מאמר שיטה

ליגציה מדויקת של העורק הכלילי השמאלי היורד (Left Anterior Descending Coronary Artery) באמצעות נקודות ציון אנטומיות במודל עכברי של אוטם שריר הלב

55 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72336

⸱

18 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 2National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 3Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education & Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province (Collaborative Innovation Center for Prevention of Cardiovascular Diseases), 4School of Integrated Traditional and Western Medicine, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה משרה אוטם שריר הלב בעכברים על ידי קשירה קבועה של העורק הכלילי השמאלי היורד (left anterior descending coronary artery), תוך שימוש בחריץ הבין-חדרי הקדמי (anterior interventricular sulcus) כנקודת ציון חיצונית הניתנת לשחזור לצורך מיקום מדויק של התפר. האוטם מאומת באמצעות אלקטרוקרדיוגרפיה, אקו-קרדיוגרפיה, צביעה היסטולוגית ואנליזה של סמנים ביולוגיים בסרום.

תקציר

ליגציה קבועה של העורק הכלילי השמאלי היורד (LAD) היא הגישה הנפוצה ביותר להקמת מודלים של עכביש לבבי (MI) בעכברים במחקר קרדיווסקולרי פרה-קליני. עם זאת, בפרוטוקולים קונבנציונליים, נקודת הליגציה ממוקמת בדרך כלל 1–2 mm מתחת לנספח העליה השמאלית, נקודת ייחוס שלעיתים קרובות קשה לזהות באופן מהימן במהלך הניתוח. בשילוב עם שונות בינאישית ניכרת באנטומיה של העורקים הכליליים בעכברים, הדבר מוביל לעיתים קרובות למיקום לא מדויק של ה-LAD, לאתרים לא עקביים של הליגציה ולפגיעה ביכולת השחזור בין מנתחים שונים. כדי להתגבר על מגבלות אלו, פרוטוקול זה מציג את החריץ הבין-חדרי הקדמי (AIS) כנקודת ייחוס להנחיית הליגציה של ה-LAD. ה-AIS הוא חריץ שטחי הנראה ישירות תחת המיקרוסקופ, כאשר ה-LAD עובר מיד תחתיו. בניגוד לגישות קונבנציונליות, הוא מספק רפרנס אנטומי יציב התומך בבחירה עקבית יותר של אתר הליגציה וקל יותר לזיהוי עבור מנתחים חסרי ניסיון. הפרוטוקול משלב הרדמה סטנדרטית בשאיפת isoflurane עם אינטובציה טרכאלית לא פולשנית, ומאמת את ה-MI באמצעות אלקטרוקרדיוגרפיה, אקו-קרדיוגרפיה, בדיקת ELISA, צביעה היסטופתולוגית והדמיה תלת-ממדית של העורק הכלילי. פרוטוקול זה מספק שיטה ניסויית מהימנה וניתנת לשחזור להשראת MI בעכברים לצורך חקירת השינויים הפתופיזיולוגיים והחיסוניים בעקבות MI.

מבוא

אוטם שריר הלב (MI), אחד הגורמים המובילים לתחלואה ותמותה קרדיווסקולרית ברחבי העולם, מהווה איום משמעותי על בריאות האדם1. MI מאופיין בהתחלה פתאומית, מהלך קליני קריטי ושיעור תמותה גבוה, נגרם בעיקר כתוצאה מחסימה תרומבוטית של העורקים הכליליים ועשוי להוביל לאיסכמיה חמורה של שריר הלב, נמק של קרדיומיוציטים בעקבותיה ושרשרת של סיבוכים, הכוללים הפרעות קצב, איסף לב ומות לב פתאומי2. למרות התקדמויות בולטות בקרדיולוגיה הקלינית, גישה מוגבלת לרקמת שריר לב אנושית ממשיכה לעכב את חקר המנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס ה-MI ואת הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות יעילות3. כתוצאה מכך, מודלים של בעלי חיים in vivo אמינים, ניתנים לשחזור ורלוונטיים קלינית, המשחזרים נאמנה את המאפיינים הקליניים ואת התקדמות ה-MI, נותרים חיוניים למחקרי מנגנונים ולהערכה טיפולית פרה-קלינית.

מאז ש-Johns ו-Olson ביססו לראשונה מודל של אוטם שריר הלב (MI) בעכברים בשנת 1954, עברו המתודולוגיות להשראת MI בעכברים עידון מתמיד4. קשירה קבועה של העורק הכלילי השמאלי היורד (LAD) תחת ויזואליזציה מיקרוסקופית ישירה הפכה לטכניקה הנפוצה ביותר, כיוון שהיא משחזרת מאפיינים פתולוגיים מרכזיים של MI בבני אדם, כולל איסכמיה מיקרוקרסולרית מקומית בשריר הלב, נמק של שריר הלב ועיצוב מחדש (remodeling) של החדרים לאחר האוטם5. עם זאת, קשירה קונבנציונלית של ה-LAD דורשת מומחיות מיקרו-כירורגית ניכרת הנרכשת בדרך כלל רק באמצעות הכשרה נרחבת, מה שמגביל את העקביות והשחזוריות של הפרוצדורה בין מנתחים ומעבדות שונות6. יתרה מכך, סיבוכים תוך-ניתוחיים ולאחר ניתוח — כולל דימום, פגיעה ריאתית או קריסת ריאה, מיקום שגוי של הקשירה ונזק רקמתי מכני כתוצאה מאוורור לא מספיק — תורמים לתמותה פרי-אופרטיבית גבוהה יחסית, מה שמגביל עוד יותר את היישום הנרחב של מודל זה7. בתגובה למגבלות אלו, Gao ועמיתיו הציגו טכניקה משופרת הכוללת קשירת LAD באמצעות היפוך הלב (cardiac eversion), המפשטת את ההליך הכירורגי ומנמיכה את הסף הטכני להקמת המודל8. גישות ניסיוניות נוספות, כולל פגיעה קריוגנית של העורקים הכליליים והשראה פרמקולוגית של פגיעה בשריר הלב, פותחו אף הן ליישומים מחקריים ספציפיים9,10. למרות זאת, קשירה קבועה של ה-LAD תחת ויזואליזציה ישירה נותרת השיטה המועדפת, כיוון שהיא משחזרת בצורה המדויקת ביותר את המאפיינים הפתופיזיולוגיים העיקריים של MI בבני אדם, תוך שהיא מאפשרת השראה מבוקרת של גודל ומיקום האוטם.

למרות השימוש הנרחב בה, ליגציה קונבנציונלית של ה-LAD נותרת מוגבלת בשל זיהוי משתנה של אתר הליגציה, חוסר עקביות פרוצדוראלית, תמותה פרי-אופרטיבית גבוהה יחסית, ושונות בין-מעבדתית ברבטיביליות, שכולן עלולות להשפיע על המהימנות וההשוואתיות של תוצאות ניסיוניות11. המטרה הכללית של הפרוטוקול הנוכחי היא לבסס שיטה סטנדרטית וניתנת לשחזור יותר לליגציה קבועה של ה-LAD בעכברים, על ידי שימוש ב-anterior interventricular sulcus (AIS) כסימן אנטומי חיצוני לאיתור כלי הדם. במקום להעריך את אתר הליגציה במרחק קבוע מתחת ל-left atrial appendage, פרוטוקול זה מזהה את ה-AIS — חריץ שטחי רדוד הגלוי ישירות תחת הדמיה מיקרוסקופית ומכסה את ה-LAD — כנקודת ייחוס אנטומית יציבה להכוונת הליגציה. בהשוואה להערכה קונבנציונלית המבוססת על סימנים, גישה זו נועדה להקל על בחירה עקבית יותר של אתר הליגציה, להפחית שונות התלויה במבצע, ולשפר את הנגישות עבור מנתחים פחות מנוסים, תוך שמירה על תאימות לפרוצדורות סטנדרטיות של MI בעכברים. לפיכך, פרוטוקול זה מתאים לחוקרים המחפשים שיטה כירורגית ניתנת לשחזור ליצירת מודלים של MI קבוע למחקרים של פגיעה בשריר הלב, remodeling ונטריקולרי, דלקת ומכניזמים קשורים של מחלות קרדיווסקולריות.

פרוטוקול

כל הניסויים הכוללים בעלי חיים בוצעו באישור ועדת האתיקה של מרכז הניסויים בבעלי חיים של Southwest Medical University (מספר אישור SWMU20240146). במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים מסוג C57BL/6J (נקיים מפתוגנים ספציפיים [SPF]), בגיל 8–10 שבועות ובמשקל 20.0 ± 3.0 g. יש להתאם את העכברים למשך שבוע אחד בתנאי מעבדה סטנדרטיים (2°C ± 2°C; מחזור של 12 שעות אור/12 שעות חושך) לפני תחילת הניסויים.

1. הכנה טרום-ניתוחית

  1. הכינו והסדירו את כל הכלים הכירורגיים ביום הניתוח, כולל פינצטות, מספרי עיניים, מחזיק מחטים, המוסטט מיקרו-mosquito, מפשע עיפנים בצורת V, תפרי ניילון 7-0 עם מחט (3/8-circle), תפרי ניילון 6-0 ותפרי ניילון 5-0. עקרו את כל כלי המתכת באוטוקלב ב-121°C למשך 20 min לפני הפרוצדורה, ועקרו אותם מחדש בין חיות באמצעות סטריליזטור חרוזי זכוכית (250°C למשך 15 s), ולאחר מכן קררו אותם על פד סטרילי. השתמשו בתפרי ניילון מאריזות סטריליות אטומות.
  2. הקימו שני אזורי עבודה נפרדים כדי לשמור על טכניקה אספטית. הכינו אזור אחד עם פינצטות, ערכה לאינטובציה של קנה הנשימה בעכברים ומכונת הרדמה, והכינו אזור ניתוחי סטרילי שני עם כלים שעברו עיקור, מקלוני צמר, פובידון-יוד וגזה סטרילית.
  3. מרחו קרם להסרת שיער באזור החזה למשך 1 min. הסירו את הקרם ואת השיער בעדינות באמצעות גזה סטרילית טבולה במים סטריליים או בתמיסת סליין.
    1. הסרת שיער לבדה אינה מהווה הכנה כירורגית של העור. בצעו חיטוי אספטי סופי של העור וכיסוי בשמיכות סטריליות רק לאחר הרדמה, אינטובציה וקיבוע של העכבר על פלטפורמת הניתוח, מיד לפני החתך בעור (שלב 2.6).
  4. מתנו צפזולין (30 mg/kg) בהזרקה אינטריפרוטוניאלית שעה אחת לפני הניתוח. השחילו את צפזולין נתרן להזרקה בתמיסת סליין סטרילית 0.9% לריכוז עבודה של 30 mg/mL, ומתנו כ-0.2 mL לכל 20 g ממשקל הגוף כדי להגיע למינון המטרה. המשיכו במתן הפרוצדורה פעם ביום למשך 5 ימים רצופים לאחר הניתוח.
    הערה: אין למתון סוכני המוסטזיס (עצירת דימומים) פרמקולוגיים סיסטמיים או מקומיים בפרוטוקול זה. השיגו המוסטזיס תוך-ניתוחי על ידי הפעלת לחץ עדין ורציף באמצעות מקלוני צמר סטריליים למשך 10–30 s, או עד להפסקת הדימום.

2. השראת הרדמה ואינטובציה של הקנה

  1. הניחו את העכבר בתא ההשראה (16 × 10 × 1 cm) המחובר למכונת ההרדמה. הגדירו את קצב זרימת גז הנשא ל-0.5 L/min והשריעו הרדמה באמצעות 3.5%–4.0% isoflurane.
    הערה: ודאו הרדמה נאותה על ידי היעדר רפלקס נסיגת כף הרגל. תחת הגדרות אלה, העכבר מגיע בדרך כלל למישור הרדמה כירורגי תוך 2–4 min.
  2. מקמו את העכבר המורדם בשכיבה על הגב (supine) על פלטפורמת האינטובציה הטרכאלית לעכברים. תלו את העכבר על ידי תליית השיניים הקדמיות העליונות על גומיות הפלטפורמה, כך שהראש והצוואר יהיו פשוטים בזווית של כ-45°. יישרו את הצירים האורליים, הפרינגיאליים והלרינגיאליים כדי להביא את הגלוטיס למבט ישיר.
  3. בצעו אינטובציה אורוטראכאלית
    1. בצעו אינטובציה אורוטראכאלית תחת לרינגוסקופיה ישירה ללא טרכאוטומיה כדי להבטיח הנשמה מכנית מבוקרת. השתמשו בקטטר תו-ורידי 20 G (קוטר חיצוני, כ-0.9 mm; אורך, כ-15 mm) כצינור אינטובציה.
    2. פתחו את הפה והסיטו בעדינות את הלשון לצד אחד באמצעות פינצטה. הכניסו את להב הלרינגוסקופ לבעלי חיים קטנים לאורך גב הלשון והורידו את בסיס הלשון.
    3. הקדימו את הלרינגוסקופ עד שהאפיגלוטיס יהיה גלוי. הרימו את הלרינגוסקופ למעלה ולפנים לאורך ציר הידית כדי להרים את האפיגלוטיס ולחשוף את פתח הגלוטיס בצורת V ואת מיתרי הקול החיוורים.
    4. הכניסו את הקטטר דרך הגלוטיס הפתוח במהלך נשיפה תוך שמירה על ויזואליזציה ישירה של מיתרי הקול. הוציאו את הלרינגוסקופ לאחר שהקטטר עובר דרך הגלוטיס.
    5. הכניסו את הקטטר לעומק של כ-5–7 mm. הוציאו את המנדרין (stylet) וחברו את הקטטר למנשם.
      הערה: ודאו מיקום נכון של צינור האינטובציה על ידי תצפית על תנועה סימטרית בילטרלית של דופן החזה המסונכרנת עם המנשם. אם תנועת דופן החזה היא מינימלית ותנועה בטנית קצבית מתרחשת במקומה, בליווי התפכחות הדרגתית מההרדמה, הוציאו את הקטטר מהוושט וחזרו על האינטובציה.
    6. אם לא ניתן לראות את הגלוטיס, הוציאו את הלרינגוסקופ ומקמו מחדש את העכבר על פלטפורמת האינטובציה כאשר הראש והצוואר פשוטים בזווית של כ-45°. יישרו מחדש את הצירים האורליים, הפרינגיאליים והלרינגיאליים, הסירו הפרשות אורופרינגיאליות בעזרת מקל צמר סטרילי, וחזרו על הלרינגוסקופיה. אם העכבר מראה סימנים להתעוררות מההרדמה, החזירו אותו לתא ההשראה, העמיקו את ההרדמה ולאחר מכן חזרו על ניסיון האינטובציה.
    7. הפסיקו את הפרוצדורה אם העכבר מפתח כיאנוז, דימום לרינגיאלי או apnea מתמשכת. הפסיקו את מתן ה-isoflurane והניחו את העכבר על משטח חימום בבקרה תרמית (37°C) עד שיתאושש לחלוטין.
    8. אל תמשיכו לתומיקטומי אם האינטובציה הטרכאלית לא הצליחה. קבעו מועד חדש לפרוצדורה למפגש מאוחר יותר או הוציאו את בעל החיים מהמחקר ורשמו זאת ככישלון פרוצדורלי.
      הערה: ניסיונות אינטובציה חוזרים עלולים לגרום לבצקת לרינגיאלית, מה שמגביר את הסיכון למצוקה נשימתית לאחר הניתוח. ברוב המקרים, אינטובציה מוצלחת מושגת בתוך שני הניסיונות הראשונים לאחר ויזואליזציה ישירה של הגלוטיס. מיומנות באינטובציה אורוטראכאלית דורשת תרגול והכרות עם הטכניקה.
  4. ספקו אוויר כגז הנשא בקצב זרימה של 0.5 L/min ושמרו על הרדמה עם 1.5%–2.0% isoflurane. הגדירו את המנשם לקצב נשימה של 130 breaths/min, נפח שוטף (tidal volume) של 2 mL, ויחס נשימה-פירהה של 5:4.
    הערה: נפח השוטף המוגדר במנשם עולה על הערך התאורטי המוערך ממשקל הגוף מכיוון שהוא מפצה על הנפח הדחיס של מעגל המנשם ועל הנפח המת (dead space) של צינור האינטובציה. העריכו את ההנשמה לאורך כל הפרוצדורה על ידי ניטור העכבר לסימני כיאנוז וסימני ברוטראומה, כולל פנאומותורקס ואמפיזמה תת-עורית.
    1. נטרו את עומק ההרדמה באופן רציף לאורך כל הפרוצדורה. העריכו את תבנית הנשימה ואת רפלקס נסיגת כף הרגל בכל 2 min. נטרו את קצב הלב באופן רציף באמצעות אקג (ECG), וכוונו את ריכוז ה-isoflurane כדי לשמור על קצב לב של 40–50 beats/min; ריכוז isoflurane של 1.5%–2.0% הוא בדרך כלל מספיק. לאורך הפרוצדורה, עקבו אחר מאמץ נשימה ספונטני נגד המנשם, תנועות שפם ושינויים בצבע ריריות הפה.
    2. הגבירו את ריכוז ה-isoflurane במדרגות של 0.5%, עד למקסימום של 3.0%, אם רפלקס נסיגת כף הרגל מופיע מחדש, נצפית תנועת שפם או מתרחש מאמץ נשימה ספונטני נגד המנשם. הפחיתו את ריכוז ה-isoflurane במדרגות של 0.5%, עד למינימום של 1.0%, אם קצב הלב יורד מתחת ל-350 beats/min. עצרו את הפרוצדורה הכירורגית בכל פעם שסימנים אלה נצפים, המשיכו לנטר את קצב הלב, תבנית הנשימה, צבע הריות ותנועת השפם, וחזרו לפרוצדורה רק לאחר שהפרמטרים הפיזיולוגיים התייצבו.
  5. הטו את העכבר לכיוון הצד הימני כאשר הצד השמאלי פונה למעלה כדי לחשוף את דופן החזה השמאלית. קבעו את ארבע הגפיים ואת הזנב לפלטפורמה באמצעות סרט הדבקה.
  6. חטאו את אזור הניתוח בשלוש יישומים עוקבים של povidone–iodine. לכל יישום, השתמשו במקל צמר סטרילי חדש, החל מאתר החתך המתוכנן והתרחקו החוצה בספירלה קונצנטרית למרחק של כ-1 cm מעבר לחתך המתוכנן בכל הכיוונים. השליכו את מקל הצמר לאחר כל יישום, ואל תחזירו מקל צמר משומש למרכז השטח הכירורגי. אפשרו ליישום האחרון להתייבש לחלוטין באוויר, ולאחר מכן הניחו סדין סטרילי, כאשר רק השטח הכירורגי נשאר חשוף לפני ביצוע חתך העור.

3. תורהקותומיה וחשיפת הלב

הערה: זרימת העבודה הכירורגית הכוללת, הכוללת את מיקום בעל החיים, תורקוטומיה (פתיחת חזה), חשיפת הלב, קשירת העורק הכלי LAD, סגירת בית החזה והתאוששות לאחר הניתוח, מומחשת ב- איור 1 ו- איור 2.

תרשים של אנטומיית הלב עם נקודת הליגציה והעורקים הכליים; תמונות של אתר הניתוח.
איור 1מיקום אנטומי של נקודת הליגציה של העורק הכלילי השמאלי היורד הקדמי (LAD) באמצעות החריץ הבין-חדרי הקדמי. (A) מבט ונטראלי על לב עכבר חשוף לפני ליגציה, המראה את החריץ הבין-חדרי הקדמי (AIS). (B) מבט על אותו אזור לאחר ליגציה של העורק הכלי השמאלי היורד (LAD); האזור המוקף בעיגול מציין אתר הליגציה. (C) תרשים המראה את הקשר המרחבי בין ה-AIS לעורקים הכליים. ה-LAD עובר לאורך ה-AIS, ונקודת הליגציה ממוקמת בשליש העליון של החריץ. RCA, עורק כלי ימני; LCA, עורק כלי שמאלי; LCX, עורק כלי שמאלי נסיגי (circumflex). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סדר הפרוצדורה הכירורגית בעכבר, חשיפת הלב, מחקר ניסויי, תרשים שלב אחר שלב.
איור 2הליך כירורגי לליגציה של העורק הכלי השמאלי היורד בעכברים, המודרכת על ידי החריץ הבין-חדרי הקדמי. (A) מקם וקבע את העכבר המורדם כאשר אזור החזה השמאלי גזור שיער. (B) בצע חתך בעור מעל דופן החזה השמאלית. (C) הפר את שרי החזה וזהה את המרווח הבין-צלעי המתאים לתו racksotomy (פתיחת בית החזה). (D,E) הכנס ומקם את מנתח החזה (chest retractor) כדי להרחיב את המרווח הבין-צלעי ולחשוף את שדה הניתוח. (F) התבונן בלב החשוף וזהה את התלם הבין-חדרי הקדמי (AIS). (G) העבר תפר ניילון 7-0 לרוחב ה-AIS ותחת העליל הכלי השמאלי היורד (LAD). (H) קבע את התפר כדי ליצור קשירה (ligation) קבועה של ה-LAD. (I) הסר את מנתח החזה וסגור את דופן החזה. (J,K) סגור את שכבות השריר והעור באופן רצופי. (L) אפשר לעכבר להתאושש תחת חימום לאחר הניתוח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של דמות זו.

  1. באמצעות מספריים אופתלמיים, בצעו חתך עורי לאורך של 1 cm בדופן בית החזה השמאלית, במקביל לציר האורכי של העצם הסטרנום (sternum) ובמרחק של כ-2 mm לטרלית לשפה השמאלית של הסטרנום. חשפו את שרי החזה שמתחתינו.
  2. באמצעות פינצטה עדינה, הפרידו בעדינות (blunt separation) את שרי ה-pectoralis major וה-pectoralis minor לאורך כיוון הסיבים שלהם. הגדילו את הגישה על ידי דחיפת השרירים לטרלית כדי לחשוף את הצלעות ואת המרווחים הבין-צלעיים, והימנעו מחיתוך השרירים כדי למזער דימומים.
  3. זהו את המרווח הבין-צלעי המתאים לפני פתיחת חל בית החזה. אתרו את העורק הבין-צלעי הקדמי (anterior intercostal artery), ענף של העורק התוראקי הפנימי העובר בתוך מרווח בין-צלעי במקביל לצלעות, וזהו את המרווח הבין-צלעי השלישי, הנמצא מיד קרניאלית לעורק הנראה באופן העקבי ביותר במרווח הבין-צלעי הרביעי.
  4. אם העורק הבין-צלעי הקדמי אינו נראה בבירור, מיששו את הצלע הראשונה וספרו קודאלית כדי לזהות את המרווח שבין הצלע השלישית לרביעית. ודאו שהמרווח הבין-צלעי שנבחר מספק מבט ישיר וללא הפרעות על העליקה של העליה השמאלית (left atrial appendage) ועל הדופן החופשית הקדמית של החדרי השמאלי לפני ההמשך.
    הערה: זיהוי מדויק של המרווח הבין-צלעי השלישי הוא חיוני, כיוון שמיקום שגוי של התורקוטומיה עלול לצמצם את השקיפות של הלב ולפגוע בפרוצדורה.
  5. בצעו תורקוטומיה דרך המרווח הבין-צלעי השמאלי השלישי. הרחיבו בעדינות את המרווח הבין-צלעי באמצעות רטרקטור עפעפיים בצורת V עד שהעליקה של העליה השמאלית והשליש העליון של החדרי השמאלי נחשפים בבירור בשדה הניתוחי.
    הערה: בשלב זה, הלב נותר מכוסה על ידי הפריקרדיום; לכן, לא ניתן לזהות את ה-AIS באופן מהימן. זהו את ה-AIS רק לאחר פתיחת הפריקרדיום (שלב 3.6), כפי שמתואר בשלבים 4.2–4.3.
  6. תפסו בעדינות את הפריקרדיום עם זוג אחד של פינצטה עדינה והרימו אותו מהמיוקרדיום. השתמשו בזוג שני של פינצטה עדינה כדי לקרוע את הפריקרדיום לאט ולחשוף את הלב במלואו.

4. ליגציה של העורק הכלי השמאלי היורד הקדמי (LAD) בהנחיית נקודות ייחוס

  1. השחילו תפר ניילון 6-0 דרך דופן בית החזה והפעילו מתיחה עדינה כדי להרחיב את שדה הניתוח. חשפו את ה-AIS במלואו לפני זיהוי אתר הליגציה (איור 1A).
  2. זהו את ה-AIS כחריץ רדוד העובר באלכסון מבסיס הלב לעבר apex ומסמן את גבול השטח בין החדר השמאלי לימני (איור 1C). תחת המיקרוסקופ, זהו אותו כשקע מעין-מעגלי הממוקם כ-1–2 mm מתחת לשוליים התחתונים של הנספח של העלייה השמאלית.
  3. אם קשה לזהות את ה-AIS, נגבו בעדינות את פני השטח של an-epicardium באמצעות מקלון צמר ספוג בתמיסת סלין חמה. בחנו שוב את שדה הניתוח תחת המיקרוסקופ כדי לזהות את החריץ בבירור רב יותר.
    הערה: תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, ה-AIS הוא חריץ רדוד שניתן לזיהוי בקלות, המגדיר אנטומית את הגבול הבין-חדרי, כאשר עורק LAD עובר מיד תחתיו. אם ה-AIS נותר לא ברור לאחר הניגוב, ודאו תחילה שהתורקוטומיה מספקת חשיפה נאותה. לאחר מכן, זהו את ה-LAD ישירות לפי שיטות שדווחו בעבר: ביחס לוריד הלבבי הנלווה לו, העורק הוא בעל גוון ורוד יותר, קטן יותר בקליבר ופועם באופן מובחן12.
    1. אם לא ניתן לזהות את ה-AIS או את עורק ה-LAD, ודאו תחילה שהתורקוטומיה בוצעה דרך המרווח הבין-צלעי השמאלי השלישי. במידת הצורך, מנקו מחדש את התורקוטומיה כפי שמתואר בשלבים 3.3–3.5, ולאחר מכן חזרו על זיהוי ה-AIS וה-LAD כפי שמתואר בשלבים 4.1–4.3.
    2. סיימו את הפרוצדורה אם לא ניתן לזהות את ה-AIS או את ה-LAD לאחר 10 min של בדיקה קפדנית, אם מתרחש דימום בלתי נשלט, אם סך זמן הפרוצדורה בבית חזה פתוח עולה על 20 min, או אם קצב הלב נשאר מתחת ל-300 beats/min למרות התאמת עומק ההרדמה. הרדימו את העכבר עמוק ב-5% isoflurane, בצעו לו המתנזים על ידי פריקה צווארית, ורשמו את החיה ככישלון פרוצדורלי לצורך הכללתה בניתוח תוצאות הניתוח.
  4. השחילו תפר ניילון 7-0 לרוחב החריץ בשליש העליון של ה-AIS (איור 1B). הכניסו את המחט בניצב לפני השטח של an-epicardium לעומק של כ-0.5–1 mm, כאשר נקודות הכניסה והיציאה ממוקמות בצדדים מנוגדים של החריץ ומקיפות בקירוב את רוחבו המקסימלי.
  5. אבטחו את הליגטורה באמצעות קשר כירורגי. כוונו את הליגטורה עד להופעת הבהרה (blanching) מיידית של ה-myocardium הדיסטלי לאתר הליגציה לאחר הקשר הראשון, ללא שקיעה ניכרת של הרקמה המקומית.
    הערה: הדקו את התפר רק במידה המספיקה לחסימת זרימת דם קרונלית. מתיחה מוגברת עלולה לפגוע ב-myocardium הסמוך או לגרום לתפר לחתוך את הכלי והרקמה שמסביבו.
  6. אשרו חסימה קרונלית מוצלחת תוך 1 min מהליגציה על ידי התבוננות בהבהרה איסכמית מפוזרת של ה-myocardium הדיסטלי לאתר הליגציה12. אשרו את החסימה באופן נוסף על ידי זיהוי ST-segment elevation ב-ECG.
  7. אם האזור האיסכמי קטן מדי או אם אין הבהרה, שחררו את הליגטורה וחזרו על הליך הליגציה.

5. סגירה והחלמה לאחר הניתוח

  1. הסר בזהירות את גורם פתיחת העפעף בצורת V. סגור את הטורקוטומיה באמצעות תפר nylon 5-0 בודד ואינטררופטיבי, על ידי העברת המחט סביב הצלעות השלישית והרביעית הסמוכות כדי לקרב מחדש את הרווח הבינצלעי השלישי. שמור על המחט קרוב למשטח הצלע כדי למנוע פגיעה בצמיג הנוירו-וסקולרי הבינצלעי. לפני קשירת התפר, דחוס בעדינות את בית החזה בסוף הנשיפה כדי לפנות אוויר תו-חזי שנותר, ולאחר מכן שמור על הדחיסה תוךماיבוי התפר בקשר כירורגי.
  2. סגור את חתך העור בשכבות באמצעות תפרי nylon 5-0. ודא הצמדה מלאה של שולי הפצע לפני ההמשך.
  3. הנח את העכבר על פלטת חימום בעלת בקרת טמפרטורה (37°C), הפסק את מתן האיסופלורן והמשך בהנשמה מכנית עד לחזרתה של נשימה ספונטנית. עקוב אחר בעל החיים במהלך ההתאוששות מההרדמה, כולל תנועה של הזנב או השפם וחזרה לדפוס נשימה רגיל של כ-150 breaths/min.
  4. אשר את המוכנות לאקסטובציה על ידי אימות נשימה ספונטנית רגילה, תנועה נראית של דופן החזה המסונכרנת עם מחזור המנשם, ותנועה מכוונת של הגפיים או השפם. שלוף את צינור ההנשמה לאט במהלך שלב הנשיפה, ולאחר מכן המשך לעקוב אחר העכבר על פלטת החימום במשך 3–5 min כדי לאשר היעדר מצוקה נשימתית.
    הערה: מצוקה נשימתית לאחר אקסטובציה נגרמת לרוב על ידי פנאומותורקס כתוצאה מסגירה חלקית של הרווח הבינצלעי. אם מופיעה מצוקה נשימתית, הרדם והנשם זמנית את העכבר, פתח מחדש את תפרי העור, בדוק את הסגירה הבינצלעית והנח תפרי תמיכה נוספים בכל אתר של דליפת אוויר לפני חזרתו על הליך האקסטובציה.
  5. החזר את העכבר לכלובו לאחר ההתאוששות מההרדמה. תן בופרנורפין (0.1 mg/kg, תת-עורית) מיד לאחר הניתוח וכל 4–6 h במהלך 48 השעות הראשונות.
  6. עקוב אחר כל עכבר לפחות פעמיים ביום בשלושת הימים הראשונים לאחר הניתוח, ופעם ביום לאחר מכן. העריך את משקל הגוף, היציבה, הפעילות, דפוס הנשימה ואת הפצע הכירורגי, ובצע המתה לכל בעל חיים העומד בנקודות הסיום ההומניות שהוגדרו מראש, כולל נשימה מאומצת מתמשכת, חוסר יכולת להגיע לאוכל או למים, או יציבה שפופה וחסרת תנועה שאינה מגיבה לגירוי.

6. הערכה אלקטרוקרדיוגרפית (ECG)

  1. הקליטו אותות אלקטרוקרדיוגרפיים באמצעות מערכת הקלטה פיזיולוגית רב-ערוצית המצוידת במגבר ECG. החדירו שלוש אלקטרודות תת-עוריות של מובילי גפיים לעכבר, כאשר הכניסה החיובית (VIN+) מחוברת לרגל האחורית השמאלית, הכניסה השלילית (VIN−) לרגל הקדמית הימנית וההארקה (GND) לרגל האחורית הימנית.
  2. חברו את מודול מגבר ה-ECG ליחידת רכישת הנתונים. הגדירו את מסנן החריץ (notch filter) ל-50 Hz (או 60 Hz, בהתאם לתדר רשת החשמל המקומי), לאחר מכן פתחו את תוכנת הרכישה והוסיפו מודול מגבר ECG חדש תחת הגדרות הערוץ האנלוגי.
    1. הגדירו את המגבר עם הפרמטרים הבאים: gain = 20, mode = normal, מסנן מעבר נמוך = 150 Hz, ומסנן מעבר גבוה = 0.05 Hz. פתחו את הגדרות הרכישה, הגדירו את קצב הדגימה ל-1 kHz וסגרו את חלון ההגדרות.
    2. לאחר הצבת האלקטרודות, לחצו על Start כדי להתחיל בהקלטה. הגדירו את בסיס זמן התצוגה ל-0.5 s לכל חלוקה ראשית ואת קנה המידה האנכי ל-0.25 mV לכל חלוקה ראשית, ולאחר מכן הקליטו את ה-ECG ברציפות למשך 30 s לפחות. בחרו מקטע יציב ללא ארטיפקטים לצורך ניתוח והצגה מייצגת.
  3. הקליטו את ה-ECG מיד לאחר הליגציה תוך שמירה על העכבר תחת הרדמה של 1.5% isoflurane ונורמותרמיה על משטח חימום. הקליטו ECG both מקבוצת ה-MI ומקבוצת הביקורת הנורמלית (NC) באותה נקודת זמן ותחת תנאי הרדמה דומים.

7. אקו-קרדיוגרפיה

  1. הסיר את הפרווה מאזור בית החזה הקדמי באמצעות קרם להסרת שיער יום אחד לפני הדימיון. הרדם את העכבר בעזרת 1.5% isoflurane לאורך כל הבדיקה.
  2. הנח את העכבר בשכיבה על גבנו על פלטפורמה מחוממת,יסכי את ארבע הגפיים לאלקטרודות ה-ECG, ומרח ג'ל אולטרה-סאונד על אזור ה-precordium. התאם את ריכוז ה-isoflurane לפי הצורך כדי לשמור על קצב לב הגבוה מ-40 beats/min.
  3. מקם את מתמר האולטרה-סאונד במרווח הבין-צלעי השלישי עד הרביעי לאורך הגבול הסטרנלי השמאלי. כוון את סימון המתמר לעבר הגפה הקדמית הימנית בזווית של כ-30° ויישר את המתמר עם הציר הארוך של הלב.
  4. בצע את כל הדימיון באמצעות מתמר בעל מערך ליניארי עם תדר שידור מרכזי של 30 MHz, רוחב פס של 20–46 MHz, ורזולוציית ציר של 50 μm. הגדר את הספק השידור ל-10%, את עומק הדמות ל-13 mm, את רוחב הדמות ל-11 mm, את הטווח הדינמי ל-60 dB, ואת ההגבר הדו-מדי ל-40 dB. רכוש לולאות cine במצב B-mode בקצב של 210 frames/s.
  5. שמור פרמטרי רכישה אלה כהגדרת מערכת מראש (preset). השתמש באותו המתמר, preset, הספק שידור, טווח דינמי, עומק דמות ורוחב דמות עבור כל בעלי החיים וכל מפגשי הדימיון, ואל תשנה את עומק הדמות בין קבוצות ה-NC וה-MI.
  6. באותו מבט של הציר הארוך, מקם את קו הדגימה של מצב M-mode בגובה מרכז החדר, בניצב למחיצה הבין-חדרית ולקיר האחורי של החדרי השמאלי, כאשר שער הדגימה מקיף את כל הקוטר האנטרו-פוסטריורי של החדרי השמאלי. הקלט את תיעוד ה-M-mode לצורך ניתוח רחב.
  7. רכוש דמויות B-mode שבהן החדרי השמאלי, העלייה השמאלית ושורש האביון נראים בבירור, והקלט לולאות cine לצורך ניתוח רחב. רכוש דמויות M-mode תואמות באותו מישור דימיון.
  8. מדוד מהדמויות שנרכשו את הקוטר הפנימי של החדרי השמאלי בסוף הדיאסטולה (Dd), את הקוטר הפנימי של החדרי השמאלי בסוף הסיסטולה (Ds), ואת עובי המחיצה הבין-חדרית. רכוש חמישה מחזורי לב עוקבים ודווח על ערכי הממוצע.
    הערה: חשב את הנפח של החדרי השמאלי בסוף הדיאסטולה (LVEDV) ואת הנפח של החדרי השמאלי בסוף הסיסטולה (LVESV) באופן אוטומטי באמצעות תוכנת הדימיון. חשב את הקיצור השברי (FS) לפי הנוסחה FS = (Dd − Ds) / Dd × 100% ואת מקדם הפליטה (EF) לפי הנוסחה EF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 10%.

8. קצירת רקמות, צביעה היסטולוגית ו-ELISA

  1. איסוף רקמות
    1. ביום השביעי לאחר השראת אוטם שריר הלב (MI), בצעו בדיקת אקו-לב לכל עכבר. הרדימו את העכבר באמצעות 4% איזופלורן, אספו כ-1.5 מ"ל דם באמצעות דימום רטרו-אורביטלי, ביצעו המתה של העכבר באמצעות פריקה של חוליי הצוואר והוציאו את הלב.
    2. יש להניח לדגימות הדם להיקרש למשך הלילה ב- 4°Cסובב את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 20 × g למשך 10 דקות ב- 4°C, אסוף את הסרום ואחסן אותו בטמפרטורה של −80°C עד להניתוח.
  2. בדיקת ספיחה חיסונית עם אנזים (ELISA)
    1. כימת BNP (פטיד נטריוריטי מסוג B), IL-1β (אינטרלוקין-1β), TNF-α (גורם נמק גידול אלפא) ו-NF-κB p65 (גורם גרעיני קאפה-B p65) בסרום באמצעות ערכות ELISA (ספיחה חיסונית מקושרת לאנזים).
      1. הביאו את כל הרכיבים ודגימות הסרום לטמפרטורת החדר והכינו את תמיסות העבודה בהתאם להוראות הערכה. דללו את דגימות הסרום ביחס של 1:5 בתמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS), כלומר, נפח אחד של סרום בתוספת ארבעה נפחים של PBS.
      2. הוסף 50 μL של סטנדרטים, PBS ודגימות סרום מדוללות לבארות הסטנדרט, לאבקה (zero) ולדגימות, בהתאמה, תוך השארת באר הבקרה (blank) ריקה. הוסף 100 μL של נוגדן זיהוי המשורשר ל-horseradish peroxidase (HRP) לכל הבארים למעט לבקרת הריק, אטום את הפלטה, והדגר ב- 37°C למשך 60 דקות בחושך.
      3. שפכו את התוכן מכל באר ושטפו את הפלטה חמש פעמים עם תמיסת שטיפה (wash buffer), תוך השארת התמיסה בכל באר למשך 20 שניות בכל מחזור שטיפה. ייבשו את הפלטה על ידי ספיגה בנייר נטול סיבים.
      4. הוסף 100 μL של תמיסות מצע שהוכן טרי (תמיסות A ו-B מעורבבות ביחס נפחי של 1:1) לכל באר. הדגרו את הפלטה הרתומה ב- 37°C במשך 15 דקות בחושך, הוסף 50 μL של תמיסת עצירה, ומדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 450 ננומטר.
    2. חסרו את הצפיפות האופטית של הבקרה (blank) מכל מדידה והפיקו עקום סטנדרט באמצעות מודל רגרסיה לוגיסטית בעל ארבעה פרמטרים (4PL). חשבו את הריכוז של כל דגימה על סמך העקום המותאם, הכפילו את הערך במקדם הדילול 5, ודווחו על ערך הממוצע משני בארי (wells) מקבילים.
  3. עיבוד רקמות, שיכון וחיתוך
    1. שטפו קצרות כל לב שהוצא במיחזור של תמיסת סבון פוספט (PBS) קרה בקרח, כדי להסיר דם שארי. קבעו את הרקמה ב-4% פאראפורמאלדהיד למשך 24 שעות לפחות בטמפרטורת החדר.
    2. יש לקצץ כל לב כדי לחשוף משטח שטוח בציר הקצר ולהניחו בקסטרטה למסומנת לרקמות. יש לבצע דהידרציה לרקמה באמצעות סדרת אתנול מדורגת (אתנול 75% למשך 4 שעות, אתנול 85% למשך שעתיים, אתנול 90% למשך שעתיים, אתנול 95% למשך שעה, ושני החלפות של אתנול מוחלט למשך 30 דקות כל אחת). יש להעביר את הרקמה לתמיסה של אתנול-קסילן למשך 5–10 דקות, לבצע הבהרה (clearing) בשתי החלפות של קסילן למשך 10 דקות כל אחת, ולהחדיר פאראפין מומס (infiltration) בשלוש החלפות למשך שעה אחת כל אחת.
    3. הטמיעו כל לב כאשר הציר הקצר פונה אל פני השטח של הבלוק. בצעו חיתוכים סדרתיים 3 μm חתכים בגובה הפפילה המרכזית, צפו את החתכים על גבי 40°C במקלחת מים, להצמידם לשקופיות זכוכית ולייבש אותם ב- 60°C.
    4. יש לבצע דה-פראפיניזציה (Deparaffinization) לחתכים בשני סבבים של שימוש בקסילן (15 דקות כל אחד), ולאחריהם שלושה סבבים של אתנול מוחלט (5 דקות כל אחד), אתנול 75% (5 דקות) ומים שעברו אוסמוזה הפוכה (RO) (5 דקות).
      אזהרה: פראפורמלהיד הוא מסרטן סביר ומגרה למערכת הנשימה ולעור, וקסילן הוא דליק ונוירוטוקסי. יש לטפל בריאגנטים אלה במכונה לשאיבת גזים (fume hood) תוך לבישת כפפות רפואיות סטריליות, חלוק מעבדה והגנה על העיניים, ולהשליך את הפסולת בהתאם לנהלי הפסולת החומרית של המוסד. אתנול ו- נ-בוטנול הם דליקים; יש להרחיקו ממקורות הצתה.
  4. צביעה היסטולוגית
    1. צביעת המטוקסילן ואוזין
      1. טבול את החתכים שעברו דפראפיניזציה ורי-הידרציה בהמטוקסילין למשך 3–5 דקות. שטוף את החתכים במים.
      2. בצעו דפרנציאציה (differentiation) של הסריקות באלכוהול חומצתי 1%, ושטפו אותן במים. צבעו את הסריקות בכחול באמצעות תמיסת אמוניה מימית 0.5%, ושטפו אותן שוב.
      3. העבירו את החתכים באופן סדרתי דרך אתנול 85%, אתנול 95% ואתנול מוחלט למשך 5 דקות בכל שלב. בצעו צביעה נגדית של החתכים באמצעותאוזין למשך 3–5 דקות.
      4. ייבשו את הפרוסות באמצעות שלושה סבבים של אתנול מוחלט למשך 5 דקות בכל סב, ולאחר מכן ב- נב-butanol למשך 5 דקות. יש לבצע שקיפות של החתכים באמצעות שלושה החלפות של xylene למשך 5 דקות כל אחת, ולהטמיעם בשרף ניטרלי.
        הערה: הגרעינים נראים בכחול, בעוד שהציטופלזמה והמטריקס החוץ-תאי נראים באדום.
    2. צביעת טריכרום של מסון (Masson’s trichrome staining)
      1. בצעו מורדנט (קיבוע עם חומר מקשר) לחתכים שעברו דה-פראפיניזציה והידרציה מחדש, בתמיסת פוטסיום דיכרומט בריכוז 2.5% למשך לילה, למשך כ-15 שעות בטמפרטורת החדר. שטפו את החתכים תחת זרימה של מים למשך כ-30 שניות עד להיעלמות הגוון הצהוב.
      2. צבעו את החתכים בתמיסת Ponceau–acid fuchsin למשך 6 דקות, עד שהרקמה תיראה באדום בהיר. האריכו את זמן הצביעה אם הצבע נותר חלש, ושטפו את החתכים תחת מים זורמים עד שהמי effluent יהיה חסר צבע.
      3. נקז את עודפי המים מבלי לאפשר לחתכים להתייבש. בצע בידול של החתכים בחומצה פוספומוליבדית מימית למשך 1–2 דקות, עד שהקולגן נראה בהיר וסיבי השריר נותרים אדומים.
      4. העבירו את החתכים ישירות לתמיסת aniline blue ללא שטיפה. דגרו את החתכים למשך 6–30 שניות.
      5. בצעו דיפרנציאציה של החתכים באמצעות שלושה עד חמישה סבבים של חומצה אצטית 1%, למשך כ-8 שניות לכל סב. בצעו דהידרציה מהירה באמצעות שלושה סבבים של אתנול מוחלט, למשך כ-3, 5 ו-5 שניות, בהתאמה.
      6. נקה את המקטעים ב- נב-butanol למשך 5 דקות ואז ב-xylene למשך 5 דקות. יש להניח את החתכים על זכוכית בעזרת שרף ניטרלי.
        הערה: סיבי קולגן מופיעים בכחול, בעוד שסיבי שריר, פיברין ואריתרוציטים מופיעים באדום.
    3. צביעה ב-Sirius Red
      1. הדגרו את החתכים שעברו דפראפיניזציה ורי-הידרציה (rehydration) בתמיסת Sirius Red A ב- 65°C בתנור למשך 30 דקות. שטפו את החתכים תחת מי ברז זורמים עד להיעלמות הגוון הצהוב.
      2. ספגו נוזלים עודפים ושקיעו את החתכים בתמיסת Sirius Red B למשך 2 דקות. שטפו את החתכים קצרה וספגו נוזלים עודפים.
      3. טבול את החתכים בתמיסת Sirius Red C למשך 30 דקות. שטוף אותם קצרה למשך 1–2 שניות.
      4. בצעו דהידרציה של החתכים באמצעות שלושה החלפות של אתנול מוחלט למשך כ-3 שניות בכל פעם. בצעו שקיפות (clearing) באמצעות שלושה החלפות של קסילן למשך 5 דקות בכל פעם, והרכיבו אותם באמצעות שרף ניטרלי.
        הערה: תחת תאורה בשדה בהיר (brightfield), סיבי קולגן מופיעים בצבע אדום על רקע צהוב.
  5. רכישת תמונות וכמותיות
    1. יש להשיג את כל התמונות ההיסטולוגיות באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי. יש להשתמש בהגדרות זהות של תאורה, איזון לבן, חשיפה והגדלה עבור כל החתכים מכל הקבוצות, ולהוסיף סרגל כיול לכל תמונה.
    2. יש לכייל את קנה המידה המרחבי לפני ניתוח התמונות. טענו תמונת ייחוס המכילה את סרגל הקנה שנרכשה באותה רזולוציה ובאותם ממדי פיקסלים של תמונות המחקר. תחת Measure > כיול > הגדר מערכת, צור כיול מרחבי חדש, הגדר את היחידה ל- μmהגדירו את המרת הפיקסלים למיקרומטרים על ידי יישור נקודות הכיול עם סרגל המقياس, שמרו את הכיול והחילו אותו על כל התמונות.
    3. טענו סרט חתך שנצבע בצביעת Masson’s trichrome ותחמו את החדר השמאלי באמצעות כלי הגדרת אזור העניין (AOI) בעל הצורה הבלתי סדירה. השמיעו את חלל החדר, את החדר הימני וארטפקטים של עיבוד הרקמה, ולאחר מכן רשמו את השטח הכולל של החדר השמאלי.
    4. מדידה פתוחה > לחצו על Count/Size ובחרו ב-Select Colors כדי לפתוח את דיאלוג הסגמנטציה. בחרו בסגמנטציה מבוססת קוביית צבע (Color Cube Based) והגדירו את הפרמטרים באופן הבא: רגישות (sensitivity) = 4, הרחבת בחירה (expand selection) באינדקס צבע אחד, גודל צבע מינימלי (minimum color size) = 1 פיקסל, וגודל גרעין (kernel size) = 3 × 3. החילו את אותן הגדרות סגמנטציה על כל החתכים.
    5. בחרו פיקסלים כחולים חיוביים לקולגן באמצעות כלי הפיפטה (eyedropper) כנקודות זרע (seed points). דגמו רק אזורים שהם בבירור חיוביים לקולגן, צרו תמונת תצוגה מקדימה, וודאו שהמסכה כוללת את האזורים החיוביים לקולגן תוך החרגת השריר הלבבי (myocardium) שצבעו באדום, את חלל הפרונטריקולר ואת הרקע. במידת הצורך, התאימו את נקודות הזרע לפני הפעלת המסכה.
      הערה: יש לבחור מחדש פיקסלי זרע (seed pixels) עבור כל חיתוך, כדי להתחשב בהבדלים קלים בעצימות הצביעה בין החיתוכים. יש לשמור על פרמטרי סגמנטציה זהים (רגישות, דרגת התרחבות, גודל צבע מינימלי וגודל גרעין/kernel) עבור כל התמונות, ולאשר את הסגמנטציה רק כאשר התצוגה המקדימה מדגימה כיסוי מלא של אזורים חיוביים לקולגן תוך החרגת מבנים שאינם קולגן.
    6. החל את מסיכת הפילוח (segmentation mask) וסגור את תיבת הדיאלוג. תחת Measure > בחר Measurements, בחר Area, לחץ על Count, פתח את View > סטטיסטיקה, ותיעוד של סך השטח החיובי לקולגן.
    7. חשבו את שבר הנפח של הקולגן (CVF) על ידי חלוקת השטח החיובי לקולגן בשטח הכולל של החדר השמאלי, והביעו את התוצאה כאחוז.

9. שקיפות רקמה והדמיה תלת-מדית של העורקים הכליים

  1. סימון פלואורסצנטי של מערכת כלי הדם הכליליים
    1. הזרקה 200 µL של תמיסת Evans Blue בריכוז 2% לווריד הזנב הצדי (lateral tail vein) כדי לסמן את כלי הדם העורקים של הלב (coronary vasculature). החזירו את העכבר לכלובו למשך 60 דקות כדי לאפשר זרימה סיסטמית של הצבע.
    2. הנח את העכבר בתא ההשראה (16 × 10 × 1 ס"מ) המחובר למכשיר ההרדמה והרדם אותו באמצעות 4% isoflurane. בצע המתה לעכבר על ידי פריקה של חוליי הצוואר, פתח את חל בית החזה, הוצא את הלב השלם, שטוף אותו ב-PBS וקבע אותו ב-4% paraformaldehyde (PFA) למשך 24 שעות ב- 4°C.
      אזהרה: PFA הוא חומר מסרטן פוטנציאלי וגורם לגירוי בדרכי הנשימה ובעור. יש לטפל ב-PFA בתוך מapay (מכסות עשן) כימי, תוך כדי חבישה של כפפות רפואיות סטריליות, חלוק מעבדה והגנה על העיניים, ולהשליך את הפסולת בהתאם לנהלי הפסולת המסוכנת של המוסד.
    3. הכינו תמיסת אגרוז בריכוז של 3% במים מזוקקים (RO) והטמיעו את הלבב המקובע כאשר אתר הליגציה מוכוון כראוי לצילום. הזריקו 1 µL הזרק תמיסת DAPI לשמונה נקודות סביב אזור הליגציה באמצעות מזרק מיקרוליטר, והדגר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך יומיים.
  2. שקיפות רקמה
    1. בצעו שקיפות רקמה (tissue clearing) באמצעות ערכה לשקיפות רקמות מסוג FDISCO (דימות תלת-מדי של איברים שעברו שקיפות בממס עם יכולת עדיפה לשימור פלואורסצנציה), בהתאם להוראות היצרן. הערכה כוללת שישה ריאגנטים (A–F): ריאגנטים A, B, C, D ו-E מכילים 50%, 70%, 80%, 10% ו-10% tetrahydrofuran (THF) במים, בהתאמה, וריאגנט F הוא dibenzyl ether.
      זהירות: THF דליח מאוד, יוצר פרוקסידים נפיצים במהלך האחסון, ומהווה גורם למגרי respiratory (דרכי הנשמה) ולעור. דיבנזיל אתר (Dibenzyl ether) הוא גורם למגרי עור ועיניים. יש לטפל בכל הריאגנטים במכסה מנדף כימי תוך לבישת ציוד הגנה אישי מתאים, הכולל כפפות רפואיות סטריליות, חלוק מעבדה והגנה על העיניים. יש להשליך פסולת בהתאם לנהלי הפסולת המסוכנת של המוסד.
    2. יש להדגיר כל לב באופן רצופי בריאגנטים A, B, C, D ו-E למשך 6 שעות לכל ריאגנט. השתמשו ב-10 מ"ל מכל ריאגנט ללב, המקביל ליחס נפח מינימלי של 1:5 בין הדגימה לריאגנט.
    3. העבירו את הדגימה לריאגנט F והמשיכו בדגירה עד שהרקמה תהפוך לשקופה אופטית, בדרך כלל למשך כשעה אחת.
    4. בצע את כל שלבי ההבהרה ב- 6°C–8°C עם ערבוב עדין. העבירו את הדגימה למכל זכוכית עטוף בנייר אלומיניום והגנו עליה מהאור לאורך כל התהליך כדי לשמר את הפלואורסצנציה.
  3. דימות פלואורסצנציה בלוחית אור (Light-sheet fluorescence imaging)
    1. הצמידו את הדגימה שעברה הבהרה למחזיק הדגימות. השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה בעל גילי דגם (light-sheet fluorescence microscope) המצויד בעדשה אובייקטיבית 4× (ממספר צמצם = 0.28; מרחק עבודה = 20.0 מ"מ).
    2. טבול את הדגימה המותקנת בתוך הדיבנזיל אתר (dibenzyl ether) בתא ההדמיה. האר את הדגימה משני הצדדים ועורר באופן רצופי DAPI באורך גל של 405 ננומטר ו-Evans Blue באורך גל של 647 ננומטר.
    3. הגדירו את פרמטרי הרכישה באופן הבא: עבור הערוץ של 405 nm, השתמשו בעוצמת לייזר של 3,0 יחידות שרירותיות ובזמן חשיפה של 30 ms; עבור הערוץ של 647 nm, השתמשו בעוצמת לייזר של 4,0 יחידות שרירותיות ובזמן חשיפה של 30 ms. רכשו את כל התמונות באמצעות גודל צעד z של 6 μm ורזולוציית תמונה של 1,024 × 1,024 פיקסלים.
    4. הגדירו את מצב הרכישה של המצלמה ל-XYCZT, שבו תמונות לטראליות (XY) נרכשות תחילה, ולאחריהן רכישת ערוצים עוקבת (C), דגימה צירית (Z) ורכישת נקודות זמן (T), כפי שהוגדר בתוכנת הדימיג'.
  4. עיבוד נתוני תמונה ושחזור תלת-מדי
    1. חברו את קבצי תמונות ה-TIFF הגולמיים באמצעות תוכנת עיבוד התמונות המצורפת למיקרוסקופ. המירו את קבצי התמונות המחוברים לפורמט IMS על ידי בחירה ב-File > המר אל Imaris.
    2. ייבאו את קבצי ה-IMS שהומרו לתוכנה לניתוח תלת-מדי. צרו שחזורים בשיטת Volume-rendering באמצעות הגדרות הרינדור ברירת המחדל, וייצאו תמונות מייצגות באמצעות מודול ה-Snapshot.
      הערה: שחזורים תלת-מדיים נוצרים באמצעות צינור הרינדור (rendering pipeline) ברירת המחדל של התוכנה ללא שינויים. לא הוחלו סגמנטציית תמונה, סף (thresholding), הסרת רעשים, חיסור רקע או כל עיבוד מקדים אחר. התמונות המשוחזרות משמשות לוויזואליזציה איכותנית של כלי הדם העוקפים (coronary vasculature) ואינן מיועדות לניתוח כמותי.

10. ניתוח סטטיסטי

  1. הציגו את כל הנתונים כממוצע ± טעות תקנית של הממוצע (SEM). בצעו ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנת GraphPad Prism (גרסה 5.0).
  2. הגדירו את היחידה הניסויית כבעל בודד. נתחו n = 8 עכברים לכל קבוצה עבור כל נקודות הסיום התפקודיות, של הסמנים הביולוגיים וההיסטו-מורפומטריים.
  3. בצעו איסוף וניתוח נתונים באמצעות מזהי דגימות מקודדים, תוך שמירה על סמיות של החוקר להקצאת הקבוצות. חשפו את השיוכים לקבוצות רק לאחר השלמת כל הניתוחים הכמותיים.
  4. בחנו את נורמליות הנתונים באמצעות מבחן Shapiro–Wilk ואת הומוגניות השונות באמצעות מבחן Levene ב-GraphPad Prism (גרסה 5.0) לפני בחירת המבחן הסטטיסטי המתאים.
  5. השוו בין שתי קבוצות באמצעות מבחן t-test של Student דו-זנבי ללא צימוד כאשר הנחות הנורמליות והשונות השווה מתקיימות. אחרת, בצעו מבחן Mann–Whitney U.
  6. הגדירו P < 0.05 כמובהק סטטיסטית. ציינו מובהות סטטיסטית כ-P < 0.05, P < 0.01, ו-P < 0.01.

תוצאות

ה-AIS שימש כסימן אנטומי לאיתור עורק הכלילי LAD ולזיהוי אתר הליגציה (איור 1A–C). לאחר זיהוי ה-AIS, בוצע זרימת העבודה הכירורגית הרצופה להשראת MI, הכוללת תורקוטומיה, חשיפת הלב, ליגציה של ה-LAD, סגירת בית החזה והחלמה לאחר הניתוח, כפי שמוצג ב-איור 2A–L. פרוטוקול פשוט זה אפשר השראה מהירה וניתנת לשחזור של MI בעכברים. פרוטוקול זה דורש תקופה מורחבת של הכשרה מעשית לפני שניתן לבצעו באופן מהימן; אינטובציה של הקנה וליגציה המונחית על ידי ה-AIS הם שני השלבים בעלי עקומת הלמידה התלולה ביותר. במהלך שלבי ההכשרה הראשוניים, תמותה פרי-אופרטיבית בתוך 7 הימים הראשונים לאחר הניתוח עשויה להגיע ל-50% או יותר, ושיעור ההצלחה של השראת המודל עשוי לרדת ל-30% או פחות. ברגע ששיטות אלו נשלטות, שיעור ההצלחה הכירורגית עולה בעקביות על 90%. במחקר הנוכחי, לא התרחשו מקרי מוות פרי-אופרטיביים במהלך 7 הימים הראשונים לאחר הניתוח. כל הלימודי ההכשרה בוצעו תחת אותו פרוטוקול מאושר מוסדי לשימוש בבעלי חיים.

בעקבות קשירת ה-LAD, נצפו חריגות אלקטרוקרדיוגרפיות אופייניות, כולל העמקה בולטת של גל Q, התרוממות של מקטע ST בעל מורפולוגיה קמורה כלפי מעלה, שיאים חריפים של גל T (שמתפתחים בדרך כלל להיפוך גל T במהלך השלב הסוב-אקוטי), עלייה במתח של קומפלקס QRS עם אמפליטודה רחבה יותר, וטאכיקרדיה ניכרת (איור 3A). בדיקה גרוסית הראתה הלבנה מקומית של השריר הלבבי והרחבה של החדרים דיסטלית לאתר הקשירה בקבוצת ה-MI בהשוואה לקבוצת ה-NC (איור 3B). בדיקה היסטופתולוגית הראתה סיבי שריר לבבי לא מאורגנים, מרחקים בין-תאיים מורחבים, חדירה של תאי דלקת, השקעת קולגן ושיבוש מבני של השריר הלבבי בקבוצת ה-MI, כפי שהודגם בצביעות hematoxylin and eosin (H&E), Masson’s trichrome ו-Sirius Red (איור 3C). ניתוח כמותי של חתכים שנצבעו ב-Masson’s trichrome הראה CVF גבוה משמעותית בקבוצת ה-MI מאשר בקבוצת ה-NC (18.24% ± 1.67% לעומת 0.05% ± 0.01%; P < 0.01; איור 3D).

ניתוח פיברוזיס לבבי: גרף ECG, תמונות של רקמת לב, סרטים היסטולוגיים, תרשים כימות פיברוזיס.
איור 3שינויים אלקטרוקרדיוגרפיים, אנטומיים גסים והיסטופתולוגיים לאחר קשירת העליל של העורק הכלי השמאלי העולה (LAD) בעכברים. (A) אלקטרוקרדיוגרמים (ECGs) מייצגים שהוקלטו מיד לאחר הניתוח בקבוצת הביקורת הנורמלית (NC) ובקבוצת אוטם השריר הלבבי (MI). (B) תמונות מאקרוסקופיות מייצגות של לבבות מקבוצות ה-NC וה-MI. סרגילי קנה מידה = 1 מ"מ. (C) חתכים רדיאליים מייצגים של הלב מקבוצות ה-NC וה-MI שצבעו בהמטוקסילין ואאוזין (H&E)&E; שמאל), Masson’s trichrome (מרכז), ו-Sirius Red (ימין). בחתכים שנצבעו ב-Masson’s trichrome, קולגן מופיע בכחול והמיוקרדיום מופיע באדום; בחתכים שנצבעו ב-Sirius Red, קולגן מופיע באדום על רקע צהוב. סרגילי קנה מידה = 1,000 µm(D) שבר נפח קולגן (CVF), שחושב כשטח חיובי לקולגן חלקי השטח הכולל של החדר השמאלי ובטאוי כאחוזים, בקבוצות NC ו-MI. הנתונים מוצגים כממוצע ± טעות תקנית של הממוצע (SEM); n = 8 עכברים לכל קבוצה. מובהקות סטטיסטית ביחס לקבוצת NC מסומנת ב-**.P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ליקוי תפקודי לב תואש באמצעות אקו-קרדיוגרפיה. תמויות מייצגות במצב M-mode הראו פגיעה בכושר התכווצות החדר השמאלי בקבוצת ה-MI (איור 4A). ניתוח כמותי הראה ירידה משמעותית ב-EF וב-FS של החדר השמאלי בקבוצת ה-MI בהשוואה לקבוצת ה-NC (איור 4B,C). בדיקת ELISA הראתה עלייה משמעותית בריכוזי BNP, TNF-α, NF-κB p65 ו-IL-1β בסרום בקבוצת ה-MI (איור 4D–G), ממצא התואם לפגיעה בתפקוד הלב ולתגובה דלקתית.

תמונות אולטרסאונד של הלב עם תרשימי עמודות; רמות EF, FS, BNP, TNFα, p65, IL-1β בקבוצות NC לעומת MI.
איור 4שינויים בתפקוד הלב ורמות של סמני ביומיים בנסיף לאחר קשירה של העורק הכלי הקדמי השמאלי (LAD). (A) תמונות אקו-קרדיוגרפיה מייצגות במצב M-mode מקבוצת הביקורת הנורמלית (NC) ומקבוצת אוטם שריר הלב (MI). (B) מקדם הפליטה (EF) של החדר השמאלי. (C) קיצור סיסטולי (FS) של החדר השמאלי. (D–G) ריכוזים בסרום של (D) פפטיד נטריורטי מסוג B ‏(BNP), (E) גורם נמק גידולי אלפא (TNF-α), (F) גורם גרעיני קפא-בי p65 ‏(NF-κB p65), ו-(G) אינטרלוקין-1בטא (IL-1β), שנמדדו באמצעות בדיקת ELISA (ספיחה חיסונית קשורה לאנזים). EF ו-FS מבוטאים באחוזים; BNP, TNF-α ו-IL-1β מבוטאים ב-pg/mL; ו-NF-κB p65 מבוטא ב-ng/mL. הנתונים מוצגים כממוצע ± טעות תקנית של הממוצע (SEM); n = 8 עכברים לקבוצה. מובהקות סטטיסטית ביחס לקבוצת ה-NC מסומנת ב-*P < 0.01 ו-**P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה מורחבת של איור זה.

דימות פלואורסצנציה תלת-מדי של לבבות שעברו הבהרה של רקמות הדגים את מסלולו של ה-LAD מתחת ל-AIS והראה כי קשירה באתר המוגדר אנטומית גרמה לחסימה של העורקים הכליליים (איור 5A–F). יחד, ממצאים אלו מדגימים השראה מוצלחת של פנוטיפ MI בסדרה ראשונית זו של שמונה בעלי חיים לכל קבוצה, המאופיינת בתפקוד לקוי של החדר השמאלי, פיברוזיס של השריר הלבבי ודלקת מערכתית. המחקר הנוכחי תוכנן כדי לבס ולהדגים את ההיתכנות של מודל MI המודרך על ידי AIS, ולא כדי לספק תיקוף מקיף של גודל המדגם, יציבות ארוכת טווח של המודל, או ההתאמה האנטומית בין ה-AIS ל-LAD. בהתאם לכך, היבטים אלו מוכרים כמגבלות של המחקר הנוכחי ונדונים בפרק הדיון. באופן ספציפי, ההערכות התפקודיות והביוכימיות הוגבלו לשלב החריף לאחר ה-MI, והקשר בין ה-AIS ל-LAD הודגם באופן איכותי אך טרם כומת בקבוצה גדולה מספיק.

דימות פלואורסצנטי של אנטומיית הלב; צביעה ב-DAPI וב-Evans Blue; מיקרוסקופיה, ניתוח מבנה תאי.
איור 5דימות פלואורסצנציה תלת-מדי של כלי הדם העורכיים של עכבר שעברו שקיפות. לבבות שלמים שעברו הבהרה סומנו ב-Evans Blue להדמיית כלי הדם העלילים וב-4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) להדמיית הגרעינים, ולאחר מכן בוצעו הדמיית פלואורסצנציה בלוח אור (light-sheet) ושחזור תלת-מדי. (A–C) שחזורי לב שלם המראים את (A) ערוץ ה-DAPI, (B) ערוץ ה-Evans Blue, ו-(C) ערוצים ממוזגים. סרגי מאсштаב = 1,000 µm(D–F) תצפיות מוגדלות של אזור כלי הדם הכליליים המציגות את (D) ערוץ ה-DAPI, (E) ערוץ ה-Evans Blue, ו-(F) ערוצים ממוזגים. פס קנה מידה = 400 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לא כל פרוצדורה מניבה מודל אופטימלי, והכרת תוצאות תת-אופטימליות היא חשובה לצורך פתרון בעיות. ליגציה שבוצעה פרוキシמלית מדי או החדרת מחט עמוקה מדי עלולות לגרום לאינפקט גדול מדי הנלווה לאי-ספיקת לב חמורה, הפרעה בקצב הלב (arrhythmia) או קרע של הפרוקיס, המובילים לתמותה מוקדמת. לעומת זאת, ליגציה שבוצעה דיסטלית מדי או באופן שטחי מדי עלולה להוביל לאינפקט קטן בלבד או לא להוביל להשראת אינפקט כלל. לכן, יש להעריך השראה מוצלחת של המודל באמצעות מספר קריטריונים. במהלך הניתוח, הלבנה של המיוקרד דיסטלית לאתר הליגציה מספקת אינדיקציה מיידית לחסימה כלילית, אם כי ממצא זה לא תמיד יהיה גלוי למבט. אקו-לב לאחר הניתוח ובדיקה היסט פתולוגית מספקים אישור נוסף להקמה מוצלחת של המודל. Supplementary Figure 1 מציגה מודל לא מוצלח מייצג, שבו בדיקה היסט פתולוגית מעידה על היעדר חדירה נראית של תאי דלקת או פיברוזיס.

איור משלים 1. ממצאים היסטולוגיים מייצגים ממודל לא מוצלח של אוטם שריר הלב. חתכים רוחביים מייצגים של לב מעכבר שבהם השראת אוטם שריר הלב לא הצליחה, שנצבעו ב-(A) המטוקסילין ואוזין (H&(E), (B) צביעת Masson's trichrome, ו-(C) צביעת Sirius Red. בהשוואה להשראה מוצלחת של אוטם שריר הלב, חתכים אלה אינם מראים חדירה ניכרת של תאי דלקת או רמיodeling פיברוטי במיוקרד של החדר השמאלי, ממצא התואם חסימה לא מוצלחת של העורקים הכליליים. סרגי מידה = 1,000 µm.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

בשנים האחרונות, מודלים קליניים וניסיוניים של MI הפכו לחשובים יותר ויותר במחקר קרדיווסקולרי, אך שאלות רבות בנוגע לפתוגנזה של MI ואסטרטגיות לטיפול בו נותרו ללא מענה. מאמר זה מתאר שיטה מעודנת להקמת מודל MI בעכברים, שבה מספר שלבים פרוצדורליים קריטיים דורשים תשומת לב מיוחדת. השלב הקריטי הראשון הוא אינטובציה של קנה הנשימה. חלק מהפרוטוקולים הקודמים מקים את נתיב הנשימה באמצעות טרכיאוטומיה, הדורשת חתך בעור הצוואר ודיסקציה של הרקמות כדי לחשוף את קנה הנשימה לפני האינטובציה13; אחרים שומרים על אינטובציה אורו-טרכאלית אך ממליצים על חתך קו-אמצע בצוואר כדי לשפר את הנראות במהלך הפרוצדורה14. בניגוד לשתי הגישות, הפרוטוקול הנוכחי משתמש בלרינגוסקופ כדי להאיר את האורופרינקס ומבצע אינטובציה אורו-טרכאלית תחת ראייה ישירה של הגלוטיס ללא חתך בצוואר. למרות שגישה זו מציבה דרישות גבוהות יותר מהמיומנות הטכנית של המבצע, היא מונעת טראומה לרקמות הצוואר, מפחיתה את הסיכון לזיהום וכאב לאחר הניתוח, ומקצרת את זמן הניתוח. הטעות הנפוצה ביותר במהלך אינטובציה היא השמה שגויה במסלול הוושנית. אם בית החזה אינו עולה במהלך ההנשמה והצינור האנדוטרכאלי אינו מראה עיבוי של אדים בזמן הנשיפה, יש להוציא את הצינור מיד ולחזור על האינטובציה. חברו את מכשיר ההנשמה רק לאחר אישור תנועה סימטרית דו-צדדית של דפנות בית החזה.

השלב השני, והקריטי ביותר, הוא זיהוי עורק הכלילי LAD והנחה מדויקת של הליגטור. שיטות קונבנציונליות ניצבות בפני מספר אתגרים בשלב זה. קצב הלב במנוחה של העכבר הוא כ-500–600 פעימות/דקה, וה-LAD שוכן בסמיכות למספר ורידים כליליים נלווים, מה שהופך את הזיהוי האינטרה-אופרטיבי של העורק בזמן אמת לקשה מטבעו. יתרה מכך, אפילו בתנאים אופטימליים, חלק ניכר מה-LADs אינם ניתנים להדמיה ברורה תחת מיקרוסקופ דיסקציה15. על רקע זה, פרוטוקולים מוקדמים יותר המעריכים את אתר הליגציה כנקודה הנמצאת 1–2 mm מתחת לנספח העליה השמאלית (left atrial appendage), מוגבלים בשל זיהוי אינטרה-אופרטיבי לא עקבי של נקודת ייחוס אנטומית זו12,14, בעוד שדפוס ההסתעפות המורכב של העורק הכלילי השמאלי עלול לפגוע עוד יותר ביכולת השחזור16. כדי להתגבר על אתגרים אלו, הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-AIS כנקודת הייחוס האנטומית למיקום הליגטור. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, ה-AIS נראה כחריץ רדוד על פני השטח הוונטרליים של הלב, כאשר ה-LAD עובר מיד מתחתיו. לפיכך, הוא מספק נקודת ייחוס אנטומית יציבה יחסית, הפחות תלויה בניסיונו של המנתח. מיקום הליגטור בשליש העליון של ה-AIS מספק מטרה אנטומית עקבית לחסימה כלילית. התוצאות המייצגות מדגימות כי גישה זו הצליחה להניב את הפנוטיפ הצפוי של MI חריף בבעלי החיים שנבדקו.

נקודת הציון AIS אינה מהימנה בכל הנסיבות. כאשר החשיפה התורקית מוגבלת או כאשר דימום מהאפיקרד מסתיר את פני השטח של הלב ומקשה על זיהוי ה-AIS, נגב בעדינות את השטח הכירורגי באמצעות מקל צמר ספוג במי מלח והערך מחדש את החריץ לפני הקשירה. אם עדיין לא ניתן לזהות את ה-AIS בביטחון, זהה את ה-LAD באופן ישיר כפי שמתואר בפרוטוקול ובצע את הקשירה תחת ויזואליזציה ישירה במקום להסתמך על ה-AIS. במידת הצורך, אשר את המרווח הבינ-צלעי הנכון על ידי ספירה לכיוון הזנב (caudally) מהצלע הראשונה כדי להבטיח חשיפה מספקת של התוספת של העלייה השמאלית ושל הדופן הקדמית של החדור השמאלי.

מבין הסיבוכים שלאחר הניתוח, פנאומותורקס (חזה אוורירי) הוא השכיח ביותר ובדרך כלל מתבטא במצוקה נשימתית לאחר extubation. המפתח למניעת פנאומותורקס הוא פינוי מלא של אוויר שיורי מחלל בית החזה לפני סגירת המרווח הבין-צלעי. אם ישנו חשד לפנאומותורקס, יש להרדימ ולנשם שוב את העכבר לזמן קצר, לפתוח מחדש את תפרי העור ולבדוק את סגירת המרווח הבין-צלעי. אם זוהו אתר אחד או יותר של סגירה חלקית, יש להניח תפריים נוספים בנקודת דליפת האוויר לפני חזרה על הליך ה-extubation. סיבוך פוטנציאלי נוסף הוא דימום תוך-ניתוחי, המתרחש לרוב כאשר המחט דוקרת כלי דם אפיקרדיאל קטן או וריד כלילי נלווה במהלך הליגציה. הדימום הוא בדרך כלל מוגבל וניתן לשליטה לרוב על ידי הפעלת לחץ עדין עם מקלון צמר ספוג בסליין למשך מספר שניות. לפני סגירת חלל בית החזה, יש לוודא שלא נותר דימום פעיל בשדה הניתוחי כדי לצמצם סיבוכים לאחר הניתוח. בנוסף, עכברים עלולים לפתח הפרעות קצב, כולל פעימות פרוקורוונטריקולריות (PVC) או פרפור ונטריקולרי חולף, במהלך הפרוצדורה או מיד אחריה. הפרעות קצב אלו מוקלות לרוב על ידי שמירה על טמפרטורת הגוף, ייצוב עומק ההרדמה והפסקה זמנית של הפרוצדורה כדי לאפשר התאוששות ספונטנית של קצב הלב. לבסוף, סיבוכים מהרדמה נובעים לרוב מכישלון בהורדת ריכוז ה-isoflurane במהירות לאחר intubation טרכאלי מוצלח. יש להפחית את ריכוז ה-isoflurane לרמת התחזוקה מיד לאחר חיבור הצינור האנדוטרכאלי למנשם, ולנטר באופן רציף את הנשימה וקצב הלב לאורך כל הפרוצדורה.

באופן כללי, שיטה זו דורשת מיומנות מיקרו-כירורגית ניכרת, ובדומה למודלים אחרים של ליגציה קבועה של עורק כלילי LAD, היא נותרת חשופה לשונות הנובעת מהבדלים אנטומיים של העורקים הכליליים ומניסיונו של המנתח. עם זאת, באמצעות הכשרה מתאימה וטכניקה כירורגית עקבית, חוקרים יכולים לבסס את מודל ה-MI בעקביות סבירה, תוך שיפור השחזוריות של הפרוצדורה ושיעורי ההישרדות לאחר הניתוח.

יש להכיר במספר מגבלות של שיטה זו. ראשית, ההערכות התפקודיות והביוכימיות הושלמו תוך שבוע לאחר השראת ה-MI, ולכן הן משקפות רק את השלב החריף של ה-MI, ללא הערכה שיטתית של תוצאות ארוכות טווח, כגון רה-מודלינג של החדרים 4–8 שבועות לאחר הניתוח. שנית, בדומה למודלים אחרים של MI המבוססים על ליגציה קבועה המשתמשים בתפרי לא-ספיגים, פרוטוקול זה עלול להוביל להידבקויות פריקרדיאליות כרוניות. הדבר מהווה מאפיין מובנה של מודל הליגציה ולא מגבלה הספציפית לגישה המודרכת על ידי ה-AIS. עם זאת, חומרת הידבקויות אלו והשפעותיהן על תפקוד הלב לטווח ארוך לא כוונתו במחקר הנוכחי. מחקרים עתידיים יוכלו לבחון את השימוש בתפרי ספיגים ולהעריך את השפעותיהם על היווצרות הידבקויות ועל ביצועי המודל. שלישית, למרות שדימות כלי דם כליליים תלת-ממדי הדגים באופן איכותני כי ה-LAD עובר מתחת ל-AIS, ההתאמה האנטומית בין מבנים אלו טרם כומתה בקוהורט גדול מספיק. רביעית, מחקר זה כלל רק עכברי C57BL/6J זכרים. למרות שה-AIS צפוי להוות נקודת ציון אנטומית עקבית, ישימותו בעכברים נקבות, בזני עכברים אחרים ובמינים אחרים דורשת תיקוף נוסף. לבסוף, היתרונות הפוטנציאליים של פרוטוקול זה ביחס לעקביות של אתר הליגציה וליכולת השחזור של הפרוצדורה מבוססים על ניסיון במעבדה אחת, ולא הועמדו להשוואה ישירה מול שיטות קונבנציונליות של ליגציית LAD או בין מפעילים ומוסדות מרובים. לפיכך, יידרשו מחקרי תיקוף נוספים כדי לבסס את יכולת ההכללה הרחבה יותר של השיטה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית המדע והטכנולוגיה של סיצ'ואן (מספרים 2026NSFSC1823 ו-2022YFS0618), פרויקט המינהל המחוזי של סיצ'ואן לרפואה סינית מסורתית (משרד המינהל המחוזי של סיצ'ואן לרפואה סינית מסורתית מס' 7 [2024]), פרויקט האיגוד של סיצ'ואן לרפואה משולבת של רפואה סינית ומערבית (מס' ZXY2025019), ופרויקט האוניברסיטה הרפואית של דרום-מערב סין (מספרי מענקים 2023ZYYQ04 ו-2023ZYYQ17).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סלין סטרילי 0.9%Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.–reconstitution של Cefazolin
אגרוז 3%Sigma-AldrichA0169הטמעה של דגימה
פראפורמאלדהיד 4%Sigma-Aldrich158127קיבוע רקמות
אתנול מוחלטChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0170Aדהידרטציה של רקמות; דליק
Acid fuchsinAladdinA104916-100gהכנת תמיסת Ponceau–acid fuchsin לצביעת Masson's trichrome
תוכנת AcqKnowledgeBIOPAC SystemsAcqKnowledge 4.0רכישה וניתוח של אלקטרוקרדיוגרם
תמיסת אמוניה, 0.5% מימיתChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.2528Aהכחלה (bluing) במהלך צביעת hematoxylin and eosin
כחול אנילין, מסיס בחומצהAladdinA111200-100gהכנת תמיסת כחול אנילין לצביעת Masson's trichrome
כפפות רפואיות סטריליותNanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.–הגנה כימית וביולוגית
BuprenorphineQinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.H10940181אלגזיה לאחר ניתוח
Cefazolin sodium להזרקהCSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.–פרופילקסיס אנטיביוטי פרי-אופרטיבי
מקלוני צמרShijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.–ניגוב האפיקרד והכנה סטרילית
תמיסת צביעת DAPIThermo FisherD1306סימון גרעיני
קרם להסרת שיערVeet–הסרת שיער מהבית
סורק שקופיות דיגיטלי3DHISTECHPannoramic MIDI IIדימוי של שקופית שלמה
מגביר ECGBIOPAC SystemsECG100Cהגברה של אלקטרוקרדיוגרם
מערכת להקלטת אלקטרוקרדיוגרםBIOPAC SystemsMP160הקלטת אלקטרוקרדיוגרם
ערכת ELISA, פפטיד נטריורטיק מסוג B של עכברQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RXW202726Mכימות BNP בסרום
ערכת ELISA, אינטרלוקין-1β של עכברQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX203063Mכימות IL-1β בסרום
ערכת ELISA, nuclear factor-κB p65 של עכברQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX201879Mכימות NF-κB p65 בסרום
ערכת ELISA, tumor necrosis factor-α של עכברQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX202412Mכימות TNF-α בסרום
קסטות להטמעהJiangsu Shitai22022הטמעת רקמות
קתטר אנדוטרכאלי, 20 GShenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.B11103אינטובציה אורלית; קוטר חיצוני של כ-0.9–1.0 mm; מקוצר לכ-15 mm לפני השימוש
Eosin Y, מסיס באלקהולHefei BASF Biotechnology Co., Ltd.Y0310-100Gצביעת נגד ציטופלזמית במהלך צביעת hematoxylin and eosin
Evans BlueJarvisbioA312001סימון של כלי הדם הכליליים
פינצטה עדינהRWD Life ScienceF12011-10טיפול ברקמות ופתיחת הפריקרד
פינצטה עדינה, למיקרו-כירורגיהRWD Life ScienceFC12002T-08טיפול ברקמות במיקרו-כירורגיה
מספריים עדיניםRWD Life ScienceS12000-09מספריים אופתלמולוגיים לחיתוך עור ודיסקציה
חומצה אצטית קרחיתChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.–הכנת חומצה אצטית 1% עבור דיפרנציאציה של Masson's trichrome
שקופיות זכוכיתJiangsu Shitai80312/80302הנחת חתכים
סטריליזטור חרוזי זכוכיתRWD Life ScienceRS3002סטריליזציה של מכשירים בין חיות
תוכנת GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 5.0ניתוח סטטיסטי
פד חימוםRWD Life Science69020ויסות תרמי לאחר ניתוח
תמיסת צביעת HematoxylinWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1004צביעת גרעין במהלך צביעת hematoxylin and eosin
נוגדן זיהוי מצומד ל-Horseradish peroxidaseQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.כלול בערכות ELISAזיהוי ב-ELISA
חומצה הידרוכלוריתChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.1337Aהכנת אלכוהול חומצי לדיפרנציאציה של hematoxylin
תוכנת Image-Pro PlusMedia CyberneticsVersion 6.0כימות של שבר נפח קולגן
תוכנת ImarisBitplaneVersion 7.2.3שחזור וניתוח תלת-ממדי
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10אלחוש בשאיפה
מערכת הרדמה ב-IsofluraneRWD Life ScienceTAIJI-IEהגשת Isoflurane
לרינגוסקופ, לבעלי חיים קטניםShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.SR310-MRויזואליזציה ישירה במהלך אינטובציה
מיקרוסקופ פלואורסצנציה Light-sheetLight Innovation TechnologyLiToneXLדימוי פלואורסצנציה תלת-ממדי
תוכנת LitScanLight Innovation TechnologyVersion 3.31תפירה והמרה של תמונות
מנשם מכניChengdu Taimeng Software Co., Ltd.HX-101Eהנשמה מכנית; 130 נשימות/דקה; נפח גאות 2 mL
המוסטט מיקרו-יתושהRWD Life ScienceFC21001R-12החזקת מחט במהלך ליגציה וסגירה
מזרק מיקרו-ליטרShanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.–הזרקת DAPI מקומית
קורא מיקרו-פלטהMolecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.SpectraMax iD5מדידת צפיפות אופטית ב-450 nm
מיקרוסקופ דיסקציהMaishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.MSD204ויזואליזציה תוך-ניתוחית
מיקרוסקופ אור אנכיLeicaDM500דימוי היסטולוגי
להבי מיקרוטוםEprediaMX35 ULTRAחיתוך פראפין
ערכה משופרת לצביעת Sirius RedWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1078צביעת קולגן; כוללת תמיסות A, B ו-C
n-ButanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0886Aדהידרטציה והבהרה היסטולוגית; דליק
שרף להנחה ניטרליShanghai YiyangYSQN41-91הנחה על שקופית
תפר ניילון, 3/8-מעגל 7-0 עם מחטNingbo Medical Needle Co., Ltd.–ליגציה של העורונרית השמאלית היורדת (LAD)
תפר ניילון, 5-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.–סגירת בית החזה והעור
תפר ניילון, 6-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.–חשיפה ומתיחה של דופן החזה
תחנת הטמעה בפראפיןWuhan Junjie ElectronicsJB-L5הטמעת רקמות
שעוות פראפיןNANAחדירה והטמעה של רקמות
סליין חוצץ פוספט (PBS)Sigma-AldrichP3813שטיפת רקמות ודילול ריאגנטים
חומצה פוספומוליבדיתTianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.–דיפרנציאציה של Masson's trichrome
Ponceau 2RAladdinP104989-25gהכנת תמיסת Ponceau–acid fuchsin לצביעת Masson's trichrome
אשלגן דיכרומטZhengzhou Paini Chemical Reagent Factory7778-50-9חומר מקבע (mordant) ל-Masson's trichrome
פובידון–יודSingleLadyGB26368-2010חיטוי עור
מים מאוסמוזה הפוכהLaboratory-purifiedNot applicableהכנת תמיסות
מיקרוטום סיבוביLeica Instruments (ShanghaiRM2016חיתוך פראפין
מתאם למחזיק דגימהLight Innovation Technologyסופק עם LiToneXLהנחת דגימות מבהירות לדימוי light-sheet
סרט דבק רפואי לעורQingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.–קיבוע גפיים וזנב
כיסויי זכוכית לשקופיותJiangsu Shitai80340-1630כיסוי שקופיות
מייבש שקופיותShaoxing Luyue101-3Bייבוש שקופיות
תמיסת עצירהQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.כלול בערכות ELISAסיום תגובת ELISA
תמיסות מצע (substrate) A ו-BQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.כלול בערכות ELISAפיתוח צבע ב-ELISA
אמבט ציפה לרקמותWuhan Junjie ElectronicsJK-5/6ציפה של חתכים
מעבד רקמותWuhan Junjie ElectronicsJT-12Sעיבוד רקמות אוטומטי
ערכה להבהרת רקמות, ריאגנטים A–FJarvisbioJA11012הבהרת רקמות מבוססת ממס
פלטפורמה לאינטובציה טרכאליתRWD Life ScienceRe20-Mמיקום לאינטובציה אורלית
תוכנה לניתוח אולטרסאונדFujifilm VisualSonicsVevoLAB 3.2.6ניתוח נתוני אקו-קרדיוגרפיה
ג'ל אולטרסאונדTianjin Jinya Electronics Co., Ltd.TM-100צימוד אקו-קרדיוגרפי
מערכת דימוי אולטרסאונדFujifilm VisualSonicsVevo 3100אקו-קרדיוגרפיה
מגבה עפעפיים בצורת VSuqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.SS5009Gהרחקה של השרירים הבינ-צלעיים והצלעות
בופר שטיפהQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.כלול בערכות ELISAשטיפת פלטת ELISA
מערכת לטיהור מיםSichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.UPT-II-20Tייצור מים מאוסמוזה הפוכה
XyleneChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0586Aהבהרת רקמות והסרת פראפין; דליק ונוירוטוקסי

מקורות

  1. Thygesen K, et al. Fourth universal definition of myocardial infarction (2018). J Am Coll Cardiol. 2018;72(18):2231-2264.
  2. Lindahl B, Mills NL. A new clinical classification of acute myocardial infarction. Nat Med. 2023;29(9):2200-2205. doi:10.1038/s41591-023-02513-2.
  3. De Villiers C, Riley PR. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Dis Model Mech. 2020;13(11):dmm046565.
  4. Johns TNP, Olson BJ. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Ann Surg. 1954;140(5):675-682.
  5. Christia P, et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. J Histochem Cytochem. 2013;61(8):555-570.
  6. Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
  7. Kumar M, et al. Animal models of myocardial infarction: mainstay in clinical translation. Regul Toxicol Pharmacol. 2016;76:221-230.
  8. Gao E, et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 2010;107(12):1445-1453.
  9. van den Bos EJ, et al. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289(3):H1291-H1300.
  10. Pinelli A, et al. Isoproterenol-induced myocardial infarction in rabbits. Protection by propranolol or labetalol: a proposed non-invasive procedure. Eur J Pharm Sci. 2004;23(3):277-285.
  11. Maruyama K, et al. Surgical protocol for permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice to generate a model of myocardial infarction. STAR Protoc. 2021;2(3):100775.
  12. Johny E, Dutta P. Left coronary artery ligation: a surgical murine model of myocardial infarction. J Vis Exp. 2022;(186).
  13. Kolk MVV, et al. LAD-ligation: a murine model of myocardial infarction. J Vis Exp. 2009;(32):1438.
  14. Lugrin J, Parapanov R, Krueger T, Liaudet L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. J Vis Exp. 2019;(150).
  15. Chen J, et al. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017;313(2):H275-H282.
  16. Ahn D, et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;286(3):H1201-H1207.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.