מחקר זה מעריך את ההשפעות של Zuogui Pill על אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר בחולדות שעברו כריתת שחלות (ovariectomized), תוך שימוש במערך ניסויי פקטוריאלי של שלושה על שלושה. התוצאות תומכות בהשפעות סינרגטיות של רכיבי Yin ו-Yang על מטבוליזם של העצם ועל סמנים קשורים של מסלול EphB4/ephrinB2, אם כי הראיות המכניסטיות נותרות אסוציאטיביות ולא סיבתיות.
מאמר מחקר
גלולת Zuogui מווסת את הצימוד בין אוסטאובלסטים לאוסטאוקלסטים בחולדות שעברו כריתת שחלות: מחקר פקטוריאלי של שלושה על שלושה
21 צפיות
⸱
11 בספטמבר 2026
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר נגרם כתוצאה מניתוק בין תהליכי בניית העצם לספיגת העצם, הקשור למחסור באסטרוגן. מחקר זה כימת את ההשפעות העצמאיות והאינטראקטיביות של תתי-פורמולציות של Zuogui Pill Yin-nourishing במודל של חולדות שעברו כריתת שחלות, ובחן קשרים עם מסלול EphB4/ephrinB2/RhoA/alkaline phosphatase. בהתאם ל-ARRIVE 2.0, 130 חולדות נקבה מסוג Sprague-Dawley נטולות פתוגנים ספציפיים חולקו רנדומלית ל-13 קבוצות (n=10/group), כולל תשע קבוצות במערך פקטוריאלי של שלושה על שלושה. מדדי הקצה כללו P1NP, CTX-1, צפיפות מינרלים של עצם הפמור כפי שנמדדה באמצעות ספיגומטריה של קרני רנטגן באנרגיה כפולה (DXA), היסטולוגיה של העצם הספוגית, וביטוי של mRNA וחלבונים שנמדד באמצעות RT-qPCR ו-Western blotting. הפורמולה המלאה (I2A2) הייתה קשורה לרמות P1NP גבוהות יותר, CTX-1 נמוך יותר ו-BMD גבוה יותר בהשוואה לקבוצת המודל. ניתוח פקטוריאלי זיהה אינטראקציית Yin-Yang בין P1NP ל-BMD, מה שתומך בסינרגיה פרמקולוגית. שינויים מולקולריים היו קשורים לעלייה בביטוי של EphB4/ephrinB2/ALP ולירידה בביטוי של RhoA. ממצאים אלו תומכים בקשר בין טיפול ב-Zuogui Pill, שיפור בפנוטיפים של העצם ומודולציה של סממני המסלול; הוכחת תלות סיבתית במסלול דורשת תיקוף באמצעות מעכבים, knockdown ותרביות משותפות (co-culture).
מבוא
אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר (PMOP) פוגע באוכלוסייה גדולה של נשים ומאופיין בשיבוש של האיזון בין בניית העצם לספיגתה, הקשור למחסור באסטרוגן1,2. מערכת הקולטן-ליגנד EphB4/ephrinB2 מתווכת את התקשורת בין אוסטאובלסטים לאוסטאוקלסטים; איתות של EphB4 תומך בדיפרנציאציה של אוסטאובלסטים ובפעילות של פוספטאזה אלקלית (ALP), בעוד שאיתות הפוך של ephrinB2 יכול להגביל את האוסטאוקלסטוגנזה באמצעות מנגנונים הקשורים ל-RhoA3,4. צימוד מופחת בעצם עם מחסור באסטרוגן מספק רציונל מכניסטי להערכת התערבויות המשפיעות על שני הזרועות התאיים של תהליך השחלוף.
טיפולים נוכחיים באוסטאופורוזיס, כולל סוכנים אנאבוליים ואנטי-רסורפטיביים, מפחיתים את הסיכון לשברים אך עשויים להיות מוגבלים על ידי היענות לטיפול, עלות, התוויות נגד, אפקטים של ריבאונד או תופעות לוואי במהלך שימוש ממושך5. לפיכך, טיפולים מועמדים המשפרים את בניית העצם תוך הגבלת רסורפציה מוגברת נותרים רלוונטיים מבחינה מדעית.
גלולת Zuo Gui (ZGP; Zuo Gui Wan) היא מרשם קלאסי רב-מרכיבים המשמש ברפואה סינית מסורתית לטיפול בחסר של תמצית הכליות (kidney-essence deficiency), תבנית תיאורטית הקשורה לחולשה של העצמות. המרכיבים המזינים את ה-Yin כוללים Rehmannia glutinosa (שורש מעובד, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (ריזומה, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (פרי, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (פרי, Gou Qi Zi, 12 g), ג'לטין מלוחית של Chinemys reevesii (ג'לטין המופק מהלוחית, Gui Ban Jiao, 12 g), ו-Cyathula officinalis (שורש, Chuan Niu Xi, 9 g). המרכיבים המחזקים את ה-Yang כוללים Cuscuta australis (זרע, Tu Si Zi, 12 g) וג'לטין מקרן של Cervus elaphus (ג'לטין המופק מהקרן, Lu Jiao Jiao, 12 g). בתיאוריה הקלאסית, העיקרון של חיפוש Yang בתוך Yin חוזה כי צמחים מחזקי Yang עשויים להגביר בסיס מזין Yin במקום לפעול כתוספים עצמאיים פשוטים. ראיות קליניות ומחקרים פרה-קליניים דיווחו על פעילות אנטי-אוסטאופורוטית של ZGP או של התערבויות המכילות ZGP, כולל השפעות על BMD, אוסטאוגנזה והתנהגות פרמקוקינטית6,7,8,9,10.
החידוש במחקר זה טמון בהפרדה פקטוריאלית פורמלית של שלושה על שלושה בין מרכיבים מזיני-Yin למרכיבים מחזקי-Yang בחולדות שעברו כריתת שחלות (OVX), תוך הערכה סימולטנית של פנוטיפים של עצם ומסמנים של נתיב ה-EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. תכנון זה בוחן את תאוריית התאימות של הפורמולציה באופן ישיר יותר ממחקרים המשתמשים רק במרשם המלא או במשווה יחיד, תוך הכרה בכך ששינויים במסמני הנתיב נותרים אסוציאטיביים אלא אם כן הם נחסמים או מושתקים באופן מכניסטי1.
פרוטוקול
כל ההליכים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ובקרת בעלי חיים של אוניברסיטת הרפואה של מונגוליה הפנימית (מספר אישור YKD202404105) ובוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE 2.012.
מערך המחקר
המחקר בוצע בפלטפורמת הניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת הרפואה של מונגוליה הפנימית. הוחל תכנון פקטוריאלי מלא של שלושה על שלושה עם שני גורמים: פורמולציית בסיס להזנת Yin (I; שלוש רמות מינון: 0, 27, 54 g של שווה ערך לסם גולמי) ופורמולציית הגברת Yang (A; שלוש רמות מינון: 0, 8, 16 g של שווה ערך לסם גולמי), מה שהניב תשעה תאים פקטוריאליים בתוספת ארבע קבוצות ביקורת. התכנון הפקטוריאלי מוצג בטבלה 1. I2A2 מייצגת את פורמולציית ZGP המלאה במינון שווה-קליני. המרת המינונים בוצעה בשיטת שטח פני השטח של הגוף (חולדה: בן אדם, פקטור = 6.25)13.
בעלי חיים, רנדומיזציה וסמיות
מאה ושלושים חולדות נקבה מסוג Sprague-Dawley נקיות מפתוגנים ספציפיים (בגיל 6 חודשים, 20–250 g) הוקצו באמצעות טבלת מספרים אקראית שהופקה במחשב. קודי ההקצאה הוכנסו למעטפות שנחתמו באופן רצפי על ידי חוקר שלא היה מעורב בהערכת התוצאות. החולדות שוכנו בקבוצות של 3–4 פרטים לכל כלוב מאוורר תחת מחזור אור/חושך של 12 h, בטמפרטורה של 22 ± 2 oC ולחות של 50–60%, עם גישה חופשית למים, מזון סטנדרטי למכרסמים עם תכולת סידן וזרחן מתועדת, פעילות בכלוב והעשרה סביבתית. בדיקות מולקולריות, דירוג היסטולוגי, כימות תמונות ודנסיטומטריה בוצעו על ידי חוקרים שהיו עיוורים להקצאה. גודל המדגם נקבע באמצעות ניתוח עוצמה a priori, שהניב n = 10 לכל קבוצה.
מודל OVX וטיפול תרופתי
כריתה דו-צדדית של השחלות (OVX) בוצעה תחת הרדמה של isoflurane שנשאף באמצעות מאייד מדויק. ההרדמה הושרתה בריכוז של 3–4% בחמצן ונשמרה בריכוז של 1.5–2.5% באמצעות קונוס לאף. עומק הרדמה מספק אוש על ידי אובדן רפלקס נסיגת הכף ורפלקס העפעפיים, לצד נשימה יציבה. הצלחת ה-OVX הוערכה על פי היעדר מחזור בנרתיק ביום ה-5 והפחתה ב-BMD כ-12 שבועות לאחר הניתוח. לאחר תיקוף המודל, ניתן טיפול באמצעות gavage למשך 8 שבועות (1 mL/10 g/day). תמציות (Decoctions) הוכנו על ידי מיצוי רצף במים ברתיחה גולית (10 °C, reflux), בנפח של 10x למשך 2 שעות, ולאחר מכן בנפח של 8x למשך 1.5 שעות, סינון דרך ארבע שכבות של גזה רפואית, וריכוז תחת לחץ מופחת ל-0.968 g של תרופה גולמית/mL. התמצית המרוכזת נשמרה ב-4 °C ונעשה בה שימוש תוך 7 ימים מההכנה. ביקורות חיוביות היו גרנולות Gusukang (1.8 g/kg/day) ו-diethylstilbestrol (0.04 mg/kg/day). בסיום הניסוי, החולדות הורדמו עמוק ב-5% isoflurane עד לאובדן רפלקס הכף והקרנית, לאחר מכן בוצע דימום מלא (exsanguination) ופריקה צווארית. המוות אוש על ידי הפסקת דופק ונשימה. גופות ורקמות נשלחו כפסולת ביולוגית; שאריות כימיות פונו כפסולת מסוכנת; ומחטים או להבים הונחו במכלי חפצים חדים מאושרים.
מדדי תוצאה
רמות P1NP ו-CTX-1 בסרום נמדדו באמצעות sandwich ELISA (מבית Jiyinmei)14צפיפות העצם (BMD) הפמורלית כמתה באמצעות DXA. היסטולוגיה של העצם הספוגית נבחנה באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין בהגדלה של 20x. ביטוי גנים נבחן באמצעות RT-qPCR תוך שימוש ב-2-ΔΔCt שיטה, בנורמליזציה ל-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). ביטוי חלבוני הוערך באמצעות Western blot וכימות באמצעות ImageJ (ראה טבלת חומרים). המשקלים המולקולריים שנצפו ומידע מקטלוג הנוגדנים מופיעים ב- טבלה נלווית 1. Primer sequences were: EphB4 forward/reverse, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.
ניתוח סטטיסטי
הנורמליות נבחנה באמצעות מבחן Shapiro-Wilk, והומוגניות השונות נבחנה באמצעות מבחן Levene לפני ביצוע ניתוח פרמטרי. נתונים מוצגים כממוצע ± SD, וכל פסי השגיאה באיורים הכמותיים מציינים SD. ניתוח שונות דו-כיווני (Two-way factorial ANOVA) הוחל על תשעת התאים הפקטוריאליים כדי להעריך את ההשפעות המרכזיות ואת האינטראקציה בין I ל-A, כאשר גודל האפקט נמדד באמצעות partial eta-squared (ηp2). השוואות זוגיות בין כל 13 הקבוצות בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם תיקון Bonferroni. הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו בתוכנת GraphPad Prism. סמלי המובהקות מוגדרים באופן עקבי כדלקמן: *, **, ***, **** מציינים p <0.05, p <0.01, p <0.01, p <0.01 לעומת המודל; #, ##, ###, #### מציינים את אותם ספי השונות לעומת full-formula ZGP.
תוצאות
תיקוף המודל באמצעות ציטולוגיה נרתיקית
הצלחת ה-OVX אוששה בכל החיות שעברו כריתת שחלות, כפי שניתן לראות מהיעדר מחזורי הסטרוס תוך 5 ימים לאחר הניתוח (איור 1A), בעוד שחיות שעברו ניתוח דמה (sham) שמרו על מחזור של 4 ימים (איור 1B). לאחר 12 שבועות, בדיקת DXA הראתה BMD פמורלי נמוך יותר בקבוצת מודל ה-OVX מאשר בביקורת ה-sham (0.214 ± 0.020 לעומת 0.281 ± 0.019 mg/cm3; Bonferroni-adjusted p < 0.01), ממצא התומך בהקמת מודל אובדן העצם המושרה על ידי OVX לפני הטיפול.
צפיפות מינרלית של העצם
נוסחת ה-ZGP המלאה (I2A2) הראתה את התשקום הגבוה ביותר של BMD מבין תתי-הנוסחאות הפקטוריאליות והייתה דומה באופן סטטיסטי לשתי ביקורות החיוביות (טבלה 2, איור 2). כל תתי-הנוסחאות הפקטוריאליות העלו את ה-BMD ביחס לקבוצת המודל. רמה גבוהה של הזנה של Yin בלבד (I3A1: 0.253 mg/cm3) ורמה גבוהה של הגברת Yang בלבד (I1A3: 0.243 mg/cm3) נותרו נמוכות יותר מ-ZGP מלא (I2A2: 0.307 mg/cm3), מה שתומך בקיומה של אינטראקציה ולא באפקט פשוט של מינון.
סמנים לסב העצם בנסיוב
בהשוואה לקבוצת המודל, ZGP בנוסחה מלאה היה קשור לעלייה ב-P1NP (+51%; 95% CI: 210.3–327.5 pg/mL; p <0.01) ולירידה ב-CTX-1 (-16%; p <0.01), באופן העולה בקנה אחד עם שיפור במאזן היצירה-ספיגה (איור 3A,B). זרועות של מונותרפיה במינון גבוה הניבו ערכי P1NP מוחלטים גבוהים יותר בחלק מההשוואות, אך הדפוס הפקטוריאלי תמך בפעילות משולבת אופטימלית ולא בתגובה למינון מקסימלי של זרוע אחת. נתונים מלאים ברמת הקבוצה מופיעים בטבלה 3.
ANOVA פקטוריאלית ואינטראקציה סינרגית
ניתוח שונות (ANOVA) פקטוריאלי דו-כיווני של תשעת התאים הפקטוריאליים העלה השפעות עיקריות מובהקות של גורמים מזיני-Yin וגורמים מחזקי-Yang, ומונחי אינטראקציה מובהקים בין I ל-A בנקודות הקצה הראשוניות (טבלה 4). אפקט האינטראקציה עבור P1NP (ηp2 = 0.74) מצביע על כך שרכיבים מחזקי-Yang הגבירו את פעילותם של רכיבים מזיני-Yin תחת תנאים ניסיוניים אלו.
צפיפות העצם (תיקוף המודל)
צפיפות העצם הפמורלית הייתה נמוכה יותר בקבוצת המודל (OVX) מאשר בקבוצות הביקורת (Blank) ובקבוצות שעברו ניתוח דמה (Sham), דבר המאשר השראה מוצלחת של פנוטיפ אובדן עצם כתוצאה מ-OVX לפני הטיפול, כפי שמוצג ב-איור 4.
ביטוי של EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP
בניתוחי RT-qPCR נעשה שימוש בדגימות ביולוגיות מכל קבוצה עם תגובות טכניות בשלוש חזרות, ובדיקת דנסיטומטריה של Western blot בוצעה על ליזטים ביולוגיים עצמאיים (איור 5 ו-איור 6). בהשוואה לקבוצת המודל, טיפול ב-ZGP בפורמולה מלאה היה קשור לרמות גבוהות יותר של EphB4 (0.498 ± 0.09 לעומת 0.048 ± 0.02; p < 0.01), ephrinB2 (0.41 ± 0.036 לעומת 0.048 ± 0.03; p < 0.01), ו-ALP (0.842 ± 0.019 לעומת 0.090 ± 0.03; p < 0.001), ולרמות נמוכות יותר של RhoA (1.658 ± 0.028 לעומת 7.32 ± 0.430; p < 0.01). ממצאים מולקולריים אלו מפורשים כהקשרים בין סמני מסלול ולא כהוכחה לתיווך סיבתי.
זמינות נתונים
קבצי הנתונים המקוריים ששימשו להפקת תוצאות המחקר הנוכחי מסופקים כקובץ קידוד נלווה (Supplementary Coding File) המצורף למאמר זה
איור 1(A) ציטולוגיה נסמכת של הנרתיק ששימשה לאימות מחזוריות הנסתר (צביעת hematoxylin and eosin, הגדלה של 200x). משטח נרתיקי מייצג מחוללת שעברה כריתת שחלות, המראה ציטולוגיה עקבית של אי-מחזוריות. (ב) משטח נרתיקי מייצג מחולדה שעברה ניתוח דמה (sham), המדגים מחזוריות בייצול תקינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2צפיפות עצם (BMD) פמורלית בכל הקבוצות. פסי השגיאה מציינים סטיית תקן (SD). סמלים סטטיסטיים מצביעים על השוואות בתיקון בונפרוני (Bonferroni-adjusted) מול מודל או ZGP בנוסחה מלאה, כפי שהוגדרו בסעיף הניתוח הסטטיסטי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 3סמני תחלופה של עצם בנסיוב. (A(P1NP, סמן לבניית עצם.)B) CTX-1, סמן לספיגת עצם. פסי השגיאה מציינים SD. סממנים סטטיסטיים מציינים השוואות מתוקננות לפי מבחן בונפרוני (Bonferroni) ביחס למודל או ל-ZGP בנוסחה מלאה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4צפיפות עצם הפמור המאשרת אובדן עצם המושרה על ידי OVX לפני הטיפול. תרשים עמודות המשווה את צפיפות העצם הפמורלית (מג/סמ"ק)3בין קבוצת הביקורת (ללא כריתת שחלות, לא טופלה), קבוצת הפרוצדורה המדומה (Sham) וקבוצת המודל (OVX) בנקודת הזמן של תיקוף המודל לפני הטיפול. הסרגלים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 10 לקבוצה). *** = p < 0.01 לעומת Blank ולעומת Sham (בדיקת ANOVA חד-כיוונית עם תיקון בונפרוני). אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5ביטוי גני יחסי של mRNA. רמות הביטוי של (A(EphB4)B(ephrinB2)C(RhoA)ד') ALP באמצעות ה-2^-ΔΔשיטת Ct שנורמלה ל-GAPDH. ב-qPCR נעשה שימוש בשלוש חזרות טכניות עבור כל דגימה ביולוגית. פסי השגיאה מציינים SD. סמלים סטטיסטיים מציינים השוואות שסוכמו לפי תיקון בונפרוני (Bonferroni). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6ביטוי חלבונים בשיטת Western blot. הפאנלים מציגים אימונובלוטים נציגים עבור EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP, ובקרת טעינה GAPDH, שנבחרו מדגימות ביולוגיות בלתי תלויות. הדנסיטומטריה נורמלה ל-GAPDH באמצעות ImageJ. משקלים מולקולריים שנצפו: EphB4, 10 kDa; ephrinB2, 36 kDa; RhoA, 2 kDa; ALP, 39 kDa; GAPDH, 37 kDa (ראה טבלה נספחת 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.
| גורם מזין-יין (I) | ||||
| I₁ (0 גרם) | I₂ (27 גרם) | I₃ (54 גרם) | ||
| גורם מעצים של Yang (A) | A₁ (0 גרם) | I₁A₁ (מודל) | I₂A₁ (יין) | I₃A₁ (הי-יין) |
| A₂ (8 גרם) | I₁A₂ (יאנג) | I₂A₂ (ZGP†) | I₃A₂ (Hi-Yin+Yang) | |
| A₃ (16 גרם) | I₁A₃ (הי-יאנג) | I₂A₃ (Yin+Hi-Yang) | I₃A₃ (Full-Hi) | |
טבלה 1: מערך פקטוריאלי שלוש על שלוש וקבוצות ניסוי. הטבלה מציגה את 13 קבוצות הניסוי המסודרות במערך פקטוריאלי של 3 על 3 של רמות מינון של הזנת-Yin (I) והגברת-Yang (A), בתוספת 4 קבוצות ביקורת. †I₂A₂ = פורמולת Zuogui Pill מלאה במינון שקול קלינית. המרת מינון בוצעה באמצעות שיטת שטח פני השטח של הגוף (חולדה : בן אדם = 6.25).
| קבוצה | תא פקטוריאלי | BMD (mg/cm³, x̄ ± SD) | לעומת מודל |
| בקרת Blank | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| ניתוח Sham | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| מודל (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| Yang-enhancing | I₁A₂ | 0.258 ± 0.01 | ** |
| High Yang-enhancing | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| Yin-nourishing | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| High Yin-nourishing | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| Yin + Hi-Yang | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| Hi-Yin + Yang | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| Full-High | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| נוסחת ZGP מלאה | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| בקרת TCM חיובית | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| בקרת רפואה מערבית | — | 0.307 ± 0.09 | **** |
טבלה 2: BMD פמורלי בכל הקבוצות (n=10/קבוצה, ממוצע ± SD). * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p<0.01, **** = p<0.001 לעומת המודל (תיקון Bonferroni).
| קבוצה | תא | P1NP (pg/mL, x̄ ± SD) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± SD) |
| בקרת בלנק | — | 1388.8 ± 29.7****#### | 3.4 ± 6.8****#### |
| ניתוח דמה (Sham) | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| מודל (OVX) | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| הגברת Yang | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| הגברת Yang גבוהה | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| הזנת Yin | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 88.2 ± 7.6** |
| הזנת Yin גבוהה | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| Yin + Hi-Yang | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| Hi-Yin + Yang | I₃A₂ | 90.2 ± 16.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| Full-High | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| פורמולת ZGP מלאה | I₂A₂ | 794.8 ± 6.0**** | 8.2 ± 6.0**** |
| בקרת TCM חיובית | — | 967.7 ± 49.9****# | 6.3 ± 6.1****#### |
| בקרת רפואה מערבית | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
טבלה 3: רמות P1NP ו-CTX-1 בסרום בכל הקבוצות (n=10 לקבוצה, ממוצע ± SD). ** = p <0.01, **** = p <0.01 לעומת המודל; # = p <0.05, ## = p <0.01, ### = p <0.01, #### = p <0.01 לעומת ZGP (במבחן Bonferroni). רווח ברת סמך (CI) של 95% עבור P1NP ב-ZGP לעומת המודל: 210.3–327.5 pg/mL.
| תוצאה | גורם | df | ז׳ | ערך p | חלקי η² |
| P1NP (pg/mL) | יין (I) | 2, 81 | 17.84 | <0.001 | 0.31 |
| יאנג (A) | 2, 81 | 6.22 | 0.003 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 57.21 | <0.001 | 0.74 | |
| צפיפות עצם (מ"ג/סמ"ק)³) | יין (I) | 2, 81 | 31.90 | <0.0001 | 0.44 |
| יאנג (A) | 2, 81 | 28.70 | <0.0001 | 0.41 | |
| I × A | 4, 81 | 24.60 | <0.0001 | 0.55 | |
| CTX-1 (ng/mL) | יין (I) | 2, 81 | 14.22 | <0.001 | 0.26 |
| יאנג (A) | 2, 81 | 5.88 | 0.004 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 19.43 | <0.001 | 0.49 |
טבלה 4: אפקטים עיקריים ואינטראקציות של ANOVA פקטוריאלי של 3x3 עם השוואות post-hoc המתוקנות בשיטת Bonferroni. Partial eta-squared מדווח כגודל האפקט. df מציין דרגות חופש.
טבלה נלווית 1. מידע על נוגדנים ל-Western blot. הטבלה מפרטת את חלבוני המטרה, המשקלים המולקולריים שנצפו, הספקים, מספרי הקטלוג, מיני המארח ודילוציות העבודה של הנוגדנים הראשוניים והמשניים ששימשו במחקר זה.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
קובץ קידוד נלווה 1. נתונים ניסיוניים גולמיים התומכים במחקר. ארכיון זה מכיל את קבצי הנתונים המקוריים ששימשו להפקת התוצאות המוצגות במאמר, כולל מדידות BMD פרטניות, נתונים גולמיים של ELISA, ערכי Ct של RT-qPCR עם פלטי הגברה ועקומות המסה, תמונות מקוריות של Western blot וקבצי ניתוח דנסיטומטריה, תמונות מיקרוסקופיה היסטולוגיות מייצגות, וקבצי פלט שהופקו ממכשירים הקשורים לניסויים אלו.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
איבר האינטראקציה הפקטוריאלית תומך בקשר לא-אדיטיבי בין הרכיבים המזינים את ה-Yin והמרקיים את ה-Yang של ZGP. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם העיקרון המסורתי של חיפוש Yang בתוך Yin, שבו רכיבים המרקיים את ה-Yang צפויים להפעיל או להגביר את הבסיס המזין את ה-Yin15. יש לפרש ממצא זה כסינרגיה פרמקולוגית ברמת הפורמולציה. הוא אינו מזהה את הרכיבים הפעילים הבודדים האחראים לאפקט.
EphB4 ו-ephrinB2 הם מתווכים סבירים מבחינה ביולוגית של צימוד בין אוסטאובלסטים לאוסטאוקלסטים3,4, אך הראיות הקיימות הן קורלטיביות. העלייה שנצפתה ב-EphB4, ephrinB2 ו-ALP עם ירידה ב-RhoA עולה בקנה אחד עם שיפור בצימוד, אך היא אינה מוכיחה כי נתיב זה הוא הכרחי או מספיק לפעולתו של ZGP. נדרשים מעכבי נתיב, גישות לחסימת EphB4 או ephrinB2, מודולציה של RhoA/ROCK16, השתקת גנים וניסויי תרבית משותפת של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים כדי לבחון תלות סיבתית.
תרגום קליני דורש זהירות. המרת המינון של חולדה למינון שווה-ערך בבני אדם תומכת בבניית קנה מידה ראשוני, אך מינון לבני אדם דורש גם מחקרי פרמקוקינטיקה, פרמקודינמיקה ובטיחות לטווח ארוך. מוצר ZGP סטנדרטי יצריך פרופיל כימי באמצעות HPLC או LC-MS, הגדרת גבולות לתרכובות סמן, השוואתיות בין סדרות ייצור, בדיקת זיהומים ותיעוד של מקור הצמחים, תהליך המיצוי, הריכוז ושיטות הייצור17. תרגום רגולטורי חייב לשקול גם אינטראקציות בין מרכיבים, תאימות לתרופות קיימות נגד אוסטאופורוזיס ותוצאות קליניות השוואתיות, כגון הפחתה בשכיחות השברים ולא רק ב-BMD.
למחקר זה מספר מגבלות. מודל החולדות שעברו OVX גורם להפסקת אסטרוגן פתאומית ואינו יכול לשחזר באופן מלא את גיל המעבר בבני אדם, הזדקנות, ויסות חיסוני, תוחלת חיים, מחלות נלוות או דינמיקה של עיצוב מחדש של העצם לטווח ארוך18,19. השפעות אנדוקריניות סיסטמיות עשויות לתרום לתוצאות שנצפו, ולכן אין להניח קיומה של איתות ישיר לתאי העצם. היעדר עיכוב של מסלולים או השתקת גנים מונע טענות מכניסטיות סיבתיות. היעדר פרופיל HPLC או LC-MS מגביל את יכולת השחזור ומונע ייחוס של השפעות למרכיבים ספציפיים. לא בוצעה הערכה כמותית של מיקרו-ארכיטקטורת העצם הטרבכולרית. מחקרי עתיד צריכים לשלב micro-CT או ניתוחים היסטומורפומטריים כמותיים, כולל BV/TV, Tb.N, Tb.Th ו-Tb.Sp, כדי לספק הערכה מקיפה יותר של שינויים מבניים בעצם20. שונות בין מנות של צמחי מרפא, נהלי מיצוי ודרישות בקרת איכות נותרים חסמים תרגומיים משמעותיים.
בנשירים עם PMOP שהושרה על ידי OVX, נטילת Zuogui Pill בפורמולה מלאה הייתה קשורה לשיפור ב-BMD, לסמנים נושאיים חיוביים של תחלופת עצם, ולשינויים מתואמים בסמני מסלול EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. ניתוח פקטוריאלי של שלושה על שלושה תומך באינטראקציה סינרגית בין רכיבים מזיני-Yin למעצירי-Yang, בהתאמה לתאוריית התאימות המסורתית של פורמולות. נתונים אלה תומכים בחקירה נוספת של ZGP כמועמד רב-מטרות לטיפול ב-PMOP, אך נדרשים מחקרי מעכבים, ניסויי השתקת גנים, תרביות משותפות של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים, פרופיל כימי, מיקרו-ארכיטקטורה כמותית של העצם, פרמקוקינטיקה, בדיקות בטיחות ארוכות טווח וניסויים קליניים לפני שניתן יהיה לגבש מסקנות סופיות לגבי המנגנונים או היישומים התרגומיים.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של מונגוליה הפנימית (מענק מספר 2025LHMS08047), הפרויקט הכללי של האוניברסיטה לרפואה של מונגוליה הפנימית (מענק מספר YKD2025MS015), וקרן ההקמה לדוקטורט של האוניברסיטה לרפואה של מונגוליה הפנימית (מענק מספר YKD2023BSQD007). למממנים לא היה תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף הנתונים, בניתוח, בהחלטה על הפרסום או בהכנת כתב היד.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מים עם 1% אמוניה | N/A | N/A | תמיסת כחול לאחר דיפרנציאציה של המטוקסילין. |
| אלכוהול עם 1% חומצה הידרוכלורית | N/A | N/A | תמיסת דיפרנציאציה לצביעת המטוקסילין. |
| 2x qPCR Mix | N/A | N/A | תערובת מאסטר ל-qPCR כמותי. נפח תגובה מקורי: 12.5 uL לתגובה. |
| תמיסת 4% פאראפורמאלדהיד | N/A | N/A | קיבוע של דגימות פמורוס וטיביה שמאליים לניתוח היסטולוגי. |
| בופר טעינה 5x | N/A | N/A | דנטורציה של דגימות לפני אלקטרופורזה. |
| נוגדן ראשוני ל-ALP | Affinity Biosciences | N/A | נוגדן ל-Western blot. דילול מקורי: 1:200. נדרשים RRID ומספר אצווה עבור JoVE. |
| זוג פריימרים ל-ALP | N/A | N/A | mRNA של ALP נמדד באמצעות qRT-PCR, אך טבלת הפריימרים המקורית אינה מספקת את רצפי הפריימרים של ALP. נדרש אישור מהמחבר. |
| ריאגנט נוגדן ביוטין | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | נוסף לבארות הדגימה במהלך ELISA. |
| ג'לטין מקרן של Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | מרכיב להגברת Yang. מינון פורמולה מלא במקור: 12 g, יחס 4. הג'לטין הומס לתוך התבשיל. |
| ג'לטין פלסטרון של Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | מרכיב להזנת Yin. מינון פורמולה מלא במקור: 12 g, יחס 4. הג'לטין הומס לתוך התבשיל. |
| כלורופורם | N/A | N/A | הפרדת פאזות במהלך מיצוי RNA. |
| במת קירור | Leica | 150 | תמיכת קירור או קריו עבור תהליך חיתוך. |
| Cornus officinalis, Shan Zhu Yu | Beijing Tongrentang | N/A | מרכיב להזנת Yin. מינון פורמולה מלא במקור: 12 g, יחס 4. |
| Cuscuta australis, Tu Si Zi | Beijing Tongrentang | N/A | מרכיב להגברת Yang. מינון פורמולה מלא במקור: 12 g, יחס 4. |
| Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi | Beijing Tongrentang | N/A | מרכיב להזנת Yin. מינון פורמולה מלא במקור: 9 g, יחס 3. |
| PBS שעבר טיפול ב-DEPC | N/A | N/A | שטיפה של חולאי L4 עד L5 לפני הקפאה בחנקן נוזלי. |
| Diethylstilbestrol | N/A | N/A | ביקורת חיובית של תרופה מערבית. מינון מקורי: 0.04 mg/kg/day, 1 mL/10 g/day. המסמך המקורי מכיל אי-עקביות במינוח הסיני שיש להאחד ל-diethylstilbestrol. |
| Dioscorea opposita, Huai Shan Yao | Beijing Tongrentang | N/A | מרכיב להזנת Yin. מינון פורמולה מלא במקור: 12 g, יחס 4. |
| תערובת dNTP | N/A | N/A | כלולה בתגובת שעתוק הפוך. |
| ריאגנט ECL כימילומינסנס | N/A | N/A | ריאגנט גילוי ל-Western blot. |
| ריאגנט כרומוגני A ל-ELISA | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | ריאגנט לפיתוח צבע עבור ELISA. |
| ריאגנט כרומוגני B ל-ELISA | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | ריאגנט לפיתוח צבע עבור ELISA. |
| תמיסת עצירה ל-ELISA | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | משת לסיום תגובת הצבע ב-ELISA. |
| ריאגנט ELISA מסומן באנזים | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | נוסף לבארות שאינן ריקות ב-ELISA. |
| נוגדן ראשוני ל-EphB4 | Proteintech | N/A | נוגדן ל-Western blot. דילול מקורי: 1:20. נדרשים RRID ומספר אצווה עבור JoVE. |
| זוג פריימרים ל-EphB4 | N/A | PCR product 232 bp | Forward CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Reverse GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. טעות דפוס בטבלה המקורית: Rat RphB4 צריך להיות Rat EphB4. |
| נוגדן ראשוני ל-ephrinB2 | Affinity Biosciences | N/A | נוגדן ל-Western blot. דילול מקורי: 1:20. נדרשים RRID ומספר אצווה עבור JoVE. |
| זוג פריימרים ל-ephrinB2 | N/A | PCR product 172 bp | Forward CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Reverse ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| אתנול, מוחלט ובדרגות 95%, 85%, 75% | N/A | N/A | דהידרטציה ורהידרטציה מדורגת במהלך צביעת המטוקסיליןת ואאוזין. |
| חולדות Sprague-Dawley נקבות | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Animal certificate and license number not supplied in source article | נקיות מפתוגנים ספציפיים, בנות 6 חודשים, נקבות בריאות שאינן בהיריון. המקור בסינית מציין 230 עד 270 g; טיוטה אנגלית מוקדמת מציינת 20 עד 250 g. יש לאמת את הטווח הסופי לפני ההגשה. |
| נוגדן ראשוני ל-GAPDH | Servicebio | N/A | נוגדן ביקורת טעינה. דילול מקורי: 1:20. נדרשים RRID ומספר אצווה עבור JoVE. |
| זוג פריימרים ל-GAPDH | N/A | PCR product 253 bp | Forward ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Reverse TTTGAGGGTGCAGCGAACTT. |
| תוכנת GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.1; RRID:SCR_02798 | ניתוח סטטיסטי וגרפים. נורמליות, הומוגניות של שונות, ANOVA, תיקון בונפרוני וגודלי אפקט צריכים להישמר בקובצי הפלט. |
| גרנולות Gusukang | Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | ביקורת חיובית של רפואה סינית מסורתית. מינון מקורי: 1.8 g/kg/day או 0.5 mL/10 g/day. |
| תמיסת צביעת המטוקסילין | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | צביעה היסטולוגית. הפרוטוקול המקורי השתמש בצביעת המטוקסילין למשך 5 min. |
| מיקרוצנטריפוגה במהירות גבוהה | N/A | TG16W | צנטריפוגציה עבור נהלי סרום וחומצות גרעיניות. |
| סורק DXA של Hologic | Hologic | N/A | ניתוח צפיפות מינרליים של העצם. המקור מדווח על סריקת פמורוס in vivo ו-ex vivo. |
| תוכנת ImageJ | National Institutes of Health | RRID:SCR_03070 | כימות דנסיטומטרי עבור פסי Western blot. גרסה לא סופקה במאמר המקורי. |
| כיריים אינדוקציה | Midea | N/A | מופיע בטבלת המכשירים של המקור הסיני. |
| איסופלורן | N/A | N/A | הרדמה עבור כריתת שחלות דו-צדדית ומיקום ל-DXA. הפרוטוקול המעודכן צריך לציין השראה, תחזוקה, נתיב וקריטריונים לעומק ההרדמה. |
| איזופרופנול | N/A | N/A | השקעת RNA במהלך מיצוי. |
| חנקן נוזלי | N/A | N/A | הקפאה מהירה של דגימות חולאי מותניים. |
| Lycium barbarum, Gou Qi Zi | Beijing Tongrentang | N/A | מרכיב להזנת Yin. מינון פורמולה מלא במקור: 12 g, יחס 4. |
| קורא מיקרו-פלטה | N/A | AMR-10 | גילוי בולענות ELISA ב-450 nm. |
| שוטף מיקרו-פלטות | N/A | APW-20 | שלב שטיפה עבור פלטות ELISA. |
| MMLV reverse transcriptase | N/A | N/A | אנזים לשעתוק הפוך. |
| דבק הרכבה ניטרלי | Sinopharm Group | N/A | תווך הרכבה עבור סליידים שצבעו בהמטוקסילין ואאוזין. |
| סליין נורמלי | N/A | N/A | חומר נשאי להזנה ב-gavage עבור קבוצת ביקורת ריקה, קבוצת Sham וקבוצת מודל. |
| פריימר Oligo(dT)18 | N/A | N/A | מש לשעתוק הפוך. |
| פניצילין | N/A | N/A | מניעת זיהומים לאחר ניתוח. מינון מקורי: 20,0 U/kg תוך-שרירית למשך 3 ימים. |
| סיר לחץ | Xinfei | N/A | מופיע בטבלת המכשירים של המקור הסיני. |
| מעכב פרוטאז | N/A | N/A | נוסף במהלך מיצוי חלבונים. |
| בופר ליזיס של חלבונים | N/A | N/A | מיצוי חלבונים מרקמת עצם עבור Western blotting. |
| ממברנת PVDF | N/A | N/A | ממברנת העברה ל-Western blot המופעלת על ידי מתנול. |
| מכשיר qRT-PCR | N/A | N/A | PCR שעתוק הפוך כמותי עבור EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP ו-GAPDH. |
| ערכת ELISA ל-Rat CTX-1 | Jiyinmei | JYM0026Ra | Sandwich ELISA עבור C-terminal telopeptide של קולגן סוג 1 בסרום. גילוי ב-450 nm. |
| ערכת ELISA ל-Rat P1NP | Jiyinmei | JYM030Ra | Sandwich ELISA עבור procollagen type 1 N-terminal propeptide בסרום. גילוי ב-450 nm. |
| Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang | Beijing Tongrentang | N/A | מרכיב להזנת Yin. מינון פורמולה מלא במקור: 24 g, יחס 8. |
| נוגדן ראשוני ל-RhoA | Proteintech | N/A | נוגדן ל-Western blot. דילול מקורי: 1:20. נדרשים RRID ומספר אצווה עבור JoVE. |
| זוג פריימרים ל-RhoA | N/A | PCR product 177 bp | Forward GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Reverse ACTATCAGGGCTGTCGATGG. המינוח אוחד מ-RHoA ל-RhoA. |
| מעכב RNase | N/A | N/A | כלול בתגובת שעתוק הפוך. |
| מים נקיים מ-RNase | N/A | N/A | המסה של RNA לאחר ייבוש. |
| מיקרוטום סיבובי | Leica | 245 | חיתוך היסטולוגי. |
| נוגדן משני ל-Western blotting | N/A | N/A | דילול מקורי: 1:150. תגובתיות המארח ו-RRID נדרשים עבור JoVE. |
| אבקת חלב דל שומן, 5% | N/A | N/A | ריאגנט חסימה ל-Western blotting, בטמפרטורת החדר למשך 2 h. |
| מכשיר למריחה וייבוש סליידים | Jinhua Yidi | N/A | הכנת סליידים להיסטולוגיה. |
| סודיום פנטובארביטול, 3% | N/A | N/A | הרדמה סופית לפני איסוף דם מאורטה בטנית במסמך המקור הסיני. יש לוודא את הליך ההמתה הסופי ואת שיטת האישור. |
| מדלל דגימות סטנדרטי | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | מש לדילול סטנדרטים סדרתי בנהל ה-ELISA. |
| בופר TBST | N/A | N/A | בופר שטיפה ל-Western blotting. |
| אינקובטור עם ניעור תרמוסטטי | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | N/A | אינקובציה וניעור במעבדה. |
| ריאגנט TRIzol | N/A | N/A | מיצוי RNA מ-10 mg רקמת עצם. |
| מיקרוסקופ אנכי | Leica | DM10 | דימוי היסטולוגי של המטוקסילין ואאוזין בהגדלה של 20x. |
| אינקובטור תרמוסטטי עם מעטפת מים | N/A | GNP-9080 | אינקובציה עבור נהלי בדיקה. |
| תמיסת צביעת אאוזין מסיסה במים | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | צביעת נגד היסטולוגית. הפרוטוקול המקורי השתמש בצביעת אאוזין למשך 3 min. |
| מערכת אלקטרופורזה ל-Western blot | N/A | N/A | הפרדת חלבונים. אלקטרופורזה מקורית: 80 V בתחילה, לאחר מכן 120 V. |
| מערכת דימוי ל-Western blot | N/A | N/A | דימוי ממברנה כימילומינסנטי. ממברנות לא חתוכות נדרשות להגשה. |
| מערכת העברה ל-Western blot | N/A | N/A | העברת חלבונים לממברנת PVDF. תנאי העברה מקוריים: 40 mA, 90 min, אמבט קרח. |
| קסילן | N/A | N/A | הסרת שעווה והבהרה של רקמה במהלך היסטולוגיה. |
| עשבי מרכיבי גלולת Zuogui | Beijing Tongrentang | N/A | פורמולה של שמונה עשבים: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, ג'לטין פלסטרון של Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis, וג'לטין מקרן של Cervus elaphus. |
מקורות
- Compston JE, McClung MR, Leslie WD. Osteoporosis. Lancet. 2019;393(10169):364-376. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)32112-3
- Shen Y, Huang X, Wu J, et al. The global burden of osteoporosis, low bone mass, and its related fracture in 204 countries and territories, 1990-2019. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:882241. https://doi.org/10.3389/fendo.2022.882241
- Zhao C, Irie N, Takada Y, et al. Bidirectional ephrinB2-EphB4 signaling controls bone homeostasis. Cell Metab. 2006;4(2):111-121. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2006.05.012
- Wu Z, Li W, Jiang K, et al. Regulation of bone homeostasis: signaling pathways and therapeutic targets. MedComm (2020). 2024;5(8):e657. https://doi.org/10.1002/mco2.657
- Reid IR, Billington EO. Drug therapy for osteoporosis in older adults. Lancet. 2022;399(10329):1080-1092. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)02646-5
- Li J, Sun K, Qi B, et al. An evaluation of the effects and safety of Zuogui pill for treating osteoporosis: current evidence for an ancient Chinese herbal formula. Phytother Res. 2021;35(4):1754-1767. https://doi.org/10.1002/ptr.6908
- Shi T, Liu T, Kou Y, et al. The synergistic effect of Zuogui Pill and eldecalcitol on improving bone mass and osteogenesis in type 2 diabetic osteoporosis. Medicina (Kaunas). 2023;59(8):1414. https://doi.org/10.3390/medicina59081414
- Yang S, Zhang B, Wang YG, et al. Zuo Gui Wan promotes osteogenesis via PI3K/AKT signaling pathway: network pharmacology analysis and experimental validation. Curr Med Sci. 2023;43(5):1051-1060. https://doi.org/10.1007/s11596-023-2782-x
- Qiu J, Zhu Y, Xing J, Wang L, Zhang J, Yin H. Comparative pharmacokinetic study of 5 active ingredients after oral administration of Zuogui Pill in osteoporotic rats with different syndrome types. Int J Anal Chem. 2023;2023:1473878. https://doi.org/10.1155/2023/1473878
- Gong W, Zhang N, Cheng G, et al. Rehmannia glutinosa Libosch extracts prevent bone loss and architectural deterioration and enhance osteoblastic bone formation by regulating the IGF-1/PI3K/mTOR pathway in streptozotocin-induced diabetic rats. Int J Mol Sci. 2019;20(16):3964. https://doi.org/10.3390/ijms20163964
- Wang K, Kou Y, Rong X, Wei L, Li J, Liu H, Li M, Song H. ED-71 improves bone mass in ovariectomized rats by inhibiting osteoclastogenesis through EphrinB2-EphB4-RANKL/OPG axis. Drug Des Devel Ther. 2024;18:1515-1528. https://doi.org/10.2147/DDDT.S454116
- Percie du Sert N, Hurst V, Ahluwalia A, et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000410. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000410
- Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-661. https://doi.org/10.1096/fj.07-9574LSF
- Eastell R, Szulc P. Use of bone turnover markers in postmenopausal osteoporosis. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(11):908-923. https://doi.org/10.1016/S2213-8587(17)30184-5
- Yao ZY, Fan SY, Song ZF, Li ZC. Network pharmacology-based and molecular docking-based analysis of You-Gui-Yin for the treatment of osteonecrosis of the femoral head. Medicine (Baltimore). 2023;102(43):e35581. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000035581
- Wang J, Xu C, Zhang J, Bao Y, Tang Y, Lv X, Ma B, Wu X, Mao G. RhoA promotes osteoclastogenesis and regulates bone remodeling through mTOR-NFATc1 signaling. Mol Med. 2023;29(1):49. https://doi.org/10.1186/s10020-023-00638-1
- Noviana E, Indrayanto G, Rohman A. Advances in fingerprint analysis for standardization and quality control of herbal medicines. Front Pharmacol. 2022;13:853023. https://doi.org/10.3389/fphar.2022.853023
- Fischer V, Haffner-Luntzer M. Interaction between bone and immune cells: implications for postmenopausal osteoporosis. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:14-21. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2021.05.014
- Komori T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 2015;759:287-294. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2015.03.028
- Dempster DW, Compston JE, Drezner MK, et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2013;28(1):2-17. https://doi.org/10.1002/jbmr.1805