מחקר זה מציג תהליך עבודה משולב להדמיה המשלב איסוף ועיבוד סטנדרטיים של נוזל שטיפה ברונכואלוולארית, פאנל ציטומטריית זרימה של שבעה סמנים, בדיקת ציטוקינים רב-אנליטית של 13 אנליטים, וקו ניתוח מאוחד.
מאמר מחקר
ויזואליזציה משולבת של גיוס נויטרופילים ואפיון ציטוקינים דלקתיים בנוזל שטיפה ברונכואלוולרי
במאמר זה
סיכום
תקציר
נוזל שטיפת ברונכואלוולרית (BALF) הוא מטריצת הדגימה הנגישה ביותר למשמעות ישירה לצורך חקר דלקת בדרכי הנשימה התחתונות, אך ניתוחים קונבנציונליים מסתמכים על ציטומטריה של זרימה בעלת סמן בודד בשילוב עם בדיקת ELISA לכל אנליט בנפרד, גישה המגבילה את צפיפות המידע ומסתירה את הצימוד בין תאים לגורמים (cell–factor coupling). מחקר זה מציג תהליך עבודה (workflow) משולב לוויזואליזציה המקשר בין איסוף ועיבוד מקדים סטנדרטיים לבין פאנל ציטומטריה של זרימה בעל שבעה סמנים עבור נויטרופילים ומונוציטים, בדיקת ציטוקינים מולטיפלקס ל-13 אנליטים, וצינור ניתוח מאוחד המבוס על UMAP (uniform manifold approximation and projection), מטא-קלסטרינג באמצעות FlowSOM, קלסטרינג היררכי, רשתות מתאם של Spearman וניתוח רכיבים ראשיים (PCA).
תהליך העבודה הוחל על קוהורט פרוספקטיבי מרכז יחיד של 12 מבוגרים שעברו ברונכוסקופיה, הכולל 64 חולים עם זיהום ריאתי המאומת מיקרוביולוגית ו-48 ביקורות ללא זיהום. תוצאות ציטולוגיות ומדידות בציטומטריה של זרימה חשפו הסטה מובהקת מפרופיל אלבולרי דומיננטי של מקרופאגים לפרופיל דומיננטי של נויטרופילים במהלך הזיהום, כאשר אחוז הנויטרופילים עלה מחציון של 3.2% ל-68.4% והריכוז המוחלט של הנויטרופילים עלה בערך פי 50. פרופיל מולטיפלקס זיהה תגובת ציטוקינים מתואמת של שלושה מודולים, כאשר המודולים של הכמוקינים, הפרו-דלקתיים והרגולטוריים היו כולם בעל-ביטוי (upregulated), כאשר CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α ו-G-CSF הראו את ההבחנה החזקה ביותר של סממן בודד בתוך קוהורט המחקר (שטח תחת העקום [AUC] של 0.89 עד 0.94). ויזואליזציה אינטגרטיבית באמצעות PCA, מטריצת קורלציה וגרף רשת חשפה ציר נויטרופיל-כמוקין המחובר באופן הדוק ברמת המשתתף, כאשר ספירת הנויטרופילים ב-BALF הגיחה כמרכז הרשת (network hub).
תהליך העבודה משתמש אך ורק בחומרים המתקבלים באופן שגרתי משטיפת ברונכית-נאבקים (BAL) המבוצעת מסיבות קליניות, אינו דורש נפח דגימה נוסף, ומספק מסגרת עשירה במידע לפתרון דלקות דרכי הנשימה בזיהומים נשימתיים, שעשויה להיות ישימה במעבדות רפואיות שלישיות המצוידות במערכות של ציטומטריה זרימה רב-פרמטרית ובפלטפורמות של multiplex bead-array, ובכך להתרחב למחקרים ארוכי טווח, למחקרי תא בודד ולהערכות טיפוליות. אימוץ קליני נרחב יותר של אנליטים בודדים כסמנים ביולוגיים ידרוש תיקוף פרוספקטיבי בקוהורטות רב-מרכזיות בלתי תלויות.
מבוא
מוותים מזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות נותרו גורם משמעותי לתמותה עולמית, למרות התקדמויות באסטרטגיות חיסונים ובשיטות טיפול; עם זאת, הדבר נכון במיוחד בקרב אוכלוסיות ילדים וקשישים1. נויטרופילים הם התאים העיקריים המדווחים בשלבים המוקדמים של תגובת חיסון מולדת במערכת הנשימה הנגועה, תהליך החיוני לסילוק הפתוגן הפולש; עם זאת, דלקת נויטרופילית בלתי נשלטת מובילה לפירוק של מחסום הנימיים האלבולרי, נזק חמצוני לרקמה ופיתוח של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS)2,3. נויטרופילים בחל האוויר של הריאה מראים גם קינטיקת גיוס, דפוסי שימור והתנהגות אפקטורית השונים מרקמות אחרות, והבדלים אלו משפיעים על השאלה האם הזיהום יחלוף או יתפתח לדלקת ריאות חמורה4.
נוזל שטיפת ברונכ׳י-אלבולארית (BALF) הוא מקור מידע חשוב על המיקרו-סביבה האלבולארית ומספק את הייצוג הקרוב ביותר של החסינות הקלינית באתר זה5. לכימוקין CXCL8 תפקיד חיוני בגיוס נויטרופילים לריאות באמצעות הקולטנים שלו, CXCR1 ו-CXCR2, לצד כימוקינים אחרים, הכוללים את CXCL1, CXCL2 ו-CXCL56. הציטוקינים IL-1β, IL-6 ו-TNF-α מעצימים תהליך זה עוד יותר, בעוד ש-IL-10 פועל כציטוקין נוגד. רמותיהם ב-BALF נמצאו כמתואמות עם חומרת זיהומי ריאות ועם התפתחות סיבוכי ריאות עקב דלקת ריאות חיידקית, נגיפית ואטיפית7, ופרופילים של סמנים ביולוגיים מרובי-מרכיבים (multiplex) ב-BALF מאומצים לצורך אבחון מוקדם יותר והבחנה בין פתוגנים בזיהומים של נתיבי הנשימה התחתונים8.
בדיקות שגרתיות של נוזל שטיפת ברונכית-נאבקים (BALF) נכשלות בדרך כלל בהכללה מלאה של הביולוגיה העומדת בבסיס הבדיקה. ניתן להעריך את ספירת התאים על ידי בידוי ידני של תאים בדגימות cytospin, בעוד שמתווכים מסיסים נמדדים באמצעות בדיקות ELISA בודדות ומוצגים כתרשים עמודות. כימוקינים, ציטוקינים וכל סוג תא מוערכים בנפרד, ללא קביעת מתאם בין מדרג ריכוז של כימוקין מסוים לבין אוכלוסיות התאים שהוא משפיע עליהן בדגימה. השילוב של מודולים של ציטוקינים, יחסי מינון-תגובה בין כימוקינים לנויטרופילים, ותתי-אוכלוסיות של חולים עם חתימות דלקתיות משלהם, נעלם לעיתים קרובות בהיעדר ניתוח רב-משתני9.
התקדמויות בחישוב הופכות גישה הוליסטית שכזו לריאלית יותר ויותר. שילוב של ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית וציטומטריית זרימה ספקטרלית עם גישות להפחתת ממדיות, כגון t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) או uniform manifold approximation and projection (UMAP), מאפשר מיפוי של פנוטיפים חיסוניים רב-ממדיים למרחב דו-מדי, כאשר UMAP הוכיחה שימור טוב יותר של טופולוגיה גלובלית ויכולת שחזור גבוהה יותר כאשר היא מיושמת על נתוני ציטומטריה10. פאנלים רב-אנליטים של ציטוקינים, ולאחריהם אשכולהיררכית ורשתות קורלציה, מסייעים בזיהוי חתימות המתואמות לחומרת המחלה שאינן ניתנות לזיהוי בגישות של ציטוקין בודד1. למרות ההתקדמות בתחום, עדיין לא קיים זרימת עבודה (workflow) המאחדת שיטות אלו כדי לחקור גיוס נויטרופילים וחתימות ציטוקינים מאותן דגימות BALF בזיהומים נשימתיים. מחקר זה מתאר זרימת עבודה ויזואלית אינטגרטיבית לבחינת גיוס נויטרופילים באמצעות ציטולוגיה וציטומטריית זרימה רב-פרמטרית, ולאחריהם ניתוחי UMAP וחתימות ציטוקינים באמצעות multiplex immunoassay, עם אשכולהיררכית, מטריצות קורלציה וניתוח רכיבים ראשיים (PCA). זרימת העבודה מניבה ויזואליזציה אינטגרטיבית המקיפה מדדי חיסון תאיים ומסיסים של דרכי הנשימה בגרף בודד, תוך שימוש בדגימות BALF המופקות באופן שגרתי במהלך ברונכוסקופיה המצוינת קלינית בזיהום בדרכי הנשימה התחתונות.
פרוטוקול
אוכלוסיית המחקר ואתיקה
זה היה מחקר תצפיתי פרוספקטיבי רב-מרכזי שנערך בבית חולים לימודי שלישוני בין ינואר 2026 לאפריל 2026. הפרוטוקול אושר תחת מספר אישור 2026HL-038, והסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל משתתף לפני ביצוע כל הליך במחקר.
מבוגרים בגילאי 18 עד 75 שעברו ברונכוסקופיה גמישה לאבחון עם שטיפת ברונכואלוולרית (BAL) כחלק מהטיפול הקליני השגרתי גויסו באופן רצף והוקצו לקבוצת זיהום או לקבוצת ביקורת ללא זיהום, בהתבס על האבחנות הקליניות והמיקרוביולוגיות הסופיות שלהם. סקירה כללית של תהליך העבודה של הוויזואליזציה המשולבת, מגיוס המטופלים ועד לתוצרים הוויזואליים המשולבים, מוצגת ב-איור 1.
איור 1סקירה כללית של תזרימה משולבת של ויזואליזציה עבור פרופיל של גיוס נויטרופילים ותגובות של ציטוקינים דלקתיים המבוס על BALF. חמשת השלבים מסכמים, משמאל לימין, גיוס פרוספקטיבי של קבוצות הזיהום והביקורת באמצעות ברונכוסקופיה ו-BAL, עיבוד מקדים של BALF לכדור תאים (cell pellet) ולפרקציית עלית (supernatant fraction), מדידות תאיות (ציטולוגיית Wright–Giemsa וציטומטריית זרימה רב-פרמטרית) ומדידות מולקולריות של חומרים מסיסים (בדיקה אימונולוגית מבוססת חרו지를 של 13-plex) במקביל, את צינור העיבוד המאוחד להדמיה (UMAP עם מטא-קלסטרינג מסוג FlowSOM, מפת חום היררכית, ניתוח רכיבים ראשיים ורשת קורלציית Spearman), ואת הפלט הוויזואלי המשולב. קיצורים: BAL = שטיפה ברונכאוולולרית; BALF = נוזל BAL; UMAP = קירוב והקרנה של יריעה אחידה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
קריטריוני ההכללה לקבוצת הזיהומים היו כדלקמן: (1) מטופלים שאובחנה אצלם דלקת ריאות נרכשת בקהילה (CAP), דלקת ריאות נרכשת בבית חולים (HAP) או דלקת ריאות הקשורה למסייע נשימה (VAP) על פי ההנחיות של ה-Infectious Diseases Society of America (IDSA) וה-American Thoracic Society (ATS); (2) זיהוי של פתוגן אחד או יותר באמצעות תרבית BALF של ≥104 יחידות יוצרות מושבות (CFU)/mL, בדיקת Multiplex PCR נשימתית, ריצוף metagenomic next-generation של BALF, או בדיקת אנטיגן/נוגדן ספציפית מדגימות נשימה/סרום זוגיות.
הקריטריונים לקבוצת הביקורת היו כדלקמן: (1) סיבות לא זיהומיות לביצוע ברונכוסקופיה, הכוללות הערכה של קשרית ריאה שאינה מוגדרת, תוצאות רדיולוגיות חריגות שאינן מעידות על זיהום, או בדיקה בשל שיעול כרוני; (2) היעדר זיהום ריאתי חריף, כפי שהוכח על ידי תוצאות שליליות של בדיקות מיקרוביולוגיות והיעדר סימני דלקת או זיהום מערכתי במועד הברונכוסקופיה; ו-(3) היעדר שימוש באנטיביוטיקה ב-30 הימים שקדמו להשתתפות. קבוצת הביקורת גויסה מקרב מטופלים שעברו ברונכוסקופיה בשל מצבים ריאתיים אחרים שהיו בעלי התוויה קלינית, ולא מקרב מתנדבים בריאים, כדי לשקף את האוכלוסייה ממנה מופק באופן שגרתי BAL בהתוויה קלינית במרכז המחקר.
קריטריוני ההדרה כללו: (1) ממאירות ו/או כימותרפיה ציטוטוקסית בששת החודשים שקדמו למחקר; (2) סרופוזיטיביות ל-HIV; (3) השתלת איבר מוצק או תאי גזע המטופויטיים; (4) טיפול אימונו-סופרסיבי ממושך הכולל מינון יומי שווה-ערך של prednisone במינון > 0.3 mg/kg למשך יותר מ-3 שבועות; (5) נשים הרות או מניקות; (6) היסטוריה של דיאתיזה דימומית או התוויות נגד לברונכוסקופיה גמישה; (7) מחלה נשימתית כרונית קשה קיימת (מחלה ריאתית חסימה כרונית [COPD] בשלב III/IV לפי ה-Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD], פיברוזיס ריאתי אידיופתי, אסתמה תמידית קשה, או ברונכייקטזיה משמעותית מבחינה קלינית); (8) שחפת פעילה; (9) השתתפות במחקר התערבותי אחר ב-30 הימים האחרונים. BAL בוצע במהלך הברונכוסקופיה הראשונה, בתוך 72 h מהקבלה לבית החולים במקרה של זיהומים, ובתוך 48 h מהאינטובציה בחולים עם זיהומים המאווררים מכנית.
חישובי גודל המדגם התמקדו בתוצאה התאית העיקרית: מספר הנויטרופילים ב-BALF בין הקבוצות. ביחס לגודל אפקט צפוי של 0.6 SD בין דרכי נשימה מזוהמות לדרכי נשימה שאינן מזוהמות, ובשקלול של 15% נשירה, נדרש גודל מדגם מינימלי של 45 נבדקים לקבוצה עבור α = 0.05 דו-זנבי עם עוצמה סטטיסטית של 80%. מתוך 156 מועמדים מתאימים, 27 לא עמדו בדרישות הסף (18 לא עמדו בקריטריוני ההכללה, בעיקר בשל חוסר יכולת לזהות גורם פתוגני האחראי למחלה שלהם בפרק הזמן שנקבע או חוסר הסכמה להליך עצמו; 9 עמדו בקריטריוני ההדרה, בעיקר עקב ממאירות פעילה או היסטוריה של טיפול כימותרפי, שימוש כרוני בקורטיקוסטרואידים, מחלת ריאות כרונית קשה קודמת או נטייה לדימומים). שאר 129 המשתתפים עברו ברונכוסקופיה. לאחר מכן, 17 נבדקים הוצאו מהמחקר (7 בשל תנובת BALF לא מספקת < 40%; 4 בשל ביטול הסכמה במהלך האשפוז; ו-6 בשל סיווג מחדש של הנבדקים לאחר הערכה מיקרוביולוגית סופית – 4 מועמדים לקבוצת הביקורת שאובחנה אצלם זיהום נסתר על סמך תוצאות התרבית; ו-2 מועמדים לקבוצת הזיהום שחסרו ראיות לזיהום לאחר ניתוח התרבית). מאגר הנבדקים הסופי כלל 12 משתפים: 64 עם זיהום ו-48 ללא זיהום.
איסוף ועיבוד מקדימה של BALF
בדיקת ברונכוסקופיה בוצעה על ידי מפעילים מיומנים בהתאם לפרוטוקול המוסדי הסטנדרטי, ובהתאם להמלצות טכניות שפורסמו עבור שטיפת ברונכואלוולרית (bronchoalveolar lavage)12. נעשה שימוש מקומי בלידוקאין, והמטופלים קיבלו סדציה תוורידית מתונה בעוד שסופק חמצן תומך כדי לשמור על רוויית חמצן (SpO₂) >92%. הברונכוסקופ הגמיש הוכנס ומוקם בתוך הסגמנט הברונכופולמונרי שבו נצפו ממצאים רדיולוגיים חריגים. במקרים בהם הממצאים הרדיולוגים היו דיפוזיים או שלא ניתן היה לאתרם, נבחרו הסגמנטים של האונה האמצעית הימנית או הלסגמנטים הלינגולריים השמאליים. לאחר כל הזרקה, בוצע שאיבה ידנית עדינה עם לחץ שלילי של < 10 mmHg. הזרקו בסך הכל שלוש עד חמש הזרקות של סליין סטרילי בטמפרטורה של 37 °C, בנפח של 20–40 mL כל אחת, לנפח כולל של 10–150 mL. יחס השחזור נאמד כנפח המשוחזר ביחס לנפח שהוזרק, ורק דגימות עם שחזור של ≥40% נלקחו בחשבון לצורך ניתוח.
הדגימות שנאספו מהשטיפה השנייה והשטיפות הבאות אוחדו כדי להפחית זיהום ברונכיאלי ולהשיג דגימה עשירה באלוולאולים. מאגר נוזל שטיפת הברונכואלוולארי (BALF) נשמר על קרח ועובד תוך 2 h מהאיסוף, תוך התחשבות בממצאים עדכניים על שינויים בהרכב התאי ובספירה הדיפרנציאלית לאחר אחסון ממושך וחימום של דגימות BALF אנושיות13. לאחר סינון באמצעות רשת ניילון סטרילית עם גודל נקבוביות של 70 microns להסרת הריר, שבוצע על ידי מעבר מכני בלבד ללא הוספת חומר ממיס ריר או חומר נוגד התגבשות כגון dithiothreitol, כיוון שבדיקות פיילוט הראו כי הדבר מספיק להסרת גושי ריר ללא אובדן מדיד שלמות האפיטופים על פני השטח בשלבים הבאים, הנוזל הועבר לסב צנטריפוגה ב-40 × g למשך 10 min ב-4 °C. הנוזל העליון נשפך וחולק לאליקוטים במבחנות הקפאה עם קישור חלבוני נמוך לצורך אנליזת ציטוקינים, והתאים הושעו ב-phosphate-buffered saline (PBS) עם 0.5% bovine serum albumin ו-2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), כאשר חלקם נשמרו לצורך ציטולוגיה וציטומטריית זרימה. דגימות הציטוקינים הוקפאו בחנקן נוזלי, נשמרו ב-–80 °C, ולא הועברו ביותר מסבב הקפאה-הפשרה אחד לפני השימוש.
ציטולוגיה של נויטרופילים וכימות באמצעות ציטומטריית זרימה
מבחינת ציטופתולוגיה, 10 µL של תרחיף תאי ה-BALF הועברו לשקופית זכוכית באמצעות ציטוצנטריפוגה (ראו טבלת חומרים) ב-30 × g למשך 5 דקות, יובשו באוויר ונצבעו בצביעת Wright-Giemsa. ספירה דיפרנציאלית בוצעה על ידי טכנאי המטולוגיה שלא היה בקיא ברקע הרפואי של המטופל, אשר ספר לפחות 40 תאים לכל שקופית וחישב את האחוזים של מקרופאגים, לימפוציטים, נויטרופילים ואאוזינופילים. אחוזי הנויטרופילים ב-BALF נחשבו למד התוצאה הראשי עבור הציטופתולוגיה, בהינתן ראיות נוכחיות המצביעות על תועלתם בהבחנה בין מחלות ריאה זיהומיות לבלתי זיהומיות בחולים עם תסננת ריאתית14.
פרוטוקול הכימות באמצעות ציטומטריית זרימה התבס על תיקוף עדכני של פרוטוקול להבחנה בין לוקוציטים בנוזל שטיפת סימפונות ונשמיות (BALF) בארבעה צבעים15 וכלל סמנים נוספים לזיהוי נויטרופילים. באופן ספציפי, כ-5 × 105 תאים שבודדו מ-BALF נחסמו באמצעות ריאגנט לחסימת קולטן Fc אנושי (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות ב-4 °C, ולאחר מכן נצבעו למשך 20 דקות ב-4 °C עם נוגדנים נגד CD45 (clone HI30), CD66b (clone G10F5), CD15 (clone HI98), CD16 (clone 3G8), CD1b (clone ICRF4), CD14 (clone M5E2), ו-HLA-DR (clone L243), בנוסף לצבע חיוניות ניתן לקיבוע (ראו טבלת חומרים). לצורך ליזיס של אריתרוציטים, נעשה שימוש בתמיסה מסחרית לליזיס של אריתרוציטים (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ליזיס האריתרוציטים, התאים נשטפו פעמיים ב-PBS בתוספת 2% סרום עגל עוברי (fetal calf serum) והושעו מחדש בבפר זרימה (flow buffer), ולאחר מכן נותחו באמצעות ציטומטר זרימה רב-צבעי (ראו טבלת חומרים). קומפנסציה בוצעה באמצעות חרוזי קומפנסציה שנצבעו בצבע בודד (ראו טבלת חומרים), ומבחנות fluorescence-minus-one ומבחנות לא צבועות נכללו עבור כל פאנל.
נרכשו לפחות 1 × 105 אירועים של CD45⁺ עבור כל דגימה. ראשית בוצע gating של סינגלטים בגרף FSC-A/FSC-H, לאחר מכן של לוקוציטים CD45⁺ חיים (viability dye⁻), ואז בוצעה החרגה של מונוציטים-מקרופגים CD14⁺HLA-DR⁺ כדי לבחור גרנולוציטים CD6b⁺ בעלי side scatter גבוה. נויטרופילים הוגדרו לאחר מכן בתוך אוכלוסיית הגרנולוציטים כאירועים של CD15⁺CD16⁺CD1b⁺. gate ראשוני זה של גרנולוציטים CD66b⁺ נמתח באופן רחב סביב כל האירועים בעלי side-scatter גבוה, במקום להיות מוגבל לגבול של CD15⁺CD16⁺CD1b⁺, כך שנויטרופילים מופעלים מסוג CD16-dim, CD1b-high וצורות גרנולוציטיות פחות בוגרות נותרו בתוך ספירת הנויטרופילים האוטומטית הכוללת; ההגדרה המחמירה יותר של CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ הוחלה רק כדי לאפיין את תת-האוכלוסייה של נויטרופילים בוגרים שדווחה בנפרד בניתוחי ה-clustering בהמשך. ספירת הנויטרופילים ב-BALF (תאים/µL) נאמדה על בסיס אחוז הנויטרופילים וספירת התאים בעלי הגרעין הכוללת שנקבעה באמצעות אנלייזר המטולוגי אוטומטי (ראו טבלת חומרים). מטריצות פיצוי (Compensation matrices), אסטרטגיית gating ודוחות בקרת איכות של דגימות בודדות נשמרו בארכיון, והאנליסטים נותרו עיוורים להקצאות של קבוצות המשתתפים לאורך כל תהליכי הרכישה והניתוח.
פרופיל Multiplex של ציטוקינים דלקתיים
על-נוזלי (supernatants) של BALF הופשרו פעם אחת על קרח רטוב, ולאחר מכן בוצע ערבוב קצר במערבל Vortex וביצוע הבהרה על ידי סנטריפוגציה ב-10,0 × g למשך 5 min ב-4 °C מיד לפני הבדיקה. מדידה של 13 אנליטים בשלוש קטגוריות תפקודיות בוצעה באמצעות פלטפורמת immunoassay מרובת-סמנים (multiplex) מבוססת חרוצים, עם פאנל חרוצים מגנטיים מותאם אישית (ראו טבלת חומרים). הקבוצה הפרו-דלקתית כללה את IL-1β, IL-6, IL-17A ו-TNF-α; קבוצת הכמוקינים כללה את CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 ו-CCL3/MIP-1α; והקבוצה הרגולטורית כללה את IL-10, IFN-γ, IL-1RA ו-G-CSF. בחירת האנליטים התבססה על אלו שדווחו באופן השכיח ביותר כבעלי ערך אינפורמטיבי בניתוחים מרובי-סמנים של ציטוקינים ב-BALF או בסרום במחקרי דלקת ריאות/זיהומים נשימתיים חמורים7,1. גורם הדילול (1:2 בבפר בדיקה) נקבע מתוך ניסוי פיילוט שנערך על תת-קבוצה מייצגת של דגימות מזוהמות ודגימות ביקורת, כדי להבטיח כי >90% מהמדידות נכללות בטווח עקומת הסטנדרט.
עקומות הסטנדרט נקבעו באמצעות דילול סדרתי של שבע נקודות של הסטנדרטים הרקומביננטיים של היצרן, שהוכנו בכפילות בכל פלטה, כולל באר ריקה אחת להפחתת הרקע. התאמת העקומה בוצעה באמצעות רגרסיה לוגיסטית בעלת חמישה פרמטרים (5PL) על ידי תוכנת הרכישה והניתוח הקניינית של המכשיר (ראו טבלת חומרים). גבול הכמות הנמוך (LLOQ) חושב ככמות הסטנדרט הקטנה ביותר המניבה התאמה חוזרת (back-fit recovery) שבין 80% ל-120% ומקדם וריאציה (CV) בתוך הרצה של ≤ 20%. ערכים שנפלו מתחת ל-LLOQ הוחלפו ב-LLOQ/√2. שתי דגימות בקרת איכות של נוזל שטיפת ברונכס-אלבולה (BALF) מאגירה, אחת ממטופל נגוע מייצג ואחת מנבדק לא נגוע, חולקו לאליקוטות והוספו לכל פלטה לצורך מעקב אחר הביצועים לטווח ארוך. תקני הבטחת האיכות התבסו על המלצות לפרקטיקה מיטבית שנגזרו מתוכנית לבדיקת מיומנות של מבחן מולטיפלקס מבוס חרוצים רב-אתרית שנמשכה 12 שנים16, כולל דרישות ל-CV תוך-מבחני של ≤ 10% בבארים כפולות, CV בין-פלטתי של ≤ 20% לבקרת איכות, ומספר חרוצים מינימלי של ≥ 50 לכל אנליט לכל באר. פלטות שלא עמדו בקריטריונים לעיל הורצו שוב. הניתוח בוצע בסבב בודד בתוך ארבעה שבועות, תוך שימוש באותה סדרת ערכה (lot), עם שזירה אקראית של דגימות הזיהום והביקורת.
תהליך ניתוח הוויזואליזציה
קבצי ה-Flow Cytometry Standard (FCS) נותחו תחילה באמצעות תוכנה מסחרית לציטומטריה עם זרימה (ראו טבלת חומרים) לצורך פיצוי (compensation) וסינון (gating) של תאי CD45 חיים⁺ סינגלטים (singlets), ולאחר מכן יצואו לצורך ניתוח בלתי מוטה ב-R v4.4. עבור כל דגימה, 10,00 CD45⁺ אירועים נדגמו מחדש (downsampled) ושורשרו, ועוצמות הסיגנל הועברו טרנספורמציה באמצעות פונקציית arcsinh עם cofactor של 150. הפחתת ממדים והשאלות UMAP בוצעו באמצעות חבילת uwot עם 15 השכנים הקרובים ביותר ומרחק מינימלי של 0.1, לצד השאלות t-SNE מקבילות באמצעות חבילת Rtsne עם perplexity של 30.10צבירי פנוטיפים זוהו באמצעות FlowSOM עם 10 צמתי מפה לארגון עצמי (self-organizing map nodes), וחולקו בהמשך ל-12–15 צבירים באמצעות meta-clustering, תוך שימוש בגישה מבוססת אופטימיזציה שאושרה לאחרונה עבור נתוני ציטומטריה רב-מדיים.17כל אשכול סווג על בסיס ביטוי החציוני של סממני שושלת והפעלה, ונבחן אל מול השערים הידניים.
לניתוח נתוני ציטוקינים מרובי-סמנים (multiplex), ערכים גולמיים עברו תחילה טרנספורמציית log₁₀ ולאחר מכן נורמלו בין האנליטים באמצעות z-scoring לפני ביצוע ניתוחים נוספים. הן האנליטים והן המטופלים עברו קיבץ היררכי (hierarchical clustering) תוך שימוש במרחק אוקלידי ובקישור מסוג Ward.D2; התוצאות הוצגו במפת חום (heatmap) עם קיבץ שורות ועמודות. גישה זו שימשה לזיהוי מודולים של ציטוקינים המבטאים ביטוי משותף ולסיווג תתי-קבוצות של מטופלים בקוהורטות דלקתיות מרובי-סמנים9. מטריצות מתאם הופקו עבור כל הביומארקרים התאיים והמסיסים באמצעות מתאמי דרגה של Spearman בזוגות. מפות חום של מטריצות המתאם שורטטו לצד רשת שבה הצמתים תואמים לביומארקרים והקשתים מציינות מתאמים ששרדו תיקון לבדיקות מרובות באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg (BH). רוחב הקשת הותאם לפי גודל מקדם המתאם |ρ|, וקשתים נכללו רק אם |ρ| ≥ 0.30 ו-p < 0.05 לאחר תיקון. ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) בוצע על המטריצה המנורמלת המכילה תאים וציטוקינים באמצעות הפונקציה prcomp() עם סקיילינג של שונות יחידה. המשתתפים הוקרינו על שני הרכיבים הראשיים הראשונים כאשר קבוצות הזיהום והביקורת הוטבכו עליהם. דגימה מופחתת (downsampling) ונורמליזציה עקביות של כל הניתוחים הבטיחו יכולת השוואה בין מדדי הביומארקרים התאיים והמסיסים בכל הוויזואליזציות.
ניתוח סטטיסטי
משתנים רציפים תוארו באמצעות החציון (טווח בין-רבעוני, IQR) כאשר ההתפלגות לא הייתה נורמלית על פי מבחני Shapiro–Wilk, ובאמצעות ממוצע (סטיית תקן, SD) במקרים אחרים. משתנים קטגוריאליים תוארו באמצעות שכיחויות ופרופורציות. השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U כאשר למשתנים רציפים הייתה התפלגות לא נורמלית, מבחן Welch t כאשר המשתנים הרציפים היו בעלי התפלגות נורמלית, ומבחן chi-squared/מבחן Fisher המדויק כאשר הדבר היה רלוונטי למשתנים קטגוריאליים. הקשרים בין משתנים רציפים הוערכו באמצעות מקדם המתאם של Spearman. כדי להתחשב בשיעור התגליות השגויות (FDR) בניתוחי ציטוקינים מרובים ובניתוחי מתאם, ערכי p הותאמו באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg עם סף של q < 0.05. ערך p < 0.05 דו-זנבי נחשב למשמעותי סטטיסטית בכל הניתוחים הראשוניים. במידת האפשר, מקרים עם נתונים חסרים במשתנים בודדים נשמרו ונותחו באמצעות ניתוח מקרים מלאים עבור המשתנה הרלוונטי, בעוד שהשלמות נתונים מרובות באמצעות משוואות שרשרת (m = 20) בוצעו לצורך ניתוחי רגישות. עקומות מאפייני תגובה (ROC) והשטח תחת העקומה (AUC) התואם הופקו עבור ציטוקינים בודדים באמצעות חבילת pROC בתוך קוהורט המחקר המלא; לא נעשה שימוש בקוהורט אימות חיצוני נפרד. ניתוחי רגישות שנקבעו מראש חזרו על השוואות הקבוצות הראשוניות לאחר החרגת משתפים שקיבלו אנטיביוטיקה בתוך 72 h לפני ברונכוסקופיה, ולאחר חלוקה של קבוצת הזיהומים לפי מצב הנשמה מלאכותית ולפי סוג הדלקת ריאות (נרכשת בקהילה, נרכשת בבית חולים או קשורה למסייע נשימה). הניתוחים בוצעו באמצעות חבילות rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC, ו-mice בתוכנת R v4.4. האיורים הופקו באמצעות תוכנה מסחרית לגרפים מדעיים (ראו טבלת חומרים).
תוצאות
אוכלוסיית המחקר ומאפייני המדגם
בקוהורט הניתוח הסופי היו 12 נבדקים, כאשר 64 נבדקים היו בקבוצת הזיהום ו-48 נבדקים היו בקבוצת ביקורת ללא זיהום. המאפיינים הדמוגרפיים בנקודת הבסיס היו דומים בין הקבוצות, בעוד שפרמטרים מעבדתיים הקשורים לזיהום היו גבוהים יותר בקבוצת הזיהום, כפי שמוצג ב טבלה 1. הזיהומים נגרמו בעיקר על ידי חיידקים גרם-שליים, כאשר הפתוגנים החיידקיים העיקריים היו Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, ו-Acinetobacter baumannii. פתוגנים נוספים היו Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, גורמים לא טיפוסיים, וירוסים וזיהומים מעורבים.
שיעורי השחזור של ה-BALF עמדו בסף שהוגדר מראש של ≥40% עבור כל הדגימות שנשמרו, עם שיעורים נמוכים מעט יותר בקבוצת הזיהום בהשוואה לקבוצת הביקורת (חציון 48.3% לעומת 53.3%, p = 0.03), באופן העולה בקנה אחד עם דלקת מוגברת בדרכי הנשימה וגודש רירי בדרכי הנשימה הזיהומיות. מכיוון שנפח השחזור היה שונה גם הוא בין הקבוצות (58 mL לעומת 64 mL, p = 0.04), ייתכן שכל ריכוזי הציטוקינים המדווחים יהיו נתונים להבדל צנוע במקדם הדילול בין הקבוצות; ניתוח רגישות שהוגדר מראש והוגבל לדגימות עם שיעור שחזור של ≥50% (n = 42 זיהום, n = 34 ביקורת) שחזר את הכיוון והעוצמה של כל השוואה בין-קבוצתית (השינוי הגדול ביותר בגודל האפקט < 8%), מה שמעיד כי לא סביר שהטיית דילול תסביר את ההבדלים שנצפו. הזמן בין האיסוף לעיבוד היה 65 min עבור קבוצת הזיהום ו-62 min עבור קבוצת הביקורת, ובכך נשמר בתוך חלון זמן של 2 h. קריטריונים של בקרת איכות (QC) ברמת הדגימה העידו על תוצאות באיכות גבוהה. ספירות דיפרנציאליות ציטולוגיות התקבלו על בסיס של ≥400 תאים שנספרו בכל 12/12 הדגימות (10%). רכישות ה-flow cytometry עמדו בקריטריון שהוגדר מראש של ≥1 × 105 אירועי CD45⁺ בכל 12/112 הדגימות (10%), עם חיוניות תאים חיים חציונית של 89.4% (IQR 85.6–92.8%). כל פלטות הציטוקינים במבנה multiplex עמדו בקריטריוני ה-QC לאחר הרצה חוזרת אחת. עבור כל 13 האנליטים, מקדם השונות (CV) התוך-בדיקתי היה 4.7% (2.1–9.3%, כולם <10%), ה-CV הבין-פלטתי של דגימות QC מאוחדות היה 1.2% (6.8–18.4%, כולם <20%), ומספר החרוזים החציוני היה 78 events/analyte/well (53–142, כולם ≥ 50).
| משתנה | זיהום (n = 64) | ביקורת (n = 48) | ערך p |
| גיל, שנים, חציון [IQR] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| זכר, n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| BMI, ק"ג/מ²2, חציונה [טווח בין-רבעוני] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.66 |
| היסטוריית עישון, n (%) | 0.52 | ||
| לעולם לא | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| הקודם | 22 (34.4) | 16 (33.3) | |
| זרם | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| יתר לחץ דם, מספר (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| סוכרת, n (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| מחלת לב דשנית, n (%) | 11 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| מחלה כלית כרונית, מספר (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| התוויה לברונכוסקופיה, מספר (%) | — | ||
| דלקת ריאות נרכשת בקהילה | 35 (54.7) | — | |
| דלקת ריאות נרכשת בבית חולים | 19 (29.7) | — | |
| דלקת ריאות הקשורה למנשם | 10 (15.6) | — | |
| קשרית ריאתית לא מוגדרת | — | 23 (47.9) | |
| חריגה רדיוגרפית מתמשכת | — | 15 (31.3) | |
| הערכת שיעול כרוני | — | 10 (20.8) | |
| פתוגן גורם, n (%) | — | ||
| חיידקים גרם-שליים | 28 (43.8) | ||
| חיידקים גרם-חיוביים | 16 (25.0) | ||
| פתוגנים אטיפיים | 7 (10.9) | ||
| נגיפי נשימה | 8 (12.5) | ||
| זיהום מעורב | 5 (7.8) | ||
| הנשמה מכנית בעת ביצוע BAL, מספר (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| חשיפה לאנטיביוטיקה בתוך 72 שעות לפני BAL, מספר (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.001 |
| נפח שהוחדר, מ"ל, חציון [IQR] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| נפח שהושב, מ"ל, חציונה [IQR] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0.04 |
| שיעור השחזור של נוזל שטיפת ברונכית ואלבאולית (BALF), %, חציון [IQR] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| זמן עיבוד, דקות, חציון [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.55 |
| תאי דם לבנים (WBC), × 10⁹/ל', חציון [טווח בין-רבעוני] | 11.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| נויטרופילים בדם, %, חציון [IQR] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.001 |
| חלבון C-ריאקטיבי, מ"ג/ל', חציון [טווח בין-רבעוני] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| פרוקלציטונין, ng/mL, חציון [IQR] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.001 |
טבלה 1: מאפיינים דמוגרפיים, קליניים ומאפייני עיבוד של BALF של קהל המחקר. מאפיינים דמוגרפיים בבסיס, מחלות רקע, אינדיקציות לברונכוסקופיה, פתוגנים גורמים, פרמטרים פרוצדורליים וערכי מעבדה של דם פריפריאלי מושווים בין 64 המשתתפים בקבוצת הזיהום לבין 48 המשתתפים בקבוצת הביקורת ללא זיהום. משתנים רציפים מדווחים כחציון [טווח בין-רבעוני] ומושווים באמצעות מבחן Mann–Whitney U ; משתנים קטגוריאליים מדווחים כ-n (%) ומושווים באמצעות מבחן chi-squared או מבחן Fisher's exact במידת הרלוונטיות. קיצורים: BAL = שטיפת ברונכאוולאולרית; BALF = נוזל שטיפה ברונכאוולאולרי; BMI = מדד מסת הגוף; IQR = טווח בין-רבעוני; WBC = ספירת תאי דם לבנים.
ויזואליזציה של גיוס נויטרופילים ל-BALF
נצפה שינוי ברור ביחס מאוכלוסייה הנשלטת על ידי מקרופאגים לאוכלוסייה הנשלטת על ידי נויטרופילים בקרב הנבדקים המודבקים, כפי שמוצג ב-איור 2. תכשירי הצנטריפוגה הציטולוגית (cytocentrifuge) נצבעו בטכניקת Wright–Giemsa, והצביעה הראתה הבחנה ברורה בין שתי הקבוצות, כאשר בקבוצת הביקורת היו יותר מקרופאגים אלבולאריים, כמה לימפוציטים ומספר נויטרופילים, בעוד שבקבוצה המודבקת שלטו נויטרופילים עם חיידקים תוך-תאיים שכיחים, גרעינים מנוונים וגרנולציות רעילות. ספירות דיפרנציאליות המבוסות על לפחות 40 תאים שנספרו שימשו לאימות ההבדלים, כאשר יחס הנויטרופילים עלה מערך חציוני של 3.2% (IQR: 1.8–5.6%) בקבוצת הביקורת ל-68.4% (IQR: 49.2–82.5%) בקבוצה המודבקת (p < 0.01), בעוד שיחס המקרופאגים האלבולאריים ירד מ-8.2% (IQR: 82.4–92.5%) ל-2.6% (IQR: 12.3–38.5%) (p < 0.001). אחוזי הלימפוציטים היו דומים בין הקבוצות (7.4% [4.8–1.3%] לעומת 6.5% [3.4–1.2%], p = 0.42).
ניתוחי ה-gating והפחתת הממדים איששו והרחיבו את הפנוטיפים התאיים שנצפו במיקרוסקופיה. לאחר הדרת שיירי תאים (debris), דובלטים ותאים מתים, גרנולוציטים CD45⁺CD6b⁺ היוו חציון של 65.8% (IQR: 46.2–79.4%) מכלל הלוקוציטים CD45⁺ בקבוצת הזיהום, לעומת 4.1% (IQR: 2.3–6.8%) בקבוצת הביקורת (p < 0.01). בתוך אוכלוסיית הגרנולוציטים, נויטרופילים בוגרים CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ היוו 92.4% (IQR: 87.5–95.8%) מכלל הגרנולוציטים בקבוצת הזיהום, לעומת 8.6% (IQR: 82.3–93.5%) בקבוצת הביקורת, נתון המעיד על כך שמאגר הנויטרופילים שגויס היה מורכב ברובו מתאים בוגרים ומובחנים באופן מלא, ולא מאוואים מוקדמים. השליכות של UMAP ו-t-SNE, המבוסות על מטריצת חלבוני פני השטח שעברה טרנספורמציית arcsinh, הראו טופולוגיות כמעט זהות שבהן מקרי זיהום תפסו "אי" בולט של נויטרופילים בוגרים CD15⁺CD16⁺CD1b⁺, שהיה מאוכלס באופן דליל בדגימות הביקורת, בעוד שאי המקרופאגים האלבאולריים HLA-DR⁺CD14⁺ הראה דפוס הפוך, עם אוכלוסייה צפופה בביקורות ואוכלוסייה דלילה בזיהום. מטא-קלסטרינג באמצעות FlowSOM זיהה 13 תת-אוכלוסיות, שביניהן תת-אוכלוסייה של נויטרופילים בוגרים (38.4% [2.6–56.2%] לעומת 2.8% [1.5–4.6%], p < 0.01) ואשכול של נויטרופילים מופעלים CD16-dim CD1b-high (22.6% [1.4–32.5%] לעומת 0.4% [0.1–1.2%], p < 0.01), שהראו את ההתרחבות הגדולה ביותר בין הקבוצות.
במונחים של מספר נויטרופילים מוחלט, נרשמה עלייה של פי 50 בערך במספר הנויטרופילים ב-BALF בקבוצת הזיהום בהשוואה לקבוצת הביקורת. המספר הכולל של תאים גרעיניים ל-µL של BALF עלה מ-156 cells/µL (IQR 8–232) בקבוצת הביקורת ל-384 cells/µL (IQR 180–712) בקבוצת הזיהום (p < 0.01), ומספר הנויטרופילים עלה מ-5 cells/µL (IQR 2–13) בקבוצת הביקורת ל-262 cells/µL (IQR 89–578) בקבוצת הזיהום (p < 0.01). הבדלים זוגיים באחוז הנויטרופילים ובמספר המוחלט בין הקבוצות נותרו מובהקים מאוד לאחר תיקון Benjamini–Hochberg (BH) (q < 0.01).
איור 2ויזואליזציה של גיוס נויטרופילים ל-BALF. שדות ייצוגיים של cytospin הצבועים בשיטת Wright–Giemsa ממשתתף ביקורת וממשתף נגוע ממחישים את המעבר מפרופיל תאי של BALF השולט בו מקרופאגים לפרופיל השולט בו נויטרופילים. אסטרטגיית gating של ציטומטריית זרימה בת ארבעה שלבים (FSC singlets → CD45 חיים⁺ לוקוציטים → CD6b⁺ גרנולוציטים לאחר CD14⁺HLA-DR⁺ הדרה → CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ נויטרופילים בוגרים), השקה (embedding) מסוג UMAP של נתוני ציטומטריית זרימה שעברו טרנספורמציית arcsinh עם שכבת overlay של 13-metacluster מ-FlowSOM, הצבועים לפי אנוטציה ביולוגית, ותרשימי קופסה של אחוז הנויטרופילים ב-BALF וריכוז נויטרופילים מוחלט (תאים/µL, סקלה לוגריתמית) מוצגים זה לצד זה כדי לאפשר השוואה ישירה של הפנוטיפים התאיים שזוהו בקבוצות ההדבקה והביקורת. קיצורים: BALF = נוזל שטיפה ברונכאוולבולרי; FSC = פיזור קדימה; UMAP = קירוב והקרנה של יריעה אחידה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
ויזואליזציה של פרופילים של ציטוקינים דלקתיים ב-BALF
דפוס של תגובות מתואמות על פני מספר צירי ציטוקינים הבדיל בין קבוצת הזיהום לקבוצת הביקורת, והציטוקינים קובצו לשלושה מודולים תפקודיים עקביים, כפי שמוצג ב-איור 3. קיבץ (Clustering) של ריכוזי ציטוקינים שעברו נרמול והמרה ל-log₁₀ באמצעות שיטת Ward.D2 הניב דנדרוגרמה ברורה של דגימות בשתי קבוצות, כאשר דגימות הזיהום והביקורות תפסו קצוות נגדיים של הדנדרוגרמה, ונצפו שבעה משתפים בלבד שסווגו באופן שגוי (ש ביקורות שקובצו עם דגימות זיהום, רובן מקרים של שיעול כרוני עם דלקת דרכי נשימה נויטרופילית קלה, ודגימת זיהום אחת שקובצה עם הביקורות, אשר ייצגה דלקת ריאות אטיפית מוקדמת). הדנדרוגרמה של האנליטים הגדירה שלושה מקבצי ציטוקינים. מקבץ הכמוקינים, הכולל את CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 ו-CCL3, הראה את השינוי המכפיל (fold change) הגדול ביותר בין קבוצת הזיהום לקבוצת הביקורת ואת המתאם התוך-מודולרי הגבוה ביותר. מקבץ הפרו-דלקתי, המכיל את IL-1β, IL-6, IL-17A ו-TNF-α, הראה עליות כיווניות דומות, אם כי פחות בולטות. מקבץ הוויסות, הכולל את IL-10, IL-1RA, IFN-γ ו-G-CSF, היה מוגבר גם הוא בדגימות זיהום, מה שמעיד על כך שהתגובה לא הייתה פרו-דלקתית בלבד אלא הפעילה במקביל זרועות נגד-ויסות ואנטי-ויראליות.
החציונים (IQRs) של כל האנליטים שנבדקו היו גבוהים יותר בקבוצת הזיהום בהשוואה לקבוצת הביקורת, וערך ה-p המתוקנן היה נמוך מ-0.01 עבור כל 13 האנליטים לאחר תיקון שיעור גילוי שגוי המבוס על BH (BH-FDR). מבין האנליטים, ל-CXCL8/IL-8 היה הריכוז הגבוה ביותר והשינוי המכפיל (fold change) החד ביותר (מ-68 [32–142] pg/mL בקבוצת הביקורת ל-2,485 [842–6,520] pg/mL בקבוצת הזיהום, עלייה של כ-36 מ 깜פלים). דפוס מקביל נראה עבור CXCL1/GRO-α, עם עלייה של כ-21 מ 깜פלים (78 [36–148] לעומת 1,672 [524–3,890] pg/mL). IL-1β הראה עלייה של כ-13 מ 깜פלים (5.8 [2.6–1.4] לעומת 78 [29–184] pg/mL). IL-6, IL-1RA, ו-G-CSF הראו עליות של 13 עד 16 מ 깜פלים (16.4 [7.8–30.5] לעומת 248 [82–612] pg/mL; 12 [48–258] לעומת 1,748 [658–3,964] pg/mL; 24 [10–52] לעומת 384 [125–912] pg/mL, בהתאמה). עליות קטנות יותר כללו את TNF-α (כ-8 מ 깜פלים), CXCL10/IP-10 (כ-9 מ 깜פלים), CCL2/MCP-1 (כ-8 מ 깜פלים), CCL3/MIP-1α (כ-10 מ 깜פלים), IL-10 (כ-10 מ 깜פלים), IFN-γ (כ-6 מ 깜פלים), ו-IL-17A (כ-4 מ 깜פלים).
ניתוח עקומת ROC (receiver operating characteristic) בתוך הקוהורט זיהה את IL-8 (AUC 0.94), IL-1β (AUC 0.92), IL-6 (AUC 0.91), CXCL1 (AUC 0.91), ו-G-CSF (AUC 0.89) כאנליטים בעלי יכולת ההבחנה החזקה ביותר כסמן בודד בין קבוצת הזיהום לקבוצת הביקורת; ערכי AUC אלו מסכמים את יכולת ההבחנה בתוך קוהורט הניתוח בהיעדר סט וולידציה חיצוני נפרד. ניתוח רגישות תחת השלמה מרובה באמצעות משוואות שרשרת (m = 20) הניב הערכות בטווח של 5% מחציוני המקרים המלאים עבור כל אנליט ולא שינה את סדר הדירוג של גדלי האפקט.
ניתוחי רגישות שנקבעו מראש שימשו להערכת ההשפעה של חשיפה קודמת לאנטיביוטיקה ושל תת-סוג הדלקת ריאות על ההבדלים שנצפו בסייטוקינים. כאשר השוואות הקבוצות העיקריות חזרו לאחר הדרת 41 המשתתפים מקבוצת הזיהום (64.1%) שקיבלו אנטיביוטיקה בתוך 72 שעות לפני BAL, כל 13 האנליטים נותרו גבוהים באופן מובהק ב-23 מקרי הזיהום שנותרו בהשוואה לקבוצות הביקורת לאחר תיקון BH-FDR (ערך p מותאם < 0.01 עבור חמשת המבדילים המובילים), עם הערכות נקודתיות שהיו מעט גבוהות יותר, ולא נמוכות יותר, מהחציונים של כלל העמותה (לדוגמה, CXCL8/IL-8 2,860 [980–7,110] pg/mL ו-IL-1β 92 [34–210] pg/mL), ממצא העולה בקנה אחד עם השתקה חלקית של סייטוקינים בדרכי הנשימה עקב חשיפה לאנטיביוטיקה לפני ה-BAL. שחלוף של קבוצת הזיהום לפי תת-סוג הדלקת ריאות הראה את אותו סדר דירוג של כימוקינים וסייטוקינים פרו-דלקתיים בדלקת ריאות שנרכשה בקהילה (n = 35), דלקת ריאות שנרכשה בבית חולים (n = 19), ודלקת ריאות הקשורה למסייע נשימה (n = 10), כאשר תת-הקבוצה של דלקת ריאות הקשורה למסייע נשימה הראתה את רמות החציונים הגבוהות ביותר עבור CXCL8, CXCL1, IL-6, ו-G-CSF, ומצב ההנשמה המכנית לא שינה את כיוון ההשוואה בין הקבוצות.
איור 3ויזואליזציה של פרופילי ציטוקינים דלקתיים ב-BALF. מפת חום של קיבץ היררכי של לוג (log)₁₀ריכוזים שעברו טרנספורמציה של $\log_{10}$ ונירמלו לציון Z (z-scored) של 13 האנליטים שנמדדו בקרב כל 12 המשתתפים, כאשר פסי הערות צבעוניים מעל מפת החום (heatmap) מציינים את השיוך לקבוצה (ביקורת, זיהום), את תת-הסוג של הדלקת ריאות (CAP, HAP או VAP), ואת קטגוריית הפתוגן הגורם למחלה (זיהום גרם-שלי, גרם-חיובי, לא טיפוסי, נגיפי או מעורב). תרשימי קופסה (Box plots) של הציטוקינים בעלי השפעות השונות הבולטות ביותר (CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF, ו-TNF-αיומן רישום₁₀ סקאלה, pg/mL) משווים בין קבוצת ההדבקה לקבוצת הביקורת. *** p < 0.01 לאחר תיקון שיעור גילויים שגויים לפי BH. קיצורים: BALF = נוזל שטיפה ברונכי-אלבולרי; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = דלקת ריאות נרכשת בקהילה; HAP = דלקת ריאות נרכשת בבית חולים; VAP = דלקת ריאות הקשורה למסייע נשימה. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
ויזואליזציה משולבת של גיוס נויטרופילים ופרופילי ציטוקינים
שילוב המדדים התאיים והמסיסים חשף קשר ביולוגי חזק בין גיוס נויטרופילים לבין מערכת הכימוקינים, כפי שמוצג ב-איור 4. ייצוג דו-מדי הופק מניתוח רכיבים ראשיים (PCA) של מטריצת התאים והציטוקינים הסטנדרטית, כאשר PC1 הסביר 51.1% מהשונות הכוללת ו-PC2 הסביר 12.7% נוספים, ובסך הכל 63.8%. PC1 הפריד בין קבוצת הזיהום לבקרה, ואופיין בעמסים חיוביים גבוהים עבור נויטרופילים ב-BALF, CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β ו-G-CSF, ועמסים שליליים גבוהים עבור מקרופאגים. PC2 הפריד בין מסלול עשיר בכימוקינים (עמסים חיוביים גבוהים עבור CXCL8 ו-CXCL1) לבין מסלול עשיר ברגולטורים (עמסים חיוביים עבור IL-10, IL-1RA ו-IFN-γ), כך שבתוך קבוצת הזיהום, המשתתפים נטו להיפרד לפי חומרת המחלה, כאשר מקרים של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה (ventilator-associated pneumonia) בטיפול בהנשמה מכנית שובצו ברביע העשיר בכימוקינים.
מתאמי דרגה של Spearman בזוגות בין 17 מאפיינים תאיים ומסיסים חשפו מתאם חיובי חזק בין מספר הנויטרופילים ב-BALF לבין ציר הכמוקינים הכללי (CXCL8 ρ = 0.78; CXCL1 ρ = 0.74; CCL3 ρ = 0.69; CCL2 ρ = 0.61; CXCL10 ρ = 0.54; כל ה- p המתוקננים < 0.01). רמה שנייה של מתאמים מובהקים זוהתה בין מספר הנויטרופילים לבין הציר הפרו-דלקתי (G-CSF ρ = 0.65; IL-1β ρ = 0.62; IL-6 ρ = 0.58; TNF-α ρ = 0.51), ולאחריה מתאמים חיוביים בינוניים עם הציר הרגולטורי (IL-10 ρ = 0.45; IL-1RA ρ = 0.48). אחוז המקרופאגים הראה מתאם שלילי מראה הן עם ציר הכמוקינים והן עם הציר הפרו-דלקתי בעוצמה דומה. מתאמים בתוך אותו ציר היו חזקים משמעותית ממתאמים בין צירים שונים (חציונו של |ρ| בתוך ציר = 0.68 לעומת חציונו של |ρ| בין צירים = 0.3), מה שתומך בקונספט של מסלולי בקרה משותפים במעלה הזרם השולטים בציר הכמוקינים, בציר הפרו-דלקתי ובציר הרגולטורי.
רשת המתאם מיפתה את הצימוד הזה על גרף שבו נויטרופילים ב-BALF היו צומת המרכז (hub) המרכזית ביותר, כאשר כל 13 הקשתים לציטוקינים שרדו את תיקון BH לבדיקות מרובות. מתוך 136 החיבורים הזוגיים האפשריים בין 17 המאפיינים, 99 עמדו בקריטריון המשולב של |ρ| ≥ 0.30 ו-BH-adjusted p < 0.05 ונשמרו. גרף רשת המתאם הציג ארכיטקטורה מודולרית ברורה של שלושה בלוקים ששחזרה את האשכולות שהתקבלו מההקבצה ההיררכית: החיבורים הצפופים והחזקים ביותר היו בין מודול הכמוקינים לבין ספירת ואחוז הנויטרופילים ב-BALF, חיבורים בעובי בינוני קישרו את המודול הפרו-דלקתי הן לנויטרופילים והן למודול הכמוקינים, וחיבורים דקים מהמודול הרגולטורי גישרו בין הבלוקים של הכמוקינים והבלוק הפרו-דלקתי. צומת אחוז המקרופאגים מיקמה את עצמה מול בלוק הנויטרופילים-כמוקינים והייתה מקושרת אליו באמצעות מניפה של קשתות בעלות משקל שלילי. יחד, PCA, מטריצת המתאם וגרף הרשת חשפו תבנית קוהרנטית שבה חדירה של נויטרופילים ל-BALF והתגובה הכמוקינית קשורות באופן חזק ברמת המשתתף הבודד, והנתיבים הפרו-דלקתיים והרגולטוריים משמשים כמודולים מוגדרים היטב אך מקושרים סביב ציר נויטרופילים-כמוקינים זה.
איור 4ויזואליזציה מצומדת של גיוס נויטרופילים ופרופילים של ציטוקינים דלקתיים. ביפלוט של ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) של מטריצת התאים והציטוקינים הסטנדרטית, כאשר המשתתפים צבועים לפי קבוצה, מפת חום של מתאם ספירמן, וגרף רשת של כל 17 המאפיינים התאיים והמסיסים (גודל הצמתים נקבע לפי הדרגה, וקנה מידה של הקשתות נקבע לפי |ρ| וסוננו באמצעות תיקון BH p < 0.05 ו-|ρ| ≥ 0.30), המדגיש את מוקד הנויטרופילים והכימוקינים. קיצורים: BH = Benjamini–Hochberg; PC = רכיב ראשי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של דמות זו.
זמינות נתונים:
מערך הנתונים ברמת המשתתף לאחר הסרת פרטים מזהים וקוד ניתוח ה-R ששימשו במחקר זה מסופקים כ-Supplemental Table S1 וכ-Supplemental File 1. נתונים נוספים התומכים בממצאי מחקר זה זמינים מהמחבר המקשר על פי בקשה סבירה.
טבלה משלימה S1: מאגר נתוני BALF. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 1: קובץ ZIP המכיל קודי ניתוח. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
החוסן של פרוטוקול זה תלוי במספר החלטות שהתקבלו לפני ובמהלך האנליזה. קביעת שיעור ההשבה (recovery rate) הגבולי התחתון ב-40% ואיחוד המכסות (aliquots) השנייה והבאות אחרייה היו החלטה מכוונת, שכן המכסה הראשונה מכילה העשרה גבוהה יותר של חומרים מדרכי הנשימה הסיבכיות, בעוד ששיעור ההשבה משתנה באופן סיסטמטי בהתאם לגיל, מין, היסטוריית עישון והסיבכי המטרה18. חסימת רצפטורי Fc וטיטרציה של נוגדנים נגד שיבוטים (clones) בודדים להבטחת גבולות גייט (gating boundaries) נכונים בין נויטרופילים בוגרים CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ לבין מקרופאגים אלבולריים CD14⁺HLA-DR⁺ (התאים הדומיננטיים בדגימת BALF עם הצביעה הלא-ספציפית ורקע האוטופלורסצנציה הגבוהים ביותר) הם חיוניים לשמירה על עקביות בין שתי הקבוצות19,20. גם הגבלת ההפשרה-הקפאה ומסגרת הזמן של 2-h לאנליזת ה-multiplex אינן מקריות. נתונים על BALF אנושי הראו ירידה משמעותית באחוזי הנויטרופילים בין 6 ל-24 h, גם כאשר נשמרו ב-4 °C, בעוד שאחוזי המקרופאגים והלימפוציטים נותרו עקביים13. פרמטרים עבור אלגוריתמי t-SNE ו-UMAP, כמו גם פרמטרים עבור רשת FlowSOM של 10-node ועבור 12–15 metaclusters, נקבעו לפני אנליזת הקבוצות כדי למנוע כיוונון לאחר מעשה (post hoc tuning), שהוא אחת הסיבות הידועות לחוסר השחזור של תהליכי ציטומטריה16. ניתן עדיין לשמור את זיהוי המפעילים והפלטה/ריצה עבור כל אירוע תאי (cell event) כדי להחיל שיטות לתיקון אצווה (batch-correction) באנליזות רחבות היקף בעתיד21.
קיימים מספר מצבי כשל נפוצים שאינם דורשים שינויים בפרוטוקול. התאוששות נמוכה (<40%) נובעת בדרך כלל ממיקום לא מספק של ה-wedge או משאיבה מוגברת; יש לטפל בבעיה זו על ידי התאמת מיקום הברונכוסקופ והפחתת השאיבה ל-<10 mmHg לפני שאיבת מנה (aliquot) נוספת. ניתן לצמצם אוטו-פלואורסצנציה מוגברת של מקרופאגים אלבולאריים, המהווה את גורם ההפרעה העיקרי בניתוח ציטומטריה של תאי ריאה, על ידי הכללת בקרות של תאי ריאה לא צבועים בכל סדרה והגדרה ברורה של שער (gate) המקרופאגים בעל ה-side-scatter הגבוה, במקום להסתמך אך ורק על צבעי חיוניות19. פאנלים רב-מרכיביים (Multiplex) נפגעים לעיתים קרובות ממספרי חרוצים (beads) נמוכים ו מערכי ערכים חריגים גבוהים. ביצוע עקומת דילול ראשונית עבור תת-קבוצה של דגימות נגועות ודגימות ביקורת לפני קביעת דילול של 1:2 מבטיח מניעה של רוויית אות של CXCL8, CXCL1 ו-G-CSF, הנמצאים בחלק העליון של עקומת הסטנדרט עבור דגימות דלקת ריאות, וזאת בשל אפקט המטריקס שהתגלה בעבר בדגימות BALF2. ניתן להתאים את הפרוטוקול עוד יותר בהתאם למאפייני העקבה. כאשר הדגימות מכילות בעיקר סוג פתוגן בודד, צמצום הפאנל הליבתי כך שיכלול רק כימוקינים ומתווכים פרו-דלקתיים ישמר עוצמה סטטיסטית מספקת. במקרה של אוכלוסייה מעורבת המכילה חיידקים, נגיפים ופתוגנים לא טיפוסיים, עדיין יהיה מועיל למדוד גם מתווכים רגולטוריים, שכן הוכח לאחרונה כי קיימת חתימה ספציפית לפתוגן בניוטרופילים ובמקרופאגים אלבולאריים23, וששילוב של ציטוקינים פרו-דלקתיים ורגולטוריים ב-BALF משקף את חומרת המחלה בדלקת ריאות שנרכשה בקהילה24.
התרומה של תהליך העבודה הנוכחי אינה התצפית הפרטנית על זרימה של נויטרופילים או עלייה ברמות של כימקינים וציטוקינים פרו-דלקתיים בזיהום נשימתי, שניהם מתועדים בהרחבה, אלא השילוב של פאנל ציטומטריית זרימה של שבעה סמנים לנויטרופילים ומונוציטים יחד עם בדיקת אימונו-assay מולטיפלקס של 13 אנליטים, בתוך צינור ויזואליזציה משותף המיושם על אותה דגימת BALF. יישום של פאנל בעל שבעה סמנים המכוון לנויטרופילים ומונוציטים, יחד עם בדיקת אימונו-assay מולטיפלקס של 13 אנליטים, לוכד את המורכבות הפנוטיפית והציטוקינית; ללא גישה זו, הניתוח היה דורש מספר בדיקות עצמאיות עם נפח BALF גדול בהרבה ממה שניתן להשיג מדגימה סטנדרטית של ברונכוסקופיה. הגישה הראשונה עולה בקנה אחד עם עבודות קודמות המראות שציטומטריית זרימה רב-צבעית היא אמינה באותה מידה כמו מיקרוסקופיה ידנית לזיהוי סוגי תאים בדגימות BALF15, בעוד שקריטריוני הקבלה עבור השנייה משקפים שיטות עבודה מומלצות מתוכנית מוכרת לבדיקת מיומנות של מערכי multiplex מבוססי חרוצים רב-מרכזית16. בפרט, השילוב של מפת חום (heatmap), תרשים רשת ו-PCA שנבנו באמצעות קלטים סטנדרטיים זהים, חושף קשרים בין סוגי התאים והגורמים הקשורים אליהם שבעבר ניתן היה להסיקם רק על ידי סיכום של תרשימי עמודות עצמאיים. הדבר חשוב מכיוון שהכימקינים CXCL8, CCL2 ו-CCL3 המופקים מ-BALF פועלים יחד כדי לגייס נויטרופילים ומונוציטים ממיטת מחזור דם משותפת, והמבנה המשותף שלהם נושא מידע שלא ניתן להפיק מקריאות עצמאיות של אנליט בודד9,10. BALF כבר מופק באופן שגרתי למטרות קליניות ואינו דורש נפח נוסף, כך שניתן להגדיר את תהליך העבודה כתוסף טרנסלציונלי לשירותי ברונכוסקופיה קיימים ולא כהליך אבחנתי עצמאי.
זמן הסב המעשי של זרימת העבודה המלאה, הכוללת הובלת דגימות, צביעה, רכישת נתונים בציטומטריה זרימה, אינקובציה וקריאה של בדיקה מולטיפלקס, והצינור החישובים הבא לאחר מכן, הוא בסדר גודל של 24 h תחת תנאי מעבדה מחקרית. לפיכך, זרימת העבודה ממוצבת ככלי לפנוטיפיה עמוקה לצורך אפיון מכניסטי וניטור תגובה לטיפול, ולא כבדיקת טריאז' דחופה לצד מיטת החולה לצורך החלטות קריטיות בזמן, כגון הבחנה מיידית בין דלקת ריאות הקשורה למנשם לבין תסמונת ג distress נשימתית חריפה סטרילית, שעבורן בדיקות מיקרוביולוגיות ובדיקות של סמן ביומטרי בודד המהירות יותר נותרות תקן הטיפול.
ישנן מספר מגבלות שיש לציין. נוזל שטיפת ברונכים-אלבולאריים (BALF) נאסף ממרחב האוויר ומייצג את האינטראקציות המיידיות של פני השטח של מרחב האוויר, אך הוא אינו מכיל תאים הממוקמים בתוך דופן הבחולב ואובב הבית (septum), שם ממוקמים מקרופאגים מופעלים רבים ולימפוציטים תושבי רקמה. לפיכך, אין יחס של אחד-לאחד בין המצב החיסוני של מרחב האוויר לבין זה של הפארנכימה, בדומה לנתונים שפורסמו בעבר25. זיהוי מרובה (Multiplex) מבוס חרוצים סובל מתגובתיות צולבת של נוגדנים, כמו גם מאפקטים של מטריצה, הנפוצים במיוחד בסביבה המכילה מוצין וסורפקטנט של BALF בהשוואה לזו של סרום דם; בנוסף, לא ניתן להתגבר על תהליך הדילול של נוזל הציפוי האפיתלי באמצעות סליין באמצעות אף אחד מהסמנים האנדוגניים, כגון urea, בהתאם לביקורות שפורסמו לאחרונה26. נפח השטיפה שהוחזר היה נמוך בממוצע ב-6 mL בקבוצת הזיהום לעומת קבוצות הביקורת, לכן הריכוזים המוחלטים המדווחים כאן כפופים להבדל מתון במקדם הדילול בין הקבוצות, ולא הופעל סמן דילול אנדוגני. חשיפה קודמת לאנטיביוטיקה ב-41 מתוך 64 המשתתפים בקבוצת הזיהום (64.1%) עשויה להפחית את ריכוזי הציטוקינים בדרכי הנשימה ואת השחזור של הפתוגנים. חשוב לציין כי הפרוטוקול מייצג רק תמונה רגעית בנקודת זמן אחת במהלך ברונכוסקופיה שהתבקשה קלינית, ובכך הוא מונע ניתוח של קינטיקת גיוס נויטרופילים, הפרשת כימוקינים מקסימלית וההחלמה שלהם בחולים בודדים. ערכי AUC של אנליט בודד נגזרו מאותה קוהורט ששימשה לזיהוי סמנים ביולוגיים, בהיעדר קוהורט תיקוף עצמאי, ויש לפרשם כמדדים להבחנה בתוך הקוהורט ולא כביצועים אבחנתיים המתוקפים חיצונית; אימוץ של כל סף של סמן בודד בפרקטיקה קלינית ידרוש תיקוף פרוספקטיבי בקוהורט רב-מרכזית עצמאית. ניתוחי רגישות שהוגדרו מראש והוגבלו לדגימות עם שיחזור גבוה יותר, למשתתפים שלא קיבלו אנטיביוטיקה, ושחולקו לפי סטטוס הנשמה מלאכותית ולפי תת-סוג של דלקת ריאות (נרכשת בקהילה, נרכשת בבית חולים או קשורה למנשם), לא שינו את כיוון ההשוואות בין הקבוצות.
בעתיד, ניתן יהיה להתגבר על מגבלות אלו על ידי הוספת ריצוף RNA של תאי בודד (single-cell RNA sequencing) או CITE-seq לאותם משקעי BALF ששימשו לכימות חלבונים ותאים, אשר יושמו בהצלחה בקוהורטים גדולים של דלקת ריאות חיידקית ודלקת ריאות של Mycoplasma pneumoniae בילדים, כדי לחשוף תתי-סוגים של נויטרופילים ומקרופאגים אלבולריים שאינם ניתנים להבחנה באמצעות ציטומטריית זרימה מסורתית27,28. הוספת המידע שיתקבל מניתוחי חלל האוויר למידע המסופק על ידי ציטומטריית מסה של תמונה (imaging mass cytometry) או טרנסקריפטומיקה מרחבית של ביופסיות תואמות או אפילו חומרים מנתיחה לאחר המוות, תעניק הקשר למידע זה29. קישור של דגימת BALF לרוחב זמן להערכה של אנטגוניסטים של CXCR1/CXCR2 וחסימה של קולטן IL-6, ששניהם הראו תועלת בהישרדות או בתמיכה באיברים בדלקת ריאות חמורה ובתסמונת גפיים חדה (ARDS), יאפשר גם לבחון את ציר הנויטרופיל-כימוקין שהודגש במסלול עבודה זה ככלי מסייע לקבלת החלטות טיפוליות30,31.
לסיכום, מחקר זה מתאר תהליך עבודה (workflow) משולב לוויזואליזציה, המורכב מהליכי איסוף והכנה סטנדרטיים של BALF, פאנל ציטומטריה זרימה בעל שבעה סמנים המכמת את הרכב הנייטרופילים והמונוציטים, בדיקת ציטוקינים מולטיפלקס המודדת 13 ציטוקינים, ופלטפורמת ויזואליזציה משותפת הכוללת ניתוחי UMAP, קיבץ היררכי (hierarchical clustering), רשת קורלציה ו-PCA. על ידי יישום תהליך העבודה על קוהורט פרוספקטיבי של 12 מבוגרים שעברו ברונכוסקופיה מהסיבות הקליניות, זיהה הניתוח מעבר בולט בהרכב התאים החיסוניים האלבולאריים ממקרופאגים לנייטרופילים בחולים עם זיהום, גילה דפוס תגובה של ציטוקינים בעל שלושה מודולים, וחשף ציר נייטרופילים-כימוקינים בעל צימוד חזק שאינו ניתן לצפייה באמצעות מדידות של סמן בודד. הפרוצדורה מסתמכת אך ורק על חומר שנאסף במהלך אבחנה קלינית, אינה דורשת נפח דגימה נוסף, ועשויה להיות ישימה במעבדות לרפואה שלישונית המצוידות לציטומטריה זרימה רב-פרמטרית ולניתוח multiplex bead-array. אימוץ רחב יותר וכל שימוש באנליטים בודדים כסמנים ביולוגיים לאבחון ידרשו תיקוף פרוספקטיבי בקוהורטים רב-מרכזיים בלתי תלויים. לפיכך, המחקר מציג מתודולוגיה שניתנת לשחזור ועשירה בנתונים לאפיון דלקת בדרכי הנשימה בזיהומים נשימתיים, ומספק בסיס לפיתוחה העתידי למחקרים אורך, ניתוחים של תא בודד וניתוחים מרחביים (spatial analysis), והערכה טיפולית של אימונומודולציה המכוונת לציר הנייטרופילים-כימוקינים.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
אנו מודים מקרב לב לכל המטופלים והמתנדבים שהשתתפו במחקר זה על שיתוף הפעולה בעל הערך שלהם. אנו מביעים את תודתנו לוועדת האתיקה על האישור האתי (מספר אישור 2026HL-038) וההכוונה הנורמטיבית לאורך כל תהליך המחקר.
אנו מודים לצוות הרפואי של המחלקה למחלות נשימה, מרכז הברונכוסקופיה והמעבדה הקלינית על תמיכתם באיסוף דגימות קליניות, עיבוד נוזל שטיפה ברונכאוולארית וזיהוי מיקרוביולוגי. כמו כן, אנו מעריכים את התמיכה בפלטפורמה הטכנית של המעבדה המרכזית של בית החולים עבור ניסויי ציטומטריה של זרימה רב-ממדית ואפיון ציטוקינים מולטיפלקס.
מחקר זה לא קיבל מענק ספציפי מגופי מימון במגזר הציבורי, המסחרי או הבלתי-מרוויח.
אנו מודים לכל החוקרים, הטכנאים וצוות הסיעוד שהיו מעורבים בפרויקט זה על מאמציהם בסינון המטופלים, ניהול הדגימות, ביצוע הניסויים וארגון הנתונים.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן Anti-human CD1b, Brilliant Violet 421, clone ICRF4 | BioLegend | מספר קטלוג 301323 | סמן להפעלת נויטרופילים; ערוץ לייזר סגול אנא ספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.biolegend.com |
| נוגדן אנטי-CD14 אנושי, APC/Cyanine7, שיבט M5E2 | BioLegend | מספר קטלוג 301820 | סמן החרגה של מונוציטים-מקרופאגים; ערוץ לייזר אדום נא לספק את הטקסט להתרגום. https://www.biolegend.com |
| נוגדן אנטי-CD15 אנושי, PE, שיבוט HI98 | BioLegend | מס' קטלוג 301906 | סמן לשושלת נויטרופילים; ערוץ לייזר כחול אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.biolegend.com |
| נוגדן Anti-human CD16, Brilliant Violet 510, clone 3G8 | BioLegend | מספר קטלוג 302048 | הבשלה של נויטרופילים וסמן של תאי NK; ערוץ לייזר סגול אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.biolegend.com |
| נוגדן Anti-human CD45, PerCP, clone HI30 | BioLegend | מס' קטלוג 304026 / RRID: AB_89338 | סמן לכל הלויקוציטים; ערוץ לייזר כחול נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://antibodyregistry.org/AB_8938 |
| נוגדן אנטי-CD6b אנושי, FITC, שיבט G10F5 | BioLegend | מס' קטלוג 305103 | סמן גרנולוציטים; ערוץ לייזר כחול נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.biolegend.com |
| נוגדן Anti-human HLA-DR, PerCP/Cyanine5.5, clone L243 | BioLegend | מספר קטלוגי 307629 | סמן של תא מציג אנטיגן; ערוץ לייזר כחול נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://www.biolegend.com |
| מנתח המטולוגיה אוטומטי (Sysmex XN-100) | Sysmex Corporation | מכשיר (דגם XN-10) | מש לקביעת ספירת התאים הגרעיניים הכוללת לצורך חישוב מספר הנויטרופילים המוחלט נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.sysmex.com |
| אלבומין מסרום בקר | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | מספר קטלוג A7906 | מש בבפר של צביעה לציטומטריה של זרימה (0.5% משקל/נפח ב-PBS עם 2 mM EDTA) נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| חבילת ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | פרויקט Bioconductor | v2.20 (קוד פתוח) | מש למפות חום של קיבץ היררכי עבור נתוני ציטוקינים במולטיפלקס לא סופק טקסט למקור. נא לספק את הטקסט באנגלית לתרגום. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| צנטריפוגה להתרכזות תאים (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | מס' קטלוג A78303 | מש להכנת סליידים ציטולוגיים מתליה של תאי BALF נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78303 |
| תמיסת ליזיס של אריתרוציטים (BD FACS Lysing Solution, ריכוז 10X) | BD Biosciences | מס' קטלוג 349202 | מש לליזיס של אריתרוציטים לאחר צביעת שטח הפנים נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.bdbiosciences.com |
| חומצה אתילנדיאמינטטרהאצטית (EDTA), ריכוז 0.5 M, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | מספר קטלוגי AM9260G | בשימוש בתמיסת צביעה לציטומטריית זרימה בריכוז של 2 mM נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| צבע חיוניות קיבוע (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | מס' קטלוג 423105 | הדרה של תאים חיים-מתים לפני בחירת האוכלוסיות (gating); ערוץ לייזר אדום כתובת URL: https://www.biolegend.com |
| ברונכוסקופ וידאו גמיש | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | מכשיר (דגם BF-1TQ290) | מש לשטיפת ברונכית-נאדיות (BAL) תחת סדציה מתונה אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.olympus-global.com |
| ציטומטר זרימה, רב-צבעי (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | מכשיר (דגם CytoFLEX LX, תצורת שישה לייזרים) | בשימוש לרכישת נתוני פאנל זרימה של שבעה סמנים עבור נויטרופילים/מונוציטים אנא ספק את הטקסט המקור שברצונך לתרגם. https://www.beckman.com |
| תוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | מש לפיצוי ולביצוע gating ידני של קובצי FCS אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.flowjo.com |
| חבילת FlowSOM (R/Bioconductor) | פרויקט Bioconductor | v2.12 (קוד פתוח) | מש לקיבץ (clustering) ומטא-קיבץ של נתוני ציטומטריית זרימה באמצעות מפת ארגון עצמי (self-organising-map) נא לספק את טקסט המקור באנגלית לתרגום. https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (תוכנה לגרפיקה סטטיסטית) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | מש להפקת דמויות סופיות לא סופק טקסט למקור לתרגום. אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.graphpad.com |
| ריאגנט לחסימת קולטני Fc אנושיים (Human TruStain FcX) | BioLegend | מס' קטלוג 42301 / RRID: AB_2818986 | חסימת קולטני Fc לפני צביעה בנוגדנים אנא ספק את הטקסט המקור באנגלית שברצונך לתרגם. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| חבילת igraph (ב-R) | CRAN | v2.0 (קוד פתוח) | מש לבנייה ולהדמיה של גרף רשת המתאמים נא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://cran.r-project.org/package=igraph |
| מבחנות קריוגניות בעלות קישור חלבון נמוך, 2.0 מ"ל | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | מספר קטלוגי 375418 | בשימוש עבור מנות של עליון (supernatant) מנוזל שטיפת ברונכיו-אלבולארית (BALF) לצורך אנליזה של ציטוקינים נא ספק את הטקסט לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| פלטפורמת immunoassay מרובת-נבדקים (multiplex) מבוססת חרוצים של Luminex (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | מכשיר (דגם MAGPIX) | מש לרכישת בדיקת ציטוקינים רב-מערכתית (multiplex cytokine assay) נא לספק את הטקסט למסמך ה-URL שברצונך לתרגם. https://www.luminexcorp.com |
| מאי-גר (May-Gr)üתמיסת צבע בנאולד-ג'ימזה (nwald-Giemsa) | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | מספר קטלוגי GS500 | מש לספירה דיפרנציאלית של תאים בשיטת Cytospin אנא ספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs50 |
| חבילת mice (R) | CRAN | v3.16 (קוד פתוח) | מש להשלמה מרובה באמצעות משוואות שרשראתיות בניתוח רגישות נא ספק את טקסט המקור לתרגום. https://cran.r-project.org/package=mice |
| פאנל רב-מרכיבי (Multiplex) של ציטוקינים/כימוקינים המבוס על חרוזי מגנט (13-plex, בהתאמה אישית; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | מספר קטלוגי HCYTOMAG-60K | פאנל מותאם אישית למדידת 13 האנליטים המתוארים בסעיף 2.4 אנא ספק את הטקסט המקור שברצונך לתרגם. https://www.merckmillipore.com |
| מסנן תאים מרשת ניילון, 70 µm | Corning (Falcon) | מספר קטלוגי 352350 | מש לסינון מכני של BALF להסרת גושי ריר נא ספק את הטקסט למקור לתרגום. https://www.corning.com |
| מלח פוספט רב-ערכי (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | מס' קטלוג 101023 | בופר בסיס לריסוספנזיה (resuspension) וצביעה של תאים נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101023 |
| חבילת pROC (שפת R) | CRAN | גרסה 1.18 (קוד פתוח) | מש ליצירת עקומות ROC וערכי AUC נא לספק את הטקסט למקור לתרגום. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (סביבת מחשוב סטטיסטי) | R Core Team | גרסה 4.4 (קוד פתוח) | פלטפורמה לניתוחים סטטיסטיים ולהדמיה חזותית נא לספק את הטקסט למעבר לתרגום. https://www.r-project.org |
| חבילת rstatix (R) | CRAN | v0.7 (קוד פתוח) | מש להשוואות בין קבוצות ולסטטיסטיקה של מתאמים כתובת URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| חבילת Rtsne (ב-R) | CRAN | v0.17 (קוד פתוח) | מש להטמעות t-SNE נא לספק את הטקסט למסירה לצורך תרגום. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| חרוזי פיצוי צבועים בצבע בודד (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | מס' קטלוג 01-2-42 | מש כביקורות פיצוי לצבע בודד אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2-42 |
| תמיסת נתרן כלוריד להזרקה, 0.9% (סליין סטרילי) | Baxter International | מס' קטלוג 2B1324 | מש להחדרה של BAL (10–150 מ"ל, 20–מנות של 40 מ"ל ב- 37 °C) אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.baxter.com |
| חבילת uwot (R) | CRAN | v0.2 (קוד פתוח) | מש להפחתת ממדיות באמצעות UMAP נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (תוכנה לרכישת נתונים והתאמת עקומות עבור בדיקות מולטיפלקס) | Luminex Corporation (DiaSorin) | גרסה 4.3 | תוכנה קניינית של מכשיר להתאמת עקום סטנדרט מסוג 5PL נא לספק את הטקסט למסירה. https://www.luminexcorp.com |
מקורות
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.