איסוף דגימות צואה התואמות למגורים קבוצתיים בהתנדבות בעכברים באמצעות מערכת כלוב מותאמת אישית

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מערכת כלוב מותאמת אישית לאיסוף דגימות צואה וולונטרי, ידידותי לרווחה, סימולטני ואישי מעכברים שמאוחסנים בקבוצה.

תקציר

מדידה אמינה של מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה דורשת דגימות צואה שניתן להקצות לבעלי חיים בודדים ולאסוף בתוך חלון זמן מוגדר. זה מאתגר בעכברים הקבוצתיים, שבהם דגימות הכלוב המאוחדות אינן מאפשרות הקצאה אישית, והפרדה זמנית עלולה להפריע לרווחת בעלי החיים ולתוצאות המחקר. מטרת הפרוטוקול היא להציג מערכת כלוב פשוטה וזולה שמאפשרת איסוף דגימות צואה וולונטרי, סימולטני ואישי מעכברים שמאוחסנים בקבוצה. המערכת מורכבת מכלוב ביתי מפוליקרבונט עם קצה חוט, המחובר לשלושה קופסאות איסוף נפרדות. לאחר ההרגל והאימון, העכברים נכנסים מרצון לקופסאות כדי לקבל פרס מזון קטן. ניתן לסגור את הדלתות ללא מרדף, טיפול או העברה בכפייה. כדורי צואה נאספים מכל קופסה בנפרד, מה שמאפשר להקצות דגימות לבעלי חיים בודדים תוך שמירה על דיור חברתי מחוץ לתקופת הדגימה. פרוטוקול זה תומך בדגימה אורכת לא פולשנית ומתאים למחקרים המודדים מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה או סמנים ביולוגיים אחרים בצואה. העיצוב קל לבנייה מחומר כלוב סטנדרטי וזכוכית אקרילית, ניתן לפרק אותו לניקוי, ומאפשר לדגום מספר כלובים במקביל. על ידי הפחתת הפרעות הקשורות לטיפול ושיפור הסטנדרטיזציה של חלון הדגימה, השיטה מספקת שיפור מעשי לניטור אנדוקריני בעכברים הקבוצתיים.

מבוא

אתגר מרכזי בהערכת ריכוזי הקורטיקוסטרון בפלזמה הוא שתהליך הדגימה עצמו עלול לגרום לעלייה חריפה בקורטיקוסטרון, ובכך לבלבל את המדידה ואולי להשפיע על פרשנות תוצאות המחקר ^1,2,3. מדידת מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה (FCMs) מספקת אלטרנטיבה לא פולשנית, שכן ריכוזי FCM משקפים רמות גלוקוקורטיקואידים בסירקולציה מספר שעות לפני הדגימה, בהתאם למין, זן, מין וזמן מעבר במעי ^4,5. עם זאת, ניתוח FCM אמין בעכברים שהובאו בקבוצה נותר מאתגר. דגימות צואה מאוחדות שנאספו מהכלוב הביתי אינן ניתנות לשיוך לבעלי חיים בודדים ועלולות להראות שונות גבוהה בשל הבדלים בין-אישיים בהפרשת גלוקוקורטיקואידים ואי-ודאות בחלון הדגימה המדויק. הפרדת בעלי חיים לפרקי זמן ממושכים עלולה להפריע למטרות המחקר, בעוד שהפרדה קצרה לאיסוף דגימות בודדת היא דורשת עבודה רבה, מגבילה את קצב התפוקה, ועלולה לגרום ללחץ².

כדי לאפשר איסוף דגימות צואה בודדות מעכברים שהוחזקו בקבוצה עם טיפול מינימלי, פותח כלוב איסוף צואה מותאם אישית (איור 1A-E). העיצוב הותאם מכלוב איסוף צואה שתואר קודם לכן לעכברים קוצניים⁶ והותאם לשימוש בעכברי מעבדה. המערכת מורכבת מכלוב פוליקרבונט סטנדרטי מסוג III המחובר לשלושה תיבות איסוף נפרדות, אליהן החיות יכולות לגשת מרצון ולסגור אותן באמצעות דלתות הזזה. מערכת זו מאפשרת איסוף דגימות צואה מעכברים בודדים ללא טיפול ישיר במהלך תקופת הדגימה ומאפשרת דגימה סימולטנית של מספר בעלי חיים. לכן, הכלוב מספק גישה מעשית לדגימת FCM לא פולשנית ומיוחסת באופן אישי בעכברים הקבוצתיים.

הפרוטוקול הבא מתאר מערכת דגימת צואה המאפשרת איסוף וזיהוי דגימות צואה מעכברים בודדים תוך שמירה על סביבה קבוצתית, תוך שימוש בכלובים מותאמים אישית לדגימת צואה ללא מגע.

פרוטוקול

ועדת האתיקה האחראית על בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של וינה התייעצה לפני ביצוע המחקר והוסבר כי אין צורך ברישיון פורמלי לניסויים בבעלי חיים; לכן, אין אישור או מספר פרוטוקול זמין. המחקר כלל רק שיטות רבייה וגידול מבוססות, יחד עם איסוף דגימות צואה לא פולשניות. לא בוצעו הליכים פולשניים. בהתאם להנחיה 2010/63/האיחוד האירופי, העומס הצפוי על בעלי החיים הוערך כמתחת לסף הכאב, הסבל, המצוקה או הנזק המתמשך השווה או גבוה יותר מזה שנגרם מהחדרת מחט בהתאם לפרקטיקה וטרינרית טובה. כל בעלי החיים אוחסנו וטופלו בהתאם לסטנדרטים מוסדיים לרווחת בעלי חיים.

1. בניית הכלובים (ראו רשימת חומרים)

1. חתכו חלקים 1-4 מזכוכית פלקסיגלס/אקריליק בקוטר 5 מ"מ לפי התבניות המוצגות באיור 2A-C.
   הערה: ניתן להדפיס תבניות במידות מדויקות בפורמט DIN A3 (איור משלים 1 ואיור משלים 2).
2. חתכו את תחתית כלוב הפוליקרבונט סוג II (PTII) כפי שמוצג באיור 2D. חלק זה ישמש מאוחר יותר ככיסוי העליון של קופסאות איסוף הצואה.
3. קדחו את החורים והחריצים בתחתית לשעבר של כלוב PTII כפי שמצוין באיור 2D.
   הערה: המידות המדויקות מוצגות באיור המשלים 3.
4. קדחו חורים בצד הקדמי ובצד הקצר של כלוב PTIII כפי שמוצג באיור 2E.
   הערה: המידות המדויקות מוצגות באיור המשלים 4.
5. השתמש בחלק 2 כתבנית לסימון חורי הקידוח המתאימים בצד הקצר של כלוב PTIII ובצד הארוך של כלוב PTII.
6. קדח את החורים המסומנים וחבר את כלוב PTIII, כלוב PTII וחלק 2 באמצעות ברגים עם הברגים, כפי שמוצג באיור 2F.
7. הכנס את חלק 1 כתחתית כלוב PTII. מקמו את החלקים 4a ו-4b כך שיחזיקו את חלק 1 במקום ותחלקו את כלוב הדגימה לקופסאות איסוף נפרדות. השתמש באקדח הדבק החם כדי לקבע אותם במקומם.
8. החלק את הבליטות התחתונות של חלקים 4a ו-4b לתוך החריצים של חלק 1. בליטות אלו מהוות את רגלי קופסאות האיסוף.
9. החליק את הבליטות העליונות של חלקים 4a ו-4b דרך הכיסוי העליון, התחתון לשעבר של כלוב PTII, כדי להחזיק אותו במקום.
10. השחיל את מקלות האכילה או המוטות מעץ דרך החורים שבבליטות הבולטות, תוך שימוש במוט אחד למעלה ושני מוטות למטה, כדי לייצב ולתקן את הבנייה.
    הערה: חומרי עץ צריכים לשמש בוויואריום רק אם הם חד-פעמיים, שכן אינם ניתנים לניקוי. אם זה לא המצב, יש להשתמש במוטות עם הרכב חלופי.
11. סגור פערים שנותרו או טעויות קטנות באמצעות אקדח דבק חם. השתמשו בחלקים 3a, 3b ו-3c (איור 2B) כדלתות הזזה בין כלוב הבית לקופסאות האיסוף.
    הערה: ודאו שאין קצוות חדים, שאריות דבק או חומר בולט שנשארו נגישים לבעלי החיים. רכיבי זכוכית אקרילית/פלקסיגלס המשמשים באב-טיפוס זה אינם מתאימים לסטריליזציה באמצעות אוטוקלאב בקיטור. לכן, אם המערכת משמשת במתקני SPF הדורשים חומר סטרילי הקשור לכלוב, יש להשתמש בהליך חיטוי שאינו אוטוקלאב מאושר מוסדית, או שיש להחליף את רכיבי האקריליק בחומר אוטוקלבי תוך שמירה על אותם מידות.

2. הכנת בעלי חיים ומגורים

1. קבל את מספר העכברים הנדרש של הזן המתאים למחקר.
   הערה: הנתונים המייצגים התקבלו מ-30 עכברים בני שמונה שבועות מסוג C57BL/6J, שכללו 20 נקבות ו-10 זכרים. העכברים היו נטולי פתוגנים ספציפיים לפי תקני FELASA והתקבלו ממעבדות צ'ארלס ריבר, סולצפלד, גרמניה.
2. חיות בית בתנאים קונבנציונליים בכלובים מותאמים מסוג פוליקרבונט III עם מקסימום שלושה עכברים בוגרים בכל כלוב.
   הערה: זכרים מופרדים הוחזקו בכלובים סטנדרטיים מסוג פוליקרבונט מסוג II לצורך מחקר זה.
3. שמרו על חדר החיות בטמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 55 ± 10% במחזור אור/חושך של 12 שעות עם אורות דלוקים בשעה 6:00 בבוקר.
4. ספק תזונה סטנדרטית לתחזוקה ומתן מים בחופשיות.
5. הוסיפו מצעים מעץ אספן, גליל טואלט מנייר, בית פלסטיק אדום שקוף ומגבות נייר כחומר קינון לכל כלוב.
6. זהה עכברים בעיקר לפי סימני זנב טבעיים. יש להניח זמנית סימני עט על בעלי חיים עם סימני זנב דומים במהלך השקילה, במידת הצורך.

3. הרגל ואילוף בעלי החיים

הערה: הכלוב המושלם מורכב מכלוב ביתי, PTIII, שמחובר לכלוב דגימה עם שלוש תיבות איסוף נפרדות, PTII. הכלובים הביתיים יכולים לשמש כמו כלובים רגילים, עם מצעים, העשרת כלוב, מכסה מתכת ללא אטמים חיצוניים, ואספקת מזון ומים. המערכת ניתנת לפירוק לכביסה וניתן להשתמש בה רק במהלך שבועות הדגימה. במהלך שבועות ללא דגימה, ניתן לאחסן בעלי חיים בכלובים סטנדרטיים מסוג PTIII.

1. הניחו את החיות במערכת הכלובים לפחות שבועיים לפני סשן הדגימה המתוכנן הראשון.
2. התרגלו את החיות לתיבות האיסוף על ידי הסרת דלתות הזזה ללילה אחד, כדי לאפשר להן לחקור את הקופסאות בחופשיות.
3. בצע שלושה מפגשי הדרכה לפני סשן הדגימה הראשון. לקיים אימונים באותם תנאי אור ובאותה שעה ביום המתוכננת לדגימה מאוחרת יותר, רצוי תחת אור אדום זמן קצר לאחר תחילת שלב החושך.
4. מרחו כמות קטנה של תגמול, כמו קרם אגוזי לוז, חמאת בוטנים, משחת מאלט או אוכל טעים דומה, על הקיר שמול הכניסה של כל קופסת איסוף.
5. ביום האימון הראשון, השאירו את הדלתות פתוחות ואפשרו לחיות לגלות ולצרוך את הפרס מרצונם.
6. ביום האימון השני, חכו עד שחיה תיכנס לקופסת איסוף ותתחיל ללקק את הפרס. סגור בזהירות את דלת ההזזה מאחורי החיה ושחרר אותה אחרי 10 דקות.
7. ביום האימון השלישי, חוזרים על ההליך והאריכו בהדרגה את זמן שהחיות נשארות בקופסאות האיסוף.
   הערה: האימון צריך להיות רגוע ועקבי. הימנעו מרדיפה אחרי בעלי החיים לתוך הקופסאות, שכן זה עלול להגדיל את הלחץ ולהפחית את ההשתתפות הוולונטרית במפגשי דגימה מאוחרים יותר.

4. איסוף דגימות צואה

1. תזמון איסוף הדגימות
   1. תכננו את זמן הדגימה בהתאם לשאלה הביולוגית ולעיכוב הצפוי בין הפרשת קורטיקוסטרון בפלזמה למטבוליט קורטיקוסטרון בצואה. בעכברים, מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה בדרך כלל משקפים רמות גלוקוקורטיקואידים במחזור כ-8-10 שעות לפני הדגימה.
      הערה: אם תזמון מדויק הוא קריטי, בצע מחקר פיילוט כדי לקבוע את מהלך הזמן של הפרשת FCM בזן הספציפי, במין ובתנאים הניסיוניים הספציפיים. ניתן לשלב את הטייס הזה עם אימוני האימון.
   2. דגימת תזמון בתקופה של תפוקת צואה גבוהה. הדגימה בדרך כלל יעילה ביותר בתחילת שלב האפלה והפעיל.
   3. בצע את כל מפגשי הדגימה באותה שעה ביום במהלך המחקר כדי להפחית את השונות הנגרמת מהקצב היומי של רמות ה-FCM.
      הערה: מניסיוננו, אירועים המתרחשים בבוקר בסביבות 10:00 משתקפים היטב כאשר הדגימה מתקיימת בין 18:00 ל-20:00, בהתאם ללוח התאורה בחדר החיות.
2. הליך דגימה ועצות מעשיות
   1. סמן את החיות בנפרד לפני הדגימה. השתמש בסימני אוזניים או סימוני זנב בודדים.
      הערה: סימוני האצבעות וקודי הצבע עשויים להיות קשים לזיהוי בתוך הקופסאות תחת אור אדום.
   2. הכינו את קופסאות האיסוף במהלך שלב האור על ידי החלת הפרס על הקיר האחורי של כל קופסה.
      הערה: הכנת הקופסאות במהלך היום משפרת את הנראות עבור הניסוי ומאפשרת לבעלי החיים להריח את התגמול לפני הטעימה.
   3. בזמן הדגימה המתוכנן, פתחו את קופסאות האיסוף והמתינו עד שהחיות ייכנסו מרצונן.
   4. לאחר שעכבר נכנס לקופסת איסוף, סגרו בזהירות את דלת ההזזה מאחוריה.
   5. לאחר שכל בעלי החיים נכנסו לקופסה, רשמו את זהותו ומיקומו של כל עכבר בדף דגימה מוכן.
   6. אם נבדקים יותר מ-10 כלובים במפגש אחד, יש לשלב ניסוי נוסף לתמיכה בזיהוי בעלי חיים, טיפול בדלת ובתיעוד.
   7. שמרו את בעלי החיים בתיבות האיסוף למשך הדגימה המתוכננת, בדרך כלל בין 30 דקות לשעתיים, בהתאם לתפוקת הצואה הצפויה ולעיצוב המחקר.
      הערה: יש להוציא דגימות אם לא ניתן להקצות זהות אישית בוודאות, אם כדורי צואה מזוהמים בשתן, מצע או צואה מבעל חיים אחר, אם משך הדגימה חורג משמעותית מחלון הזמן המתוכנן, או אם כמות הצואה אינה מספקת לניתוח FCM.
      הערה: השימוש ב-50 מ"ג הוא הפרוטוקול הסטנדרטי שלנו, וכמות זו שימשה בכל הבדיקות ובכל שאר המאמרים ^5,7,8. בדרך כלל, ניתן להשיג אותו בקלות.
   8. בסיום תקופת הדגימה, פתחו את דלתות ההזזה ואפשרו לעכברים לחזור לכלוב הבית.
   9. סגור את תיבות האיסוף מיד לאחר שהעכברים עזבו כדי למנוע כניסה מחדש וזיהום הדגימות.
   10. הסר כדורי צואה מכל קופסת איסוף באמצעות מלקחיים ארוכים והעבר אותם לצינורות איסוף מסומנים בנפרד.
   11. אחסן דגימות בטמפרטורה של -20°C עד להכנה נוספת של מבחן FCM.
       הערה: אם הקופסאות סגורות היטב והעכברים אינם יכולים להיכנס אליהן מחדש, איסוף כדורי הצואה יכול להידחות לשלב האור הבא. עם זאת, יש לעשות זאת באופן עקבי בתוך מחקר.
   12. תשאיר את החיות בחלק הכלוב הביתי (PTIII) עד להחלפת הכלוב הבאה. לאחר מכן ניתן לפרק אותם ולשטוף אותם במכונת כביסה רגילה.

תוצאות

מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה (FCMs) נמדדו בהצלחה מדגימות שנאספו עם כלובי דגימות צואה מותאמים אישית במחקר אורך שהשווה עכברים שגדלו באופן קבוע או לסירוגין. ניתוח ה-FCM המייצג כלל 30 בעלי חיים: קבוצת קביעת קבע, n = 15 בעלי חיים ב-5 כלובים; קבוצה שגודלה לסירוגין, n = 10 בעלי חיים ב-5 כלובים, כאשר 5 זכרים שוהים לבד למעט 3 אירועי רבייה, בהם הם שוכנו יחד עם הנקבות. הדגימות נאספו ב-19 נקודות זמן דו-שבועיות בימי החלפת הכלוב וכן בסופי שבוע. הזמן הממוצע עד שרוב בעלי החיים נכנסו לקופסה היה 7.5 דקות (סך הכל = 3.07), כאשר רוב בעלי החיים היוו בממוצע 27.6 (SD = 1.44) עכברים מתוך 30 עכברים בסך הכל. כל העכברים נכנסו לתיבה לאחר ממוצע של 11.69 דקות (SD = 3.29). משך הכליאה הממוצע לכל העכברים היה 24.56 דקות (SD = 15.51), והזמן הממוצע מהעכבר הראשון שנכנס לקופסה ועד תחילת השחרור היה 43.14 דקות (SD = 8.51). משך השחרור הממוצע היה 14.86 דקות (SD = 22.82), ומשך ההליך הממוצע היה 68.00 דקות (SD = 11.87). מתוך 19 דגימות (3 ניסוי + 16 רגילות), ציפייה ל-480 דגימות, שתי דגימות היו חסרות כי העכברים לא עשו צרכים בזמן הכליאה, שלוש דגימות לא נאספו כי העכברים היו בהריון גבוה או זמן קצר לאחר הלידה, ו-5 עכברים נזקקו לתמיכה עדינה כדי להיכנס. המשקל הממוצע של הדגימות שנאספו משלושת הדגימות הראשונות היה 51.16 מ"ג (SD = 25.39). מתוך כלל הדגימות שנאספו (475), ניתן היה לנתח 473 והניבו תוצאות.

בעלי חיים בודדים נחשבו לשכפולים ביולוגיים. דגימות צואה חוזרות שנאספו מאותם בעלי חיים במהלך תקופת המחקר בת שמונה השבועות טופלו כמדידות אורכיות וחוזרות ולא כשכפולים ביולוגיים עצמאיים. הניתוח בוצע באמצעות מודל לינארי של השפעות מעורבות עם מין, קבוצת הרבייה, יום הדגימה ומספר העכברים בכל כלוב כאפקטים קבועים, וכלוב כהפרעה אקראית. האינטראקציות בין המין, קבוצת הרבייה ויום הדגימה נכללו במודל. מספר העכברים בכל כלוב נכלל כאפקט קבוע נוסף אך לא נבדק במונחי אינטראקציה, משום שמשתנה זה התבלבל חלקית עם עיצוב הניסוי, במיוחד בזכרים שגודלו לסירוגין.

המודל הראה השפעה ברורה של מין על ריכוזי FCM (איור 3A-D). לנקבות היו ריכוזי FCM גבוהים יותר מהזכרים לאורך תנאי רבייה וימי דגימה, הערכה = 28.30, SE = 2.58, t = 10.98, P < 0.0001. השוואות לאחר מכן אישרו את ההבדל המגדרי הזה בשתי קבוצות הרבייה ובשני ימי הדגימה. בבעלי חיים שגדלו באופן קבוע, לנקבות היו ריכוזי FCM גבוהים יותר מהזכרים בימי ראשון, הערכה = 53.41, SE = 8.28, P < 0.0001, ובימי רביעי, הערכה = 55.27, SE = 8.37, P < 0.0001. אותו דפוס נצפה בבעלי חיים שגודלו לסירוגין בימי ראשון, הערכה = 58.04, SE = 12.00, P < 0.0001, ובימי רביעי, הערכה = 59.68, SE = 9.88, P < 0.0001.

המודל גם הצביע על השפעה עיקרית משמעותית של קבוצת הרבייה, הערכה = 11.59, SE = 4.65, t = 2.49, P = 0.0227. עם זאת, השוואות פוסט-הוק שהותאמו על ידי טוקי לא הראו הבדלים משמעותיים בין בעלי חיים שגדלו באופן קבוע לבין בעלי חיים שגדלו לסירוגין בתוך שילובי המין/יום האישיים. אצל נקבות, בעלי חיים שגודלו קבוע או לסירוגין לא היו שונים משמעותית בימי ראשון, ההערכה = 24.51, SE = 12.20, P = 0.2085, או בימי רביעי, ההערכה = 17.31, SE = 12.20, P = 0.4950. באופן דומה, אצל זכרים לא זוהה הבדל משמעותי בקבוצות רבייה בימי ראשון, הערכה = 29.14, SE = 14.00, P = 0.1708, או בימי רביעי, הערכה = 21.72, SE = 13.30, P = 0.3682. ההשפעה העיקרית המשמעותית של קבוצת הרבייה צריכה להתפרש אפקט כולל ברמת המודל, בעוד שהשוואות הפוסט-הוק הספציפיות יותר שהותאמו על ידי טוקי בין המין וביום הדגימה לא זיהו הבדל זוגי חזק.

היעדר הבדל משמעותי בקבוצת הרבייה בין הזכרים חשוב במיוחד, שכן הזכרים תמיד היו גרים לבית יחיד בימי ראשון. לכן, ההשוואה ביום ראשון בזכרים מראה ששיטת הדגימה עצמה אינה מעלה את ריכוזי ה-FCM, לפחות בעכברים זכרים. כלובי הדגימה של הצואה שימשו גם למחקר נוסף שהשווה FCMs בעכברי שומרים מלוכלכים לבין ביקורת.⁹.

איור 1: סקירה של כלוב הדגימה המותאם אישית לצואה. מערכת הכלובים מאפשרת איסוף דגימות צואה מעכברים בודדים המאוחסנים בכלוב קבוצתי ללא טיפול ישיר במהלך הדגימה. (א) מערכת כלובים מורכבת במלואה הכוללת כלוב ביתי וכלוב דגימת צואה צמוד. (ב) מבט צד של כלוב הדגימה הצמוד. (ג) תצוגה עליונה המציגה את שלוש הכניסות הנפרדות לתיבות האיסוף האישיות. (ד) מבט מתוך כלוב הבית אל כניסות קופסאות הדגימה. (ה) כלוב דגימה פתוח, המאפשר גישה לתיבות האיסוף להסרת וניקוי כדורי צואה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: תכנית הבנייה והרכבה של כלוב הדגימה בצואה. (A-C) חלקי זכוכית אקרילית משמשים לבניית הרצפה, קירות הצד, דלתות הזזה והמחיצות של כלוב הדגימה. (ד) שינוי כלוב הפוליקרבונט מסוג II על ידי הסרת התחתית וקידוח חורים וחריצים לכיסוי תיבת האיסוף. (ה) שינוי כלוב הבית מפוליקרבונט מסוג III על ידי קידוח שלושה חורי כניסה בצד הקדמי. (ו) תצוגת צד סכמטית של מערכת הכלובים המורכבת, המציגה את כלוב הבית מפוליקרבונט מסוג III מחובר לכלוב הדגימה הפוליקרבונטי המותאם מסוג II ואת מיקום החלקים 1, 2 ו-4. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: נתוני FCM מייצגים שהתקבלו לאחר איסוף דגימות צואה באמצעות כלוב מותאם אישית. מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה (FCMs) נמדדו בדגימות צואה שנאספו בנפרד מעכברים שהוחזקו בקבוצה באמצעות כלוב דגימת צואה מותאם אישית. הערכים מוצגים על פני שמונה נקודות דגימה שבועיות לעכברים שגדלו באופן קבוע ומזדמן. הדגימות נאספו בימי החלפת כלוב או בסופי שבוע. נקודות וקווי חיבור מייצגים ממוצעים קבוצתיים בכל נקודת זמן. פסי שגיאה ורצועות מוצלות מציינים סטיית תקן ממוצעת ± (SD). (א) נקבות שנדגמו בימי החלפת כלוב. (ב) נקבות שנדגמו בסופי שבוע. (ג) זכרים שנדגמו בימי החלפת כלוב. (ד) זכרים שנבדקו בסופי שבוע. התרשים ממחיש שהשיטה הפיקה ריכוזי FCM מדידים בכל הקבוצות ונקודות הזמן. נקבות בדרך כלל הראו ריכוזי FCM גבוהים יותר מזכרים, בעוד שההבדלים בין קבוצות הרבייה היו פחות עקביים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: תבניות לרכיבי זכוכית אקרילית 1-3. תבניות לחיתוך חלקים 1, 2 ו-3a-c מזכוכית אקריליקה/פלקסיגלס 5 מ"מ לבניית כלוב הדגימה בצואה. חלק 1 משמש כתוספת התחתונה של כלוב פוליקרבונט סוג II שעבר שינוי בצורת הפחמן. חלק 2 משמש לחיבור כלוב הפוליקרבונט מסוג III לכלוב הפוליקרבונט סוג II ולסימון חורי קידוח מתאימים. חלקים 3a-c מהווים מחיצים/אלמנטים מבניים פנימיים של מערכת האיסוף. סימונים לבנים עגולים מציינים חורי אוויר, וסימונים קטנים יותר מציינים חורי בורג. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: תבניות לרכיבי זכוכית אקרילית 4a ו-4b. תבניות לחיתוך חלקים 4a ו-4b מזכוכית אקריליקה/פלקסיגלס 5 מ"מ. חלקים אלו מוכנסים לחלק 1 כדי להחזיק את התוספת התחתונה במקום ולחלק את כלוב הדגימה לקופסאות איסוף צואה נפרדות. הבליטות התחתונות יוצרות את רגלי תיבות האיסוף, בעוד שהבליטות העליונות עוברות דרך הכיסוי העליון ומקובעות באמצעות מוטות עץ או מקלות אכילה לייצוב המבנה. עיגולים לבנים מציינים פתחים למוטות או לחורי האוויר. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: שינוי כלוב פוליקרבונט מסוג II. תבנית סכמטית לשינוי כלוב פוליקרבונט מסוג II. תחתית הכלוב נחתכת כפי שמצוין ומשמשת מאוחר יותר ככיסוי העליון של קופסאות איסוף הצואה. חורים וחריצים נקדחים בחלק התחתון שהוסר כדי לאפשר הכנסה וקיבוע של חלקים 4a ו-4b. חורי בורג משמשים לחיבור כלוב פוליקרבונט סוג II, כלוב פוליקרבונט סוג III וחלק 2. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 4: שינוי חזית הכלוב מפוליקרבונט סוג III. תבנית סכמטית לקידוח הצד הקדמי של כלוב הפוליקרבונט מסוג III. שלושה פתחים עגולים נקדחים בצד הקצר של הכלוב כדי לאפשר גישה בין הכלוב הביתי לכלוב הדגימה בצואה. חורי בורג נוספים משמשים לקיבוע לחלק 2 ולכלוב הפוליקרבונט סוג II. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר מערכת כלוב פשוטה לאיסוף דגימות צואה שניתן להקציא בנפרד מעכברים הקבוצתיים. היתרון המרכזי של השיטה הוא שהיא משלבת ייחוס דגימה בודדת עם שמירה על היבטים מרכזיים של דיור חברתי, במיוחד מגע חזותי וריחני עם בני הכלוב. זה רלוונטי כי דיור קבוצתי נדרש לעיתים קרובות לרווחת בעלי חיים ויכול להיות גם חלק מתכנון הניסוי¹⁰. בניגוד לדגימה משותפת בכלוב ביתי, המערכת מאפשרת להקצות ערכי FCM לבעלי חיים בודדים, תוך הימנעות משהייה ממושכת של מגורים בודדים לפני או במהלך איסוף הדגימות.

גישות נפוצות לאיסוף דגימות צואה בעכברי מעבדה כוללות דגימה משותפת בכלוב ביתי, מגורים זמניים בכלובים נקיים, כלובים מטבוליים, ואיסוף ישיר לאחר טיפול או העברה. דגימות כלוב ביתי מאוחדות קלות להשגה, לא פולשניות, זולות ותואמות לדגימה מקבילה של כלובים רבים, אך אינן מאפשרות שיוך אישי בבעלי חיים הקבוצתיים. מגורים זמניים לפרטים או העברה לכלובים נקיים מאפשרים הקצאת דגימה אישית, אך מסירים את בעלי החיים מהקבוצה החברתית שלהם ועלולים לגרום ללחץ חריף עקב טיפול, חידוש או הפרדה חברתית. זה רלוונטי במיוחד לניתוח FCM, שכן מדדים הקשורים לקורטיקוסטרון רגישים ללחץ הנגרם על ידי הליך הדגימה עצמו¹¹. כלובים מטבוליים מספקים איסוף דגימות מבוקר ומאפשרים הפרדה בין צואה לשתן, אך הם דורשים ציוד מיוחד, פחות תואמים לטיפול שגרתי, ובדרך כלל כוללים מגורים אישיים. איסוף מבוסס טיפול ישיר יכול גם לספק דגימות הניתנות לייחוס אישי, אך דורש טיפול חוזר או מניפולציה של בעלי החיים ולכן עשוי להשפיע על קריאות הקשורות ללחץ.

בהשוואה לגישות הקיימות הללו, המערכת הנוכחית תוכננה כשיפור תואם למגורים קבוצתיים לדגימת צואה אישית חוזרת, לא פולשנית. לאחר ההרגל והאימון, העכברים נכנסים לתיבות הדגימה מרצונם בתגובה לפרס קטן של מזון. לכן ניתן לאסוף דגימות ללא רדיפה, טיפול או העברה כפויה לכלוב נפרד. אין לפרש את המערכת כמוכחת כמשפרת רווחה או הפחתת לחץ במובן ניסויי קפדני, משום שצעדי רווחה ישירים לא נכללו במחקר הנוכחי. עם זאת, היא נועדה להפחית את מידת ההפרדה החברתית במהלך איסוף המדגימות ולכן עשויה להיות פחות מפריעה משיטות איסוף אישיות מסורתיות. בנוסף, ניתן לדגום מספר בעלי חיים וכמה כלובים במקביל, מה שמסייע לאחיד חלון הדגימה, דבר חשוב כי ריכוזי ה-FCM תלויים בקצב הצירקדי ומשקפים הפרשת גלוקוקורטיקואידים כמה שעות לפני הדגימה ^5,12.

התוצאות המייצגות מראות שהמערכת מתאימה לאיסוף דגימות צואה שניתן לנתח ריכוזי FCM. ריכוזי FCM ניתנים למדידה הושגו בין קבוצות ונקודות זמן, והשיטה זיהתה את ההבדל הצפוי הברור בין המין, עם ריכוזים גבוהים יותר של FCM אצל נקבות מאשר אצל גברים. המחקר כלל גם השוואה פנימית לדיור יחיד קונבנציונלי בגברים. בימי ראשון, זכרים בקבוצת הרבייה לסירוגין היו חד-ביתיים, בעוד שזכרים שגודלו קבוע נבדקו באמצעות מערכת האיסוף החדשה. ריכוזי ה-FCM לא היו שונים משמעותית בין קבוצות אלו בימי ראשון. דבר זה מצביע על כך שכניסה מרצון לכלוב הדגימה והשהות הקצרה בתיבת האיסוף לא העלו משמעותית את ריכוזי ה-FCM בהשוואה לאיסוף מגורים בודדים קונבנציונליים. עם זאת, השוואה זו הייתה מוגבלת לגברים ולא נועדה כמחקר ייעודי לשוויון או לאימות חצי-אוברים. מחקרים נוספים צריכים להשוות את המערכת לגישות מגורים אישיות או כלוב מטבולי מבוססות בתנאים ניסיוניים מאוזנים ולכלול מדדים התנהגותיים של לחץ חריפה במהלך הדגימה.

מעבר להערכת מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה, המערכת עשויה להיות שימושית גם ליישומים נוספים הדורשים איסוף זמני של דגימות צואה בודדות. יישומים פוטנציאליים כוללים בדיקות פרזיטולוגיות, ניתוחי מיקרוביוטה, מחקרי עיכול או בדיקות ביומרקרים צואתיים אחרות. עם שינויים טכניים קלים, ניתן להתאים את המערכת גם לאיסוף שתן, למשל על ידי הוספת רצפה מחוררת ומגש איסוף מתאים מתחת לחיה. ביישומים אלו, האפשרות לשמור על קרבה לבני כלוב במהלך איסוף דגימות עשויה להיות יתרון לעומת גישות קונבנציונליות של מגורים בודדים או כלוב מטבולי. עם זאת, יש לאמת את התאמת המערכת לכל סוג דגימה ספציפי ולכל ניתוח במורד הזרם, במיוחד כאשר זיהום, נפח דגימה, זמן איסוף או תנאי אחסון הם קריטיים.

באופן כללי, יש להרגל את החיות לקופסאות לפני סשן הדגימה הראשון, סימונים בודדים חייבים להיות גלויים בבירור תחת תנאי התאורה בהם משתמשים, ויש לבצע דגימה באותו זמן ביום במהלך המחקר. יש להוציא דגימות אם זהות הפרט אינה ודאית, אם הכדורים מזוהמים, אם משך הדגימה שונה משמעותית מחלון הזמן המתוכנן, או אם החומר הצואתי אינו מספיק לניתוח¹³. מספר גורמים מעשיים עשויים להשפיע על היישום של מערכת הדגימה, כולל היררכיות דומיננטיות, אינטראקציות אגרסיביות, שונות במוטיבציה למזון, הבדלי זן, וירידה בניידות או שינוי התנהגות בבעלי חיים שמנים, מבוגרים, בהריון, לאחר לידה או בשיניים אחרים. עם זאת, בקבוצה הנוכחית, הכניסה הוולונטרית והצלחת הדגימה הייתה גבוהה. מתוך 480 דגימות רגילות צפויות, שתיים נעדרו משום שהעכברים לא עשו צרכים במהלך הכליאה, ושלוש לא יכלו להיאסף כי בעלי החיים היו בהריון גבוה או זמן קצר לאחר הלידה. כך נאספו 475 דגימות, מתוכן 473 הניבו תוצאות ניתנות לניתוח. נתונים אלה מצביעים על כך שסירוב להיכנס לקופסאות ואי קבלת דגימות היו נדירים בתנאים בהם נעשה שימוש במחקר זה. עם זאת, ייתכן שיידרשו התאמות נוספות או התאמות פרוטוקוליות לזנים אחרים, קבוצות גדולות יותר או בעלי חיים עם תנועה משתנה, מצב גוף, מצב בריאותי או התנהגות חברתית משופרת. מגבלות נוספות הן שהשיטה דורשת הכשרה ומיועדת כיום לקבוצות קטנות של שלושה עכברים, ושרכיבי זכוכית אקרילית/פלקסיגלס אינם ניתנים לאוטוקלב בקיטור.

הכלוב זול, קל לבנייה מחומר כלוב סטנדרטי וזכוכית אקרילית, ואינו דורש רכיבים אלקטרוניים. העיצוב שלו מאפשר פירוק, ניקוי ושילוב בשגרות החלפת כלובים רגילות, מה שהופך אותו למתאים לדגימה חוזרת לאורך זמן. בסך הכול, המערכת מייצגת גישה מעשית ותואמת לדיור קבוצתי לדגימת צואה לא פולשנית וניתנת להקצאה אישית בעכברים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Drill bit 5 mm	Craftomat	22380487	5mm diameter; Quantity 1
Drill bits 60 mm	Bosch	32064647	60 mm diameter; Quantity 1
Drill bits 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm diameter; Quantity 1
Drilling machine	Makita	25730054	Standard handheld or bench drill; Quantity 1
Hot glue gun	Einhell	29051207	For cage assembly; Quantity 1
Hot glue sticks	Einhell	29049664	Compatible with hot glue gun; Quantity 5-10
Makrolon cage	Animalab	31200129	Standard Type II cage; Quantity 1
Makrolon cage	Animalab	31200256	Standard Type III cage; Quantity 1
Plexiglass / acrylic glass	Bauhaus	29122352	Approx. 0.25 m² total; 5 mm thickness; Quantity  2DIN A3 sheets
Saw or milling device	Scheppach	32079641	Small band saw, jigsaw, or CNC mill; Quantity 1
Threaded screws	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Quantity 4
Wooden chopsticks / rods	Ikea	903.429.71	Round wooden rods; Quantity 3