מאמר מחקר

זיהוי סמנים ביולוגיים מועמדים הקשורים לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה ו-SUMOylation באי ספיקת לב בהתבסס על גישות ביואינפורמטיקה

DOI:

10.3791/72265

⸱

26 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Hebei Medical University Third Hospital, 2Department of Clinical Pharmacy, Hebei Medical University Third Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות ביואינפורמטיקה, למידת מכונה ואימות qPCR, המחקר זיהה חמישה סמנים ביולוגיים מועמדים הקשורים ל-SUMOylation ולדיספונקציה המיטוכונדרית באי ספיקת לב. ממצאים אלו משפרים את ההבנה של מנגנוני אי ספיקת לב ומציעים כיוונים פוטנציאליים למחקר אבחוני עתידי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אי ספיקת לב (HF) מציבה אתגר קליני מתמשך. בעוד ש-SUMOylation ותפקוד מיטוכונדריה חיוניים לבריאות הקרדיומיוציטים, השפעתם המשותפת על HF נותרה חמקמקה. שני מערכי נתונים הקשורים ל-HF הורדו מ-GEO. הגנים החופפים התקבלו מכל הגנים במערך האימון, מגנים הקשורים ל-SUMO ומגנים הקשורים למיטוכונדריה. שלושה אלגוריתמים של למידת מכונה יושמו לזיהוי גנים מרכזיים באבחון. בהמשך, נבנו והוערכו מודלים אבחנתיים על בסיס גנים אלו. בנוסף, המיקרו-סביבה החיסונית בביקורת HF לעומת בריאות הוערכה באמצעות CIBERSORT, MCP-counter ו-ssGSEA. נותחו ההבדלים בחדירת מערכת החיסון בין HF לביקורת בריאה. בוצעו חיזוי תרופות ועגינה מולקולרית כדי לזהות מועמדים פוטנציאליים לתרופות המכוונים לגנים אלו. לבסוף, qPCR שימש לאימות רמות ביטוי גנים בדגימות קליניות. זוהו בסך הכול 113 גנים נפוצים עם העשרה משמעותית בוויסות המיטוכונדריה. חמישה גנים מרכזיים, כלומר NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 ו-FKBP4, זוהו על ידי שלושה אלגוריתמים ללמידת מכונה. ניתוחי העשרה פונקציונלית קישרו בין גנים אלו לתגובה חיסונית, עיבוד RNA וויסות מחזור התא. יתרה מזאת, פרופיל חדירה חיסון גילה כי חדירת נויטרופילים תורמת לתגובות חיסוניות לא מווסתות ב-HF. עגינה מולקולרית גילתה כי התרופה IMX-942 למולקולה קטנה יש זיקה חיובית ל-SQSTM1 (-5.8 קקלורי/מול). אימות qPCR תמך בתוצאות הביואינפורמטיקה. NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 ו-FKBP4 זוהו כגנים מרכזיים המקשרים בין SUMOylation לתפקוד מיטוכונדריה ב-HF. ממצאים אלו מספקים תובנות חדשות על פתופיזיולוגיה של HF ועשויים לתרום לפיתוח אסטרטגיות אבחנתיות וטיפוליות חדשניות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אי ספיקת לב (HF), השלב הסופי של מחלות לב וכלי דם שונות, מאופיינת בפגיעה בתפקוד הלב שאינו עונה על דרישות המטבוליות של הגוף1. מצב משתק זה מהווה איום משמעותי על בריאות המטופל, מה שמוביל לירידה באיכות החיים ולשיעורי תמותה מוגברים2. שיטות האבחון הנוכחיות ל-HF כוללות בעיקר זיהוי סמנים ביוכימיים 3,4, אקו לב והדמיה רדיולוגית5. למרות שהטיפולים הזמינים כוללים סוכנים פרמקולוגיים, התערבויות מבוססות מכשירים ופרוצדורות כירורגיות, התוצאות הקליניות נותרות לא מספקות6. מגבלות כמו תגובות לוואי תרופתיות, יישום מוגבל של מכשירים, דחיית מערכת חיסון וסיבוכים נוספים לעיתים קרובות פוגעים ביעילות הטיפולית 7,8,9,10,11. לכן, יש צורך דחוף להבהיר את המנגנונים הבסיסיים של HF, לזהות סמנים ביולוגיים אבחנתיים מוקדמים ומדויקים, ולפתח אסטרטגיות טיפוליות יעילות ובטוחות יותר.

חלבוני מודיפייר דמוי יוביקוויטין קטנים (SUMO) מצמידים קוולנטית לשאריות הליזין של חלבוני הסובסטרט בתהליך דינמי והפיך, המווסת את המבנה והתפקוד של חלבוני הסובסטרט12. SUMOylation, שינוי קריטי לאחר התרגום, משמשת כרגולטור מרכזי של תהליכים תאיים שונים13,14. מיטוכונדריה, כמרכז האנרגיה-מטבוליזם של התאים, מעורבות באופן קריטי בפתוגנזה של HF. בתהליך הפתולוגי של HF, תפקוד לקוי של מיטוכונדריה, כגון ייצור לא מספק של ATP, התפרצות של מיני חמצן תגובתי (ROS) וחוסר איזון הומאוסטזיסב-Ca2+, תורמים משמעותית להתקדמות 15,16,17,18. ראוי לציין כי ראיות מתפתחות מצביעות על אינטראקציה פוטנציאלית בין SUMOylation לתפקוד המיטוכונדריה. לחץ מיטוכונדריאלי יכול להפעיל מסלולים הקשורים ל-SUMOylation, בעוד שחלבוני SUMO והפרוטאזות הספציפיות שלהם חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי 19,20,21. מחקרים אחרונים הדגישו עוד יותר את חשיבות בקרת איכות המיטוכונדריה ודינמיקת המיטוכונדריה במחלות לב וכלי דם ובהתקדמות HF22,23. עם זאת, ההשפעה הסינרגטית של SUMOylation וויסות המיטוכונדריה על התפתחות HF נותרה לא ברורה, במיוחד ברמת הגן.

במחקר זה, חקרנו באופן שיטתי גנים בצומת בין SUMOylation לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה ב-HF, שני תהליכים ביולוגיים מרכזיים שהיו מעורבים בנפרד ב-HF אך טרם שולבו באופן מקיף. גנים חופפים זוהו על ידי הצטלבות גנים המובעים באופן שונה הקשורים ל-HF, גנים הקשורים ל-SUMOylation, וגנים הקשורים למיטוכונדריה. גנים מרכזיים נבדקו לאחר מכן באמצעות אלגוריתמים של למידת מכונה ושימשו לבניית מודל אבחון. בוצעו ניתוחים נוספים של העשרה פונקציונלית וחדירת חיסון כדי לחקור את תפקידיהם הביולוגיים הפוטנציאליים ב-HF. גישה משולבת זו עשויה לספק מסגרת שיטתית לחקר השיח הצלב בין SUMOylation לבין תפקוד לקוי של מיטוכונדריה ב-HF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נערך בהתאם להצהרת הלסינקי, והפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים השלישי של אוניברסיטת הרפואה של חביי (W2025-065-1) בנובמבר 2024. התקבלה הסכמה מדעת מכל הנבדקים המעורבים במחקר.

מקור הנתונים ועיבוד מוקדם

נתוני RNA-seq הקשורים ל-HF התקבלו, כולל שני מערכי מיקרו-מערך מתוך Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). נבחרו שני מערכי נתוני מיקרו-מערך דם היקפיים: GSE59867 (34 דגימות HF ו-30 ביקורת) שימש כמערך האימון; GSE57338 (177 דגימות HF ו-136 ביקורות) שימש כמאגר הנתונים לאימות המכשירים. המידע הקליני הזמין GSE57338, כולל גיל, מגדר ומצב מחלה, נאסף מ-GEO ומסוכם בטבלה משלימה 1. בנוסף, נאספו בסך הכל 3,893 גנים הקשורים ל-SUMOylation (SRGs) ממאגר הנתונים dbPTM (https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php) (טבלה משלימה 2), בעוד שנאספו 2,030 גנים הקשורים למיטוכונדריה (MRGs) על בסיס מחקר קודם24 (טבלה משלימה 3). לאחר מכן, חבילת R GEOquery (v 2.72.0)25 שימשה להורדת מערכי נתונים ממסד הנתונים GEO, חילוץ מטריצת הביטויים וקבלת מידע על הפנוטיפ של המדגם. ההערה בוצעה על ידי מיפוי קובץ ההערות והתאמת מזהי הגנים. מזהי גנים לא תקינים הוסרו, והפרובים המובעים ביותר נשמרו.

בחירת גנים מרכזיים באמצעות למידת מכונה

שיטה רב-שלבית שימשה לבחירת הגנים הקשורים ל-HF, SUMOylation ולמיטוכונדריה. ראשית, הגנים המשותפים בין מאגר הנתונים של האימון, SRGs ו-MRGs זוהו באמצעות ניתוח חיתול. הפונקציה הפוטנציאלית של גנים נפוצים זוהתה על ידי Gene Ontology (GO) וניתוח העשרת אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) באמצעות חבילת R ClusterProfiler (v 4.12.6)26. לאחר מכן, נעשה שימוש בשלוש גישות למידת מכונה, כלומר רגרסיית LASSO, XGBoost ויער אקראי (RF), כדי לסנן את הגנים. ברגרסיית LASSO, פרמטר הרגולריזציה האופטימלי λ נבחר באמצעות אימות צולב כדי לזהות את התכונות הגנטיות עם הערך החיזוי הגבוה ביותר. הגנים בעלי מקדם שאינו אפס נבחרו לניתוח מאוחר יותר. לאחר מכן, אלגוריתמים של XGBoost ו-RF שימשו לחישוב ציוני חשיבות התכונה ולסינון 20 הגנים המובילים.

בנייה והערכה של מודלים אבחנתיים

נבנה מודל אבחוני באמצעות רגרסיה לוגיסטית המבוסס על מערך הנתונים GSE59867. המודל יושם אז לחיזוי מצב המחלה ולחישוב ציוני הסתברות. כדי לאמת את המודל, אותם גנים מרכזיים הופקו ממאגר הנתונים GSE57338, נורמל כדי להתאים למאגר האימון, ושימשו לחיזוי חיצוני. ביצועי המודל הוערכו באמצעות עקומות מאפיין פעולה של מקלט (ROC), מטריצת בלבול, עקומת כיול וניתוח עקומת החלטה (DCA).

ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) ולוקליזציה תת-תאית

ניתוח קורלציה של ספירמן שימש לזיהוי גנים מתואם לכל גן מפתח. ניתוח GSEA בוצע באמצעות חבילת R ClusterProfiler (גרסה 4.12.6) על גנים קשורים לגנים המרכזיים. בינתיים, כדי לקבוע את המיקום התת-תאי המדויק של הגנים המרכזיים בתוך התא, נקבעה המיקום התת-תאי שלהם באמצעות מאגר GeneCards (https://www.genecards.org/).

קשר גנטי-מחלה וחיזוי תרופות

כדי להעריך את הרלוונטיות הקלינית של הגנים המרכזיים שזוהו, בוצעו ניתוחים שיטתיים של אסוציאציות מחלות ואינטראקציה בין תרופות. קשרי מחלה-גנים נבדקו באמצעות מאגר הנתונים השוואתי לטוקסיגנומיקה (CTD; https://ctdbase.org/), כאשר התוצאות דורגו לפי ציוני הסקה וספירת מקורות (עשרת הקשרים המובילים שדווחו). נתוני אינטראקציה גנטית-תרופתית עבור גנים מרכזיים התקבלו ממאגר האינטראקציה בין תרופות לגנים (DGIdb), ותרופות הוצאו על בסיס ציון אינטראקציה < 0.5. לאחר מכן הורדנו את המבנים התלת-ממדיים של חלבונים התואמים לגנים מרכזיים ממאגר הנתונים של PDB (https://www.rcsb.org/) ואת המבנים המולקולריים של תרופות פוטנציאליות מ-PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). לאחר מכן בוצע ניתוח עגינה מולקולרית באמצעות CB-Dock227 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php) לחישוב ציוני הקישור בין התרופות הפוטנציאליות לחלבונים. אנרגיה חופשית נמוכה יותר מצביעה על אינטראקציה יציבה יותר, מה שמרמז שהתרכובת עשויה להיות בעלת פוטנציאל מיקוד גבוה יותר.

ניתוח חדירה חיסונית

חדירת תאי החיסון הוערכה באמצעות שלוש שיטות משלימות: מיקרוסביבה של אוכלוסיות תאים (MCP-counter)28, זיהוי סוגי תאים על ידי הערכת תת-קבוצות יחסיות של תמלילי RNA (CIBERSORT)29 וניתוח העשרת דגימה בודדת (ssGSEA)30. ניתוח מונה MCP ו-CIBERSORT בוצע באמצעות חבילת R IOBR (v 0.99.0)31. מונה MCP שימש להערכת שפע תאי החיסון ותאי הסטרומל, בעוד ש-CIBERSORT שימש לכימות היחסים היחסיים של 22 סוגי תאי חיסון. ssGSEA בוצע באמצעות חבילת GSVA (v1.52.3)32 להערכת העשרה ברמת הדגימה של תת-סוגי תאי חיסון.

בניית רשת הרגולציה המתחרה של RNA אנדוגני (ceRNA)

כדי לחקור את תפקידי הרגולציה הפוטנציאליים של miRNA–lncRNA הקשורים לגנים מרכזיים שזוהו בעבר, נבנתה רשת רגולציה של ceRNA. חבילת R multiMiR (v 1.26.0)33 שימשה לחיזוי אינטראקציות פוטנציאליות בין microRNA (miRNA)–mRNA עבור גנים מרכזיים, תוך שילוב נתונים מ-PITA (https://omictools.com/pita-tool/) וממסד הנתונים miRDB (https://mirdb.org/). נבחרו זוגות miRNA–mRNA עם ביטחון ועקביות גבוהים. בהמשך, אינטראקציות בין lncRNA–miRNA נאספו ממסד הנתונים StarBase (https://rnasysu.com/encori/) וסוננו לאינטראקציות הנתמכות על ידי ≥ 10 ניסויי CLIP-seq וסווגו כ-lincRNA. רשת ceRNA נבנתה על ידי שילוב אינטראקציות בין lncRNA-miRNA-mRNA.

אימות qPCR

כדי לאמת את ביטוי הגנים המרכזיים, נאספו דגימות דם ממטופלים עם HF וביקורת בריאה מהקבוצה הקלינית (n = 6 לכל קבוצה) בבית החולים השלישי של אוניברסיטת הרפואה Hebei (W2025-065-1) בהתאם לפרוטוקולים מאושרים והסכמה מדעת. כל ה-RNA בודד באמצעות תגובת טריזול בשילוב עם כלורופורם ואיזופרופנול. לאחר החילוץ, ה-RNA הומס במים שטופלו ב-DEPC, וריכוזו וטוהרו הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. לצורך ניתוח שעתוק, ה-RNA הועתק הפוך ל-cDNA באמצעות תערובת סינתזת cDNA מהירה מסוג First Strand עבור RT (עם dsDNase). PCR כמותי בוצע לאחר מכן באמצעות Fast Taq qPCR SYBR Green Mix. רצפי הפריימרים הספציפיים מפורטים בטבלת החומרים. רמות הביטוי הגנטיות היחסיות חושבו בשיטת 2-ΔΔCT , עם נרמול מתאים.

ניתוח סטטיסטי

כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת R ו-GraphPad Prism. השוואות סטטיסטיות בין שתי קבוצות עצמאיות בוצעו באמצעות מבחן ה-t של סטודנט או מבחן מאן-וויטני U, בהתאם להתפלגות הנתונים. ערך p של פחות מ-0.05 נחשב כמצביע על מובהקות סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי והעשרת פונקציונליות של גנים מצטלבים

כדי לזהות גנים המעורבים ב-SUMOylation ובתפקוד המיטוכונדריה ב-HF, בוצעה תחילה בקרת איכות על סט האימון GSE59867 (איור משלים 1A). בוצע ניתוח חיתוך תלת-כיווני בין כל הגנים במערך האימון, SRGs ו-MRGs, וזיהוי 113 גנים חופפים (איור 1A). כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות הפוטנציאליות של גנים אלו, בוצעו ניתוחי העשרת מסלולי GO ו-KEGG. כפי שמוצג ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HF, שלב מתקדם וסופי של מחלות לב וכלי דם שונות, מאופיין במנגנונים פתופיזיולוגיים מורכבים ורב-פקטוריים17,34. למרות שגם SUMOylation וגם תפקוד לקוי של מיטוכונדריה היו מעורבים בנפרד ב-HF, תפקידיהם הסינרגטיים הפוטנציאליים עדיין לא נחקרו מספיק, במיוחד ברמת הגן. במחקר הנוכחי זיהינו חמישה גנים מרכזיים—NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 ו-FKBP4—והקמנו מודל אבחוני ל-HF באמצעות גישות שונות של למידת מכונה. הבהרנו עוד יותר את הפונקציות הביולוגיות הפו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מחקר מדעי הרפואה של חביי (מספר מענק: 20250084).

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תחליף כלורופורםServicebioG3014-02qPCR reagent
מים שטופלו ב-DEPC BiosharpBL510AqPCR reagent
תערובת סינתזת cDNA מסדר ראשון מהירה עבור RT (עם dsDNase)Albatross Biology500-101qPCR reagent
תערובת Fast Taq qPCR SYBR GreenAlbatross Biology500-102qPCR reagent
פריימרים של FKBP4TsingkeN/AForward: 5’-GAAGGCGTGCTGAAGGTCAT-3’
Reverse: 5’-TGCCATCTAATAGCCAGCCAG-3’
איזופרופנולHushi80109218qPCR reagent
פריימרים של MYEF2TsingkeN/AForward: 5’-CAGCTCCAATGGCGTTAAAATG-3’
Reverse: 5’-TGGCCTTCTTACTTCCTGTAGAT-3’
ספקטרופוטומטר NanoDropThermo Fisher ScientificNanoDrop 2000CqPCR reagent
פריימרים של NFKB1TsingkeN/AForward: 5’-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3’
Reverse: 5’-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’
פריימרים של NSUN2TsingkeN/AForward: 5’-GAACTTGCCTGGCACACAAAT-3’
Reverse: 5’-TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA-3’
פריימרים של SQSTM1TsingkeN/AForward: 5’-GCACCCCAATGTGATCTGC-3’
Reverse: 5’-CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG-3’
תכשיר TRIzolVazymeR401-01qPCR reagent
פריימרים של בטא-אקטיןTsingkeN/AForward: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’
Reverse: 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

232232

מאמרים קשורים