ארבעים זכרים בוגרים של Sprague–Dawley (SD) בוגרים מסוג SPF, במשקל 240–280 גרם, נרכשו מ-Beijing Vital River Laboratory Animal Technology [מספר רישיון: SCXK (Jing) 2021-0011]. כל העכברים אוחסנו במרכז בעלי החיים המעבדה של אוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג בתנאים מבוקרים, עם טמפרטורת חדר של 23°C ±-1°C, לחות יחסית של 50% ±-5%, ומחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך, עם גישה חופשית למזון ולמים. העכברים הסתגלו ל-5 ימים, שבמהלכם בוצעה אימון הסתגלות על הליכון במקביל. בעלי החיים עברו הסתגלות להליכון פעם ביום במהירות של 10 מ'/דקה במשך 15 דקות בכל מפגש ללא גירוי חשמלי להפחתת לחץ בטיפול.
בהתבסס על המחקר הקודם שלנו, שיעור ההצלחה של השראת PSS באמצעות שיטת חסימת העורק המוחי האמצעי (MCAO) הוא כ-60%15. באמצעות טבלת מספרים אקראית, 9 חולדות נבחרו מראש כקבוצת ההפעלה המזויפת; 31 העכברים הנותרים שימשו להקמת דגמים. לאחר מידול מוצלח, חולקו חולדות אלו באקראי לקבוצת המודלים ולקבוצת MSSA. בסופו של דבר, בכל קבוצה נכללו תשעה חולדות. ניסוי זה בוצע בהתאם לעקרונות 3R לרווחת בעלי חיים במעבדה ואושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג (BUCM 20250915-008).
הקמת דגם
מודל MCAO הוקם בחולדות באמצעות טכניקת חוט תוך-לומי מותאמת. החולדות הורדמו עם 3% איזופלורן לצורך השראת, וההרדמה נשמרה עם 1.5% איזופלוראן שסופק בחמצן בקצב זרימה קבוע של 1 ליטר לדקה לאורך כל ההליך. בוצעה חתך צווארי אמצע, ואחריו ניתוח קהה לחשיפת עורק הקרוטיד הימני (CCA), עורק הקרוטיד החיצוני (ECA) והעורק הקרוטידי הפנימי (ICA). תפר מונופילמנט מניילון (קוטר, 0.36 ± 0.02 מ"מ) הוכנס ל-ICA דרך ה-ECA והתקדם כ-18–20 מ"מ לנקודת מוצא העורק המוחי האמצעי (MCA) להשגת חסימה עורקית. כלי הדם היו קשורים, והחתך נסגר. העכברים הונחו לאחר מכן על כרית חימום עד להחלמה מההרדמה. חולדות בקבוצת הניתוח המדומה עברו חשיפה ניתוחית זהה ל-CCA, ICA ו-ECA ללא הכנסת החוט התוך-לומינלי.
לאחר הניתוח, כל חולדות MCAO קיבלו טיפול סטנדרטי לאחר ניתוח. בעלי החיים הוחזקו על כרית חימום של 37°C במשך 12 השעות הראשונות כדי למנוע היפותרמיה. חתכים כירורגיים נוקו מדי יום במשך שלושה ימים רצופים, אמפיצילין (100 מ"ג/ק"ג) ניתנה בהזרקה תוך-צפקית למניעת זיהומים, וסופק מזון מרוכך לשמירה על תזונה מספקת. פעילות כללית, צריכת מזון, מצב הפצע ותפקוד המוטורי של הגפה נבדקו מדי יום מיום 1 עד 10 לאחר הניתוח.
ליקויים נוירולוגיים הוערכו על ידי חוקרים עיוורים להקצאת קבוצות באמצעות ציון החסר הנוירולוגי של Zea Longa, וטונוס השרירים הוערך באמצעות סולם אשוורת' מותאם (MAS). ההערכות בוצעו יום אחד לפני הניתוח (יום −1), ביום הניתוח לפני MCAO (יום 0), ובימים 1, 3, 5, 7 ו-10 לאחר הניתוח. עכברים עם ציוני זיאה לונגה ו-MAS ≥1 ביום השלישי לאחר הניתוח נחשבו כמי שהקימו מודל PSS מוצלח.
טיפול ב-MSSA
ההתערבויות החלו ביום השלישי לאחר הניתוח. אתר גירוי הדיקור בקרקפת היה קו ה-MS 6 האיפסילסיונלי (קו אלכסוני קדמי פריאטוטמפורלי). בהתאם לתקן הלאומי למניפולציות סטנדרטיות של דיקור קרקפת (GB/T 21709.2-2021), קו MS 6 משתרע מ-GV 21 (צ'יאנדינג) ועד GB 6 (שואנלי).
מחטי דיקור סטריליות חד-פעמיות (0.25 × 13 מ"מ) הוכנסו מתחת לגלאה אפונורוטיקה ב-GV 21 בזווית אלכסונית של כ-15° יחסית לפני הקרקפת, והוקדמו לכיוון GB 6 לאורך הקו האלכסוני הפרייטוטמפורלי הקדמי לעומק של כ-10 מ"מ. סיבוב מהיר (200 סיבובים לדקה) בוצע ברציפות במשך דקה אחת. לאחר 15 דקות של החזקת המחט, אותה סיבוב סיבוב חזר פעם אחת, מה שהוביל לזמן החזקת המחט הכולל של 30 דקות. במהלך כל תקופת שמירת המחטים, העכברים עברו בו זמנית תרגיל הליכון במהירות קבועה של 10 מ' לדקה.
העכברים בקבוצות המופעלות בדומה ובקבוצות הדגם לא קיבלו דיקור סיני ולא תרגיל על הליכון. כדי לשלוט בטיפול לא ספציפי ולחץ ריסון, הם טופלו בעדינות ונכבלו במחזיקי גרב לא דחיסיים למשך 30 דקות ליום, בהתאם למשך ההתערבות היומי הכולל של קבוצת MSSA.
הערכות התנהגותיות
ציון זאה לונגה לליקויים נוירולוגיים:
ליקויים נוירולוגיים בעכברים הוערכו באמצעות מערכת הניקוד Zea Longa16. הקריטריונים הבאים יושמו: ציון 0 הצביע על חוסר פגיעה נוירולוגית ותנועה בלתי מוגבלת תקינה; ציון של 1 הצביע על הארכה לא מלאה של הגפה הקדמית או האחורית הנגדית לצד הפגוע; ניקוד של 2 הצביע על סיבוב לכיוון הצד הנגדי במהלך תנועה; ציון של 3 הצביע על נפילה לצד הנגדי בזמן הליכה; וציון של 4 הצביע על אובדן הכרה עם היעדר תנועה ספונטנית.
MAS לטונוס שרירים:
טונוס השרירים הוערך באמצעות MAS17. הקריטריונים הוגדרו כך: דרגה 0, ללא עלייה בטונוס השרירים; דרגה 1, עלייה קלה בטונוס השריר, עם תפיסה חולפת או התנגדות מינימלית בסוף כיפוף והארכה פסיבית; דרגה 1+, עלייה משמעותית בטונוס השרירים, עם תפיסה חולפת בטווח התנועה האמצעי והתנגדות מתמשכת במחצית השנייה של התנועה; דרגה 2, עלייה בולטת בטונוס השרירים, עם התנגדות ניכרת ברוב טווח התנועה, אם כי הגפה נותרה ניתנת לתנועה בקלות; דרגה 3, עלייה משמעותית בטונוס השרירים שהקשתה על כיפוף והארכה פסיבית; ודרגה 4, תנועה פסיבית מוגבלת עקב קשיחות מפרקים. כיתה 1+ קיבלה ציון של 2 נקודות, מה שהניב ציון MAS מקסימלי של 5 נקודות במחקרזה 10.
הדמיה מוחית T2WI לכימות נפח אוטם מוחי
כל סריקות T2WI נרכשו באמצעות סורק MRI של PharmaScan שהופעל בתוכנת ParaVision 360 (גרסה 3.5). רצף פולס טורבו מהיר משוקלל במשקל T2 עם שיפור הרפיה (T2_TurboRARE, המכונה גם RARE/echo ספין מהיר [FSE]) יושם על חולדות MCAO לכימות נפח האונם המוחי. פרמטרי ההדמיה הוגדרו כך: זמן חזרה (TR) = 3000.0 מילישניות, זמן הד (TE) = 33.0 מילישניות, שדה ראייה (FOV) = 35.00 × 35.00 מ"מ 2, גודל מטריצה = 250 × 250, עובי פרוסה = 0.80 מ"מ, מספר פרוסות = 35, מספר עירורים (NEX) = 3.0, וזווית היפוך (FA) = 180.0°. אזורי האונם המוחי סומנו ידנית על בסיס פרוסה-אחר פרוסה בתוכנת ITK-SNAP (גרסה 4.4.0) על ידי חוקר יחיד שהיה עיוור להקצאת קבוצות, תוך שימוש בשינויים בעוצמת האות ותכונות מורפולוגיות התואמים לאוטם איסכמית. נפח האוטם המוחי חושב אוטומטית על ידי התוכנה.
DTI Neuroimaging להערכת שלמות מיקרו-מבנית של חומר לבן
נתוני MRI נאספו באמצעות סורק תהודה מגנטית PharmaScan בנפח 7.0 טון. הרדמה הושרתה עם 3% איזופלוראן שסופק באוויר דחוס (0.4–0.6 ליטר לדקה) ונשמרה עם איזופלורן של 1% לאורך כל רכישת DTI. טמפרטורת הגוף המרכזית נשמרה באמצעות אמבטיית מים מבוקרת תרמוסטטית לאורך כל תהליך ההדמיה.
במהלך סריקת MRI, הוחל לראשונה רצף מיקום בשלושה מישורים כדי למקם את מוח העכברוש בתוך המגנט. DTI בוצע באמצעות רצף דימות אקו-מישורי ספין-אקו צירי עם הפרמטרים הבאים: TR/TE = 3000/27 מילישניות, מטריצה = 90 × 75, שדה ראייה = 20 × 15מ"מ 2, עובי פרוסה = 0.7 מ"מ, 30 כיווני גרדיאנט דיפוזיה, וערכי b של 0 ו-1000 שניות/מ"מ 2. לניתוח DTI, אזורים בעלי עניין צוירו בקפסולה החיצונית על פרוסות מוח בעומק 1.3 מ"מ אחורי לברגמה. מיפויים פרמטריים של אניזוטרופיה חלקית (FA), דיפוזיביות ממוצעת (MD), דיפוזיביות אקסיאלית (AD) ודיפוזיביות רדיאלית (RD) שוחזרו באמצעות תוכנת ParaVision 360. הנתונים מבוטאים כיחס בין ההמיספרה הפגועה לחצי הכדור הבריא הנגדי.
צביעת LFB להערכת פגיעת מיאלין ורמיאלינציה
צביעת LFB בוצעה להערכת נזק מבני לאקסונים המיאליניים בקפסולה החיצונית. פגיעת המיאלין, המתאפיינת בהחזרת מיאלין ווואקוולציה, נמדדה על ידי מדידת צפיפות אופטית משולבת (IOD) של סיבים מיואליניים מוצבעים ב-LFB בתוך ה-ROI בקפסולה החיצונית באמצעות תוכנת ImageJ (גרסה 6.0; סף גווני אפור, 35–225). בהתבסס על אטלס סטריאוטקסי18 של מוח העכברים, נותחו שלושה חתכים קורונליים לכל בעל חיים בעומק של ברגמה +1.0 מ"מ, −1.3 מ"מ ו-−1.6 מ"מ, התואמים לחלקים הקדמיים, האמצעיים והאחוריים של הקפסולה החיצונית. ממוצע ה-IOD בשלושת החלקים חושב כך שייצג כל בעל חיים (n = 4 לכל קבוצה). ערכי IOD איפסילטרליים ננורמו לצד הנגדי והובאו לביטוי באחוז19.
הקלטות אלקטרופיזיולוגיות להערכת התעוררות רפלקס בעמוד השדרה
רפלקס H-הסינפטי המונוסינפטי של השדרה נרשם באמצעות מערכת ניסוי תפקוד ביולוגי. חולדות הורדמו בעדינות עם α-כלורלוז (50 מ"ג/ק"ג, תוך-פריטוני) כדי לשמור על התעוררות רפלקס עמוד שדרה במהלך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. העצב הסיאטי השמאלי נחשף על ידי דיסקציה קהה והוצב על אלקטרודות דו-קוטביות לגירוי חשמלי. תמיסת ויטמינים שומנית הונחה לסירוגין על העצב החשוף כדי לשמור על הידרציה ברקמה ובחיוניות עצבית. זוג אלקטרודות רישום מפלדת אל-חלד הוכנסו לשרירי הבין-עצמות של כף הרגל האחורית השמאלית, ואלקטרודה קרקעית הונחה בזנב. רפלקס ה-H הופעל באמצעות מגרה פולס מונופולרי-דו-קוטבי עם אורך פולס של 100 מיקרושניות. סף רפלקס H וסף המוטורי (MT) נקבעו באמצעות גירוי חשמלי הדרגתי, כאשר הזרם הוגדל בשלבים של 0.05 mA לעוצמה מקסימלית של 3.0 mA כדי למנוע פגיעה בלתי הפיכה בעצב ההיקפי.
באמצעות אותה עוצמת גירוי שגרמה לרפלקס H המקסימלי (Hmax), סופקו גירויים פולסים בתדרים משתנים (0.3, 5 ו-10 הרץ) לקבלת אמפליטודות רפלקס H בתדרי גירוי שונים. גירוי פולסים חוזר ב-0.3 הרץ יושם כדי לוודא שהמשרעת של גל M נשארת בטווח של 95% מערכה ההתחלתי; אחרת, מערך הנתונים נזרק. דיכאון תלוי בתדר H רפלקס (FDD) חושב כאחוז יחס המשרעת של גל H/M (יחס H/M) ב-5 הרץ ו-10 הרץ ביחס לזה ב-0.3 הרץ, כאשר יחס H/M ב-0.3 הרץ משמש כנקודת ייחוסבסיסית 10.
ניתוח נתונים
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת SPSS (גרסה 20.0). נתונים רציפים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). נורמליות הנתונים הוערכה באמצעות מבחן שפירו–וילק. ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) שימש להשוואת תוצאות דימות קונבנציונליות ומשתנים כמותיים נוספים בין קבוצות. כאשר הושג הומוגניות של השנות, בוצעו בדיקות פוסט-הוק של בונפרוני; אחרת, מבחן T3 של דאנט יושם. נתוני התנהגות נותחו באמצעות ANOVA דו-כיווני עם קבוצת ניסוי ונקודת זמן לאחר ניתוח כגורמים קבועים. ניתוח קורלציה של ספירמן שימש להערכת קשרים בין משתני המחקר. ערך של p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.