מחקר זה הדגים כי LUS ו-miR-486-3p בסרום היו מוגברים בילודים עם תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS). הערכה משולבת שלהם שיפרה את הניבוי של חומרת המחלה והפרוגנוזה, ונמצא כי miR-486-3p מווסת את תפקוד התאים במודל ARDS על ידי התמקדמות ב-Delta-Like Canonical Notch Ligand 4.
מאמר מחקר
הערך הפרוגנוסטי של מדד אולטרסאונד ריאות ושל miR-486-3p בנסיוב בסינדרום איסוף נשימתי חריף ברך newborns
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקר זה נועד להעריך את הערך הפרוגנוסטי של מדד האולטרסאונד של הריאות (LUS) ושל serum miR-486-3p בתסמונת רסדירה חריפה של הנשימה (ARDS) בילודים, ולבחון את המנגנון הבסי. בסך הכל גויסו למחקר 12 ילודים עם ARDS ו-10 תינוקות בריאים שנולדו באותה תקופה לקבוצת הביקורת הבריאה, בהתאמה. כל ילוד עבר בדיקת אולטרסאונד של הריאות בתוך 6 h מהקבלה ליחידה לטיפול נמרץ ונבדק לצורך קביעת LUS. נעשה שימוש ב-Real-time quantitative PCR כדי לכמת את ביטוי הגנים, בעוד שניתוחי עקומת מאפייני תפעול מקבל (ROC) וניתוחי מתאם של פירסון בוצעו כדי להעריך את הביצועים הפרוגנוסטיים ואת המתאמים. יתרה מכך, הוקם מודל ARDS in vitro באמצעות HPMECs כדי לחקור את המנגנון הבסי של miR-486-3p. בוצע מבחן dual-luciferase reporter כדי לאמת את קשר המטרה בין miR-486-3p לבין Delta-Like Canonical Notch Ligand 4 (DLL4). התוצאות גילו כי LUS ו-serum miR-486-3p היו מוגברים באופן משמעותי בילודים עם ARDS. ניתוח עקומת ROC הראה כי הן miR-486-3p והן LUS יכולים לנבא את הפרוגנוזה של ARDS בילודים (AUC = 0.83 ו-0.873, רגישות: 96.4% ו-89.3%, סגוליות: 7.4% ו-73.8%, בהתאמה), ושילוב של miR-486-3p עם LUS הניב אפקט ניבוי טוב יותר (AUC = 0.929, רגישות: 92.9%, סגוליות: 84.5%). מבחינה מנגנונית, miR-486-3p כוון ל-DLL4 כדי לווסת את התפקודים הביולוגיים של תאי מודל ARDS. יחד, הערכה משולבת של LUS ו-serum miR-486-3p עשויה לשמש כגישה מבטיחה להערכת חומרת המחלה ולניבוי הפרוגנוזה בילודים עם ARDS. עדיין נדרש תיקוף רב-מרכזי נוסף כדי לאשר את התקינות הכללית של גישה זו.
מבוא
תסמונת הגעגוע הנשימתי החריף של יילודים (ARDS) היא הפרעה נשימתית קריטית ומסכנת חיים, המאופיינת בעיקרה בפגיעה בתפקוד הסורפקטנט האלבולרי, דבר המהווה סיכון רב להישרדות היילודים1,2. למרות פיתוחן של שיטות טיפול שונות, הפרוגנוזה הכללית של יילודים שנפגעו נותרת לא מספקת3. לכן, זיהוי מוקדם של חומרת המחלה והערכה פרוגנוסטית מדויקת הם חיוניים כדי למקסם את ההתערבויות הקליניות ולשפר את תוצאות הטיפול במטופלים. לאחר התפתחות ARDS, תפקוד הריאות של היילוד נפגע קשות, בליווי שיבוש באוורור ובחילוף הגזים4. אולטרסאונד של הריאות עשוי להיחשב כשיטת ההדמיה העיקרית לניטור האוור ב-ARDS5. הוא הפך לכלי הדמיה מועדף לצד מיטת החולה לניטור נגעים ריאתיים ב-ARDS, ומד אולטרסאונד הריאות (LUS) יושם באופן נרחב לאבחון מחלות נשימתיות חריפות ביילודים ולהערכת חומרת המחלה והפרוגנוזה במסגרות של טיפול נמרץ6. עם זאת, לבדיקת הדמיה או בדיקת מעבדה בודדת ישנם פגמים מובנים, והן אינן יכולות לספק מענה מלא לדרישות ההערכה הקלינית7. לפיכך, לבחינת סמנים ביולוגיים (biomarkers) חדשים לצורך ביסוס מערכת הערכה משולבת ישנה חשיבות קלינית רבה.
מיקרו-RNA (miRNA) מייצג מחלקה חדשה של גורמי בקרה גנטים המשחקים תפקיד מרכזי בפתוגנזה של ARDS8. לדוגמה, ביטוי מופחת של miR-141-3p קשור באופן הדוק לחומרת המחלה בפיברוזיס ריאתי ובפגיעה ריאתית9. miR-124-3p מהווה גורם מגן מפני ARDS על ידי סימון p6510. מחקרי ריצוף בעלת תפוקה גבוהה שבוצעו בעבר אישרו כי miR-486-3p מועלה באופן משמעותי בחולים עם ARD11. מחקרים עדכניים הדגישו את ציר hsa_circ_06892/miR-486-3p כמנגנון מולקולרי פוטנציאלי המעורב בהתפתחות של ARDS12. ממצאים אלו מרמזים כי miR-486-3p קשור באופן הדוק ל-ARDS. עם זאת, הערך הפרוגנוסטי והניבוי של miR-486-3p בנוגע לחומרה ולתוצאות של ARDS בילודים טרם הובהרו במלואם.
כיום, צילום רנטגן של החזה, אנליזה של גזי דם וזיהוי של סמן ביולוגי בודד הם השיטות המקובלות להערכת ARDS בילודים. דימות של החזה כרוך בחשיפה לקרינה ואינו יכול לספק ניטור חוזר בזמן אמת. אנליזה של גזי דם משקפת רק תפקוד נשימתי חריף וחסרה ערך ניבוי עבור פרוגנוזה לטווח ארוך. זיהוי של microRNA בודד מספק תוצאות כמותיות אובייקטיביות, אך אינו יכול לשקף שינויים מורפולוגיים בזמן אמת של רקמת הריאה. בהשוואה לגישות קונבנציונליות אלו, השילוב של LUS ו-serum miR-486-3p משלב את היתרונות של דימות לצד מיטת החולה וזיהוי מולקולרי.
מחקר זה התמקד בילודים שעמדו בקריטריונים של ARDS ולא ב-RDS קלאסי הנובע מחסר בסורפקטנט. לפיכך, מחקר זה מבקש להעריך האם LUS בסיסי ו-miR-486-3p בסרום מנבאים תמותה בטווח הקצר ב-ARDS של ילודים. מחקר זה שואף לספק נתונים בעלי ערך לשיפור ההערכה הקלינית של מצבי המחלה והערכות פרוגנוסטיות לטווח הקצר ב-ARDS של ילודים.
פרוטוקול
מחקר זה קיבל אישור אתי מוועדת האתיקה הרפואית של בית החולים הראשון של העם ביונגקאנג (The First People's Hospital of Yongkang), תוך הקפדה מלאה על הצהרת הלסינקי.
נבדקים
מחקר עוקבה תצפיתי זה, שנערך במרכז רפואי יחיד וכלל מרכיב ניסויי in vitro, בוצע בין ינואר 202 לדצמבר 2023. בסך הכל גויסו 12 רכים נולדים עוקבים שאובחנו עם ARDS בבית החולים הראשון של יונגקאנג (The First People's Hospital of Yongkang). לצורכי השוואה, גויסו תינוקות בריאים שנולדו באותה תקופה, ללא היסטוריה של אספיקסיה או מצוקה תוך-רחמית, כקבוצת ביקורת.
קריטריוני הכללה:
כל המשתתפים עמדו בקריטריונים האבחנתיים לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה בילודים כפי שהוגדרו בהנחיות מונטרה (מהדורת 2017). האבחנה אומתה באמצעות בדיקות דימות והערכות קליניות: בדיקות רנטגן העלו עכירות דיפוזית בשתי הריאות התואמת בצקת ריאתית, ובדיקת אקו-לב לא הראתה עדות ליתר לחץ דם בעליה השמאלית, ובכך נשללה בצקת ריאתית קרדיוגנית. קריטריונים נוספים כללו הופעה חריפה של תסמינים וצורך בהנשמה מכנית למשך יותר מ-3 ימים, ללא זיהומים חוץ-ריאתיים חמורים. הסכמה מדעת התקבלה כנדרש ממשפחותיהם של היילודים.
קריטריוני החרגה:
ילודים עם חסר ראשוני של סורפקטנט אלבIולרי, מחלות לב מולדת, הפרעות מטבוליות או מצבים רפואיים משמעותיים אחרים הוחרגו מהמחקר. יתרה מכך, תינוקות עם מומים בריאות או בדופן בית החזה או מומים מולדים משמעותיים אחרים הוחרגו. RDS ניאונטלי הוחרג.
נתונים קליניים
גיל הריוני, מין, משקל לידה בעת הקבלה ומאפיינים אימהיים תועדו עבור כל המשתתפים. כל רך נולד עבר בדיקת אולטרסאונד של הריאות בתוך 6 h מהקבלה ליחידה לטיפול נמרץ ונבדק עבור LUS. ה-LUS דורג על סולם עם מקסימום של 36 נקודות, כאשר ציון גבוה יותר העיד על חומרה רבה יותר של תסמינים ריאתיים. דגימות דם נאספו מיד עם ההקבלה כחלק מההערכה הקלינית הראשונית ולפני כל התערבות טיפולית משמעותית (למשל, מתן חוזר של סורפקטנט, העלאת דרגת הנשמה או התחלת טיפול בחומרים וזוואסו-אקטיביים). דגימות דם מרכים נולדים בריאים נלקחו בעת גיוסם למחקר. לצורך בידוד הסרום, דם מלא הוכנס למבחנות הפרדת סרום ונשאר ללא תנועה בטמפרטורת החדר למשך 30 min כדי לאפשר קרישה מלאה. לאחר מכן, הדגימות סובבו בצנטריפוגה במהירות של 150 x g למשך 15 min בטמפרטורה של 4 °C. supernatant הסרום הצלול העליון נשאב בזהירות, חולק למבחנות קריוגניות סטריליות ואוחסן מיד במקפיא בעל טמפרטורה נמוכה מאוד ב-80 °C- עבור ניסויים עתידיים. רק דגימות סרום צלולות וללא המוליזה שימשו לניסויים הבאים. מבחנות איסוף דם משומשות ושאריות דם נשלחו כפסולת ביולוגית רפואית בהתאם לתקנות המוסדיות.
קיבוץ
כל היילודים סווגו לשתי קבוצות נפרדות: הקבוצה הקלה (דרגות I–II) והקבוצה החמורה (דרגות III–IV), בהתבס על ממצאי צילום החזה הראשוני ועל חומרת המצב כפי שנבחנה 24 שעות לאחר האשפוז. פרשנויות צילומי החזה גילו דרגה I, המאופיינת בירידה בשקיפות הריאות באופן דו-צדדי, עם חלקיקים קטנים וצללים רשתית בתוך פרנכימת הריאה. דרגה II הצביעה על כך שהנגעים התפשטו לאזורי הריאה המרכזיים והחיצוניים, עם עדות לסימן של ברונכוגרמה אווירית (air bronchogram). בדרגה III חלה ירידה משמעותית בשקיפות בשתי הריאות, שהובילה לטשטוש גבולות הלב והסרעפת. דרגה IV התאפיינה בסימני ברונכוגרמה אווירית בולטים, שהגיעו לשיאם בעכירות כמעט מלאה המדמה מראה של "ריאה לבנה".
ילודים שאובחנו עם ARDS קיבלו משטר ניהול מקיף לאחר קבלתם ליחידה לטיפול נמרץ יילודים. משטר זה הכלה הנשמה מלאכותית, סדציה, מתן סורפקטנט ריאתי, טיפולים אנטי-דלקתיים, תמיכה תזונתית, סיוע בפינוי ליחה ואמצעים להחלפת נוזלים. האבחנה של ARDS ביילודים שימשה כנקודת הפתיחה למחקר. נקודות הסיום הוגדרו כהחלמה מוצלחת ושחרור של המטופל, או פטירתו של המטופל כתוצאה מטיפול לא יעיל. בהתבסס על התוצאות הקליניות, המשתתפים סווגו לשתי קבוצות: קבוצת השורדים וקבוצת הנפטרים.
תרבית תאים וטיפול
תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים אנושיים (HPMECs) גודלו ב-DMEM מועשר ב-10% fetal bovine serum, 10 U/mL penicillin, ו-10 µg/mL streptomycin. התאים הוחזקו ב-37 °C באינקובטור לח הכולל 5% CO₂. כדי להקים מודל תאי של ARDS, התאים טופלו ב-lipopolysaccharide (LPS) בריכוז של 1 mg/L13,14. הקמה מוצלחת של המודל אוששה על ידי תצפית על התכווצות תאית קלה תחת מיקרוסקופ הפוך לאחר הטיפול ב-LPS. עם סיום הניסויים, מצע גידול משומש, תאים מתים וחומרי תרבית חד-פעמיים נשלחו לפסולת ביולוגית מסוכנת.
טרנספקציית תאים וחלוקה לקבוצות
תאי HPMECs נזרעו בצלחות תרבית ודגרו עד להגעה ל-70% התלכדות (confluence) לפני הטרנספקציה. קומפלקסים של טרנספקציה הוכנו בהתאם להוראות היצרן. התאים חולקו לקבוצות: ביקורת ריקה, mimic של miR-486-3p, ביקורת שלילית ל-mimic, מעכב (inhibitor) של miR-486-3p, ביקורת שלילית למעכב, mimic של miR-486-3p + פלסמיד לביטוי יתר של DLL4 (OE-DLL4), ו-mimic של miR-486-3p + פלסמיד ביטוי יתר ריק (OE-NC). קומפלקסים של טרנספקציה הוספו לבארים המתאימות ודגרו למשך 4–6 h. המצע הוחלף במצע מלא טרי, והתרבית המשיכה למשך 24–48 h לצורך ניסויים המשך. טרנספקציה מוצלחת הוכרה על ידי התלכדות תאים יציבה ללא מוות תאי מוגבר.
PCR כמותי בזמן אמת
RNA כולל הוצא מתוך דגימות סרום ותאים בתרבית באמצעות ריאגנט להוצאת RNA. ריכוז ה-RNA ודרגת הניקיון שלו נמדדו באמצעות ספקטרופוטומטר, ודגימות עם A260/A280 יחס של 1.8–2.1 נחשב למתאים להמשך הניתוח. DNA משלים (cDNA) סונתז באמצעות ערכה לשעתוק הפוך. לאחר מכן בוצע PCR כמותי באמצעות מערכת PCR בזמן אמת עם תנאי המחזורים הבאים: דנטורציה ראשונית ב- 95 °C במשך 3 דקות, ולאחריהם 40 מחזורים של 95 °C למשך 10 שניות ו- 60 °C במשך 30 שניות. לצורך זיהוי microRNA, חושב הביטוי היחסי של miR-486-3p באמצעות ה-2-ΔΔCt שיטה שבה U6 snRNA משמש כביקורת פנימית. לצורך כימות mRNA, ביטוי DLL4 נורמל ל-GAPDH mRNA באמצעות אותה שיטה של 2-ΔΔCt algorithm. The primer sequences were listed as follows: miR-486-3p forward: 5'-GTATGACGGGGCAGCTCAGTA-3' and miR-486-3p reverse: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3', U6 forward: 5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3' and U6 reverse: 5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'. DLL4 forward: 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC-3' and DLL4 reverse: 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA-3', GAPDH forward: 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3' and GAPDH reverse: 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'.
בדיקת שגשוג תאים בשיטת CCK-8
תאים שעברו טרנספקציה נזרעו לתוך פלטות של 96 בארות בצפיפות של 1 × 103 תאים לבער, ודגרו למשך 24, 48 ו-72 שעות. לאחר מכן שאבו את מצע הגידול, והתאים נשטפו פעמיים ב-1× PBS. לאחר מכן, הוספו לכל בארה 100 µL של 1× PBS טרי ו-10 µL של תמיסת CCK-8, והפלטות דגרו ב-37 °C למשך שעתיים. הבליעה נמדדה ב-450 nm באמצעות קורא מיקרופלטות, ושגשוש התאים הוערך על סמך ערכי הבליעה. ביצוע מוצלח של הבדיקה התבטא בשינויים תלויי-זמן בבליעה בין הקבוצות הניסיוניות.
בדיקת אפופטוזיס באמצעות ציטומטריה של זרימה
התאים עוכרו באמצעות 0.25% trypsin, ות сусפנזיית התאים שהתקבלה נאספה וסובבה בצנטריפוגה במהירות 150 × g למשך 5 min בטמפרטורה של 4 °C. הנוזל העליון הוסר, ומשקעי התאים נשטפו שלוש פעמים ב-1× PBS שקולל מראש. לאחר מכן, התאים הושחו מחדש ב-50 µL של 1x Binding Buffer, ולאחר מכן נוספו 5 µL Annexin V-FITC ו-5 µL propidium iodide (PI). לאחר ערבוב עדין, הדגימות דגרו למשך 40 min בטמפרטורת החדר בחשיפה מוגבלת לאור. אפופטוזיס של התאים נמדד באמצעות ציטומטריית זרימה, והנתונים נותחו באמצעות תוכנה מתאימה לניתוח ציטומטריית זרימה. ביצוע מוצלח של הבדיקה התבטא בשיעור אפופטוזיס נמוך בקבוצת הביקורת הנורמלית ובעלייה ניכרת באפופטוזיס בקבוצת מודל ה-ARDS.
בדיקת לוסיפראז רפורטר (Luciferase reporter assay)
גנים מטרה פוטנציאליים של miR-486-3p זוהו באמצעות מאגר המידע המקוון TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/). לאחר זיהוי אתרי הקשירה החזויים, נבנו פלסמידי דווח לוסיפראז מסוג פרא (DLL4-WT) ומוטנטיים (DLL4-MUT) המכילים את רצפי הקשירה המתאימים. וקטורי ה-DLL4-WT וה-DLL4-MUT הועברו בטרנספקציה משותפת לתאי HPMECs יחד עם mimic-ים או מעכבים של miR-486-3p, בהתאמה. פעילות לוסיפראז יחסית נמדדה לאחר מכן באמצעות ערכה לבדיקת דווח לוסיפראז כפול (dual-luciferase reporter assay kit). אותות ביולומינסנציה זוהו באמצעות לומינומטר בהתאם להוראות היצרן. תיקוף מוצלח של המטרה התבטא בירידה משמעותית בפעילות הלוסיפראז בקבוצת ה-DLL4-WT בעקבות ביטוי יתר של miR-486-3p.
מידע מפורט על כל الريאגנטים, החומרים המתכלים והציוד המעבדתי ששימשו במחקר זה סופק בטבלת החומרים המצורפת.
שיטות סטטיסטיות
ניתוחים סטטיסטיים והדמיות נתונים בוצעו באמצעות SPSS גרסה 26.0 ו-GraphPad Prism גרסה 9.0. נתוני המדידה הוצגו כממוצע ± סטיית תקן, כאשר השוואות בין ממוצעים של שתי דגימות בלתי תלויות הוערכו באמצעות מבחן t למדגמים בלתי תלויים. להשוואות בין שלוש קבוצות או יותר, נעשה שימוש בניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) וב-ANOVA למדידות חוזרות, ולאחריהם מבחן השוואות מרובות post-hoc של Tukey כדי לזהות הבדלים בין הקבוצות. נתונים קטגוריאליים הוצגו כמספרים (אחוזים), והשוואות בין קבוצות נותחו באמצעות מבחן חי-ריבוע. מבחן Wilcoxon Mann-Whitney הוחל על נתונים לא פרמטריים. בנוסף, נבנתה עקומת ROC כדי להעריך את הערך הניבוי של רמות הביטוי של miR-486-3p בסרום ושל LUS בקביעת תמותה במטופלים ילדים עם ARDS. ניתוח מתאם פירסון שימש לבחינת מתאמים. לכל הקבוצות הניסיוניות היו שלושה שחזורים ביולוגיים בלתי תלויים ושחזורים טכניים. היחידה הסטטיסטית הוגדרה כניסוי בלתי תלוי, כאשר כל שחזור ביולוגי ייצג סבב תרבית תאים נפרד שנגזר ממעברים שונים, ושחזורים טכניים שימשו להפחתת השונות התוך-ניסיונית. נתונים משחזורים טכניים חושבו תחילה כממוצע, ולאחר מכן בוצע ניתוח סטטיסטי בהתבס על ערכי הממוצע של השחזורים הביולוגיים. מובהקות סטטיסטית נקבעה עבור p < 0.05.
תוצאות
נתוני בסיס ברי השוואה בין הקבוצות
המאפיינים הכלליים של התינוקות שנכללו במחקר מוצגים בטבלה 1. לא נמצאו הבדלים משמעותיים במאפיינים הדמוגרפיים הבסיים בין שתי הקבוצות: גיל הריון (36.07 ± 2.71 לעומת 35.72 ± 2.64 שבועות, p = 0.347), שיעור זכרים (59.0% לעומת 6.1%, p = 0.290), משקל לידה (3.39 ± 0.57 לעומת 3.3 ± 0.5 kg, p = 0.437), גיל האם (29.18 ± 4.00 לעומת 29.6 ± 4.05 שנים, p = 0.387), ושיטת הלידה (לידה נתובית: 54.0% לעומת 58.0%; ניתוח קיסרי: 46.0% לעומת 42.0%, p = 0.54), נתונים המצביעים על כך שקבוצות אלו היו ברי-השוואה. על בסיס הערכת צילום חזה, בקבוצת ה-ARDS, 72 מקרים (64.3%) סווגו כקלות (דרגה I-II), בעוד ש-40 מקרים (35.7%) סווגו כחמורות (דרגה III-IV).
חומרת ה-ARDS נמצאת במתאם עם הפרוגנוזה של המטופל
הניתוח ההשוואתי של תוצאות ההישרדות בין קבוצת הילדים עם ARDS ששרדו לבין אלו שנפטרו מוצג ב- טבלה 2מבין 12 הרכים שנולדו שאובחנו עם ARDS, 84 מקרים (75%) שרדו, בעוד ש-28 מקרים (25%) הסתיימו במוות. ראוי לציין כי לא נרשמו הבדלים מובהקים סטטיסטית בגיל התינוק, מין, משקל לידה, גיל האם, אופן הלידה, מאפייני מי השפיר, האטיולוגיה או משתנים אחרים בין שתי הקבוצות (p > 0.05). עם זאת, נצפה הבדל מובהק בחומרת ה-ARDS (p < 0.01), ובכך מדגיש גורם פרוגנוסטי קריטי.
miR-486-3p ו-LUS מוגברים ב-ARDS. ניתוח RT-qPCR העלה כי רמות miR-486-3p בסרום היו מוגברות באופן משמעותי בילודים עם ARDS בהשוואה לקבוצות ביקורת בריאות. יתרה מכך, בתוך קבוצת ה-ARDS, לקבוצה החמורה היו רמות גבוהות באופן בולט מאשר לקבוצה הקלה (P < 0.01) (איור 1A). בנוסף, LUS היה גבוה יותר בקבוצת ה-ARDS החמורה מאשר בקבוצת ה-ARDS הקלה (p < 0.01) (איור 1B). כאשר חלוקת חולי ה-ARDS בוצעה לפי תוצאה קלינית, קבוצת הנפטרים הראתה רמות LUS ו-miR-486-3p גבוהות באופן ניכר מקבוצת השורדים (איור 1C,D). נמצא מתאם חיובי חזק בין LUS ל-miR-486-3p בסרום בחולים שלא שרדו (r = 0.832, p <0.001) (איור 1E).
זיהוי משולב משפר את התחזית הפרוגנוסטית
בהתבס על פרוטוקול ניתוח ROC, הערכנו את הביצועים הפרוגנוסטיים של מדדים בודדים ומרוכבים. ערכי ה-AUC של LUS ו-miR-486-3p לניבוי תמותה בטווח הקצר היו 0.873 (95% CI: 0.809-0.936) ו-0.83 (95% CI: 0.822-0.94), בהתאמה. ערכי הרגישות היו 89.3% ו-96.4%, בעוד שערכי הספציפיות היו 73.8% ו-7.4%, בהתאמה. ערכי הסף (cut-off) האופטימליים עבור LUS ו-miR-486-3p היו 15.50 ו-1.465, בהתאמה. יתרה מכך, ה-AUC עבור המודל הניבוי המרוכב היה 0.929 (95% CI: 0.83-0.975), תוך הפגנת רגישות של 92.9% וספציפיות של 84.5% עם ערך סף אופטימלי של 1.659 (איור 1F).
עלייה בביטוי של miR-486-3p פוגעת בתפקוד התא
בעקבות הפרוטוקול לתרבית תאים ולהתערבות ב-LPS, בנינו מודל תאי in vitro של ARDS באמצעות HPMECs. תוצאות ה-qPCR הראו כי ביטוי miR-486-3p עלה בהדרגה עם הזמן לאחר גירוי ב-LPS (איור 2A). miR-486-3p עבר ביטוי יתר (overexpression) או השתקה (knockdown) כדי לבחון את השפעותיו על תאי מודל ה-ARDS (איור 2B). בהתאם לפרוטוקולים של בדיקת CCK-8 וציטומטריית זרימה, נבדקו שגשוג תאים ואפופטוזיס. ביטוי יתר של miR-486-3p דיכא באופן משמעותי את שגשוג התאים וקידם אפופטוזיס של תאים. לעומת זאת, השתקה של miR-486-3p הפחיתה את הנזק התאי המושרה על ידי LPS (איור 2C,D).
miR-486-3p מדכא את ביטוי ה-DLL4
בהתאם לפרוטוקול בניית הפלסמיד ומבחן הדו-לוסיפראז (dual-luciferase reporter assay), אימתנו את האינטראקציה בין miR-486-3p ל-DLL4. חיזוי ביואינפורמטי confirmed את קיומה של נקודת קישור שמורה בין miR-486-3p ל-3’UTR של DLL4 (איור 3A). פעילות הלוסיפראז בקבוצת ה-wild-type של DLL4 פחתה באופן משמעותי לאחר ביטוי יתר של miR-486-3p, בעוד שבקבוצת המוטנט לא נצפה שינוי ניכר (איור 3B), מה שמוכיח כי DLL4 הוא גן מטרה ישיר של miR-486-3p. במודלים של תאים, ביטוי DLL4 פחת באופן תלוי זמן לאחר טיפול ב-LPS (איור 3C). מניפולציה של ביטוי miR-486-3p ויססה באופן שלילי גם את רמות ה-DLL4 (איור 3D).
בדגימות קליניות, ביטוי ה-DLL4 היה נמוך יותר בילודים עם ARDS מאשר בביקורות בריאות, ופחת עוד יותר בקבוצת הנפטרים (איור 3E–F). נצפתה קורלציה שלילית בין miR-486-3p ל-DLL4 בחולים שלא שרדו (r = -0.795, P < 0.01) (איור 3G). כל בדיקות ה-qPCR עבור DLL4 בוצעו עם שלוש חזרות טכניות, והתוצאות היו יציבות.
DLL4 הופך את הפגיעה התאית המתווכת על ידי miR-486-3p
בעקבות פרוטוקול הקו-טרנספקציה באמצעות ה-miR-486-3p mimic והפלסמיד לביטוי יתר של DLL4, ביצענו ניסויי הצלה (rescue experiments). qPCR איש כי ביטוי ה-DLL4 שוחזר ביעילות לאחר טרנספקציה של OE-DLL4 (איור 4A). בדיקות תפקודיות הראו כי ביטוי יתר של DLL4 הפך באופן חלקי את ההשפעה העיכובית של miR-486-3p על שגשוג התאים ואת השפעתו הפרו-אפופטוטית (איור 4B,C). תוצאות אלו הצביעו על כך ש-miR-486-3p מווסת באופן חלקי את פעילות התאים על ידי תקיפת DLL4.
זמינות נתונים:
כל הנתונים שהופקו או נותחו במהלך מחקר זה מסופקים כ- קובץ משלים 1.
איור 1השוואה של רמות LUS ו-miR-486-3p בסרום בין הקבוצות. (A) רמות miR-486-3p בנסיוב אצל יילודים בריאים ויילודים עם ARDS. (Bערכי LUS בילודים בריאים ובילודים עם ARDS.C) רמות miR-486-3p בסרום בקבוצת השורדים ובקבוצת הנפטרים. (ד') ערכי LUS בקבוצת השורדים ובקבוצת הנפטרים. (הניתוח מתאם בין miR-486-3p בסרום לבין LUS בילודים עם ARDS שלא שרדו.F) עקומות ROC של LUS בודד, miR-486-3p בודד, וזיהוי משולב לניבוי פרוגנוזה של ARDS בילודים. כל הנתונים הכמותיים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן; פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. *** = p <0.01, בהשוואה לקבוצת הבריאים; ### = p <0.01, בהשוואה לקבוצת ה-ARDS הקל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 2השפעת miR-486-3p על תאי מודל של ARDS. (A) שינויים תלויי-זמן בביטוי של miR-486-3p בתאי HPMECs לאחר טיפול ב-LPS. (B) ביטוי יחסי של miR-486-3p לאחר התערבות של ביטוי יתר (overexpression) והשתקה (knockdown). (C) פעילות שגשוג תאים שזוהתה באמצעות בדיקת CCK-8 לאחר שינוי בביטוי של miR-486-3p. (Dשיעור אפופטוזיס של תאים שנמדד באמצעות ציטומטריה של זרימה לאחר שינוי בביטוי של miR-486-3p. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן; פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. סימונים סטטיסטיים: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3אימות קשר המטרה בין miR-486-3p ל-DLL4. (A(דגמה סכמטית של אתר הקישור החזוי בין miR-486-3p לבין ה-3'UTR של DLL4. (Bבדיקת גן דגל דואלית של לוסיפראז (Dual luciferase reporter gene assay) אישרה את קשר המטרה בין miR-486-3p ל-DLL4.C) שינויים דינמיים בביטוי של DLL4 בתאי HPMECs לאחר טיפול ב-LPS. (ד'ביטוי DLL4 לאחר ביטוי יתר או השתקה של miR-486-3p.ה) רמות DLL4 בסרום של יילודים בריאים ושל יילודים עם ARDS. (F) רמות DLL4 בקבוצת השורדים ובקבוצת הנפטרים בקרב ילודים עם ARDS. (ג'ניתוח מתאם בין miR-486-3p בנסיוב לבין DLL4 ביילודים עם ARDS שלא שרדו. כל הנתונים הכמותיים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן; פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. סימונים סטטיסטיים: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.01 לעומת הקבוצה הבריאה, ### = p <0.01, לעומת קבוצת ה-ARDS הקלה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4השפעת miR-486-3p המכוון ל-DLL4 על תאי מודל של ARDS. (A) זיהוי ביטוי DLL4 לאחר טרנספקציה משותפת של miR-486-3p mimic ושל פלסמיד לביטוי יתר של DLL4. (B) שינויים בפעילות השגשוג התאי לאחר הצלה של DLL4. (C) שינויים בשיעור האפופטוזיס של תאים לאחר הצלה של DLL4. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן; פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. סימונים סטטיסטיים: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| משתנה | בריאים (n=10) | תסמונת הגעה רסנית של היילוד (n=12) | pערך-p |
| גיל הריון (שבועות) | 36.07 ± 2.71 | 35.72 ± 2.64 | 0.347 |
| מין (זכר, %) | 59 (59.0 %) | 74 (66.1 %) | 0.29 |
| משקל לידה (ק"ג) | 3.39 ± 0.57 | 3.33 ± 0.55 | 0.437 |
| גיל האם (שנים) | 29.18 ± 4.00 | 29.66 ± 4.05 | 0.387 |
| שיטת מסירה | 0.439 | ||
| נרתיקי | 54 (54.0 %) | 65 (58.0 %) | |
| ניתוח קיסרי | 46 (46.0 %) | 47 (42.0 %) | |
| דרגות ARDS | --- | ||
| I-II | --- | 72 (64.3 %) | |
| III-IV | --- | 40 (35.7 %) |
טבלה 1: מאפייני בסיס של התינוקות שנכללו במחקר. טבלה זו מסכמת את המידע הדמוגרפי הבסי של ילודים בריאים וילודים עם ARDS. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן עבור משתנים רציפים, וכמספר (אחוזים) עבור משתנים קטגוריאליים. ערכי P מצביעים על הבדלים סטטיסטיים בין הקבוצות. קיצורים: ARDS = acute respiratory distress syndrome.
| משתנה | הישרדות (n=84) | מוות (n=28) | ערך p |
| גיל הריוני (שבועות) | 35.95 ± 2.58 | 35.04 ± 2.76 | 0.12 |
| מין (זכר, %) | 53 (63.1 %) | 21 (75.0%) | 0.253 |
| משקל לידה (kg) | 3.37 ± 0.58 | 3.23 ± 0.42 | 0.248 |
| גיל האם (שנים) | 29.49 ± 3.82 | 30.18 ± 4.74 | 0.438 |
| שיטת הלידה | 0.44 | ||
| לידה נתובית | 47 (56.0 %) | 18 (64.3 %) | |
| ניתוח קיסרי | 37 (4.0 %) | 10 (35.7 %) | |
| מי שפיר לא תקין | 6 (9.5 %) | 4 (14.3 %) | 0.485 |
| דרגות ARDS | 0.01** | ||
| I-II | 61 (72.6 %) | 11 (39.3 %) | |
| III-IV | 23 (27.4 %) | 17 (60.7%) | |
| אטיולוגיה | 0.827 | ||
| חנק | 33 (39.3 %) | 12 (42.9 %) | |
| דלקת ריאות | 17 (20.2 %) | 6 (21.4 %) | |
| אלח דם (Sepsis) | 12 (14.3 %) | 2 (7.1 %) | |
| תסמונת שאיפת מיליום | 2 (26.2 %) | 8 (28.6 %) |
טבלה 2: השוואה של נתונים קליניים בין קבוצת השורדים לקבוצת הנפטרים בקרב ילודים עם ARDS. טבלה זו משווה בין מדדים קליניים של ילודים עם ARDS ששרדו לעומת כאלו שלא שרדו. נתונים רציפים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן, ונתונים קטגוריאליים מוצגים כמספר (אחוז). pערכי-p מעידים על מובהקות סטטיסטית בין שתי הקבוצות. ** = p<0.01. קיצורים: ARDS = תסמונת הגעה מפתיעה של מצוקה נשימתית חריפה.
קובץ נלווה 1: מערכי נתונים קליניים וניסיוניים גולמיים התומכים בממצאי מחקר זה, הכוללים מדידות ברמת הפרט עבור מדד אולטרסאונד של הריאות (LUS), ביטוי של miR-486-3p בסרום, ביטוי של DLL4 ותוצאות של בדיקות מבוסות תאים.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
ARDS ניאונטלי הוא גורם מוביל לכשל נשימתי ולתמותה מוקדמת בקרב ילודים במצב קריטי15. הערכה מוקדמת ומדויקת של חומרת המחלה והפרוגנוזה היא תנאי מוקדם להתערבות מותאמת אישית ולהפחתת התמותה. גוף הוכחות הולך וגדל מאשר כי microRNAs משתפים בהתקדמות הפתולוגית של ARDS ומשים כסממנים ביולוגיים מבטיחים במחזור הדם16. מחקרים מצביעים על כך ש-miR-15 מוגבר באופן משמעותי בחולים עם ספסיס הסובלים מפגיעה ריאתית חריפה/ARDS17. בנוסף, מחקרים חשפו עלייה ברמות של miR-629-5p בסרום בקרב ילדים המאובחנים עם ARDS18. miR-34a בסרום קשור קשר הדוק לחומרת המחלה ולפרוגנוזה של RDS ניאונטלי19. מחקרים חדשים מראים כי miR-375 משמש כסמן ביולוגי לאבחון ולפרוגנוזה של ARDS ניאונטלי20. בדומה למולקולות אלו, ניתן לזהות miR-486-3p בסרום באופן יציב בדם פריפריאלי באמצעות quantitative PCR, והוא מתאים לסריקה מהירה ביחידות לטיפול נמרץ בילודים (NICUs). בהשוואה ל-miR-375 ו-miR-34a, המשקפים בעיקר את תחילת המחלה המוקדמת, הביטוי של miR-486-3p נמצא במתאם הדוק יותר עם חומרת הנגעים הריאתיים ומשתנה באופן דינמי לצד התקדמות הפגיעה הריאתית. כאשר הוא משולב עם LUS, הוא משיג דיוק פרוגנוסטי גבוה יותר עבור תמותה בטווח הקצר. עם זאת, miR-486-3p מפגין ספציפיות נמוכה יחסית למחלה, והראיות ממחקרים קליניים רלוונטיים נותרות מוגבלות בהשוואה לאלו של סמני miRNA מבוססים. לסיכום, ל-miR-486-3p יש פוטנציאל לשמש כסמן לאבחון עזר או לחיזוי פרוגנוסטי של ARDS ניאונטלי.
LUS הוא מדד דימות במיטת החולה בשל ומקובל המעריך אוור ריאתי בהתבס על מאפיינים אולטרסוניים של רקמת הריאה21. באופן בולט, LUS משמש כמד כמותי יעיל להערכת היקף האוור האלבאולרי2. מחקרים איששו את תועלתו בהערכת החומרה והפרוגנוזה של ARDS בילודים23. בהתאם למחקרים קודמים, המחקר הקליני שלנו גילה כי מדידות LUS בילודים עם ARDS היו גבוהות באופן משמעותי בהשוואה לאלו של ילודים בריאים. יתרה מכך, בקרב היילודים שנפגעו, תת-הקבוצה עם המחלה החמורה הראתה ערכי LUS גבוהים באופן ניכר מאשר תת-הקבוצה עם המחלה הקלה, דבר המדגיש קשר ישיר בין קריאות LUS גבוהות לבין חומרת האטלקטזיס, בצקת הריאות וקונסולידציה של הריאה24. ממצאינו הצביעו עוד על כך שחולים שבסופו של דבר נפטרו הראו LUS גבוה באופן ניכר בהשוואה לשורדים. במקרים של יילודים שלא שרדו, נצפתה קורלציה חיובית חזקה בין LUS לבין serum miR-486-3p, מה שתומך בערך הסינרגטי של שני המדדים. לכל שיטה יש מאפיינים מהותיים: LUS אינו כרוך בקרינה, הוא נייד ומתאים לניטור בזמן אמת במיטת החולה, אך פרשנותו נשענת רבות על ניסיונו של המפעיל וכפופה להטיה סובייקטיבית. זיהוי serum miR-486-3p מספק תוצאות כמותיות אובייקטיביות וחזרתיות, אך אינו יכול לשקף שינויים מורפולוגיים בזמן אמת ברקמת הריאה. בפרקטיקה הקלינית, גישה משולבת זו מומלצת לשימוש שגרתי ביחידות לטיפול נמרץ בילודים. היא מתאימה לסיווג סיכונים מוקדם של יילודים עם חשד או אישור ל-ARDS, להערכה דינמית שוטפת של התקדמות המחלה, ולשיפוט עזר של פרוגנוזה קלינית לטווח קצר. עם זאת, שיטה זו אינה נועדה להחליף דימות דפיניטיבי או בדיקות אטיולוגיות; היא מראה ספציפיות מוגבלת כאשר היא מיושמת על יילודים הסובלים ממחלות ריאה דלקתיות אחרות. בנוסף, כיוון שהמחקר שלנו נערך במרכז יחיד, נותר לאמת את ישימותו לאוכלוסיות מאזורים שונים.
מבחינה קלינית, הבחנו כי ערכי LUS מוגברים, בשילוב עם רמות גבוהות של miR-486-3p בסרום, היו קשורים לפרוגנוזה רעה ב-ARDS ניאונטלי, מה שמרמז כי miR-486-3p עשוי להיות קשור באופן הדוק לפגיעה חמורה בכלי הדם של הריאה ולירידה ביכולת התיקון הווסקולרית בריאה הבלתי בשלה. ניסויי התאים שלנו in vitro השלימו תצפית קלינית זו בכך שהדגימו כי miR-486-3p מווסת באופן ישיר את השגשוג ואפופטוזיס של תאי אנדותל, שהם תהליכי ליבה השולטים בשלמות הווסקולרית ובתיקון בריאת היילוד. יתרה מכך, מחקרים הדגימו כי ל-miRNAs תפקידים מכריעים בתהליכים תאיים שונים25,26. ידוע כי miRNAs מפעילים את השפעותיהם בעיקר באמצעות בקרה פוסט-טרנסקריפציונלית של גנים מטרים, הכוללת בעיקר שחלוף miRNA ודיכוי של תרגום חלבונים27. הגן DLL4 ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות כלי דם ובאנגיוגנזה28. מחקרים הצביעו על כך שמשפחת microRNA-30 מטרגטת את DLL4 כדי לווסת את התנהגות תאי האנדותל במהלך אנגיוגנזה29. ממצאים אלו מרמזים כי ויסות של DLL4 באנדותל עשוי להיות קשור לפגיעה וסקולרית ריאתית ב-ARDS ניאונטלי. במחקר שלנו, זיהינו ותיקפנו את קשר המטרה בין miR-486-3p ל-DLL4. ניתוחים עוקבים גילו כי ביטוי מוגבר של miR-486-3p עיכב באופן משמעותי את השגשוג של HPMECs שהושרה על ידי LPS, תוך קידום אפופטוזיס. באופן חשוב, ביטוי של DLL4 יכול היה להפוך חלקית את ההשפעות המתווכות על ידי miR-486-3p. דבר זה מרמז כי miR-486-3p מטרגט את DLL4 כדי להשפיע על תפקוד HPMECs ולווסת את התקדמות ה-ARDS הניאונטלי. עם זאת, השאלה האם הוא משפיע באופן ישיר על דיספונקציה וסקולרית ריאתית ותורם ל-ARDS נותרה למענה בבדיקות נוספות. ראוי לציין כי DLL4 הפך רק חלקית את השינויים התאיים שהושרו על ידי miR-486-3p. כ-miRNA טיפוסי, miR-486-3p מווסת מספר גני מטרה במורד הזרם. מחקרים עתידיים יתמקדו בזיהוי גני מטרה נוספים כדי להבהיר את המנגנון המלא של miR-486-3p ב-ARDS ניאונטלי.
לבסוף, ראוי לציין כי סטנדרטיזציה קפדנית שלבי פרוטוקול מרכזיים מבטיחה נתונים אמינים וניתנים לשחזור. איחדנו את נהלי איסוף הדגימות, אימצנו פרוטוקולים סטנדרטיים לתרבית תאים ולטרנספקציה, והכללנו חזרות בלתי תלויות כדי למזער שגיאות ניסוייות. בעיות תפעוליות נפוצות והפתרונות להן מסוכמים כדלקמן: להערכת LUS, יש להגדיר פרוטוקול סריקה סטנדרטי של 12 אזורים וכללי ניקוד מאוחדים, ולהתאים את תנוחת היילוד כדי לקבל תמונות ברורות. לזיהוי miRNA בסרום, יש להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים, לאמת את טוהר ה-RNA (A260/A280 = 1.8–2.1), ולהכלול חזרות טכניות. עבור מודלים של תאים המושרים על ידי LPS, יש להשתמש ב-LPS בריכוז 1 mg/L שהוכן טרי ובתנאי תרבית יציבים. יש למטב את צפיפות התאים (confluence) ואת יחס הרכיבים במהלך הטרנספקציה, ולהחליף את המצע כדי להפחית ציטוטוקסיות. יש להבטיח ליזיס תאים מלא ותפעול סטנדרטי עבור בדיקות dual-luciferase.
בסיכומו של דבר, בהשוואה לשיטות קונבנציונליות הכוללות דימות של בית החזה, אנליזת גזי דם ובדיקה של סמן ביולוגי בודד, האסטרטגיה המשולבת של LUS/miR-486-3p היא נטולת קרינה, בעלות נמוכה וקלה לביצוע, עם ביצועי ניבוי משופרים. היא משמשת ככלי פרוגנוסטי משלים ואמין עבור neonatal ARDS. מבחינה קלינית, ניתן ליישם שיטה זו לצורך סיווג סיכונים מוקדם וניטור דינמי של המצב ביחידות לטיפול נמרץ יילודים. היא יכולה לשמש גם כמדד הערכה אחיד עבור מחקרים רב-מרכזיים. מבחינה מכניסטית, ציר ה-miR-486-3p/DLL4 שעבר תיקוף מספק כיוונים חדשים לחקר מנגנונים פתולוגיים ולטיפול ממוקד. עם זאת, לגישה משולבת זו יש גם מגבלות טכניות מובנות. תוצאות LUS משתנות בין מפעילים שונים, ו-miR-486-3p חסר ספציפיות למחלות ריאה דלקתיות. שיטה זו תומכת רק בגילוי בנקודת זמן בודדת ואינה יכולה להחליף דימות מכריע או בדיקות אתיולוגיות.
למרות הממצאים המבטיחים, מספר מגבלות ראויות להתייחסות. ראשית, תכנון המחקר במוסד בודד מגביל את היכולת להכליל את מסקנותינו. שנית, לא הייתה ברשותנו קבוצת תיקוף חיצונית כדי לאמת את העמידות של ביצועי הניבוי של פאנל ה-LUS/miR-486-3p. שלישית, רמות miR-486-3p בסרום נמדדו בנקודת זמן אחת בלבד, ובכך לא נלכד הקשר הדינמי שלהן עם התקדמות המחלה. רביעית, היעדר ניתוחי חלבון משלימים ותיקוף in vitro/in vivo מגבילים את העמידות של הסקת המסקנות המכניסטית שלנו. לבסוף, התפקיד הספציפי של miR-486-3p בפתופיזיולוגיה של ARDS בילודים טרם הובהר במלואו ומצריך חקירה נוספת. לסיכום, העלייה ב-LUS והרמות המוגברות של miR-486-3p בסרום בילודים שאובחנו עם ARDS משמשות כנקודות ייחוס משמעותיות בפרקטיקה הקלינית. הערכה סינרגית של שני סמנים ביולוגיים אלו עשויה לסייע בניבוי מדויק הן של החומרה והן של הפרוגנוזה של ARDS בילודים, ובכך להוכיח ערך יישומי קליני מסוים.
גילויים
נעשה שימוש ב-Grammarly לצורך אופטימיזציה של הביטוי באנגלית, בדיקת דקדוק ותקינה של הפורמט. כל רעיונות המחקר, הניסויים, הנתונים והמסקנות הם עבודתם המקורית של המחברים.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מבחנות PCR בנפח 0.2 מ"ל | Axygen | PCR-02-C | |
| תמיסת Trypsin-EDTA בריכוז 0.25% | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | |
| מבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל | Axygen | MCT-150-C | |
| אינקובטור לתרביות תאים עם לחות ו-5% CO2 | Thermo Fisher | 3111 | |
| פלטות תרבית תאים בעלות 6 בארות | Corning | 3516 | |
| פלטות תרבית תאים בעלות 96 בארות | Corning | 3599 | |
| אתנול מוחלט | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| ערכה לזיהוי אפופטוזיס באמצעות Annexin V-FITC | BD Biosciences | 556547 | |
| צנטריפוגה שולחנית | Eppendorf | 5810R | |
| מכבסת בטיחות ביולוגית | Thermo Fisher | סדרה 130 A2 | |
| ערכה לספירת תאים CCK-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| מבחנות סטריליות חד-פעמיות לאיסוף דם | BD Vacutainer | 367815 | |
| פלסמיד לביטוי יתר של DLL4 (OE-DLL4) | GenePharma | EX-M02151 | |
| פלסמיד רפורטר ללוסיפראז DLL4-MUT | GenePharma | PGL3-DLL4-MUT | |
| פלסמיד דוחה לוציפרז DLL4-WT | GenePharma | PGL3-DLL4-WT | |
| מצע DMEM עם ריכוז גלוקוז גבוה | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | |
| ערכה לבדיקת דואל-לוציפראז (Dual-Luciferase Reporter Assay Kit) | מעבדת ביולוגיה | BL101A | |
| קורא ELISA (סמיכה חיסונית קשורה לאנזים) | Thermo Fisher | Multiskan FC | |
| סרום עגל עוברי (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 1099141C | |
| טיפים למסננת עבור פיפטה (10 μL, 200 μL, 1000 μL) | Axygen | TF-10-R-S, TF-20-R-S, TF-100-R-S | |
| ציטומטר זרימה | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| מבחנות לציטומטריית זרימה | BD Biosciences | 352054 | |
| צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוהה | Eppendorf | 5424R | |
| ליפופוליסכריד (LPS) מ-E. coli O1:B4 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| מערכת לאולטרסאונד של הריאות | Mindray | M9 | |
| ספקטרופוטומטר לנפחים זעירים | Thermo Fisher | NanoDrop 20 | |
| מעכב miR-486-3p | RiboBio | HmiR00486-AS | |
| מימיק של miR-486-3p | RiboBio | HmiR00486 | |
| סט פריימרים ל-qPCR עבור miR-486-3p | RiboBio | HmiRQP0486 | |
| מעכב בקרה שלילית (NC) | RiboBio | HmiR01-AS | |
| חיקוי של ביקורת שלילית (NC) | RiboBio | HmiR01 | |
| פלסמיד ביטוי יתר כביקורת שלילית (OE-NC) | GenePharma | ביקורת שלילית | |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומייצין (10×) | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | |
| מלח תמיסת פוספט (PBS) 1× | Gibco (Thermo Fisher) | 10010023 | |
| סט פיפטות (10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL) | Eppendorf | מחקר פלוס | |
| תמיסת צביעה של פרופידיום יודאיד (PI) | BD Biosciences | 556463 | |
| מערכת PCR כמותית בזמן אמת | Applied Biosystems (Thermo Fisher) | 750 Fast | |
| מים נקיים מ-RNase | Invitrogen (Thermo Fisher) | 10977015 | |
| תערובת מאסטרה מהירה ל-RT-PCR | Toyobo | FSQ-101 | |
| פיפטות סטריליות חד-פעמיות | Corning | 4487, 4488, 4489 | |
| תערובת מאסטר ל-PCR בזמן אמת עם SYBR Green | Toyobo | QPK-201 | |
| ריאגנט Trizol | Invitrogen (Thermo Fisher) | 15596026 | |
| ערכת פריימרים ל-qPCR עבור U6 snRNA | RiboBio | HmiRQP001 | |
| מערבל וורטקס | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
מקורות
- Chi M, Mei YB, Feng ZC. A review on neonatal acute respiratory distress syndrome. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2018;20(9):724-728.
- Garcia MJ, Amarelle L, Malacrida L, Briva A. Novel opportunities from bioimaging to understand the trafficking and maturation of intracellular pulmonary surfactant and its role in lung diseases. Front Immunol. 2023;14:1250350.
- Wu H, et al. The value of oxygen index and base excess in predicting the outcome of neonatal acute respiratory distress syndrome. J Pediatr (Rio J). 2021;97(4):409-413.
- Coppola S, et al. Respiratory mechanics, lung recruitability, and gas exchange in pulmonary and extrapulmonary acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 2019;47(6):792-799.
- Bello G, Blanco P. Lung ultrasonography for assessing lung aeration in acute respiratory distress syndrome: a narrative review. J Ultrasound Med. 2019;38(1):27-37.
- Wu HL, et al. Lung ultrasound score for monitoring the withdrawal of extracorporeal membrane oxygenation on neonatal acute respiratory distress syndrome. Heart Lung. 2024;63:9-12.
- King A, Blank D, Bhatia R, Marzbanrad F, Malhotra A. Tools to assess lung aeration in neonates with respiratory distress syndrome. Acta Paediatr. 2020;109(4):667-678.
- Zhu Z, et al. Whole blood microRNA markers are associated with acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Med Exp. 2017;5(1):38.
- Long G, Zhang Q, Yang X, Sun H, Ji C. Diagnostic and predictive significance of serum miR-141-3p in acute respiratory distress syndrome patients with pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 2024;262(3):157-162.
- Liang Y, et al. MiR-124-3p helps to protect against acute respiratory distress syndrome by targeting p65. Biosci Rep. 2020;40(5).
- Najafipour R, et al. Screening for differentially expressed microRNAs in BALF and blood samples of infected COVID-19 ARDS patients by small RNA deep sequencing. J Clin Lab Anal. 2022;36(11):e24672.
- Zhang S, et al. Clinical significance and potential mechanism of hsa_circ_0006892 in acute respiratory distress syndrome complicated with pulmonary fibrosis. Mol Biol Rep. 2024;51(1):1120.
- Yao MY, et al. Long non-coding RNA MALAT1 exacerbates acute respiratory distress syndrome by upregulating ICAM-1 expression via microRNA-150-5p downregulation. Aging (Albany NY). 2020;12(8):6570-6585.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-338-3p is a biomarker in neonatal acute respiratory distress syndrome and has roles in the inflammatory response of ARDS cell models. Acta Med Okayama. 2022;76(6):635-643.
- Shi S, et al. Evaluation of the neonatal sequential organ failure assessment and mortality risk in neonates with respiratory distress syndrome: a retrospective cohort study. Front Pediatr. 2022;10:911444.
- Martucci G, et al. Identification of a circulating miRNA signature to stratify acute respiratory distress syndrome patients. J Pers Med. 2020;11(1).
- Wang ZF, Yang YM, Fan H. Diagnostic value of miR-155 for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome in patients with sepsis. J Int Med Res. 2020;48(7):300060520943070.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-629-5p may serve as a biomarker for pediatric acute respiratory distress syndrome and can regulate the inflammatory response. Pediatr Neonatol. 2024. doi:10.1016/j.pedneo.2024.05.003.
- Li Q, Chen Y, Lin L. Value of serum miR-34a and Ang-1 in severity evaluation and prognosis of neonatal respiratory distress syndrome. Emerg Med Int. 2022;2022:5480026.
- Deng Y, Zhang R, Jiang X. Association of umbilical cord blood miR-375 with neonatal respiratory distress syndrome and adverse neonatal outcomes in premature infants. Acta Biochim Pol. 2022;69(3):605-611.
- Ostras O, Shponka I, Pinton G. Ultrasound imaging of lung disease and its relationship to histopathology: an experimentally validated simulation approach. J Acoust Soc Am. 2023;154(4):2410-2425.
- Soliman RM, et al. Prediction of extubation readiness using lung ultrasound in preterm infants. Pediatr Pulmonol. 2021;56(7):2073-2080.
- Huang L, Ye D, Wang J. Analysis of diagnosing neonatal respiratory distress syndrome with lung ultrasound score. Pak J Med Sci. 2022;38(5):1101-1106.
- Chardoli M, et al. Lung ultrasound in predicting COVID-19 clinical outcomes: a prospective observational study. J Am Coll Emerg Physicians Open. 2021;2(6):e12575.
- Jafari N, Abediankenari S. Role of microRNAs in immunoregulatory functions of epithelial cells. BMC Immunol. 2024;25(1):84.
- Sun LL, Li WD, Lei FR, Li XQ. The regulatory role of microRNAs in angiogenesis-related diseases. J Cell Mol Med. 2018;22(10):4568-4587.
- Hynes C, Kakumani PK. Regulatory role of RNA-binding proteins in microRNA biogenesis. Front Mol Biosci. 2024;11:1374843.
- Chowdhury TA, Li K, Ramchandran R. Lessons learned from a lncRNA odyssey for two genes with vascular functions, DLL4 and TIE1. Vascul Pharmacol. 2019;114:103-109.
- Bridge G, et al. The microRNA-30 family targets DLL4 to modulate endothelial cell behavior during angiogenesis. Blood. 2012;120(25):5063-5072.