מערכת אופטית להערכת מכניקה עלייתית וחדרית בלבבות עכברים בפרפוזיה בשיטת לנגנדורף (Langendorff)

Jorge Armenta Valenzuela; Jesús Rodríguez González

doi:10.3791/72264

מאמר שיטה

מערכת אופטית להערכת מכניקה עלייתית וחדרית בלבבות עכברים בפרפוזיה בשיטת לנגנדורף (Langendorff)

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 באוגוסט 2026

Jorge Armenta Valenzuela^*¹ , Jesús Rodríguez González^*¹

¹Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להוצאה וקניולציה של לב עכבר, וכן את ההכנה וההגדרה של מערכת הפרפוזיה הרטרוגרדית של לנגנדורף (Langendorff). המערך הניסויי מצומד למערכת אופטית ברזולוציה גבוהה שנועדה להעריך את התגובות המכניות של העליות והחדרים תוך שימור הדינמיקה הטבעית שלהם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לב העכבר משמש כמודל נפוץ במחקר קרדיווסקולרי, זאת הודות להתקדמות בטכנולוגיות הנדסיות. עם זאת, הערכת התכווצות העליות והחדרים נותרה מאתגרת בשל גודלו הקטן של לב העכבר. מחקר זה מציג מתודולוגיה חדשנית להערכת התכווצות וקצב לב בלב שלם ומבודד. שימוש בלב עכבר בפרפוזיה לפי שיטת Langendorff בשילוב עם מערכת אופטית ברזולוציה גבוהה מאפשר הערכה של תכווצות העליות והחדרים. המערך הניסויי נותן מענה לאתגרים הקשורים לגודל הלב הקטן ולקצבי התכווצות מהירים, תוך רכישת אותות ברזולוציה גבוהה. סנכרון בין תדירות הגירוי לתדירות התכווצות הלב בטווח של 420 עד 660 פעימות לדקה (bpm) היה עקבי עם תוצאות שהתקבלו בשיטה האוקסוטונית (auxotonic method). בנוסף, מדידות של קיצור החדרים ואותות דינמיים של העליות מאפשרות קביעה של התכווצות עליות-חדרים. שיטה זו מתאימה להערכת תכווצות וקצב לב בלב שלם ומבודד, ללא השפעות פרמקולוגיות או סיסטמיות. תוצאות אלו מדגימות כי המערכת האופטית מאפשרת מדידה של תגובות קיצור של החדרים והעליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש הרבה מה לגלות בפיזיולוגיה של הלב; תהליכי מפתח, כגון קביעת קצב הלב (pace-making) וצימוד עירור-כיווץ (excitation-contraction coupling), הם עקרונות מרכזיים הנחקרים באופן מתמיד¹. למרות שהשפעותיו של רעש ביולוגי על כושר הכיווץ של הלב² ועל פעילות קביעת הקצב נותרו niezמנות להבנה מועטה¹, שיטות חדשות של דימוי אופטי אפשרו את הצגתם של פרדיגמות חדשות³^,⁴.

שתי מתודולוגיות ניסוייות המשתמשות במערכת לנגנדורף (Langendorff) תרמו תרומה רבה למדידת תפקוד הלב. הראשונה היא שיטת הכיווץ האיסו-וולומי (isovolumic contraction), שבה מתקבל אות מבלון קטן המוחדר לחדר השמאלי⁵^,⁶^,⁷. השנייה היא שיטת רישום האוקסוטונית (auxotonic recording), שבה מתקבל אות על ידי תפירת קצה אחד של חוט לשיא הלב (apex) והקצה השני למכשיר רישום מכני, כדי למדוד כיווצים אוקסוטוניים לאורך ציר הלב²^,⁸. עם זאת, הערכת כושר הכיווץ של העליות והחדרים בלב העכבר היא מאתגרת בשל גודלו המזערי. יתרה מכך, ההכנה דורשת רמה מסוימת של עדינות, מכיוון שהלב רגיש לפגיעות⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³.

למערכת האופטית להערכת הדינמיקה המכנית של לבבות עכברים ישנם מספר מאפיינים ויתרונות חדשניים. ראשית, שיטה זו מתאימה להערכת כושר התכווצות וקצב לב בלב שלם ומבודד, בהיעדר השפעות פרמקולוגיות או מערכתיות. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה ביעילות גם בניסויים להערכת פגיעה כתוצאה מאיסכמיה-רפרפוזיה (ischemia-reperfusion injury) כאשר בוחנים טיפולים מבוססי פרמקולוגיה, רגנרציה של תאים או טיפול בחמצן.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת פרמטרים ביופיזיים של תפקוד התכווצות לב עכבר באמצעות מערכת אופטית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מסייעת בהערכת כושר ההתכווצות וקצב הלב בלב מבודד ושלם. יתרה מכך, היא מאפשרת הערכה של כושר התכווצות העליות והחדרים. הכנת לב עכבר בשיטת Langendorff מציגה שיפור הכולל שינוי קל במטרה למזער את איבוד הטמפרטורה של נוזל הפרפוזיה ואת ארטיפקטים של תנועה, מבלי להמעיט מהתכווצויות השריר.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות הפדרליות לניסויים וטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת הרווחה לבעלי חיים של CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Mexico). במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים מסוג C57BL/6J, במשקל 28–34 g ובגיל 8–14 שבועות. כל החומרים והציוד ששימשו בפרוטוקול מפורטים בטבלת החומרים. קבצי העזר 1–11 מספקים תרשימים תומכים, מדריכי תוכנה, תוכניות ניתוח, נתוני קוצבי לב וקבצי יישום עבור הפרוטוקול.

1. הכנת תמיסות סטוק

הכינו מראש שני תמיסות סטוק ואחסנו אותן במקרר בטמפרטורה של 4 °C: (1) סטוק I, בנפח 1 L (במים דאיוניים; בריכוז של g/L: 76.13 NaCl, 4.02 KCl, 1 MgCl₂(6H₂O), 0.4 NaH₂PO₄) ו-(2) סטוק II, בנפח 0.1 L (במים דאיוניים; בריכוז של g/L: 73.5 CaCl₂(2H₂O)).
הערה: ניתן להשתמש בתמיסות עד 30 יום לאחר הכנתן. יש לאחסן אותן בטמפרטורה של 4 °C.

2. חיבור וניקוי של מערכת לנגנדורף (Langendorff)

חברו את המיכל (1), את האמבט התרמי של המיכל (2), את משאבת הפרפוזיה (3), את הסרפנטין (4), את רציקלטור הסרפנטין (5), את מערכת הניטור (6) ואת מערכת הניקוז (8), כפי שמוצג ב-איור 1A.
הערה: החיבור בין מערכת הניטור למערכת הניקוז מוצג בפירוט רב יותר ב-קובץ משלים 1.
מלאו את מערכת הלנגנדורף ב-1 L של מים דה-יוניים בטמפרטורה של 50 °C, ולאחר מכן הפעילו את משאבות הפרפוזיה והניקוז (קובץ משלים 1, מערכת ניקוז). לאחר כ-20–30 דקות, רוקנו את הנוזל מהמערכת, ועברו לשלב הבא.
הערה: ודאו שאין דליפות או ירידות בלחץ במערכת. אם הדבר קורה, אין להמשיך בניסוי.
מלאו את המערכת ב-1 L של חומצה אצטית בריכוז 1% (מומסת במים דה-יוניים), לאחר מכן כבו את משאבות הפרפוזיה והניקוז והמתינו 60 דקות, ואז הפעילו את המשאבות כדי להוציא את הנוזל.
חזרו על שלב 2.2 פעמיים.
מלאו את המערכת ב-70% אתנול (מומס במים דה-יוניים) כדי למנוע הידבקות של רכיבי התמיסה.
הערה: יש לנקות את מערכת פרפוזיית הלנגנדורף מדי עשרה ניסויים או אחת לחודש. פרוטוקול הניקוי שלפני הניסוי מוסבר ב-סעיף 4, בעוד שפרוטוקול הניקוי שלאחר הניסוי מפורט ב-סעיף 8.

3. הכנת תמיסת Tyrode במהלך הניסוי

הכן 1 L של תמיסה בריכוזים של mM: 130.25 NaCl, 5.4 KCl, 0.53 MgCl₂(6H₂O), 0.33 NaH₂PO₄, 1.8 CaCl₂(2H₂O), 10 D-glucose, 10 HEPES, כאשר ה-pH מכוון ל-7.35 ± 0.05 באמצעות NaOH.
1. ערבב 100 mL של Stock I עם 700 mL של מים דה-יוניים תחת ערבוב קבוע, ולאחר מכן העלה את טמפרטורת התמיסה ל-37 °C; שמור על חמצון התמיסה על ידי חיבור מיכל ה-O₂ לאבן האוורור כפי שמוצג ב-איור 1A (1).
2. הוסף 3.6 mL של Stock II ו-96.4 mL של מים דה-יוניים כדי להגיע לריכוז של 1.8 mM CaCl₂(2H₂O), ולאחר מכן הוסף NaOH כדי לכוון את ה-pH ל-7.35 ± 0.05.
3. השלם במים דה-יוניים עד להשגת 1 L של תמיסת Tyrode.
  הערה: מומלץ לאחסן 100 mL מהתמיסה במקרר בטמפרטורה של 4 °C; נפח זה יידרש בהמשך בשלב 6.

4. הכנת מערכת לנגנדורף (Langendorff)

הערה: אם מערכת ה-Langendorff אינה מלאה באתנול ביום הניסוי, לא מומלץ להמשיך בביצוע הפרוצדורה; במקום זאת, יש לחזור על סעיף 2.

הפעילו את משאבות הפרפוזיה והניקוז. הגדירו את קצב הזרימה של משאבת הפרפוזיה ל-3 mL/min ואת משאבת הניקוז ל-10 mL/min. נקזו את המערכת.
מלאו את המערכת ב-1 L של מים דה-יוניים בטמפרטורה של 37 °C, ולאחר מכן נקזו את המים.
מלאו את המערכת בתמיסת Tyrode שהוכנה בשלב 3 ושמרו את התמיסה בטמפרטורה פיזיולוגית ובחמצון קבוע.
הפעילו את מקבצי החימום של המאגר ואת רסיקולטור הסרפנטין. הגדירו את טמפרטורת המאגר (איור 1A (2)) ל-38 °C כדי לשמור על התמיסה בתנאים פיזיולוגיים. הגדירו את טמפרטורת הסרפנטין (איור 1A (5)) ל-40 °C. פעולה זו מפצה על איבוד הטמפרטורה בתמיסת מערכת ה-Langendorff.
הערה: אם טמפרטורת תמיסת ה-Tyrode במוצא המערכת אינה פיזיולוגית (37 ± 0.5 °C), כווננו את טמפרטורת רסיקולטור הסרפנטין. לא מומלץ להמשיך לשלב 6 עד שהטמפרטורה תתייצב בערך המתאים.
הפעילו את מד הלחץ (קובץ משלים 1, מערכת ניטור) וכיילו אותו בטווח של 0–200 mmHg. יישום הניטור והקוצביות (pacing) זמין כדי לסייע בכיול המערכת (קובץ משלים 3 ו-קובץ משלים 11).
הערה: חיוני לוודא שאין דליפת לחץ ושאין בועות במערכת. אם ישנן בועות במערכת, חסמו זמנית את המוצא התחתון של הסרפנטין ופתחו את השסתום העליון; פעולה זו תגרום למילוי העמודה ותאפשר לבועות להשתחרר החוצה. לא מומלץ להמשיך בניסוי עד שיתנאי זה יאומת.

5. מערכת אופטית¹⁴

הרכיבו את מצלמת ה-CMOS (איור 1A, 10), עדשת מצלמה מתכווננת (LC), ומערכת התאורה.
הערה: מערכת התאורה מורכבת משתי נורות LED (איור 1A, 9), שתי עדשות תאורה פלאנו-קונבקס (LI), בקר תאורה (איור 1A, 11), כרטיס רכישה (קובץ משלים 1, מערכת ניטור), וחלק תמיכה בתכנון תלת-ממדי (קובץ משלים 1).
מקמו אובייקט ייחוס בנפח של כ-1,000 mm³ במרחק של 100–200 mm מעדשת המצלמה (מרכז איור 1A).
הערה: יש למקם את האובייקט במיקום הלב במערכת Langendorff. ניתן לצפות במיקום זה באיור 1B, ספציפית במרכז התמונה שבה פוגעות קרני האור.
הפעילו את תוכנת הרכישה של המצלמה, ולאחר מכן הגדירו את המצלמה עם דגימה תת-דגימה (subsampling) של 4x (4 פיקסלים = 1 סאב-פיקסל). הגדירו אזור עניין (ROI) של 200 x 200 סאב-פיקסלים (קובץ משלים 2).
הערה: בתצורה זו, ניתן להשיג רזולוציה זמנית של 750 פריימים לשנייה (fps).
הפעילו את מערכת התאורה (קובץ משלים 1), כווננו את קרני האור כך שיתמקדו באובייקט הייחוס, והשיגו תאורה הומוגנית (איור 1B).
כווננו את עוצמת האור על אובייקט הייחוס כדי למנוע חשיפת יתר של התמונה.
הערה: התמונה חייבת להיראות כפי שמוצג באיור 2A (או איור 1C, מחשב הבקר). יש לצמצם השתקפויות על פני השטח של האובייקט (הלב) ככל האפשר מבלי לאבד את הגדרת קווי המתאר שלו. ניתן לעשות זאת על ידי כיוון הספק בקר התאורה או על ידי הפחתת זמן החשיפה בהגדרות המצלמה.
כווננו את מיקוד עדשת המצלמה כדי לקבל תמונה ברורה של אובייקט הייחוס (איור 1C, מחשב הבקר). ודאו שאובייקט הייחוס תופס 80% משדה הראייה (איור 2A) כדי לקבל קנה מידה להמרה של כ-61 µm לסאב-פיקסל.
הערה: המערכת האופטית מפעילה אוטומטית את מערכת התאורה כאשר המצלמה מוגדרת למצב רכישה (איור 1A וקובץ משלים 2). מומלץ להשאיר את המצלמה במצב המתנה (standby) כך שמערכת התאורה תישאר כבויה, ותופעל רק במהלך תקופות איסוף נתונים ניסיוניים כדי למנוע התחממות יתר.

6. הליכים כירורגיים והנחת קטטרים

הפריניזציה והרדמה
1. הכינו תערובת הרדמה המכילה tiletamine-zolazepam (במינון של 40 mg/kg ממשקל גוף העכבר) ו-xylazine (במינון של 10 mg/kg ממשקל גוף העכבר), ולאחר מכן דללו ל-200 µL עם תמיסת סליין.
2. הזריקו את תערובת ההרדמה תוך-peritoneally באמצעות מחט 27 G. המתינו עד שהעכבר יגיע להרדמה עמוקה.
  הערה: ודאו היעדר רפלקס בתגובה לגירוי בגפיים או בזנב (בדרך כלל, 10 דקות מספיקות).
3. הזריקו 200 UI של הפרין לא מופרד (unfractionated heparin) תוך-peritoneally באמצעות מחט 27 G והמתינו כ-5 דקות לפני המשך הניסוי.
הוצאה וקנולציה
1. הניחו את העכבר במצב שכיבה על הגב (supine), והסירו את הפרווה והעור מאזור בית החזה באמצעות מספריים כירורגיים.
2. בצעו חתך בבטן מתחת לסרעפת, תוך הקפדה על שמירת שלמותה.
3. המשיכו בחתך רוחבי בסרעפת ובצעו במהירות תורקוטומיה עולה דו-צדדית דרך הצלעות, ולאחר מכן הסירו את דופן הצלעות.
  הערה: יש להיזהר לא לפגוע בלב. אם הלב נפגע או הושחת במהלך הפרוצדורה, מומלץ שלא להמשיך בניסוי.
4. החזיקו בעדינות את המבנים העליונים של הלב באמצעות פינצטה עדינה, את קשת האאורטה ואת כלי הדם הסמוכים. הרימו בעדינות כדי לבצע חתך מתחת ומעלה, והוציאו את הלב והריאות יחד.
5. העבירו במהירות את הלב לצלחית פטרי המכילה 50 mL של תמיסת Tyrode בטמפרטורה של 4 °C לשטיפה ראשונית.
  הערה: מרגע החיתוך של הסרעפת, החיה תתחיל לחוות מצוקה נשימתית; מנקודה זו והלאה, ישנו חלון זמן של 60 s לביצוע שלבים 6.2.3–6.2.6. חריגה ממגבלה זו עלולה לגרום לנזק איסכמי.
6. הסירו את הריאות ורקמת שומן עודפת כדי לחשוף את קשת האאורטה באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי ומספריים עדינים.
  הערה: בעת ניקוי הרקמה, ודאו שקשת האאורטה אינה נפגעת. אם האאורטה נחתכת מתחת לעורק הברכיוצפלי (brachiocephalic artery), הקנולציה תהיה קשה, מה שעלול להוביל לדליפות בלחץ.
7. העבירו את הלב לבסיס קנולציה ייעודי המכיל 50 mL של באפר Tyrode בטמפרטורה של 4 °C והחדירו את קצה האאורטה לקנולה שהוכנה ממחט 20 G (Supplementary File 1).
  הערה: היזהרו לא לפגוע במסתמי האאורטה. אם המסתם נפגע, הלב ינפח והסירקולציה הקורונרית לא תשטף כראוי.
8. קשרו שני קשרי קנולציה באמצעות תפר משי 4/0: הראשון בשקע הדיסטלי לקצה הקנולה והשני לפני גזע הברכיוצפלי (Supplementary File 1).
9. החילו לאט תמיסת Tyrode באמצעות מזרק 1 mL מלא בבאפר בטמפרטורת החדר. ודאו שהרקמה הקורונרית מבהירה כדי לאשר קנולציה תקינה.
10. הסירו רקמת שומן כדי לאפשר גישה לחדרים ולעליות.
  הערה: הימנעו מחריגה מ-5 דקות של קנולציה כדי לשמור על חיות הלב.
11. העבירו את הלב למערכת Langendorff ואפשרו לו להתייצב במשך 30 דקות.
  הערה: הלב מונח במרכז המערכת (Figure 1A,B), תלוי בצורה אנכית. בעת תליית הלב, יש לנקוט זהירות קיצונית כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. אם זה יקרה, הלחץ יעלה מעל 140 mmHg, הלב יתחיל להתנפח ולא יהיה עוד חיוני.
  הערה: הרכבת ה-Langendorff נחשבת לשלמה כאשר הלב מראה תגובה יציבה מכנית, תדר תנודה טבעי של כ-360 פעימות לדקה (BPM), ולחץ פרפוזיה שבין 60 ל-110 mmHg.

7. פרוטוקול קצב והקלטת וידאו

חיוניות הלב
1. וודאו כי לחץ המסביב ללב (coronary pressure) נמצא בטווח של 60–110 mmHg באמצעות משאבת פרפוזיה של 3 mL/min. אם לחץ הפרפוזיה יורד מתחת ל-60 mmHg, הגבירו מעט את קצב הזרימה של משאבת הפרפוזיה (לחץ נמוך יגרום ללב להפוך לחיוור ורפוי). לעומת זאת, אם הלחץ עולה על 110 mmHg, הפחיתו מעט את קצב זרימת המשאבה (לחץ מופרז יגביש בצקת ברקמות ועליה הדרגתית בלחץ עד להפסקת פעילות הלב).}
  הערה: שמירה על לחץ הפרפוזיה מחוץ לטווח האופטימלי הנ"ל למשך זמן ממושך תפגע בחיוניות הלב באופן בלתי הפיך.
2. מקמו את הלב בעמדה פרונטלית כך שיתקבל מבט פרונטלי מלא במצלמה. כווננו את המיקום כך ששני העליות (atria) יהיו גלויים במצלמה (איור 2A).
3. הניחו בעדינות את אלקטרודות הפלטינה באופן שטחי על החלק העליון של העלייה הימנית באזור קוצב הלב (pacemaker node). השתמשו בהזנת המצלמה כמדריך כדי להביא את האלקטרודות לשדה הראייה. מקמו את האלקטרודה כך שלא תחסום את העלייה הימנית. תוך ניטור תצוגת המצלמה בזמן אמת, הניעו את האלקטרודה לאט קדימה עד שתבוא במגע עם רקמת העלייה, תוך הקפדה לא להפעיל לחץ מופרז (שעלול לגרום למעיכה של העלייה הימנית בתמונה).
  הערה: אם הפעולה בוצעה נכונה, תצוגת המצלמה תהיה דומה לאיור 2A.
4. הפעילו את אפליקציית הניטור והקצוב (pacing) (קובץ משלים 11) והדליקו את כרטיס הרכישה (איור 1A (6)). הגדירו את ערכי פרמטרי הגירוי: אמפליטודה של 2 V, תדר של 420, 540 ו-720 פולסים לדקה (PPM) עם פולס מרובע במחזור עבודה (duty-cycle) של 7 ms (בתוך איור 2A).
5. בצעו את גירויי החיוניות החל מהתדר הנמוך ביותר, תוך שימוש במשך גירוי של 20 s ולאחריו תקופת התאוששות של 20 s (זמן מנוחה) בין האירועים.
  הערה: העריכו את חיוניות הלב באמצעות ניטור במצלמה. אם האיבר תפקודי פיזיולוגית, תצפה סנכרון בין הגירוי המופעל לתגובת הלב, בליווי תיאום תקין בין חללי הלב. לעומת זאת, חוסר חיוניות יבוא לידי ביטוי באובדן התיאום בין החללים או בנוכחות בלעדית של התכווצויות בודדות בעליות.
6. סגרו את דלת התא מכיוון שהניסוי רגיש לאור החדר ולתנודות תרמיות (איור 1C).
  הערה: דלת התא חייבת להישאר סגורה במהלך זמן הניסוי. נטרו את חיוניות הלב באמצעות המצלמה ולחץ הפרפוזיה.
הקלטת נתונים
1. בצעו את פרוטוקול הקצוב, המהווה רצפים של פולסים מרובעים במשך 30 s, ולאחריהם 30 s ללא אות. הגדירו את ערכי פרמטרי הגירוי בכל רצף קצוב: אמפליטודה של 2 V, מחזור עבודה של 7 ms, ותדר בטווח של 360 עד 720 PPM.
  הערה: פרוטוקול הקצוב מתחיל ב-360 PPM ועולה ב-60 PPM בכל נקודת זמן (בתוך איור 2A).
2. הקליטו ברצף סרטוני וידאו של הדינמיקה של המבט הפרונטלי של הלב בפורמט .avi באמצעות תוכנת רכישת המצלמה (קובץ משלים 2). בצעו הקלטת וידאו של 20 s לכל רצף קצוב. הקליטו את המקטע של 20 s המתחיל 5 s לאחר תחילת הקצוב. הקלטה גולמית מייצגת מוצגת בסרט משלים 1.
  הערה: מחשב מקליט בו-זמנית את רצף הקצוב המופעל (.xls, קובץ משלים 9) עבור כל וידאו מוקלט (.avi), אשר נוצרים על ידי אפליקציית הניטור והקצוב ותוכנת רכישת המצלמה, בהתאמה (קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3).
3. וודאו את חיוניות הלב על ידי השוואת הווידאו הראשון, שהוקלט לפני תחילת פרוטוקול הגירוי, עם הווידאו השני, שהוקלט לאחר ביצוע הפרוטוקול (איור 2B).

8. ניקוי מערכת פרפוזיה של לנגנדורף (Langendorff) לאחר הניסוי

הסיר את המעבב ואת אלקטרודות הפלטינה של ה-ECG. הוצא את הלב מהמערכת ורוקן את כל שאריות תמיסות ה-Tyrode.
כבה את המערכת האופטית וסגור את שסתום ה-O₂.
שטוף את המערכת עם 1 L של מים דה-יוניים בטמפרטורה של 37 °C, ורוקן את המערכת.
חזור על שלבים 2.4 ו-2.5.
כבה את כל המערכות והציוד.

9. עיבוד וידאו

התחילו ביבוא של כל סרטון לתוכנה חישובית והחילו פונקציית נרמול וידאו¹⁵.
בחרו אזור עניין (ROI) הכולל את אזור הלב. בצעו סגמנטציית תמונה כדי להסיר רעשי רקע, אלקטרודות ואת הקנולה (קובץ משלים 4).
הערה: לבחירה נכונה של אזור התמונה שיש להסיר, אנא עיינו בקובץ משלים 10.
בצעו ניתוח דינמיקה מכנית גלובלי (קובץ משלים 5). דוגמאות תומכות לשונות ולאותים מוצגות באיור משלים S1, איור משלים S2, ואיור משלים S3.
1. החילו אופרטורים מורפולוגיים על כל פריים של הווידאו כדי לזהות את היקף הלב, ולאחר מכן החילו אלגוריתם למילוי פריים כדי להפיק מסכה¹⁵.
2. ספרו את הפיקסלים בתוך האזור שעבר סגמנטציה בכל פריים, ולאחר מכן נרמלו ספירה זו לפי המספר הכולל של הפיקסלים בתמונה כדי להפיק אות דינמי (בתוך איור 2B ואיור משלים S3).
3. החילו מסנן Butterworth דו-כיווני מסדר 5 בין 3 ל-100 Hz על האות שהתקבל כדי לדכא רעשים בתדר גבוה וארטיפקטים של טפטוף פבסיה¹⁵.
4. נרמלו את האותים בכל הסרטונים באמצעות ערכי המקסימום והמינימום שנרשמו.
5. קבעו את קצב הלב על ידי חישוב המרווח בין שני ערכי אמפליטודה מקסימליים (IAA (s)) עבור כל אות דינמי ואות גירוי.
6. השיגו את התדר ביחידות BPM באמצעות הנוסחה הבאה:
7. הפיקו מפות Poincaré מנתוני IAA כדי להמחיש שונות בטווחים קצרים וארוכים¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ (איור משלים S1 ואיור משלים S2).
  הערה: למידע מפורט יותר, אנא עיינו בקובץ משלים 10.
בצעו ניתוח סגמנטלי של הדינמיקה המכנית של החדרים (קובץ משלים 6).
1. החילו בינאריזציה של התמונה. השתמשו באופרטורים מורפולוגיים כדי להגדיר את אזור החדרים, תוך התאמתו לגאומטריה אליפטית מבלי לפגוע ב-ROI¹⁵.
2. התאימו אליפסה מינימלית לאזור החדרים בכל פריים. חלצו את הקואורדינטות של קבוצת נקודות מרוחקות בפריים. השתמשו בקבוצה של 10–20 נקודות בכל קצה לאורך ציר Y (איור 3A). פלט מייצג של אומדן אליפסה מסופק בסרט משלים 2.
3. חשבו את הקיצור החדרי (ventricular shortening) כמרחק הממוצע בין נקודות קיצון לאורך ציר Y בכל סרטון¹⁹.
4. החילו מסנן Butterworth דו-כיווני מסדר 5 בין 3 ל-100 Hz על האות שהתקבל כדי לדכא רעשים בתדר גבוה וארטיפקטים של טפטוף פרפוזיה¹⁵.
5. נרמלו את אות הקיצור החדרי ביחס לכל הסרטונים שהתקבלו עבור כל קצב (pacing), וחשבו את קצב הלב והעיכוב כבשלבים 9.3.5–9.3.6.
  הערה: פרמטרים, כגון משך מחזור החדרים (DVE), משך הרפיה (DVW), מרווח בין-חדרי (IVV), ואמפליטודה חדרית (VA), מתקבלים (איור 3A).
  הערה: למידע מפורט יותר, אנא עיינו בקובץ משלים 10.
בצעו ניתוח סגמנטלי של הדינמיקה המכנית של העליות (קובץ משלים 7).
1. השתמשו בשני ROI כדי להגדיר את העליות (איור 3C).
2. נתחו כל עליה בנפרד.
  1. השתמשו באופרטורים מורפולוגיים כדי לתחום את העליות תוך התאמתן מבלי לפגוע ב-ROI¹⁵. השתמשו באלגוריתם להגברת ניגודיות כדי לתחום כל עליה²⁰^,²¹.
  2. החילו בינאריזציה של התמונה וכמתו את מספר הפיקסלים השונים מאפס לכל פריים כדי לקבל אות דינמי עליתי.
  3. החילו מסנן Butterworth דו-כיווני מסדר 5 בין 3 ל-100 Hz על האותות שהתקבלו כדי לדכא רעשים בתדר גבוה וארטיפקטים של טפטוף פרפוזיה¹⁵.
  4. חשבו את הממוצע של שני אותות עליים (איור 3D).
3. נרמלו את אות הקיצור העליתי ביחס לכל הסרטונים שהתקבלו עבור כל קצב וחשבו את קצב הלב והעיכוב כבשלבים 9.3.5–9.3.6.
  הערה: פרמטרים, כגון משך מחזור עליתי (DAE), מרווח עליה-עליה (IAT), ואמפליטודה עליתית (AA), מתקבלים (איור 3D). למידע מפורט יותר, עיינו בקובץ משלים 10.
בצעו ניתוח אלקטרו-מכני¹³^,²² (קובץ משלים 8).
1. השוו את נתוני הקצב עם האותות העליים והחדריים (איור 3D).
2. חשבו את זמן ההפצה במערכת ההולכה של הלב, והשיגו את העיכוב בין האירועים בעליה ובחדר (AVD), כאשר הגירוי שהוחל משמש כנקודת ייחוס.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויי התפקוד המכני של הלב מבוצעים באמצעות מכשיר Langendorff, כפי שמוצג ב-איור 1A(למעלה). מערכות הניטור והאופטיקה מאפשרות הקלטת וידאו כאשר בקרת התאורה מופעלת, כפי שמוצג ב-איור 1A(למטה). איור 1C מדגים את המבט החיצוני של תא הבקרה התרמוסטטית, שנועד לשמור על הלב מבודד מתנודות תרמיות ואור מהסביבה. כפי שמתואר ב-איור 1B, הלב המבודד ממוקם כאובייקט ייחוס במערך הניסוי הכולל את מכשיר ה-Langendorff, מערכת האופטיקה ומערכות הגירוי.

כפי שמוצג ב איור 2A, הלב המבודד מוקם כך שניתן לקבל מבט פרונטלי ברור של העליות והחדרים תחת פרפוזיה רטרוגרדית. השימוש בבסיס הניקוז (קובץ משלים 1, מערכת ניקוז) היה חיוני להפחתת ארטיפקטים של תנועה הנובעים מטפטוף נוזל הפרפוזיה ולייצוב האותות שנרכשו. פרוטוקולי הגירוי כללו רצפי פולסים (2 V, 7 ms) בתדרים שבין 360 ל-720 bpm, שכל אחד מהם נמשך 30 s.

המערכת האופטית מתעדת שינויים באזור הלב (HA). אות דינמי זה מאפשר גם לקבל את מרווח הזמן בין שיאים (IAA) (בתוך איור 2B). חיוניות המודל הוערכה על ידי השוואה בין קצב הלב הממוצע לפני (Start) ואחרי (End) פרוטוקול הגירוי בקבוצה של n = 6 לבבות. לא נמצאו הבדלים מובהקים בקצבי הלב הממוצעים (Start: 385 ± 38 BPM לעומת End: 372 ± 18 BPM, Student’s t-test P > 0.05), מה שמעיד על כך שההליך הניסויי לא השפיע על התפקוד הלבבי (איור 2B).

איור 2C מציג את תגובת התדר של הלב לשבעה תדרי גירוי שונים, ומדגים קשר ליניארי ברור² (R2 = 0.98 ± 0.01, מצב 1:1). ערך הקצב המינימלי מוגבל על ידי המאפיינים הפיזיולוגיים של העכבר (360 bpm)²²^,²³. הלב בביסוס פרפוזיה של Langendorff מציג פרופיל של טכיקרדיה. גירויי קצב מייצגים והתגובות התואמות להם מוצגים בתוך האיורים המוכנסים של איור 2C.

בהמשך, כדי להעריך את הדינמיקה של חללי הלב, מיושמות טכניקות סגמנטציה ספציפיות. פרמטרים של קיצור החדרים הושגו מהקלטות אופטיות (איור 3A). התמונה המוכנסת באיור 3A מציגה את קיצור החדרים הנורמליזציה. מאות זה הדינמי, מופקים ארבעה פרמטרים: אמפליטודת קיצור החדרים (VA), מרווח הזמן בין התכווצויות החדרים (IVV), משך התכווצות החדרים (DVE) ומשך הרפיית החדרים (DVW).

איור 3B מציג את אמפליטודת ההתקצרות של החדר עבור שבעה ערכי קוצב. פסים כחולים מייצגים את מחקר זה. פסים כתומים מתאימים לנתונים שהתקבלו בשיטת ההקלטה האוקסוטונית². בוצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA דו-כיווני ולאחריו מבחן Sidak. אמפליטודת ההתקצרות של החדר (VA) עבור ערכי קוצב גבוהים יותר, 600 PPM ו-660 PPM, עולה באופן משמעותי (P < 0.05*, P < 0.005**), בהתאמה. VA (ref. 15 vs. 360 P > 0.05, ref. 15 vs. 420 P > 0.05, ref. 15 vs. 480 P > 0.05, ref. 15 vs. 540 P > 0.05, ref. 15 vs. 600 P < 0.005, ref. 15 vs. 660 P < 0.05, ref. 15 vs. 720 P > 0.05).

כדי לקבל את שטח העלייה, מיושמות טכניקות סגמנטציה מסוימות (איור 3C). ROI מוגדר בכל עלייה. איור 3D מציג את אות הממוצע של העלייה ואת קיצור החדר. מאות דינמי זה מתקבלים שני פרמטרים: אמפליטודת העלייה (AA) ומרווח הזמן בין התכווצויות העלייה (IAT). על ידי השוואה בין אותות החדר והעלייה, מתקבל העיכוב בין אירועי העלייה והחדר (AVD).

figure-results-1
איור 1. מערך ניסויי עבור לב מבודד בשיטת Langendorff ומערכת אופטית המותקנת בארון. (A) תרשים סכמטי של מערכת פרפוזיה רטרוגרדית בזרימה קבועה בשיטת Langendorff המחוברת למערכת אופטית. מערכת ה-Langendorff (למעלה) כוללת: (1) מיכל המכיל תמיסת Tyrode מחומצנת באופן רציף. טמפרטורת הפרפוזאט נשמרת ב-37 °C על ידי (2) מיכל אמבט תרמי ו-(5) רסיקולטור סלילי (serpentine recirculator). (3) משאבת פרפוזיה פריסטלטית מבטיחה זרימה קבועה של 3 mL/min. (8) מערכת ניקוז מסירה את התמיסה. (4) סליל הקירור משמש גם כמחליף חום וגם כמלכודת בועות. ניטור לחץ ויישומי קצב חשמלי (pacing) נשלטים על ידי (6) מערכת הניטור. המערכת האופטית (למטה) כוללת את הסנכרון בין (11) בקר התאורה, (10) מצלמה מהירה עם עדשה טלקצנטרית, ושני מקורות אור (LEDs). עדשת המצלמה מאפשרת מיקוד ידני בטווח של 100–200 mm. (9) שני נורות LED, המחוברות לעדשה פלאנו-קנוקסית (LI), מאירות את הלב באופן הומוגני. נתוני הקצב מוקלטים באמצעות יישום הניטור והסטימולציה (קובץ משלים 11). (7) מחשב הבקרה מחובר למצלמה וליישום הניטור והסטימולציה כדי להקליט את הנתונים בו-זמנית (וידאו וקצב חשמלי). (B) מבט פנימי של הארון. מיקומו האנכי של הלב מוצג באמצעות אובייקט ייחוס. רכיבים אחרים של מכשיר ה-Langendorff מוצגים. (C) מבט חיצוני של הארון. הארון מבודד תרמית, והקירות הפנימיים והחיצוניים השחורים ממזערים השתקפויות ואור סביבתי. מוצג המחשב המריץ את יישומי הניטור ורכישת הווידאו. קיצורים: LC = עדשה טלקצנטרית; LEDs = דיודות פולטות אור; LI = עדשת תאורה; PC = מחשב אישי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2. קיבוע לב עכבר ותיקוף המערכת האופטית. (A) מבט פרונטלי על הלב המראה את העליות, הפרונטים, את ה-pacing ואת אלקטרודות ה-ECG. התמונה תואמת לפריים בקצב pacing של 420 bpm (סרטון משלים 1). התמונה המוכנסת מראה את ה-pacing המיושם. הווידאו נרכש בין השניות 5 ל-25 של פרוטוקול הגירוי. (B) בדיקת חיוניות הלב. שני סרטונים מוקלטים כדי לקבל את תדר התנודות, אחד לפני ואחד אחרי יישום פרוטוקול ה-pacing. תדר התגובה מחושב. בוצע מבחן Student's t-test (P > 0.05). ההבדל בין הקבוצות אינו מובהק. הנתונים מוצגים כערכי ממוצע ± סטיית תקן (n = 6). התמונה המוכנסת מראה את שטח הלב (HA) שהתקבל משלב 9.3 של הפרוטוקול ואת ה-pacing המיושם. (C) תגובת קצב הלב ל-pacing המיושם. פסים כחולים מציינים את תגובת הלב לשבעה ערכי pacing (R2 = 0.98 ± 0.01). פסים כתומים תואמים לנתונים שדווחו על ידי Peña-Romo². התמונה המוכנסת מראה עקומות תגובה טיפוסיות. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות two-way ANOVA ולאחריו מבחן Sidak. ההבדל בין הקבוצות אינו מובהק (P > 0.05). הנתונים מוצגים כערכי ממוצע ± סטיית תקן (n = 6). קיצורים: ANOVA = analysis of variance; BPM = beats per minute; ECG = electrocardiogram; HA = heart area; PPM = pulses per minute. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3. ניתוח התגובה המכנית של העליות והחדרים. (A) התקצרות החדרים. התמונה תואמת לפריים בקצב קוצבי של 420 bpm (סרטון משלים 1). אליפסה אדומה מאפשרת את הערכת התקצרות החדרים (VS) (סרטון משלים 2). ה-VS מחושב על ידי ממוצע הערכים המקסימליים והמינימליים על פני קבוצה של 10–20 קווים לאורך הציר הראשי (NV; קווים כתומים). התקצרות החדרים המנורמלת מוצגת בתוספת (inset). ניתן להפיק מערכה קבוצה של פרמטרים: משך ההתקצרות (DVE), משך ההרפיה (DVW), מרווח הזמן בין התכווצויות החדרים (IVV), ואמפליטודת התקצרות החדרים (VA). (B) מוצגת אמפליטודת התגובה הלבבית, VA כפונקציה של הקוצב. פסים כחולים מייצגים מחקר זה. פסים כתומים תואמים לנתונים שהתקבלו בשיטת רישום אוקסוטונית². הופעל ניתוח סטטיסטי באמצעות two-way ANOVA ולאחריו מבחן Sidak. אמפליטודת התקצרות החדרים (VA) עבור ערכי קוצב גבוהים יותר, 600 PPM ו-660 PPM, עולה באופן משמעותי (P < 0.05*, P < 0.005**), בהתאמה. VA (ref. 15 vs. 360 P > 0.05, ref. 15 vs. 420 P > 0.05, ref. 15 vs. 480 P > 0.05, ref. 15 vs. 540 P > 0.05, ref. 15 vs. 600 P < 0.005, ref. 15 vs. 660 P < 0.05, ref. 15 vs. 720 P > 0.05). הנתונים מוצגים כערכי ממוצע ± סטיית תקן (n = 6). (C) סגמנטציה של העליות. התמונה תואמת לפריים בקצב קוצבי של 420 bpm (סרטון משלים 1). התמונה ממחישה את אזורי העניין (ROIs) שהוחלו על העלייה הימנית (מעגל צהוב) והעלייה השמאלית (מעגל כחול). האות המכנית של העליות מתקבלת על ידי ממוצע של שני ה-ROIs. (D) דינמיקה של העליות והחדרים. מוצגים תגובות מנורמלות של שטח העליות הממוצע (קו שחור), התקצרות החדרים (קו כחול), וקוצב (קו אדום) ב-420 bpm. ניתן להפיק מערכה קבוצה של פרמטרים: מרווח הזמן בין התכווצויות העליות (IAT), אמפליטודה ממוצעת של העליות (AA), ועיכוב עליות-חדרים (AVD). קיצורים: AA = אמפליטודת עליות; ANOVA = ניתוח שונות; AVD = עיכוב עליות-חדרים; DVE = משך התקצרות החדרים; DVW = משך הרפיית החדרים; IAT = מרווח בין עליות; IVV = מרווח בין חדריים; NV = מספר קווי חדרים; PPM = פולסים לדקה; ROI = אזור עניין; VA = אמפליטודת התקצרות החדרים; VS = התקצרות החדרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון משלים 1. וידאו תחת גרייה של 420 PPM. הקלטה של לב עכבר מבודד שנתפסה ברזולוציה מרחבית של 200 x 200 סוב-פיקסלים וברזולוציה זמנית של 750 fps. קיצורים: fps = פריימים לשנייה; PPM = פעימות לדקה.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרטון משלים 2. סרטון מייצג של אמידת אליפסה עבור קיצור חדרים. הדגמה של אלגוריתם הסגמנטציה באמצעות ההקלטה מסרטון משלים 1, שנדגמה מחדש ב-75 fps. קיצור: fps = frames per second.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים S1. ניתוח שונות של מרווחי שטח הלב. (A) מצב בסיסי ללא גירוי, (B) 360 PPM, (C) 420 PPM, ו-(D) 480 PPM. שונות לטווח קצר ולטווח ארוך חושבה כפיזור ביחס לממוצע הנתונים, כפי שמוצג על ידי האליפסה האדומה. קיצורים: IAA = מרווח שטח הלב; PPM = פעימות לדקה; SD1 = שונות לטווח קצר; SD2 = שונות לטווח ארוך.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים S2. ניתוח שונות של מרווחי שטח הלב. (A) 540 PPM, (B) 600 PPM, (C) 660 PPM, ו-(D) 720 PPM. שונות לטווח קצר ולטווח ארוך חושבה כפיזור ביחס לממוצע הנתונים, כפי שמסומן על ידי האליפסה האדומה. קיצורים: IAA = מרווח שטח לב; PPM = פעימות לדקה; SD1 = שונות לטווח קצר; SD2 = שונות לטווח ארוך.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים S3. גרף זמני של אותות מנורמלים שהתקבלו מדינמיקה התכווצית. הגירוי שהופעל היה 420 PPM (אדום), והתגובות כוללות את שטח הלב הגלובלי (שחור), קיצור החדרים (כחול) ודינמיקת שטח העליות (צהוב). קיצור: PPM = pulses per minute.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

קבצים משלימים 1–11. אלגוריתמים ותיעוד טכני. תיקייה דחוסה המכילה: 1) תמונות ומפרטים של החלקים המודפסים בתלת-ממד. 2) מדריכים מפורטים עבור תוכנת הרכישה של המצלמה. 3) מדריכים מפורטים עבור יישומי הניטור והקצוב (pacing). 4) תוכנית חישוב לנורמליזציה וסגמנטציה של וידאו (שלבים 9.1–9.2). 5) תוכנית חישוב לחישוב המכניקה הגלובלית של הלב (שלב 9.3). 6) תוכנית חישוב לחישוב סגמנטרי של מכניקת החדרים (שלב 9.4). 7) תוכנית חישוב לסגמנטציה של מכניקת העליות (שלב 9.5). 8) תוכנית חישוב לחישוב עיכוב עליתי-חדרי (שלב 9.6). 9) קצוב חשמלי המיושם על סרט משלים 1. 10) מדריך מפורט על תפעול תוכניות החישוב (קבצים 4–7). 11) יישום הניטור והקצוב. בנוסף, קיימות חמש פונקציות חיצוניות (AumCont, filterPeaks, FucCordenada, FucMaskIm, FucPoincare) הנדרשות להפעלת תוכניות החישוב.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לב העכבר רגיש מאוד לשינויי טמפרטורה²^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,²². בניסוי זה, הלב שעבר פרפוזיה מוקם בצורה אנכית. הכללנו שינוי קל כדי למזער את איבוד טמפרטורת הפרפוזאט ואת ארטיפקטי התנועה בשיטת פרפוזיית Langendorff. משאבת רסיркуלציה נוספה לסרפנטינה כדי למזער את איבוד טמפרטורת הפרפוזאט ב-37 ± 0.5 °C, ובסיס ניקוז נוסף כדי למזער ארטיפקטי תנועה. יתרה מכך, נעשה שימוש בארון מבודד תרמית המצויד במערכת אופטית ובשני מקורות אור LED בעוצמה מתכווננת, הממוקמים באופן בילטרלי כדי להקרין באופן אחיד את רקמת הלב, כפי שמוצג ב-איור 1.

כדי לבחון את ההיתכנות של ההרכבה הניסויית, בוצעה סדרת ניסויים למעקב אחר שינויים בשטח הלב תחת תנאי קוצב שונים. התקבל טווח סנכרון בין הקוצב לבין תגובת התדר של הלב, התואם לאזור הסנכרון שדווח על ידי Peña-Romo², אשר השתמש בשיטת ההקלטה האוקסוטונית (auxotonic)⁸. ניתן להסיק כי המערך הניסויי האופטי מספיק לתמיכה במחקרים ניסויים נוספים של קיצור הפרונטריקלום (איור 2).

בדקנו בהמשך האם אותות של קיצור הפרונטריקולר ודינמיקה של שטח העליות מאפשרים ניתוח של הצימוד אלקטרומכני של הלב. האותות מהחדרים ומהעליות מאפשרים קביעה של משך העיכוב בכיווץ העליות-חדרים (AVD). בתדר קוצב של 420 PPM, התקבל ערך של 53 ± 14 ms (ממוצע ± SD). תוצאה זו תואמת לאלו של VanderBrink²⁴, המדווח על מרווח PR של 44 ± 6 ms שנמדד באמצעות אלקטרוקרדיוגרם (ECG).

לשיטה זו ישנן גם מגבלות מסוימות; חוסר הדיוק בעיכוב העל-חדרי בהשוואה לטכניקות ECG והאמפליטודה הפרוקטורית בהשוואה לתוצאות שהתקבלו בשיטת ההקלטה האוקסוטונית, כפי שמוצג באיור 3B, עשויים לנבוע מארטפקטים של תנועה חיצונית.

שיטה זו תורמת להערכת כושר התכווצות וקצב לב ללא השפעות פרמקולוגיות או מערכתיות בלב מבודד ושלם. תוצאות אלו מוכיחות כי המערכת האופטית מאפשרת מדידה של תגובות הקיצור של הפרוventricular וה-atrial של הלב, ובכך מדגישה את יעילותה למחקרי הפרעות קצב הפוגעות בתיאום בין העליות לחדרים או להערכת השפעות פרמקולוגיות.

לשיטה זו ישנן גם מספר מגבלות. ראשית, מכיוון שמדובר בקירוב דו-ממדי (2D), לא ניתן למדוד את כוח ההתכווצות כפי שנעשה בשיטה האוקסוטונית. שיטה זו מועילה גם להפחתת ארטיפקטים של תנועה הנובעים מטפטוף תמיסות ולבקרת טמפרטורת התמיסה. שנית, הבדלים בין המינים במודלים של עכברים משפיעים באופן משמעותי על התוקף, השחזוריות והבטיחות של מחקרים ביו-רפואיים. מבחינה היסטורית, חוקרים העדיפו באופן נרחב עכברים זכרים כדי למנוע שונות בנתונים הנגרמת ממחזורי ה Estrus של נקבות, הנחת יסוד שהוכחה מאז כשגויה במידה רבה²⁵^,²⁶. בהתאם לסוג המחקר, ניתן להחיל פרוטוקול זה על מחקרים הכוללים עכברים זכרים או נקבות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מספר LN-2025-C-23 שמימנה מזכירות המדע, הרוח, הטכנולוגיה והחדשנות (SECIHTI).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרק 1 mL	BD Plastipak	302485	הליך כירורגי
מחט 20 G	NIPRO	AH-2032	קנולה אאורטלית
עדשה מתכווננת 25 mm עם הגדלה של 8x-100x	Generic	N/A	עדשת מצלמה של מערכת אופטית; מצוין באופן כללי כעדשת מצלמה מתכווננת
מחט 27 G	BD PrecisionGlide	302358	הליך כירורגי
חלקי תמיכה בעיצוב תלת-ממדי	CINVESTAV	N/A	חלקי תמיכה בהתאמה אישית בעיצוב תלת-ממדי
חוט תפר משי 4-0	AMERICAN SUTURE	TGSN0901	קנולה אאורטלית
ספק כוח 40-A	STEREN	PRL-25	ספק כוח עבור LED
אבן אוורור	N/A	N/A	חממצון של תמיסת Tyrode
CaCl₂ (2H₂O)	Sigma-Aldrich	C3306	תמיסת Tyrode
D-Glucose	J.T. Baker	1916-01	תמיסת Tyrode
משאבת ניקוז	CINVESTAV	N/A	משאבת ניקוז בהתאמה אישית; מצוין באופן כללי כמשאבת ניקוז
עדשה פלאנו-קמורה, F = 25.4 mm	THORLABS	LA1951-A	עדשת תאורה של מערכת אופטית; מצוין באופן כללי כעדשת תאורה פלאנו-קמורה
חומצה אצטית גלציאלית	Sigma-Aldrich	695092	ניקוי מערכת Langendorff
הפרין	PiSA	060M91	נוגד קרישה
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	תמיסת Tyrode
נוריות LED בעלות הספק גבוה	Luminius	CBT-90-G-L11-C12	מקור אור LED
מערכת תאורה	CINVESTAV	N/A	מערכת תאורה בהתאמה אישית; מצוין באופן כללי כמערכת תאורה
KCl	CTR SCIENTIFIC	CTR02196	תמיסת Tyrode
תוכנת LabVIEW גרסה 2018	NATIONAL INSTRUMENTS	N/A	תוכנה המשמשת להרצת יישום הניטור והקוצביות; מצוין באופן כללי כיישום ניטור וקוצביות
תוכנת MATLAB	The MathWorks	N/A	תוכנה חישובית לתוכניות נורמליזציה, סגמנטציה ואנליזה של וידאו; מצוין באופן כללי כתוכנה חישובית
חמצן בדרגה רפואית	GRUPO INFRA	N/A	חממצון של תמיסת Tyrode
MgCl₂ (6H₂O)	CTR SCIENTIFIC	CTR02104	תמיסת Tyrode
מיני-משאבה עם זרימה משתנה	CONTROL COMPANY	3385	משאבת פרפוזיה
ערכת ניתוח לעכברים	Kent Scientific	INSMOUSEKIT	הליך כירורגי
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	תמיסת Tyrode
NaH₂PO₄	DEQ	DEQF290400250	תמיסת Tyrode
NaOH	CTR SCIENTIFIC	CTR03108	כוונון pH
NI USB-6009	NATIONAL INSTRUMENTS	779026-01	כרטיס רכישה
אלקטרודות פלטינה, קוטר 0.25 mm	Sigma-Aldrich	349402	אלקטרודות לגירוי חשמלי
ספק כוח (12 V, 30 A)	Karnick	PTA-12V30A	ספק כוח למסחר
מד לחץ	CINVESTAV	N/A	מד לחץ בהתאמה אישית; מצוין באופן כללי כמד לחץ
מתמר לחץ	LA BOUVET	B17295	מד לחץ של מערכת Langendorff
אתנול טהור	Sigma-Aldrich	493511	אתנול לניקוי המערכת
אמבט תרמי עם סחרור (LXC)	PolyScience	L113A0412	מסחר של מיכל
תמיסת מלח	PiSA	111848	תמיסת נתרן כלוריד (NaCl) 0.9%
אמבט תרמי נחשית	CINVESTAV	N/A	מסחר/אמבט תרמי נחשית בהתאמה אישית
מיקרוסקופ סטריאו	N/A	N/A	הליך כירורגי
תאורה למיקרוסקופ סטריאו	N/A	N/A	הליך כירורגי
תוכנת uEye Cockpit	IDS Imaging Development System GmBH	N/A	תוכנת רכישה למצלמה; מצוין באופן כללי כתוכנת רכישה למצלמה
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2	IDS	AB00624	מצלמת CMOS במהירות גבוהה; מצוין באופן כללי כמצלמת CMOS
קסילזין	PiSA	4001211	חומר הרדמה
Zoletil 100	Virbac	83048907	חומר הרדמה טילטמין-זולזפאם; מצוין באופן כללי כתערובת הרדמה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מערכת אופטית להערכת מכניקה עלייתית וחדרית בלבבות עכברים בפרפוזיה בשיטת לנגנדורף (Langendorff)

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים