הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מערכת אופטית להערכת מכניקה עלייתית וחדרית בלבבות עכברים בפרפוזיה בשיטת לנגנדורף (Langendorff)

67 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 באוגוסט 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להוצאה וקניולציה של לב עכבר, וכן את ההכנה וההגדרה של מערכת הפרפוזיה הרטרוגרדית של לנגנדורף (Langendorff). המערך הניסויי מצומד למערכת אופטית ברזולוציה גבוהה שנועדה להעריך את התגובות המכניות של העליות והחדרים תוך שימור הדינמיקה הטבעית שלהם.

תקציר

לב העכבר משמש כמודל נפוץ במחקר קרדיווסקולרי, זאת הודות להתקדמות בטכנולוגיות הנדסיות. עם זאת, הערכת התכווצות העליות והחדרים נותרה מאתגרת בשל גודלו הקטן של לב העכבר. מחקר זה מציג מתודולוגיה חדשנית להערכת התכווצות וקצב לב בלב שלם ומבודד. שימוש בלב עכבר בפרפוזיה לפי שיטת Langendorff בשילוב עם מערכת אופטית ברזולוציה גבוהה מאפשר הערכה של תכווצות העליות והחדרים. המערך הניסויי נותן מענה לאתגרים הקשורים לגודל הלב הקטן ולקצבי התכווצות מהירים, תוך רכישת אותות ברזולוציה גבוהה. סנכרון בין תדירות הגירוי לתדירות התכווצות הלב בטווח של 420 עד 660 פעימות לדקה (bpm) היה עקבי עם תוצאות שהתקבלו בשיטה האוקסוטונית (auxotonic method). בנוסף, מדידות של קיצור החדרים ואותות דינמיים של העליות מאפשרות קביעה של התכווצות עליות-חדרים. שיטה זו מתאימה להערכת תכווצות וקצב לב בלב שלם ומבודד, ללא השפעות פרמקולוגיות או סיסטמיות. תוצאות אלו מדגימות כי המערכת האופטית מאפשרת מדידה של תגובות קיצור של החדרים והעליות.

מבוא

יש הרבה מה לגלות בפיזיולוגיה של הלב; תהליכי מפתח, כגון קביעת קצב הלב (pace-making) וצימוד עירור-כיווץ (excitation-contraction coupling), הם עקרונות מרכזיים הנחקרים באופן מתמיד1. למרות שהשפעותיו של רעש ביולוגי על כושר הכיווץ של הלב2 ועל פעילות קביעת הקצב נותרו niezמנות להבנה מועטה1, שיטות חדשות של דימוי אופטי אפשרו את הצגתם של פרדיגמות חדשות3,4.

שתי מתודולוגיות ניסוייות המשתמשות במערכת לנגנדורף (Langendorff) תרמו תרומה רבה למדידת תפקוד הלב. הראשונה היא שיטת הכיווץ האיסו-וולומי (isovolumic contraction), שבה מתקבל אות מבלון קטן המוחדר לחדר השמאלי5,6,7. השנייה היא שיטת רישום האוקסוטונית (auxotonic recording), שבה מתקבל אות על ידי תפירת קצה אחד של חוט לשיא הלב (apex) והקצה השני למכשיר רישום מכני, כדי למדוד כיווצים אוקסוטוניים לאורך ציר הלב2,8. עם זאת, הערכת כושר הכיווץ של העליות והחדרים בלב העכבר היא מאתגרת בשל גודלו המזערי. יתרה מכך, ההכנה דורשת רמה מסוימת של עדינות, מכיוון שהלב רגיש לפגיעות9,10,11,12,13.

למערכת האופטית להערכת הדינמיקה המכנית של לבבות עכברים ישנם מספר מאפיינים ויתרונות חדשניים. ראשית, שיטה זו מתאימה להערכת כושר התכווצות וקצב לב בלב שלם ומבודד, בהיעדר השפעות פרמקולוגיות או מערכתיות. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה ביעילות גם בניסויים להערכת פגיעה כתוצאה מאיסכמיה-רפרפוזיה (ischemia-reperfusion injury) כאשר בוחנים טיפולים מבוססי פרמקולוגיה, רגנרציה של תאים או טיפול בחמצן.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת פרמטרים ביופיזיים של תפקוד התכווצות לב עכבר באמצעות מערכת אופטית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מסייעת בהערכת כושר ההתכווצות וקצב הלב בלב מבודד ושלם. יתרה מכך, היא מאפשרת הערכה של כושר התכווצות העליות והחדרים. הכנת לב עכבר בשיטת Langendorff מציגה שיפור הכולל שינוי קל במטרה למזער את איבוד הטמפרטורה של נוזל הפרפוזיה ואת ארטיפקטים של תנועה, מבלי להמעיט מהתכווצויות השריר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוצדורות בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות הפדרליות לניסויים ובטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת הרווחה לבעלי חיים של CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Mexico). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי זכר מסוג C57BL/6J, במשקל 28–34 גרם ובגיל 8–14 שבועות. כל החומרים והציוד ששימשו בפרוטוקול מפורטים ב- טבלת חומרים. קבצים משלימים 1–11 ספק דיאגרמות תומכות, מדריכי תוכנה, תוכניות ניתוח, נתוני קצב וקבצי יישום עבור הפרוטוקול.

1. הכנת תמיסות מלאי

  1. הכינו מראש שני תמיסות מלאי ואחסנו אותן במקרר בטמפרטורה של 4 °C: (1) מלאי I, 1 L (במים דה-יונזים; ב-g/L: 76.13 NaCl, 4.02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0.4 NaH2PO4) ו-(2) מלאי II, 0.1 L (במים דה-יונזים; ב-g/L: 73.5 CaCl2(2H2O)).
    הערה: ניתן להשתמש בתמיסות עד 30 ימים לאחר ההכנה. אחסנו אותן בטמפרטורה של 4 °C.

2. חיבור וניקוי של מערכת Langendorff

  1. חברו את המאגר (1), אמבט התרמוסטט של המאגר (2), משאבת הפרפוזיה (3), הסרפנטין (4), מחזור הסרפנטין (5), מערכת הניטור (6) ומערכת הניקוז (8), כפי שמוצג ב-איור 1A.
    הערה: החיבור בין מערכת הניטור למערכת הניקוז מוצג בפירוט רב יותר ב-קובץ משלים 1.
  2. מלאו את מערכת הלנגנדורף (Langendorff) ב-1 L של מים דאיונזים בטמפרטורה של 50 °C, ולאחר מכן הפעילו את משאבות הפרפוזיה והניקוז (קובץ משלים 1, מערכת ניקוז). לאחר כ-20–30 דקות, רוקנו את הנוזל מהמערכת, ולאחר מכן עברו לשלב הבא.
    הערה: ודאו שאין דליפות או ירידות לחץ במערכת. אם הדבר קורה, אין להמשיך בניסוי.
  3. מלאו את המערכת ב-1 L של חומצה אצטית 1% (מומס במים דאיונזים), לאחר מכן כבו את משאבות הפרפוזיה והניקוז והמתינו 60 דקות, ואז הפעילו את המשאבות כדי להוציא את הנוזל.
  4. חזרו על שלב 2.2 פעמיים.
  5. מלאו את המערכת באתנול 70% (מומס במים דאיונזים) כדי למנוע הידבקות של רכיבי התמיסה.
    הערה: יש לנקות את מערכת הפרפוזיה של לנגנדורף בכל עשרה ניסויים או אחת לחודש. פרוטוקול הניקוי לפני הניסוי מוסבר ב-סעיף 4, בעוד שפרוטוקול הניקוי לאחר הניסוי מפורט ב-סעיף 8.

3. הכנת תמיסת Tyrode במהלך הניסוי

  1. הכן 1 ליטר תמיסה בריכוזים של mM: ‏130.25 NaCl, ‏5.4 KCl, ‏0.53 MgCl2(6H2O), 0.33 NaH2PO4, 1.8 CaCl22(2H2O), 10 D-glucose, 10 HEPES, עם התאמה ל-pH 7.35 ± 0.05 באמצעות NaOH.
    1. ערבבו 100 מ"ל של תמיסת מקור I עם 700 מ"ל של מים דה-יוניים תחת ערבוב מתמיד, ולאחר מכן העלו את טמפרטורת התמיסה ל- 37 °C; שמרו על חמצון התמיסה באמצעות חיבור ה-O2 מיכל לאבן האוורור כפי שמוצג ב- איור 1A (1).
    2. הוסיפו 3.6 מ"ל של Stock II ו-96.4 מ"ל של מים דה-יוניים כדי לקבל 1.8 mM CaCl22(2H2O), ולאחר מכן יש להוסיף NaOH כדי לכוון את ה-pH ל-7.35 ± 0.05.
    3. השלם עם מים דה-יוניים כדי לקבל 1 ליטר של תמיסת Tyrode.
      הערה: מומלץ לאחסן 100 מ"ל מהתמיסה במקרר בטמפרטורה של 4 °C; נפח זה将יהיה דרוש מאוחר יותר בשלב 6.

4. הכנת מערכת לנגנדורף (Langendorff)

הערה: אם מערכת ה-Langendorff אינה מלאה באתנול ביום הניסוי, לא מומלץ להמשיך בפרוצדורה; במקום זאת, יש לחזור על סעיף 2.

  1. הפעל את משאבות הפרפוזיה והניקוז. הגדר את קצב הזרימה של משאבת הפרפוזיה ל-3 מ"ל/דקה ואת משאבת הניקוז ל-10 מ"ל/דקה. נקז את המערכת.
  2. מלאו את המערכת ב-1 L של מים דה-יוניים ב- 37 °C, ולאחר מכן נתקו את המים.
  3. מלאו את המערכת בתמיסת Tyrode שהוכנה ב- שלב 3 ויש לשמור על התמיסה בטמפרטורה פיזיולוגית ובחמצון קבוע.
  4. הפעילו את המכלילי החימום (thermal baths) ואת רכיב הסירקולטור הסרפנטיני. הגדירו את טמפרטורת המכליל (איור 1A (2)) ל- 38 °C כדי לשמור על התמיסה בתנאים פיזיולוגיים. הגדירו את הטמפרטורה של הסליל (איור 1A (5)) ב- 40 °Cפעולה זו מפצה על אובדן החום בתמיסתו של מערכת לנגנדורף (Langendorff).
    הערה: אם טמפרטורת תמיסת הטיי로드 (Tyrode solution) במוצא המערכת אינה פיזיולוגית (37 ± 0.5 °C), כווננו את טמפרטורת הרציקלטור הסרפנטיני. לא מומלץ להמשיך לשלב 6 עד שהטמפרטורה תתייצב בערך המתאים.
  5. הפעל את מד הלחץ (קובץ נלווה 1, מערכת ניטור) וכילוב בטווח של 0–200 mmHg. אפליקציית הניטור והקצבי זמינה כדי לסייע בכיול המערכת (קובץ משלים 3 ו- קובץ משלים 11).
    הערה: חיוני לוודא שאין הפסד בלחץ ושאין בועות במערכת. אם קיימות בועות במערכת, חסמו זמנית את יציאת התחתית של הסרפנטין ופתחו את השסתום העליון; פעולה זו תגרום למילוי העמודה ותאפשר לבועות להשתחרר החוצה. לא מומלץ להמשיך בניסוי עד שמאומת תנאי זה.

5. מערכת אופטית14

  1. הרכיבו את מצלמת ה-CMOS (איור 1A, 10), עדשה מתכווננת למצלמה (LC), ומערכת תאורה.
    הערה: מערכת התאורה מורכבת משתי נורות LED (איור 1A, 9), שתי עדשות תאורה פלאנו-קונבקס (LI), בקר תאורה (איור 1A, 11), כרטיס רכישה (קובץ משלים 1, מערכת ניטור), וחלקי תמיכה שתוכננו בתלת-ממד (קובץ משלים 1).
  2. הנח אובייקט ייחוס בעל נפח של כ-1,000 ממ"ק3 במרחק של 100–200 מ"מ מעדשת המצלמה (מרכז של איור 1A).
    הערה: יש למקם את האובייקט במיקום הלב במערכת לנגנדורף (Langendorff). ניתן להבחין במיקום זה ב- איור 1ב, במיוחד במרכז התמונה, במקום שבו פוגעות קרני האור.
  3. הפעילו את תוכנת רכישת הנתונים של המצלמה, ולאחר מכן הגדירו את המצלמה עם דגימה חלקית (subsampling) של 4x (4 פיקסלים = 1 סאב-פיקסל). הגדירו אזור עניין (ROI) של 200 x 200 סאב-פיקסלים (קובץ משלים 2).
    הערה: בתצורה זו, ניתן להשיג רזולוציה זמנית של 750 פריימים לשנייה (fps).
  4. הדליקו את מערכת התאורה (קובץ משלים 1), כוון את קרני האור כך שיתמקדו באובייקט הייחוס, והשג תאורה הומוגנית (איור 1B).
  5. כווננו את עוצמת התאורה על אובייקט הייחוס כדי למנוע חשיפת יתר של התמונה.
    הערה: התמונה חייבת להיראות כך איור 2A (או איור 1C, מחשב בקרה (Controller PC)). יש להפחית ככל האפשר השתקפויות על פני השטח של האובייקט (לב), מבלי לאבד את הגדרת קווי המתאר שלו. ניתן לבצע זאת על ידי כיוון הספק בקרת התאורה (Illumination control) או על ידי הפחתת זמן החשיפה בהגדרות המצלמה.
  6. כוון את עדשת המצלמה כדי לקבל תמונה ברורה של אובייקט הייחוס (איור 1C, מחשב בקרה). ודאו כי אובייקט הייחוס תופס 80% משדה הראייה (איור 2A) כדי לקבל קנה מידה להמרה של בערך 61 µm לכל תת-פיקסל.
    הערה: המערכת האופטית מפעילה באופן אוטומטי את מערכת התאורה כאשר המצלמה מוגדרת למצב רכישה (איור 1A ו- קובץ משלים 2מומלץ להשאיר את המצלמה במצב המתנה (standby) כך שמערכת התאורה תישאר כבויה ותופעל רק במהלך תקופות איסוף הנתונים הניסיוניים, וזאת כדי למנוע התחממות יתר.

6. פרוצדורות כירורגיות וקניולציה

  1. הפריניזציה והרדמה
    1. הכינו תערובת הרדמה המכילה tiletamine-zolazepam (במינון של 40 mg/kg ממשקל גוף העכבר) ו-xylazine (במינון של 10 mg/kg ממשקל גוף העכבר), ולאחר מכן דללו ל-200 µL באמצעות תמיסת סליין.
    2. הזריקו את תערובת ההרדמה תוך-peritoneally באמצעות מחט 27 G. המתינו עד שהעכבר ייכנס להרדמה עמוקה.
      הערה: ודאו את היעדרו של רפלקס בתגובה לגירוי בגפיים או בזנב (בדרך כלל, 10 min מספיקים).
    3. הזריקו 200 UI של heparin לא מופרד תוך-peritoneally באמצעות מחט 27 G והמתינו כ-5 min לפני המשך הניסוי.
  2. הוצאה וקנולציה
    1. הניחו את העכבר במצב גב (supine), והסירו את הפרווה והעור מאזור בית החזה באמצעות מספריים כירורגיים.
    2. בצעו חתך בבטן מתחת לסרעפת, תוך הקפדה על שמירת שלמותה.
    3. המשיכו בחתך רוחבי בסרעפת ובצעו במהירות תורקוטומיה (thoracotomy) עולה דו-צדדית דרך הצלעות, ולאחר מכן הסירו את דופן הצלעות.
      הערה: יש להיזהר לא לפגוע בלב. אם הלב נפגע או הושחת במהלך הפרוצדורה, מומלץ שלא להמשיך בניסוי.
    4. אחזו בעדינות במבנים העליונים של הלב באמצעות פינצטה עדינה, את קשת האאורטה ואת כלי הדם הסמוכים. הרימו בעדינות כדי לבצע חתך מתחת ומעלה, והוציאו את הלב והריאות יחד.
    5. העבירו במהירות את הלב לצלחית פטרי המכילה 50 mL של Tyrode solution בטמפרטורה של 4 °C לשטיפה ראשונית.
      הערה: מהרגע שבו נחתכה הסרעפת, בעל החיים יתחיל לחוות מצוקה נשימתית; מנקודה זו ואילך, יש חלון זמן של 60 s לביצוע שלבים 6.2.3–6.2.6. חריגה מגבול זמן זה עלולה לגרום לנזק איסכמי.
    6. הסירו את הריאות ורקמת שומן עודפת כדי לחשוף את קשת האאורטה באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי ומספריים עדינים.
      הערה: בעת ניקוי הרקמה, ודאו שקשת האאורטה אינה נפגעת. אם האאורטה נחתכת מתחת לעורק ה-brachiocephalic, הקנולציה תהיה קשה, מה שעלול להוביל לדליפות בלחץ.
    7. העבירו את הלב לבסיס קנולציה בהתאמה המכיל 50 mL של Tyrode buffer בטמפרטורה של 4 °C והכניסו את קצה האאורטה לתוך הקנולה שהוכנה ממחט 20 G (Supplementary File 1).
      הערה: היזהרו לא לפגוע במסתם האאורטי. אם המסתם נפגע, הלב ינפח, והסירקולציה הקורונרית לא תשטף כראוי.
    8. קשרו שני קשרי קנולציה באמצעות תפר משי 4/0: הראשון בשקע המרוחק (distal) מקצה הקנולה והשני לפני ה-brachiocephalic trunk (Supplementary File 1).
    9. החילו לאט את ה-Tyrode solution באמצעות מזרק 1 mL מלא בבופר בטמפרטורת החדר. ודאו שרקמת הקורונריות מזדככת כדי לאשר קנולציה תקינה.
    10. הסירו רקמת שומן כדי לאפשר גישה לחדרים ולעליות.
      הערה: הימנעו מחריגה מ-5 min של קנולציה כדי לשמר את חיוניות הלב.
    11. העבירו את הלב למערכת Langendorff ואפשרו לו להתייצב למשך 30 min.
      הערה: הלב ממוקם במרכז המערכת (Figure 1A,B), תלוי אנכית. בעת תליית הלב, גלו זהירות קיצונית כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. אם הדבר יקרה, הלחץ יעלה מעל 140 mmHg, הלב יתחיל לנפח ולא יהיה עוד חיוני.
      הערה: הרכבת ה-Langendorff נחשבת לשלמה כאשר הלב מראה תגובה יציבה מכנית, תדר תנודה טבעי של כ-360 פעימות לדקה (BPM), ולחץ פרפוזיה שבין 60 ל-110 mmHg.

7. פרוטוקול קצב והקלטת וידאו

  1. חיוניות הלב
    1. וודאו כי הלחץ הכלילי הוא בטווח של 60–110 mmHg עם משאבת פרפוזיה של 3 mL/min. אם לחץ הפרפוזיה הכלילי יורד מתחת ל-60 mmHg, הגבירו מעט את קצב הזרימה של משאבת הפרפוזיה (לחץ נמוך יגרום ללב להפוך לחיוור ורפוי). לעומת זאת, אם הלחץ עולה על 110 mmHg, הפחיתו מעט את קצב זרימת המשאבה (לחץ מופרז יגרום לבצקת ברקאות ולעלייה הדרגתית בלחץ עד להפסקת פעילות הלב).}
      הערה: שמירה על לחץ הפרפוזיה מחוץ לטווח האופטימלי שהוזכר לעיל למשך זמן ממושך תפגע באופן בלתי הפיך בחיוניות הלב.
    2. מקמו את הלב במנח פרונטלי כך שיתקבל מבט פרונטלי מלא במצלמה. כוונו את המיקום כך ששתי העליות יהיו גלויות במצלמה (איור 2A).
    3. הניחו בעדינות את אלקטרודות הפלטינה באופן שטחי בחלק העליון של העלייה הימנית באזור קוצב הלב. השתמשו בשידור המצלמה כמדריך כדי להביא את האלקטרודות לשדה הראייה. מקמו את האלקטרודה כך שלא תחסום את העלייה הימנית. תוך ניטור תצוגת המצלמה בזמן אמת, התקדמו לאט עם האלקטרודה עד למגע עם רקמת העלייה, תוך הקפדה לא להפעיל דחיסה מופרזת (שעלולה לשטח את העלייה הימנית בתמונה).
      הערה: אם הפעולה בוצעה נכון, תצוגת המצלמה תהיה דומה ל-איור 2A.
    4. הפעילו את אפליקציית הניטור והקוצב (קובץ משלים 11) והפעילו את כרטיס הרכישה (איור 1A (6)). הגדירו את ערכי פרמטרי הגירוי: אמפליטודה של 2 V, תדר של 420, 540 ו-720 פולסים לדקה (PPM) עם פולס מרובע במחזור עבודה (duty-cycle) של 7 ms (בתוך איור 2A).
    5. בצעו את גירויי החיוניות החל מהתדר הנמוך ביותר, תוך שימוש במשך גירוי של 20 s ולאחריו תקופת התאוששות של 20 s (זמן מנוחה) בין האירועים.
      הערה: העריכו את חיוניות הלב באמצעות ניטור במצלמה. אם האיבר תפקודי מבחינה פיזיולוגית, תצפה סנכרון בין הגירוי המיושם לתגובה הלבבית, בליווי תיאום תקין בין חללי הלב. לעומת זאת, חוסר חיוניות יבוא לידי ביטוי באובדן התיאום בין החללים או בנוכחות בלעדית של התכווצויות עליות מבודדות.
    6. סגרו את דלת התא כיוון שהניסוי רגיש לאור החדר ולתנודות תרמיות (איור 1C).
      הערה: דלת התא חייבת להישאר סגורה במהלך זמן הניסוי. נטרו את חיוניות הלב באמצעות המצלמה ולחץ הפרפוזיה.
  2. הקלטת נתונים
    1. בצעו את פרוטוקול הקוצב, המהווה רצפים של פולסים מרובעים במשך 30 s, ולאחריהם 30 s ללא אות. הגדירו את ערכי פרמטרי הגירוי בכל רצף קוצב: אמפליטודה של 2 V, מחזור עבודה של 7 ms, ותדר בטווח של 360 עד 720 PPM.
      הערה: פרוטוקול הקוצב מתחיל ב-360 PPM ועולה ב-60 PPM בכל נקודת זמן (בתוך איור 2A).
    2. הקליטו באופן רציף סרטוני וידאו של הדינמיקה של המבט הפרונטלי של הלב בפורמט .avi באמצעות תוכנת רכישת המצלמה (קובץ משלים 2). בצעו הקלטת וידאו של 20 s עבור כל רצף קוצב. הקליטו את המקטע של 20 s המתחיל 5 s לאחר תחילת הקוצב. הקלטה גולמית מייצגת מוצגת ב-סרט משלים 1.
      הערה: מחשב מקליט בו-זמנית את רצף הקוצב המיושם (.xls, קובץ משלים 9) לכל וידאו שהוקלט (.avi), אשר נוצרים על ידי אפליקציית הניטור והקוצב ותוכנת רכישת המצלמה, בהתאמה (קובץ משלים 2 ו-קובץ משלים 3).
    3. וודאו את חיוניות הלב על ידי השוואת הווידאו הראשון, שהוקלט לפני תחילת פרוטוקול הגירוי, עם הווידאו השני, שהוקלט לאחר יישום הפרוטוקול (איור 2B).

8. ניקוי מערכת פרפוזיית לנגנדורף (Langendorff) לאחר הניסוי

  1. הסיר את המעורר ואת אלקטרודות הפלטינה של ה-ECG. הוצא את הלב מהמערכת ורוקן את כל שאריות תמיסות ה-Tyrode.
  2. כבה את המערכת האופטית וסגור את שסתום ה-O2.
  3. שטוף את המערכת עם 1 L של מים דה-יוניים בטמפרטורה של 37 °C, ורוקן את המערכת.
  4. חזור על שלבים 2.4 ו-2.5.
  5. כבה את כל המערכות והציוד.

9. עיבוד וידאו

  1. התחילו ביבוא של כל סרטון לתוכנה חישובית והחילו פונקציית נורמליזציה של וידאו15.
  2. בחרו אזור עניין (ROI) הכולל את אזור הלב. בצעו סגמנטציה של התמונה כדי להסיר רעשי רקע, אלקטרודות ואת הקנולה (קובץ משלים 4).
    הערה: לבחירה נכונה של אזור התמונה שיש להסיר, אנא עיינו בקובץ משלים 10.
  3. בצעו ניתוח דינמיקה מכנית גלובלי (קובץ משלים 5). דוגמאות לתשתיות של שונות ואותים מוצגות באיור משלים S1, איור משלים S2, ואיור משלים S3.
    1. החילו אופרטורים מורפולוגיים על כל פריים בסרטון כדי לזהות את היקף הלב, ולאחר מכן החילו אלגוריתם מילוי פריים כדי ליצור מסכה15.
    2. ספרו את הפיקסלים בתוך האזור שעבר סגמנטציה בכל פריים, ולאחר מכן נרמלו ספירה זו לפי מספר הפיקסלים הכולל בתמונה כדי להפיק אות דינמי (מוטמע באיור 2B ובאיור משלים S3).
    3. החילו מסנן Butterworth דו-כיווני מסדר 5 בין 3 ל-100 Hz על האות שהתקבל כדי לדכא רעשים בתדר גבוה וארטיפקטים של טפטוף פירפוזיה15.
    4. נרמלו את האותים בכל הסרטונים באמצעות ערכי המקסימום והמינימום שנרשמו.
    5. קבעו את קצב הלב על ידי חישוב המרווח בין שני ערכי אמפליטודה מקסימליים (IAA (s)) עבור כל אות דינמי ואות גירוי.
    6. חשבו את התדירות ב-BPM באמצעות הנוסחה הבאה:
      משוואת חישוב תדירות המראה שקצב הלב ב-BPM שווה ל-60 חלקי IAA.
    7. צרו מפות Poincaré מנתוני IAA כדי להדגים שונות בפרקי זמן קצרים וארוכים16,17,18 (איור משלים S1 ואיור משלים S2).
      הערה: למידע מפורט יותר, אנא עיינו בקובץ משלים 10.
  4. בצעו ניתוח סגמנטלי של הדינמיקה המכנית של החדרים (קובץ משלים 6).
    1. בצעו בינריזציה של התמונה. השתמשו באופרטורים מורפולוגיים כדי להגדיר את אזור החדרים, תוך התאמתו לגאומטריה אליפטית מבלי לפגוע ב-ROI15.
    2. התאימו אליפסה מינימלית לאזור החדרים בכל פריים. חלצו את הקואורדינטות של קבוצת נקודות דיסטליות בפריים. השתמשו בקבוצה של 10–20 נקודות בכל קצה לאורך ציר Y (איור 3A). פלט מייצג של הערכת אליפסה מסופק בסרטון משלים 2.
    3. חשבו את קיצור החדרים כמרחק הממוצע בין נקודות קיצון לאורך ציר Y בכל סרטון19.
    4. החילו מסנן Butterworth דו-כיווני מסדר 5 בין 3 ל-100 Hz על האות שהתקבל כדי לדכא רעשים בתדר גבוה וארטיפקטים של טפטוף פירפוזיה15.
    5. נרמלו את אות קיצור החדרים ביחס לכל הסרטונים שהתקבלו עבור כל קצב גירוי, וחשבו את קצב הלב והעיכוב כבשלבים 9.3.5–9.3.6.
      הערה: פרמטרים, כגון משך מחזור חדרים (DVE), משך הרפיה (DVW), מרווח בין-חדרי (IVV), ואמפליטודת חדרים (VA), מתקבלים (איור 3A).
      הערה: למידע מפורט יותר, אנא עיינו בקובץ משלים 10.
  5. בצעו ניתוח סגמנטלי של הדינמיקה המכנית של העליות (קובץ משלים 7).
    1. השתמשו בשני ROI כדי להגדיר את העליות (איור 3C).
    2. נתחו כל עליה בנפרד.
      1. השתמשו באופרטורים מורפולוגיים כדי לתחום את העליות תוך התאמתן מבלי לפגוע ב-ROI15. השתמשו באלגוריתם להגברת ניגודיות כדי לתחום כל עליה20,21.
      2. בצעו בינריזציה של התמונה וכמתו את מספר הפיקסלים השונים מאפס לכל פריים כדי לקבל אות דינמי של העליות.
      3. החילו מסנן Butterworth דו-כיווני מסדר 5 בין 3 ל-100 Hz על האותות שהתקבלו כדי לדכא רעשים בתדר גבוה וארטיפקטים של טפטוף פירפוזיה15.
      4. חשבו את הממוצע של שני אותות העליות (איור 3D).
    3. נרמלו את אות קיצור העליות ביחס לכל הסרטונים שהתקבלו עבור כל קצב גירוי וחשבו את קצב הלב והעיכוב כבשלבים 9.3.5–9.3.6.
      הערה: פרמטרים, כגון משך מחזור עליות (DAE), מרווח עליה-עליה (IAT), ואמפליטודת עליות (AA), מתקבלים (איור 3D). למידע מפורט יותר, עיינו בקובץ משלים 10.
  6. בצעו ניתוח אלקטרו-מכני13,22 (קובץ משלים 8).
    1. השוו את נתוני קצב הגירוי עם אותות העליות והחדרים (איור 3D).
    2. חשבו את זמן ההפצה במערכת ההולכה של הלב, וקבלו את העיכוב בין אירועי העליה והחדרים (AVD), כאשר הגירוי שהוחל משמש כנקודת ייחוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניסויי התפקוד המכני של הלב מבוצעים באמצעות מכשיר לנגנדורף (Langendorff), כפי שמוצג ב- איור 1A (למעלה)מערכות הניטור והאופטיקה מאפשרות הקלטת וידאו כאשר מופעלת בקרת התאורה, כפי שמוצג ב- איור 1A (למטה). איור 1C ממחיש את המבט החיצוני של התא בעל הבקרה התרמוסטטית, שנועד לשמור על הלב מבודד מתנודות תרמיות של הסביבה ומאור. כפי שמתואר ב- איור 1Bהלב המבודד ממוקם כאובייקט ייחוס במער...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לב העכבר רגיש מאוד לשינויי טמפרטורה2,9,10,11,22. בניסוי זה, הלב שעבר פרפוזיה מוקם בצורה אנכית. הכללנו שינוי קל כדי למזער את איבוד טמפרטורת הפרפוזאט ואת ארטיפקטי התנועה בשיטת פרפוזיית Langendorff. משאבת רסיркуלציה נוספה לסרפנטינה כדי למזער את איבוד טמפרטורת הפרפוזאט ב-37 ± 0.5 °C, ובסיס ניקוז נוסף כדי למזער ארטיפקטי תנועה. יתרה מכך, נעשה שימוש בארון מבודד תרמית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מספר LN-2025-C-23 שמימנה מזכירות המדע, הרוח, הטכנולוגיה והחדשנות (SECIHTI).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 1 mLBD Plastipak302485הליך כירורגי
מחט 20 GNIPROAH-2032קנולה אאורטלית
עדשה מתכווננת 25 mm עם הגדלה של 8x-100xGenericN/Aעדשת מצלמה של מערכת אופטית; מצוין באופן כללי כעדשת מצלמה מתכווננת
מחט 27 GBD PrecisionGlide302358הליך כירורגי
חלקי תמיכה בעיצוב תלת-ממדיCINVESTAVN/Aחלקי תמיכה בהתאמה אישית בעיצוב תלת-ממדי
חוט תפר משי 4-0AMERICAN SUTURETGSN0901קנולה אאורטלית
ספק כוח 40-ASTERENPRL-25ספק כוח עבור LED
אבן אוורורN/AN/Aחממצון של תמיסת Tyrode
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306תמיסת Tyrode
D-GlucoseJ.T. Baker1916-01תמיסת Tyrode
משאבת ניקוזCINVESTAVN/Aמשאבת ניקוז בהתאמה אישית; מצוין באופן כללי כמשאבת ניקוז
עדשה פלאנו-קמורה, F = 25.4 mmTHORLABSLA1951-Aעדשת תאורה של מערכת אופטית; מצוין באופן כללי כעדשת תאורה פלאנו-קמורה
חומצה אצטית גלציאליתSigma-Aldrich695092ניקוי מערכת Langendorff
הפריןPiSA060M91נוגד קרישה
HEPESSigma-AldrichH3375תמיסת Tyrode
נוריות LED בעלות הספק גבוהLuminiusCBT-90-G-L11-C12מקור אור LED
מערכת תאורהCINVESTAVN/Aמערכת תאורה בהתאמה אישית; מצוין באופן כללי כמערכת תאורה
KClCTR SCIENTIFICCTR02196תמיסת Tyrode
תוכנת LabVIEW גרסה 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Aתוכנה המשמשת להרצת יישום הניטור והקוצביות; מצוין באופן כללי כיישום ניטור וקוצביות
תוכנת MATLABThe MathWorksN/Aתוכנה חישובית לתוכניות נורמליזציה, סגמנטציה ואנליזה של וידאו; מצוין באופן כללי כתוכנה חישובית
חמצן בדרגה רפואיתGRUPO INFRAN/Aחממצון של תמיסת Tyrode
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104תמיסת Tyrode
מיני-משאבה עם זרימה משתנהCONTROL COMPANY3385משאבת פרפוזיה
ערכת ניתוח לעכבריםKent ScientificINSMOUSEKITהליך כירורגי
NaClSigma-AldrichS5886תמיסת Tyrode
NaH2PO4DEQDEQF290400250תמיסת Tyrode
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108כוונון pH
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01כרטיס רכישה
אלקטרודות פלטינה, קוטר 0.25 mmSigma-Aldrich349402אלקטרודות לגירוי חשמלי
ספק כוח (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30Aספק כוח למסחר
מד לחץCINVESTAVN/Aמד לחץ בהתאמה אישית; מצוין באופן כללי כמד לחץ
מתמר לחץLA BOUVETB17295מד לחץ של מערכת Langendorff
אתנול טהורSigma-Aldrich493511אתנול לניקוי המערכת
אמבט תרמי עם סחרור (LXC)PolyScienceL113A0412מסחר של מיכל
תמיסת מלחPiSA111848תמיסת נתרן כלוריד (NaCl) 0.9%
אמבט תרמי נחשיתCINVESTAVN/Aמסחר/אמבט תרמי נחשית בהתאמה אישית
מיקרוסקופ סטריאוN/AN/Aהליך כירורגי
תאורה למיקרוסקופ סטריאוN/AN/Aהליך כירורגי
תוכנת uEye CockpitIDS Imaging Development System GmBHN/Aתוכנת רכישה למצלמה; מצוין באופן כללי כתוכנת רכישה למצלמה
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624מצלמת CMOS במהירות גבוהה; מצוין באופן כללי כמצלמת CMOS
קסילזיןPiSA4001211חומר הרדמה
Zoletil 100Virbac83048907חומר הרדמה טילטמין-זולזפאם; מצוין באופן כללי כתערובת הרדמה

מקורות

  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.