הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

איסוף דגימות צואה התואמות למגורים קבוצתיים בהתנדבות בעכברים באמצעות מערכת כלוב מותאמת אישית

184 צפיות

DOI:

10.3791/72280

7 באוגוסט 2026

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מערכת כלוב מותאמת אישית לאיסוף דגימות צואה וולונטרי, ידידותי לרווחה, סימולטני ואישי מעכברים שמאוחסנים בקבוצה.

תקציר

מדידה אמינה של מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה דורשת דגימות צואה שניתן להקצות לבעלי חיים בודדים ולאסוף בתוך חלון זמן מוגדר. זה מאתגר בעכברים הקבוצתיים, שבהם דגימות הכלוב המאוחדות אינן מאפשרות הקצאה אישית, והפרדה זמנית עלולה להפריע לרווחת בעלי החיים ולתוצאות המחקר. מטרת הפרוטוקול היא להציג מערכת כלוב פשוטה וזולה שמאפשרת איסוף דגימות צואה וולונטרי, סימולטני ואישי מעכברים שמאוחסנים בקבוצה. המערכת מורכבת מכלוב ביתי מפוליקרבונט עם קצה חוט, המחובר לשלושה קופסאות איסוף נפרדות. לאחר ההרגל והאימון, העכברים נכנסים מרצון לקופסאות כדי לקבל פרס מזון קטן. ניתן לסגור את הדלתות ללא מרדף, טיפול או העברה בכפייה. כדורי צואה נאספים מכל קופסה בנפרד, מה שמאפשר להקצות דגימות לבעלי חיים בודדים תוך שמירה על דיור חברתי מחוץ לתקופת הדגימה. פרוטוקול זה תומך בדגימה אורכת לא פולשנית ומתאים למחקרים המודדים מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה או סמנים ביולוגיים אחרים בצואה. העיצוב קל לבנייה מחומר כלוב סטנדרטי וזכוכית אקרילית, ניתן לפרק אותו לניקוי, ומאפשר לדגום מספר כלובים במקביל. על ידי הפחתת הפרעות הקשורות לטיפול ושיפור הסטנדרטיזציה של חלון הדגימה, השיטה מספקת שיפור מעשי לניטור אנדוקריני בעכברים הקבוצתיים.

מבוא

אתגר מרכזי בהערכת ריכוזי הקורטיקוסטרון בפלזמה הוא שתהליך הדגימה עצמו עלול לגרום לעלייה חריפה בקורטיקוסטרון, ובכך לבלבל את המדידה ואולי להשפיע על פרשנות תוצאות המחקר 1,2,3. מדידת מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה (FCMs) מספקת אלטרנטיבה לא פולשנית, שכן ריכוזי FCM משקפים רמות גלוקוקורטיקואידים בסירקולציה מספר שעות לפני הדגימה, בהתאם למין, זן, מין וזמן מעבר במעי 4,5. עם זאת, ניתוח FCM אמין בעכברים שהובאו בקבוצה נותר מאתגר. דגימות צואה מאוחדות שנאספו מהכלוב הביתי אינן ניתנות לשיוך לבעלי חיים בודדים ועלולות להראות שונות גבוהה בשל הבדלים בין-אישיים בהפרשת גלוקוקורטיקואידים ואי-ודאות בחלון הדגימה המדויק. הפרדת בעלי חיים לפרקי זמן ממושכים עלולה להפריע למטרות המחקר, בעוד שהפרדה קצרה לאיסוף דגימות בודדת היא דורשת עבודה רבה, מגבילה את קצב התפוקה, ועלולה לגרום ללחץ2.

כדי לאפשר איסוף דגימות צואה בודדות מעכברים שהוחזקו בקבוצה עם טיפול מינימלי, פותח כלוב איסוף צואה מותאם אישית (איור 1A-E). העיצוב הותאם מכלוב איסוף צואה שתואר קודם לכן לעכברים קוצניים6 והותאם לשימוש בעכברי מעבדה. המערכת מורכבת מכלוב פוליקרבונט סטנדרטי מסוג III המחובר לשלושה תיבות איסוף נפרדות, אליהן החיות יכולות לגשת מרצון ולסגור אותן באמצעות דלתות הזזה. מערכת זו מאפשרת איסוף דגימות צואה מעכברים בודדים ללא טיפול ישיר במהלך תקופת הדגימה ומאפשרת דגימה סימולטנית של מספר בעלי חיים. לכן, הכלוב מספק גישה מעשית לדגימת FCM לא פולשנית ומיוחסת באופן אישי בעכברים הקבוצתיים.

הפרוטוקול הבא מתאר מערכת דגימת צואה המאפשרת איסוף וזיהוי דגימות צואה מעכברים בודדים תוך שמירה על סביבה קבוצתית, תוך שימוש בכלובים מותאמים אישית לדגימת צואה ללא מגע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ועדת האתיקה האחראית על בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של וינה התייעצה לפני ביצוע המחקר והוסבר כי אין צורך ברישיון פורמלי לניסויים בבעלי חיים; לכן, אין אישור או מספר פרוטוקול זמין. המחקר כלל רק שיטות רבייה וגידול מבוססות, יחד עם איסוף דגימות צואה לא פולשניות. לא בוצעו הליכים פולשניים. בהתאם להנחיה 2010/63/האיחוד האירופי, העומס הצפוי על בעלי החיים הוערך כמתחת לסף הכאב, הסבל, המצוקה או הנזק המתמשך השווה או גבוה יותר מזה שנגרם מהחדרת מחט בהתאם לפרקטיקה וטרינרית טובה. כל בעלי החיים אוחסנו וטופלו בהתאם לסטנדרטים מוסדיים לרווחת בעלי חיים.

1. בניית הכלובים (ראו רשימת חומרים)

  1. חתכו חלקים 1-4 מזכוכית פלקסיגלס/אקריליק בקוטר 5 מ"מ לפי התבניות המוצגות באיור 2A-C.
    הערה: ניתן להדפיס תבניות במידות מדויקות בפורמט DIN A3 (איור משלים 1 ואיור משלים 2).
  2. חתכו את תחתית כלוב הפוליקרבונט סוג II (PTII) כפי שמוצג באיור 2D. חלק זה ישמש מאוחר יותר ככיסוי העליון של קופסאות איסוף הצואה.
  3. קדחו את החורים והחריצים בתחתית לשעבר של כלוב PTII כפי שמצוין באיור 2D.
    הערה: המידות המדויקות מוצגות באיור המשלים 3.
  4. קדחו חורים בצד הקדמי ובצד הקצר של כלוב PTIII כפי שמוצג באיור 2E.
    הערה: המידות המדויקות מוצגות באיור המשלים 4.
  5. השתמש בחלק 2 כתבנית לסימון חורי הקידוח המתאימים בצד הקצר של כלוב PTIII ובצד הארוך של כלוב PTII.
  6. קדח את החורים המסומנים וחבר את כלוב PTIII, כלוב PTII וחלק 2 באמצעות ברגים עם הברגים, כפי שמוצג באיור 2F.
  7. הכנס את חלק 1 כתחתית כלוב PTII. מקמו את החלקים 4a ו-4b כך שיחזיקו את חלק 1 במקום ותחלקו את כלוב הדגימה לקופסאות איסוף נפרדות. השתמש באקדח הדבק החם כדי לקבע אותם במקומם.
  8. החלק את הבליטות התחתונות של חלקים 4a ו-4b לתוך החריצים של חלק 1. בליטות אלו מהוות את רגלי קופסאות האיסוף.
  9. החליק את הבליטות העליונות של חלקים 4a ו-4b דרך הכיסוי העליון, התחתון לשעבר של כלוב PTII, כדי להחזיק אותו במקום.
  10. השחיל את מקלות האכילה או המוטות מעץ דרך החורים שבבליטות הבולטות, תוך שימוש במוט אחד למעלה ושני מוטות למטה, כדי לייצב ולתקן את הבנייה.
    הערה: חומרי עץ צריכים לשמש בוויואריום רק אם הם חד-פעמיים, שכן אינם ניתנים לניקוי. אם זה לא המצב, יש להשתמש במוטות עם הרכב חלופי.
  11. סגור פערים שנותרו או טעויות קטנות באמצעות אקדח דבק חם. השתמשו בחלקים 3a, 3b ו-3c (איור 2B) כדלתות הזזה בין כלוב הבית לקופסאות האיסוף.
    הערה: ודאו שאין קצוות חדים, שאריות דבק או חומר בולט שנשארו נגישים לבעלי החיים. רכיבי זכוכית אקרילית/פלקסיגלס המשמשים באב-טיפוס זה אינם מתאימים לסטריליזציה באמצעות אוטוקלאב בקיטור. לכן, אם המערכת משמשת במתקני SPF הדורשים חומר סטרילי הקשור לכלוב, יש להשתמש בהליך חיטוי שאינו אוטוקלאב מאושר מוסדית, או שיש להחליף את רכיבי האקריליק בחומר אוטוקלבי תוך שמירה על אותם מידות.

2. הכנת בעלי חיים ומגורים

  1. קבל את מספר העכברים הנדרש של הזן המתאים למחקר.
    הערה: הנתונים המייצגים התקבלו מ-30 עכברים בני שמונה שבועות מסוג C57BL/6J, שכללו 20 נקבות ו-10 זכרים. העכברים היו נטולי פתוגנים ספציפיים לפי תקני FELASA והתקבלו ממעבדות צ'ארלס ריבר, סולצפלד, גרמניה.
  2. חיות בית בתנאים קונבנציונליים בכלובים מותאמים מסוג פוליקרבונט III עם מקסימום שלושה עכברים בוגרים בכל כלוב.
    הערה: זכרים מופרדים הוחזקו בכלובים סטנדרטיים מסוג פוליקרבונט מסוג II לצורך מחקר זה.
  3. שמרו על חדר החיות בטמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 55 ± 10% במחזור אור/חושך של 12 שעות עם אורות דלוקים בשעה 6:00 בבוקר.
  4. ספק תזונה סטנדרטית לתחזוקה ומתן מים בחופשיות.
  5. הוסיפו מצעים מעץ אספן, גליל טואלט מנייר, בית פלסטיק אדום שקוף ומגבות נייר כחומר קינון לכל כלוב.
  6. זהה עכברים בעיקר לפי סימני זנב טבעיים. יש להניח זמנית סימני עט על בעלי חיים עם סימני זנב דומים במהלך השקילה, במידת הצורך.

3. הרגל ואילוף בעלי החיים

הערה: הכלוב המושלם מורכב מכלוב ביתי, PTIII, שמחובר לכלוב דגימה עם שלוש תיבות איסוף נפרדות, PTII. הכלובים הביתיים יכולים לשמש כמו כלובים רגילים, עם מצעים, העשרת כלוב, מכסה מתכת ללא אטמים חיצוניים, ואספקת מזון ומים. המערכת ניתנת לפירוק לכביסה וניתן להשתמש בה רק במהלך שבועות הדגימה. במהלך שבועות ללא דגימה, ניתן לאחסן בעלי חיים בכלובים סטנדרטיים מסוג PTIII.

  1. הניחו את החיות במערכת הכלובים לפחות שבועיים לפני סשן הדגימה המתוכנן הראשון.
  2. התרגלו את החיות לתיבות האיסוף על ידי הסרת דלתות הזזה ללילה אחד, כדי לאפשר להן לחקור את הקופסאות בחופשיות.
  3. בצע שלושה מפגשי הדרכה לפני סשן הדגימה הראשון. לקיים אימונים באותם תנאי אור ובאותה שעה ביום המתוכננת לדגימה מאוחרת יותר, רצוי תחת אור אדום זמן קצר לאחר תחילת שלב החושך.
  4. מרחו כמות קטנה של תגמול, כמו קרם אגוזי לוז, חמאת בוטנים, משחת מאלט או אוכל טעים דומה, על הקיר שמול הכניסה של כל קופסת איסוף.
  5. ביום האימון הראשון, השאירו את הדלתות פתוחות ואפשרו לחיות לגלות ולצרוך את הפרס מרצונם.
  6. ביום האימון השני, חכו עד שחיה תיכנס לקופסת איסוף ותתחיל ללקק את הפרס. סגור בזהירות את דלת ההזזה מאחורי החיה ושחרר אותה אחרי 10 דקות.
  7. ביום האימון השלישי, חוזרים על ההליך והאריכו בהדרגה את זמן שהחיות נשארות בקופסאות האיסוף.
    הערה: האימון צריך להיות רגוע ועקבי. הימנעו מרדיפה אחרי בעלי החיים לתוך הקופסאות, שכן זה עלול להגדיל את הלחץ ולהפחית את ההשתתפות הוולונטרית במפגשי דגימה מאוחרים יותר.

4. איסוף דגימות צואה

  1. תזמון איסוף הדגימות
    1. תכננו את זמן הדגימה בהתאם לשאלה הביולוגית ולעיכוב הצפוי בין הפרשת קורטיקוסטרון בפלזמה למטבוליט קורטיקוסטרון בצואה. בעכברים, מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה בדרך כלל משקפים רמות גלוקוקורטיקואידים במחזור כ-8-10 שעות לפני הדגימה.
      הערה: אם תזמון מדויק הוא קריטי, בצע מחקר פיילוט כדי לקבוע את מהלך הזמן של הפרשת FCM בזן הספציפי, במין ובתנאים הניסיוניים הספציפיים. ניתן לשלב את הטייס הזה עם אימוני האימון.
    2. דגימת תזמון בתקופה של תפוקת צואה גבוהה. הדגימה בדרך כלל יעילה ביותר בתחילת שלב האפלה והפעיל.
    3. בצע את כל מפגשי הדגימה באותה שעה ביום במהלך המחקר כדי להפחית את השונות הנגרמת מהקצב היומי של רמות ה-FCM.
      הערה: מניסיוננו, אירועים המתרחשים בבוקר בסביבות 10:00 משתקפים היטב כאשר הדגימה מתקיימת בין 18:00 ל-20:00, בהתאם ללוח התאורה בחדר החיות.
  2. הליך דגימה ועצות מעשיות
    1. סמן את החיות בנפרד לפני הדגימה. השתמש בסימני אוזניים או סימוני זנב בודדים.
      הערה: סימוני האצבעות וקודי הצבע עשויים להיות קשים לזיהוי בתוך הקופסאות תחת אור אדום.
    2. הכינו את קופסאות האיסוף במהלך שלב האור על ידי החלת הפרס על הקיר האחורי של כל קופסה.
      הערה: הכנת הקופסאות במהלך היום משפרת את הנראות עבור הניסוי ומאפשרת לבעלי החיים להריח את התגמול לפני הטעימה.
    3. בזמן הדגימה המתוכנן, פתחו את קופסאות האיסוף והמתינו עד שהחיות ייכנסו מרצונן.
    4. לאחר שעכבר נכנס לקופסת איסוף, סגרו בזהירות את דלת ההזזה מאחוריה.
    5. לאחר שכל בעלי החיים נכנסו לקופסה, רשמו את זהותו ומיקומו של כל עכבר בדף דגימה מוכן.
    6. אם נבדקים יותר מ-10 כלובים במפגש אחד, יש לשלב ניסוי נוסף לתמיכה בזיהוי בעלי חיים, טיפול בדלת ובתיעוד.
    7. שמרו את בעלי החיים בתיבות האיסוף למשך הדגימה המתוכננת, בדרך כלל בין 30 דקות לשעתיים, בהתאם לתפוקת הצואה הצפויה ולעיצוב המחקר.
      הערה: יש להוציא דגימות אם לא ניתן להקצות זהות אישית בוודאות, אם כדורי צואה מזוהמים בשתן, מצע או צואה מבעל חיים אחר, אם משך הדגימה חורג משמעותית מחלון הזמן המתוכנן, או אם כמות הצואה אינה מספקת לניתוח FCM.
      הערה: השימוש ב-50 מ"ג הוא הפרוטוקול הסטנדרטי שלנו, וכמות זו שימשה בכל הבדיקות ובכל שאר המאמרים 5,7,8. בדרך כלל, ניתן להשיג אותו בקלות.
    8. בסיום תקופת הדגימה, פתחו את דלתות ההזזה ואפשרו לעכברים לחזור לכלוב הבית.
    9. סגור את תיבות האיסוף מיד לאחר שהעכברים עזבו כדי למנוע כניסה מחדש וזיהום הדגימות.
    10. הסר כדורי צואה מכל קופסת איסוף באמצעות מלקחיים ארוכים והעבר אותם לצינורות איסוף מסומנים בנפרד.
    11. אחסן דגימות בטמפרטורה של -20°C עד להכנה נוספת של מבחן FCM.
      הערה: אם הקופסאות סגורות היטב והעכברים אינם יכולים להיכנס אליהן מחדש, איסוף כדורי הצואה יכול להידחות לשלב האור הבא. עם זאת, יש לעשות זאת באופן עקבי בתוך מחקר.
    12. תשאיר את החיות בחלק הכלוב הביתי (PTIII) עד להחלפת הכלוב הבאה. לאחר מכן ניתן לפרק אותם ולשטוף אותם במכונת כביסה רגילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואה (FCMs) נמדדו בהצלחה מדגימות שנאספו עם כלובי דגימות צואה מותאמים אישית במחקר אורך שהשווה עכברים שגדלו באופן קבוע או לסירוגין. ניתוח ה-FCM המייצג כלל 30 בעלי חיים: קבוצת קביעת קבע, n = 15 בעלי חיים ב-5 כלובים; קבוצה שגודלה לסירוגין, n = 10 בעלי חיים ב-5 כלובים, כאשר 5 זכרים שוהים לבד למעט 3 אירועי רבייה, בהם הם שוכנו יחד עם הנקבות. הדגימות נאספו ב-19 נקודות זמן דו-שבועיות בימי החלפת הכלוב וכן בסופי שבוע. הזמן הממוצע עד שרוב בעלי החיים נכנסו לקופסה היה 7.5 דק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר מערכת כלוב פשוטה לאיסוף דגימות צואה שניתן להקציא בנפרד מעכברים הקבוצתיים. היתרון המרכזי של השיטה הוא שהיא משלבת ייחוס דגימה בודדת עם שמירה על היבטים מרכזיים של דיור חברתי, במיוחד מגע חזותי וריחני עם בני הכלוב. זה רלוונטי כי דיור קבוצתי נדרש לעיתים קרובות לרווחת בעלי חיים ויכול להיות גם חלק מתכנון הניסוי10. בניגוד לדגימה משותפת בכלוב ביתי, המערכת מאפשרת להקצות ערכי FCM לבעלי חיים בודדים, תוך הימנעות משהייה ממושכת של מגורים בודדים לפני או במהלך איסו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו מודים לפרופ' פולאק על תמיכתו בפרסום מאמר זה.

קתרינה טילמן מודה בהכרת תודה על תמיכתו של סבה המנוח, ברונו ווכנר, שבגיל 99 תרם לתכנון מערכת הכלובים, הפך את סדנת העץ שלו לזמינה וסייע בשיוף ובבנייה. ההתלהבות שלו ממלאכת יד ובנייה הייתה מקור השראה מתמשך, והיא זכורה כאן בהכרת תודה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Drill bit 5 mmCraftomat223804875mm diameter; Quantity 1
Drill bits 60 mmBosch3206464760 mm diameter; Quantity 1
Drill bits 7 mmCraftomat223805207 mm diameter; Quantity 1
Drilling machineMakita25730054Standard handheld or bench drill; Quantity 1
Hot glue gunEinhell 29051207For cage assembly; Quantity 1
Hot glue sticksEinhell29049664Compatible with hot glue gun; Quantity 5-10
Makrolon cageAnimalab31200129Standard Type II cage; Quantity 1
Makrolon cageAnimalab31200256Standard Type III cage; Quantity 1
Plexiglass / acrylic glassBauhaus29122352Approx. 0.25 m² total; 5 mm thickness; Quantity  2DIN A3 sheets
Saw or milling deviceScheppach32079641Small band saw, jigsaw, or CNC mill; Quantity 1
Threaded screwsProfi Depot1080753320 mm × 3 mm; Quantity 4
Wooden chopsticks / rodsIkea903.429.71Round wooden rods; Quantity 3

מקורות

  1. Abelson KS, Adem B, Royo F, Carlsson HE, Hau J. High plasma corticosterone levels persist during frequent automatic blood sampling in rats. In vivo (Athens, Greece) 2005; 19(5): 815-819.
  2. Kim S, Foong D, Cooper MS, Seibel MJ, Zhou H. Comparison of blood sampling methods for plasma corticosterone measurements in mice associated with minimal stress-related artefacts. Steroids 2018; 135: 69-72.
  3. Teilmann AC, Kalliokoski O, Sorensen DB, Hau J, Abelson KS. Manual versus automated blood sampling: impact of repeated blood sampling on stress parameters and behavior in male NMRI mice. Lab Anim 2014; 48(4): 278-291.
  4. Thanos PK, Cavigelli SA, Michaelides M, Olvet DM, Patel U, Diep MN et al. A non-invasive method for detecting the metabolic stress response in rodents: characterization and disruption of the circadian corticosterone rhythm. Physiological research 2009; 58(2): 219-228.
  5. Touma C, Sachser N, Möstl E, Palme R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and Comparative Endocrinology 2003; 130(3): 267-278.
  6. Frynta D, Nováková M, Kutalová H, Palme R, Sedláček F. Apparatus for Collection of Fecal Samples from Undisturbed Spiny Mice (Acomys cahirinus) Living in a Complex Social Group. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS 2009; 48(2): 196-201.
  7. Meyer N, Kroger M, Thummler J, Tietze L, Palme R, Touma C. Impact of three commonly used blood sampling techniques on the welfare of laboratory mice: Taking the animal's perspective. PLoS One 2020; 15(9): e0238895.
  8. Touma C, Palme R, Sachser N. Analyzing corticosterone metabolites in fecal samples of mice: a noninvasive technique to monitor stress hormones. Hormones and Behavior 2004; 45(1): 10-22.
  9. Müller K, Lengheimer T, Kral-Pointner JB, Wojta J, Yeghiazaryan L, Krall C et al. Exposure to soiled bedding reduces abnormal repetitive behaviors in mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience 2022; 16.
  10. Cinque C, Zinni M, Zuena AR, Giuli C, Alemà SG, Catalani A et al. Faecal corticosterone metabolite assessment in socially housed male and female Wistar rats. Endocrine connections 2018; 7(2): 250-257.
  11. Palme R. Monitoring stress hormone metabolites as a useful, non-invasive tool for welfare assessment in farm animals. Animal Welfare 2012; 21(3): 331-337.
  12. Kalliokoski O, Jacobsen KR, Teilmann AC, Hau J, Abelson KSP. Quantitative Effects of Diet on Fecal Corticosterone Metabolites in Two Strains of Laboratory Mice. In vivo (Athens, Greece) 2012; 26(2): 213.
  13. Rowland NE, Toth LA. Analytic and Interpretational Pitfalls to Measuring Fecal Corticosterone Metabolites in Laboratory Rats and Mice. Comparative medicine 2019; 69(5): 337-349.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

התנהגותגיליון 234גיליון 234ערך ריקגיליוןכלוב לדגימת צואהמטבוליטים של קורטיקוסטרון בצואהעכבררווחת בעלי חייםדגימה אינדיבידואליתהפחתת סטרס

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב