מחקר זה מציג תהליך עבודה משולב להדמיה המשלב איסוף ועיבוד סטנדרטיים של נוזל שטיפה ברונכואלוולארית, פאנל ציטומטריית זרימה של שבעה סמנים, בדיקת ציטוקינים רב-אנליטית של 13 אנליטים, וקו ניתוח מאוחד.
מאמר מחקר
ויזואליזציה משולבת של גיוס נויטרופילים ואפיון ציטוקינים דלקתיים בנוזל שטיפה ברונכואלוולרי
במאמר זה
סיכום
תקציר
נוזל שטיפת ברונכואלוולרית (BALF) הוא מטריצת הדגימה הנגישה ביותר למשמעות ישירה לצורך חקר דלקת בדרכי הנשימה התחתונות, אך ניתוחים קונבנציונליים מסתמכים על ציטומטריה של זרימה בעלת סמן בודד בשילוב עם בדיקת ELISA לכל אנליט בנפרד, גישה המגבילה את צפיפות המידע ומסתירה את הצימוד בין תאים לגורמים (cell–factor coupling). מחקר זה מציג תהליך עבודה (workflow) משולב לוויזואליזציה המקשר בין איסוף ועיבוד מקדים סטנדרטיים לבין פאנל ציטומטריה של זרימה בעל שבעה סמנים עבור נויטרופילים ומונוציטים, בדיקת ציטוקינים מולטיפלקס ל-13 אנליטים, וצינור ניתוח מאוחד המבוס על UMAP (uniform manifold approximation and projection), מטא-קלסטרינג באמצעות FlowSOM, קלסטרינג היררכי, רשתות מתאם של Spearman וניתוח רכיבים ראשיים (PCA).
תהליך העבודה הוחל על קוהורט פרוספקטיבי מרכז יחיד של 12 מבוגרים שעברו ברונכוסקופיה, הכולל 64 חולים עם זיהום ריאתי המאומת מיקרוביולוגית ו-48 ביקורות ללא זיהום. תוצאות ציטולוגיות ומדידות בציטומטריה של זרימה חשפו הסטה מובהקת מפרופיל אלבולרי דומיננטי של מקרופאגים לפרופיל דומיננטי של נויטרופילים במהלך הזיהום, כאשר אחוז הנויטרופילים עלה מחציון של 3.2% ל-68.4% והריכוז המוחלט של הנויטרופילים עלה בערך פי 50. פרופיל מולטיפלקס זיהה תגובת ציטוקינים מתואמת של שלושה מודולים, כאשר המודולים של הכמוקינים, הפרו-דלקתיים והרגולטוריים היו כולם בעל-ביטוי (upregulated), כאשר CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α ו-G-CSF הראו את ההבחנה החזקה ביותר של סממן בודד בתוך קוהורט המחקר (שטח תחת העקום [AUC] של 0.89 עד 0.94). ויזואליזציה אינטגרטיבית באמצעות PCA, מטריצת קורלציה וגרף רשת חשפה ציר נויטרופיל-כמוקין המחובר באופן הדוק ברמת המשתתף, כאשר ספירת הנויטרופילים ב-BALF הגיחה כמרכז הרשת (network hub).
תהליך העבודה משתמש אך ורק בחומרים המתקבלים באופן שגרתי משטיפת ברונכית-נאבקים (BAL) המבוצעת מסיבות קליניות, אינו דורש נפח דגימה נוסף, ומספק מסגרת עשירה במידע לפתרון דלקות דרכי הנשימה בזיהומים נשימתיים, שעשויה להיות ישימה במעבדות רפואיות שלישיות המצוידות במערכות של ציטומטריה זרימה רב-פרמטרית ובפלטפורמות של multiplex bead-array, ובכך להתרחב למחקרים ארוכי טווח, למחקרי תא בודד ולהערכות טיפוליות. אימוץ קליני נרחב יותר של אנליטים בודדים כסמנים ביולוגיים ידרוש תיקוף פרוספקטיבי בקוהורטות רב-מרכזיות בלתי תלויות.
מבוא
מוותים מזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות נותרו גורם משמעותי לתמותה עולמית, למרות התקדמויות באסטרטגיות חיסונים ובשיטות טיפול; עם זאת, הדבר נכון במיוחד בקרב אוכלוסיות ילדים וקשישים1. נויטרופילים הם התאים העיקריים המדווחים בשלבים המוקדמים של תגובת חיסון מולדת במערכת הנשימה הנגועה, תהליך החיוני לסילוק הפתוגן הפולש; עם זאת, דלקת נויטרופילית בלתי נשלטת מובילה לפירוק של מחסום הנימיים האלבולרי, נזק חמצוני לרקמה ופיתוח של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS)2,3. נויטרופילים בחל האוויר של הריאה מראים גם קינטיקת גיוס, דפוסי שימור והתנהגות אפקטורית השונים מרקמות אחרות, והבדלים אלו משפיעים על השאלה האם הזיהום יחלוף או יתפתח לדלקת ריאות חמורה4.
נוזל שטיפת ברונכ׳י-אלבולארית (BALF) הוא מקור מידע חשוב על המיקרו-סביבה האלבולארית ומספק את הייצוג הקרוב ביותר של החסינות הקלינית באתר זה5. לכימוקין CXCL8 תפקיד חיוני בגיוס נויטרופילים לריאות באמצעות הקולטנים שלו, CXCR1 ו-CXCR2, לצד כימוקינים אחרים, הכוללים את CXCL1, CXCL2 ו-CXCL56. הציטוקינים IL-1β, IL-6 ו-TNF-α מעצימים תהליך זה עוד יותר, בעוד ש-IL-10 פועל כציטוקין נוגד. רמותיהם ב-BALF נמצאו כמתואמות עם חומרת זיהומי ריאות ועם התפתחות סיבוכי ריאות עקב דלקת ריאות חיידקית, נגיפית ואטיפית7, ופרופילים של סמנים ביולוגיים מרובי-מרכיבים (multiplex) ב-BALF מאומצים לצורך אבחון מוקדם יותר והבחנה בין פתוגנים בזיהומים של נתיבי הנשימה התחתונים8.
בדיקות שגרתיות של נוזל שטיפת ברונכית-נאבקים (BALF) נכשלות בדרך כלל בהכללה מלאה של הביולוגיה העומדת בבסיס הבדיקה. ניתן להעריך את ספירת התאים על ידי בידוי ידני של תאים בדגימות cytospin, בעוד שמתווכים מסיסים נמדדים באמצעות בדיקות ELISA בודדות ומוצגים כתרשים עמודות. כימוקינים, ציטוקינים וכל סוג תא מוערכים בנפרד, ללא קביעת מתאם בין מדרג ריכוז של כימוקין מסוים לבין אוכלוסיות התאים שהוא משפיע עליהן בדגימה. השילוב של מודולים של ציטוקינים, יחסי מינון-תגובה בין כימוקינים לנויטרופילים, ותתי-אוכלוסיות של חולים עם חתימות דלקתיות משלהם, נעלם לעיתים קרובות בהיעדר ניתוח רב-משתני9.
התקדמויות בחישוב הופכות גישה הוליסטית שכזו לריאלית יותר ויותר. שילוב של ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית וציטומטריית זרימה ספקטרלית עם גישות להפחתת ממדיות, כגון t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) או uniform manifold approximation and projection (UMAP), מאפשר מיפוי של פנוטיפים חיסוניים רב-ממדיים למרחב דו-מדי, כאשר UMAP הוכיחה שימור טוב יותר של טופולוגיה גלובלית ויכולת שחזור גבוהה יותר כאשר היא מיושמת על נתוני ציטומטריה10. פאנלים רב-אנליטים של ציטוקינים, ולאחריהם אשכולהיררכית ורשתות קורלציה, מסייעים בזיהוי חתימות המתואמות לחומרת המחלה שאינן ניתנות לזיהוי בגישות של ציטוקין בודד1. למרות ההתקדמות בתחום, עדיין לא קיים זרימת עבודה (workflow) המאחדת שיטות אלו כדי לחקור גיוס נויטרופילים וחתימות ציטוקינים מאותן דגימות BALF בזיהומים נשימתיים. מחקר זה מתאר זרימת עבודה ויזואלית אינטגרטיבית לבחינת גיוס נויטרופילים באמצעות ציטולוגיה וציטומטריית זרימה רב-פרמטרית, ולאחריהם ניתוחי UMAP וחתימות ציטוקינים באמצעות multiplex immunoassay, עם אשכולהיררכית, מטריצות קורלציה וניתוח רכיבים ראשיים (PCA). זרימת העבודה מניבה ויזואליזציה אינטגרטיבית המקיפה מדדי חיסון תאיים ומסיסים של דרכי הנשימה בגרף בודד, תוך שימוש בדגימות BALF המופקות באופן שגרתי במהלך ברונכוסקופיה המצוינת קלינית בזיהום בדרכי הנשימה התחתונות.
פרוטוקול
אוכלוסיית המחקר ואתיקה
זהו מחקר תצפיתי פרוספקטיבי רב-מרכזי שנערך בבית חולים אקדמי שלישרי בין ינואר 2026 לאפריל 2026. הפרוטוקול אושר תחת מספר אישור 2026HL-038, והסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל משתתף לפני ביצוע כל הליך במחקר.
מבוגרים בגילאי 18 עד 75 שעברו ברונכוסקופיה גמישה לאבחון עם שטיפת ברונכ׳אוולאולרית (BAL) כחלק מהטיפול הקליני השגרתי גויסו באופן רציף ושובצו לקבוצת זיהום או לקבוצת ביקורת ללא זיהום, בהתבסס על האבחנות הקליניות והמיקרוביולוגיות הסופיות שלהם. סקירה כללית של זרימת העבודה לוויזואליזציה המשולבת, מגיוס המטופלים ועד לתוצרי הוויזואליזציה המשולבים, מוצגת ב-איור 1.
איור 1: סקירה כללית של תהליך הוויזואליזציה המשולב לאפיון גיוס נויטרופילים ותגובות ציטוקינים דלקתיים המבוסס על BALF. חמשת השלבים מסכמים, משמאל לימין, גיוס פרוספקטיבי של קבוצות הזיהום והביקורת באמצעות ברונכוסקופיה ו-BAL, עיבוד מקדים של BALF למשקע תאים ולשבר על-נוזלי (supernatant), מדידות תאיות (ציטולוגיית Wright–Giemsa וציטומטריה עם זרימה רב-פרמטרית) ומדידות מסיסות (בדיקה אימונית מבוססת חרוזי 13-plex) במקביל, צינור הוויזואליזציה המאוחד (UMAP עם meta-clustering של FlowSOM, מפת חום היררכית, ניתוח רכיבים ראשיים ורשת מתאמי Spearman), והפלט הוויזואלי המשולב. קיצורים: BAL = bronchoalveolar lavage; BALF = BAL fluid; UMAP = uniform manifold approximation and projection. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
קריטריוני ההכללה לקבוצת הזיהום היו כדלקמן: (1) מטופלים שאובחנו עם דלקת ריאות שנרכשה בקהילה (CAP), דלקת ריאות שנרכשה בבית חולים (HAP) או דלקת ריאות הקשורה למנשם (VAP) בהתאם להנחיות ה-Infectious Diseases Society of America (IDSA) וה-American Thoracic Society (ATS); (2) זיהוי של פתוגן אחד או יותר באמצעות תרבית BALF בערך של ≥104 colony-forming units (CFU)/mL, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) רספיטורית מולטיפלקס, ריצוף metagenomic next-generation של BALF, או בדיקת אנטיגן/נוגדן ספציפית מדגימות נשימה/סרום זוגיות.
הקריטריונים לקבוצת הביקורת היו כדלקמן: (1) סיבות לא זיהומיות לביצוע ברונכוסקופיה, הכוללות הערכה של קשרית ריאה לא מוגדרת, תוצאות רדיולוגיות חריגות שאינן מעידות על זיהום, או בדיקה בשל שיעול כרוני; (2) היעדר זיהום ריאתי חריף, כפי שהוכח על ידי תוצאות שליליות של בדיקות מיקrobiולוגיות והיעדר סימנים לדלקת או לזיהום סיסטמי בזמן הברונכוסקופיה; ו-(3) היעדר שימוש באנטיביוטיקה ב-30 הימים שקדמו להשתתפות. קבוצת הביקורת גויסה מתוך מטופלים שעברו ברונכוסקופיה בשל מצבים ריאתיים אחרים שהיו בעלי התוויה קלינית, ולא מתוך מתנדבים בריאים, כדי לשקף את האוכלוסייה ממנה משיגים באופן שגרתי BAL בהתוויה קלינית במרכז המחקר.
קריטריוני ההדרה כללו: (1) ממאירות ו/או כימותרפיה ציטוטוקסית בששת החודשים שקדמו למחקר; (2) סרופוזיטיביות ל-HIV; (3) השתלת איבר מוצק או תאי גזע המטופויטיים; (4) טיפול אימונוסופרסיבי מתמשך הכולל מינון יומי שווה-ערך של prednisone במינון > 0.3 mg/kg למשך יותר מ-3 שבועות; (5) נשים הרות/מניקות; (6) היסטוריה של דיאטזה דימומית או התוויות נגד לברונכוסקופיה גמישה; (7) מחלה נשימתית כרונית חמורה קיימת (מחלה ריאתית חסימתית כרונית [COPD] שלב III/IV לפי ה-Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD], פיברוזיס ריאתי אידיופתי, אסתמה פרסיסטנטית חמורה, או ברונכיאקטזיה משמעותית מבחינה קלינית); (8) שחפת פעילה; (9) השתתפות במחקר התערבותי אחר ב-30 הימים האחרונים. BAL בוצע במהלך הברונכוסקופיה הראשונה, בתוך 72 h מהקבלה למסגרת רפואית בשל זיהומים, ובתוך 48 h מהאינטובציה בחולים עם זיהומים המאוננפים במכונה.
חישוב גודל המדגם התמקד בתוצאה התאית העיקרית: מספר הנויטרופילים ב-BALF בין הקבוצות. ביחס לגודל אפקט צפוי של 0.6 SD בין דרכי נשימה מזוהמות ללא מזוהמות, ובשקלול של 15% לנשירה, נדרש גודל מדגם מינימלי של 45 נבדקים לקבוצה עבור α = 0.05 דו-זנבי עם עוצמה סטטיסטית של 80%. מתוך 156 מועמדים מתאימים, 27 לא עמדו בדרישות הסף (18 לא עמדו בקריטריוני ההכללה בעיקר בשל חוסר יכולת לזהות גורם פתוגני האחראי למחלה שלהם בתוך התקופה שנקבעה או חוסר הסכמה להליך עצמו; 9 עמדו בקריטריוני ההדרה בעיקר עקב ממאירות פעילה או היסטוריה של טיפול כימותרפי, שימוש כרוני בקורטיקוסטרואידים, מחלת ריאה כרונית קשה קיימת, או נטייה לדימומים). שאר 129 המשתתפים עברו ברונכוסקופיה. לאחר מכן, 17 נבדקים הוסרו מהמחקר (7 בשל תנובת BALF לא מספקת < 40%; 4 בשל ביטול הסכמה במהלך האשפוז; ו-6 בשל סיווג מחדש של נבדקים לאחר הערכה מיקרוביולוגית סופית – 4 מועמדים לקבוצת הביקורת שאובחנה אצלם זיהום נסתר על סמך תוצאות התרבית; ו-2 מועמדים לקבוצת הזיהום שחסרה אצלם הוכחה לזיהום לאחר ניתוח תרביות). קבוצת הנבדקים הסופית כללה 112 משתתפים: 64 עם זיהום ו-48 ללא.
איסוף ועיבוד מקדים של BALF
בדיקת ברונכוסקופיה בוצעה על ידי מפעילים מיומנים בהתאם לפרוטוקול המוסדי הסטנדרטי, בדומה להמלצות הטכניות שפורסמו עבור שטיפה ברונכואלוולולרית (bronchoalveolar lavage)12. נעשה שימוש מקומי בלידוקאין, והמטופלים קיבלו סדציה תו-ורידית מתונה תוך מתן חמצן משלים לשמירה על רמת רוויית חמצן (SpO₂) >92%. הברונכוסקופ הגמיש הוכנס ומוקם בסגמנט הברונכופולמונרי שבו נצפו ממצאים רדיולוגיים חריגים. במקרים שבהם הממצאים הרדיולוגים היו מפוזרים או שלא ניתן היה לאתרם, נבחרו הסגמנטים של האונה האמצעית הימנית או הסגמנטים הלינגולריים השמאליים. לאחר כל הזרקה, בוצעה שאיבה ידנית עדינה עם לחץ שלילי < 100 mmHg. הזרקו סך כולל של שלוש עד חמש מנות של תמיסת מלח סטרילית בטמפרטורה של 37 °C, בנפח של 20–40 mL למנה, לנפח כולל של 100–150 mL. יחס השחזור נאמד כנפח השחזור ביחס לנפח שהוזרק, ורק דגימות עם שחזור של ≥40% נכללו בניתוח.
הדגימות שנאספו מהשטיפות השנייה והבאות אחריהאאולטנו כדי להפחית זיהום ברונכיאלי ולהשיג דגימה עשירה באלוולאולריים. מאגר נוזל שטיפת הברונכיולי והאלוולאולרי (BALF) נשמר על קרח ועובד בתוך 2 h מרגע האיסוף, בהתחשב בממצאים אחרונים על שינויים בהרכב התאים ובספירה הדיפרנציאלית לאחר אחסון ממושך וחימום של דגימות BALF אנושיות13. לאחר סינון באמצעות רשת ניילון סטרילית עם גודל נקבוביות של 70 microns כדי לסנן את הריר, שבוצע על ידי מעבר מכני בלבד ללא הוספת חומר ממיס ריר או חומר נוגד התגבשות כגון dithiothreitol, כיוון שבדיקות פיילוט הראו כי הדבר מספיק להסרת גושי ריר ללא אובדן מדיד של שלמות האפיטופים השטחיים בשלבים הבאים, הנוזל הועבר לצנטריפוגציה ב-400 × g למשך 10 min ב-4 °C. הנוזל העליון הועבר למבחנות קריו עם קישור חלבון נמוך (low-protein-binding cryovials) לצורך אנליזת ציטוקינים, והתאים הושעו בתוך phosphate-buffered saline (PBS) עם 0.5% bovine serum albumin ו-2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), כאשר חלקם נשמרו לצורך ציטולוגיה וציטומטריית זרימה. דגימות הציטוקינים הוקפאו בחנקן נוזלי, נשמרו ב-–80 °C, ולא הועברו ביותר ממחזור הקפאה-הפשרה אחד לפני השימוש.
ציטולוגיה של נויטרופילים וכמותיזציה באמצעות פלוו-ציטומטריה
מבחינת ציטופתולוגיה, 100 µL של תרחיף התאים מנוזל שטיפת סימפונות (BALF) הועברו לסרטית זכוכית באמצעות ציטוצנטריפוגה (ראה טבלת חומרים) ב-300 × g למשך 5 דקות, יובשו באוויר ונצבעו בצביעת Wright-Giemsa. ספירה דיפרנציאלית בוצעה על ידי טכנאי המטולוגיה ללא ידיעה על הרקע הרפואי של המטופל, אשר ספר לפחות 400 תאים לכל סרטית וחישב את האחוזים של מקרופאגים, לימפוציטים, נויטרופילים ואאוזינופילים. אחוזי הנויטרופילים ב-BALF נחשבו למדד התוצאה הראשוני עבור הציטופתולוגיה, לאור ראיות נוכחיות המצביעות על תועלתם בהבחנה בין מחלות ריאה זיהומיות לבלתי זיהומיות בחולים עם חלחול ריאתי14.
פרוטוקול הכימות באמצעות ציטומטריית זרימה התבסס על תיקוף עדכני של פרוטוקול להבחנה בין לוקוציטים בנוזל שטיפת סימפונות ונאדיש (BALF) בארבעה צבעים15 ונכללו סממנים נוספים לזיהוי נויטרופילים. באופן ספציפי, כ-5 × 105 תאים שבודדו מ-BALF נחסמו באמצעות ריאגנט לחסימת קולטן Fc אנושי (ראה טבלת חומרים) למשך 10 דקות ב- 4 °C, ולאחר מכן צבעו במשך 20 דקות ב- 4 °C עם נוגדנים נגד CD45 (שיבט HI30), CD66b (שיבט G10F5), CD15 (שיבט HI98), CD16 (שיבט 3G8), CD11b (שיבט ICRF44), CD14 (שיבט M5E2), ו-HLA-DR (שיבט L243), בנוסף לצבע חיות קבוע (ראה טבלת חומרים). עבור ליזיס של תאי דם אדומים (erythrocyte lysis), השתמשו בתמיסה מסחרית לליזיס של תאי דם אדומים (ראו טבלת חומריםהושתמש במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ליזיס של תאי דם אדומים, התאים נשטפו פעמיים ב-PBS בתוספת 2% סרום עגל עוברי (fetal calf serum) והוסבססו בבופר זרימה (flow buffer), ולאחר מכן נותחו באמצעות ציטומטר זרימה רב-צבעי (ראו טבלת חומרים). הפיצוי בוצע באמצעות חרוזי פיצוי צבועים בצבע בודד (ראה טבלת חומרים), ובכל פאנל נכללו מבחנות של fluorescence-minus-one ומבחנות ללא צביעה.
נרכשו לפחות 1 × 105 אירועים של CD45⁺ עבור כל דגימה. ראשית בוצע gating של סינגלטים בגרף FSC-A/FSC-H, לאחר מכן של לוקוציטים חיים (viability dye⁻) מסוג CD45⁺, ולאחר מכן בוצעה החרגה של מונוציטים-מקרופאגים מסוג CD14⁺HLA-DR⁺ כדי לבחור גרנולוציטים עם side scatter גבוה מסוג CD66b⁺. נויטרופילים הוגדרו לאחר מכן בתוך אוכלוסיית הגרנולוציטים כאירועים מסוג CD15⁺CD16⁺CD11b⁺. gate ראשוני זה של גרנולוציטים CD66b⁺ נמשך באופן רחב סביב כל האירועים בעלי side-scatter גבוה, במקום להיות מוגבל לגבול של CD15⁺CD16⁺CD11b⁺, כך שנויטרופילים מופעלים מסוג CD16-dim ו-CD11b-high וצורות גרנולוציטים פחות בוגרות נותרו בתוך ספירת הנויטרופילים האוטומטית הכוללת; ההגדרה המחמירה יותר של CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ הוחלה רק כדי לאפיין את תת-אוכלוסיית הנויטרופילים הבוגרים שדווחה בנפרד בניתוחי האשכולות (clustering) בהמשך. ספירת הנויטרופילים ב-BALF (תאים/µL) נאמדה על בסיס אחוז הנויטרופילים וספירת התאים הגרעיניים הכוללת שנקבעה באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטי (ראה טבלת חומרים). מטריצות פיצוי (Compensation matrices), אסטרטגיית gating ודוחות בקרת איכות של דגימות בודדות תועדו, והאנליסטים נותרו עיוורים להקצאות קבוצות המשתתפים לאורך כל שלבי הרכישה והניתוח.
פרופילינג רב-מרכיבי (Multiplex) של ציטוקינים דלקתיים
על-נוזלי BALF הופשרו פעם אחת על קרח רטוב, ולאחר מכן בוצע ערבול קצר במערבל (vortex) והבהרה באמצעות סנטריפוגה במהירות של 10,000 × g למשך 5 min בטמפרטורה של 4 °C רגע לפני הבדיקה. מדידה של 13 אנליטים בשלוש קטגוריות תפקודיות בוצעה באמצעות פלטפורמת immunoassay מרובת-מדדים (multiplex) מבוססת חרוצים, עם פאנל חרוצים מגנטיים מותאם אישית (ראו טבלת חומרים). קבוצת הפרו-דלקת כוללה את IL-1β, IL-6, IL-17A ו-TNF-α; קבוצת הכמוקינים כוללה את CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 ו-CCL3/MIP-1α; והקבוצה הרגולטורית כוללה את IL-10, IFN-γ, IL-1RA ו-G-CSF. בחירת האנליטים התבססה על אלו שדווחו באופן השכיח ביותר כבעלי ערך אינפורמטיבי בניתוחים מרובי-מדדים של ציטוקינים ב-BALF או בסרום במחקרי דלקת ריאות/זיהומים נשימתיים חמורים7,11. מקדם הדילול (1:2 בבופר הבדיקה) נקבע מתוך ניסוי פיילוט שנערך על תת-קבוצה מייצגת של דגימות מזוהמות ומדגימות ביקורת, כדי להבטיח ש->90% מהמדידות ינופלו בתוך עקומת הסטנדרט.
עקומות הסטנדרט נקבעו באמצעות דילולים סדרתיים בשבע נקודות של הסטנדרטים הרקומביננטיים של היצרן, שהוכנו בשכפולים בכל פלטה, כולל באר אחת ריקה (blank) להפחתת הרקע. התאמת העקומה בוצעה באמצעות רגרסיה לוגיסטית בעלת חמישה פרמטרים (5PL) על ידי תוכנת הרכישה והניתוח הקניינית של המכשיר (ראה טבלת חומריםגבול הכמות הנמוך (LLOQ) חושב ככמות הסטנדרט הקטנה ביותר שהניבה השגחה חוזרת (back-fit recovery) שבין 80% ל-120% ומקדם וריאציה (CV) בתוך ריצה (intrarun) של ≤ 20%. ערכים שהיו נמוכים מה-LLOQ הוחלפו ב-LLOQ/√2. שתי דגימות בקרת איכות של נוזל שטיפת סימפונות ונשק (BALF) מאוחדות, אחת מחולה נגוע מייצג ואחת מנבדן לא נגוע, חולקו למנתים והוסיפו לכל פלטה כדי לעקוב אחר הביצועים לטווח ארוך. תקני הבטחת האיכות התבססו על המלצות לשיטות עבודה מומלצות (best-practice) שנגזרו מתוכנית לבדיקת מיומנות של בדיקות multiplex מבוססות חרוזים רב-אתרית שנערכה במשך 12 שנים.16, כולל דרישות למקדם וריאציה (CV) תוך-בדיקתי של ≤ 10% בבארים כפולות, CV בין-לוחיות של ≤ 20% לבקרת איכות, ומספר חרוזים מינימלי של ≥ 50 לכל אנליט בכל באר. לוחות שלא עמדו בקריטריונים הנ"ל הופעלו מחדש. הניתוח בוצע בסבב אחד תוך ארבעה שבועות, תוך שימוש בסדרת קיט אחת, עם שזירה אקראית של דגימות הזיהום ודגימות הביקורת.
תהליך ניתוח ויזואליזציה
קבצי ה-Flow Cytometry Standard (FCS) נותחו תחילה באמצעות תוכנה מסחרית לציטומטריה זורמת (ראה טבלת חומרים) לצורך פיצוי וביצוע gating לתאי CD45⁺ חיים (singlets), ולאחר מכן הועברו לניתוח בלתי מוטה ב-R v4.4. עבור כל דגימה, נדגמו 10,000 אירועים של CD45⁺ (downsampling) ושורשרו, ועוצמות האות הומרו באמצעות פונקציית arcsinh עם cofactor של 150. הפחתת ממדים והשלכות UMAP בוצעו באמצעות חבילת uwot עם 15 השכנים הקרובים ביותר ומרחק מינימלי של 0.1, לצד השחלות t-SNE מקבילות באמצעות חבילת Rtsne עם perplexity של 30.10צבירי פנוטיפים זוהו באמצעות FlowSOM עם 100 צמתי מפה מארגנת-עצמית (self-organizing map nodes), וחולקו בהמשך ל-12–15 צבירים באמצעות מטא-קלסטרינג (meta-clustering), תוך שימוש בגישה מבוססת אופטימיזציה שאושרה לאחרונה עבור נתוני ציטומטריה רב-ממדיים.17כל אשכול סווג על בסיס ביטוי החציוני של סמני שושלת והפעלה, ונבחן אל מול השערים הידניים.
ניתוח נתוני ציטוקינים מרובי-סמנים (multiplex) בוצע תחילה על ידי טרנספורמציית log₁₀ של הערכים הגולמיים ולאחר מכן נורמלו הסמנים באמצעות z-scoring לפני ביצוע ניתוחים נוספים. הן הסמנים והן המטופלים עברו קיבץ היררכי (hierarchical clustering) תוך שימוש במרחק אוקלידי וקישור Ward.D2; התוצאות הוצגו במפת חום (heatmap) עם קיבץ שורות ועמודות. גישה זו שימשה לזיהוי מודולים של ציטוקינים המובעים יחד ולסיווג תתי-קבוצות של מטופלים בקוהורטים דלקתיים מרובי-סמנים9. מטריצות מתאם הופקו עבור כל הביומארקרים התאיים והמסיסים באמצעות מתאמי דרג של Spearman בזוגות. מפות חום של מטריצות המתאם שורטטו לצד רשת שבה הצמתים תואמים לביומארקרים והקשתים מצביעות על מתאמים ששרדו תיקון לבדיקות מרובות באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg (BH). רוחב הקשת הותאם למגניט्यूड של מקדם המתאם |ρ|, וקשתות נכללו רק אם |ρ| ≥ 0.30 ו- p < 0.05 לאחר תיקון. ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) בוצע על המטריצה הנורמלית המכילה תאים וציטוקינים באמצעות הפונקציה prcomp() עם סקאלינג של שונות יחידה. המשתתפים הוקרינו על שני הרכיבים הראשיים הראשונים, כאשר קבוצות הזיהום והבקרה הוצגו עליהם. דגימה מופחתת (downsampling) עקבית ונורמליזציה של כל הניתוחים הבטיחו השוואתיות בין קריאות הביומארקרים התאיים והמסיסים בכל הוויזואליזציות.
ניתוח סטטיסטי
משתנים רציפים תוארו באמצעות החציון (טווח בין-רבעוני, IQR) כאשר ההתפלגות לא הייתה נורמלית לפי מבחני Shapiro–Wilk, ובאמצעות ממוצע (סטיית תקן, SD) אחרת. משתנים קטגוריאליים תוארו באמצעות תדירויות ופרופורציות. השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U כאשר למשתנים הרציפים הייתה התפלגות לא נורמלית, מבחן Welch t כאשר המשתנים הרציפים היו בעלי התפלגות נורמלית, ומבחן chi-squared/מבחן Fisher המדויק כאשר הדבר היה רלוונטי למשתנים קטגוריאליים. הקשרים בין משתנים רציפים הוערכו באמצעות מקדם המתאם של Spearman. כדי להגדיר את שיעור התגליות השגויות (FDR) בניתוחים של ציטוקינים מרובים ובניתוחי מתאם, ערכי p הותאמו באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg עם סף של q < 0.05. ערך p < 0.05 דו-זנבי נחשב למשמעותי סטטיסטית בכל הניתוחים הראשוניים. במידת האפשר, מקרים עם נתונים חסרים במשתנים בודדים נשמרו ונותחו באמצעות ניתוח מקרים שלמים (complete-case analysis) עבור המשתנה הרלוונטי, בעוד שהשלמות נתונים מרובות באמצעות משוואות משורשרות (m = 20) בוצעו לצורך ניתוחי רגישות. עקומות מאפיין תגובה של מקלט (ROC) והשטח תחת העקומה (AUC) התואם הופקו עבור ציטוקינים בודדים באמצעות חבילת pROC בתוך קוהורט המחקר המלא; לא נעשה שימוש בקוהורט אימות חיצוני נפרד. ניתוחי רגישות שהוגדרו מראש חזרו על השוואות הקבוצות הראשוניות לאחר החרגת משתתפים שקיבלו אנטיביוטיקה בתוך 72 h לפני ברונכוסקופיה, ולאחר שחולקה קבוצת הזיהום לפי מצב הנשמה מלאכותית ולפי תת-סוג דלקת ריאות (נרכשת בקהילה, נרכשת בבית חולים, או מקושרת למנשם). הניתוחים בוצעו באמצעות חבילות rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC ו-mice בתוכנת R v4.4. איורים הופקו באמצעות תוכנה מסחרית לגרפיקה מדעית (ראה טבלת חומרים).
תוצאות
אוכלוסיית המחקר ומאפייני המדגם
בקוהורט הניתוח הסופי היו 112 נבדקים, מתוכם 64 נבדקים בקבוצת הזיהום ו-48 נבדקים בקבוצת הביקורת ללא זיהום. המאפיינים הדמוגרפיים הבסיסיים היו דומים בין הקבוצות, בעוד שפרמטרים מעבדתיים הקשורים לזיהום היו גבוהים יותר בקבוצת הזיהום, כפי שמוצג בטבלה 1. הזיהומים נגרמו בעיקר על ידי חיידקים גרם-שליליים, כאשר הפתוגנים החיידקיים העיקריים היו Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, ו-Acinetobacter baumannii. פתוגנים אחרים היו Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, גורמים אטיפיים, נגיפים וזיהומים מעורבים.
שיעורי השחזור של ה-BALF עמדו בסף שנקבע מראש של ≥40% עבור כל הדגימות שנשמרו, כאשר נרשמו שיעורים נמוכים מעט בקבוצת הזיהום בהשוואה לקבוצת הביקורת (חציונה 48.3% לעומת 53.3%, p = 0.03), ממצא העולה בקנה אחד עם דלקת מוגברת בדרכי הנשימה וגודש רירי בדרכי הנשימה המזוהמות. מכיוון שנפח השחזור היה שונה אף הוא בין הקבוצות (58 mL לעומת 64 mL, p = 0.04), ייתכן שכל ריכוזי הציטוקינים המדווחים מושפעים מהבדל צנוע במקדם הדילול בין הקבוצות; ניתוח רגישות שנקבע מראש, שהוגבל לדגימות עם שיעור שחזור של ≥50% (n = 42 זיהום, n = 34 ביקורת), שחזר את הכיוון והעוצמה של כל השוואה בין-קבוצית (השינוי הגדול ביותר בגודל האפקט < 8%), מה שמעיד כי הסיכוי שהטיית הדילול מסבירה את ההבדלים שנצפו הוא נמוך. הזמן בין האיסוף לעיבוד היה 65 min עבור קבוצת הזיהום ו-62 min עבור קבוצת הביקורת, ובכך נשמר בתוך חלון הזמן של 2 h. קריטריוני בקרת איכות (QC) ברמת הדגימה הצביעו על תוצאות באיכות גבוהה. ספירות דיפרנציאליות ציטולוגיות הושגו על בסיס ≥400 תאים שנספרו בכל 112/112 הדגימות (100%). רכישות זרימה ציטומטריות עמדו בקריטריון שנקבע מראש של ≥1 × 105 אירועי CD45⁺ בכל 112/112 הדגימות (100%), עם חציונה של חיוניות תאים חיים של 89.4% (IQR 85.6–92.8%). כל פלטות הציטוקינים הרב-מדד (multiplex) עמדו בקריטריוני ה-QC לאחר הרצה אחת חוזרת. עבור כל 13 האנאליטים, מקדם השונות (CV) בתוך הבדיקה היה 4.7% (2.1–9.3%, כולם <10%), ה-CV הבין-פלטתי של דגימות QC מאוחדות היה 11.2% (6.8–18.4%, כולם <20%), ומספר החרוזים החציוני היה 78 אירועים/אנאליט/באר (53–142, כולם ≥ 50).
| משתנה | זיהום (n = 64) | ביקורת (n = 48) | ערך p |
| גיל, שנים, חציוני [טווח בין-רבעוני] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| זכר, n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| BMI, ק"ג/מ"ר2, חציונה [טווח בין-רבעוני] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.66 |
| היסטוריית עישון, n (%) | 0.52 | ||
| לעולם לא | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| הקודם | 22 (34.4) | 16 (33.3) | |
| זרם | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| יתר לחץ דם, מספר (%), | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| סוכרת (Diabetes mellitus), מספר (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| מחלה כלילית, מספר (%) | 11 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| מחלה כלית כרונית, מספר (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| התוויה לברונכוסקופיה, נ (%) | — | ||
| דלקת ריאות שנרכשה בקהילה | 35 (54.7) | — | |
| דלקת ריאות נרכשת בבית חולים | 19 (29.7) | — | |
| דלקת ריאות הקשורה למנשם (Ventilator-associated pneumonia) | 10 (15.6) | — | |
| קשרית ריאה לא מוגדרת | — | 23 (47.9) | |
| המשך קיומה של חריגה רדיוגרפית | — | 15 (31.3) | |
| הערכת שיעול כרוני | — | 10 (20.8) | |
| פתוגן גורם, מספר (%) | — | ||
| חיידקים גרם-שליליים | 28 (43.8) | ||
| חיידקים גרם-חיוביים | 16 (25.0) | ||
| פתוגנים אתיפיים | 7 (10.9) | ||
| נגיפי נשימה | 8 (12.5) | ||
| זיהום מעורב | 5 (7.8) | ||
| הנשמה מכנית בעת ביצוע BAL, מספר (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| חשיפה לאנטיביוטיקה בתוך 72 שעות לפני BAL, מספר (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.001 |
| נפח שהוחדר, מ"ל, חציון [טווח בין-רבעוני] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| נפח שהושב, מ"ל, חציון [טווח בין-רבעוני] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0.04 |
| שיעור השחזור של BALF, %, חציון [IQR] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| זמן העיבוד, דקות, חציון [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.55 |
| תאי דם לבנים בדם, × 10⁹/L, חציון [IQR] | 11.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| נויטרופילים בדם, %, חציון [IQR] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.001 |
| חלבון C ראקטיבי, מ"ג/ליטר, חציון [טווח בין-רבעוני] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| פרוקלציטונין, ng/mL, חציון [IQR] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.001 |
טבלה 1: מאפיינים דמוגרפיים, קליניים ומאפייני עיבוד של BALF בקרב קהל המחקר. השוואה בין 64 המשתתפים בקבוצת הזיהום לבין 48 המשתתפים בקבוצת הביקורת ללא זיהום של מאפיינים דמוגרפיים בנקודת הבסיס, תחלואה נלווית, אינדיקציות לברונכוסקופיה, פתוגנים גורמים, פרמטרים פרוצדורליים וערכי מעבדה של דם פריפרי. משתנים רציפים מדווחים כחציון [טווח בין-רבעוני] ומושווים באמצעות מבחן Mann–Whitney U ; משתנים קטגוריאליים מדווחים כ-n (%) ומושווים באמצעות מבחן חי-ריבוע או מבחן Fisher המדויק במידת הרלוונטיות. קיצורים: BAL = שטיפת ברונכואלוולארית; BALF = נוזל שטיפה ברונכואלוולארית; BMI = מדד מסת גוף; IQR = טווח בין-רבעוני; WBC = ספירת תאי דם לבנים.
ויזואליזציה של גיוס נויטרופילים ל-BALF
נצפה שינוי ברור ביחס מאוכלוסייה בעלת דומיננטיות של מקרופאגים לאוכלוסייה בעלת דומיננטיות של נויטרופילים בקרב הנבדקים המודבקים, כפי שמוצג ב-איור 2. תכשירי הצנטריפוגה הציטולוגית (cytocentrifuge) נצבעו בשיטת Wright–Giemsa, והצביעה הראתה הבחנה ברורה בין שתי הקבוצות, כאשר בקבוצת הביקורת נצפו יותר מקרופאגים אלבולאריים, מספר לימפוציטים ומספר קטן של נויטרופילים, בעוד שבקבוצה המודבקת שלטו הנויטרופילים עם בקטריות תוך-תאיות שכיחות, גרעינים מנוונות וגרנולציות רעילות. ספירה דיפרנציאלית המבוססת על לפחות 400 תאים שנספרו שימשה לאימות ההבדלים, כאשר יחס הנויטרופילים עלה מערך חציוני של 3.2% (IQR: 1.8–5.6%) בקבוצת הביקורת ל-68.4% (IQR: 49.2–82.5%) בקבוצה המודבקת (p < 0.001), בעוד שיחס המקרופאגים האלבולאריים ירד מ-88.2% (IQR: 82.4–92.5%) ל-22.6% (IQR: 12.3–38.5%) (p < 0.001). אחוזי הלימפוציטים היו דומים בין הקבוצות (7.4% [4.8–11.3%] לעומת 6.5% [3.4–11.2%], p = 0.42).
ניתוחי ה-gating וההפחתה של ממדיות אישרו והרחיבו את הפנוטיפים התאיים שנצפו במיקרוסקופיה. לאחר הדרה של פסדתיים (debris), דובלטים ותאים מתים, גרנולוציטים CD45⁺CD66b⁺ היוו חציון של 65.8% (IQR: 46.2–79.4%) מכלל הלויקוציטים CD45⁺ בקבוצת הזיהום לעומת 4.1% (IQR: 2.3–6.8%) בקבוצת הביקורת (p < 0.001). בתוך אוכלוסיית הגרנולוציטים, נויטרופילים בוגרים CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ היוו 92.4% (IQR: 87.5–95.8%) מכלל הגרנולוציטים בקבוצת הזיהום לעומת 88.6% (IQR: 82.3–93.5%) בקבוצת הביקורת, מה שמעיד על כך שמאגר הנויטרופילים שגויס היה מורכב בעיקר מתאים בוגרים ומובחנים לחלוטין ולא מקדמונים מוקדמים. השליכות ב-UMAP וב-t-SNE, המבוססות על מטריצת חלבוני פני-התא שעברה טרנספורמציית arcsinh, הראו טופולוגיות דומות כמעט לחלוטין, שבהן מקרי הזיהום תפסו "אי" בולט של נויטרופילים בוגרים CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ שהיה מאוכלס באופן דליל בדגימות הביקורת, בעוד ש"אי" המקרופאגים האלבולהריים HLA-DR⁺CD14⁺ הראה דפוס הפוך, עם אוכלוסייה צפופה בביקורות ואוכלוסייה דלילה בזיהום. מטא-קלסטרינג באמצעות FlowSOM זיהה 13 תתי-אוכלוסיות, שביניהן תת-אוכלוסייה של נויטרופילים בוגרים (38.4% [22.6–56.2%] לעומת 2.8% [1.5–4.6%], p < 0.001) ואשכול נויטרופילים מופעלים CD16-dim CD11b-high (22.6% [11.4–32.5%] לעומת 0.4% [0.1–1.2%], p < 0.001) שהראו את ההתרחבויות הגדולות ביותר בין הקבוצות.
במונחים של מספר נוטרופילים מוחלט, נצפתה עלייה של פי 50 בערך במספר הנוטרופילים ב-BALF בקבוצת הזיהום בהשוואה לקבוצת הביקורת. המספר הכולל של תאים בעלי גרעין ל-µL של BALF עלה מ-156 cells/µL (IQR 88–232) בקבוצת הביקורת ל-384 cells/µL (IQR 180–712) בקבוצת הזיהום (p < 0.001), ומספר הנוטרופילים עלה מ-5 cells/µL (IQR 2–13) בקבוצת הביקורת ל-262 cells/µL (IQR 89–578) בקבוצת הזיהום (p < 0.001). הבדלים זוגיים באחוז הנוטרופילים ובספירה המוחלטת בין הקבוצות נותרו מובהקים מאוד לאחר תיקון Benjamini–Hochberg (BH) (q < 0.001).
איור 2: ויזואליזציה של גיוס נויטרופילים ל-BALF. שדות representative של cytospin שנצבעו ב-Wright–Giemsa ממשתתף בקבוצת הביקורת וממשתתף נגוע ממחישים את המעבר מפרופיל תאי BALF הנשלט על ידי מקרופאגים לפרופיל הנשלט על ידי נויטרופילים. אסטרטגיית gating של ציטומטריה זרימה בארבעה שלבים (FSC singlets ← תאי leukocytes חיים CD45⁺ ← גרנולוציטים CD66b⁺ לאחר החרגת CD14⁺HLA-DR⁺ ← נויטרופילים בוגרים CD15⁺CD16⁺CD11b⁺), השחלה (embedding) של UMAP לנתוני ציטומטריה זרימה שעברו התמרת arcsinh עם שכבת FlowSOM 13-metacluster הצבועה לפי הערה ביולוגית, וגרפי קופסה של אחוז הנויטרופילים ב-BALF וריכוז נויטרופילים מוחלט (cells/µL, סקאלה לוגריתמית) מוצגים זה לצד זה כדי לאפשר השוואה ישירה של הפנוטיפים התאיים שזוהו בקבוצות הזיהום והביקורת. קיצורים: BALF = bronchoalveolar lavage fluid; FSC = forward scatter; UMAP = uniform manifold approximation and projection. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
ויזואליזציה של פרופילי ציטוקינים דלקתיים ב-BALF
דפוס של תגובות מתואמות על פני מספר צירים של ציטוקינים בידל בין קבוצת הזיהום לקבוצת הביקורת, והציטוקינים קובצו לשלושה מודולים פונקציונליים עקביים, כפי שמוצג ב-איור 3. אשכול (Clustering) של ריכוזי ציטוקינים שעברו נרמול והמרה לערכי log₁₀ באמצעות שיטת Ward.D2 הפיק דנדרוגרמה ברורה של שתי קבוצות דגימות, שבה דגימות הזיהום והביקורות תפסו קצוות נגדיים של הדנדרוגרמה, ונצפו שבעה משתתפים בלבד שסווגו באופן שגוי (שש ביקורות שרוכזו עם דגימות זיהום, בעיקר מקרים של שיעול כרוני עם דלקת דרכי נשימה נויטרופילית קלה, ודגימת זיהום אחת שרוכזה עם הביקורות, שייצגה דלקת ריאות אטיפית מוקדמת). הדנדרוגרמה של האנליטים הגדירה שלושה אשכולי ציטוקינים. אשכול הכמוקינים, הכולל את CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 ו-CCL3, הראה את השינוי המכפלה (fold change) הגדול ביותר בין קבוצות הזיהום והביקורת ואת המתאם התוך-מודולרי הגבוה ביותר. האשכול הפרו-דלקתי, המכיל את IL-1β, IL-6, IL-17A ו-TNF-α, הראה עליות כיווניות דומות, אם כי פחות בולטות במ分ע certain. האשכול הרגולטורי, הכולל את IL-10, IL-1RA, IFN-γ ו-G-CSF, היה מוגבר אף הוא בדגימות זיהום, מה שמעיד על כך שהתגובה לא הייתה פרו-דלקתית בלבד, אלא הפעילה במקביל זרועות נגדיות רגולטוריות ואנטי-ויראליות.
החציונים (IQRs) של כל האנליטים שנבחנו היו גבוהים יותר בקבוצת הזיהום בהשוואה לקבוצת הביקורת, וערך ה-p המתוקנן היה נמוך מ-0.001 עבור כל 13 האנליטים לאחר תיקון שיעור גילוי שגוי מבוסס BH (BH-FDR). מבין האנליטים, ל-CXCL8/IL-8 היה הריכוז הגבוה ביותר והשינוי המכפלה (fold change) החד ביותר (מ-68 [32–142] pg/mL בקבוצת הביקורת ל-2,485 [842–6,520] pg/mL בקבוצת הזיהום, עלייה של פי 36 בקירוב). תבנית מקבילה נראתה עבור CXCL1/GRO-α, עם עלייה של פי 21 בקירוב (78 [36–148] לעומת 1,672 [524–3,890] pg/mL). IL-1β הראה עלייה של פי 13 בקירוב (5.8 [2.6–11.4] לעומת 78 [29–184] pg/mL). IL-6, IL-1RA ו-G-CSF הראו עליות של פי 13 עד 16 (16.4 [7.8–30.5] לעומת 248 [82–612] pg/mL; 112 [48–258] לעומת 1,748 [658–3,964] pg/mL; 24 [10–52] לעומת 384 [125–912] pg/mL, בהתאמה). עליות קטנות יותר כללו את TNF-α (פי ~8), CXCL10/IP-10 (פי ~9), CCL2/MCP-1 (פי ~8), CCL3/MIP-1α (פי ~10), IL-10 (פי ~10), IFN-γ (פי ~6) ו-IL-17A (פי ~4).
ניתוח עקומת ROC (receiver operating characteristic) בתוך הקוהורט זיהה את IL-8 (AUC 0.94), IL-1β (AUC 0.92), IL-6 (AUC 0.91), CXCL1 (AUC 0.91) ו-G-CSF (AUC 0.89) כנחליטים עם ההבחנה החזקה ביותר של סמן בודד בין קבוצת הזיהום לקבוצת הביקורת; ערכי AUC אלו מסכמים את ההבחנה בתוך קוהורט הניתוח בהיעדר סט ולידציה חיצוני נפרד. ניתוח רגישות תחת השלמה מרובה באמצעות משוואות שרשרת (m = 20) הניב הערכות בטווח של 5% מחציוני המקרים המלאים עבור כל נחליט, ולא שינה את סדר הדירוג של גדלי האפקט.
ניתוחי רגישות שנקבעו מראש שימשו להערכת ההשפעה של חשיפה קודמת לאנטיביוטיקה ושל תת-סוג הדלקת ריאות על ההבדלים שנצפו בסייטוקינים. כאשר השוואות הקבוצות העיקריות חזרו לאחר החרגת 41 המשתתפים מקבוצת הזיהום (64.1%) שקיבלו אנטיביוטיקה בתוך 72 שעות לפני ה-BAL, כל 13 האנליטים נותרו גבוהים באופן מובהק ב-23 מקרי הזיהום שנותרו בהשוואה לקבוצת הביקורת לאחר תיקון BH-FDR (ערך p מתוקנן < 0.001 עבור חמשת המבדילים המובילים), עם הערכות נקודתיות שהיו גבוהות מעט, ולא נמוכות, מהחציונים של כלל העמותה (לדוגמה, CXCL8/IL-8 2,860 [980–7,110] pg/mL ו-IL-1β 92 [34–210] pg/mL), ממצא העולה בקנה אחד עם השתקה חלקית של סייטוקיני דרכי הנשימה עקב חשיפה לאנטיביוטיקה לפני ה-BAL. שחולול של קבוצת הזיהום לפי תת-סוג של דלקת ריאות הראה את אותו סדר דירוג של כימוקינים וסייטוקינים פרו-דלקתיים בקרב דלקת ריאות שנרכשה בקהילה (n = 35), דלקת ריאות שנרכשה בבית חולים (n = 19), ודלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה (n = 10), כאשר תת-הקבוצה של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה הראתה את רמות החציון הגבוהות ביותר עבור CXCL8, CXCL1, IL-6, ו-G-CSF, ומצב ההנשמה המכנית לא שינה את כיוון ההשוואה בין הקבוצות.
איור 3: ויזואליזציה של פרופילי ציטוקינים דלקתיים ב-BALF. מפת חום של אשכולה היררכית של ריכוזים שעברו טרנספורמציית log₁₀ וכיול z-score עבור 13 האנליטים שנמדדו בקרב כל 112 המשתתפים, כאשר פסי הערות צבעוניים מעל מפת החום מציינים את השמה לקבוצה (ביקורת, זיהום), תת-סוג של דלקת ריאות (CAP, HAP או VAP), וקטגוריית הפתוגן הגורם (גרם-שלילי, גרם-חיובי, אטיפי, ויראלי או זיהום מעורב). דיאגרמות קופסא של הציטוקינים הבולטים בעלי שפע דיפרנציאלי (CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF ו-TNF-α; סקאלת log₁₀, pg/mL) משוות בין קבוצת הזיהום לקבוצת הביקורת. *** p < 0.001 לאחר תיקון שיעור התגליות השגויות של BH. קיצורים: BALF = bronchoalveolar lavage fluid; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = community-acquired pneumonia; HAP = hospital-acquired pneumonia; VAP = ventilator-associated pneumonia. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
ויזואליזציה משולבת של גיוס נויטרופילים ופרופילי ציטוקינים
ההצמדה של המדדים התאיים והמסיסים חשפה קשר ביולוגי חזק בין גיוס נויטרופילים לבין מערכת הקמיוקינים, כפי שמוצג ב-איור 4. ייצוג דו-ממדי הופק מניתוח רכיבים ראשיים (PCA) של מטריצת התאים והציטוקינים הסטנדרטית, כאשר PC1 הסביר 51.1% מהשונות הכוללת ו-PC2 הסביר 12.7% נוספים, לסך מצטבר של 63.8%. PC1 הפריד בין קבוצת הזיהום לקבוצות הביקורת, ואופיין בטעינות חיוביות גבוהות עבור נויטרופילים ב-BALF, CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β ו-G-CSF, ובטעינות שליליות גבוהות עבור מקרופאגים. PC2 הפריד בין מסלול עשיר בקמיוקינים (טעינות חיוביות גבוהות עבור CXCL8 ו-CXCL1) לבין מסלול עשיר ברגולטורים (טעינות חיוביות עבור IL-10, IL-1RA ו-IFN-γ), כך שבתוך קבוצת הזיהום, המשתתפים נטו להיפרד לפי חומרת המחלה, כאשר מקרי דלקת ריאות הקשורה למסייע נשימה תחת הרדחה נפלו לרביע העשיר בקמיוקינים.
מתאמי דרג של Spearman בזוגות בין 17 מאפיינים תאיים ומסיסים חשפו מתאם חיובי חזק בין מספר הנויטרופילים ב-BALF לבין ציר הכמוקינים הכולל (CXCL8 ρ = 0.78; CXCL1 ρ = 0.74; CCL3 ρ = 0.69; CCL2 ρ = 0.61; CXCL10 ρ = 0.54; כולם בתיקון p < 0.001). רמה שנייה של מתאמים מובהקים זוהתה בין מספר הנויטרופילים לבין הציר הפרו-דלקתי (G-CSF ρ = 0.65; IL-1β ρ = 0.62; IL-6 ρ = 0.58; TNF-α ρ = 0.51), ואחריה מתאמים חיוביים בינוניים עם הציר הרגולטורי (IL-10 ρ = 0.45; IL-1RA ρ = 0.48). אחוז המקרופאגים הראה מתאם שלילי מראה עם הצירים הכמוקיני והפרו-דלקתי בעוצמה דומה. מתאמים בתוך הצירים היו חזקים משמעותית ממתאמים בין הצירים (חציון |ρ| בתוך ציר = 0.68 לעומת חציון |ρ| בין צירים = 0.33), מה שתומך בתפיסה של מסלולי בקרה משותפים במעלה הזרם השולטים בצירים הכמוקיני, הפרו-דלקתי והרגולטורי.
רשת המתאם מיפתה צימוד זה על גרף שבו נויטרופילים ב-BALF היו צומת המרכז המרכזית ביותר, כאשר כל 13 הקשתות לציטוקינים שרדו תיקון BH לבדיקות מרובות. מתוך 136 החיבורים הזוגיים האפשריים בין 17 המאפיינים, 99 עמדו בקריטריון המשותף של |ρ| ≥ 0.30 ו-p מתוקנן ל-BH < 0.05 ונשמרו. גרף רשת המתאם הציג ארכיטקטורה מודולרית ברורה של שלושה בלוקים ששחזרה את הצבירים שהתקבלו מהצבירה ההיררכית: החיבורים הצפופים והחזקים ביותר היו בין מודול הכמוקינים לבין מספר ואחוז הנויטרופילים ב-BALF, חיבורים במשקל בינוני קישרו את המודול הפרו-דלקתי הן לנויטרופילים והן למודול הכמוקינים, וחיבורים דקים מהמודול הרגולטורי גישרו בין הבלוקים של הכמוקינים והפרו-דלקתיים. צומת אחוז המקרופאגים מוקמה מול בלוק הנויטרופילים-כמוקינים וקושרה אליו באמצעות מניפה של קשתות בעלות משקל שלילי. יחד, PCA, מטריצת המתאם וגרף הרשת חשפו דפוס קוהרנטי שבו חדירת נויטרופילים ל-BALF והתגובה של הכמוקינים קשורות חזק ברמת המשתתף הבודד, והמסלולים הפרו-דלקתיים והרגולטוריים משמשים כמודולים מוגדרים היטב אך מקושרים סביב ציר נויטרופילים-כמוקינים זה.
איור 4: ויזואליזציה משולבת של גיוס נויטרופילים ופרופילי ציטוקינים דלקתיים. Biplot של ניתוח רכיבים ראשיים של מטריצת התאים והציטוקינים הסטנדרטית, כאשר המשתתפים צבועים לפי קבוצה, מפת חום של מתאם ספירמן, וגרף רשת של כל 17 המאפיינים התאיים והמסיסים (גודל הצמתים נקבע לפי דרגה, קצוות הScaled לפי |ρ| וסוננו לפי BH-adjusted p < 0.05 ו- |ρ| ≥ 0.30), המדגיש את מוקד הנויטרופילים-כימוקינים. קיצורים: BH = Benjamini–Hochberg; PC = רכיב ראשי. אנא לחצו כאן כדי להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
זמינות נתונים:
ערך הנתונים ברמת המשתתף ללא פרטים מזהים וקוד ניתוח ה-R ששימשו במחקר זה מסופקים כ-Supplemental Table S1 ו-Supplemental File 1. נתונים נוספים התומכים בממצאי מחקר זה זמינים מהמחבר המקשר על פי בקשה סבירה.
טבלה משלימה S1: סט נתונים של BALF. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 1: קובץ ZIP המכיל קודי ניתוח. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
החוסן של פרוטוקול זה תלוי במספר החלטות שהתקבלו לפני ובמהלך האנליזה. קביעת שיעור ההשבה (recovery rate) הגבולי התחתון ב-40% ואיחוד המכסות (aliquots) השנייה והבאות אחרייה היו החלטה מכוונת, שכן המכסה הראשונה מכילה העשרה גבוהה יותר של חומרים מדרכי הנשימה הסיבכיות, בעוד ששיעור ההשבה משתנה באופן סיסטמטי בהתאם לגיל, מין, היסטוריית עישון והסיבכי המטרה18. חסימת רצפטורי Fc וטיטרציה של נוגדנים נגד שיבוטים (clones) בודדים להבטחת גבולות גייט (gating boundaries) נכונים בין נויטרופילים בוגרים CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ לבין מקרופאגים אלבולריים CD14⁺HLA-DR⁺ (התאים הדומיננטיים בדגימת BALF עם הצביעה הלא-ספציפית ורקע האוטופלורסצנציה הגבוהים ביותר) הם חיוניים לשמירה על עקביות בין שתי הקבוצות19,20. גם הגבלת ההפשרה-הקפאה ומסגרת הזמן של 2-h לאנליזת ה-multiplex אינן מקריות. נתונים על BALF אנושי הראו ירידה משמעותית באחוזי הנויטרופילים בין 6 ל-24 h, גם כאשר נשמרו ב-4 °C, בעוד שאחוזי המקרופאגים והלימפוציטים נותרו עקביים13. פרמטרים עבור אלגוריתמי t-SNE ו-UMAP, כמו גם פרמטרים עבור רשת FlowSOM של 10-node ועבור 12–15 metaclusters, נקבעו לפני אנליזת הקבוצות כדי למנוע כיוונון לאחר מעשה (post hoc tuning), שהוא אחת הסיבות הידועות לחוסר השחזור של תהליכי ציטומטריה16. ניתן עדיין לשמור את זיהוי המפעילים והפלטה/ריצה עבור כל אירוע תאי (cell event) כדי להחיל שיטות לתיקון אצווה (batch-correction) באנליזות רחבות היקף בעתיד21.
קיימים מספר מצבי כשל נפוצים שאינם דורשים שינויים בפרוטוקול. התאוששות נמוכה (<40%) נובעת בדרך כלל ממיקום לא מספק של ה-wedge או משאיבה מוגברת; יש לטפל בבעיה זו על ידי התאמת מיקום הברונכוסקופ והפחתת השאיבה ל-<10 mmHg לפני שאיבת מנה (aliquot) נוספת. ניתן לצמצם אוטו-פלואורסצנציה מוגברת של מקרופאגים אלבולאריים, המהווה את גורם ההפרעה העיקרי בניתוח ציטומטריה של תאי ריאה, על ידי הכללת בקרות של תאי ריאה לא צבועים בכל סדרה והגדרה ברורה של שער (gate) המקרופאגים בעל ה-side-scatter הגבוה, במקום להסתמך אך ורק על צבעי חיוניות19. פאנלים רב-מרכיביים (Multiplex) נפגעים לעיתים קרובות ממספרי חרוצים (beads) נמוכים ו מערכי ערכים חריגים גבוהים. ביצוע עקומת דילול ראשונית עבור תת-קבוצה של דגימות נגועות ודגימות ביקורת לפני קביעת דילול של 1:2 מבטיח מניעה של רוויית אות של CXCL8, CXCL1 ו-G-CSF, הנמצאים בחלק העליון של עקומת הסטנדרט עבור דגימות דלקת ריאות, וזאת בשל אפקט המטריקס שהתגלה בעבר בדגימות BALF2. ניתן להתאים את הפרוטוקול עוד יותר בהתאם למאפייני העקבה. כאשר הדגימות מכילות בעיקר סוג פתוגן בודד, צמצום הפאנל הליבתי כך שיכלול רק כימוקינים ומתווכים פרו-דלקתיים ישמר עוצמה סטטיסטית מספקת. במקרה של אוכלוסייה מעורבת המכילה חיידקים, נגיפים ופתוגנים לא טיפוסיים, עדיין יהיה מועיל למדוד גם מתווכים רגולטוריים, שכן הוכח לאחרונה כי קיימת חתימה ספציפית לפתוגן בניוטרופילים ובמקרופאגים אלבולאריים23, וששילוב של ציטוקינים פרו-דלקתיים ורגולטוריים ב-BALF משקף את חומרת המחלה בדלקת ריאות שנרכשה בקהילה24.
התרומה של תהליך העבודה הנוכחי אינה התצפית הפרטנית על זרימה של נויטרופילים או עלייה ברמות של כימקינים וציטוקינים פרו-דלקתיים בזיהום נשימתי, שניהם מתועדים בהרחבה, אלא השילוב של פאנל ציטומטריית זרימה של שבעה סמנים לנויטרופילים ומונוציטים יחד עם בדיקת אימונו-assay מולטיפלקס של 13 אנליטים, בתוך צינור ויזואליזציה משותף המיושם על אותה דגימת BALF. יישום של פאנל בעל שבעה סמנים המכוון לנויטרופילים ומונוציטים, יחד עם בדיקת אימונו-assay מולטיפלקס של 13 אנליטים, לוכד את המורכבות הפנוטיפית והציטוקינית; ללא גישה זו, הניתוח היה דורש מספר בדיקות עצמאיות עם נפח BALF גדול בהרבה ממה שניתן להשיג מדגימה סטנדרטית של ברונכוסקופיה. הגישה הראשונה עולה בקנה אחד עם עבודות קודמות המראות שציטומטריית זרימה רב-צבעית היא אמינה באותה מידה כמו מיקרוסקופיה ידנית לזיהוי סוגי תאים בדגימות BALF15, בעוד שקריטריוני הקבלה עבור השנייה משקפים שיטות עבודה מומלצות מתוכנית מוכרת לבדיקת מיומנות של מערכי multiplex מבוססי חרוצים רב-מרכזית16. בפרט, השילוב של מפת חום (heatmap), תרשים רשת ו-PCA שנבנו באמצעות קלטים סטנדרטיים זהים, חושף קשרים בין סוגי התאים והגורמים הקשורים אליהם שבעבר ניתן היה להסיקם רק על ידי סיכום של תרשימי עמודות עצמאיים. הדבר חשוב מכיוון שהכימקינים CXCL8, CCL2 ו-CCL3 המופקים מ-BALF פועלים יחד כדי לגייס נויטרופילים ומונוציטים ממיטת מחזור דם משותפת, והמבנה המשותף שלהם נושא מידע שלא ניתן להפיק מקריאות עצמאיות של אנליט בודד9,10. BALF כבר מופק באופן שגרתי למטרות קליניות ואינו דורש נפח נוסף, כך שניתן להגדיר את תהליך העבודה כתוסף טרנסלציונלי לשירותי ברונכוסקופיה קיימים ולא כהליך אבחנתי עצמאי.
זמן הסב המעשי של זרימת העבודה המלאה, הכוללת הובלת דגימות, צביעה, רכישת נתונים בציטומטריה זרימה, אינקובציה וקריאה של בדיקה מולטיפלקס, והצינור החישובים הבא לאחר מכן, הוא בסדר גודל של 24 h תחת תנאי מעבדה מחקרית. לפיכך, זרימת העבודה ממוצבת ככלי לפנוטיפיה עמוקה לצורך אפיון מכניסטי וניטור תגובה לטיפול, ולא כבדיקת טריאז' דחופה לצד מיטת החולה לצורך החלטות קריטיות בזמן, כגון הבחנה מיידית בין דלקת ריאות הקשורה למנשם לבין תסמונת ג distress נשימתית חריפה סטרילית, שעבורן בדיקות מיקרוביולוגיות ובדיקות של סמן ביומטרי בודד המהירות יותר נותרות תקן הטיפול.
ישנן מספר מגבלות שיש לציין. נוזל שטיפת ברונכים-אלבולאריים (BALF) נאסף ממרחב האוויר ומייצג את האינטראקציות המיידיות של פני השטח של מרחב האוויר, אך הוא אינו מכיל תאים הממוקמים בתוך דופן הבחולב ואובב הבית (septum), שם ממוקמים מקרופאגים מופעלים רבים ולימפוציטים תושבי רקמה. לפיכך, אין יחס של אחד-לאחד בין המצב החיסוני של מרחב האוויר לבין זה של הפארנכימה, בדומה לנתונים שפורסמו בעבר25. זיהוי מרובה (Multiplex) מבוס חרוצים סובל מתגובתיות צולבת של נוגדנים, כמו גם מאפקטים של מטריצה, הנפוצים במיוחד בסביבה המכילה מוצין וסורפקטנט של BALF בהשוואה לזו של סרום דם; בנוסף, לא ניתן להתגבר על תהליך הדילול של נוזל הציפוי האפיתלי באמצעות סליין באמצעות אף אחד מהסמנים האנדוגניים, כגון urea, בהתאם לביקורות שפורסמו לאחרונה26. נפח השטיפה שהוחזר היה נמוך בממוצע ב-6 mL בקבוצת הזיהום לעומת קבוצות הביקורת, לכן הריכוזים המוחלטים המדווחים כאן כפופים להבדל מתון במקדם הדילול בין הקבוצות, ולא הופעל סמן דילול אנדוגני. חשיפה קודמת לאנטיביוטיקה ב-41 מתוך 64 המשתתפים בקבוצת הזיהום (64.1%) עשויה להפחית את ריכוזי הציטוקינים בדרכי הנשימה ואת השחזור של הפתוגנים. חשוב לציין כי הפרוטוקול מייצג רק תמונה רגעית בנקודת זמן אחת במהלך ברונכוסקופיה שהתבקשה קלינית, ובכך הוא מונע ניתוח של קינטיקת גיוס נויטרופילים, הפרשת כימוקינים מקסימלית וההחלמה שלהם בחולים בודדים. ערכי AUC של אנליט בודד נגזרו מאותה קוהורט ששימשה לזיהוי סמנים ביולוגיים, בהיעדר קוהורט תיקוף עצמאי, ויש לפרשם כמדדים להבחנה בתוך הקוהורט ולא כביצועים אבחנתיים המתוקפים חיצונית; אימוץ של כל סף של סמן בודד בפרקטיקה קלינית ידרוש תיקוף פרוספקטיבי בקוהורט רב-מרכזית עצמאית. ניתוחי רגישות שהוגדרו מראש והוגבלו לדגימות עם שיחזור גבוה יותר, למשתתפים שלא קיבלו אנטיביוטיקה, ושחולקו לפי סטטוס הנשמה מלאכותית ולפי תת-סוג של דלקת ריאות (נרכשת בקהילה, נרכשת בבית חולים או קשורה למנשם), לא שינו את כיוון ההשוואות בין הקבוצות.
בעתיד, ניתן יהיה להתגבר על מגבלות אלו על ידי הוספת ריצוף RNA של תאי בודד (single-cell RNA sequencing) או CITE-seq לאותם משקעי BALF ששימשו לכימות חלבונים ותאים, אשר יושמו בהצלחה בקוהורטים גדולים של דלקת ריאות חיידקית ודלקת ריאות של Mycoplasma pneumoniae בילדים, כדי לחשוף תתי-סוגים של נויטרופילים ומקרופאגים אלבולריים שאינם ניתנים להבחנה באמצעות ציטומטריית זרימה מסורתית27,28. הוספת המידע שיתקבל מניתוחי חלל האוויר למידע המסופק על ידי ציטומטריית מסה של תמונה (imaging mass cytometry) או טרנסקריפטומיקה מרחבית של ביופסיות תואמות או אפילו חומרים מנתיחה לאחר המוות, תעניק הקשר למידע זה29. קישור של דגימת BALF לרוחב זמן להערכה של אנטגוניסטים של CXCR1/CXCR2 וחסימה של קולטן IL-6, ששניהם הראו תועלת בהישרדות או בתמיכה באיברים בדלקת ריאות חמורה ובתסמונת גפיים חדה (ARDS), יאפשר גם לבחון את ציר הנויטרופיל-כימוקין שהודגש במסלול עבודה זה ככלי מסייע לקבלת החלטות טיפוליות30,31.
לסיכום, מחקר זה מתאר תהליך עבודה (workflow) משולב לוויזואליזציה, המורכב מהליכי איסוף והכנה סטנדרטיים של BALF, פאנל ציטומטריה זרימה בעל שבעה סמנים המכמת את הרכב הנייטרופילים והמונוציטים, בדיקת ציטוקינים מולטיפלקס המודדת 13 ציטוקינים, ופלטפורמת ויזואליזציה משותפת הכוללת ניתוחי UMAP, קיבץ היררכי (hierarchical clustering), רשת קורלציה ו-PCA. על ידי יישום תהליך העבודה על קוהורט פרוספקטיבי של 12 מבוגרים שעברו ברונכוסקופיה מהסיבות הקליניות, זיהה הניתוח מעבר בולט בהרכב התאים החיסוניים האלבולאריים ממקרופאגים לנייטרופילים בחולים עם זיהום, גילה דפוס תגובה של ציטוקינים בעל שלושה מודולים, וחשף ציר נייטרופילים-כימוקינים בעל צימוד חזק שאינו ניתן לצפייה באמצעות מדידות של סמן בודד. הפרוצדורה מסתמכת אך ורק על חומר שנאסף במהלך אבחנה קלינית, אינה דורשת נפח דגימה נוסף, ועשויה להיות ישימה במעבדות לרפואה שלישונית המצוידות לציטומטריה זרימה רב-פרמטרית ולניתוח multiplex bead-array. אימוץ רחב יותר וכל שימוש באנליטים בודדים כסמנים ביולוגיים לאבחון ידרשו תיקוף פרוספקטיבי בקוהורטים רב-מרכזיים בלתי תלויים. לפיכך, המחקר מציג מתודולוגיה שניתנת לשחזור ועשירה בנתונים לאפיון דלקת בדרכי הנשימה בזיהומים נשימתיים, ומספק בסיס לפיתוחה העתידי למחקרים אורך, ניתוחים של תא בודד וניתוחים מרחביים (spatial analysis), והערכה טיפולית של אימונומודולציה המכוונת לציר הנייטרופילים-כימוקינים.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
אנו מודים מקרב לב לכל המטופלים והמתנדבים שהשתתפו במחקר זה על שיתוף הפעולה בעל הערך שלהם. אנו מביעים את תודתנו לוועדת האתיקה על האישור האתי (מספר אישור 2026HL-038) וההכוונה הנורמטיבית לאורך כל תהליך המחקר.
אנו מודים לצוות הרפואי של המחלקה למחלות נשימה, מרכז הברונכוסקופיה והמעבדה הקלינית על תמיכתם באיסוף דגימות קליניות, עיבוד נוזל שטיפה ברונכאוולארית וזיהוי מיקרוביולוגי. כמו כן, אנו מעריכים את התמיכה בפלטפורמה הטכנית של המעבדה המרכזית של בית החולים עבור ניסויי ציטומטריה של זרימה רב-ממדית ואפיון ציטוקינים מולטיפלקס.
מחקר זה לא קיבל מענק ספציפי מגופי מימון במגזר הציבורי, המסחרי או הבלתי-מרוויח.
אנו מודים לכל החוקרים, הטכנאים וצוות הסיעוד שהיו מעורבים בפרויקט זה על מאמציהם בסינון המטופלים, ניהול הדגימות, ביצוע הניסויים וארגון הנתונים.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן Anti-human CD1b, Brilliant Violet 421, clone ICRF4 | BioLegend | מספר קטלוג 301323 | סמן להפעלת נויטרופילים; ערוץ לייזר סגול אנא ספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.biolegend.com |
| נוגדן אנטי-CD14 אנושי, APC/Cyanine7, שיבט M5E2 | BioLegend | מספר קטלוג 301820 | סמן החרגה של מונוציטים-מקרופאגים; ערוץ לייזר אדום נא לספק את הטקסט להתרגום. https://www.biolegend.com |
| נוגדן אנטי-CD15 אנושי, PE, שיבוט HI98 | BioLegend | מס' קטלוג 301906 | סמן לשושלת נויטרופילים; ערוץ לייזר כחול אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.biolegend.com |
| נוגדן Anti-human CD16, Brilliant Violet 510, clone 3G8 | BioLegend | מספר קטלוג 302048 | הבשלה של נויטרופילים וסמן של תאי NK; ערוץ לייזר סגול אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.biolegend.com |
| נוגדן Anti-human CD45, PerCP, clone HI30 | BioLegend | מס' קטלוג 304026 / RRID: AB_89338 | סמן לכל הלויקוציטים; ערוץ לייזר כחול נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://antibodyregistry.org/AB_8938 |
| נוגדן אנטי-CD6b אנושי, FITC, שיבט G10F5 | BioLegend | מס' קטלוג 305103 | סמן גרנולוציטים; ערוץ לייזר כחול נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.biolegend.com |
| נוגדן Anti-human HLA-DR, PerCP/Cyanine5.5, clone L243 | BioLegend | מספר קטלוגי 307629 | סמן של תא מציג אנטיגן; ערוץ לייזר כחול נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://www.biolegend.com |
| מנתח המטולוגיה אוטומטי (Sysmex XN-100) | Sysmex Corporation | מכשיר (דגם XN-10) | מש לקביעת ספירת התאים הגרעיניים הכוללת לצורך חישוב מספר הנויטרופילים המוחלט נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.sysmex.com |
| אלבומין מסרום בקר | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | מספר קטלוג A7906 | מש בבפר של צביעה לציטומטריה של זרימה (0.5% משקל/נפח ב-PBS עם 2 mM EDTA) נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| חבילת ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | פרויקט Bioconductor | v2.20 (קוד פתוח) | מש למפות חום של קיבץ היררכי עבור נתוני ציטוקינים במולטיפלקס לא סופק טקסט למקור. נא לספק את הטקסט באנגלית לתרגום. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| צנטריפוגה להתרכזות תאים (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | מס' קטלוג A78303 | מש להכנת סליידים ציטולוגיים מתליה של תאי BALF נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78303 |
| תמיסת ליזיס של אריתרוציטים (BD FACS Lysing Solution, ריכוז 10X) | BD Biosciences | מס' קטלוג 349202 | מש לליזיס של אריתרוציטים לאחר צביעת שטח הפנים נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.bdbiosciences.com |
| חומצה אתילנדיאמינטטרהאצטית (EDTA), ריכוז 0.5 M, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | מספר קטלוגי AM9260G | בשימוש בתמיסת צביעה לציטומטריית זרימה בריכוז של 2 mM נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| צבע חיוניות קיבוע (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | מס' קטלוג 423105 | הדרה של תאים חיים-מתים לפני בחירת האוכלוסיות (gating); ערוץ לייזר אדום כתובת URL: https://www.biolegend.com |
| ברונכוסקופ וידאו גמיש | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | מכשיר (דגם BF-1TQ290) | מש לשטיפת ברונכית-נאדיות (BAL) תחת סדציה מתונה אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.olympus-global.com |
| ציטומטר זרימה, רב-צבעי (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | מכשיר (דגם CytoFLEX LX, תצורת שישה לייזרים) | בשימוש לרכישת נתוני פאנל זרימה של שבעה סמנים עבור נויטרופילים/מונוציטים אנא ספק את הטקסט המקור שברצונך לתרגם. https://www.beckman.com |
| תוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | מש לפיצוי ולביצוע gating ידני של קובצי FCS אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.flowjo.com |
| חבילת FlowSOM (R/Bioconductor) | פרויקט Bioconductor | v2.12 (קוד פתוח) | מש לקיבץ (clustering) ומטא-קיבץ של נתוני ציטומטריית זרימה באמצעות מפת ארגון עצמי (self-organising-map) נא לספק את טקסט המקור באנגלית לתרגום. https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (תוכנה לגרפיקה סטטיסטית) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | מש להפקת דמויות סופיות לא סופק טקסט למקור לתרגום. אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.graphpad.com |
| ריאגנט לחסימת קולטני Fc אנושיים (Human TruStain FcX) | BioLegend | מס' קטלוג 42301 / RRID: AB_2818986 | חסימת קולטני Fc לפני צביעה בנוגדנים אנא ספק את הטקסט המקור באנגלית שברצונך לתרגם. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| חבילת igraph (ב-R) | CRAN | v2.0 (קוד פתוח) | מש לבנייה ולהדמיה של גרף רשת המתאמים נא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://cran.r-project.org/package=igraph |
| מבחנות קריוגניות בעלות קישור חלבון נמוך, 2.0 מ"ל | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | מספר קטלוגי 375418 | בשימוש עבור מנות של עליון (supernatant) מנוזל שטיפת ברונכיו-אלבולארית (BALF) לצורך אנליזה של ציטוקינים נא ספק את הטקסט לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| פלטפורמת immunoassay מרובת-נבדקים (multiplex) מבוססת חרוצים של Luminex (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | מכשיר (דגם MAGPIX) | מש לרכישת בדיקת ציטוקינים רב-מערכתית (multiplex cytokine assay) נא לספק את הטקסט למסמך ה-URL שברצונך לתרגם. https://www.luminexcorp.com |
| מאי-גר (May-Gr)üתמיסת צבע בנאולד-ג'ימזה (nwald-Giemsa) | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | מספר קטלוגי GS500 | מש לספירה דיפרנציאלית של תאים בשיטת Cytospin אנא ספק את הטקסט המקור לתרגום. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs50 |
| חבילת mice (R) | CRAN | v3.16 (קוד פתוח) | מש להשלמה מרובה באמצעות משוואות שרשראתיות בניתוח רגישות נא ספק את טקסט המקור לתרגום. https://cran.r-project.org/package=mice |
| פאנל רב-מרכיבי (Multiplex) של ציטוקינים/כימוקינים המבוס על חרוזי מגנט (13-plex, בהתאמה אישית; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | מספר קטלוגי HCYTOMAG-60K | פאנל מותאם אישית למדידת 13 האנליטים המתוארים בסעיף 2.4 אנא ספק את הטקסט המקור שברצונך לתרגם. https://www.merckmillipore.com |
| מסנן תאים מרשת ניילון, 70 µm | Corning (Falcon) | מספר קטלוגי 352350 | מש לסינון מכני של BALF להסרת גושי ריר נא ספק את הטקסט למקור לתרגום. https://www.corning.com |
| מלח פוספט רב-ערכי (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | מס' קטלוג 101023 | בופר בסיס לריסוספנזיה (resuspension) וצביעה של תאים נא לספק את טקסט המקור לתרגום. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101023 |
| חבילת pROC (שפת R) | CRAN | גרסה 1.18 (קוד פתוח) | מש ליצירת עקומות ROC וערכי AUC נא לספק את הטקסט למקור לתרגום. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (סביבת מחשוב סטטיסטי) | R Core Team | גרסה 4.4 (קוד פתוח) | פלטפורמה לניתוחים סטטיסטיים ולהדמיה חזותית נא לספק את הטקסט למעבר לתרגום. https://www.r-project.org |
| חבילת rstatix (R) | CRAN | v0.7 (קוד פתוח) | מש להשוואות בין קבוצות ולסטטיסטיקה של מתאמים כתובת URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| חבילת Rtsne (ב-R) | CRAN | v0.17 (קוד פתוח) | מש להטמעות t-SNE נא לספק את הטקסט למסירה לצורך תרגום. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| חרוזי פיצוי צבועים בצבע בודד (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | מס' קטלוג 01-2-42 | מש כביקורות פיצוי לצבע בודד אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2-42 |
| תמיסת נתרן כלוריד להזרקה, 0.9% (סליין סטרילי) | Baxter International | מס' קטלוג 2B1324 | מש להחדרה של BAL (10–150 מ"ל, 20–מנות של 40 מ"ל ב- 37 °C) אנא ספק את הטקסט שברצונך לתרגם. https://www.baxter.com |
| חבילת uwot (R) | CRAN | v0.2 (קוד פתוח) | מש להפחתת ממדיות באמצעות UMAP נא לספק את הטקסט המקור לתרגום. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (תוכנה לרכישת נתונים והתאמת עקומות עבור בדיקות מולטיפלקס) | Luminex Corporation (DiaSorin) | גרסה 4.3 | תוכנה קניינית של מכשיר להתאמת עקום סטנדרט מסוג 5PL נא לספק את הטקסט למסירה. https://www.luminexcorp.com |
מקורות
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.