מחקר זה מציג תהליך עבודה משולב להדמיה המשלב איסוף ועיבוד סטנדרטיים של נוזל שטיפה ברונכואלוולארית, פאנל ציטומטריית זרימה של שבעה סמנים, בדיקת ציטוקינים רב-אנליטית של 13 אנליטים, וקו ניתוח מאוחד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר מחקר
ויזואליזציה משולבת של גיוס נויטרופילים ואפיון ציטוקינים דלקתיים בנוזל שטיפה ברונכואלוולרי
במאמר זה
סיכום
תקציר
נוזל שטיפת ברונכואלוולרית (BALF) הוא מטריצת הדגימה הנגישה ביותר למשמעות ישירה לצורך חקר דלקת בדרכי הנשימה התחתונות, אך ניתוחים קונבנציונליים מסתמכים על ציטומטריה של זרימה בעלת סמן בודד בשילוב עם בדיקת ELISA לכל אנליט בנפרד, גישה המגבילה את צפיפות המידע ומסתירה את הצימוד בין תאים לגורמים (cell–factor coupling). מחקר זה מציג תהליך עבודה (workflow) משולב לוויזואליזציה המקשר בין איסוף ועיבוד מקדים סטנדרטיים לבין פאנל ציטומטריה של זרימה בעל שבעה סמנים עבור נויטרופילים ומונוציטים, בדיקת ציטוקינים מולטיפלקס ל-13 אנליטים, וצינור ניתוח מאוחד המבוס על UMAP (uniform manifold approximation and projection), מטא-קלסטרינג באמצעות FlowSOM, קלסטרינג היררכי, רשתות מתאם של Spearman וניתוח רכיבים ראשיים (PCA).
תהליך העבודה הוחל על קוהורט פרוספקטיבי מרכז יחיד של 12 מבוגרים שעברו ברונכוסקופיה, הכולל 64 חולים עם זיהום ריאתי המאומת מיקרוביולוגית ו-48 ביקורות ללא זיהום. תוצאות ציטולוגיות ומדידות בציטומטריה של זרימה חשפו הסטה מובהקת מפרופיל אלבולרי דומיננטי של מקרופאגים לפרופיל דומיננטי של נויטרופילים במהלך הזיהום, כאשר אחוז הנויטרופילים עלה מחציון של 3.2% ל-68.4% והריכוז המוחלט של הנויטרופילים עלה בערך פי 50. פרופיל מולטיפלקס זיהה תגובת ציטוקינים מתואמת של שלושה מודולים, כאשר המודולים של הכמוקינים, הפרו-דלקתיים והרגולטוריים היו כולם בעל-ביטוי (upregulated), כאשר CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α ו-G-CSF הראו את ההבחנה החזקה ביותר של סממן בודד בתוך קוהורט המחקר (שטח תחת העקום [AUC] של 0.89 עד 0.94). ויזואליזציה אינטגרטיבית באמצעות PCA, מטריצת קורלציה וגרף רשת חשפה ציר נויטרופיל-כמוקין המחובר באופן הדוק ברמת המשתתף, כאשר ספירת הנויטרופילים ב-BALF הגיחה כמרכז הרשת (network hub).
תהליך העבודה משתמש אך ורק בחומרים המתקבלים באופן שגרתי משטיפת ברונכית-נאבקים (BAL) המבוצעת מסיבות קליניות, אינו דורש נפח דגימה נוסף, ומספק מסגרת עשירה במידע לפתרון דלקות דרכי הנשימה בזיהומים נשימתיים, שעשויה להיות ישימה במעבדות רפואיות שלישיות המצוידות במערכות של ציטומטריה זרימה רב-פרמטרית ובפלטפורמות של multiplex bead-array, ובכך להתרחב למחקרים ארוכי טווח, למחקרי תא בודד ולהערכות טיפוליות. אימוץ קליני נרחב יותר של אנליטים בודדים כסמנים ביולוגיים ידרוש תיקוף פרוספקטיבי בקוהורטות רב-מרכזיות בלתי תלויות.
מבוא
מוותים מזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות נותרו גורם משמעותי לתמותה עולמית, למרות התקדמויות באסטרטגיות חיסונים ובשיטות טיפול; עם זאת, הדבר נכון במיוחד בקרב אוכלוסיות ילדים וקשישים1. נויטרופילים הם התאים העיקריים המדווחים בשלבים המוקדמים של תגובת חיסון מולדת במערכת הנשימה הנגועה, תהליך החיוני לסילוק הפתוגן הפולש; עם זאת, דלקת נויטרופילית בלתי נשלטת מובילה לפירוק של מחסום הנימיים האלבולרי, נזק חמצוני לרקמה ופיתוח של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS)2,3. נויטרופילים בחל האוויר של הריאה מראים גם קינטיקת גיוס, דפוסי שימור והתנהגות אפקטורית השונים מרקמות אחרות, והבדלים אלו משפיעים על השאלה האם הזיהום יחלוף או יתפתח לדלקת ריאות חמורה4.
נוזל שטיפת ברונכ׳י-אלבולארית (BALF) הוא מקור מידע חשוב על המיקרו-סביבה האלבולארית ומספק את הייצוג הקרוב ביותר של החסינות הקלינית באתר זה5. לכימוקין CXCL8 תפקיד חיוני בגיוס נויטרופילים לריאות באמצעות הקולטנים שלו, CXCR1 ו-CXCR2, לצד כימוקינים אחרים, הכוללים את CXCL1, CXCL2 ו-CXCL56. הציטוקינים IL-1β, IL-6 ו-TNF-α מעצימים תהליך זה עוד יותר, בעוד ש-IL-10 פועל כציטוקין נוגד. רמותיהם ב-BALF נמצאו כמתואמות עם חומרת זיהומי ריאות ועם התפתחות סיבוכי ריאות עקב דלקת ריאות חיידקית, נגיפית ואטיפית7, ופרופילים של סמנים ביולוגיים מרובי-מרכיבים (multiplex) ב-BALF מאומצים לצורך אבחון מוקדם יותר והבחנה בין פתוגנים בזיהומים של נתיבי הנשימה התחתונים8.
בדיקות שגרתיות של נוזל שטיפת ברונכית-נאבקים (BALF) נכשלות בדרך כלל בהכללה מלאה של הביולוגיה העומדת בבסיס הבדיקה. ניתן להעריך את ספירת התאים על ידי בידוי ידני של תאים בדגימות cytospin, בעוד שמתווכים מסיסים נמדדים באמצעות בדיקות ELISA בודדות ומוצגים כתרשים עמודות. כימוקינים, ציטוקינים וכל סוג תא מוערכים בנפרד, ללא קביעת מתאם בין מדרג ריכוז של כימוקין מסוים לבין אוכלוסיות התאים שהוא משפיע עליהן בדגימה. השילוב של מודולים של ציטוקינים, יחסי מינון-תגובה בין כימוקינים לנויטרופילים, ותתי-אוכלוסיות של חולים עם חתימות דלקתיות משלהם, נעלם לעיתים קרובות בהיעדר ניתוח רב-משתני9.
התקדמויות בחישוב הופכות גישה הוליסטית שכזו לריאלית יותר ויותר. שילוב של ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית וציטומטריית זרימה ספקטרלית עם גישות להפחתת ממדיות, כגון t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) או uniform manifold approximation and projection (UMAP), מאפשר מיפוי של פנוטיפים חיסוניים רב-ממדיים למרחב דו-מדי, כאשר UMAP הוכיחה שימור טוב יותר של טופולוגיה גלובלית ויכולת שחזור גבוהה יותר כאשר היא מיושמת על נתוני ציטומטריה10. פאנלים רב-אנליטים של ציטוקינים, ולאחריהם אשכולהיררכית ורשתות קורלציה, מסייעים בזיהוי חתימות המתואמות לחומרת המחלה שאינן ניתנות לזיהוי בגישות של ציטוקין בודד1. למרות ההתקדמות בתחום, עדיין לא קיים זרימת עבודה (workflow) המאחדת שיטות אלו כדי לחקור גיוס נויטרופילים וחתימות ציטוקינים מאותן דגימות BALF בזיהומים נשימתיים. מחקר זה מתאר זרימת עבודה ויזואלית אינטגרטיבית לבחינת גיוס נויטרופילים באמצעות ציטולוגיה וציטומטריית זרימה רב-פרמטרית, ולאחריהם ניתוחי UMAP וחתימות ציטוקינים באמצעות multiplex immunoassay, עם אשכולהיררכית, מטריצות קורלציה וניתוח רכיבים ראשיים (PCA). זרימת העבודה מניבה ויזואליזציה אינטגרטיבית המקיפה מדדי חיסון תאיים ומסיסים של דרכי הנשימה בגרף בודד, תוך שימוש בדגימות BALF המופקות באופן שגרתי במהלך ברונכוסקופיה המצוינת קלינית בזיהום בדרכי הנשימה התחתונות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אוכלוסיית המחקר ואתיקה
זהו מחקר תצפיתי פרוספקטיבי רב-מרכזי שנערך בבית חולים אקדמי שלישרי בין ינואר 2026 לאפריל 2026. הפרוטוקול אושר תחת מספר אישור 2026HL-038, והסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל משתתף לפני ביצוע כל הליך במחקר.
מבוגרים בגילאי 18 עד 75 שעברו ברונכוסקופיה גמישה לאבחון עם שטיפת ברונכ׳אוולאולרית (BAL) כחלק מהטיפול הקליני השגרתי גויסו באופן רציף ושובצו לקבוצת זיהום או לקבוצת ביקורת ללא זיהום, בהתבסס על האבחנות הקליניות והמיקרוביולוגיות הסופיות שלהם. סקירה כללית של זרימת העבודה לוויזואליזציה המשולבת, מגיוס המטופלים ועד לתוצרי הוויזואליזציה המשולבים, מוצגת ב-איור 1.
איור 1: סקירה כללית של תהליך הוויזואליזציה המשולב לאפיון גיוס נויטרופילים ותגובות ציטוקינים דלקתיים המבוסס על BALF. חמשת השלבים מסכמים, משמאל לימין, גיוס פרוספקטיבי של קבוצות הזיהום והביקורת באמצעות ברונכוסקופיה ו-BAL, עיבוד מקדים של BALF למשקע תאים ולשבר על-נוזלי (supernatant), מדידות תאיות (ציטולוגיית Wright–Giemsa וציטומטריה עם זרימה רב-פרמטרית) ומדידות מסיסות (בדיקה אימונית מבוססת חרוזי 13-plex) במקביל, צינור הוויזואליזציה המאוחד (UMAP עם meta-clustering של FlowSOM, מפת חום היררכית, ניתוח רכיבים ראשיים ורשת מתאמי Spearman), והפלט הוויזואלי המשולב. קיצורים: BAL = bronchoalveolar lavage; BALF = BAL fluid; UMAP = uniform manifold approximation and projection. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
קריטריוני ההכללה לקבוצת הזיהום היו כדלקמן: (1) מטופלים שאובחנו עם דלקת ריאות שנרכשה בקהילה (CAP), דלקת ריאות שנרכשה בבית חולים (HAP) או דלקת ריאות הקשורה למנשם (VAP) בהתאם להנחיות ה-Infectious Diseases Society of America (IDSA) וה-American Thoracic Society (ATS); (2) זיהוי של פתוגן אחד או יותר באמצעות תרבית BALF בערך של ≥104 colony-forming units (CFU)/mL, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) רספיטורית מולטיפלקס, ריצוף metagenomic next-generation של BALF, או בדיקת אנטיגן/נוגדן ספציפית מדגימות נשימה/סרום זוגיות.
הקריטריונים לקבוצת הביקורת היו כדלקמן: (1) סיבות לא זיהומיות לביצוע ברונכוסקופיה, הכוללות הערכה של קשרית ריאה לא מוגדרת, תוצאות רדיולוגיות חריגות שאינן מעידות על זיהום, או בדיקה בשל שיעול כרוני; (2) היעדר זיהום ריאתי חריף, כפי שהוכח על ידי תוצאות שליליות של בדיקות מיקrobiולוגיות והיעדר סימנים לדלקת או לזיהום סיסטמי בזמן הברונכוסקופיה; ו-(3) היעדר שימוש באנטיביוטיקה ב-30 הימים שקדמו להשתתפות. קבוצת הביקורת גויסה מתוך מטופלים שעברו ברונכוסקופיה בשל מצבים ריאתיים אחרים שהיו בעלי התוויה קלינית, ולא מתוך מתנדבים בריאים, כדי לשקף את האוכלוסייה ממנה משיגים באופן שגרתי BAL בהתוויה קלינית במרכז המחקר.
קריטריוני ההדרה כללו: (1) ממאירות ו/או כימותרפיה ציטוטוקסית בששת החודשים שקדמו למחקר; (2) סרופוזיטיביות ל-HIV; (3) השתלת איבר מוצק או תאי גזע המטופויטיים; (4) טיפול אימונוסופרסיבי מתמשך הכולל מינון יומי שווה-ערך של prednisone במינון > 0.3 mg/kg למשך יותר מ-3 שבועות; (5) נשים הרות/מניקות; (6) היסטוריה של דיאטזה דימומית או התוויות נגד לברונכוסקופיה גמישה; (7) מחלה נשימתית כרונית חמורה קיימת (מחלה ריאתית חסימתית כרונית [COPD] שלב III/IV לפי ה-Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD], פיברוזיס ריאתי אידיופתי, אסתמה פרסיסטנטית חמורה, או ברונכיאקטזיה משמעותית מבחינה קלינית); (8) שחפת פעילה; (9) השתתפות במחקר התערבותי אחר ב-30 הימים האחרונים. BAL בוצע במהלך הברונכוסקופיה הראשונה, בתוך 72 h מהקבלה למסגרת רפואית בשל זיהומים, ובתוך 48 h מהאינטובציה בחולים עם זיהומים המאוננפים במכונה.
חישוב גודל המדגם התמקד בתוצאה התאית העיקרית: מספר הנויטרופילים ב-BALF בין הקבוצות. ביחס לגודל אפקט צפוי של 0.6 SD בין דרכי נשימה מזוהמות ללא מזוהמות, ובשקלול של 15% לנשירה, נדרש גודל מדגם מינימלי של 45 נבדקים לקבוצה עבור α = 0.05 דו-זנבי עם עוצמה סטטיסטית של 80%. מתוך 156 מועמדים מתאימים, 27 לא עמדו בדרישות הסף (18 לא עמדו בקריטריוני ההכללה בעיקר בשל חוסר יכולת לזהות גורם פתוגני האחראי למחלה שלהם בתוך התקופה שנקבעה או חוסר הסכמה להליך עצמו; 9 עמדו בקריטריוני ההדרה בעיקר עקב ממאירות פעילה או היסטוריה של טיפול כימותרפי, שימוש כרוני בקורטיקוסטרואידים, מחלת ריאה כרונית קשה קיימת, או נטייה לדימומים). שאר 129 המשתתפים עברו ברונכוסקופיה. לאחר מכן, 17 נבדקים הוסרו מהמחקר (7 בשל תנובת BALF לא מספקת < 40%; 4 בשל ביטול הסכמה במהלך האשפוז; ו-6 בשל סיווג מחדש של נבדקים לאחר הערכה מיקרוביולוגית סופית – 4 מועמדים לקבוצת הביקורת שאובחנה אצלם זיהום נסתר על סמך תוצאות התרבית; ו-2 מועמדים לקבוצת הזיהום שחסרה אצלם הוכחה לזיהום לאחר ניתוח תרביות). קבוצת הנבדקים הסופית כללה 112 משתתפים: 64 עם זיהום ו-48 ללא.
איסוף ועיבוד מקדים של BALF
בדיקת ברונכוסקופיה בוצעה על ידי מפעילים מיומנים בהתאם לפרוטוקול המוסדי הסטנדרטי, בדומה להמלצות הטכניות שפורסמו עבור שטיפה ברונכואלוולולרית (bronchoalveolar lavage)12. נעשה שימוש מקומי בלידוקאין, והמטופלים קיבלו סדציה תו-ורידית מתונה תוך מתן חמצן משלים לשמירה על רמת רוויית חמצן (SpO₂) >92%. הברונכוסקופ הגמיש הוכנס ומוקם בסגמנט הברונכופולמונרי שבו נצפו ממצאים רדיולוגיים חריגים. במקרים שבהם הממצאים הרדיולוגים היו מפוזרים או שלא ניתן היה לאתרם, נבחרו הסגמנטים של האונה האמצעית הימנית או הסגמנטים הלינגולריים השמאליים. לאחר כל הזרקה, בוצעה שאיבה ידנית עדינה עם לחץ שלילי < 100 mmHg. הזרקו סך כולל של שלוש עד חמש מנות של תמיסת מלח סטרילית בטמפרטורה של 37 °C, בנפח של 20–40 mL למנה, לנפח כולל של 100–150 mL. יחס השחזור נאמד כנפח השחזור ביחס לנפח שהוזרק, ורק דגימות עם שחזור של ≥40% נכללו בניתוח.
הדגימות שנאספו מהשטיפות השנייה והבאות אחריהאאולטנו כדי להפחית זיהום ברונכיאלי ולהשיג דגימה עשירה באלוולאולריים. מאגר נוזל שטיפת הברונכיולי והאלוולאולרי (BALF) נשמר על קרח ועובד בתוך 2 h מרגע האיסוף, בהתחשב בממצאים אחרונים על שינויים בהרכב התאים ובספירה הדיפרנציאלית לאחר אחסון ממושך וחימום של דגימות BALF אנושיות13. לאחר סינון באמצעות רשת ניילון סטרילית עם גודל נקבוביות של 70 microns כדי לסנן את הריר, שבוצע על ידי מעבר מכני בלבד ללא הוספת חומר ממיס ריר או חומר נוגד התגבשות כגון dithiothreitol, כיוון שבדיקות פיילוט הראו כי הדבר מספיק להסרת גושי ריר ללא אובדן מדיד של שלמות האפיטופים השטחיים בשלבים הבאים, הנוזל הועבר לצנטריפוגציה ב-400 × g למשך 10 min ב-4 °C. הנוזל העליון הועבר למבחנות קריו עם קישור חלבון נמוך (low-protein-binding cryovials) לצורך אנליזת ציטוקינים, והתאים הושעו בתוך phosphate-buffered saline (PBS) עם 0.5% bovine serum albumin ו-2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), כאשר חלקם נשמרו לצורך ציטולוגיה וציטומטריית זרימה. דגימות הציטוקינים הוקפאו בחנקן נוזלי, נשמרו ב-–80 °C, ולא הועברו ביותר ממחזור הקפאה-הפשרה אחד לפני השימוש.
ציטולוגיה של נויטרופילים וכמותיזציה באמצעות פלוו-ציטומטריה
מבחינת ציטופתולוגיה, 100 µL של תרחיף התאים מנוזל שטיפת סימפונות (BALF) הועברו לסרטית זכוכית באמצעות ציטוצנטריפוגה (ראה טבלת חומרים) ב-300 × g למשך 5 דקות, יובשו באוויר ונצבעו בצביעת Wright-Giemsa. ספירה דיפרנציאלית בוצעה על ידי טכנאי המטולוגיה ללא ידיעה על הרקע הרפואי של המטופל, אשר ספר לפחות 400 תאים לכל סרטית וחישב את האחוזים של מקרופאגים, לימפוציטים, נויטרופילים ואאוזינופילים. אחוזי הנויטרופילים ב-BALF נחשבו למדד התוצאה הראשוני עבור הציטופתולוגיה, לאור ראיות נוכחיות המצביעות על תועלתם בהבחנה בין מחלות ריאה זיהומיות לבלתי זיהומיות בחולים עם חלחול ריאתי14.
פרוטוקול הכימות באמצעות ציטומטריית זרימה התבסס על תיקוף עדכני של פרוטוקול להבחנה בין לוקוציטים בנוזל שטיפת סימפונות ונאדיש (BALF) בארבעה צבעים15 ונכללו סממנים נוספים לזיהוי נויטרופילים. באופן ספציפי, כ-5 × 105 תאים שבודדו מ-BALF נחסמו באמצעות ריאגנט לחסימת קולטן Fc אנושי (ראה טבלת חומרים) למשך 10 דקות ב- 4 °C, ולאחר מכן צבעו במשך 20 דקות ב- 4 °C עם נוגדנים נגד CD45 (שיבט HI30), CD66b (שיבט G10F5), CD15 (שיבט HI98), CD16 (שיבט 3G8), CD11b (שיבט ICRF44), CD14 (שיבט M5E2), ו-HLA-DR (שיבט L243), בנוסף לצבע חיות קבוע (ראה טבלת חומרים). עבור ליזיס של תאי דם אדומים (erythrocyte lysis), השתמשו בתמיסה מסחרית לליזיס של תאי דם אדומים (ראו טבלת חומריםהושתמש במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ליזיס של תאי דם אדומים, התאים נשטפו פעמיים ב-PBS בתוספת 2% סרום עגל עוברי (fetal calf serum) והוסבססו בבופר זרימה (flow buffer), ולאחר מכן נותחו באמצעות ציטומטר זרימה רב-צבעי (ראו טבלת חומרים). הפיצוי בוצע באמצעות חרוזי פיצוי צבועים בצבע בודד (ראה טבלת חומרים), ובכל פאנל נכללו מבחנות של fluorescence-minus-one ומבחנות ללא צביעה.
נרכשו לפחות 1 × 105 אירועים של CD45⁺ עבור כל דגימה. ראשית בוצע gating של סינגלטים בגרף FSC-A/FSC-H, לאחר מכן של לוקוציטים חיים (viability dye⁻) מסוג CD45⁺, ולאחר מכן בוצעה החרגה של מונוציטים-מקרופאגים מסוג CD14⁺HLA-DR⁺ כדי לבחור גרנולוציטים עם side scatter גבוה מסוג CD66b⁺. נויטרופילים הוגדרו לאחר מכן בתוך אוכלוסיית הגרנולוציטים כאירועים מסוג CD15⁺CD16⁺CD11b⁺. gate ראשוני זה של גרנולוציטים CD66b⁺ נמשך באופן רחב סביב כל האירועים בעלי side-scatter גבוה, במקום להיות מוגבל לגבול של CD15⁺CD16⁺CD11b⁺, כך שנויטרופילים מופעלים מסוג CD16-dim ו-CD11b-high וצורות גרנולוציטים פחות בוגרות נותרו בתוך ספירת הנויטרופילים האוטומטית הכוללת; ההגדרה המחמירה יותר של CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ הוחלה רק כדי לאפיין את תת-אוכלוסיית הנויטרופילים הבוגרים שדווחה בנפרד בניתוחי האשכולות (clustering) בהמשך. ספירת הנויטרופילים ב-BALF (תאים/µL) נאמדה על בסיס אחוז הנויטרופילים וספירת התאים הגרעיניים הכוללת שנקבעה באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטי (ראה טבלת חומרים). מטריצות פיצוי (Compensation matrices), אסטרטגיית gating ודוחות בקרת איכות של דגימות בודדות תועדו, והאנליסטים נותרו עיוורים להקצאות קבוצות המשתתפים לאורך כל שלבי הרכישה והניתוח.
פרופילינג רב-מרכיבי (Multiplex) של ציטוקינים דלקתיים
על-נוזלי BALF הופשרו פעם אחת על קרח רטוב, ולאחר מכן בוצע ערבול קצר במערבל (vortex) והבהרה באמצעות סנטריפוגה במהירות של 10,000 × g למשך 5 min בטמפרטורה של 4 °C רגע לפני הבדיקה. מדידה של 13 אנליטים בשלוש קטגוריות תפקודיות בוצעה באמצעות פלטפורמת immunoassay מרובת-מדדים (multiplex) מבוססת חרוצים, עם פאנל חרוצים מגנטיים מותאם אישית (ראו טבלת חומרים). קבוצת הפרו-דלקת כוללה את IL-1β, IL-6, IL-17A ו-TNF-α; קבוצת הכמוקינים כוללה את CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 ו-CCL3/MIP-1α; והקבוצה הרגולטורית כוללה את IL-10, IFN-γ, IL-1RA ו-G-CSF. בחירת האנליטים התבססה על אלו שדווחו באופן השכיח ביותר כבעלי ערך אינפורמטיבי בניתוחים מרובי-מדדים של ציטוקינים ב-BALF או בסרום במחקרי דלקת ריאות/זיהומים נשימתיים חמורים7,11. מקדם הדילול (1:2 בבופר הבדיקה) נקבע מתוך ניסוי פיילוט שנערך על תת-קבוצה מייצגת של דגימות מזוהמות ומדגימות ביקורת, כדי להבטיח ש->90% מהמדידות ינופלו בתוך עקומת הסטנדרט.
עקומות הסטנדרט נקבעו באמצעות דילולים סדרתיים בשבע נקודות של הסטנדרטים הרקומביננטיים של היצרן, שהוכנו בשכפולים בכל פלטה, כולל באר אחת ריקה (blank) להפחתת הרקע. התאמת העקומה בוצעה באמצעות רגרסיה לוגיסטית בעלת חמישה פרמטרים (5PL) על ידי תוכנת הרכישה והניתוח הקניינית של המכשיר (ראה טבלת חומריםגבול הכמות הנמוך (LLOQ) חושב ככמות הסטנדרט הקטנה ביותר שהניבה השגחה חוזרת (back-fit recovery) שבין 80% ל-120% ומקדם וריאציה (CV) בתוך ריצה (intrarun) של ≤ 20%. ערכים שהיו נמוכים מה-LLOQ הוחלפו ב-LLOQ/√2. שתי דגימות בקרת איכות של נוזל שטיפת סימפונות ונשק (BALF) מאוחדות, אחת מחולה נגוע מייצג ואחת מנבדן לא נגוע, חולקו למנתים והוסיפו לכל פלטה כדי לעקוב אחר הביצועים לטווח ארוך. תקני הבטחת האיכות התבססו על המלצות לשיטות עבודה מומלצות (best-practice) שנגזרו מתוכנית לבדיקת מיומנות של בדיקות multiplex מבוססות חרוזים רב-אתרית שנערכה במשך 12 שנים.16, כולל דרישות למקדם וריאציה (CV) תוך-בדיקתי של ≤ 10% בבארים כפולות, CV בין-לוחיות של ≤ 20% לבקרת איכות, ומספר חרוזים מינימלי של ≥ 50 לכל אנליט בכל באר. לוחות שלא עמדו בקריטריונים הנ"ל הופעלו מחדש. הניתוח בוצע בסבב אחד תוך ארבעה שבועות, תוך שימוש בסדרת קיט אחת, עם שזירה אקראית של דגימות הזיהום ודגימות הביקורת.
תהליך ניתוח ויזואליזציה
קבצי ה-Flow Cytometry Standard (FCS) נותחו תחילה באמצעות תוכנה מסחרית לציטומטריה זורמת (ראה טבלת חומרים) לצורך פיצוי וביצוע gating לתאי CD45⁺ חיים (singlets), ולאחר מכן הועברו לניתוח בלתי מוטה ב-R v4.4. עבור כל דגימה, נדגמו 10,000 אירועים של CD45⁺ (downsampling) ושורשרו, ועוצמות האות הומרו באמצעות פונקציית arcsinh עם cofactor של 150. הפחתת ממדים והשלכות UMAP בוצעו באמצעות חבילת uwot עם 15 השכנים הקרובים ביותר ומרחק מינימלי של 0.1, לצד השחלות t-SNE מקבילות באמצעות חבילת Rtsne עם perplexity של 30.10צבירי פנוטיפים זוהו באמצעות FlowSOM עם 100 צמתי מפה מארגנת-עצמית (self-organizing map nodes), וחולקו בהמשך ל-12–15 צבירים באמצעות מטא-קלסטרינג (meta-clustering), תוך שימוש בגישה מבוססת אופטימיזציה שאושרה לאחרונה עבור נתוני ציטומטריה רב-ממדיים.17כל אשכול סווג על בסיס ביטוי החציוני של סמני שושלת והפעלה, ונבחן אל מול השערים הידניים.
ניתוח נתוני ציטוקינים מרובי-סמנים (multiplex) בוצע תחילה על ידי טרנספורמציית log₁₀ של הערכים הגולמיים ולאחר מכן נורמלו הסמנים באמצעות z-scoring לפני ביצוע ניתוחים נוספים. הן הסמנים והן המטופלים עברו קיבץ היררכי (hierarchical clustering) תוך שימוש במרחק אוקלידי וקישור Ward.D2; התוצאות הוצגו במפת חום (heatmap) עם קיבץ שורות ועמודות. גישה זו שימשה לזיהוי מודולים של ציטוקינים המובעים יחד ולסיווג תתי-קבוצות של מטופלים בקוהורטים דלקתיים מרובי-סמנים9. מטריצות מתאם הופקו עבור כל הביומארקרים התאיים והמסיסים באמצעות מתאמי דרג של Spearman בזוגות. מפות חום של מטריצות המתאם שורטטו לצד רשת שבה הצמתים תואמים לביומארקרים והקשתים מצביעות על מתאמים ששרדו תיקון לבדיקות מרובות באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg (BH). רוחב הקשת הותאם למגניט्यूड של מקדם המתאם |ρ|, וקשתות נכללו רק אם |ρ| ≥ 0.30 ו- p < 0.05 לאחר תיקון. ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) בוצע על המטריצה הנורמלית המכילה תאים וציטוקינים באמצעות הפונקציה prcomp() עם סקאלינג של שונות יחידה. המשתתפים הוקרינו על שני הרכיבים הראשיים הראשונים, כאשר קבוצות הזיהום והבקרה הוצגו עליהם. דגימה מופחתת (downsampling) עקבית ונורמליזציה של כל הניתוחים הבטיחו השוואתיות בין קריאות הביומארקרים התאיים והמסיסים בכל הוויזואליזציות.
ניתוח סטטיסטי
משתנים רציפים תוארו באמצעות החציון (טווח בין-רבעוני, IQR) כאשר ההתפלגות לא הייתה נורמלית לפי מבחני Shapiro–Wilk, ובאמצעות ממוצע (סטיית תקן, SD) אחרת. משתנים קטגוריאליים תוארו באמצעות תדירויות ופרופורציות. השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U כאשר למשתנים הרציפים הייתה התפלגות לא נורמלית, מבחן Welch t כאשר המשתנים הרציפים היו בעלי התפלגות נורמלית, ומבחן chi-squared/מבחן Fisher המדויק כאשר הדבר היה רלוונטי למשתנים קטגוריאליים. הקשרים בין משתנים רציפים הוערכו באמצעות מקדם המתאם של Spearman. כדי להגדיר את שיעור התגליות השגויות (FDR) בניתוחים של ציטוקינים מרובים ובניתוחי מתאם, ערכי p הותאמו באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg עם סף של q < 0.05. ערך p < 0.05 דו-זנבי נחשב למשמעותי סטטיסטית בכל הניתוחים הראשוניים. במידת האפשר, מקרים עם נתונים חסרים במשתנים בודדים נשמרו ונותחו באמצעות ניתוח מקרים שלמים (complete-case analysis) עבור המשתנה הרלוונטי, בעוד שהשלמות נתונים מרובות באמצעות משוואות משורשרות (m = 20) בוצעו לצורך ניתוחי רגישות. עקומות מאפיין תגובה של מקלט (ROC) והשטח תחת העקומה (AUC) התואם הופקו עבור ציטוקינים בודדים באמצעות חבילת pROC בתוך קוהורט המחקר המלא; לא נעשה שימוש בקוהורט אימות חיצוני נפרד. ניתוחי רגישות שהוגדרו מראש חזרו על השוואות הקבוצות הראשוניות לאחר החרגת משתתפים שקיבלו אנטיביוטיקה בתוך 72 h לפני ברונכוסקופיה, ולאחר שחולקה קבוצת הזיהום לפי מצב הנשמה מלאכותית ולפי תת-סוג דלקת ריאות (נרכשת בקהילה, נרכשת בבית חולים, או מקושרת למנשם). הניתוחים בוצעו באמצעות חבילות rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC ו-mice בתוכנת R v4.4. איורים הופקו באמצעות תוכנה מסחרית לגרפיקה מדעית (ראה טבלת חומרים).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אוכלוסיית המחקר ומאפייני המדגם
בקוהורט הניתוח הסופי היו 112 נבדקים, מתוכם 64 נבדקים בקבוצת הזיהום ו-48 נבדקים בקבוצת הביקורת ללא זיהום. המאפיינים הדמוגרפיים הבסיסיים היו דומים בין הקבוצות, בעוד שפרמטרים מעבדתיים הקשורים לזיהום היו גבוהים יותר בקבוצת הזיהום, כפי שמוצג בטבלה 1. הזיהומים נגרמו בעיקר על ידי חיידקים גרם-שליליים, כאשר הפתוגנים החיידקיים העיקריים היו Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, ו-Acinetobacter baumannii. ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
החוסן של פרוטוקול זה תלוי במספר החלטות שהתקבלו לפני ובמהלך האנליזה. קביעת שיעור ההשבה (recovery rate) הגבולי התחתון ב-40% ואיחוד המכסות (aliquots) השנייה והבאות אחרייה היו החלטה מכוונת, שכן המכסה הראשונה מכילה העשרה גבוהה יותר של חומרים מדרכי הנשימה הסיבכיות, בעוד ששיעור ההשבה משתנה באופן סיסטמטי בהתאם לגיל, מין, היסטוריית עישון והסיבכי המטרה18. חסימת רצפטורי Fc וטיטרציה של נוגדנים נגד שיבוטים (clones) בודדים להבטחת גבולות גייט (gating boundaries) נכונים בין נויטרופילים בוגרים CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ לבין...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
אנו מודים מקרב לב לכל המטופלים והמתנדבים שהשתתפו במחקר זה על שיתוף הפעולה בעל הערך שלהם. אנו מביעים את תודתנו לוועדת האתיקה על האישור האתי (מספר אישור 2026HL-038) וההכוונה הנורמטיבית לאורך כל תהליך המחקר.
אנו מודים לצוות הרפואי של המחלקה למחלות נשימה, מרכז הברונכוסקופיה והמעבדה הקלינית על תמיכתם באיסוף דגימות קליניות, עיבוד נוזל שטיפה ברונכאוולארית וזיהוי מיקרוביולוגי. כמו כן, אנו מעריכים את התמיכה בפלטפורמה הטכנית של המעבדה המרכזית של בית החולים עבור ניסויי ציטומטריה של זרימה רב-ממדית ואפיון ציטוקינים מולטיפלקס.
מחקר זה לא קיבל מענק ספציפי מגופי מימון במגזר הציבורי, המסחרי או הבלתי-מרוויח.
אנו מודים לכל החוקרים, הטכנאים וצוות הסיעוד שהיו מעורבים בפרויקט זה על מאמציהם בסינון המטופלים, ניהול הדגימות, ביצוע הניסויים וארגון הנתונים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן Anti-human CD1b, Brilliant Violet 421, clone ICRF4 | BioLegend | מספר קטלוג 301323 | סמן להפעלת נויטרופילים; ערוץ לייזר סגול אנא ספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.biolegend.com |
| נוגדן אנטי-CD14 אנושי, APC/Cyanine7, שיבט M5E2 | BioLegend | מספר קטלוג 301820 | סמן החרגה של מונוציטים-מקרופאגים; ערוץ לייזר אדום נא לספק את הטקסט להתרגום. https://www.biolegend.com |
| נוגדן אנטי-CD15 אנושי, PE, שיבוט HI98 | BioLegend | מס' קטלוג 301906 | סמן לשושלת נויטרופילים; ערוץ לייזר כחול אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.biolegend.com |
| נוגדן Anti-human CD16, Brilliant Violet 510, clone 3G8 | BioLegend | מספר קטלוג 302048 | הבשלה של נויטרופילים וסמן של תאי NK; ערוץ לייזר סגול אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.biolegend.com |
| נוגדן Anti-human CD45, PerCP, clone HI30 | BioLegend | מס' קטלוג 304026 / RRID: AB_89338 | סמן לכל הלויקוציטים; ערוץ לייזר כחול נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://antibodyregistry.org/AB_8938 |
| נוגדן אנטי-CD6b אנושי, FITC, שיבט G10F5 | BioLegend | מס' קטלוג 305103 | סמן גרנולוציטים; ערוץ לייזר כחול נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.biolegend.com |
| נוגדן Anti-human HLA-DR, PerCP/Cyanine5.5, clone L243 | BioLegend | מספר קטלוגי 307629 | סמן של תא מציג אנטיגן; ערוץ לייזר כחול נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://www.biolegend.com |
| מנתח המטולוגיה אוטומטי (Sysmex XN-100) | Sysmex Corporation | מכשיר (דגם XN-10) | מש לקביעת ספירת התאים הגרעיניים הכוללת לצורך חישוב מספר הנויטרופילים המוחלט נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.sysmex.com |
| אלבומין מסרום בקר | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | מספר קטלוג A7906 | מש בבפר של צביעה לציטומטריה של זרימה (0.5% משקל/נפח ב-PBS עם 2 mM EDTA) נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| חבילת ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | פרויקט Bioconductor | v2.20 (קוד פתוח) | מש למפות חום של קיבץ היררכי עבור נתוני ציטוקינים במולטיפלקס לא סופק טקסט למקור. נא לספק את הטקסט באנגלית לתרגום. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| צנטריפוגה להתרכזות תאים (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | מס' קטלוג A78303 | מש להכנת סליידים ציטולוגיים מתליה של תאי BALF נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78303 |
| תמיסת ליזיס של אריתרוציטים (BD FACS Lysing Solution, ריכוז 10X) | BD Biosciences | מס' קטלוג 349202 | מש לליזיס של אריתרוציטים לאחר צביעת שטח הפנים נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.bdbiosciences.com |
| חומצה אתילנדיאמינטטרהאצטית (EDTA), ריכוז 0.5 M, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | מספר קטלוגי AM9260G | בשימוש בתמיסת צביעה לציטומטריית זרימה בריכוז של 2 mM נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| צבע חיוניות קיבוע (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | מס' קטלוג 423105 | הדרה של תאים חיים-מתים לפני בחירת האוכלוסיות (gating); ערוץ לייזר אדום כתובת URL: https://www.biolegend.com |
| ברונכוסקופ וידאו גמיש | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | מכשיר (דגם BF-1TQ290) | מש לשטיפת ברונכית-נאדיות (BAL) תחת סדציה מתונה אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.olympus-global.com |
| ציטומטר זרימה, רב-צבעי (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | מכשיר (דגם CytoFLEX LX, תצורת שישה לייזרים) | בשימוש לרכישת נתוני פאנל זרימה של שבעה סמנים עבור נויטרופילים/מונוציטים אנא ספק את הטקסט המקור שברצונך לתרגם. https://www.beckman.com |
| תוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | מש לפיצוי ולביצוע gating ידני של קובצי FCS אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.flowjo.com |
| חבילת FlowSOM (R/Bioconductor) | פרויקט Bioconductor | v2.12 (קוד פתוח) | מש לקיבץ (clustering) ומטא-קיבץ של נתוני ציטומטריית זרימה באמצעות מפת ארגון עצמי (self-organising-map) נא לספק את טקסט המקור באנגלית לתרגום. https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (תוכנה לגרפיקה סטטיסטית) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | מש להפקת דמויות סופיות לא סופק טקסט למקור לתרגום. אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.graphpad.com |
| ריאגנט לחסימת קולטני Fc אנושיים (Human TruStain FcX) | BioLegend | מס' קטלוג 42301 / RRID: AB_2818986 | חסימת קולטני Fc לפני צביעה בנוגדנים אנא ספק את הטקסט המקור באנגלית שברצונך לתרגם. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| חבילת igraph (ב-R) | CRAN | v2.0 (קוד פתוח) | מש לבנייה ולהדמיה של גרף רשת המתאמים נא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://cran.r-project.org/package=igraph |
| מבחנות קריוגניות בעלות קישור חלבון נמוך, 2.0 מ"ל | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | מספר קטלוגי 375418 | בשימוש עבור מנות של עליון (supernatant) מנוזל שטיפת ברונכיו-אלבולארית (BALF) לצורך אנליזה של ציטוקינים נא ספק את הטקסט לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| פלטפורמת immunoassay מרובת-נבדקים (multiplex) מבוססת חרוצים של Luminex (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | מכשיר (דגם MAGPIX) | מש לרכישת בדיקת ציטוקינים רב-מערכתית (multiplex cytokine assay) נא לספק את הטקסט למסמך ה-URL שברצונך לתרגם. https://www.luminexcorp.com |
| מאי-גר (May-Gr)üתמיסת צבע בנאולד-ג'ימזה (nwald-Giemsa) | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | מספר קטלוגי GS500 | מש לספירה דיפרנציאלית של תאים בשיטת Cytospin אנא ספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs50 |
| חבילת mice (R) | CRAN | v3.16 (קוד פתוח) | מש להשלמה מרובה באמצעות משוואות שרשראתיות בניתוח רגישות נא ספק את טקסט המקור לתרגום. https://cran.r-project.org/package=mice |
| פאנל רב-מרכיבי (Multiplex) של ציטוקינים/כימוקינים המבוס על חרוזי מגנט (13-plex, בהתאמה אישית; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | מספר קטלוגי HCYTOMAG-60K | פאנל מותאם אישית למדידת 13 האנליטים המתוארים בסעיף 2.4 אנא ספק את הטקסט המקור שברצונך לתרגם. https://www.merckmillipore.com |
| מסנן תאים מרשת ניילון, 70 µm | Corning (Falcon) | מספר קטלוגי 352350 | מש לסינון מכני של BALF להסרת גושי ריר נא ספק את הטקסט למקור לתרגום. https://www.corning.com |
| מלח פוספט רב-ערכי (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | מס' קטלוג 101023 | בופר בסיס לריסוספנזיה (resuspension) וצביעה של תאים נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101023 |
| חבילת pROC (שפת R) | CRAN | גרסה 1.18 (קוד פתוח) | מש ליצירת עקומות ROC וערכי AUC נא לספק את הטקסט למקור לתרגום. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (סביבת מחשוב סטטיסטי) | R Core Team | גרסה 4.4 (קוד פתוח) | פלטפורמה לניתוחים סטטיסטיים ולהדמיה חזותית נא לספק את הטקסט למעבר לתרגום. https://www.r-project.org |
| חבילת rstatix (R) | CRAN | v0.7 (קוד פתוח) | מש להשוואות בין קבוצות ולסטטיסטיקה של מתאמים כתובת URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| חבילת Rtsne (ב-R) | CRAN | v0.17 (קוד פתוח) | מש להטמעות t-SNE נא לספק את הטקסט למסירה לצורך תרגום. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| חרוזי פיצוי צבועים בצבע בודד (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | מס' קטלוג 01-2-42 | מש כביקורות פיצוי לצבע בודד אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2-42 |
| תמיסת נתרן כלוריד להזרקה, 0.9% (סליין סטרילי) | Baxter International | מס' קטלוג 2B1324 | מש להחדרה של BAL (10–150 מ"ל, 20–מנות של 40 מ"ל ב- 37 °C) אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.baxter.com |
| חבילת uwot (R) | CRAN | v0.2 (קוד פתוח) | מש להפחתת ממדיות באמצעות UMAP נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (תוכנה לרכישת נתונים והתאמת עקומות עבור בדיקות מולטיפלקס) | Luminex Corporation (DiaSorin) | גרסה 4.3 | תוכנה קניינית של מכשיר להתאמת עקום סטנדרט מסוג 5PL נא לספק את הטקסט למסירה. https://www.luminexcorp.com |
מקורות
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.