעלי חיים, בית החולים ווסט צ'יינה, אוניברסיטת סיצ'ואן) על הסיוע באולטרסאונד של בעלי חיים קטנים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פלטפורמת תמיכה כלי דם מודפסת בתלת-ממד	הכנה מותאמת אישית	N/A	פלטפורמת תמיכה כלי דם מותאמת אישית מודפסת בתלת-ממד; קובץ CAD משלים מסופק בפורמט .stp.
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-3ML	קיבוע רקמות
חוט תפירה ניילון 5-0	Jinhuan Medical	F503	סגירת העור באמצעות תפריים מקוטעים
חוט תפירה משי 6-0	Jinhuan Medical	RC411	ליגציה קבועה של ה-RCCA הדיסטלי וקשר החלקה פרוקסימלי
ג'ל צימוד אקוסטי (מחומם מראש)	Keppler	KL-250	אקו-קרדיוגרפיה
שרף פוטו-פולימר תואם ביולוגית	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	חומר הדפסת SLA ששימש לייצור פלטפורמת התמיכה לכלי דם מותאמת אישית מודפסת בתלת-ממד.
עכברי C57BL/6 (8–10 שבועות; זכרים 22–25 g, נקבות 18–20 g)	GemPharmatech	C57BL/6	שני המינים שימשו לאורך כל הניסוי; השוכנו בתנאים סטנדרטיים
גז אתילן אוקסיד	מתקן סטריליזציה מוסדי	N/A	סטריליזציה של פלטפורמת התמיכה לכלי דם מותאמת אישית מודפסת בתלת-ממד.
FreeCAD	FreeCAD Project Association	1.1.1	ויזואליזציית CAD ויצירת שרטוט מבני תלת-ממדי מקובץ ה-.stp.
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.0	ניתוח סטטיסטי והצגת נתונים בגרפים
חוט מדריך (Guidewire), קוטר 0.014-inch	Boston Scientific	H749393071900	פגיעה מכנית במסתם האאורטלי
ערכת צביעה של Hematoxylin and Eosin (H&E)	Beyotime	C0105S	מורפולוגיה ועובי של עלה המסתם
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-2	3% להשראה; 1.5–2% לתחזוקה ב-100% O₂
Lidocaine	Shijiazhuang Pharmaceutical Group	H14024045	חלחול מקומי מניעתי באתר החיתוך (0.5%, שלב 1.5)
מספרי מיקרו-כירורגיה	RWD Life Science	F11022-11	חיתוך עור, ארטריוטומיה, תורקוטומיה
מתמר MX550D (40 MHz)	FUJIFILM VisualSonics	MX550D	אקו-קרדיוגרפיה
קרם להסרת שיער Nair	Nair	255 g	להסרת שיער מהצוואר הקדמי ומדופן החזה
סלקציית פוספט (PBS)	Servicebio	G4202-100ML	פרפוזיה
מיקרוטום סיבובי	Leica Biosystems	RM2125 RTS	חיתוך סדרתי בעובי 4–5 µm
מיקרוסקופ סטריאוסקופי (כירורגי)	Olympus	SZX7	בידוד כלי דם ומיקרו-כירורגיה
מערכת אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	אקו-קרדיוגרפיה
ערכת צביעה של Von Kossa	Servicebio	G1043-20ML	גילוי הסתיידות דיסטרופית
Xylene	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.	C0430530209	הבהרה של רקמות במהלך עיבוד פראפין.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otto CM, Newby DE, Hillis GS. Calcific aortic stenosis: a review. JAMA. 2024;332(23):2014–2026.
Vincent F, et al. Transcatheter aortic valve replacement in bicuspid aortic valve stenosis. Circulation. 2021;143(10):1043–1061.
Kraler S, et al. Calcific aortic valve disease: from molecular and cellular mechanisms to medical therapy. Eur Heart J. 2021;43(7):683–697.
Blaser MC, Bäck M, Lüscher TF, Aikawa E. Calcific aortic stenosis: omics-based target discovery and therapy development. Eur Heart J. 2025;46(7):620–634.
Lindman BR, et al. Calcific aortic stenosis. Nat Rev Dis Primers. 2016;2(1):16006.
Yu Chen H, et al. Dyslipidemia, inflammation, calcification, and adiposity in aortic stenosis: a genome-wide study. Eur Heart J. 2023;44(21):1927–1939.
Peeters FECM, et al. Calcific aortic valve stenosis: hard disease in the heart: a biomolecular approach towards diagnosis and treatment. Eur Heart J. 2018;39(28):2618–2624.
Cai D, Saint L, Markley J, Chen SY. Novel humanized aortic valve calcification model. Circ Res. 2025;136(12):1632–1635.
Rattazzi M, et al. Calcification of advanced atherosclerotic lesions in the innominate arteries of ApoE-deficient mice: potential role of chondrocyte-like cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(7):1420–1425.
Aikawa E, et al. Arterial and aortic valve calcification is abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 2009;119(13):1785–1794.
Hjortnaes J, et al. Arterial and aortic valve calcification inversely correlates with osteoporotic bone remodeling: a role for inflammation. Eur Heart J. 2010;31(16):1975–1984.
Aikawa E, et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 2007;116(24):2841–2850.
Honda S, et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014;34(2):270-278. doi:10.1161/ATVBAHA.113.302610.
Zhu Z, et al. Models for calcific aortic valve disease in vivo and in vitro. Cell Regen. 2024;13:6.
Zhong G, et al. Activation of Piezo1 promotes osteogenic differentiation of aortic valve interstitial cells through YAP-dependent glutaminolysis. Sci Adv. 2023;9(22):eadg0478.
Li S, et al. Targeted inhibition of PTPN22 is a novel approach to alleviate osteogenic responses in aortic valve interstitial cells and aortic valve lesions in mice. BMC Med. 2023;21(1):252.
Niepmann ST, et al. The graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics the human functional and morphological disease phenotype. Clin Res Cardiol. 2019;108(8):847–856.
Qian N, et al. A novel mouse model of calcific aortic valve stenosis. Anim Models Exp Med. 2024;7(4):523–532.
Iqbal F, et al. Sortilin enhances fibrosis and calcification in aortic valve disease by inducing interstitial cell heterogeneity. Eur Heart J. 2023;44(10):885–898.
Billig H, et al. Aortic valve stenosis and osteoporosis: insights from a mouse model. BMC Cardiovasc Disord. 2025;25(1):562.
Artiach G, et al. Omega-3 polyunsaturated fatty acids reduce aortic valve disease via the resolvin E1-ChemR23 axis. Circulation. 2020;142(8):776–789.
Clayton JA, Collins FS. NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 2014;509(7500):282–283.
Li B, et al. IGF1-mediated mesenchymal-endothelial transition as a potential regulatory target in calcific aortic valve disease. BMC Med. 2025;23(1):600.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

פרוטוקול אופטימלי למודל של היצרות מסתם אבי העורקים בהשראת תיל גלישה בעכברים

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים