הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכבר לפגיעה ריאתית הקשורה למחלת נגיף הקורונה 2019, המושרה על ידי נגיף התסמונת הנשימתית החריפה וקשה 2 וליפופוליסכריד

109 צפיות

⸱

11 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Sichuan Center for Disease Control and Prevention

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מודל עכברי של פגיעה ריאתית הקשורה למחלת נגיף הקורונה 2019, המושרה על ידי מתן תוך-נחרי משולב של severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 וליפופוליסכריד. המודל מאפשר חקירה של תגובות דלקתיות ריאתיות, ליקויים בתגובות אינטרפרון מסוג I והתערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

תקציר

על אף היישום הנרחב של חיסונים וטיפולים אנטי-ויראליים, זיהום ב-SARS-CoV-2 ממשיך לגרום לתחלואה ותמותה משמעותיות בקרב אוכלוסיות פגיעות, מה שמדגיש את הצורך הדחוף במודלים ניסיוניים מהימנים לחקר הפתוגנזה של COVID-19, להבנת מנגנוני הפעולה של תרופות ולהערכת אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. זיהום ב-SARS-CoV-2 עלול לגרום לפגיעה رئתית חמורה, המאופיינת בתגובות דלקתיות מוגברות ובחסימה של חסינות אנטי-ויראלית המתווכת על ידי interferon type I (IFN-I); עם זאת, מודלי בעלי חיים נוכחיים נותרו מוגבלים ביכולתם לשחזר את התגובות האימונו-דלקתיות המשובשות הקשורות ל-COVID-19. מודל עכברים לפגיעה رئתית הקשורה ל-COVID-19, המושרה על ידי SARS-CoV-2 ו-LPS, פותח כדי לשחזר מאפיינים אימונו-פתולוגיים מרכזיים של COVID-19. מודל זה משרה מאפיינים פתולוגיים בולטים ברקמת הריאה, כולל חדירה של תאי דלקת, הרס מבני של הנאדיות וביטוי מוגבר של ציטוקינים פרו-דלקתיים, בליווי תגובות IFN-I פגומות. מחקר זה מספק תיאור מפורט של הפרוצדורות המשמשות להקמת המודל של פגיעה رئתית בעכברים המושרה על ידי SARS-CoV-2 ו-LPS, ומאפיין באופן שיטמי את המודל באמצעות ניתוחים של שינויים היסטופתולוגיים בריאה, עומס ויראלי, ציטוקינים דלקתיים ורמות IFN-I. מודל זה מציע פלטפורמה ניסיונית לחקירת המנגנונים האימונו-דלקתיים העומדים בבסיס הפגיעה הר رئתית הקשורה ל-COVID-19 והתהליכים המעורבים בתיקון רקמת הריאה, ובמקביל מספק בסיס להערכת אסטרטגיות טיפוליות שמטרתן להקל על השיבוש האימונו-דלקתי ולקדם את ההחלמה של התפקוד הר رئתי.

מבוא

מאז הופעתו בסוף שנת 2019, גרם נגיף ה-SARS-CoV-2 לאתגר בריאותי עולמי, והאבולוציה הוויראלית המתמשכת ממשיכה להציב אתגרים בפני חיסונים קיימים ואסטרטגיות טיפוליות1,2,3. לפיכך, מחקר מעמיק יותר של פגיעות ריאה הקשורה ל-COVID-19 חיוני להבנת מנגנוני המחלה ולקידום אסטרטגיות טיפוליות.

זיהום ב-SARS-CoV-2 עלול לגרום לפגיעה חמורה בריאות ועשוי אף להתפתח לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) ולתסמונת של כשל רב-איברי4,5. גוף הראיות הגדל מצביע על כך שהפתוגנזה של פגיעה ריאתית הקשורה ל-COVID-19 היא מורכבת מאוד, כאשר סימן היכר מרכזי הוא הפרה של התגובות החיסוניות והדלקתיות6,7,8,9. מצד אחד, זיהום ב-SARS-CoV-2 עלול להשרות תגובה דלקתית מוגברת, המובילה לשחרור מאסיבי של ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) ו-tumor necrosis factor-α (TNF-α), ובכך להפעיל את מה שנקרא "סערת ציטוקינים"10,11, הנחשבת למניע מרכזי לפגיעה ריאתית ולהחמרת המחלה. מצד שני, בשלב מוקדם של הזיהום, SARS-CoV-2 יכול לדכא את תגובת ה-IFN-I של המאכסן באמצעות מנגנונים מרובים, מה שמוביל לפגיעה בחסינות האנטי-ויראלית המתווכת על ידי IFN-I12,13,14. בהתאם לכך, תגובת אינטרפרון מושהית המלווה ברמות מוגברות של ציטוקינים פרו-דלקתיים נחשבת למאפיין אופייני של COVID-196,15.

מודלים בעלי חיים זמינים כיום ל-COVID-19 מסתמכים במידה רבה על עכברים טרנסגניים hACE2, זנים נגיפיים שהותאמו לעכברים, או מינים אחרים כגון פראטים ופרימטים שאינם בני אדם16,17. עם זאת, מודלים קונבנציונליים של זיהום ב-SARS-CoV-2 בעכברים לרוב אינם מצליחים לשחזר באופן מלא את המאפיינים ההיפר-דלקתיים של COVID-1918,19,20. LPS, שהוואגוניסט של TLR4, משרה תגובות דלקתיות חזקות ונמצא בשימוש נרחב במודלים של פגיעה ריאתית חריפה21. לפיכך, המודל המושרה על ידי SARS-CoV-2 ו-LPS המתואר במחקר זה תוכנן עבור חקירות המתמקדות בפגיעה ריאתית הקשורה ל-COVID-19, ובמיוחד במנגנונים העומדים בבסיס הפעלת דלקת מופרזת ותגובות חיסוניות אנטי-ויראליות לקויות. בהשוואה למודלים של SARS-CoV-2 בלבד, גישה זו מדגישה מאפיינים חיסוניים-דלקתיים תוך שימור הקשרי הזיהום הנגיפי. למודל זה פוטנציאל ניכר לחקירת מנגנונים חיסוניים-דלקתיים, ולא למידול העברה נגיפית או את המהלך הטבעי המלא של זיהום ב-SARS-CoV-2.

פרוטוקול זה מפרט את ההקמה הפרוצדורלית של מודל עכברים לפגיעה ריאתית הקשורה ל-COVID-19, המושרה על ידי SARS-CoV-2 ו-LPS. בהתחשב במגבלות של מודלים קיימים בשחזור של הפרעות חיסוניות-דלקתיות הקשורות ל-COVID-19, גישה זו מספקת פלטפורמה מעשית לחקר מנגנוני המחלה ולהערכת אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. המודל הוערך באופן שיטתי באמצעות היסטופתולוגיה של הריאות, עומס ויראלי, ציטוקינים דלקתיים ותגובות IFN-I.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה ביסס מודל עכבר לפגיעה ריאתית הקשורה ל-COVID-19 באמצעות טיפות תוך-נחריות של SARS-CoV-2 ו-LPS, ובכך סיפק חלופה יציבה וחסכונית למודלים של עכברים טרנסגניים. הפרוטוקול הניסויי אושר על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן של סיצ'ואן (Sichuan Center for Disease Control and Prevention) וקיבל אישור אתי לניסויים בבעלי חיים [Sichuan CDC (Animal Ethics) Approval No. 005 (2025)]. כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הרלוונטיות ולתקנות הבטיחות הביולוגית.

מידע מפורט על הרכיבים והציוד העיקריים מסופק ב- טבלת חומרים.

1. תכנון פרוטוקול המחקר

  1. הקצו באופן אקראי עכברי BALB/c לקבוצת הביקורת או לקבוצת המודל.
  2. החדירו SARS-CoV-2 דרך האף לעכברים בקבוצת המודל ביום 0.
  3. החדירו LPS דרך האף לעכברים בקבוצת המודל ביום 2.
  4. החדירו נפח שווה של תמיסת סליין פיזיולוגית דרך האף לעכברי הביקורת בנקודות הזמן התואמות.
  5. בצעו המתת חסד לכל העכברים ביום 3 לאחר ההדבקה ב-SARS-CoV-2 ואספו רקמת ריאה לצורך תיקוף המודל.
    הערה: זרימת העבודה הניסוית מומחשת ב-איור 1A.

2. הכנה

  1. הכנת בעלי החיים
    1. השתמשו בנקבות עכברי BALB/c נקיים מפתוגנים ספציפיים (SPF), בגיל 6–8 חודשים ובמשקל של כ-25–30 g.
    2. חלקו את העכברים באופן אקראי לקבוצת ביקורת או לקבוצת מודל באמצעות טבלת מספרים אקראיים, כאשר ארבעה בעלי חיים בכל קבוצה.
    3. שכנו את העכברים בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם גישה חופשית למזון ומים.
      הערה: מחקרים קודמים הראו כי עכברים מבוגרים רגישים יותר לזיהום אינטראנזאלי ב-SARS-CoV-2 מאשר עכברים צעירים18,22. לפיכך, במחקר זה נבחרו עכברי BALB/c מבוגרים כדי להקל על הקמת מודל של פגיעה ריאתית הקשורה ל-SARS-CoV-2.
    4. חסנו כל עכבר באופן אינטראנזאלי עם 100 µL של תרחיף נגיפי, המתאימים למינון זיהומי סופי של 4.5 x 105 TCID₅₀ לכל עכבר.
      הערה: ה-SARS-CoV-2 סופק על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן של סיצ'ואן (Sichuan Center for Disease Control and Prevention). הזן ששימש במחקר זה היה הווריאנט Omicron של SARS-CoV-2, עם תרכיז מלאי נגיפי של 4.5 x 106 TCID₅₀/mL.
      זהירות: מאחר ש-SARS-CoV-2 הוא מיקרואורגניזם פתוגני ביותר, בצעו את כל הפרוצדורות הקשורות לנגיף במתקן בטיחות ביולוגית לבעלי חיים ברמה 3 (ABSL-3). אופטימיזציה של המינון הזיהומי צריכה להתבצע על בסיס ניסויים מקדימים כאשר משתמשים בווריאנטים נגיפיים שונים או במודלים אחרים של בעלי חיים.
  2. הכנת תמיסות עבודה
    1. הכנת תמיסת מלאי של LPS: שקלו 3 mg של אבקת LPS והמיסו אותה ב-1 mL של תמיסת סליין נורמלית. ערבבו בעדינות או במיקסר וורטקס ברציפות עד להמסה מלאה כדי לקבל תמיסת מלאי בריכוז של 3 mg/mL. לפני המתן, דללו את תמיסת המלאי עם סליין נורמלי לריכוז העבודה הרצוי בהתאם למשקל הגוף של העכברים.
    2. הכנת תמיסת הרדמה: המיסו את האבקה עם מי ההזרקה הסטריליים המסופקים בחבילת Zoletil כדי להכין תמיסה ביחס המסה-נפח הנדרש לשימוש בהמשך.
    3. הכנת תמיסת עבודה נגיפית: הפשיקו 1 mL של תרחיף נגיפי של SARS-CoV-2 באיטיות על קרח בתוך קבִינט בטיחות ביולוגית לפני השימוש.
      הערה: פעלו לפי הוראות היצרן הרלוונטיות בעת הכנה ושימוש בכל תמיסות העבודה.

3. מתן תוך-אפי nasal בעכברים

  1. שקלו כל עכבר לפני המתן והרישמו את משקל הגוף.
  2. חשבו את המינונים של Zoletil ו-LPS בהתבסס על משקל הגוף של כל עכבר.
  3. הכינו את תמיסות העבודה המתאימות ושאבו את הנפחים הנדרשים באמצעות מזרק מתאים לצורך מתן התמיסות.
  4. ריסון העכבר: אחזו בעדינות בעור העורף של העכבר באמצעות האגודל והאצבע המורה של יד שמאל, תוך החזקת העור מאחורי האוזניים והצוואר.
  5. הניחו את בעל החיים על כף היד תוך שימוש באצבע הטבעת ובזרת כדי לקבע את הגב והזנב. מקמו את העכבר בתנוחה גבנית (supine) כך שהבטן חשופה לחלוטין והגוף יציב.
  6. חיטוי: חטאו את נקודת ההזרקה הבטנית באמצעות 75% ethanol בעזרת מקלוני צמר גפן סטריליים.
  7. הרדמה: הכניסו את מחט המזרק המכיל Zoletil (במינון 25mg/kg) למרחק של כ-0.5 cm מהקו האמצעי של הבטן התחתונה. התקדמו עם המחט בזווית של 45° אל תוך החלל הפריטוניאלי לעומק של כ-2–3 mm לאחר חדירה לעור. בצעו אספירציה כדי לוודא שאין דם, ולאחר מכן הניחו את חומר ההרדמה באיטיות.
    הערה: בצעו אופטימיזציה למינון חומר ההרדמה בהתבסס על ניסויי פיילוט כדי להבטיח הרדמה נאותה ולמזער תמותה. הימנעו מדקירות חוזרות כדי למזער נזק לרקמות.
  8. אישור ההרדמה: ודאו את מצב ההרדמה על ידי תצפית בנשימה יציבה וסדירה ללא סימנים של קוצר נשימה (dyspnea) או מצוקה נשימתית.
  9. החדרה תוך-אפית של SARS-CoV-2 (יום 0): הניחו 100 µL של תמיסה נגיפית של SARS-CoV-2 (50 µL לכל נחיר) באיטיות ובטפטוף על הנחירים החיצוניים באמצעות מיקרופיפטה או מזרק, במהלך מחזור נשימה יציב ובתחילת השאיפה.
  10. החליפו בין הנחירים כדי להקל על שאיפה אחידה. טפלו בעכברי ביקורת בנפח שווה של תמיסת סליין (normal saline) באמצעות אותו הליך.
    הערה: הניחו את התמיסה בטפטוף, תוך וידוא שכל טיפה נשאפת אל תוך חלל האף לפני החלת הטיפה הבאה, עד להגעה לנפח המטרה.
  11. טיפול לאחר מתן התמיסה: החזיקו את ראש העכבר במצב מורם מעט למשך כ-30–60 s לאחר ההחדרה התוך-אפית כדי להקל על הגעת התמיסה למסלקי הנשימה התחתונים. החזירו את העכברים לכלוביםיהם ברגע שנצפו סימני התאוששות מההרדמה, ועקבו אחריהם עד להשבתה מלאה של ההכרה.
  12. רישום ומעקב: רשמו את נפח המתן ומספר הזיהוי של כל עכבר. עקבו אחר בעלי החיים באופן רציף לאורך תקופת הניסוי כדי לבחון את מצב ההישרדות והמצב הפיזיולוגי הכללי.
  13. החדרה תוך-אפית של LPS (יום 2): הניחו LPS לעכברים ביום השני לאחר ההדבקה ב-SARS-CoV-2. בצעו החדרה תוך-אפית של LPS (במינון 5 mg/kg) בהתאם לאותו פרוטוקול ששימש למתן SARS-CoV-2. הניחו נפח שווה של תמיסת סליין לעכברי ביקורת באמצעות אותו הליך.
    הערה: בשלב זה, LPS ותמיסת סליין הוענקו בהתאם לאותו הליך של הזרקת SARS-CoV-2, כולל הרדמה והחדרה תוך-אפית.

4. נתיחה של עכבר ואיסוף רקמת ריאה

  1. בצע המתה לעכברים ביום ה-3 לאחר ההדבקה ב-SARS-CoV-2 לצורך איסוף רקמות. הרדם את בעלי החיים תחילה ולאחר מכן השמד אותם באמצעות פריקה צווארית (cervical dislocation). עבד את עכברי הביקורת באמצעות אותו הליך.
    הערה: להליכים מפורטים בנוגע לפריקה צווארית, ראה Supplementary File 1.
  2. קבע את העכבר המומת בתנוחה גבית (supine) על לוח ניתוח, כאשר אזורי הבטן וחזה חשופים לחלוטין. הרטב את פרוות הבטן ב-75% ethanol כדי למזער זיהום.
  3. השתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך בזהירות את עצם החזה (sternum) לאורך השוליים הצלעיים הדו-צדדיים ופתח את חלל החזה בהדרגה. השתמש בפינצטה כדי להסיט בעדינות רקמות ובצע דיסקציה של הריאות בשלבים מהמבנים התורקסיים הסובבים, תוך מזעור פגיעה מכנית ברקמת הריאה.
    הערה: בקר את כיוון קצות המספריים בזהירות במהלך החיתוך כדי למנוע נזק ללב, לריאות ולמבנים וסקולריים מרכזיים.
  4. העבר את רקמות הריאה שהוצאו מיד ל-PBS מקורר מראש או לתמיסת סלין נורמלית, ושטוף אותן בעדינות 2–3 פעמים כדי להסיר דם ופסוליות שנותרו. ספח נוזלים עודפים מהפני השטח בזהירות באמצעות נייר סינון נטול סיבים והימנע מדחיסה כדי למנוע נזק מבני לרקמה.
  5. שקול את רקמות הריאה המעובדות ללא דיחוי באמצעות מאזניים אלקטרוניים ורשום את המדידות.
  6. הוצא את האונה הזנבית הימנית (right caudal lobe) וקבע אותה מיד ב-4% paraformaldehyde בנפח הגדול פי 10 מנפח הרקמה לצורך אנליזה היסטופתולוגית בהמשך.
    זהירות: Paraformaldehyde הוא חומר רעיל; טפל בו בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות.
  7. אסוף את שארית רקמות הריאה, חלק אותן לאליקווטים בתוך מבחנות קריו, הקפא אותן במהירות בחנקן נוזלי ואחסן אותן ב-−80 °C לצורך שימור. הקצה את האונה הקרניאלית הימנית, האונה האמצעית הימנית והאונה העזרית לזיהוי עומס נגיפי של SARS-CoV-2 וציטוקינים פרו-דלקתיים, ושמור את הריאה השמאלית לאנליזת ELISA.
    זהירות: חנקן נוזלי הוא קר ביותר; לבש כפפות קריוגניות מתאימות ומשקפי מגן בעת הטיפול בו כדי למנוע כוויות קור או כוויות קפאה.
  8. נקה והסטרל את כל הכלים ביסודיות בהתאם להליכים סטנדרטיים לאחר סיום הדיסקציה. השמד את גופות בעלי החיים ואת הפסולת הביולוגית בהתאם להנחיות המוסדיות והרגולטוריות לניסויים בבעלי חיים.

5. צביעת המטוקסילין-אאוזין (HE)23

  1. קבעו רקמות ריאה טריות ב-4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר למשך 24 h.
    הערה: בקרו את זמן הקיבוע בקפידה. הימנעו מקיבוע חסר, שעלול להוביל לשימור רקמות לא מלא, ומקיבוע ממושך, שעלול לגרום לקשירה מוגברת של חלבונים ולהשפיע על איכות הצביעה.
  2. עבדו את הרקמות המקובעות באמצעות מעבד רקמות אוטומטי לצורך דהידרציה מדורגת, הבהרה (clearing) וחדירה של פאראפין.
    הערה: הפרוטוקול עבור מעבד הרקמות האוטומטי מופיע ב-Supplementary File 2.
  3. הניחו את הרקמות שהחדירו אליהן פאראפין לתבניות הטמעה. הוסיפו פאראפין מומס וכוונו בזהירות את כיוון הרקמה.
  4. העבירו את התבניות ללוח קירור לצורך התמצקות. הוציאו את בלוקי הפאראפין מהתבניות לאחר הקשחה מלאה.
  5. הניחו את בלוקי הפאראפין במיקרוטום וכוונו את משטח החיתוך כך שיהיה מקביל ללהב. השגיחו חיתוכים סדרתיים בעובי של כ-3–5 µm.
  6. העבירו את החיתוכים מיד לאמבט מים בטמפרטורה של כ-45 °C לצורך ציפה (flotation) כדי לאפשר התפשטות מלאה.
  7. אספו את החיתוכים על גבי זכוכיות על ידי טבילה אנכית של קצה אחת של הזכוכית במים, והשתמשו בפינצטה כדי לסייע להצמדה נכונה של החיתוכים למשטח הזכוכית.
  8. הניחו את הזכוכיות במייבש זכוכיות בטמפרטורה של 65 °C למשך כשעה אחת כדי לשפר את היצמדות הרקמה.
    הערה: התאימו את זמן הייבוש לפי סוג הרקמה, עובי החיתוך ותנאי הציוד. הימנעו מחימום יתר כדי למנוע נזק לרקמה.
  9. בצעו צביעת HE לחיתוכים המיובשים באמצעות צובע אוטומטי.
    הערה: הפרוטוקול עבור הצובע האוטומטי מופיע ב-Supplementary File 3.
  10. הוציאו את החיתוכים הצבועים והניחו להם להתייבש באוויר. מרחו טיפה של חומר סגירה (mounting medium) ניטרלי וכסו את הזכוכיות בכיסוי זכוכית (coverslip). בחנו את החיתוכים תחת מיקרוסקופ אור לאחר שהחומר לסגירה התמצק.

6. ביטוי של העומס הוויראלי של SARS-CoV-2 ושל ציטוקינים פרו-דלקתיים ברקמת ריאה

  1. הומוגניזציה של רקמת ריאה
    1. הכינו מבחנות הומוגניזציה נקיות מ-RNase על ידי הוספה של 4–5 כדורי פלדת אל-חלד (בקוטר 3 mm) ו-900 µL של באפר ליזיס מקורר מראש כתוצר להומוגניזציה.
      הערה: התאימו את נפח באפר הליזיס למשקל הרקמה, בדרך כלל ביחס של כ-9 mL ל-1 g של רקמה.
    2. שקלו כ-50 mg של רקמת ריאה, קצצו את הרקמה דקית והעבירו אותה למבחנת ההומוגניזציה.
    3. בצעו הומוגניזציה לרקמה באמצעות טחון רקמות (60 Hz, 60 s, למשך 2–3 מחזורים עם מרווחים של 10 s בין המחזורים).
      הערה: בצעו אופטימיזציה לפרמטרי ההומוגניזציה בהתאם למכשיר ולסוג הרקמה.
    4. בדקו את הדגימה לאחר ההומוגניזציה כדי לוודא פירוק מלא. חזרו על תהליך ההומוגניזציה אם נותרו שברים נראים של רקמה, עד לקבלת ליזאט אחיד.
  2. מיצוי של total RNA מרקמת ריאה באמצעות עמודה
    ​הערה: מצעו total RNA מרקמת ריאה באמצעות שיטת טיהור מבוססת עמודה בהתאם להוראות היצרן. בצעו שיטות חלופיות למיצוי RNA בהתאם למדריכים של המוצר הרלוונטי במידת הצורך.
    1. העבירו את ההומוגנאט למבחנה חדשה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 mL הנקייה מ-RNase. הוסיפו 100 µL של תמיסת gDNA Eliminator. סגרו את מכסה המבחנה ונערה בעוצמה למשך 15–20 s.
    2. פתחו את המכסה לזמן קצר, הוסיפו 180 µL כלורופורמה, ובצעו וורטקס יסודי למשך 15 s.
      זהירות: כלורופורמה היא חומר נדיף ורעיל; טפלו בה באזור מאוורר היטב או במכסה פיר פחמי, והשתמשו בציוד מגן אישי מתאים כדי למנוע שאיפה ומגע עם העור.
    3. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 2 min ולאחר מכן סנטריגו ב-12,000 x g למשך 15 min ב-4 °C.
    4. העבירו בזהירות את השלב המימי העליון למבחנה חדשה. הוסיפו נפח שווה של 70% אתנול וערבבו היטב באמצעות וורטקס.
      הערה: הימנעו מהפרעה לממשק (interphase) ולשכבה האורגנית בעת איסוף השלב המימי כדי להבטיח את טהרת ה-RNA. המשיכו לשלב הבא מיד לאחר הוספת 70% אתנול ללא סנטריפוגה.
    5. העבירו את התערובת לעמודת ספין (spin column) וסנטריגו ב-8,000 x g למשך 15 s. השליכו את הנוזל שעבר דרך העמודה (flow-through).
    6. הוסיפו 700 µL של באפר שטיפה לעמודת הספין וסנטריגו ב-8,000 x g למשך 15 s. השליכו את הנוזל שעבר.
    7. הוסיפו 500 µL של באפר שטיפה לעמודת הספין וסנטריגו ב-8,000 x g למשך 15 s. חזרו על שלב שטיפה זה פעם אחת.
    8. העבירו את עמודת הספין למבחנת איסוף חדשה וסנטריגו ב-12,000 x g למשך 1 min כדי להסיר שאריות של באפר השטיפה.
    9. הניחו את עמודת הספין בתוך מבחנת מיקרוצנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 mL הנקייה מ-RNase. הוסיפו 30 µL של מים נקיים מ-RNase ישירות למרכז הממברנה וסנטריגו ב-8,000 x g למשך 1 min כדי להוציא (elute) את ה-RNA.
      הערה: התאימו את נפח המים הנקיים מ-RNase לטווח של 30–50 µL בהתאם ליישומים הבאים. השתמשו בנפח אלוציה נמוך יותר כאשר נדרש ריכוז RNA גבוה יותר.
  3. זיהוי עומס נגיפי של SARS-CoV-2 באמצעות RT-dPCR (reverse transcription digital PCR)
    ​הערה: נעשה שימוש במערך RT-dPCR שלב אחד לצורך כימות מוחלט של RNA של SARS-CoV-2. נעשה שימוש בערכי פריימר-פרוב ספציפיים המכוונים לגן ה-nucleocapsid (N) כדי לקבוע את מספר העותקים של ה-RNA הנגיפי.
    1. המיסו את דגימות ה-RNA והריאגנטים על קרח.
    2. הכינו את תערובת התגובה ל-RT-dPCR בהתאם להוראות היצרן.
    3. ערבבו 20 µL של תערובת תגובה ל-RT-dPCR עם 20 µL של תבנית RNA. בצעו וורטקס קצר לתערובת, סנטריגו אותה בספין קצר, ושמרו על קרח.
    4. טענו את תערובת התגובה בנפח 40 µL לבארות של שבב ה-digital PCR ואטמו את השבב בהתאם לפרוטוקול המכשיר.
    5. בצעו הגברה תחת תנאי מחזור תרמי הבאים: 50 °C למשך 40 min (מחזור 1), 95 °C למשך 2 min (מחזור 1), ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 °C למשך 15 s ו-57 °C למשך 60 s. הגדירו את ערוצי הגילוי ל-GREEN (250 ms) ו-RED (150 ms).
  4. זיהוי ביטוי של ציטוקינים דלקתיים באמצעות RT-qPCR (reverse transcription quantitative PCR)
    1. קבעו את ריכוז וטהרת ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV.
    2. השתמשו ב-1,000 ng של total RNA לכל תגובה עבור שעתוק הפוך (reverse transcription) לסינתזה של DNA משלים (cDNA) בהתאם להוראות היצרן.
    3. בצעו RT-qPCR תוך שימוש ב-100 ng של cDNA לכל תגובה כתבנית, עם SYBR Green PCR master mix ופריימרים ספציפיים לגן. השתמשו בתנאי מחזור הבאים: 95 °C למשך 2 min, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 °C למשך 5 s ו-60 °C למשך 10 s. רצפי הפריימרים מופיעים ב-טבלה 1.
      הערה: בצעו אופטימיזציה לתנאי התגובה בהתאם לריאגנטים ולמכשירים הספציפיים שבהם נעשה שימוש, ופעלו לפי הוראות היצרן המתאימות.
    4. השתמשו ב-GAPDH כגן ייחוס פנימי וחשבו את רמות ביטוי הגן היחסיות באמצעות שיטת 2−ΔΔCt.

7. זיהוי ציטוקינים פרו-דלקתיים ברקמת ריאה באמצעות תגובה חיסונית סופחת אנזים (ELISA)24

הערה: השתמשו בערכות ELISA בהתאם לפרוטוקולים הספציפיים המסופקים על ידי היצרנים השונים. פעלו בהחלט לפי הוראות היצרן הרלוונטי בעת שימוש בערכות מספקים חלופיים.

  1. בצע הומוגניזציה לרקמת ריאה כפי שתיאר לעיל. השתמש ב-PBS או בבופר לליזת רקמה ספציפי ל-ELISA כמדיום להומוגניזציה.
  2. סבב במערכת צנטריפוגה את הדגימות ההומוגניות (למשל, 12,000 x g, 4 °C, 10 min) ואסוף את supernatant (הנוזל העליון) לצורך ניתוח בהמשך.
  3. המתן 30 min עד שערכת ה-ELISA תגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. הוצא את רצועות המיקרופלטה הדרושות משקית נייר האלומיניום.
  4. הכן סטנדרטים, בארי דגימה ובארי ביקורת (blank) בהתאם להוראות היצרן. הוסף 50 µL של סטנדרטים לבארי הסטנדרט ו-10 µL של דגימה בתוספת 40 µL של בופר לדילול דגימות לבארי הדגימה. בצע שתי חזרות טכניות עבור כל סטנדרט ודגימה.
  5. הוסף 100 µL של נוגדן זיהוי המשורשר ל-horseradish peroxidase (HRP) לכל באר של סטנדרט ודגימה, למעט בארי הביקורת. אטום את הפלטה באמצעות סרט דביק והדגר ב-37 °C למשך 60 min.
  6. רוקן את הנוזל מכל באר לאחר ההדגרה והקש בעדינות על הפלטה כנגד נייר סופג כדי להסיר שאריות נוזלים.
  7. הוסף בופר שטיפה לכל באר, המתן 1 min, ולאחר מכן רוקן את הבופר. ייבש את הפלטה בניגוב. חזור על שלב שטיפה זה חמש פעמים בסך הכל.
  8. הוסף לכל באר 50 µL של תמיסת סובסטרט A ו-50 µL של תמיסת סובסטרט B באופן רצופי. ערבב בעדינות את הפלטה והדגר אותה ב-37 °C בחושך למשך 15 min כדי לאפשר פיתוח צבע.
  9. עצור את התגובה על ידי הוספת 50 µL של תמיסת עצירה (stop solution) לכל באר. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) בתוך 10 min באורך גל של 450 nm באמצעות קורא מיקרופלטה.
  10. צור עקומת סטנדרט על ידי שרטוט ריכוזי הסטנדרטים (ציר x) מול ערכי ה-OD (ציר y), ובצע התאמה לעקומה. חשב את ריכוזי הציטוקינים המבוקשים בדגימות על ידי הצבת ערכי ה-OD במשוואת עקומת הסטנדרט והכפל במקדמי הדילול המתאימים.
  11. קבע את ריכוז החלבון הכולל ברקמת הריאה באמצעות ערכה לבדיקת חלבון BCA. נרמל את רמות הציטוקינים הסופיות לתוכן החלבון הכולל והצג את התוצאות ככמות הציטוקין המבוקש למיליגרם חלבון כולל (למשל, pg/mg protein).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תיקוף המודל בוצע על ידי הערכת שינויים היסטופתולוגיים ריאתיים, העומס הנגיפי של SARS-CoV-2, ורמות של ציטוקינים פרו-דלקתיים ואינטרפרונים מסוג I הן בקבוצת הביקורת והן בקבוצת המודל.

ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כממוצע ± טעות תקן (SE). להשוואות בין קבוצת המודל לקבוצת הביקורת נעשה שימוש במבחן t של Student למדגמים בלתי תלויים. מבחן זה נבחר מכיוון שהוא מתאים להשוואת ממוצעים של משתנים רציפים בין שתי קבוצות בלתי תלויות. במחקר זה, העכברים הוקצו באופן בלתי תלוי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה ביסס מודל עכברי של פגיעה ריאתית הקשורה ל-COVID-19 באמצעות חדרת SARS-CoV-2 ו-LPS דרך הנחיריים. התוצאות הדגימו כי מתן משולב של SARS-CoV-2 ו-LPS דרך הנחיריים משרה תגובה דלקתית חזקה הנלווית לדיכוי של אותיות IFN-I. עכברים בקבוצת המודל הראו ירידה משמעותית במשקל הגוף ועלייה במדד הריאה, המעידים על כשש מערכתי ופגיעה ריאתית מחמירה. צביעת HE אישרה עוד כי קבוצת המודל הראתה פגיעה ריאתית דיפוזית טיפוסית, המאופיינת בשיבוש של ארכיטקטורת הנאדירים ובחדירה נרחבת של תאי דלקת. בנוסף, בהשוואה לקבוצת הביקורת, רקמות ריאה מקבוצת המודל הר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי The National Natural Science Foundation of China (82374291); תוכנית המדע והטכנולוגיה של Sichuan (2024NSFJQ0059); נושא מחקר מדעי מיוחד של Sichuan Administration of Traditional Chinese Medicine (2024zd0059); פרויקט כישרונות מובילים במדע וטכנולוגיה של "Tianfu Qingcheng Plan" לשנת 2022 (Chuan Qingcheng No. 1090); קרן החדשנות המשותפת של ועדת הבריאות של Chengdu ואוניברסיטת Chengdu לרפואה סינית מסורתית (WXLH202403091).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מעבד רקמות אוטומטיDakewe Biotech Co., Ltd.HP300משמש לדהידרטציה של רקמות.
צובע אוטומטיLeica BiosystemsLEICA ST5010משמש לצביעת HE.
צנטריפוגהDLAB Scientific D3024Rמשמשת לצנטריפוגציה של דגימות או ריאגנטים.
אמבט מים בטמפרטורה קבועהShanghai LICHEN-BX Instrument Techonology Co., Ltd.HH-6משמש לאמבטי מים בטמפרטורה קבועה.
מערכת Digital PCRQIAGENQIAcuity Oneמשמשת ל-RT-dPCR.
TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)TransGen Biotech Co.,Ltd.AT341משמש לשעתוק הפוך.
תמיסת EosinBASOBA4024משמשת לצביעה היסטולוגית.
מערכת Fluorescent Quantitative PCRRocgene (Beijing) Technology Co., Ltd.Archimed X6משמשת ל-RT-qPCR.
תמיסת HematoxylinBASOBA4041משמשת לצביעה היסטולוגית.
תוכנת IBM SPSS StatisticsIBM Corp., Armonk, NY, USAversion 22.0משמשת לניתוח סטטיסטי.
Lipopolysaccharides מ-Escherichia coli O55:B5Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.L2880משמש למודלי עכברים.
קורא מיקרופלטהMolecular Devices SpectraMax Plus 384משמש ל-Elisa.
ערכת Mouse IFN-α ELISAZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37863Wמשמשת לזיהוי רמות IFN-α ברקמת ריאה של עכברים.
ערכת Mouse IFN-β ELISAZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37887Wמשמשת לזיהוי רמות IFN-β ברקמת ריאה של עכברים.
ערכת Mouse IL-1β ELISAZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37974Wמשמשת לזיהוי רמות IL-1β ברקמת ריאה של עכברים.
ערכת Mouse IL-6 ELISAZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37988Wמשמשת לזיהוי רמות IL-6 ברקמת ריאה של עכברים.
ערכת Mouse TNF-α ELISAZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-39024Wמשמשת לזיהוי רמות TNF-α ברקמת ריאה של עכברים.
One-Step RT-PCR Kit for Digital PCRQIAGEN4829104משמש ל-digital PCR.
מכשיר להטמעה בפרפיןHubei Aristion Medical Industrial Co., Ltd.ABM-7Lמשמש להטמעה בפרפין של רקמת ריאה של עכברים.
QuantiNova SYBR PCR Mix KitQIAGEN1129280משמש ל-RT-qPCR.
RNeasy Plus Universal Mini KitQIAGEN1062832משמש למיצוי RNA כולל.
מיקרוטום (Slicer)Leica BiosystemsLEICA RM2235משמש לחיתוכי פרפין.
כדוריות פלדת אל-חלד להומוגניזטור רקמותBeyotime BiotechnologyF6621משמש להומוגניזציה של רקמת ריאה.
XG primer Pool 1.0 for Digital PCRQIAGEN4828104משמש ל-digital PCR.
Zoletil 50VIRBACBN9VS7Aמשמש להרדמת עכברים.

מקורות

  1. Zhang X, et al. SARS-CoV-2 Evolution: Immune Dynamics, Omicron Specificity, and Predictive Modeling in Vaccinated Populations. Adv Sci (Weinh). 2024;11(40):e2402639.
  2. Yu Y, et al. COVID-19 Serum Drives Spike-Mediated SARS-CoV-2 Variation. Viruses. 2024;16(5):763.
  3. Alhamlan FS, Al-Qahtani AA. SARS-CoV-2 Variants: Genetic Insights, Epidemiological Tracking, and Implications for Vaccine Strategies. Int J Mol Sci. 2025;26(3):1263.
  4. Habashi NM, Camporota L, Gatto LA, Nieman G. Functional pathophysiology of SARS-CoV-2-induced acute lung injury and clinical implications. J Appl Physiol (1985). 2021;130(3):877-891.
  5. Nie X, et al. Multi-organ proteomic landscape of COVID-19 autopsies. Cell. 2021;184(3):775-791.e14.
  6. Blanco-Melo D, et al. Imbalanced Host Response to SARS-CoV-2 Drives Development of COVID-19. Cell. 2020;181(5):1036-1045.e9.
  7. Wang J, Li Q, Qiu Y, Lu H. COVID-19: imbalanced cell-mediated immune response drives to immunopathology. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2393-2404.
  8. Sa Ribero M, Jouvenet N, Dreux M, Nisole S. Interplay between SARS-CoV-2 and the type I interferon response. PLoS Pathog. 2020;16(7):e1008737.
  9. El-Saber Batiha G, Al-Gareeb AI, Saad HM, Al-Kuraishy HM. COVID-19 and corticosteroids: a narrative review. Inflammopharmacology. 2022;30(4):1189-1205.
  10. Ye Q, Wang B, Mao J. The pathogenesis and treatment of the 'Cytokine Storm' in COVID-19. J Infect. 2020;80(6):607-613.
  11. Jiang Y, et al. Cytokine storm in COVID-19: from viral infection to immune responses, diagnosis and therapy. Int J Biol Sci. 2022;18(2):459-472.
  12. Zhang S, Wang L, Cheng G. The battle between host and SARS-CoV-2: Innate immunity and viral evasion strategies. Mol Ther. 2022;30(5):1869-1884.
  13. Beyer DK, Forero A. Mechanisms of Antiviral Immune Evasion of SARS-CoV-2. J Mol Biol. 2022;434(6):167265.
  14. Lei X, et al. Activation and evasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2. Nat Commun. 2020;11(1):3810.
  15. Mostafa-Hedeab G, et al. A raising dawn of pentoxifylline in management of inflammatory disorders in Covid-19. Inflammopharmacology. 2022;30(3):799-809.
  16. Chen Z, et al. SARS-CoV-2 immunity in animal models. Cell Mol Immunol. 2024;21(2):119-133.
  17. Johansen MD, et al. Animal and translational models of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Mucosal Immunol. 2020;13(6):877-891.
  18. Zhang Y, et al. SARS-CoV-2 rapidly adapts in aged BALB/c mice and induces typical pneumonia. J Virol. 2021;95(11):e02477-20.
  19. Sun SH, et al. A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host Microbe. 2020;28(1):124-133.e4.
  20. Muñoz-Fontela C, et al. Animal models for COVID-19. Nature. 2020;586(7830):509-515.
  21. Liu T, et al. Therapeutic potential of inosine in acute lung injury: mechanistic insights into TLR4 suppression and macrophage polarization. Phytomedicine. 2025;143:156854.
  22. Powers JM, et al. Divergent pathogenetic outcomes in BALB/c mice following Omicron subvariant infection. Virus Res. 2024;341:199319.
  23. Fan F, et al. Association between systemic immune-inflammation indexes and Nuodikang capsule's protection in LPS-induced acute lung injury in mice. Phytomedicine. 2025;147:157229.
  24. Xie N, et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 2022;103:154240.
  25. Jiang S, et al. Generic Diagramming Platform (GDP): a comprehensive database of high-quality biomedical graphics. Nucleic Acids Res. 2025;53(D1):D1670-D1676.
  26. Onohuean H, et al. Covid-19 and development of heart failure: mystery and truth. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2021;394(10):2013-2021.
  27. Zarrilli G, et al. The Immunopathological and Histological Landscape of COVID-19-Mediated Lung Injury. Int J Mol Sci. 2021;22(2):974.
  28. Fernandes de Souza WD, et al. Lung Inflammation Induced by Inactivated SARS-CoV-2 in C57BL/6 Female Mice Is Controlled by Intranasal Instillation of Vitamin D. Cells. 2023;12(7):1092.
  29. Ciesielska A, Matyjek M, Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021;78(4):1233-1261.
  30. Brandenburg K, et al. A Comparison between SARS-CoV-2 and Gram-Negative Bacteria-Induced Hyperinflammation and Sepsis. Int J Mol Sci. 2023;24(20):15169.
  31. Samsudin F, et al. SARS-CoV-2 spike protein as a bacterial lipopolysaccharide delivery system in an overzealous inflammatory cascade. J Mol Cell Biol. 2023;14(9):mjac058.
  32. Petruk G, et al. SARS-CoV-2 spike protein binds to bacterial lipopolysaccharide and boosts proinflammatory activity. J Mol Cell Biol. 2020;12(12):916-932.
  33. Martin-Sancho L, et al. Functional landscape of SARS-CoV-2 cellular restriction. Mol Cell. 2021;81(12):2656-2668.e8.
  34. Minkoff JM, tenOever B. Innate immune evasion strategies of SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 2023;21(3):178-194.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

זיהום ב-SARS-CoV-2פגיעה ריאתית ב-COVID-19השראה באמצעות ליפופוליסכרידתגובה דלקתית חיסוניתהיסטופתולוגיה של הריאהציטוקינים פרו-דלקתייםתגובת אינטרפרוןניתוח עומס ויראליתפקוד ריאתי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.