הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

זיהוי גנים מרכזיים (Hub Genes) הקשורים להזדקנות ולמיטוכונדריה בקרדיומיופתיה מדורגית (Dilated Cardiomyopathy)

55 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72286

⸱

25 באוגוסט 2026

1Henan University of Chinese Medicine, 2The Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה משלב נתונים טרנסקריפטומיים רב-ממדיים עם למידת מכונה כדי לזהות גנים הקשורים להזדקנות ולמיטוכונדריה בקרדיומיופתיה מדורגית (dilated cardiomyopathy), לצורך גילוי סמנים ביולוגיים וסיווג לתת-סוגים מולקולריים.

תקציר

קרדיומיופתיה מורחבת (DCM) מאופיינת בהרחבה של החדר השמאלי ובתפקוד סיסטולי לקוי, והיא קשורה לתפקוד מיטוכונדריאלי לקוי ולהפעלה אימונו-דלקתית. עם זאת, חתימות מולקולריות הקשורות להזדקנות ומסלולי בקרה מיטוכונדריאליים ב-DCM עדיין אינם מובנים במלואם. מחקר זה ניתח שישה מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים (bulk transcriptomic) ומאגר נתונים אחד של ריצוף RNA של תא בודד (single-cell RNA sequencing) מתוך מאגר הנתונים Gene Expression Omnibus. לאחר נורמליזציה של הנתונים, תיקון אפקטים של סדרות (batch correction) ואנוטציה של סוגי תאים, זוהו גנים מועמדים הקשורים להזדקנות ולמיטוכונדריה באמצעות ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, ניתוח רשתות ביטוי משותף משוקלל של גנים (WGCNA) ובניית רשת אינטראקציות חלבון-חלבון. גנים מרכזיים סוננו עוד יותר באמצעות רגרסיית LASSO (least absolute shrinkage and selection operator), יער אקראי (random forest) וביטול תכונות רקורסיבי של מכונת וקטורים תומכים (SVM-RFE). ניתוחים של חדירת תאי חיסון, תקשורת בין-תאית ותתי-סוגים מולקולריים בוצעו כדי לאפיין את המיקרו-סביבה החיסונית של הלב ב-DCM. סך של 66 גנים הקשורים להזדקנות ו-16 גנים הקשורים למיטוכונדריה נמצאו קשורים ל-DCM, והם היו מועשרים בעיקר במסלולי סיגנל של hypoxia-inducible factor-1, פוספורילציה חמצונית ומסלולים הקשורים ל-nitric oxide synthase. ניתוחי למידת מכונה וריצוף RNA של תא בודד זיהו את SERPINE1, TGFB2, CYBB ו-TLR2 כגנים מרכזיים. CYBB ו-TLR2 ביטו ביטוי גבוה במונוציטים ובמקרופגים, בעוד ש-SERPINE1 ו-TGFB2 ביטאו ביטוי בעיקר בתאי סטורמה. ניתוח של נוף החיסון הראה עלייה בהפעלת מקרופגים פרו-דלקתיים ותקשורת בין-תאית משתנה בדגימות DCM. בהתבסס על ביטוי הגנים המרכזיים, דגימות DCM חולקו לשני תתי-סוגים מולקולריים הקשורים לסיגנל של vascular endothelial growth factor ולביו-סינתזה של חומצות מרה ראשוניות, בהתאמה. פרוטוקול זה מספק מסגרת אינטגרטיבית לזיהוי סמנים ביולוגיים מועמדים ותתי-סוגים מולקולריים ב-DCM.

מבוא

קרדיומיופתיה מורחבת (DCM) היא הפרעה של השריר הלבבי המאופיינת בהרחבה של החדר השמאלי ובליקוי בתפקוד הסיסטולי. זוהי הסיבה השלישית בשכיחותה לאי-ספיקת לב והאינדיקציה המובילה להשתלת לב ברחבי העולם1. מחקרים מבוססי אוכלוסייה מעריכים שכיחות של כ-1 מתוך 250 מבוגרים, עם שכיחות גבוהה יותר בגברים ושיעור ניכר של מקרים המיוחסים לווריאנטים מונוגניים2. ממצאים אלו מעידים כי הן רגישות גנטית והן גורמים סביבתיים תורמים להיווצרותה ולהחמרתה של DCM.

הפתוגנזה של DCM כוללת תהליכים השזורים זה בזה, הכוללים הפעלה דלקתית, עקה חמצונית, אפופטוזיס של קרדיומיוציטים ואותות פרו-פיברוטיים לא מווסתים. פולימורפיזמים גנטיים דלקתיים, כולל וריאנטים של מקדם tumor necrosis factor-α, נקשרו לרגישות ל-DCM ויראלי3. עקה חמצונית מוגברת נקשרה אף היא למות קרדיומיוציטים ולליקוי בתפקוד החדר השמאלי בסוגי DCM אנושיים4. בנוסף, הפעלה חריגה של אותות Wnt/β-catenin ו-calcineurin/nuclear factor of activated T cells מקדמת היפרטרופיה של השריר הלבבי ופיברוזיס אינטרסטיציאלי, ובכך תורמת להתקדמות המחלה5,6. תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי הוא מרכיב חשוב נוסף ב-DCM כיוון שלקרדיומיוציטים יש דרישות אנרגיה גבוהות. שיבוש בביוגנזה מיטוכונדריאלית, בהומאוסטזיס של סידן, במיטופאגיה ובשלמות ה-DNA המיטוכונדריאלי עלול לפגוע בפוספורילציה חמצונית ולתרום לליקוי תפקודי לב הדרגתי7,8,9,10.

למרות ממצאים מכניסטיים אלה, נותרו פערי ידע משמעותיים. בפרט, הקשרים הזמניים והסיבתיים בין עיצוב מחדש של המבנה המיטוכונדריאלי לבין תפקוד ביואנרגטי לקוי במהלך התחלה והתקדמות של DCM טרם הוגדרו במלואם11. מספר אסטרטגיות טיפוליות נבחנו. טיפול בתאי גזע הראה פוטנציאל רגנרטיבי באמצעות השפעות פראקריניות, ציטופרוטקטיביות ואימונו-מודולטוריות, אך נדרשת אופטימיזציה של מקורות התאים, נתיבי ההחדרה והישרדות לאחר השתלה12. גישות של טיפול גנטי, הכוללות החדרה מבוססת נגיף adeno-associated ועריכה גנומית מבוססת clustered regularly interspaced short palindromic repeats, מציעות גם הן אסטרטגיות לטיפול מדויק. עם זאת, מגבלות הקשורות לטרופיזם קרדיאלי, אימונוגניות של הווקטור ובטיחות לטווח ארוך נותרו ללא פתרון13.

מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים ציבוריים ממאגרים כגון ה-Gene Expression Omnibus (GEO) נמצאים בשימוש נרחב לגילוי סמנים ביולוגיים ב-DCM. משאבים אלו מספקים גישה לקוהורטות קליניות רב-מרכזיות, תומכים במחקרים חסכוניים וניתנים לשחזור, ויכולים לשפר את העוצמה הסטטיסטית באמצעות אינטגרציה של מספר מאגרי נתונים14. פרופיל טרנסקריפטומי מאפשר גם סריקה של גנים מועמדים ברמה הגנומית, סיווג לתת-סוגים מולקולריים וניתוח ברמת מסלולים ביולוגיים15. עם זאת, למאגרי נתונים ציבוריים יש מגבלות מובנות, הכוללות השפעות של אצוות טכניות (batch effects), הטרוגניות קלינית ואטיולוגית, יכולת מוגבלת להסקה סיבתית, ומידע לונגיטודיני או פרוגנוסטי חסר16. לכן, ממצאים המופקים ממאגרי נתונים טרנסקריפטומיים ציבוריים מתאימים ביותר להצבת היפותזות ולתיעדוף סמנים ביולוגיים מועמדים, ודורשים תיקוף בקוהורטות עצמאיות ובמודלים ניסיוניים.

מחקרים ביואינפורמטיים רבים של DCM מסתמכים בעיקר על ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, שעלול להניב ממצאים של חיוביים שגויים ואינו מאפיין באופן מלא רשתות של ביטוי גנים משותף או הטרוגניות תאית בתוך רקמת הלב. כדי להתגבר על מגבלות אלו, המחקר הנוכחי השתמש באסטרטגיה אנליטית אינטגרטיבית המשלבת שיטות משלימות. ניתוח טרנסקריפטומי של אוכלוסיית תאים (Bulk transcriptomic analysis) מספק פרופילים של ביטוי ברמת הרקמה המתאימים להשוואות בין קבוצת ביקורת לקבוצת מחלה. ניתוח רשת של ביטוי גנים משותף משוקלל (WGCNA) מזהה מודולים של גנים הקשורים למאפיינים פנוטיפיים ומאפשר תיעדוף של קבוצות גנים הקשורות תפקודית, במקום גנים בודדים בעלי ביטוי דיפרנציאלי. ניתוח רשת של אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI) מזהה גנים בעלי קישוריות גבוהה על בסיס טופולוגיית הרשת. שלושה אלגוריתמים של למידת מכונה—רגרסיית LASSO (least absolute shrinkage and selection operator), יער אקראי (random forest), ומכונת וקטורים תומכים עם סילוק תכונות רקורסיבי (support vector machine-recursive feature elimination)—שימשו לזיהוי ביומרקרים מועמדים על פני מערכי הנתונים המשולבים¹⁷. לאחר מכן, נעשה שימוש בריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq) כדי לבחון דפוסי ביטוי ספציפיים לסוג התא ורשתות תקשורת בין-תאיות18.

למרות שדיספונקציה מיטוכונדריאלית ושינויים מולקולריים הקשורים להזדקנות נחקרו כל אחד בנפרד ב-DCM, הקשרים המשולבים שלהם עם שינויים תעתוקיים הקשורים למחלה נותרו בלתי נחקרים דיו. המחקר הנוכחי שילב מספר מערכי נתונים של bulk transcriptomic ו-scRNA-seq כדי לזהות גני-צומת (hub genes) הקשורים להזדקנות ולמיטוכונדריה ב-DCM, לאפיין את המיקרו-סביבה החיסונית של הלב, ולבחון תת-סוגים מולקולריים על בסיס הגנים שזוהו. גישה משולבת זו שימשה לתיעדוף של ביומרקרים מועמדים ולספק בסיס למחקרי מנגנונים ותיקוף עוקבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים נסקרו ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים במעבדה של בית החולים המסופח השני של אוניברסיטת הרפואה הסינית בהנאן (מספר אישור HNSZYYYJS2023011150). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות לבדיקה אתית של רווחת בעלי חיים במעבדה (GB/T 35892-2018) ובהתאם לעקרונות ה-3R של Replacement (החלפה), Reduction (צמצום) ו-Refinement (שיפור). הרכיבים, מאגרי המידע, התוכנות והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים ב- טבלת חומרים. 

1. משאבי נתונים וחומרים ניסיוניים
עכברי CTNTR141W טרנסגניים זכרים בדרגת SPF, בעלי פנוטיפ של קרדיומיופתיה התרחבותית (DCM) ספונטנית ומשקל גוף של 25 ± 2 g, שימשו כקבוצת המודל. עכברי C57BL/6J זכרים בדרגת SPF, בעלי גיל תואם ומשקל גוף של 25 ± 2 g, שימשו כקבוצת הביקורת. כל קבוצה כללה 12 עכברים. כל בעלי החיים הושגו ממוסדות המחזיקים ברישיונות תקפים להפקת חיות מעבדה, ושוכנו בסביבת מחסום בדרגת SPF בטמפרטורה של 22 ± 2 °C ובלחות יחסית של 40%–60% תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית למזון ומים סטריליים. לאחר שבוע אחד של אקלימטציה, כל העכברים הוחזקו תחת אותם תנאים למשך 4 שבועות נוספים לפני הערכת תפקוד הלב ואיסוף דגימות. כל העכברים היו בני 6–8 שבועות בתחילת הניסוי. העכברים הורדמו עמוקות והורגו באמצעות פריקה צווארית.

שבעה מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים ציבוריים של רקמת שריר לב מהחדר השמאלי של חולים עם DCM נשלפו ממאגר הנתונים Gene Expression Omnibus (GEO)19. מאגרי נתונים אלו כללו שישה מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים מסוג bulk ומאגר נתונים אחד של ריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq), GSE145154. הן פרקציות חיוביות ל-CD45 והן פרקציות שליליות ל-CD45 נכללו בניתוח. שתי פרקציות התאים, החיוביות והשליליות ל-CD45, אוחדו לפני ביצוע ה-clustering. זהות הדגימה שימשה כמשתנה ה-batch העיקרי עבור אינטגרציית Harmony. דגימות של חדר שמאלי נורמלי וחדר שמאלי עם DCM מתוך GSE145154 נכללו, ובמיוחד GSM4307515, GSM4307516, GSM4307520 ו-GSM4307521. מאגרי הנתונים ששימשו במחקר זה היו GSE145154, GSE5406, GSE42955, GSE57338, GSE79962, GSE116250 ו-GSE141910. כל הדגימות שאינן DCM הוצאו, ורק דגימות ביקורת (קבוצת Control) ודגימות DCM (קבוצת DCM) נשמרו. אף דגימה לא הוסרה לאחר בקרת איכות. מידע על הדגימות ממאגרי ה-GEO שנכללו מסוכם כך: GSE5406 הכיל 102 דגימות (16 ביקורת ו-86 דגימות DCM); GSE42955 הכיל 17 דגימות (5 ביקורת ו-12 דגימות DCM); GSE57338 הכיל 231 דגימות (136 ביקורת ו-95 דגימות DCM); GSE79962 הכיל 20 דגימות (11 ביקורת ו-9 דגימות DCM); GSE116250 הכיל 51 דגימות (14 ביקורת ו-37 דגימות DCM); ו-GSE141910 הכיל 322 דגימות (161 ביקורת ו-161 דגימות DCM).

2. עיבוד מקדים של נתוני טרנסקריפטום מסוג bulk
מטריצות ביטוי גולמיות וקבצי אנוטציה קלינית עבור ששת מאגרי הנתונים מסוג bulk הורדו באמצעות חבילת GEOquery20. קבצי CEL גולמיים נשלפו עבור מאגרי נתוני המיקרו-מערך (microarray) של Affymetrix, ומטריצות ספירה גולמיות נשלפו עבור מאגרי נתוני ה-RNA-seq. תיקון רקע, נורמליזציית קוונטילים וחישוב ביטוי עבור נתוני המיקרו-מערך בוצעו באמצעות אלגוריתם ה-robust multi-array average המיושם בחבילת affy21.

נתוני הספירה של RNA-seq נורמלו באמצעות שיטת trimmed mean of M-values בחבילת edgeR22 והומרו לערכי counts per million שעברו טרנספורמציית log₂. מזהי הגששים (probes) הומרו לסמלי גנים רשמיים באמצעות קובצי אנוטציה ספציפיים לפלטפורמה. כאשר מספר גששים מופו לאותו גן, חושב ערך הביטוי הממוצע.

השפעות אלומה (batch effects) טכניות בין מערכי נתונים הוסרו באמצעות אלגוריתם ComBat בחבילת sva23. מקור מערך הנתונים ופלטפורמת הזיהוי הוגדרו כגורמי אלומה (batch factors). ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) בוצע לפני ואחרי תיקון האלומה כדי להעריך את יעילות ההסרה של השפעות האלומה.

3. עיבוד מקדים של נתוני טרנסקריפטום של תא בודד ואנוטציה של תאים
מטריצת ביטוי הגנים מ-GSE145154 יובאה ל-Seurat כדי לבנות אובייקט Seurat באמצעות Seurat גרסה 524. תאים באיכות נמוכה הוצאו מהניתוח על פי הסף הבא: 200–6,000 גנים מזוהים לתא, ספירה כוללת של מזהים מולקולריים ייחודיים (UMI) הגבוהה מ-500, ואחוז גנים מיטוכונדריאליים נמוך מ-25%. תאים שחרגו מספי סף בקרת האיכות הללו הוצאו כמרכיבים באיכות נמוכה או כתאים קרועים. הסרנו תאים באיכות נמוכה אך ורק על בסיס ספי בקרת האיכות שתיארו לעיל.

נורמליזציה לוגריתמית בוצעה באמצעות פונקציית NormalizeData עם מקדם קנה מידה של 10,000. 3,000 הגנים בעלי השונות הגבוהה ביותר נבחרו באמצעות פונקציית FindVariableFeatures עם שיטת vst. הנתונים עברו סקלינג באמצעות ScaleData, ולאחריו בוצע ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) להפחתת מימדיות ליניארית.

אפקטים של סדרות (Batch effects) תוקנו באמצעות אלגוריתם Harmony25 דרך הפונקציה RunHarmony, כאשר זהות הדגימה הוגדרה כמשתנה הקיבוץ. 15 הרכיבים הראשיים הראשונים שימשו למקבץ תאים באמצעות הפונקציות FindNeighbors ו-FindClusters. המקבץ בוצע באמצעות אלגוריתם Leiden ברזולוציה של 0.15. הפחתת ממדים לא ליניארית וויזואליזציה בוצעו באמצעות שיטת uniform manifold approximation and projection.

סוגי התאים סווגו באמצעות גני סימון קנוניים יחד עם סיווג אוטומטי באמצעות חבילת SingleR26. גני הסימון היו כדלקמן: לתאי B, הגנים IGKC, MS4A1 ו-CD79A; לתאי שריר לב (cardiomyocytes), הגנים TNNI3, MYL2 ו-ACTC1; לתאי אנדותל, הגנים VWF, PECAM1 ו-EGFL7; למקרופאגים, הגנים C1QC, C1QB ו-C1QA; למונוציטים, הגנים S100A8, S100A9 ו-G0S2; לתאי NK (natural killer cells), הגנים NKG7, GNLY ו-CCL5; לתאי שריר חלק, הגנים MYL9, TAGLN ו-ACTA2; לתאי סטרומה, הגנים FBLN1, LUM ו-DCN; ולתאי T, הגנים CD3E, CD3G ו-CD3D.

4. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי ודירוג העשרה של קבוצות גנים
מודל ליניארי נבנה באמצעות חבילת limma27 כדי להשוות את ביטוי הגנים בין קבוצת ה-DCM לקבוצת הביקורת הבריאה. גנים עם P value < 0.05 ושינוי מקפלת (fold change) מוחלט הגדול מ-1.5, המקביל ל-log₂ fold change מוחלט הגדול מ-0.58, הוגדרו כבעלי ביטוי דיפרנציאלי מובהק.

ניתוח העשרה של קבוצות גנים עבור דגימה בודדת (Single-sample gene set enrichment analysis) בוצע כדי לחשב ציוני העשרה עבור קבוצות גנים הקשורות להזדקנות ולקטבונים בכל דגימה28. הבדלים בציוני ההעשרה בין קבוצת ה-DCM לקבוצת הביקורת הבריאה הוערכו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum, כאשר ערך P value < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית.

ברמת התא הבודד, חישובי ציוני מודול הקשור להזדקנות ומודול מיטוכונדריאלי בוצעו באמצעות פונקציית AddModuleScore ב-Seurat. הבדלים בציוני המודולים בין הקבוצות הוערכו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum.

חתימות גנים הקשורות להזדקנות נשלפו ממאגר הנתונים CellAge (https://genomics.senescence.info/cells/), ומערכי גנים הקשורים למיטוכונדריה התקבלו מ-GeneCards (https://www.genecards.org/). רשימות הגנים המלאות ששימשו לדירוג מופיעות ב- קובץ משלים 1.

5. בניית רשת ביטוי גנים משותף משוקללת
עבור בניית הרשת, נשמרו 5000 הגנים המקודדים לחלבון עם שונות הביטוי הגבוהה ביותר בנתוני הטרנסקריפטומיקה הגולמיים (bulk transcriptomic data). פונקציית pickSoftThreshold הופעלה כדי לחשב את מדד התאמה לטופולוגיה נטולת-סולם (scale-free topology fit index) תחת מספר הספקים של חזקות סף-רכות (soft-thresholding powers). הסף האופטימלי נקבע כחזקה המינימלית המניבה רשת נטולת-סולם עם ערך R2 הגבוה מ-0.9. בהתאם לכך, נבחרה חזקת סף-רכה של β = 5 עבור ניתוח הרשת בהמשך.

רשת ביטוי-משותף שקולה בעלת סימן (signed weighted co-expression network) נבנתה באמצעות הפונקציה blockwiseModules עם גודל מודול מינימלי של 30. מקדמי מתאם פירסון חושבו בין כל eigengene של מודול לבין מדד העשירה הקשור להזדקנות או למיטוכונדריה. מודולים בעלי מקדם מתאם מוחלט הגבוה מ-0.4 ו-P < 0.001 נחשבו כמודולים בעלי קשר מובהק.

ביצעו חיתוך בין גנים בתוך מודולים בעלי קשר מובהק לבין גנים עם ביטוי Differentially Expressed, במטרה לזהות גנים מועמדים להזדקנות הקשורה ל-DCM וגנים מועמדים למיטוכונדריה הקשורה ל-DCM.

6. ניתוח העשרה תפקודי
ניתוחים של העשרה תפקודית, כולל ניתוחי Gene Ontology (GO) ומסלולי Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), בוצעו עבור הגנים המועמדים באמצעות חבילת clusterProfiler29. העשרת GO כיסתה שלוש קטגוריות סטנדרטיות: תהליך ביולוגי, רכיב תאי ותפקוד מולקולרי.

כל הניתוחים בוצעו עם אנוטציה של מין אדם, שימוש בשיעור התגליות השגויות (FDR) לצורך תיקון של ערכי P, וסף q-value של 0.05. קבוצות הגנים הוגבלו לטווח גודל של 10–500 גנים, ומונחים עם FDR < 0.05 הוגדרו כבעלי מובהקות סטטיסטית. לבסוף, תוצאות העשרה של GO הוצגו באמצעות תרשימי עמודות מקובצים, בעוד שתוצאות העשרה של KEGG הוצגו באמצעות תרשימי בועות.

7. בניית רשת PPI וסריקת גני מפתח (hub genes)
גנים מועמדים הוכנסו למסד הנתונים STRING גרסה 11.530, כאשר האורגניזם הוגדר כ-Homo sapiens וסף הביטחון לאינטראקציה הוגדר כציון משולב הגבוה מ-0.7. צמתים מנותקים הוסתרו, ונתוני האינטראקציה יוצאו בפורמט של ערכים מופרדים בטאבים (TSV).

נתוני האינטראקציה יובאו לתוכנת Cytoscape גרסה 3.9.1 לצורך ויזואליזציה31. ציונים טופולוגיים של צמתים חושבו באמצעות תוסף CytoHubba32 עם שלושה אלגוריתמים: Degree, maximum neighborhood component, ו-maximal clique centrality.

מודולים פונקציונליים מרכזיים בתוך הרשת זוהו באמצעות תוסף ה-MCODE33 עם פרמטרי ברירת המחדל הבאים: סף דרגה (degree cutoff), 2; k-core, 2; סף ציון צומת (node score cutoff), 0.2; ועומק מרבי, 100. גנים שדורגו בין 10 המובילים על ידי שלושת האלגוריתמים הטופולוגיים הועברו להצלבה עם גנים בתת-הרשת הליבתית של MCODE כדי לזהות את הגנים המהווים את מוקדי (hubs) האינטראקציה הסופיים בין חלבונים.

8. בחירת גנים מרכזיים ובניית מודל אבחנתי מבוססי למידת מכונה
כדי להבטיח הדירות וייצוג מאוזן, מאגר הנתונים המשולב של הטרנסקריפטומיקה ב-bulk פולח באופן אקראי למערכות אימון ותיקוף ביחס של 7:3 באמצעות גרעין אקראי קבוע (seed = 123456). פילוח זה בוצע באופן שכובתי לפי קבוצת המחלה (DCM לעומת ביקורת) כדי לשמור על פרופורציות מחלקות עקביות בשתי המערכות. לפני הפילוח, תוקנו אפקטים של אצוות (batch effects) ממקורות נתונים שונים באמצעות חבילת ה-sva, והדגימות המשולבות טופלו כקוהורט מאוחד במהלך ההקצאה האקראית.

שלושה אלגוריתמים של למידת מכונה יושמו לסריקת גנים מועמדים. ראשית, בוצעה רגרסיה לוגיסטית מסוג LASSO באמצעות הפונקציה cv.glmnet בחבילת glmnet34נבנה מודל סיווג בינארי בשיטת אימות צולב של 5 קיפולים (5-fold cross-validation), כאשר מדד ה-AUC אומץ כמדד ההערכה. גנים בעלי מקדמים שאינם אפס בערך lambda.min נשמרו כגנים מועמדים.

שנית, נבנה מודל סיווג של יער אקראי (random forest) עם 500 עצי החלטה באמצעות חבילת randomForest35. מספר המשתנים שנדגמו עבור כל פיצול נקבע לשורש הריבועי של מספר המאפיינים הכולל. חשיבות הגנים כומתה על בסיס מקדם ג'יני (Gini coefficient), ועשרת הגנים בעלי ציוני החשיבות הגבוהים ביותר נשמרו.

שלישית, ניתוח SVM-RFE בוצע באמצעות פונקציית rfe בחבילת caret36. מספר התכונות נקבע בטווח של 1–10, ולאימון המודל אומצה וולידציה צולבת של 5-fold. לבסוף נבחרה תת-קבוצת הגנים בעלת הדיוק האופטימלי בוולידציה הצולבת.

גנים שזוהו על ידי כל שלושת האלגוריתמים הוגדרו כגני הליבה הסופיים הקשורים להזדקנות ולמיטוכונדריה ב-DCM. לאחר מכן נבנו מודלים אבחנתיים באמצעות 10 אלגוריתמי סיווג: עץ החלטה (decision tree), gradient boosting machine, boosted generalized linear model, k-nearest neighbors, רגרסיה לוגיסטית, רשת עצבית, ריבועים פחותים חלקיים (partial least squares), יער אקראי (random forest), support vector machine ו-extreme gradient boosting.

עקומות מאפייני תפעול של מקלט (Receiver operating characteristic curves) הופקו באמצעות חבילת pROC37. השטח תחת העקומה, הדיוק, הרגישות והסגוליות חושבו כדי להעריך את הביצועים האבחנתיים בקבוצות האימון והתיקוף.

ניתוח SHapley Additive exPlanations בוצע כדי לחשב את התרומה של כל גן ליבה לתחזיות המודל38. נוצרו תרשימי סיכום ותרשימי מפל (waterfall plots) לכל דגימה. מודל אבחוני סופי עם שטח תחת העקומה הגבוה מ-0.8 בסט validaion נחשב בעל ביצועי אבחון טובים.

9. הסקת תקשורת בין-תאית
רשתות תקשורת בין-תאית במיקרו-סביבה הלבבית הוסקו באמצעות חבילת התוכנה CellChat39. אובייקט CellChat נבנה באמצעות מסד הנתונים CellChatDB.human. ליגנדים וקולטנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי זוהו באמצעות identifyOverExpressedGenes, וזוגות אינטראקציה משמעותיים סוננו באמצעות identifyOverExpressedInteractions.

הסתברויות תקשורת בין סוגי תאים חושבו באמצעות computeCommunProb. רשת התקשורת הגלובלית ברמת סוג התא רוכזה באמצעות aggregateNet. מספר האינטראקציות ועוצמת התקשורת בין כל זוג של סוגי תאים נמדדו והוצגו חזותית באמצעות מפות חום (heatmaps) ותרשימי עמודות.

10. כימות חדירת תאי מערכת החיסון
ציוני העשרה עבור 28 סוגי תאי מערכת החיסון חושבו עבור כל דגימת bulk באמצעות ניתוח העשרת קבוצות גנים של דגימה בודדת (single-sample gene set enrichment analysis)28 ומערכת גנים המהווה חתימה של תאי מערכת החיסון40. מבחן Wilcoxon rank-sum שימש להשוואת ציוני העשרת תאי מערכת החיסון בין קבוצת ה-DCM לקבוצת הביקורת הבריאה. ערך של P < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

ניתוח מתאם פירסון בוצע כדי להעריך את הקשר בין רמות הביטוי של הגנים המרכזיים לבין ציוני העשרה של תאי מערכת החיסון. כל המתאמים עם P < 0.05 נחשבו למשמעותיים מבחינה סטטיסטית.

11. קיבץ קונסנזוס (Consensus clustering) עבור סיווג סוב-טיפים מולקולריים
ביצוע קיבץ קונסנזוס לא מודרך של דגימות DCM בוצע באמצעות פרופילי ביטוי של גנים מרכזיים באמצעות חבילת ConsensusClusterPlus41. פרמטרי הקיבץ נקבעו למספר מקסימלי של 6 אשכולות, 1000 איטרציות של דגימה חוזרת (resampling), ופרופורציית דגימה חוזרת של 0.8. לצורך הקיבץ אומצה שיטת Partitioning around medoids עם מרחק אוקלידי, ונעשה שימוש ב-seed אקראי קבוע כדי להבטיח שחזוריות.

מספר תתי-הסוגים האופטימלי נקבע בהתאם לתרשים delta area ולציוני יציבות של אשכולות קונסנזוס (consensus cluster stability scores), כאשר בסופו של דבר זוהה K = 2. בנוסף, בוצע ניתוח רכיבים ראשיים (Principal component analysis) כדי לאמת את ההפרדה המובחנת בין שני תתי-הסוגים המולקולריים.

ניתוח שונות של קבוצות גנים (Gene set variation analysis)42 הוחל כדי לחשב מדדי העשרה של נתיבי KEGG ספציפיים לדגימה. חבילת ה-limma27 שימשה לזיהוי הפעלת נתיבים דיפרנציאלית בין תתי-סוגים, וערך P נמוך מ-0.05 הוגדר כבעל מובהקות סטטיסטית.

12. הערכה אקו-קרדיוגרפית של תפקוד הלב
העכברים הורדמו באמצעות הזרקה תוך-peritoneאלית (intraperitoneal) של סודיום פנטוברביטאל 1% (30 מ"ג/ק"ג), וקיבוע בתנוחת שכיבה על הגב על שולחן ניתוחים תרמוסטטי. לאחר הסרת שיער מהחזה, נמרח באופן אחיד ג'ל צימוד לאולטרסאונד באזור הפרקורדיאלי (precordial).

בדיקת אקו-קרדיוגרפיה במצב M בהנחיה דו-ממדית בוצעה בגובה השרירים הפפילריים של החדר השמאלי באמצעות מערכת אולטרסאונד לבעלי חיים קטנים. נרשמו שלושה מחזורי לב רציפים ויציבים כדי למדוד את הקוטר הדיאסטולי הסופי של החדר השמאלי, הקוטר הסיסטולי הסופי, מקדם הפליטה (ejection fraction) והקיצור הפרקציונלי (fractional shortening). כל הערכות האקו-קרדיוגרפיה בוצעו באופן סמיים על ידי טכנאי אולטרסאונד מוסמך.

שלושה עכברים נבחרו באופן אקראי מכל קבוצה לבדיקת אקו-לב, ו-6 בעלי חיים אלו בסך הכל נשחטו לאחר מכן לצורך איסוף רקמת שריר לב ומדידת ELISA. שאר בעלי החיים הניסויים עברו בדיקות מעבדה מקבילות נוספות, ונתוניהם לא נכללו במחקר הנוכחי.

13. איסוף רקמת שריר הלב, מיצוי חלבון ובדיקת ELISA (ספיחה חיסונית מקושרת לאנזים)
לאחר הערכה אקו-קרדיוגרפית, העכברים הורדמו עמוק והורגו בהמתה הומנית. רקמות הלב נשלו במהירות באמצעות thoracotomy חציונית, ושריר הלב של החדר השמאלי נחתך על קרח. הרקמות המבודדות נשטפו ביסודיות בתמיסת phosphate‑buffered saline קרה כדי להסיר דם תוך-לבי שנותר. לאחר ספיגת עודפי נוזלים בעזרת נייר סינון סטרילי, הדגימות הוקפאו מיד בהקפאה מהירה (snap‑frozen) בחנקן נוזלי ואוחסנו בטמפרטורה של −80 °C לצורך מיצוי חלבון בהמשך, תוך הימנעות קפדנית ממחזורי הפשרה והקפאה חוזרים.

רקמות שריר לב קפואות נשקלו ונחתכו על קרח למקטעים של כ-1 mm3. הרקמות עברו ליזיס בבופר ליזיס RIPA קר, המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז, ביחס סטנדרטי של 100 µL בופר ל-10 mg רקמה. הדגימות עברו הומוגניזציה מכנית מלאה על קרח והובאו לדגירה למשך 30 min להשגת ליזיס תאי מלא.

את הליזטים סבבנו בצנטריפוגה במהירות של 12,000 × g למשך 15 min בטמפרטורה של 4 °C. את העליונות שהתקבלו אספנו למבחנות נקיות מאנזימים, ואת ריכוז החלבון הכולל כימתנו באמצעות ערכה לבדיקת חלבון מסוג bicinchoninic acid, בהתאם לפרוטוקולי היצרן. את כל הדגימות נורמלנו לריכוז חלבון זהה באמצעות באפר ליזיס.

רמות הביטוי של החלבונים של ארבעת הגנים המרכזיים (hub genes) בליזאטים של שריר הלב נמדדו באמצעות ערכות ELISA (enzyme‑linked immunosorbent assay) המתאימות. סטנדרטים בדילול סדרתי וליזאטים של רקמה מנורמלים הוספו בשכפולים (100 µL לבאר) למיקרו-פלטות מצופות מראש. הפלטות דגרו במשך 2 h בטמפרטורת החדר ונשטפו ביסודיות עם בופר השטיפה שסופק בערכה.

לכל באער הוסף נוגדן מצומד לאנזים והוא דגר במשך 1 h בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בוצע שטיפה יסודית. לאחר מכן הוסף תמיסת כרומוגן של סובסטרט, והפלטות דגרו במשך 20 min בטמפרטורת החדר בחושך. תגובת הצבע הופסקה באמצעות תמיסת עצירה, וערכי הבליעה נמדדו ב-450 nm (אורך גל ייחוס: 570 nm) באמצעות קורא מיקרו-פלטות רב-אורכי גל.

14. ניתוח סטטיסטי
כל הניתוחים הסטטיסטיים והדמיונים הוויזואליים של הנתונים בוצעו באמצעות R גרסה 4.2.3. עבור מדידות ריכוז ב-ELISA של כל גן מטרה (TGFB2, SERPINE1, CYBB, TLR2), הוחל תחילה מבחן Shapiro-Wilk כדי להעריך את נורמליות הנתונים בקבוצת הביקורת ובקבוצת ה-DCM בנפרד. לאחר מכן, נעשה שימוש במבחן F כדי להעריך את הומוגניות השונויות בין שתי הקבוצות. שיטת ההשוואה בין הקבוצות נקבעה בהתאם לתוצאות מבחן הומוגניות השונות: אם השונויות היו הומוגניות (P ≥ 0.05), נבחר מבחן t של Student למדגמים בלתי תלויים להשוואת ערכי הממוצע בין הקבוצות; אם השונויות היו הטרוגניות (P < 0.05), נעשה שימוש במבחן t של Welch המתוקן לצורך הניתוח. כל המבחנים היו דו-זנביים, וסף המובהקות הסטטיסטית נקבע על P < 0.05. הנתונים הוצגו כתרשימי קופסה (boxplots) עליהם ה superimposed נקודות נתונים אינדיבידואליות מפוזרות (jittered). ערכי ה-P של כל המבחנים וסוג מבחן ה-t שיושם צוינו בפירוט על כל תרשים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עיבוד מקדמי של נתונים וניתוח ביטוי דיפרנציאלי
כל ששת מערכי הנתונים הטרנסקריפטומיים (bulk transcriptomic datasets) עברו עיבוד מקדמי סטנדרטי ותיקון השפעות של אצוות (batch-effect correction) לפני הניתוחים הבאים. נתוני המערכים הזרקריים (Microarray) נורמלו באמצעות אלגוריתם ה-robust multi-array average, בעוד שנתוני הספירה של RNA-seq נורמלו בשיטת ה-trimmed mean of M-values. אלגוריתם ה-ComBat יושם כדי להסיר השפעות אצוות טכניות הקשורות למקור מערכי הנתונים ולפלטפורמת הגילוי. ניתוח רכיבים ראשיים (Principal comp...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תהליך העבודה הרב-שכבתי המשולב שילב מטה-אנליזה טרנסקריפטומית של דגימות bulk, בניית רשת ביטוי גנים משותף משוקללת (WGCNA), למידת מכונה מסוג ensemble, תיקוף טרנסקריפטומי ברמת התא הבודד ואימות במודל בעלי חיים in vivo. ארבעה גני מפתח (hub genes) הקשורים להזדקנות ולמיטוכונדריה, CYBB, SERPINE1, TGFB2 ו-TLR2, זוהו כביומארקרים אבחנתיים פוטנציאליים לקריודילטציה של החדר השמאלי (DCM). שילוב של שישה מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים עצמאיים של החדר השמאלי ממאגר ה-Gene Expression Omnibus, כולל פלטפורמות של microarray וריצוף RNA, הפח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר מצהיר כי אין לו ניגודי אינטרסים.

תודות

החוקרים מודים על הנתונים הזמינים לציבור שסופקו באמצעות מאגר הנתונים Gene Expression Omnibus. תודה מודעת גם למבקרים ולעורכים על הערותיהם הבונות לגבי כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המחקר המדעי ברמת המחלקה המחוזית (מענק מס' 2021JDZX2026), "מנגנון של פורמולת Yiqi Huoxue בהפחתת עיצוב מחדש של כלי דם טרשתיים via בקרת דלקת המתווכת על ידי KLF2-Nrf2".

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Aquasonic Clear Ultrasound GelParker Laboratories, Inc.Mar-34משמש לדמיונאקוקרדיוגרפיה של בעלי חיים קטנים.
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227גילוי ב-562 nm; טווח, 20–2,000 µg/mL; משמש לכימות חלבון כולל של ליזאטים של לב עכבר.
CellAge databaseHuman Ageing Genomic Resourceshttps://genomics.senescence.info/cells/מקור לחתימות גנים הקשורות להזדקנות.
CytoHubba, Cytoscape pluginCytoscape App StoreVersion 0.1משמש לדירוג טופולוגיית צמתים ברשתות אינטראקציה של חלבון-חלבון.
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.9.1משמש לוויזואליזציה של רשתות אינטראקציה של חלבון-חלבון.
Full-wavelength microplate readerThermo Fisher ScientificMultiskan FCמשמש למדידת בליעה בבדיקות ELISA.
Gene Expression OmnibusNational Center for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/מאגר ציבורי המשמש להשגת מערכי נתוני טרנסקריפטומיקה.
GeneCardsWeizmann Institute of Sciencehttps://www.genecards.org/מקור למערכי גנים הקשורים למיטוכונדריה.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, 100×, EDTA-freeThermo Fisher Scientific78441נשמר ב-4 °C; מתווסף לבאפר RIPA בריכוז של 10 µL/mL מיד לפני השימוש.
Liquid nitrogenLocal laboratory gas supplierNot applicableמשמש להקפאה מהירה (snap-freezing) של רקמת שריר לב.
Male SPF-grade C57BL/6J mice, 6–8 weeks old, 25 ± 2 gBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.Not applicableרישיון ייצור בעלי חיים מס' SCXK (Jing) 2021-0006; שימשו כביקרות נורמליות.
Male SPF-grade CTNTR141W transgenic DCM mice, 6–8 weeks old, 25 ± 2 gInstitute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical SciencesNot applicableרישיון ייצור בעלי חיים מס' SCXK (Jing) 2021-0065; שימשו כמודל DCM ספונטני.
MCODE, Cytoscape pluginCytoscape App StoreVersion 2.0.2משמש לזיהוי תת-רשתות תפקודיות מרכזיות ברשתות אינטראקציה של חלבון-חלבון.
Mouse CYBB ELISA KitBiogradetechA-QEK09250-96wellsשימש במחקר זה למדידת CYBB בליזאטים של רקמת שריר לב של עכבר.
Mouse PAI-1 ELISA KitEK-BIOML30970שימש במחקר זה למדידת PAI-1, החלבון המקודד על ידי SERPINE1, בליזאטים של רקמת שריר לב של עכבר.
Mouse TGF-β2 ELISA KitElaBoXSEKM-0036שימש במחקר זה למדידת TGF-β2 בליזאטים של רקמת שריר לב של עכבר.
Mouse TLR-2 ELISA KitSolarbioSEKM-0163שימש במחקר זה למדידת TLR-2 בליזאטים של רקמת שריר לב של עכבר.
Phosphate-buffered saline, pH 7.4, calcium- and magnesium-freeBiological Industries02-024-1ACSתמיסה סטרילית 1×; נשמרת ב-4 °C; משמשת לשטיפת רקמה ולדילול.
R package: caretCRANVersion 6.0-94משמש לביצוע recursive feature elimination באמצעות support vector machine.
R package: CellChatCellChat developersVersion 1.6.1משמש להסקת תקשורת בין-תאית מנתוני רצף RNA של תא בודד.
R package: clusterProfilerBioconductorVersion 4.8.3משמש לניתוח העשרה תפקודית.
R package: ConsensusClusterPlusBioconductorVersion 1.64.0משמש לביצוע consensus clustering לא מפוקח.
R package: edgeRBioconductorVersion 3.42.4משמש לנורמליזציה של נתוני רצף RNA בשיטת trimmed mean of M-values.
R package: GEOqueryBioconductorVersion 2.68.0משמש להורדת נתונים מ-Gene Expression Omnibus.
R package: glmnetCRANVersion 4.1-8משמש לביצוע רגרסיה לוגיסטית בשיטת least absolute shrinkage and selection operator.
R package: limmaBioconductorVersion 3.56.2משמש לניתוח ביטוי דיפרנציאלי ומידול סטטיסטי.
R package: pROCCRANVersion 1.18.5משמש לניתוח עקומי receiver operating characteristic.
R package: randomForestCRANVersion 4.7-1.2משמש ללמידת מכונה בשיטת random forest.
R package: SeuratCRANVersion 5.0.1משמש לניתוח נתוני רצף RNA של תא בודד.
R package: SingleRBioconductorVersion 2.2.0משמש לאנוטציה אוטומטית של סוגי תאים.
R package: svaBioconductorVersion 3.48.0משמש לתיקון אפקט-אצווה (batch-effect) באמצעות ComBat.
Refrigerated centrifugeSigma-AldrichSIGMA 3-Kמשמש לסנטריפוגציה של ליזאטים של רקמת שריר לב.
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific89900תמיסה 1× מוכנה לשימוש; נשמרת ב-4 °C; מתווספים לה מעכבי פרוטאז ופוספטאז לפני השימוש.
Small-animal ultrasound imaging systemVINNO Technology Co., Ltd.VINN06LABמשמש להערכה אקוקרדיוגרפית של תפקוד הלב.
Sodium pentobarbitalSinopharm Chemical Reagent Co.20040428הוכן כתמיסה של 1%, 10 mg/mL, בסליין סטרילי; משמש להרדמה תוך-peritoneal במינון של 30 mg/kg.
STRING databaseSTRING ConsortiumVersion 11.5משמש לבניית רשתות אינטראקציה של חלבון-חלבון.
TGrinder H24 Tissue HomogenizerTIANGENOSE-TH-01משמש להומוגניזציה של רקמת שריר לב של עכבר בבאפר RIPA במהירות של 6.0 m/s למשך 30–60 s לאורך 2–3 מחזורים.
Thermostatic animal platform/heated operating table for small animalsShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.T-30350משמש לשמירה על טמפרטורה של 37 °C של העכברים במהלך אקוקרדיוגרפיה; טווח פעולה, מטמפרטורת החדר ועד 50 °C.

מקורות

  1. Pinto YM et al. Proposal for a revised definition of dilated cardiomyopathy, hypokinetic non-dilated cardiomyopathy, and its implications for clinical practice: a position statement of the ESC working group on myocardial and pericardial diseases. Eur Heart J. 2016;37(23):1850-1858. https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehv727
  2. Newman NA, Burke MA. Dilated Cardiomyopathy: A Genetic Journey from Past to Future. Int J Mol Sci. 2024;25(21):11460. https://doi.org/10.3390/ijms252111460
  3. Mishra B et al. Tumour necrosis factor-alpha promoter polymorphism and its association with viral dilated cardiomyopathy in Indian population: a pilot study. Indian J Med Microbiol. 2015;33(1):16–20. https://doi.org/10.4103/0255-0857.148368
  4. Frustaci A et al. Oxidative myocardial damage in human cocaine-related cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 2015;17(3):283-290. https://doi.org/10.1002/ejhf.219
  5. Ni B et al. The role of β-catenin in cardiac diseases. Front Pharmacol. 2023;14:1157043. https://doi.org/10.3389/fphar.2023.1157043
  6. Kuwahara K et al. TRPC6 fulfills a calcineurin signaling circuit during pathologic cardiac remodeling. J Clin Invest. 2006;116(12):3114-3126. https://doi.org/10.1172/JCI27702
  7. He SL et al. Mitochondrial-related gene expression profiles suggest an important role of PGC-1alpha in the compensatory mechanism of endemic dilated cardiomyopathy. Exp Cell Res. 2013;319(17):2604–2616. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2013.07.017
  8. Luczak ED et al. Mitochondrial CaMKII causes adverse metabolic reprogramming and dilated cardiomyopathy. Nat Commun. 2020;11(1):4416. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18165-6
  9. Li E et al. BMAL1 regulates mitochondrial fission and mitophagy through mitochondrial protein BNIP3 and is critical in the development of dilated cardiomyopathy. Protein Cell. 2020;11(9):661–679. https://doi.org/10.1007/s13238-020-00713-1
  10. Alila-Fersi O et al. First description of a novel mitochondrial mutation in the MT-TI gene associated with multiple mitochondrial DNA deletion and depletion in family with severe dilated mitochondrial cardiomyopathy. Biochem Biophys Res Commun. 2018;497(4):1049-1054. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.02.162
  11. Ramaccini D et al. Mitochondrial Function and Dysfunction in Dilated Cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 2020;8:624216. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.624216
  12. Yang J et al. Stem cells in the treatment of myocardial injury-induced cardiomyopathy: mechanisms and efficient utilization strategies. Front Pharmacol. 2025;16:1600604. https://doi.org/10.3389/fphar.2025.1600604
  13. Van Linthout S et al. State of the art and perspectives of gene therapy in heart failure. A scientific statement of the Heart Failure Association of the ESC, the ESC Council on Cardiovascular Genomics and the ESC Working Group on Myocardial & Pericardial Diseases. Eur J Heart Fail. 2025;27(1):5–25. https://doi.org/10.1002/ejhf.3516
  14. Alimadadi A, Munroe PB, Joe B, Cheng X. Meta-Analysis of Dilated Cardiomyopathy Using Cardiac RNA-Seq Transcriptomic Datasets. Genes (Basel). 2020;11(1):60. https://doi.org/10.3390/genes11010060
  15. Verdonschot J et al. Clustering of Cardiac Transcriptome Profiles Reveals Unique Subgroups of Dilated Cardiomyopathy Patients. JACC Basic Transl Sci. 2023;8(4):406–418. https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2022.10.007
  16. Zhu T et al. Identification and Verification of Feature Biomarkers Associated With Immune Cells in Dilated Cardiomyopathy by Bioinformatics Analysis. Front Genet. 2022;13:874544. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.874544
  17. Li H et al. Identification of Centrosome Duplication-Related Biomarkers in Hypertrophic Cardiomyopathy Through Integrative Multi-Omics, Single-Cell Transcriptomics, and Experimental Validation. J Am Heart Assoc. 2026;15(12):e047416. https://doi.org/10.1161/JAHA.125.047416
  18. Ni L et al. Dissecting and validation the biomarker of heart failure progression in patients with atherosclerosis by single-cell sequencing, bioinformatics, and machine learning. Front Genet. 2025;16:1587274. https://doi.org/10.3389/fgene.2025.1587274
  19. Barrett T et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 2013;41(Database issue):D991–D995. https://doi.org/10.1093/nar/gks1193
  20. Davis S, Meltzer PS. GEOquery: a bridge between the Gene Expression Omnibus (GEO) and BioConductor. Bioinformatics. 2007;23(14):1846-1847. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btm254
  21. Irizarry RA et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 2003;4(2):249-264. https://doi.org/10.1093/biostatistics/4.2.249
  22. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 2010;26(1):139–140. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp616
  23. Leek JT et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics. 2012;28(6):882–883. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts034
  24. Butler A et al. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420. https://doi.org/10.1038/nbt.4096
  25. Korsunsky I et al. Fast, sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nat Methods. 2019;16(12):1289-1296. https://doi.org/10.1038/s51592-019-0619-0
  26. Aran D et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 2019;20(2):163-172. https://doi.org/10.1038/s41590-018-0276-y
  27. Ritchie ME et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47. https://doi.org/10.1093/nar/gkv007
  28. Barbie DA et al. Systematic RNA interference reveals that oncogenic KRAS-driven cancers require TBK1. Nature. 2009;462(7269):108-112. https://doi.org/10.1038/nature08460
  29. Yu G et al. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284-287. https://doi.org/10.1089/omi.2011.0118
  30. Szklarczyk D et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D607–D613. https://doi.org/10.1093/nar/gky1131
  31. Shannon P et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 2003;13(11):2498-2504. https://doi.org/10.1101/gr.1239303
  32. Chin CH et al. cytoHubba: identifying hub objects and sub-networks from complex interactome. BMC Syst Biol. 2014;8(Suppl 4):S11. https://doi.org/10.1186/1752-0509-8-S4-S11
  33. Bader GD, Hogue CW. An automated method for finding molecular complexes in large protein interaction networks. BMC Bioinformatics. 2003;4:2. https://doi.org/10.1186/1471-2105-4-2
  34. Friedman J, Hastie T, Tibshirani R. Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent. J Stat Softw. 2010;33(1):1-22. https://doi.org/10.18637/jss.v033.i01
  35. Touw WG et al. Data mining in the Life Sciences with Random Forest: a walk in the park or lost in the jungle. Brief Bioinform. 2013;14(3):315-326. https://doi.org/10.1093/bib/bbs034
  36. Chicco D. Ten quick tips for machine learning in computational biology. BioData Min. 2017;10:35. https://doi.org/10.1186/s13040-017-0155-3
  37. Robin X et al. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011;12:77. https://doi.org/10.1186/1471-2105-12-77
  38. Lundberg SM et al. From Local Explanations to Global Understanding with Explainable AI for Trees. Nat Mach Intell. 2020;2(1):56-67. https://doi.org/10.1038/s42256-019-0138-9
  39. Jin S et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nat Commun. 2021;12(1):1088. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21246-9
  40. Charoentong P et al. Pan-cancer Immunogenomic Analyses Reveal Genotype-Immunophenotype Relationships and Predictors of Response to Checkpoint Blockade. Cell Rep. 2017;18(1):248–262. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.12.019
  41. Wilkerson MD, Hayes DN. ConsensusClusterPlus: a class discovery tool with confidence assessments and item tracking. Bioinformatics. 2010;26(12):1572–1573. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btq170
  42. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013;14:7. https://doi.org/10.1186/1471-2105-14-7
  43. Zheng Y et al. Exploring Key Genes to Construct a Diagnosis Model of Dilated Cardiomyopathy. Front Cardiovasc Med. 2022;9:865096. https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.865096
  44. Johnson WE, Li C, Rabinovic A. Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics. 2007;8(1):118-127. https://doi.org/10.1093/biostatistics/kxj037
  45. Koslow M, Mondaca-Ruff D, Xu X. Transcriptome studies of inherited dilated cardiomyopathies. Mamm Genome. 2023;34(2):312-322. https://doi.org/10.1007/s00335-023-09978-z
  46. Zhang B, Horvath S. A general framework for weighted gene co-expression network analysis. Stat Appl Genet Mol Biol. 2005;4:Article17. https://doi.org/10.2202/1544-6115.1128
  47. Lin M et al. Machine learning and multi-omics integration: advancing cardiovascular translational research and clinical practice. J Transl Med. 2025;23(1):388. https://doi.org/10.1186/s12967-025-06425-2
  48. Climente-González H et al. Interpretable machine learning leverages proteomics to improve cardiovascular disease risk prediction and biomarker identification. Commun Med (Lond). 2025;5(1):170. https://doi.org/10.1038/s43856-025-00872-0
  49. Shah P et al. Predicting cardiovascular risk with hybrid ensemble learning and explainable AI. Sci Rep. 2025;15(1):17927. https://doi.org/10.1038/s41598-025-01650-7
  50. Chaffin M et al. Single-nucleus profiling of human dilated and hypertrophic cardiomyopathy. Nature. 2022;608(7921):174-180. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04817-8
  51. Juan F et al. The changes of the cardiac structure and function in cTnTR141W transgenic mice. Int J Cardiol. 2008;128(1):83-90. https://doi.org/10.1016/j.ijcard.2008.03.006
  52. Russell-Hallinan A et al. Single-Cell RNA Sequencing Reveals Cardiac Fibroblast-Specific Transcriptomic Changes in Dilated Cardiomyopathy. Cells. 2024;13(9):752. https://doi.org/10.3390/cells13090752
  53. Knowlton KU. Dilated Cardiomyopathy. Circulation. 2019;139(20):2339-2341. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.119.040037
  54. Smith GD, Ebrahim S. Mendelian randomization: prospects, potentials, and limitations. Int J Epidemiol. 2004;33(1):30-42. https://doi.org/10.1093/ije/dyh132
  55. Chen R et al. Macrophages in cardiovascular diseases: molecular mechanisms and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):130. https://doi.org/10.1038/s41392-024-01840-1
  56. Liu R et al. Tead1 is essential for mitochondrial function in cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2020;319(1):H89-H99. https://doi.org/10.1152/ajpheart.00732.2019
  57. Sharma S et al. SOD2 deficiency in cardiomyocytes defines defective mitochondrial bioenergetics as a cause of lethal dilated cardiomyopathy. Redox Biol. 2020;37:101740. https://doi.org/10.1016/j.redox.2020.101740

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תפקוד מיטוכונדריאלי לקויגנים הקשורים להזדקנותטרנסקריפטומיקה של אוכלוסיות תאים (Bulk Transcriptomics)RNA של תא בודדביטוי גנים משותףרשת אינטראקציית חלבוניםחדירת תאי מערכת החיסוןסממנים ביולוגיים מבוססי למידת מכונהסיווג לתתי-סוגים מולקולריים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.