מאמר מחקר

ARHGAP22 כסמן ביולוגי פרוגנוסטי פוטנציאלי בקרצינומה של תאי כליה עם תאים בהירים: תובנות לגבי חסינות הגידול ורשתות ביטוי משותף

54 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72307

⸱

3 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastroenterology, The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 2Qilu Medical University, 3General Hospital of Fushun Mining Bureau of Liaoning Health Industry Group, 4Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה בוחן את ביטוי ARHGAP22 בקרצינומה של תאי כליה מסוג תאים בהירים (clear cell renal cell carcinoma) ואת הקשריו לפרוגנוזה, למאפיינים קליניקו-פתולוגיים, למיקרו-סביבה החסונית של הגידול ולרגישות לתרופות שנחזתה באופן חישובי.

תקציר

קרצינומה של תאי כלייה ברורים (ccRCC) היא תת-הסוג השכיח ביותר של סרטן הכליות ומאופיינת בהטרוגניות קלינית משמעותית, מה שמדגיש את הצורך בביו-מרקרים פרוגנוסטיים מהימנים. מחקר זה בחן את דפוס הביטוי, הרלוונטיות הפרוגנוסטית והקשרים הקשורים למערכת החיסון של ARHGAP22 ב-ccRCC, תוך שימוש בנתונים טרנסקריפטומיים וקליניים מקבוצת The Cancer Genome Atlas Kidney Renal Clear Cell Carcinoma (TCGA-KIRC), יחד עם נתוני תיקוף חיצוניים ומידע על ביטוי חלבונים מ-Human Protein Atlas (HPA). ביטויו של ARHGAP22 הושווה בין רקמות גידול לרקמות נורמליות סמוכות, ונבחנו הקשריו להישרדות כוללת, למאפיינים קליניו-פתולוגיים, לציוני מיקרו-סביבת הגידול ולשברי תאי חיסון מוערכים. כמו כן, בוצעו ניתוחי ביטוי משותף (Co-expression) והעשרה פונקציונלית כדי לאפיין קשרים ביולוגיים פוטנציאליים. נמצא כי ARHGAP22 נמצא בביטוי מוגבר (upregulated) באופן מובהק ברקמות ccRCC ברמה הטרנסקריפטומית, עם הבדלים תואמים שנצפו בתמונות אימונוהיסטוכימיות. ביטוי גבוה של ARHGAP22 היה קשור להישרדות כוללת קצרה יותר, למאפיינים קליניו-פתולוגיים מתקדמים ולערכי ImmuneScore, StromalScore ו-ESTIMATEScore גבוהים יותר. ניתוח מבוסס CIBERSORT הראה כי לקבוצת הביטוי הגבוה היו שברים מוערכים גבוהים יותר של מקרופאגים M2 ותאי T רגולטוריים, ושברים מוערכים נמוכים יותר של תאי B נאיביים, תאי תסתון (mast cells) במצב מנוחה ותאי דנדריטיים מופעלים, לאחר תיקון שיעור התגליות השגויות (false discovery rate). ניתוחי העשרה פונקציונלית קישרו גנים הקשורים ל-ARHGAP22 לתהליכים הקשורים למערכת החיסון, לנדידת תאים ولمסלולי סיגנלינג המתווכים על ידי כימוקינים וציטוקינים. ממצאים אלו מרמזים כי ARHGAP22 עשוי להוות ביו-מרקר פרוגנוסטי וקשור למערכת החיסון ב-ccRCC, אם כי נדרש תיקוף קליני וניסויי עצמאי נוסף.

מבוא

קרצינומה של תאי כלייה עם תאים בהירים (ccRCC) היא תת-הסוג ההיסטולוגי השכיח ביותר של קרצינומה של תאי כלייה, והיא מהווה כ-70%–80% מהמקרים ותורמת באופן משמעותי לתחלואה הקשורה לסרטן הכליות1˒2. השכיחות של קרצינומה של תאי כלייה עלתה באופן כללי בשנים האחרונות, עם שונות אפידמיולוגית בולטת בין אזורים שונים. גורמי סיכון מבוססים כוללים עישון, השמנה, יתר לחץ דם ומחלת כליות כרונית3˒4. קרצינומה של תאי כלייה עם תאים בהירים מאופיינת באגרסיביות בולטת ובהטרוגניות מולקולרית. חלק מהמטופלים מגיעים עם מחלה גרורתית בעת האבחנה, והישנות והתקדמות המחלה לאחר ניתוח נפוצות2˒5. ברמה המולקולרית, אינאקטיבציה של von Hippel–Lindau (VHL) והפעלה מתמשכת של שילוח hypoxia-inducible factor (HIF) מוכרות כאירועים מרכזיים בפתוגנזה של ccRCC, והן מלוות בשינויים גנומיים ואפיגנטיים נרחבים6˒7. למרות שטיפולים ממוקדים ואימונותרפיות שיפרו את התוצאות במחלה בשלבים מתקדמים, התגובות לטיפול נותרות הטרוגניות מאוד, מה שמדגיש את הצורך בביומארקרים פרוגנוסטיים וקשורים למערכת החיסון שהם אמינים8,9,10.

Rho guanosine triphosphatases (Rho GTPases) הם מתגים מולקולריים המווסתים עיצוב מחדש של השלד התאי, קוטביות תאית, היצמדות, נדידה ופלישה, ויש להם תפקידים רב-גוניים בתהליך התסבך הגידולי (tumorigenesis) ובהתקדמות הסרטן11˒12. בנוסף לוויסות של שגשוג תאי גידול, אפופטוזיס וניידות, סיגנלינג של Rho GTPase תורם לאנגיוגנזה, לתגובות דלקתיות ולעיצוב מחדש של המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול13,14,15. המשמעות הביולוגית של סיגנלינג Rho GTPase ב-ccRCC זכתה לתשומת לב גוברת. דווח כי סיגנלינג של Rac מקדם את הצמיחה של ccRCC ואת המעבר האנגיוגני (angiogenic switching), בעוד ש-ccRCC המונע על ידי VHL/HIF עשוי להיות תלוי במסלול של Rho GTPase/Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase (ROCK)16˒17. חתימות גנטיות הקשורות ל-Rho GTPase נקשרו גם לפרוגנוזה רעה, למצב של דיכוי חיסוני ולתגובות שונות לאימונותרפיה ב-ccRCC, מה שמרמז כי מסלול זה עשוי להוות קשר מולקולרי חשוב בין התקדמות הגידול לבין החסינות הגידולית18˒19.

ARHGAP22 שייך למשפחת חלבוני Rho GTPase-activating protein (RhoGAP) ולתת-משפחה הקשורה ל-FilGAP, ומתפקד בעיקר כ-RhoGAP ספציפי ל-Rac המעורב בבקרה אנטגוניסטית של ציר RhoA–Rac120˒21. החלבון מכיל דומיין pleckstrin homology (PH) ודומיין RhoGAP, ויכול לווסת את פעילות ה-Rac באמצעות לוקליזציה אנדוזומלית והסעה לממברנת הפלזמה, ובכך להשפיע על היווצרות למליפודיה (lamellipodia), פריסת תאים ונדידה20˒22˒23. מחקרים קודמים קשרו את ARHGAP22 לדינמיקה של השלד התאי, ניידות תאי גידול, המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול, ותפקידים פוטנציאליים כסמן ביולוגי במספר סוגי סרטנים20,23,24,25. עם זאת, דפוס הביטוי, המשמעות הפרוגנוסטית, הקשרים החיסוניים והרלוונטיות הטיפולית הפוטנציאלית של ARHGAP22 ב-ccRCC טרם אופיינו באופן מספיק. לפיכך, המחקר הנוכחי בחן האם ביטוי של ARHGAP22 קשור להתקדמות קליניקופתולוגית, לפרוגנוזה של המטופל, להסנפילטרציה חיסונית, לרגישות לתרופות שנחזתה באופן חישובי, ולרשתות ביטוי משותף ב-ccRCC, במטרה להעריך את ערכו הפוטנציאלי כסמן ביולוגי פרוגנוסטי וקשור למערכת החיסון.

פרוטוקול

מחקר זה השתמש בנתונים מזוהים שאינם גלויים, הזמינים לציבור, מ-TCGA, HPA וממאגרי מידע פתוחים אחרים, ולא כלל גיוס חדש של משתתפים אנושיים, ניסויים בבעלי חיים או מידע פרטי שניתן לזיהויו. לפיכך, לא נדרשו אישורי אתיקה מוסדיים נוספים או הסכמה מדעת. מידע מפורט על הכלים ששימשו בפרוטוקול מופיע בטבלת החומרים.

1. מאגרי נתונים ציבוריים וניתוח ביו-אינפורמטיקה
נעשה שימוש במאגרי נתונים הזמינים לציבור, ולא נערך מחקר ישיר הכולל משתתפים אנושיים או בעלי חיים. נתונים טרנסקריפטומיים וקליניים הופקו מפרויקט The Cancer Genome Atlas Kidney Renal Clear Cell Carcinoma (TCGA-KIRC), ונתונים על ביטוי חלבונים נשלוף מ-Human Protein Atlas. גישה חישובית זו אפשרה סינון יעיל של מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים וקליניים רחבי היקף, תמכה בזיהוי ראשוני של סמני ביולוגיים מועמדים, וסיפקה בסיס לאישוש ניסיוני עוקב. כל האנליזות החישוביות בוצעו באמצעות תוכנה סטטיסטית.

2. רכישת נתונים ובחירת דגימות
הגישה לפורטל הנתונים של Genomic Data Commons בוצעה, ופרויקט TCGA-KIRC נבחר. נתונים של פרופיל תעתוק ומידע קליני תואם עבור קרצינומה של תאי כליה מסוג תאים בהירים (ccRCC) הורדו. נתוני ביטוי של messenger RNA שנורמלו לפי תעתוקים למיליון (TPM) שימשו לניתוחים טרנסקריפטומיים עוקבים. ערכי ביטוי של ARHGAP22 הופקו מהמטריצה הטרנסקריפטומית של TCGA-KIRC והותאמו לרשומות הקליניות התואמות באמצעות ברקודי הדגימות של TCGA. נכללו רקמות גידול ראשוניות ורקמות כליה נורמליות סמוכות עם נתוני ביטוי זמינים של ARHGAP22 והערות קליניות. דגימות עם ערכי ביטוי חסרים של ARHGAP22, מידע קליני או מידע הישרדותי מרכזי שאינו שלם, רשומות כפולות, או זמני הישרדות של פחות מ-30 ימים הוצאו מהניתוח. לאחר הסינון, 533 דגימות גידול ו-72 דגימות רקמה נורמלית סמוכה נשמרו לניתוחים המשכיים.

3. ניתוח ביטוי בסוגי סרטן שונים (Pan-cancer)
ניתוח ביטוי של ARHGAP22 בסוגי סרטן שונים בוצע באמצעות מודול ה-Gene_DE של TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org/; נגישה ב-12 באפריל, 2026). נתוני RNA-sequencing מ-TCGA שימשו להשוואת הביטוי של ARHGAP22 בין רקמות גידול לרקמות נורמליות תואמות במספר סוגי סרטן. ערכי הביטוי הוצגו כ-log2(TPM), וביטוי דיפרנציאלי הוערך באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum המיושם ב-TIMER2.0. ערך P דו-צדדי הפחות מ-0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

4. תיקוף חיצוני באמצעות GEO
תיקוף חיצוני בוצע באמצעות מערך הנתונים GSE167573 מ-Gene Expression Omnibus דרך הפלטפורמה המקוונת BEST (https://rookieutopia.hiplot.com.cn/app_direct/BEST/; נגישה ב-9 ביולי 2026). ביטוי של ARHGAP22 ברקמות ccRCC וברקמות כליה נורמליות הושווה באמצעות נתוני ביטוי מנורמלים שסופקו על ידי הפלטפורמה ונבדק באמצעות מבחן t של Student לא מזווג. לצורך ניתוח הישרדות, החולים חולקו לקבוצות של ביטוי גבוה ונמוך באמצעות שיטת נקודת החיתוך האופטימלית של הפלטפורמה, וההישרדות הכוללת הוערכה באמצעות ניתוח Kaplan–Meier עם מבחן log-rank. ערך P דו-צדדי של פחות מ-0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית.

5. ניתוח ביטוי של ARHGAP22
נתוני ביטוי של mRNA של ARHGAP22, מנורמלים לפי TPM, הופקו מקבוצת ה-TCGA-KIRC ועברו טרנספורמציה של log2(TPM + 1) לפני הניתוח הסטטיסטי. נבחן ביטוי דיפרנציאלי של ARHGAP22 בין רקמות גידול ראשוניות לבין רקמות כליה נורמליות סמוכות. מבחן Wilcoxon rank-sum שימש להשוואות לא מזווגות בין רקמות גידול לרקמות נורמליות. לצורך ניתוח מזווג, זוהו זוגות תואים של גידול-נורמלי באמצעות ברקודי המטופלים של TCGA, ומבחן Wilcoxon signed-rank הוחל כדי להשוות את ביטוי ARHGAP22 בין רקמות נורמליות סמוכות לבין רקמות הגידול התואמות. ערך P דו-צדדי הפחות מ-0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

6. ניתוח הישרדות ועקומות מאפייני תגובה של המקלט (ROC)
ניתוחי הישרדות וניתוחי מאפייני תגובה של המקלט (ROC) תלויי-זמן בוצעו באמצעות דגימות גידולים מ-TCGA-KIRC עם נתוני מעקב קליניים זמינים. זמן ההישרדות הכולל הומר מימים לשנים. החולים חולקו לקבוצות בעלות ביטוי גבוה ונמוך של ARHGAP22 בהתבסס על ערך הביטוי החציוני של ARHGAP22, ואותו ערך חיתוך הוחל באופן עקבי בכל הניתוחים שכללו חלוקה לקבוצות על בסיס ביטוי. עקומות קפלן-מייר (Kaplan–Meier) הופקו באמצעות חבילות survival ו-survminer. הבדלים בין הקבוצות הוערכו באמצעות מבחן log-rank. רגרסיית סיכונים פרופורציונלית של קוקס (Cox proportional hazards regression) שימשה להערכת יחסי סיכון ומרווחי סמך של 95%. עקומות ROC תלויי-זמן הופקו באמצעות חבילת timeROC. שטחים תחת העקומה בנקודות זמן של 1, 3 ו-5 שנים חושבו באמצעות שיטת השקלול של Aalen. ערך P דו-צדדי קטן מ-0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית.

7. ניתוח קשרים קליניקופתולוגיים
הקשר בין הביטוי של ARHGAP22 למאפיינים קליניקופתולוגיים נותח באמצעות דגימות גידולים מ-TCGA-KIRC. דגימות נורמליות הוסירו. הגיל סווג כ-65 שנים ומטה או מעל 65 שנים. דגימות עם הערות לא ידועות או חסרות הוסירו מהניתוח המתאים. למשווה בין שתי קבוצות נעשה שימוש במבחן הדירוג של וילקוקסון (Wilcoxon rank-sum test), ולביצוע השוואות הכוללות שלוש קבוצות או יותר נעשה שימוש במבחן קרוסקל-וואליס (Kruskal–Wallis). תרשימי כינור (Violin plots) נוצרו באמצעות חבילת ggpubr; ggplot2, ו-scales. לצורך ויזואליזציה במפת חום (heatmap), חולו חלוקת המטופלים לקבוצות בעלות ביטוי גבוה ונמוך של ARHGAP22 על בסיס ערך החציונה (median cutoff). קשרים בין קבוצות הביטוי למשתנים קליניקופתולוגיים הוערכו באמצעות מבחני חי-ריבוע (chi-square tests). מפות חום נוצרו באמצעות ComplexHeatmap, לאחר עיבוד מקדים עם limma. ערך P דו-צדדי של פחות מ-0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

8. בניית נומוגרמה
נומוגרמה פרוגנוסטית נבנתה על ידי שילוב של ביטוי ARHGAP22 עם מאפיינים קליניקו-פתולוגיים זמינים במודל רגרסיה של סיכונים פרופורציונליים של Cox. המודל שימש להערכת הישרדות כוללת ל-1, 3 ו-5 שנים בקוהורט TCGA-KIRC. מדדי סיכון עבור מטופלים בודדים חושבו באמצעות מודל Cox המותאם. עקומות כיול להישרדות כוללת ל-1, 3 ו-5 שנים הופקו בשיטת Kaplan–Meier עם 1,000 חזרות של דגימה חוזרת בשיטת bootstrap. נבחנה ההתאמה בין הסטירויות להישרדות שנחזו על ידי הנומוגרמה לבין תוצאות ההישרדות שנצפו. רגרסיית Cox בוצעה באמצעות חבילת survival. ויזואליזציה של הנומוגרמה ואנליזות כיול בוצעו באמצעות regplot ו-rms. ערך P דו-צדדי של פחות מ-0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

9. ניתוח ביטוי משותף
נתוני טרנסקריפטומיקה מדגימות גידולים של TCGA-KIRC שימשו להערכת קשרי ביטוי משותף בין ARHGAP22 לכל שאר הגנים באמצעות ניתוח מתאם פירסון (Pearson correlation analysis). גנים עם מקדם מתאם פירסון מוחלט הגבוה מ-0.6 וערך P נמוך מ-0.001 הוגדרו כגנים עם ביטוי משותף משמעותי. גנים עם ביטוי משותף משמעותי דורגו לפי הערך המוחלט של מקדם המתאם. הגנים בעלי הדירוג הגבוה ביותר נבחרו לבניית מטריצת מתאם, ודיאגרמת מיתרים (chord diagram) נוצרה כדי להמחיש את רשת הביטוי המשותף הקשורה ל-ARHGAP22.

10. ניתוחים של גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי והעשרה תפקודית
ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בין הקבוצות בעלות הביטוי הגבוה והנמוך של ARHGAP22 בוצע באמצעות מבחן הדירוג של וילקסון (Wilcoxon rank-sum test) עם תיקון עבור שיעור התגליות השגויות (FDR). גנים עם שינוי קיפול (fold change) בערך מוחלט של log2 הגבוה מ-1 ו-FDR נמוך מ-0.05 הוגדרו כגנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי מובהק. התוצאות הוצגו ויזואלית באמצעות תרשים הרי געש (volcano plot) ומפת חום (heatmap). ניתוחי העשרה של Gene Ontology ושל Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes בוצעו באמצעות clusterProfiler. סמלי גנים הומרו למזהי Entrez באמצעות org.Hs.eg.db. מונחי Gene Ontology ומסלולים של Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, שניהם בעלי ערך P נומינלי נמוך מ-0.05 וערך P מותאם FDR נמוך מ-0.05, נחשבו כמעשירים באופן מובהק. ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) בוצע באמצעות קבוצות גנים של Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes מקובץ ה-Molecular Signatures Database שנקרא c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt. הגנים דורגו לפי שינוי קיפול של log2, וקבוצות גנים עם ערך P נומינלי < 0.05 נחשבו למועשרים באופן מובהק.

11. ניתוח חדירת תאי מערכת החיסון ונקודות בקרה חיסוניות
ניתוחים של חדירת תאי מערכת החיסון ושל נקודות בקרה חיסוניות בוצעו באמצעות דגימות גידולים מ-TCGA-KIRC. ערכי StromalScore, ImmuneScore ו-ESTIMATEScore חושבו באמצעות חבילת estimate. שיעורי תאי מערכת החיסון נאמדו באמצעות סקריפט R של CIBERSORT, עם 1,000 פרמוטציות ונורמליזציית קוונטילים. דגימות עם ערך P של דקונבולוציית CIBERSORT נמוך מ-0.05 נשמרו. חולים חולקו לקבוצות של ARHGAP22-high ו-ARHGAP22-low על פי רמת הביטוי החציונית של ARHGAP22. הבדלים במדדי ESTIMATE ובשיעורי תאי מערכת החיסון בין שתי הקבוצות הוערכו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum. מתאמים בין ביטוי ARHGAP22 לבין גנים של נקודות בקרה חיסוניות הוערכו באמצעות ניתוח מתאם פירסון. ערכי P מהשוואות מרובות של תאי מערכת החיסון וממבחני מתאם של נקודות בקרה חיסוניות הותאמו באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg FDR, וערך FDR נמוך מ-0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית. גנים של נקודות בקרה חיסוניות שמעמדם היה משמעותי מבחינת FDR הוצגו באמצעות מפות חום של מתאמים שנוצרו בעזרת corrplot. עיבוד מקדמי נתונים והדמיות בוצעו בעיקר באמצעות limma; ggpubr; ו-corrplot.

12. חיזוי רגישות לתרופות
נתוני טרנסקריפטומיקה של גידולי TCGA-KIRC נעשה בהם שימוש לאחר הדרת דגימות של רקמה נורמלית. ערכי ריכוז מעכב חצית-מקסים (IC50) שנחזו באופן חישובי חושבו באמצעות חבילת oncoPredict ומסד נתונים ייחוס המבוסס על Genomics of Drug Sensitivity in Cancer 2. החולים חולקו לקבוצות של ביטוי ARHGAP22 גבוה וביטוי ARHGAP22 נמוך על פי ערך הביטוי החציוני של ARHGAP22. ערכי ריכוז מעכב חצית-מקסים שנחזו הושוו בין הקבוצות באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum. ערכי P מהשוואות של מספר תרופות תוקנו באמצעות שיטת Benjamini–Hochberg, וערך FDR נמוך מ-0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית. התוצאות פורשו כהערכות של רגישות לתרופות שנחזו באופן חישובי, ולא כתגובות לתרופות שאומתו ניסיונית או נצפו קלינית.

13. תיקוף באמצעות מאגר Human Protein Atlas
נעשה שימוש במאגר הנתונים Human Protein Atlas, ובו בוצע חיפוש עבור ARHGAP22. סקירה של מדור הרקמות (Tissue section) בוצעה כדי להעריך את ביטוי חלבון ARHGAP22 ברקמת כליה תקינה. לאחר מכן נפתח מדור הפתולוגיה (Pathology section), נבחר סרטן תאי כליה בעלי תאים בהירים (clear cell renal cell carcinoma), ונבחן ביטוי חלבון ARHGAP22 ברקמת הגידול. תמונות אימונוהיסטוכימיות מייצגות של רקמת כליה תקינה ושל רקמת ccRCC נשלפו ונבחרו להכללה במאמר, כדי להשוות את ביטוי חלבון ARHGAP22 בין רקמות תקינות לרקמות גידול.

תוצאות

פרופיל ביטוי של ARHGAP22 בסוגי סרטן שונים
פרופיל שעתוק רב-סרטני הראה הטרוגניות בולטת בביטוי של ARHGAP22 בין סוגי גידולים שונים ובין הרקמות הנורמליות התואמות להם (איור 1). נצפתה מגמה כללית של עלייה בביטוי ARHGAP22 במספר גידוליים מוצקים. ביטוי ARHGAP22 היה גבוה משמעותית ברקמות גידול מאשר ברקמות נורמליות תואמות בקרצינומה פולשנית של השד, בכולנגיוקרצינומה, בקרצינומה של תאי קשקשת של הראש והצוואר, בקרצינומה כרומופובית של הכליה, בקרצינומה של תאים בהירים של הכליה, בקרצינומה פפילרית של הכליה ובקרצינומה הפטו-סלולרית של הכבד. ממצאים אלו העידו על כך ש-ARHGAP22 מבוטא באופן דיפרנציאלי במספר סוגי סרטן ועשוי להיות רלוונטי כסמן ביולוגי הקשור לגידולים.

דפוס הביטוי והערך הפרוגנוסטי של ARHGAP22 בקרצינומה של תאי כליה מסוג תאים בהירים
דפוס הביטוי והרלוונטיות הקלינית של ARHGAP22 בקרצינומה של תאי כליה מסוג תאים בהירים (ccRCC) נבחנו באמצעות נתוני טרנסקריפטומיקה, ניתוחי הישרדות, סט נתונים חיצוני לאימות ותמונות אימונוהיסטוכימיות. ביטוי ARHGAP22 היה גבוה באופן מובהק ברקמות ccRCC מאשר ברקמות כליה נורמליות, הן בדגימות לא מזווגות והן בדגימות מזווגות של The Cancer Genome Atlas Kidney Renal Clear Cell Carcinoma (TCGA-KIRC) (איור 1B, C). ניתוח קפלן-מייר הראה כי לחולים עם ביטוי גבוה של ARHGAP22 הייתה הישרדות כוללת (OS) קצרה באופן מובהק מאשר לחולים עם ביטוי נמוך (P = 0.013; איור 1D). ניתוח עקומת ROC תלויית-זמן הניב שטח תחת העקומה של 0.641, 0.637 ו-0.641 עבור OS ל-1, 3 ו-5 שנים, בהתאמה, מה שמעיד על ביצועי פרוגנוזה מתונים (איור 1E). הממצאים נבחנו בהמשך באמצעות סט הנתונים העצמאי GSE167573. ביטוי ARHGAP22 היה גבוה באופן מובהק ברקמות ccRCC מאשר ברקמות כליה נורמליות (איור 1F), וביטוי גבוה של ARHGAP22 היה קשור ל-OS קצרה יותר (איור 1G). תמונות אימונוהיסטוכימיות שהושגו מה-Human Protein Atlas הראו צביעת חלבון חזקה יותר של ARHGAP22 ברקמת ccRCC מאשר ברקמת כליה נורמלית, מה שסיפק תמיכה נוספת ברמת החלבון לממצאי הטרנסקריפטומיקה (איור 1H, I).

ניתוח ביטוי של ARHGEF22; A: תרשים קופסה של הביטוי; B-D: עקומות הישרדות; E: עקומת ROC; F-H: השוואת רקמות.
איור 1: ביטוי Pan-cancer, דפוסי ביטוי וערך פרוגנוסטי של ARHGAP22 בקרצינומה של תאי כליה עם תאים בהירים. (A) פרופיל ביטוי Pan-cancer של ARHGAP22 במגוון סוגי גידולים וברקמות נורמליות תואמות. (B) ביטוי של ARHGAP22 בקרצינומה של תאי כליה עם תאים בהירים (ccRCC) לא מזווגים וברקמות כליה נורמליות. (C) ביטוי של ARHGAP22 ב-ccRCC מזווג ובסביבת רקמת כליה נורמלית. (D) עקומות הישרדות כללית של Kaplan–Meier המשוות בין מטופלים עם ביטוי גבוה ונמוך של ARHGAP22. (E) עקומות ROC (receiver operating characteristic) תלויות זמן המעריכות את הביצועים הפרוגנוסטיים של ARHGAP22 עבור הישרדות כללית של 1, 3 ו-5 שנים. (F) תיקוף של ביטוי ARHGAP22 במערך הנתונים GSE167573. (G) ניתוח הישרדות כללית של Kaplan–Meier במערך הנתונים GSE167573. (H, I) תמונות אימונוהיסטוכימיות מה-Human Protein Atlas המראות ביטוי של חלבון ARHGAP22 ברקמת כליה נורמלית (H) וברקמת ccRCC (I). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. קיצורים: ccRCC, clear cell renal cell carcinoma; OS, הישרדות כללית; ROC, receiver operating characteristic; DEG, גן עם ביטוי דיפרנציאלי; GO, Gene Ontology; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; GSEA, Gene Set Enrichment Analysis; FDR, שיעור גילוי שגוי; IC50, ריכוז עיכוב חציוני מקסימלי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

הקשר בין ARHGAP22 למאפיינים קליניקו-פתולוגיים
הקשר בין הביטוי של ARHGAP22 למאפיינים קליניקו-פתולוגיים נבדק כדי לקבוע האם הביטוי משתנה בהתאם לחומרת המחלה. ביטוי ARHGAP22 היה גבוה באופן משמעותי בחולים עם סיווגי T, M ו-N מתקדמים, כולל חולים עם מחלה גרורתית (איור 2A–C). הביטוי עלה גם עם התקדמות הדרגה ההיסטולוגית והשלב הקליני (איור 2D, E). ניתוח מפת חום (Heatmap) הראה קשרים משמעותיים נוספים בין ביטוי גבוה של ARHGAP22 לדרגה היסטולוגית גבוהה יותר, שלב קליני מתקדם וסיווג גרורות-קשרי לימפה-גידול (TNM) שאינו נוח (איור 2F). תוצאות אלו הצביעו על כך שביטוי מוגבר של ARHGAP22 היה קשור למאפיינים קליניקו-פתולוגיים אגרסיביים יותר ב-ccRCC.

תרשים כינור של ביטוי ARHGAP22; הניתוח הסטטיסטי כולל מבחני Kruskal-Wallis ו-Wilcoxon.
איור 2: קשר בין ביטוי ARHGAP22 למאפיינים קליניקופתולוגיים בקרצינומה של תאי כלייה מסוג תאים בהירים. (A–C) ביטוי ARHGAP22 לפי סיווג T, M ו-N, בהתאמה. (D) ביטוי ARHGAP22 לפי דרגה היסטולוגית. (E) ביטוי ARHGAP22 לפי שלב קליני. (F) מפת חום המראה קשרים בין ביטוי ARHGAP22 למאפיינים קליניקופתולוגיים. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מאפיינים קליניקופתולוגיים והישרדות כוללת
ניתוח Kaplan–Meier הראה הבדלים משמעותיים ב-OS בין תתי-קבוצות קליניקופתולוגיות (איור 3). לחולים עם דרגות היסטולוגיות גבוהות יותר, G3–G4, הייתה OS קצרה משמעותית מאשר לחולים עם דרגות נמוכות יותר, G1–G2 (P < 0.0001; איור 3A). גם לחולים עם מחלה בשלב III–IV הייתה OS קצרה משמעותית מאשר לחולים עם מחלה בשלב I–II (P < 0.0001; איור 3B). ההישרדות הכוללת נבדלה באופן משמעותי בין תתי-קבוצות של סיווג T, כאשר סיווגי T מתקדמים היו קשורים לתוצאות פחות טובות (P < 0.0001; איור 3C). לחולים עם גרורות בבלוטות הלימפה (N1) או גרורות מרוחקות (M1) הייתה גם היא OS קצרה משמעותית מאשר לאלה ללא גרורות בבלוטות הלימפה או גרורות מרוחקות (שניהם P < 0.0001; איור 3D, E). ממצאים אלו אישרו כי הדרגה ההיסטולוגית, השלב הקליני וסיווג ה-tumor-node-metastasis היו קשורים להישרדות ב-ccRCC.

עקומות קפלאן-מייר של הסתברות להישרדות מסרטן; השוואה בין דרגות ושלבים; מוצג p-value.
איור 3: הישרדות כוללת בהתאם למאפיינים קליניקופתולוגיים בקרצינומה של תאי כלליה שקיפים. (A–E) עקומות הישרדות כוללת של קפלאן-מייר בהתאם לדרגה היסטולוגית, שלב קליני, סיווג T, סיווג N וסיווג M, בהתאמה. אנא לחצו כאן להצגת גרסה מורחבת של איור זה.

נומוגרמה פרוגנוסטית לסרטן תאי כליה מסוג תאים בהירים
נומוגרמה פרוגנוסטית המשלבת את ביטוי ARHGAP22 עם מאפיינים קליניקו-פתולוגיים זמינים נבנתה כדי להעריך OS למשך שנה אחת, 3 שנים ו-5 שנים בחולים עם ccRCC (איור 4A). ניתוח כיול הראה התאמה בין הסבירויות להישרדות שנחזו על ידי הנומוגרמה לבין אלה שנצפו בכל שלוש נקודות הזמן. עקומות הכיול מוקמו קרוב לקו הייחוס האידיאלי, מה שמעיד על ביצועי כיול מספקים (איור 4B). למודל הקליני היה מדד התאמה (concordance index) של 0.779 (רווח בר סמך של 95%, 0.729–0.828), בעוד שהוספת ARHGAP22 הניבה מדד התאמה של 0.781 (רווח בר סמך של 95%, 0.735–0.827), דבר המעיד על שיפור פרוגנוסטי מינימלי.

תרשים נומוגרמה לחיזוי שיעורי הישרדות נצפים; תרשים OS מול OS חזוי עם קווי מגמה של שנים.
איור 4: נומוגרמה פרוגנוסטית המבוססת על ARHGAP22 ואנליזת כיול בקרצינומה של תאי כליה עם תאים בהירים. (A) נומוגרמה להערכת הישרדות כללית ל-1, 3 ו-5 שנים. (B) עקומות כיול המשוואות בין הישרדות כללית של 1, 3 ו-5 שנים שחזו בתוכה הנומוגרמה לבין זו שנצפתה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח רשת מולקולרית של ARHGAP22
ניתוח קורלציה בוצע כדי לאפיין את הרשת המולקולרית הקשורה לביטוי של ARHGAP22. רשת הקורלציה הראתה קשרים בין ARHGAP22 לבין גנים מרובים ב-ccRCC (איור 5A). ביטוי ARHGAP22 נמצא במתאם חיובי מובהק עם GMIP, TRPM2, CARD9, FMNL1, STAC3 ו-MYO9B. מתאמים שליליים מובהקים נצפו עם BSND, HEPACAM2, ATP6V1G3, TMEM38A ו-FOXI1 (איור 5B–L). ממצאים אלו הצביעו על כך שביטוי ARHGAP22 קשור לרשת ביטוי משותף (co-expression) מורכבת ב-ccRCC.

תרשימי מתאם של ביטוי גנים לניתוח ARHGAP22; דיאגרמת קשר מעגלית; תרשימי פיזור.
איור 5מאפיינים מולקולריים הקשורים ל-ARHGAP22 בקרצינומה של תאי כליה מסוג תאים בהירים. (A) רשת מתאמים המראה קשרים בין ARHGAP22 לבין גנים קשורין. (ב–ז) חיובי מתאמים בין ARHGAP22 לבין GMIP, TRPM2, CARD9, FMNL1, STAC3 ו-MYO9B, בהתאמה. (H–L) מתאמים שליליים בין ARHGAP22 לבין BSND, HEPACAM2, ATP6V1G3, TMEM38A ו-FOXI1, בהתאמה. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי הקשורים ל-ARHGAP22
דגימות של קרצינומה של תאי כליה עם תאים בהירים חולקו לקבוצות בעלות ביטוי גבוה ונמוך של ARHGAP22 בהתבסס על ערך הביטוי החציוני, ובוצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי. סך של 334 גנים הראו ביטוי מוגבר (upregulated), ו-38 גנים הראו ביטוי מופחת (downregulated) בקבוצת הביטוי הגבוה (איור 6A). ניתוח מפת חום (Heatmap) חשף דפוסי ביטוי מובחנים בין קבוצות ה-ARHGAP22 הגבוהה והנמוכה, מה שמעיד על כך שהגנים בעלי הביטוי הדיפרנציאלי שזוהו הפרידו בין שתי הקבוצות (איור 6B).

תרשימי ניתוח ביטוי גנים; כוללים תרשים געש (volcano plot), מפת חום, ותרשים נקודות להעשרה.
איור 6: גנים בעלי ביטוי מבדל הקשורים ל-ARHGAP22 והעשרה תפקודית. (A) תרשים געש של גנים בעלי ביטוי מבדל בין קבוצות עם ביטוי גבוה ונמוך של ARHGAP22. (B) מפת חום של גנים בעלי ביטוי מבדל. (C) ניתוח העשרה של Gene Ontology. (D) ניתוח העשרת מסלולים של Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. (E) ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) המראה מסלולים מועשרים בקבוצת הביטוי הגבוה של ARHGAP22. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

העשרה תפקודית של גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי הקשורים ל-ARHGAP22
ניתוח העשרה תפקודית בוצע כדי לאפיין את התהליכים הביולוגיים הקשורים לגנים בעלי הביטוי הדיפרנציאלי. ניתוח Gene Ontology הראה העשרה בתהליכים ביולוגיים הקשורים למערכת החיסון, כולל חיסון המתווך על ידי לוקוציטים, כימוטקסיס, ייצור ציטוקינים, והבדלה ושגשוג של לימפוציטים. ברמת הרכיב התאי, נצפתה העשרה במטריצה החוץ-תאית, גרנולות הפרשה ומבנים הקשורים לממברנה הפלזמית. ברמת התפקוד המולקולרי, נצפתה העשרה עבור פעילות ציטוקינים, קישור לרצפטורים של כימוקינים ופעילויות הקשורות למטאלופפטידאז (איור 6C). ניתוח Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes הראה העשרה משמעותית באינטראקציה בין ציטוקינים לרצפטורי ציטוקינים, סיגנלציה של כימוקינים, סיגנללציה של סידן ומסלולים הקשורים לזיהום ולמערכת החיסון (איור 6D). ניתוח Gene Set Enrichment Analysis זיהה בנוסף מספר מסלולים הקשורים למערכת החיסון שהיו מועשרים בקבוצה עם ביטוי גבוה של ARHGAP22 (איור 6E).

ARHGAP22 ומיקרו-סביבה חיסונית בקרצינומה של תאי כליה מסוג תאים בהירים
ניתוח מבוסס CIBERSORT של שיעורי תאי מערכת החיסון המוערכים הראה הבדלים משמעותיים בין הקבוצות בעלות ביטוי גבוה של ARHGAP22 וביטוי נמוך של ARHGAP22 (איור 7A). לאחר תיקון עבור שיעור גילוי שגוי (FDR), בקבוצה עם ביטוי גבוה של ARHGAP22 נמצאו שיעורים מוערכים גבוהים יותר של מקפגים מסוג M2 ותאי T רגולטוריים, ושיעורים מוערכים נמוכים יותר של תאי B נאיביים, תאי מאסט במצב מנוחה ותאים דנדריטיים מופעלים. ניתוח מתאמים הראה כי ביטוי של ARHGAP22 קשור באופן חיובי למקפגים מסוג M2 ולתאי T רגולטוריים, ובאופן שלילי לתאי B נאיביים, תאי מאסט במצב מנוחה ותאים דנדריטיים מופעלים (איור 7B). הערכות אלו שנגזרו מ-CIBERSORT הצביעו על כך שביטוי מוגבר של ARHGAP22 קשור לפרופיל מדכא חיסון ב-ccRCC.

תרשימי ניתוח ביטוי גנים; תרשימי קופסה, גרפי מתאם, מפות חום; השפעת ARHGAP22.
איור 7: הקשר בין ביטוי ARHGAP22 למאפייני המיקרו-סביבה החיסונית בקרצינומה של תאי כליה עם תאים בהירים. (A) הבדלים בחלקי תאי מערכת החיסון כפי שהוערכו על ידי CIBERSORT בין הקבוצות בעלות ביטוי ARHGAP22 גבוה ונמוך. (B) מתאמים בין ביטוי ARHGAP22 לחלקי תאי מערכת החיסון כפי שהוערכו על ידי CIBERSORT. (C) מפת חום של מתאמים המראה קשרים בין ביטוי ARHGAP22 לגנים של נקודות בקרה חיסוניות. (D) מטריצת מתאמים של ARHGAP22 ומולקולות של נקודות בקרה חיסוניות. (E) הבדלים ב-StromalScore, ImmuneScore ו-ESTIMATEScore בין הקבוצות בעלות ביטוי ARHGAP22 גבוה ונמוך, שחושבו באמצעות אלגוריתם ESTIMATE. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ARHGAP22, נקודות ביקורת חיסוניות ומרכיבי הסביבה המיקרוסכופית של הגידול
ביטוי גבוה של ARHGAP22 נמצא בקשר חיובי עם מספר גנים של נקודות ביקורת חיסוניות, כולל PDCD1LG2, CTLA4, LAG3, TIGIT ו-ICOS (איור 7C, D), דבר המצביע על קשר פוטנציאלי למאפיינים הקשורים להתחמקות חיסונית. ניתוח ESTIMATE הראה גם כי ערכי ה-StromalScore, ה-ImmuneScore וה-ESTIMATEScore היו גבוהים באופן משמעותי בקבוצה בעלת הביטוי הגבוה של ARHGAP22 (איור 7E), מה שמשקף עלייה במרכיבי הסטרומה והמערכת החיסונית בתוך הסביבה המיקרוסכופית של הגידול. ממצאים אלו העידו כי ביטוי ARHGAP22 היה קשור לפרופורציות תאי חיסון כפי שהוערכו ב-CIBERSORT, לביטוי נקודות ביקורת חיסוניות ולפרופיל של סביבה מיקרוסכופית של גידול מדכאת חיסון ב-ccRCC.

ARHGAP22 ורגישות לתרופות ממוקדות שנחזתה באופן חישובי
הקשר בין ביטוי של ARHGAP22 לבין רגישות לתרופות ממוקדות שנחזתה באופן חישובי הוערך על ידי השוואת ערכי ריכוז עיכוב חציוני מקסימלי (half-maximal inhibitory concentration) חזויים בין קבוצות הביטוי הגבוה והנמוך (איור 8A–I). לקבוצת הביטוי הנמוך היו ערכי ריכוז עיכוב חציוני מקסימלי חזויים נמוכים באופן מובהק עבור axitinib, sorafenib, savolitinib, foretinib, cediranib, alpelisib, buparlisib, afuresertib ו-ipatasertib. ערכי ריכוז עיכוב חציוני מקסימלי חזויים נמוכים יותר הצביעו על רגישות גבוהה יותר שנחזתה באופן חישובי. ממצאים אלו הצביעו על קשר בין ביטוי נמוך יותר של ARHGAP22 לרגישות חזויה גבוהה יותר לסוכנים הממוקדים שנבחנו. התוצאות ייצגו תחזיות חישוביות ולא היוו תגובות תרופתיות שעברו תיקוף ניסויי או קליני.

תרשימי קופסה המראים ניתוח רגישות של ARHGAP22 בקבוצות בסיכון נמוך לעומת גבוה; השוואה סטטיסטית.
איור 8: הקשר בין ביטוי ARHGAP22 לרגישות לטיפול תרופתי ממוקד שנחזה באופן חישובי בקרצינומה של תאי כליה מסוג תאים בהירים. (A–I) השוואה של ערכי ריכוז עיכוב חציוני מקסימלי שניתחנו באופן חישובי עבור axitinib, sorafenib, savolitinib, foretinib, cediranib, alpelisib, buparlisib, afuresertib, ו-ipatasertib, בהתאמה, בין הקבוצות עם ביטוי ARHGAP22 גבוה ונמוך. ערכי ריכוז עיכוב חציוני מקסימלי נמוכים יותר מעידים על רגישות תרופתית גבוהה יותר שנחזתה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

זמינות נתונים:
הנתונים הטרנסקריפטומיים והקליניים שנותחו במחקר זה הושגו מפרויקט The Cancer Genome Atlas Kidney Renal Clear Cell Carcinoma (TCGA-KIRC) הזמין לציבור (https://portal.gdc.cancer.gov/). נתונים חיצוניים לתיקוף ביטוי והישרדות הושגו ממאגר הנתונים GSE167573 של Gene Expression Omnibus. נתונים על ביטוי חלבונים נשגבו מ-Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/). נתוני ביטוי Pan-cancer נותחו באמצעות TIMER2.0, ותיקוף חיצוני בוצע באמצעות פלטפורמת BEST. נתוני ייחוס לרגישות לתרופות הושגו ממאגר הנתונים Genomics of Drug Sensitivity in Cancer 2, ומערכי גנים ששימשו לאנליזת העשרה הושגו מ-Molecular Signatures Database. מאגרי הנתונים המקוריים נגישים לציבור דרך המאגרים והפלטפורמות המתאימים. סקריפטי ה-R ששימשו לעיבוד נתונים, לניתוח סטטיסטי ולהדמיה מסופקים כ-קובץ משלים 1. תוצאות מעובדות מסופקות כ-טבלה משלימה 1, המכילה את תוצאות ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי המלאות; טבלה משלימה 2, המכילה את תוצאות העשרת ה-Gene Ontology; ו-טבלה משלימה 3, המכילה את תוצאות העשרת המסלולים של Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

טבלה נלווית 1: תוצאות מלאות של ניתוח ביטוי דיפרנציאלי. קובץ זה מכיל את הרשימה המלאה של הגנים בעלי הביטוי הדיפרנציאלי שזוהו בין קבוצות הביטוי הגבוה והנמוך של ARHGAP22, כולל מזהי גנים, ערכי ביטוי של הקבוצות, שינויי קיפול של log2, ערכי P, ערכי P מתוקננים לפי שיעור התגליות השגויות (FDR) וכיוון הרגולציה. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית 2: תוצאות ניתוח העשרה של אונטולוגיית גנים (Gene Ontology).קובץ זה מכיל את תוצאות ההעשרה המלאות של אונטולוגיית גנים עבור גנים המבטאים ביטוי דיפרנציאלי הקשורים ל-ARHGAP22, כולל קטגוריות של תהליכים ביולוגיים, רכיבים תאיים ותפקודים מולקולריים, יחד עם סטטיסטיקות העשרה, ערכי P, ערכי P מתוקננים, ספירת גנים ומזהי גנים קשורים.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה נלווית 3: תוצאות ניתוח העשרה של מסלולים מתוך ה-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. קובץ זה מכיל את תוצאות העשרה המלאות של מסלולי ה-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes עבור גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי הקשורים ל-ARHGAP22, כולל מזהים ושמות של מסלולים, סטטיסטיקות העשרה, ערכי P, ערכי P מתוקננים, ערכי q, ספירת גנים ומזהי הגנים הקשורים. נא ללחוץ כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים 1: סקריפטי R לעיבוד נתונים, ניתוח סטטיסטי וויזואליזציה. קובץ זה מכיל את סקריפטי ה-R ששימשו לעיבוד מקדמי של נתונים, ניתוח ביטוי, ניתוח הישרדות, ניתוח קשרים קליניקופתולוגיים, ניתוח ביטוי משותף, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, ניתוח העשרה פונקציונלית, ניתוח חדירת תאי מערכת החיסון, חיזוי רגישות לתרופות ויצירת איורים. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

קרצינומה של תאי הכליה (RCC) היא אחת המחלות הממאירות השכיחות ביותר של מערכת השתן, וקרצינומה של תאי כליה עם תאים בהירים (ccRCC) היא תת-הסוג ההיסטולוגי השכיח ביותר ותורמת באופן משמעותי לתמותה הקשורה ל-RCC. השכיחות של RCC עלתה באופן כללי בשנים האחרונות, עם שונות גאוגרפית בולטת. גורמי סיכון מבוססים כוללים עישון, השמנת יתר, יתר לחץ דם ומחלת כליות כרונית3˒4. למרות התקדמויות באבחון ובטיפול, ccRCC נותרת הטרוגנית מבחינה קלינית; חלק מהמטופלים מגיעים עם מחלה בשלב מתקדם או גרורתי, והישנות לאחר ניתוח וגרורות מרוחקות נותרו שכיחות2˒5˒26. לכן, זיהוי של סמנים ביולוגיים מולקולריים הקשורים להתנהגות הגידול ולפרוגנוזה נותר יעד חשוב במחקר של ccRCC. האנליזה הנוכחית הראתה כי ARHGAP22 היה בעל ביטוי מוגבר ב-ccRCC והיה קשור להישרדות כללית נמוכה יותר, למאפיינים קליניו-פתולוגיים שליליים, לשינויים טרנסקריפטומיים הקשורים למערכת החיסון, לפרופיל של מיקרו-סביבת גידול אימונו-סופרסיבית, ולהבדלים ברגישות שנחזתה חישובית לסוכנים ממוקדים. ממצאים אלו תומכים בערך הפוטנציאלי של ARHGAP22 כסמן ביולוגי פוטנציאלי לפרוגנוזה ולקשר למערכת החיסון, אם כי התועלת הקלינית והסיבתיות טרם הוכחו.

הגן ARHGAP22 מקודד לחלבון Rho GTPase-activating protein המעורב בוויסות השלד התאי ובניידות תאים. החלבון כולל מתחם pleckstrin homology, מתחם RhoGAP ואזור coiled-coil קצבי-C, והוא יכול להקיים אינטראקציה עם חלבונים מסוג 14-3-3, דבר המצביע על תפקיד בנדידת תאים המוןחית על ידי גורמי גדילה22. כחלבון הקשור ל-FilGAP, ARHGAP22 משתתף בוויסות אנטגוניסטי של ציר RhoA–Rac1 ובשליטה על מצבי נדידת תאים21˒27. ARHGAP22 ממוקם בעיקר באנדוזומים ויכול להיות מועבר לקפלי ממברנה (membrane ruffles) או לממברנה הפלזמית, שם הוא מעכב היווצרות של lamellipodia תלוי-Rac ופריסת תאים; מיקומו התת-תאי קשור קשר הדוק לפעילות RacGAP20˒23. דווחו גם קשרים הקשורים לגידולים. ב-ccRCC, ARHGAP22 זוהה כחלבון מועמד בניתוחים תעתוקיים הקשורים לעיכוב של חלבון 4 מכיל-bromodomain, והוא נקשר להישרדות כוללת נמוכה יותר28. חברים במשפחת ARHGAP קושרו גם לחלחול חיסוני מעודד גידולים ולהתקדמות מחלה בסרטן השלפוחית25, לביטוי משתנה ולווריאציות באקסונים בלוקמיה מיאלואידית חריפה24, ולתגובה דיפרנציאלית ל-bevacizumab בסרטן מעי גדול גרורתי29.

הממצאים הנוכחיים היו עקביים עם תצפיות אלו. ביטוי של ARHGAP22 עלה עם התקדמות בסיווגי T, N ו-M, בדרגה ההיסטולוגית ובשלב הקליני, וביטוי גבוה יותר היה קשור להישרדות כללית קצרה יותר. בעבר הוכח כי סיגנלינג של Rac מקדם צמיחה של ccRCC ומעבר אנגיוגני (angiogenic switching)16, בעוד שנתיב Rho GTPase/Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase נקשר להתנהגות ממאירה ב-ccRCC17. לפיכך, העלייה שנצפתה בביטוי של ARHGAP22 עשויה לשקף שינויים מולקולריים הקשורים לפנוטיפים תמוריים אגרסיביים. ניתוחים של ביטוי משותף (Co-expression) וביטוי דיפרנציאלי הראו עוד כי ARHGAP22 היה קשור לרשת שעתוק רחבה. מתאמים חיוביים נצפו עם גנים כולל FMNL1, CARD9 ו-TRPM2, בעוד שמתאמים שליליים נצפו עם גנים כולל BSND ו-FOXI1. תוצאות של Gene Ontology, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ו-Gene Set Enrichment Analysis הראו העשרה בחסינות המתווכת על ידי לוקוציטים, כיmotaxis, ייצור ציטוקינים, דיפרנציאציה ופרוליפרציה של לימפוציטים, אינטראקציות בין ציטוקינים לרספטורים וסיגנלינג של כימוקינים. רשתות כימוקינים תורמות לגיוס תאי חיסון, לצמיחת גידול ולגרור ב-RCC30, בעוד שהעשרה של נתיבים הקשורים למערכת החיסון נקשרה לפרוגנוזה רעה ולמיקרו-סביבה תמורית משונה ב-ccRCC31. קרצינומה של תאי כליה מסוג תאי בהירים מראה גם חתימות שעתוק חיסוניות מובחנות הקשורות לתוצאה קלינית ולמורכבות המיקרו-סביבה החיסונית32. קשרים דומים בין ביטוי גנים חריג, העשרה של נתיבי חיסון, פרוגנוזה רעה ודפוסי ביטוי משותף מורכבים דווחו בממאירות אחרות33.

ביטוי של ARHGAP22 היה קשור גם להבדלים במיקרו-סביבה החיסונית של הגידול. הקבוצה עם הביטוי הגבוה הראתה שיעורים מוערכים גבוהים יותר של תאי T רגולטוריים ומקרופאגים מסוג M2, ושיעורים מוערכים נמוכים יותר של תאי B נאיביים, תאי תסתית (mast cells) במצב מנוחה ותאי דנדריטיים מופעלים, לאחר תיקון עבור שיעור גילוי שגוי (FDR). נמצאו קשרים חיוביים גם בין ביטוי ARHGAP22 לבין מספר מולקולות של נקודות בקרה חיסונית (immune-checkpoint molecules), יחד עם ערכי ImmuneScore, StromalScore ו-ESTIMATEScore גבוהים יותר. קרצינומה של תאי כליה מסוג תאי בהירים (Clear cell renal cell carcinoma) מאופיינת בחדירה חיסונית משמעותית, אך מאפיין זה אינו מעיד בהכרח על תגובה אנטי-גידולית יעילה34. מצבים של תאי חיסון שאינם מתפקדים ומאפיינים של דיכוי חיסוני עלולים להגביל את יעילותם של חסמי נקודות בקרה חיסונית35. תאי T רגולטוריים ומקרופאגים מסוג M2 נקשרו לדיכוי חיסוני, להתקדמות הגידול ולפרוגנוזה גרועה ב-RCC36˒37, בעוד שביטוי מוגבר של נקודות בקרה חיסונית עשוי לשקף תהליכים הקשורים להתחמקות חיסונית38. לפיכך, התוצאות הנוכחיות מרמזות כי ביטוי גבוה של ARHGAP22 אינו קשור רק לחדירה חיסונית רבה יותר, אלא לפרופיל חיסוני הכולל מאפיינים הקשורים בדרך כלל לדיכוי חיסוני. פרשנות זו נשארת רמה של הסקה בלבד, מכיוון שהערכות תאי החיסון נגזרו מנתוני bulk RNA-sequencing ומשיטה חישובית אחת של דה-קונבולוציה (deconvolution).

נצפו הבדלים ברגישות לתרופות שחזו באופן חישובי גם בין קבוצות הביטוי של ARHGAP22. מאפיינים מולקולריים בסיכון גבוה נקשרו בעבר להסנפילציה חיסונית משובשת, העשרה של מסלולים חיסוניים ותגובה דיפרנציאלית לתרופות39. דווח כי חתימות גנים הקשורות למערכת החיסון ב-ccRCC מסוגלות להבדיל בין שיעורי הישרדות ולחזות תגובות דיפרנציאליות לאימונותרפיה ולטיפול ממוקד40˒41. בניתוח הנוכחי, לקבוצה עם ביטוי נמוך של ARHGAP22 היו ערכי ריכוז עיקוב חציוני מקסימלי (IC₅₀) חזויים נמוכים יותר עבור מספר סוכנים ממוקדים. ממצאים אלו מצביעים על קשר בין ביטוי ARHGAP22 לבין רגישות לתרופות שחזו באופן חישובי, אך אינם מוכיחים תגובה טיפולית בפועל או תועלת קלינית. מספר בחירות מתודולוגיות תמכו בעקביות האנליטית, כולל סינון איכות דגימות, שימוש בנקודת חיתוך אחידה לביטוי המבוססת על חציונה, סינון רמת ביטחון של תוצאות CIBERSORT ותיקון שיעור גילוי שגוי להשוואות מרובות. עם זאת, יש לפרש את הרגישות החזויה לתרופות כחוקרית, ויש צורך באימות עצמאי באמצעות נתוני תגובה לתרופות שנמדדו בניסוי או שנצפו באופן קליני.

יש להביא בחשבון מספר מגבלות. על אף ש-GSE167573 סיפק תיקוף חיצוני לביטוי של ARHGAP22 ולהקשרים שלו עם הישרדות, נדרש עדיין תיקוף בקוהורטות קליניות רב-מרכזיות גדולות יותר. הניתוחים התבססו במידה רבה על מאגרי נתונים ציבוריים רטרוספקטיביים ועל נתוני bulk RNA-sequencing; כתוצאה מכך, לא ניתן היה להבחין בין המקור התאי של ביטוי ARHGAP22 בקרב תאי גידול, תאי סטרומה ותאי מערכת חיסון חודרים. ביצוע single-cell RNA sequencing, immunofluorescence רב-צבעי (multiplex), או טרנסקריפטומיקה מרחבית (spatial transcriptomics) יעזרו לטפל במגבלה זו. חדירת תאי מערכת חיסון, ביטוי של נקודות בקרה חיסוניות (immune-checkpoint) ורגישות לתרופות הוסקו באופן חישובי וייתכן שאינם מייצגים באופן ישיר תפקוד ביולוגי או תגובה לטיפול קליני. לא נכללו במחקר שיטת דקונבולוציה חיסונית עצמאית, קוהורט אימונוהיסטוכימי מוסדי, או ניתוח הפרעה ניסויי (experimental perturbation analysis). בנוסף, הקשרים שנצפו אינם מבססים מערכות יחסים סיבתיות בין ביטוי ARHGAP22, גנים המובעים יחד, חדירת תאי מערכת חיסון ותגובה לתרופות. לפיכך, יידרשו ניסויים מכניסטיים, תיקוף קליני פרוספקטיבי והשוואות ביצועי מודלים לפני יישום קליני. באופן כללי, זרימת העבודה מספקת מסגרת הניתנת לשחזור להערכת סממנים ביולוגיים מועמדים באמצעות מאגרי נתונים מולקולריים ציבוריים, אך הרלוונטיות הביולוגית והקלינית של ARHGAP22 דורשת אישור עצמאי נוסף.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

במחקר זה נעשה שימוש בנתונים הזמינים לציבור מ-The Cancer Genome Atlas (TCGA). אנו מודים לרשת המחקר של TCGA על יצירתם ואספקתם של משאבים אלו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חבילת ה-R בשם circlizeגרסה 0.4.16CRANמשמש עבור תרשימי Circos ודיאגרמות מיתרים (chord diagrams).
חבילת ה-R clusterProfilerגרסה 4.12.0Bioconductorמשמש לאנליזות העשרה של GO, KEGG ו-GSEA.
חבילת ה-R ComplexHeatmapגרסה 2.20.0Bioconductorמשמש לוויזואליזציה של מפות חום מורכבות ומפות חום של אנוטציות קליניות.
חבילת ה-R‏ e1071גרסה 1.7.16CRANמשמש לרגרסיית וקטור תמיכה (support vector regression) בניתוחים הקשורים ל-CIBERSORT.
חבילת ה-R enrichplotגרסה 1.24.0Bioconductorמשמש לוויזואליזציה של תוצאות העשרה פונקציונלית.
חבילת ה-R שנקראת estimateגרסה 1.0.13חבילת R/חבילת מקורמשמש לחישוב מדדי סטרומה, מערכת החיסון ו-ESTIMATE.
חבילת ה-R ‏ggExtraגרסה 0.10.1CRANמשמש לתרשימי פיזור עם התפלגויות צפיפות שוליות.
חבילת ה-R ggplot2גרסה 3.5.1CRANמשמש להדמיה כללית של נתונים.
חבילת ה-R ‏ggpubrגרסה 0.6.0CRANמשמש עבור תרשימי קופסא (boxplots), תרשימי כינור (violin plots) והשוואות סטטיסטיות.
חבילת ה-R ggrepelגרסה 0.9.5CRANמשמש עבור תוויות טקסט שאינן חופפות בתרשימי הภูเขา (volcano plots).
חבילת ה-R limmaגרסה 3.60.4Bioconductorמשמש לעיבוד מקדים של נתוני ביטוי ולניתוחים הקשורים לביטוי דיפרנציאלי.
חבילת ה-R oncoPredictגרסה 1.2CRANמשמש לניבוי רגישות לתרופות על בסיס נתונים טרנסקריפטומיים.
חבילת ה-R בשם org.Hs.eg.dbגרסה 3.19.1Bioconductorמשמש לאנוטציה של גנים ולהמרה בין סמלי גנים למזהי Entrez.
חבילת ה-R pheatmapגרסה 1.0.12CRANמשמש להדמיה של מפת חום (heatmap).
חבילת ה-R בשם preprocessCoreגרסה 1.68.0Bioconductorמשמש לנורמליזציה של רבעונים (quantile normalization) בניתוחים הקשורים ל-CIBERSORT.
תוכנת Rגרסה 4.4.0R Foundation for Statistical Computingמשמש לניתוח סטטיסטי ולהדמיה.
חבילת ה-R‏ RColorBrewerגרסה 1.1.3CRANמשמש להפקת פלטת צבעים בוויזואליזציה.
חבילת ה-R regplotגרסה 1.1CRANמשמש להדמיה של נומוגרמה.
חבילת ה-R reshape2גרסה 1.4.4CRANמשמש לעיצוב מחדש של נתונים לפני ויזואליזציה.
חבילת ה-R‏ rmsגרסה 6.8.1CRANמשמש לבניית מודל פרוגנוסטי, לניתוח כיול ולניתוחים הקשורים לנומוגרמה.
חבילת ה-R ‏scalesגרסה 1.4.0CRANמשמש להתאמת קנה מידה ולהגדרות שקיפות צבע.
חבילת ה-R survivalגרסה 3.5.8CRANמשמש עבור רגרסיית קוקס (Cox regression) וניתוח הישרדות קפלן-מייר (Kaplan-Meier).
חבילת ה-R‏ survminerגרסה 0.4.9CRANמשמש להדמיה של עקומות הישרדות קפלן-מאייר.
חבילת ה-R ‏timeROCגרסה 0.4CRANמשמש לניתוח עקומות ROC תלויות-זמן.

מקורות

  1. Winter TD et al. Using Mendelian randomization to investigate etiologic heterogeneity across renal cell carcinoma subtypes. Int J Epidemiol. 2025;54(6):dyaf177. https://doi.org/10.1093/ije/dyaf177
  2. Hsieh JJ et al. Renal cell carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 2017;3:17009. https://doi.org/10.1038/nrdp.2017.9
  3. Capitanio U et al. Epidemiology of renal cell carcinoma. Eur Urol. 2019;75(1):74-84.
  4. Siegel RL, Miller KD, Fuchs HE, Jemal A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer J Clin. 2022;72(1):7-33.
  5. Wiechno P et al. Contemporary treatment of metastatic renal cell carcinoma. Med Oncol. 2018;35(12):156. https://doi.org/10.1007/s12032-018-1217-1
  6. Chen W et al. Targeting renal cell carcinoma with a HIF-2 antagonist. Nature. 2016;539(7627):112-117.
  7. Rydzanicz M, Wrzesiński T, Bluyssen HA, Wesoły J. Genomics and epigenomics of clear cell renal cell carcinoma: recent developments and potential applications. Cancer Lett. 2013;341(2):111-126.
  8. Barata PC, Rini BI. Treatment of renal cell carcinoma: current status and future directions. CA Cancer J Clin. 2017;67(6):507-524.
  9. Chowdhury N, Drake CG. Kidney cancer: an overview of current therapeutic approaches. Urol Clin North Am. 2020;47(4):419-431.
  10. Gulati S, Vaishampayan U. Current state of systemic therapies for advanced renal cell carcinoma. Curr Oncol Rep. 2020;22(3):26. https://doi.org/10.1007/s11912-020-0892-1
  11. Haga RB, Ridley AJ. Rho GTPases: regulation and roles in cancer cell biology. Small GTPases. 2016;7(4):207-221.
  12. Sahai E, Marshall CJ. RHO-GTPases and cancer. Nat Rev Cancer. 2002;2(2):133-142.
  13. Bustelo XR. RHO GTPases in cancer: known facts, open questions, and therapeutic challenges. Biochem Soc Trans. 2018;46(3):741-760.
  14. Crosas-Molist E et al. Rho GTPase signaling in cancer progression and dissemination. Physiol Rev. 2022;102(1):455-510.
  15. Li H, Peyrollier K, Kilic G, Brakebusch C. Rho GTPases and cancer. BioFactors. 2014;40(2):226-235.
  16. Goka ET, Chaturvedi P, Lopez DTM, Lippman ME. Rac signaling drives clear cell renal carcinoma tumor growth by priming the tumor microenvironment for an angiogenic switch. Mol Cancer Ther. 2020;19(7):1462-1473.
  17. Thompson JM, Landman J, Razorenova OV. Targeting the RhoGTPase/ROCK pathway for the treatment of VHL/HIF pathway-driven cancers. Small GTPases. 2020;11(1):32-38.
  18. Feng J et al. RhoJ promotes the progression of clear cell renal cell carcinoma via .the TNF-α/NF-κB axis. Transl Androl Urol. 2025;14(7):1849-1864.
  19. Guo K et al. Activation of RHO-GTPase gene pattern correlates with adverse clinical outcome and immune microenvironment in clear cell renal cell carcinoma. Clin Exp Med. 2025;25(1):67. https://doi.org/10.1007/s10238-025-01593-3
  20. Mori M, Saito K, Ohta Y. ARHGAP22 localizes at endosomes and regulates actin cytoskeleton. PLoS One. 2014;9(6):e100271. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0100271
  21. Nakamura F. FilGAP and its close relatives: a mediator of Rho-Rac antagonism that regulates cell morphology and migration. Biochem J. 2013;453(1):17-25.
  22. Hu SH et al. The weak complex between RhoGAP protein ARHGAP22 and signal regulatory protein 14-3-3 has 1:2 stoichiometry and a single peptide binding mode. PLoS One. 2012;7(8):e41731. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041731
  23. Mori M et al. Endosomal localization of RacGAP protein ARHGAP22 regulates its GAP activity in human melanoma cells. Anticancer Res. 2022;42(12):5763-5771.
  24. El-Masry OS, Alamri AM, Alzahrani F, Alsamman K. ADAMTS14, ARHGAP22, and EPDR1 as potential novel targets in acute myeloid leukaemia. Heliyon. 2022;8(3):e09065. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2022.e09065
  25. Yang C et al. Transcriptomic analysis identified ARHGAP family as a novel biomarker associated with tumor-promoting immune infiltration and nanomechanical characteristics in bladder cancer. Front Cell Dev Biol. 2021;9:657219. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.657219
  26. Schiavoni V et al. Recent advances in the management of clear cell renal cell carcinoma: novel biomarkers and targeted therapies. Cancers (Basel). 2023;15(12):3207. https://doi.org/10.3390/cancers15123207
  27. Sanz-Moreno V et al. Rac activation and inactivation control plasticity of tumor cell movement. Cell. 2008;135(3):510-523.
  28. Sakaguchi T et al. Bromodomain protein BRD4 inhibitor JQ1 regulates potential prognostic molecules in advanced renal cell carcinoma. Oncotarget. 2018;9(33):23003-23017.
  29. Stránská J et al. Copy number variation and clinical response to chemotherapy and bevacizumab in Czech patients with metastatic colorectal cancer. Klin Onkol. 2024;37(4):277-285.
  30. Parihar JS, Tunuguntla HS. Role of chemokines in renal cell carcinoma. Rev Urol. 2014;16(3):118-121.
  31. Chen Z, Wu R, Ma J, Zheng J. C chemokines are prognostic biomarkers correlated with diverse immune cell infiltrations in clear cell renal cell carcinoma. Transl Cancer Res. 2022;11(8):2501-2522.
  32. Şenbabaoğlu Y et al. Tumor immune microenvironment characterization in clear cell renal cell carcinoma identifies prognostic and immunotherapeutically relevant messenger RNA signatures. Genome Biol. 2016;17(1):231. https://doi.org/10.1186/s13059-016-1092-z
  33. Song DM et al. LIG1 is a novel marker for bladder cancer prognosis: evidence based on experimental studies, machine learning, and single-cell sequencing. Front Immunol. 2024;15:1419126. https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1419126
  34. Vuong L, Kotecha RR, Voss MH, Hakimi AA. Tumor microenvironment dynamics in clear-cell renal cell carcinoma. Cancer Discov. 2019;9(10):1349-1357.
  35. Burgers FH et al. Immunological features of clear-cell renal-cell carcinoma and resistance to immune checkpoint inhibitors. Nat Rev Nephrol. 2025;21(10):687-701.
  36. Davidsson S et al. Infiltration of M2 macrophages and regulatory T cells plays a role in recurrence of renal cell carcinoma. Eur Urol Open Sci. 2020;20:62-71.
  37. Zhang X et al. Tumor-associated M2 macrophages in the immune microenvironment influence the progression of renal clear cell carcinoma by regulating M2 macrophage-associated genes. Front Oncol. 2023;13:1157861. https://doi.org/10.3389/fonc.2023.1157861
  38. Tronik-Le Roux D et al. Comprehensive landscape of immune checkpoints uncovered in clear cell renal cell carcinoma reveals new and emerging therapeutic targets. Cancer Immunol Immunother. 2020;69(7):1237-1252.
  39. Hong J et al. A zinc metabolism-related gene signature for predicting prognosis and characteristics of breast cancer. Front Immunol. 2023;14:1276280. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1276280
  40. Xu W et al. Prognostic immunophenotyping clusters of clear cell renal cell carcinoma defined by the unique tumor immune microenvironment. Front Cell Dev Biol. 2021;9:785410. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.785410
  41. Gu J et al. A novel immune-related gene signature for predicting immunotherapy outcomes and survival in clear cell renal cell carcinoma. Sci Rep. 2023;13(1):18922. https://doi.org/10.1038/s41598-023-45966-8

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ARHGAP22TCGA KIRC
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.