מאמר מחקר

ביטוי של Mir-488-3p בסרום משמש כסמן ביולוגי לאבחון לא פולשני בחולים עם דלקת מפרקים שגרונית

27 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72346

⸱

28 באוגוסט 2026

 , 
1Department of Medical Laboratory, Hefei BOE Hospital

במאמר זה

סיכום

miR-488-3p עשוי לשמש כסמן אבחנתי לא פולשני חדש עבור RA. miR-488-3p מווסת את התפקוד הביולוגי של סינוביוציטים באמצעות ROCK1. הוא הראה מתאם שלילי משמעותי עם חומרת המחלה בחולי RA.

תקציר

האבחנה של דלקת מפרקים שיגית (rheumatoid arthritis - RA) נותרת מאתגרת בשל המגבלות של הסמנים הביולוגיים הקיימים. מטרת המחקר הייתה לבחון את הפוטנציאל של miR-488-3p בסרום כסמן ביולוגי ל-RA ולחשוף את מנגנון הפעולה הפוטנציאלי שלו. המחקר כלל 135 חולי RA, 130 חולי דלקת מפרקים שחיקית (osteoarthritis - OA) ו-125 ביקורות בריאות. רמות הביטוי של miR-488-3p נבדקו באמצעות RT-qPCR. מנגנון הפעולה נותח באמצעות בדיקות תפקודיות (CCK-8, ציטומטריה זרימה, ELISA) וניסויי תיקוף של מטרות (גן דווח לוציפראז, RIP). רמות הביטוי של miR-488-3p בסרום היו נמוכות באופן מובהק בחולי RA מאשר בחולי דלקת מפרקים שחיקית (OA) ובביקורות בריאות (p < 0.001). ניתוח עקומת ROC הראה כי ל-miR-488-3p דיוק אבחנתי גבוה בהבחנה בין RA לבין ביקורות בריאות וחולי OA. miR-488-3p נמצא במתאם שלילי עם קצב שקיעת כדוריות דם אדומות (ESR), חלבון C-reactive (CRP), גורם שיגית (RF) ומדדי DAS28. תיקוף תפקודי גילה כי ביטוי יתר של miR-488-3p עיכב את השגשוג והתגובה הדלקתית של סינוביוציטים תוך השראת אפופטוזיס. מחקרי מנגנון הראו כי miR-488-3p יכול להכווין באופן ישיר ל-Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1 (ROCK1), המתווך את השפעותיו המגנות. miR-488-3p בסרום מבטיח לשמש כסמן אבחנתי לא פולשני חדש ל-RA ומגן על סינוביוציטים מפני פגיעה.

מבוא

דלקת מפרקים שיגית (RA) היא מחלה אוטואימונית שכיחה המאופיינת בדלקת סינוביאלית, שחיקת מפרקים והרסם1,2. השכיחות העולמית של RA היא כ-0.5%–1%3, דבר המשפיע באופן משמעותי על איכות חיי המטופלים ועל יכולתם לעבוד. למחלה התחלה זוחלת, ותסמינים מוקדמים הם לעיתים קרובות לא טיפוסיים ועלולים להיות מאובחנים באופן שגוי או להתפספס4. עם התקדמות המחלה, היא עלולה להוביל לעיוותי מפרקים, לאובדן תפקוד ואפילו להגביר את הסיכון לסיבוכים כגון מחלות קרדיווסקולריות5, מה שמטיל נטל כבד על המטופלים, משפחותיהם ומערכות הבריאות.

נכון לעת זו, לצורך אבחנת RA נדרש שילוב של תסמינים קליניים, סימנים, בדיקות מעבדה והערכה דימויית6. מדדים מעבדתיים נפוצים כוללים את קצב שקיעת כדוריות הדם האדומות (ESR) וחלבון C-reactive (CRP), שהם סממנים לא ספציפיים של דלקת מערכתית, כמו גם גורם שגשוגת (RF) ונוגדנים לפפטיד ציטרולין ציקלי (anti-CCP), המהווים ביומרקרים סרולוגיים חשובים ל-RA7,8. עם זאת, לביומרקרים מסורתיים אלו יש מגבלות: RF עשוי להיות חיובי אצל חלק מהאנשים הבריאים ואצל חולים עם מחלות אוטואימוניות אחרות (שיעור חיוביים שגוי של כ-5%); למרות ש-anti-CCP הוא ספציפי מאוד (>95%), רגישותו בשלבים מוקדמים של המחלה מוגבלת (כ-60–70%)4,9, וחלק מהחולים עם RA נותרים סרו-שליליים10. לפיכך, חשוב למצוא ביומרקרים רגישים וספציפיים יותר לצורך אבחון מוקדם, ניטור המחלה והערכת הפרוגנוזה של RA11.

MicroRNAs (miRNAs) הן קבוצה של מולקולות RNA רגולטוריות לא מקודדות אנדוגניות, שאורכן הוא כ-22–25 בסיסים12,13. נמצא כי miRNAs פועלות כווסתים מרכזיים בהתפתחות של מגוון מחלות, וביטוין השגוי קשור קשר הדוק לפתוגנזה של המחלה13,14,15, מה שהופך את miRNAs לביומארקרים מבטיחים לאבחון מחלות ולניטור טיפולי. בשנים האחרונות, תפקידן של miRNAs ב-RA זכה לתשומת לב גוברת16. מחקרים הראו כי מספר miRNAs קשורות לביטוי לא מאוזן (למשל, miR-146a, miR-155 וכו') בסרום, ברקמות סינוביאליות ובתאי מונונוקלאר של דם היקפי (PBMCs) של חולי RA17,18,19. miRNAs אלו תורמות לפתוגנזה של RA על ידי ויסות ייצור ציטוקינים דלקתיים, קידום פרוליפרציה ופלישה של תאים סינוביאליים והשפעה על התמיינות אוסטאוקלסטים20. מבין אלה, miR-488 ממופה לאזור הכרומוזום האנושי 1q25.221, ומחקרים קודמים אישרו את השפעותיה הנוירופרוטקטיביות: היא ממלאת תפקיד רגולטורי בהתקדמות של גליומות22 ונוירובלסטומות23, ובאופן בולט, miR-488-3p מקדמת אפופטוזיס של כונדרוציטים אוסטאו-ארטריטיים באוסטאו-ארטריטיס (OA)24. למרות ש-OA ו-RA הן מחלות מפרקים שונות, הן חולקות מנגנונים משותפים בתהליכים הפתולוגיים של דלקת סינוביאלית והרס סחוס25. השערנו כי miR-488-3p עשויה למלא תפקיד ב-RA על ידי ויסות נתיבי מטרה דומים. עם זאת, התפקיד הספציפי והמנגנונים הפוטנציאליים של miR-488-3p ב-RA טרם הובהרו.

המחקר בחן את השינויים ברמות הביטוי של miR-488-3p בסרום של חולי RA ואת הקשר שלהם לפעילות המחלה ולמדדים קליניים, במטרה להעריך את ערכו הפוטנציאלי כסמן אבחנתי לא פולשני עבור RA. מחקר זה מספק תובנה חדשנית לגבי סריקה מוקדמת וחיזוי של התקדמות המחלה ב-RA, ובכך משפר את הפרוגנוזה של חולי RA.

פרוטוקול

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים Hefei BOE (מספר אישור 2021–1), והסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים לפני הגיוס.

מטופלים ודגימות

מחקר זה גייס 135 חולים עם RA (שאובחנו על פי קריטריוני הסיווג של ACR/EULAR משנת 2010) מהמחלקה לראומטולוגיה ואימונולוגיה של בית החולים Hefei BOE, 130 חולים עם OA מהמחלקה לאורתופדיה (שאובחנו על פי קריטריוני האבחנה של ה-Chinese Medical Association ל-OA משנת 2018), ו-125 ביקורות בריאות שהותאמו לפי גיל ומגדר ממרכז הבדיקות הרפואיות של אותו בית חולים. המשתתפים היו בני 30–80 שנים. ביחס לקבוצת הביקורות הבריאות, בוצע אישור להיעדר מחלות אוטואימוניות, הפרעות במפרקים וזיהומים חריפים באמצעות סקירת היסטוריה מקיפה, בדיקה גופנית ובדיקות מעבדה. משתתפים הוצאו מהמחקר אם היו להם מחלות אוטואימוניות נלוות, היסטוריה של זיהום או טראומה ב-3 החודשים האחרונים, ממאירות, או אם היו בהריון או בתקופת הנקה.

דגימה והכנה

דם ורידי בצום נאסף מכל נשואי המחקר. לאחר קרישה בטמפרטורת החדר למשך 30 min, דגימות סרום בודדו על ידי סרכוז ב-1500 × g למשך 15 min. הסרום נשמר ב-80°C- עד לניתוח נוסף.

זיהוי סממנים קליניים וסרולוגיים

על מנת להעריך באופן מקיף את מצב המחלה ואת הפעילות הדלקתית, נמדדו סממנים ביולוגיים קליניים וסרולוגיים באמצעות שיטות מעבדה קליניות סטנדרטיות. ESR נמדד בשיטת Westergren כדי להעריך דלקת מערכתית לא ספציפית. CRP כומת באמצעות בדיקה אימונו-טורבידימטרית (ערך סימוכין נורמלי: <10 mg/L) להערכת התגובה הדלקתית בשלב החריף. RF נמדד באמצעות סבון סופח חיסוני המשורשר לאנזים (ELISA) עם ערך סימוכין נורמלי של ≤20 IU/mL. נוגדני Anti-CCP נמדדו באמצעות ELISA מהדור השני כדי לספק ראיות סרולוגיות לאבחנה של RA.

שורות תאים ותרבית

תאי סינוביוציטים דמויי פיברובלסטים אנושיים המושפעים מ-RA (HFLS-RA) גודלו במצע דולבקו משופר (DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטפטומייצין. התאים הוחזקו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO₂, ותאים בין המעברים השלישי והשישי שימשו לכל הניסויים.

מיצוי RNA ו-RT-PCR כמותי בזמן אמת

RNA כולל הופק מדגימות סרום באמצעות ריאגנט להפקת RNA. תעתוק הפוך בוצע באמצעות ערכה לסינתזת הגדיל הראשון של miRNA עבור miRNAs וערכה לתעתוק הפוך עבור גנים של RNA שליח (mRNA) בהתאם להוראות היצרן. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR) בוצעה באמצעות מערכת PCR בזמן אמת עם תערובת PCR מאסטר המבוססת על SYBR Green. תוכנית המחזור התרמי נקבעה לטמפרטורה של 95 °C לפני דנטורציה למשך 30 s; לאחר מכן 40 מחזורי הגברה (דנטורציה ב-95 °C למשך 5 s והלחמה/הארכה ב-60 °C למשך 30 s). כל דגימה נותח באופן משולש. RNA גרעיני קטן U6 (U6 snRNA) ו-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) שימשו כגנים של ייחוס אנדוגניים לנורמליזציה של miRNA ו-mRNA, בהתאמה. רצפי הפריימרים סוכמו ב-טבלה משלימה 1. רמות הביטוי היחסיות של miR-488-3p ושל הגנים מטרה שלו חושבו באמצעות שיטת 2−ΔΔCt. כמו כן, נותחו השינויים ברמות ה-mRNA של הגנים מטרה לאחר ביטוי יתר או עיכוב של miR-488-3p כדי לאמת את קשרי הוויסות ביניהם.

טרנספקציית תאים

תאי HFLS-RA נזרעו בלוחיות בעלות 6 בארות בצפיפות של 5 × 105 תאים לבאר. התאים עברו טרנספקציה באמצעות ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפוזומים, בהתאם להוראות היצרן. קבוצות הטרנספקציה כללו קבוצות של טרנספקציה בודדת וקבוצות של קו-טרנספקציה (co-transfection). קבוצות הטרנספקציה הבודדת היו: 1) ביקורת — תאים שלא עברו טרנספקציה; 2) ביקורת שלילית למיימיק (mimic NC) — תאים שעברו טרנספקציה עם ביקורת שלילית של miR-488-3p mimic; 3) miR-488-3p mimic — תאים שעברו טרנספקציה עם miR-488-3p mimic; 4) ביקורת שלילית למעכב (inhibitor NC) — תאים שעברו טרנספקציה עם ביקורת שלילית של miR-488-3p inhibitor; 5) miR-488-3p inhibitor — תאים שעברו טרנספקציה עם miR-488-3p inhibitor. קבוצות הקו-טרנספקציה היו: 1) miR-488-3p mimic + ביקורת לביטוי-יתר (oe-NC) — תאים שעברו קו-טרנספקציה עם miR-488-3p mimic וביקורת שלילית של וקטורי ביטוי-יתר של ROCK1; 2) miR-488-3p mimic + oe-ROCK1 — תאים שעברו קו-טרנספקציה עם miR-488-3p mimic ווקטורי ביטוי-יתר של ROCK1. כל רצפי הטרנספקציה סוכמו ב- טבלה משלימה 1. ווקטור הביטוי-יתר של ROCK1 הוקם על ידי שיבוט של אזור רצף הקידוד (CDS) אל תוך פלסמיד pcDNA 3.1. תאים שעברו טרנספקציה היו זמינים לניסויים הבאים לאחר 48 שעות מהטרנספקציה של התאים.

בדיקת תפקוד תאים

בדיקת שגשוג תאים (Cell Counting Kit-8 [CCK-8]): תאי HFLS-RA שעברו טרנספקציה הוחדרו ללוחיות 96 בארות בריכוז של 5 × 103 תאים/באר, עם שלוש בארות חזרתיות לכל קבוצה. בנקודות זמן של 0, 24, 48 ו-72 שעות לאחר הטרנספקציה, הוספו 10 µL של תמיסת CCK-8 לכל בארה, ולאחר מכן בוצעה אינקובציה ב-37 °C למשך 2 שעות. הבליעה נמדדה באורך גל של 450 nm (אורך גל גילוי) ו-630 nm (אורך גל ייחוס) באמצעות קורא מיקרופלייט. קצב השגשוג היחסי חושב כאשר נקודת הזמן 0 שעות שימשה כקו בסיס.

זיהוי אפוप्टוזה (ציטומטריה של זרימה): האפוप्टוזה הוערכה באמצעות ניתוח עם בדיקת אפוप्टוזה של Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI). תאים עברו טרנספקציה עם הפלסמידים המתאימים ואספו לאחר טריפסינציה. שיעור האפוप्टוזה נקבע באמצעות ציטומטריה של זרימה.

בדיקה של גורמים דלקתיים (Sorbent Immunosorbent Assay [ELISA] מקושר אנזימטית): תאי HFLS-RA נזרעו בלוחות בעלי 24 בארות והועברו טרנספקציה עם mimic של miR-488-3p, מעכב (inhibitor) של miR-488-3p, או בישורות השלילה המתאימות למשך 48 h. ריכוזיהם של interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) ו-interleukin-1β (IL-1β) במעטפת התרבית התאית נמדדו באמצעות ערכות ELISA.

תיקוף המטרה

חיזוי מטרה: ROCK1 נחזה להיות מטרה במורד המסלול של miR-488-3p באמצעות מאגר המידע TargetScan26אתרי הקישור החזויים בין miR-488-3p לבין ה- ROCK1 3′אזור לא מתורגם' (3'UTR)′אזור שאינו מקודד (UTR) זוהו גם.

בדיקת גן דוחה (Reporter Gene Assay) של לוסיפראז כפולה: ה-3′UTR מסוג הפרא או מוטנט של ROCK1 שובט לתוך הפלסמיד pGL3. אתרי הקישור החזויים והאתרים המוטנטים מוצגים ב-איור 4. תאי HEK- 293T עברו טרנספקציה משולבת של mimic או מעכב (inhibitor) של miR-488-3p יחד עם הווקטורים הבנויים27. פעילות הלוסיפראז נמדדה 48 h לאחר טרנספקציה עם mimic או מעכב של miR-488-3p.

שיקוע חיסוני של RNA‏ (RIP): תאי HFLS-RA דגרו עם נוגדן נגד Argonaute 2 (Ago2)‏ (RRID: AB_2882071, בדילול של 1:200) או עם נוגדן בקרה מסוג immunoglobulin G (IgG)‏ (RRID: AB_2819160, בדילול של 1:5000), ולאחר מכן בוצעו הפקת RNA ו-qPCR כמותי לבדיקת העשרה של mRNA של ROCK1, כפי שתואר לעיל.

ניתוח סטטיסטי

הניתוח הסטטיסטי של המחקר בוצע באמצעות SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) ו-GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). נתוני המדידה הוצגו כממוצע ± סטיית תקן (SD). כל הניסויים בוצעו עם שלושה חזרות ביולוגיות, וכל חזרה ביולוגית נותחה בשלוש חזרות טכניות. הנתונים הגולמיים צורפו בחומרי העזר. הנתונים הוערכו באמצעות תרשים הסתברות נורמלית (P-P plot) לפני ביצוע מבחנים סטטיסטיים פרמטריים. מבחן t למדגמים בלתי תלויים שימש להשוואת משתנים רציפים בקו הבסיס (למשל, גיל, מדד מסת גוף [BMI], וכו'), ומבחן חי-ריבוע שימש למשתנים קטגוריאליים (למשל, מגדר, וכו'). רמות ביטוי של גנים הושוו באמצעות מבחן t למדגמים בלתי תלויים. שינויים בשגשוג תאים בנקודות זמן שונות נותחו באמצעות ניתוח שונות (ANOVA) למדידות חוזרות, בעוד ש-ANOVA חד-כיווני שימש להשוואת שיעורי אפופטוזה שנקבעו באמצעות ציטומטריית זרימה. ניתוח מתאם בוצע באמצעות מבחני Spearman (עבור משתנים שאינם עומדים בהנחת התפלגות נורמלית) ו-Pearson (עבור משתנים העומדים בהנחת התפלגות נורמלית). ביצועים דיאגנוסטיים הוערכו באמצעות ניתוח עקומת מאפיין סטטיסטי (ROC). ערך הסף האופטימלי, הרגישות והסגוליות נקבעו באמצעות מדד Youden המקסימלי. כל המבחנים הסטטיסטיים היו דו-צדדיים, וערך p < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

תוצאות

מאפיינים בסיים של משתפי המחקר

מחקר זה כלל 125 ביקרות בריאות, 130 חולים עם OA ו-135 חולים עם RA לצורך ניתוח שיטתי (Table 1). לא נמצאו הבדלים משמעותיים במאפייני הבסיס של שלוש הקבוצות במונחים של גיל (p = 0.191), יחס מינים (p = 0.203) ו-BMI (p = 0.562), דבר שהבטיח את היכולת להשוות בין אוכלוסיות המחקר. במונחים של מאפייני המחלה, רמות ESR (82.63 ± 40.32 לעומת 18.39 ± 6.38 mm/h, p < 0.01) ורמות CRP (56.3 ± 38.07 לעומת 10.54 ± 4.98 mg/L, p < 0.01) בקבוצת ה-RA היו גבוהות משמעותית מאלו של קבוצת ה-OA, מה שמשקף את רמת הדלקת המערכתית. במקביל, RF, סמן סרולוגי הקשור ל-RA, היה חיובי ב-70.37% (95/135), עם ריכוז סרום גבוה משמעותית (14.13 ± 81.05 לעומת 5.10 ± 1.37 IU/mL, p < 0.01); ושיעור החיוביות ל-anti-CCP בחולי RA היה 56.30% (76/135), עם מדד DAS28 של 4.12 ± 1.36.

מאפייני ביטוי והערך האבחנתי של miR-48-3p בחולי RA

רמות הביטוי בנסיוב של miR-48-3p היו נמוכות באופן משמעותי בחולים עם RA בהשוואה לחולים עם OA ולביקורות בריאות (p < 0.01, איור 1A). ניתוח עקומות ROC הראה כי ל-miR-48-3p דיוק אבחנתי גבוה בהבחנה בין RA לבין OA ולביקורות בריאות: בהבחנה בין RA לביקורות בריאות, ערך ה-AUC היה 0.931 (95% CI: 0.896–0.967), רגישות של 96.15% (95% CI: 91.31%–98.35%) וסגוליות של 80.95% (95% CI: 73.2%–86.85%, p < 0.01, איור 1B); ובעת ההבחנה בין RA לחולים עם OA, ערך ה-AUC היה 0.80 (95% CI: 0.747–0.854), עם רגישות של 85.93% (95% CI: 79.06%–90.80%) וסגוליות של 66.15% (95% CI: 57.66%–73.72%, p < 0.01, איור 1C). ניתוח רגרסיה לוגיסטית רב-משתנית זיהה את miR-48-3p כגורם בלתי תלוי הקשור לסיכון ל-RA (OR = 0.16, 95% CI: 0.097–0.284; טבלה 2).

ניתוח קורלציה של miR-48-3p עם מדדים קליניים של RA

רמות הביטוי של miR-48-3p בסרום נמצאו במתאם שלילי מובהק עם מדדי קליניקה מרכזיים של RA, כולל ESR, CRP, RF ו-DAS28 (כולם p < 0.01; טבלה 3). באופן ספציפי, miR-48-3p נמצא במתאם שלילי עם ESR (r = −0.718), CRP (r = −0.726), RF (r = −0.805), ומד DAS28 (r = −0.836) (טבלה 3).

ביטוי יתר של miR-48-3p מעכב פרוליפרציה של תאים ותגובות דלקתיות ומשרה אפופטוזה בתאי HFLS-RA

כדי לבחון את ההשפעה של miR-48-3p על תפקודם של HFLS-RA, ויסלנו את ביטויו באמצעות טרנספקציה של mimics ומעכבים (inhibitors). ניתוח RT-qPCR אישר כי רמת הביטוי של miR-48-3p הייתה גבוהה משמעותית בקבוצת ה-miR-48-3p mimic בהשוואה לקבוצת הביקורת (p = 0.01), בעוד שרמת הביטוי בקבוצת המעכב של miR-48-3p הייתה נמוכה משמעותית (p = 0.03, Figure 2A). בדיקת CCK-8 הראתה כי ביטוי יתר של miR-48-3p עיכב את שגשוג התאים, שהיה נמוך משמעותית מזה של קבוצת הביקורת לאחר 24 h, 48 h ו-72 h (p = 0.0208, p < 0.001, p = 0.036), ועיכוב של ביטוי miR-488-3p הגביר משמעותית את שגשוג התאים (Figure 2B). זרימה ציטומטרית (Flow cytometry) הראתה כי ביטוי יתר של miR-48-3p קידם משמעותית אפופטוזיס (p = 0.03, Figure 2C).

לאחר מכן ביצענו ELISA כדי לבחון את ההשפעה של עלייה בביטוי של miR-48-3p על רמות של ציטוקינים דלקתיים. התוצאות הראו כי כאשר miR-488-3p היה מבוטא באופן יתר, רמות הציטוקינים הדלקתיים (IL-6, TNF-α, ו-IL-1β) פחתו באופן משמעותי (p < 0.01, איור 3A-C), בעוד שעיכוב של ביטוי miR-48-3p הביא לאפקט הפוך. השפעות רגולטוריות משמעותיות אלו אומתו בכל שלושת ניסויי החזרים הביולוגיים הבלתי תלויים, ובביקורות השליות לא נצפו שינויים משמעותיים (p > 0.05).

MiR-48-3p מווסת את ביטוי ROCK1 של מולקולות ROCK1

כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תפקידו של miR-488-3p בהתקדמות מחלת RA, בחנו את המטרות הזרימה (downstream targets) של miR-48-3p. ניתוחים ביו-אינפורמטיים הראו כי miR-48-3p צפוי להיקשר לאזור ה-3'UTR של ROCK1 (איור 4A). בדיקת דו-לוקיפראז (Dual luciferase reporter assay) אישרה כי פעילות הלוקיפראז פחתה באופן משמעותי כאשר ROCK1 3'UTR מסוג פרא (wild-type) עבר טרנספקציה משותפת עם miR-48-3p mimics (p < 0.001), ופעילות הלוקיפראז עלתה באופן משמעותי כאשר הביטוי של miR-48-3p נעיכב (p < 0.01); לעומת זאת, לא חל שינוי משמעותי באפקט רגולטורי זה לאחר מוטציה באתר ההיקשרות (איור 4B). ניסויי RIP אישרו עוד יותר קשר רגולטורי זה, והראו כי רמת הביטוי של ROCK1 mRNA הייתה גבוהה באופן משמעותי בקומפלקסים המועשרים בנוגדן Ago2 בהשוואה לבבקרי IgG (p < 0.001, איור 4C).

בנוסף, בדגימות קליניות, ROCK1 הראה דפוס ביטוי הפוך מזה של miR-48-3p, כאשר נצפתה עלייה משמעותית בביטוי של ROCK1 ביחס הן לחולי OA והן לקבוצות ביקורת בריאות (איור 4D). בתאי HFLS-RA, בדיקת RT-qPCR גילתה כי ביטוי יתר של miR-48-3p הוביל לירידה משמעותית בביטוי של ROCK1 (p = 0.093), בעוד שעיכוב של miR-48-3p הגביר באופן משמעותי את ביטוי ROCK1 (p = 0.03, איור 4E).

ROCK1 מתווך את ההשפעות הרגולטוריות של miR-48-3p על תאי HFLS-RA

בתאי HFLS-RA, הדיכוי של ביטוי ROCK1 על ידי ביטוי יתר של miR-48-3p הובא לסיומו באמצעות טרנספקציה של וקטורים לביטוי יתר של ROCK1 (איור 5A). באופן דומה, ההשפעה העיכובה של ביטוי יתר של miR-48-3p על ת proliferation של תאים נחלשה על ידי ביטוי יתר של ROCK1 (איור 5B). יתרה מכך, ביטוי יתר של ROCK1 ביטל גם את הגברת האפופטוזיס שהושרה על ידי miR-48-3p (איור 5C) והחזיר את רמות הציטוקינים הדלקתיים שדוכאו על ידי ביטוי יתר של miR-48-3p (איור 5D).

תרשימי כינור (Violin plots) ועקומות ROC המציגים ניתוח ביטוי ורגישות-סגוליות במחקר RA.
איור 1. רמות ביטוי וביצועים אבחנתיים של miR-48-3p בחולים עם דלקת מפרקים שגרונית (RA), דלקת מפרקים ניוונית (OA) ובקרי בריאות. (Aהשוואה של רמות ביטוי יחסיות של miR-48-3p בחולי RA, חולי OA ובביקרים בריאים.B( ) ניתוח עקומת מאפייני תגובה של מקלט (ROC) של miR-48-3p להבחנה בין RA לבקרות בריאות. (Cניתוח עקומת ROC של miR-48-3p להבחנה בין חולי RA לחולי OA. AUC, שטח תחת העקומה; CI, רווח סמך. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח ביטוי גנים; תרשימי עמודות וגרף קווי; חיוניות תאים, אפופטוזיס, השפעות של miR-48-3p.
איור 2. השפעות תפקודיות של miR-48-3p בתאי HFLS-RA. (Aביטוי יחסי של miR-48-3p בתאי HFLS-RA שעברו טרנספקציה, שנקבע באמצעות תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותית (RT-qPCR).B) השפעות של ביטוי יתר ועיכוב של miR-48-3p על שגשוג תאים. (C) השפעות של ביטוי יתר ועיכוב של miR-488-3p על אפופטוזה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. כל המדידות בוצעו באמצעות שלוש חזרות ביולוגיות, כאשר לכל אחת מהן שלוש חזרות טכניות. p < 0.05 מעיד על הבדל מובהק סטטיסטית בין הקבוצות המצוינות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשימי עמודות של ריכוזי ציטוקינים; פנלים A-C; IL-6, TNF-α, IL-1β; השוואה סטטיסטית.
איור 3. השפעת miR-48-3p על הפרשת ציטוקינים דלקתיים. (Aאינטרלוקין-6 (IL-6).Bגורם נמק גידולי אלפא (TNF-α).C) אינטרלוקין-1בטא (IL-1β). ריכוזי הציטוקינים נמדדו באמצעות תגובת ספיחה חיסונית מקושרת לאנזים (ELISA). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. כל המדידות בוצעו באמצעות שלוש חזרות ביולוגיות, כאשר לכל אחת מהן שלוש חזרות טכניות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

תרשים בדיקת לוסיפראז: אינטראקציה של miRNA עם ROCK1, תרשימי עמודות ותוצאות ניתוח נתונים.
איור 4תיקוף המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הבקרה המכוונת של miR-48-3p על ROCK1. (Aאתר קישור חזוי של miR-488-3p בתוך האזור הבלתי מתורגם מ-'(3'UTR של ROCK1.B) בדיקת דואל-לוסיפראז (Dual luciferase reporter assay) המדגימה את האינטראקציה בין miR-48-3p לבין ה-3′UTR של ROCK1 מסוג הפרא (wild-type) או מוטנטי. (Cבדיקת שיקוע חיסוני של RNA (RIP) המראה העשרה של RNA מסנגר (mRNA) של ROCK1 בקומפלקסים המועשרים בנוגדן ל-Argonaute 2 (Ago2).ד') רמות ביטוי יחסיות של ROCK1 בחולים עם RA, חולים עם OA ובקרי בריאות. (ה) ביטוי יחסי של ROCK1 בתאי HFLS-RA שעברו טרנספקציה, שנקבע באמצעות תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותית (RT-qPCR). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. כל המדידות בוצעו באמצעות שלוש חזרות ביולוגיות, ובכל אחת מהן שלוש חזרות טכניות. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מורחבת של דמות זו.

תרשימי ביטוי גנים המשווים את רמות ROCK1 ומסמנים דלקתיים באמצעות שיטת mimic של miR-48-3p.
איור 5מעורבות של ROCK1 בוויסות של תאי HFLS-RA על ידי miR-48-3p. (A(ויסות של ביטוי ROCK1 בתאי HFLS-RA בעקבות טרנספקציה של התאים. (Bהשפעות של ביטוי יתר של ROCK1 על שגשוג תאים תחת ביטוי יתר של miR-48-3p.Cהשפעות של ביטוי יתר של ROCK1 על אפופטוזה תחת ביטוי יתר של miR-48-3p.D) השפעות של ביטוי יתר של ROCK1 על ייצור ציטוקינים דלקתיים תחת ביטוי יתר של miR-48-3p. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. כל המדידות בוצעו באמצעות שלוש חזרות ביולוגיות, כאשר לכל אחת מהן שלוש חזרות טכניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

משתנהביקורת (n = 125)OA (n = 130)RA (n = 135)pערך-p
גיל (שנים)55.10 ± 9.3057.21 ± 10.2755.22 ± 11.610.191
מין (זכר/נקבה)74/5163/6769/660.203
BMI (ק"ג/מ²)2)22.79 ± 1.7322.98 ± 1.9823.04 ± 2.050.562
משך המחלה (שנים)-7.96 ± 4.008.03 ± 3.830.882
חיוביים ל-Anti-CCP ‏(n/%)--76 (56.30)-
שעוברי שקיעה (מ"מ/שעה)18.39 ± 6.3882.63 ± 40.32<0.001
CRP (מ"ג/ליטר)10.54 ± 4.9856.33 ± 38.07<0.001
חיובי ל-RF--95 (70.37)
RF (IU/mL)-5.10 ± 1.37144.13 ± 81.05<0.001
DAS28--4.12 ± 1.36-

טבלה 1: מאפייני בסיס של משתפי המחקר. שלוש קבוצות המחקר היו דומות מבחינת מאפיינים דמוגרפיים. חולי RA הראו רמות מוגברות של סמנים דלקתיים ושל RF.

משתנהOR95%CIp-value
גיל (שנים)1.410.82–2.420.21
מין (זכר/נקבה)1.2090.707–2.0670.489
BMI (kg/m2)1.360.78–2.2950.293
משך המחלה (שנים)1.130.63–1.9290.653
MiR-483-3p0.1660.097–0.284<0.01

טבלה 2: גורמים בלתי תלויים שהופקו מרגרסיה לוגיסטית רב-משתנית הקשורים להתקדמות של אוסטאוארתריטיס לדלקת מפרקים שיגרונית. נמצא כי MiR-48-3p קשור לסיכון להתפתחות RA בחולי OA.

פריטיםMiR-48-3p (דלקת מפרקים שיקומייה)p-value
מתאם (r)
ESR (mm/h)-0.718<0.001
CRP (mg/L)-0.726<0.01
RF (IU/mL)-0.805<0.01
DAS28 -0.836<0.01

טבלה 3: מתאמים בין miR-48-3p לבין מאפיינים קליניקו-פתולוגיים של חולי RA. miR-48-3p נמצא במתאם שלילי מובהק עם ESR, CRP, RF ומד DAS28 בחולים עם RA.

טבלה משלימה 1. מידע על רצפים של טרנספקציית תאים ובדיקת PCR. ריכוז של רצפי הפריימרים וחומרי הטרנספקציה ששימשו במחקר.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

דיון

כפי שהודגש על ידי Smolen et al1 בהנחיות האחרונות לאבחון וטיפול ב-RA, לפיתוח של סמנים ביולוגיים חדשים יש ערך קליני משמעותי. במחקר זה, אישרנו שרמות של serum miR-488-3p היו נמוכות באופן משמעותי בחולים עם RA והראו ביצועי אבחון מבטיחים, עם רגישות וסגוליות משביעות רצון יחסית. אבחון מוקדם של RA היה תמיד קושי קליני, וסמנים ביולוגיים קיימים אינם רגישים מספיק לאבחון RA, בעוד שהפוטנציאל האבחוני המשמעותי של miR-488-3p עשוי למלא פער זה, במיוחד לזיהוי חולי RA סרו-שליליים. בהשוואה לאנשים בריאים, חולי RA הראו דלקת מערכתית בולטת יותר. בעוד שחולי OA סובלים בעיקר מהפרעה מפרקית ניוונית מקומית, דלקת מערכתית בדרגה נמוכה נצפית לעיתים קרובות. לפיכך, יעילות ההבחנה של miR-488-3p גבוהה בהרבה כאשר היא מושווה לאנשים בריאים מאשר בהשוואה לחולי OA. ביצועי האבחון של miR-488-3p לא הושוו ישירות לאלו של סמנים ביולוגיים קליניים מבוססים. החולים שנכללו במחקר זה אובחנו לפי תקן הזהב הקליני הנוכחי ל-RA, השיל סמנים ביולוגיים מבוססים כגון נוגדני anti-CCP, RF, ESR ו-CRP. הבדלים משמעותיים בסמנים אלו נצפו בין חולי OA ל-RA (Table 1). לכן, קוהורט זה לא היה מתאים להשוואה ישירה של ביצועי האבחון של miR-488-3p מול סמנים ביולוגיים מבוססים אלו. השוואות כאלה דורשות קוהורט אימות עצמאי.

בנוסף, נמצא כי רמות הביטוי של miR-488-3p נמצאות במתאם שלילי מובהק עם מדדים קליניים שונים של RA, כולל סממנים דלקתיים מערכתיים (ESR, CRP)28, ונוגדנים עצמיים (RF)6. בעל משמעות קלינית מיוחדת, miR-488-3p הראה מתאם שלילי חזק עם מדד הפעילות של המחלה (DAS28). DAS28 הוא מדד מורכב המשקף את פעילות המחלה בהתבסס על נפיחות במפרקים, רגישות, דלקת והמצב הקליני של המטופלים. לפיכך, ממצאים אלו מצביעים על כך ש-miR-488-3p עשוי לשמש כביומארקר פוטנציאלי לפעילות המחלה ב-RA. הדבר תומך גם בתפקידו הרגולטורי בפתוגנזה של RA, ועשוי להשפיע על התקדמות המחלה על ידי עיכוב מסלולי איתות דלקתיים או תגובות אוטואימוניות29.

בניסויים פונקציונליים, מצאנו כי miR-488-3p דיכא את השכפול ועודד אפופטוזיס של תאי HFLS-RA מחולי RA, והפחית באופן משמעותי את הייצור של ציטוקינים דלקתיים (IL-6, TNF-α, ו-IL-1β). תאי HFLS-RA ממלאים תפקיד מרכזי בתהליך הפתולוגי של RA30, כאשר שכפולם השגוי וצמיחתם הפולשנית עלולים להוביל להיפרפלזיה סינוביאלית ולהרס המפרק, בעוד שייצור יתר של גורמים דלקתיים מחמיר עוד יותר את התגובות הדלקתיות המקומיות והסיסטמיות31. לפיכך, ויסות תפקוד ה-HFLS-RA על ידי miR-488-3p עשוי לעכב ישירות פלישה סינוביאלית ושחיקת עצם ב-RA, ובכך לספק בסיס תיאורטי לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות חדשניות. מחקרים קודמים הראו כי miRNAs אחרים, כגון miR-155, יכולים להשפיע על התקדמות ה-RA על ידי ויסות תפקוד הסינוביוציטים19, דבר התומך ממילא בממצאינו.

מחקרים מכניסטיים הוכיחו כי miR-488-3p יכול להכווין באופן ישיר את ROCK1 ולעכב את ביטויו על ידי קישור ל-3'UTR שלו. ROCK1 הוא מולקולת אפקטור מרכזית במסלול השיגנלינג Rho/ROCK, המעורב בארגון מחדש של השלד התאי, בתגובה דלקתית ובפיברוזיס32. מחקרים קודמים הראו כי ROCK1 מובע ברמה גבוהה בסינוביוציטים של RA ומקדם את הגירתם ופלישתם33. כצפוי, ביטוי יתר של ROCK1 ביטל באופן משמעותי את השפעותיו של miR-488-3p על תאי HFLS-RA, דבר המצביע על מעורבותו בתפקיד הרגולטורי של miR-488-3p בהתקדמות RA.

עם זאת, נותר עוד תהליך עבודה רב למחקרים עתידיים. הביטוי של miR-488-3p בדגימות קליניות הוערך באמצעות RT-qPCR כאשר U6 שימש כרפרנס פנימי. מחקרים קודמים דיווחו על ממצאים סותרים בנוגע ליציבות של U6, במיוחד בדגימות במחזור הדם, כגון סרום. למרות שניתוח ניסויים ראשוניים נערכו במחקר הנוכחי כדי להבטיח את יציבות ה-U6, התנודתיות הפוטנציאלית של U6 עדיין מהווה מגבלה, ובכך מעלה את הסיכון לאבחנה שגויה. נדרש תיקוף נוסף באמצעות גנים של רפרנס פנימי יציבים יותר. מצד שני, ההערכה הקלינית של miR-488-3p התבססה על קוהורט ממרכז רפואי אחד ללא תיקוף חיצוני. גודל המדגם היה קטן יחסית, ומוגבל להיקף בית החולים. יתרה מכך, חסר היה מעקב אlongitudinal להערכת הערך הפרוגנוסטי של miR-488-3p. יש לטפל במגבלות אלו במחקרי המשך. בנוסף, מספר מחקרים מראים כי הולכה של miRNAs in vivo נותרה אתגר מרכזי עבור יישום קליני34. מחקרים עתידיים יוכלו לתקף את הפוטנציאל הטיפולי של miR-488-3p in vivo על ידי בניית עכברים עם knockout מותנה או שימוש במערכות הולכה ממוקדות כגון נשאים ננומטריים35.

לסיכום, מחקר זה חשף את הערך הפוטנציאלי של miR-488-3p באבחנה ובמיקוד טיפולי פוטנציאלי של RA. miR-488-3p הפגין ביצועים אבחנתיים גבוהים ועכב את השגשוג ואת התגובות הדלקתיות של תאי HFLS-RA, תוך קידום אפופטוזה. הדבר מרמז כי הוא עשוי להוות מטרה מבטיחה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור RA. מחקר עתידי צריך להתמקד ב-1) תיקוף היציבות האבחנתית של miR-488-3p בקוהורטים רב-מרכזיים גדולים, 2) בחינת השפעות סינרגיסטיות שלו עם סוכני טיפול קיימים, כגון מעכבי JAK או תרופות ביולוגיות28, ו-3) אופטימיזציה של מערכות הובלת ה-miRNA כדי לשפר את ההיתכנות שלהן לתרגום קליני36.

זמינות נתונים:

הנתונים הגולמיים התומכים בממצאי מחקר זה זמינים בחומרי העזר שהוגשו עם כתב יד זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכה לזיהוי אפופטוזיס באמצעות Annexin V-FITCBD Bioscience556547אפופטוזיס של תאים
נוגדן anti-Ago2Proteintech66720-1-Igשיקוע חיסוני של RNA
תמיסת CCK-8DojindoCK04שגשוג תאים
מצע דאלבקו משופר איגל (DMEM)Thermo Fisher121000146תרבית תאים
סרום עגל עובריThermo Fisher10437028תרבית תאים
ציטומטר זרימהBD Bioscience FACSCaliburאפופטוזיס של תאים
ערכה לבדיקת ELISA לנוגדני anti-CCP אנושייםCusabioCSB-E09077h זיהוי anti-CCP
ערכת ELISA עבור RF-IgA אנושיFeien BiotechnologyEH4270גילוי RF
סינוביוציטים דמויי פיברובלסטים של בני אדם עם דלקת מפרקים שיגרונית (HFLS-RA)יישומי תאיםHFLS-RA-200תיקוף במעבדה (in vitro) לתפקוד של miR-488-3p
נוגדן בקרה IgGAbcamab205718שיקוע חיסוני של RNA
אינטרלוקין-1β (IL-1βערכת ELISAR&D SystemsDY201-05IL-1 תאיβ ריכוז
ערכה לבדיקת ELISA עבור אינטרלוקין-6 (IL-6)R&מערכות DD6050Bריכוז IL-6 תאי
ריאגנט טרנספקציה ליפוזומלית 3000Ingenuity Life TechnologiesL3000015טרנספקציית תאים
קורא מיקרו-פלטותBioTek ELx808בדיקת ELISA
ערכה לסינתזה של הגדיל הראשון של miRNA מסוג Mir-XTMNihonbao Bioengineering Co., Ltd.638313שעתוק הפוך
מצע Opti-MEMIngenuity Life Technologies, Inc31985070טרנספקציית תאים
pcDNA 3.1InvitrogenV790-20ביטוי יתר של ROCK1
פניסילין-סטרפטומייציןThermo Fisher15140122תרבית תאים
מערכת מעבדה Phadia 250Thermo Fisher Phadia 250בדיקת דם
ערכת שעתוק הפוך PrimeScriptTMNihonbao Bioengineering Co., Ltd.RR037Aשעתוק הפוך
פרופידיום יודיד (PI)/ ריבנוקלאס (RNase)BD Bioscience550825אפופטוזיס של תאים
מערכת QuantStudio 5Applied Biosystems, Inc.A28138בדיקת PCR
ריאגנט RNAiso PlusNihonbao Bioengineering Co., Ltd.9108בידוד RNA
SYBR Green Premix Ex TaqNippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd.RR420Aהגברה באמצעות PCR
מאגר המידע TargetScanTargetScanלא רלוונטיחיזוי אתרי קישור, (https://www.targetscan.org/) 
Tina-quant C-Reactive Protein IVRoche Diagnostics7876033190גילוי CRP
גורם נמק גידולי-α (TNF-αערכת ELISAR&D SystemsDY210-05TNF תאי-α ריכוז

מקורות

  1. Smolen JS, et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 2018;4:18001.
  2. Kook HY, et al. Serum miR-214 as a novel biomarker for ankylosing spondylitis. Int J Rheum Dis. 2019;22(7):1196-201.
  3. Alamanos Y, Voulgari PV, Drosos AA. Incidence and prevalence of rheumatoid arthritis, based on the 1987 American College of Rheumatology criteria: a systematic review. Semin Arthritis Rheum. 2006;36(3):182-8.
  4. van der Linden MPM, et al. Long-term impact of delay in assessment of patients with early arthritis. Arthritis Rheum. 2010;62(12):3537-46.
  5. Anderson J, et al. Rheumatoid arthritis disease activity measures: American College of Rheumatology recommendations for use in clinical practice. Arthritis Care Res (Hoboken). 2012;64(5):640-7.
  6. Aletaha D, et al. 2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative. Arthritis Rheum. 2010;62(9):2569-81.
  7. Yang J, et al. MicroRNA-488: a miRNA with diverse roles and clinical applications in cancer and other human diseases. Biomed Pharmacother. 2023;165:115115.
  8. Molendijk M, Hazes JMW, Lubberts E. From patients with arthralgia, pre-RA and recently diagnosed RA: what is the current status of understanding RA pathogenesis? RMD Open. 2018;4(1):e000256.
  9. van Venrooij WJ, van Beers JJBC, Pruijn GJM. Anti-CCP antibodies: the past, the present and the future. Nat Rev Rheumatol. 2011;7(7):391-8.
  10. Szodoray P, et al. Anti-citrullinated protein/peptide autoantibodies in association with genetic and environmental factors as indicators of disease outcome in rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev. 2010;9(3):140-3.
  11. Filer A, et al. Utility of ultrasound joint counts in the prediction of rheumatoid arthritis in patients with very early synovitis. Ann Rheum Dis. 2011;70(3):500-7.
  12. Zuo C, Fan P, Yang Y, Hu C. MiR-488-3p facilitates wound healing through CYP1B1-mediated Wnt/β-catenin signaling pathway by targeting MeCP2. J Diabetes Investig. 2024;15(2):145-58.
  13. Mendell JT, Olson EN. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 2012;148(6):1172-87.
  14. Cai Z, Poulos RC, Liu J, Zhong Q. Machine learning for multi-omics data integration in cancer. iScience. 2022;25(2):103798.
  15. Fabian MR, Sonenberg N. The mechanics of miRNA-mediated gene silencing: a look under the hood of miRISC. Nat Struct Mol Biol. 2012;19(6):586-93.
  16. Duroux-Richard I, et al. Circulating miRNA-125b is a potential biomarker predicting response to rituximab in rheumatoid arthritis. Mediators Inflamm. 2014;2014:342524.
  17. Zakeri Z, et al. MicroRNA and exosome: key players in rheumatoid arthritis. J Cell Biochem. 2019;120(7):10930-44.
  18. Pauley KM, et al. Upregulated miR-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients. Arthritis Res Ther. 2008;10(4):R101.
  19. Kurowska-Stolarska M, et al. MicroRNA-155 as a proinflammatory regulator in clinical and experimental arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(27):11193-8.
  20. Pers YM, et al. miR-155 contributes to the immunoregulatory function of human mesenchymal stem cells. Front Immunol. 2021;12:624024.
  21. Fu Q, et al. miR-488-3p alleviates neuropathic pain by regulating target gene ROCK1. Acta Neurobiol Exp (Wars). 2023;83(3):271-9.
  22. Xue W, et al. PVT1 regulates the malignant behaviors of human glioma cells by targeting miR-190a-5p and miR-488-3p. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2018;1864(5 Pt A):1783-94.
  23. Muiños-Gimeno M, et al. Human microRNAs miR-22, miR-138-2, miR-148a, and miR-488 are associated with panic disorder and regulate several anxiety candidate genes and related pathways. Biol Psychiatry. 2011;69(6):526-33.
  24. Le TD, Zhang J, Liu L, Li J. Computational methods for identifying miRNA sponge interactions. Brief Bioinform. 2017;18(4):577-90.
  25. Scanzello CR, Goldring SR. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 2012;51(2):249-57.
  26. McGeary SE, et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 2019;366(6472):eaav1741.
  27. Liu X, et al. Impaired AGO2/miR-185-3p/NRP1 axis promotes colorectal cancer metastasis. Cell Death Dis. 2021;12(4):390.
  28. Smolen JS, Aletaha D, McInnes IB. Rheumatoid arthritis. Lancet. 2016;388(10055):2023-38.
  29. O'Connell RM, Rao DS, Baltimore D. microRNA regulation of inflammatory responses. Annu Rev Immunol. 2012;30:295-312.
  30. Bottini N, Firestein GS. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 2013;9(1):24-33.
  31. Firestein GS, McInnes IB. Immunopathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunity. 2017;46(2):183-96.
  32. Amano M, Nakayama M, Kaibuchi K. Rho-kinase/ROCK: a key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton (Hoboken). 2010;67(9):545-54.
  33. Peng H, et al. ROCK1 induces endothelial-to-mesenchymal transition in glomeruli to aggravate albuminuria in diabetic nephropathy. Sci Rep. 2016;6:20304.
  34. van der Meel R, et al. Smart cancer nanomedicine. Nat Nanotechnol. 2019;14(11):1007-17.
  35. Yin H, et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 2014;15(8):541-55.
  36. Setten RL, Rossi JJ, Han SP. The current state and future directions of RNAi-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(6):421-46.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סמן ביולוגי בנסיובRT-qPCRאפופטוזיס של סינוביוציטיםתגובה דלקתיתעקומת ROCמטרת ROCK1ציטומטריה של זרימה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.