תהליך עבודה חישובי לתיעדוף גנים של המארח הקשורים למטבוליטים מיקרוביאליים בתסמונת המעי הרגיז עם דומיננטיות של עצירות

סיכום

פרוטוקול זה משלב חיזוי יעדים של מטבוליטים מיקרוביאליים, טרנסקריפטומיקה של הרירית הרקטלית, אינטראקציה בין חלבונים להעשרה של מסלולים, עגינה מולקולרית (molecular docking), סימולציית דינמיקה מולקולרית והערכת אנרגיה חופשית של קישור באמצעות מכניקה מולקולרית/שטח פנים של פואסון-בולצמן (MM-PBSA), במטרה ליצור רשימה קצרה ומדורגת של גנים של המארח הקשורים למטבוליטים לצורך יצירת היפותזות, וקומפלקסים של חלבון-ליגנד בעדפות מבנית להמשך מעקב ניסיוני.

תקציר

לא קיים צינור חישובי סטנדרטי לתיעדוף שיטתי של גנים של המארח הקשורים למטבוליטים מיקרוביאליים ושל קומפלקסים של חלבון-ליגנד מתוך מאגרי נתונים כימיים, גנומיים ומבניים הזמינים לציבור. מאמר זה מתאר זרימת עבודה בת שמונה שלבים, המקבלת קבוצה של מטבוליטים המופקים מחיידקי המעי שמוגדרת על ידי המשתמש, ומפיקה רשימה מדורגת ומקוצרת של גנים מועמדים של המארח הקשורים למטבוליטים, מסלולים ביולוגיים מועשרים, וקומפלקסים של חלבון-ליגנד מתועדפים מבנית להמשך מעקב ניסיוני. צינור העבודה משלב (i) פרופיל מטבוליטים כימואינפורמטי; (ii) חיזוי מטרות מועמדות מתוך מספר מאגרי נתונים באמצעות כלי לחיזוי מטרות המבוסס על ליגנדים ואינטראקציה בין חלבון לכימיקלים ותוכנה לעגינה מולקולרית (molecular docking); (iii) ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי של נתונים טרנסקריפטומיים הזמינים לציבור; (iv) חפיפת מטרות עם גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי; (v) בניית רשת אינטראקציות חלבון-חלבון והעשרת מסלולים; (vi) עגינה מולקולרית באמצעות תוכנה לעגינה מולקולרית; (vii) סימולציית דינמיקה מולקולרית של 200 ns באמצעות מנוע דינמיקה מולקולרית עם שדה כוחות חלבון המשמש לסימולציות דינמיקה מולקולרית; ו-(viii) הערכת אנרגיה חופשית של קישור בשיטת MM-PBSA. כדוגמה מעשית, תשעה מטבוליטים המופקים מחיידקי המעי או שונו על ידיהם, המייצגים חומצות שומן קצרות שרשרת, חומצות מרה, מטבוליטים המופקים מטריפטופן ו-urolithin A, עובדו באמצעות מאגר הנתונים הטרנסקריפטומי הציבורי GSE36701 של רירית רקטום במצבי IBS-C. זרימת העבודה דירגה 17 גנים ייחודיים שנחזו כקשורים למטבוליטים אשר הראו ביטוי דיפרנציאלי במערך נתונים זה. ניתוחי עגינה, סימולציית דינמיקה מולקולרית ו-MM-PBSA תיעדו מבנית חמישה קומפלקסים של מטבוליט-חלבון: lithocholic acid-VDR, lithocholic acid-NR1H4/FXR, ursodeoxycholic acid-NR1H4/FXR, tryptamine-HTR2A (שסומולץ בשכבה כפולה של ליפידים מסוג 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) מפורשת), ו-urolithin A-CASP3. הפרוטוקול תוכנן להיות ניתן להתאמה לקבוצות מטבוליטים אחרות, למאגרי נתונים טרנסקריפטומיים של מחלות ולסוגי מטרות שונים; כל הפלטים הם תחזיות חישוביות המייצרות היפותזה, הדורשות שכפול טרנסקריפטומי עצמאי, תיקוף ברמת החלבון ובדיקות תגובה פונקציונלית לליגנד לפני שניתן להסיק מסקנות סיבתיות או טיפוליות.

מבוא

תסמונת המעי הרגיז עם עצירות (IBS-C) היא הפרעה תפקודית נפוצה של מערכת העיכול, המתאפיינת בכאבים בטניים חוזרים, שינוי בהרגלי היציאות, נפיחות ועצירות, כאשר השכיחות העולמית מוערכת בכ-10–15% מהאוכלוסייה הכללית^1,2. טיפולים פרמקולוגיים נוכחיים, הכוללים חומרים מעוררי הפרשה (secretagogues), פרוקינטיקה ותרופות נוגדות עוויתות, עשויים לשפר תסמינים בודדים בחלק מהמטופלים; עם זאת, התגובה לטיפול נשארת הטרוגנית והשגה של רמיסיה בר-קיימא היא נדירה, דבר המשקף את הפתופיזיולוגיה המורכבת והרב-גורמית של המצב^1,3,4. לפיכך, נדרשה הבנה מכניסטית מלאה יותר של האופן שבו אותות מיקרוביאליים במעי מועברים ברמת הרירית, כדי להגדיר היפותזות הניתנות לבדיקה עבור יעדים טיפוליים חדשניים.

מיקרוביוטת המעי תורמת להומיאוסטזיס של מערכת העיכול התחתונה באמצעות ייצור וביוטרנספורמציה של מטבוליטים מגוונים מבחינה כימית, כולל חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs), חומצות מרה משניות, תרכובות נגזרות מטריפטופן ומטבוליטים נגזרים מפוליפנולים כגון אורוליתינים^5,6,7,8. מולקולות אלו מתקשרות עם תאי המאכסן דרך רפרטואר רחב שטרם אופיין במלואו של מטרות מולקולריות, אשר חורג הרבה מעבר לקולטני קרום קנוניים להסנס של מטבוליטים וכולל קולטנים גרעיניים, אנזימים ציטוזוליים, חלבונים המשנים היסטונים, מקדימים להורמונים פפטידיים וחלבונים של העברה תוך-תאית⁹. הרכבי קהילה מיקרוביאלית של המעי ופרופילי מטבוליטים משתנים תועדו בחולים עם תסמונת המעי הרגיז (IBS), מה שמספק רציונל ביולוגי לבדיקה האם גנים של המאכסן הקשורים לתגובה למטבוליטים מיקרוביאליים הם בעלי הפרעה תעתוקית ברירית הרקטום ב-IBS-C¹⁰.

פאנל תשעת המטבוליטים הוגדר מראש כדי לספק קבוצה תמציתית, מגוונת כימית וניתנת לפירוש ביולוגי של מולקולות קטנות המופקות על ידי מיקרוביומת המעי או משתנות על ידו. הבחירה התבססה על חמישה קריטריונים: ייצוג של מחלקות מטבוליטים מיקרוביאליות עיקריות המעורבות באותוות בין המארח למיקרוביומה; חשיפה ידועה או סבירה של הרירית במעי הרחוק; זמינות של מזהי PubChem חד-משמעיים ומבנים קנוניים; גודל מולקולרי ויכולת טיפול מבנית לניבוי מטרות מבוסס-ליגנד וסימולציית docking; וסבירות מוקדמת לאותוות הקשורה לתאי אפיתל, למערכת הנוירו-אימונית, לתאים אנטרואנדוקריניים, לקולטנים גרעיניים או לתנועתיות ב-IBS-C. הפאנל שנבחר כלל butyrate ו-propionate כ-SCFAs; chenodeoxycholic acid, lithocholic acid ו-ursodeoxycholic acid כחומצות מרה; tryptamine, indole-3-propionic acid ו-indole-3-lactic acid כמטבוליטים נגזרות טריפטופן; ו-urolithin A כמטבוליט פוליפנולי המופק על ידי מיקרוביומת המעי^5,6,7,8,9,10.

מרבית המחקריםBחישוביים והניסויים הקודמים בחנו זוגות בודדים של מטבוליט–רצפטור או מטבוליט–אנזים בבידוד, גישה שאינה לוכדת את הטבע המבוזר והמתכנס של סיגנלינג מטבוליטים מיקרוביאליים על פני מסלולי המארח^9,11. שילוב של מספר שלבים אנליטיים מעניק כוח סינון הדדי ומחזק ששום שלב בודד אינו יכול לספק באופן עצמאי. חיזוי חישובי של מטרות מול מאגרי מידע מאושרים מניב קבוצה רחבה של חלבוני מארח מועמדים עבור כל מטבוליט. חיתוך עם נתונים טרנסקריפטומיים רלוונטיים למחלה מסנן באופן משמעותי קבוצה זו, תוך השארת מועמדים שרק התמלילים שלהם השתנו בהקשר של המחלה. ניתוחים של העשרת מסלולים ורשתות אינטראקציה בין חלבונים ממפים לאחר מכן את רשימת המועמדים המצומצמת למודולים ביולוגיים ידועים. עגינה מולקולרית (Molecular docking) מספקת הערכה חישובית ראשונית של השלימתיות של כיס הקשירה עבור כל קומפלקס מועמד, וסימולציית דינמיקה מולקולרית (MD) נוספת של 200 ns עם פירוק אנרגיה חופשית של קשירה בשיטת MM-PBSA מספקת ממד תרמודינמי ותלוי-זמן לתעדוף מבני שאינו זמין מצייוני עגינה בלבד. ביצוע כל שלב באופן עצמאי, ללא שילוב שיטתי וסינון רצופי, יביא לרשימות מועמדים רחבות מדי מכדי שניתן יהיה לבחון אותן ניסויית, ויכשיל את הזיהוי של ארכיטקטורת מסלולים מתכנסת.

במסגרת פרוטוקול זה, במונח "גן הקשור למטבוליט" (MAG), הכוונה היא לגן אנושי, שמוצר החלבון שלו הוגדר כמטרה מולקולרית משוערת של אחד או יותר ממטבוליטים שמקורם במיקרוביוטת המעי על ידי לפחות מאגר נתונים אחד של חיזויי חישוב מאושרים, וששכפול התעתקו (transcript) שלו מבוטא באופן דיפרנציאלי במערך הנתונים הטרנסקריפטומי הרלוונטי למחלה ששימש להדגמת זרימת העבודה. הגדרה אופרטיבית זו כוללת במכוון קולטנים של ממברנה בתוספת קולטנים גרעיניים, אנזימים ציטוזוליים, חלבוני איתות, מקדימי הורמונים פפטידיים וחלבוני תאי-פנים אחרים. הגדרה כ-MAG אינה מהווה ראיה ניסיונית לכך שמטבוליט נקשר, יוצר קומפלקס חלבון-ליגנד, מפעיל קולטן, משנה את שכיחות החלבון או גורם למחלה, אלא היא הגדרה שהופקה בחישוב לצורך יצירת השערות, אשר דורשת תיקוף ניסיוני.

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה החישובית המלאה בת שמונת השלבים (איור 1) עם פירוט תפעולי מספיק כדי לאפשר שכפול עצמאי, התאמה לפאנלים אחרים של מטבוליטים או למערכי נתונים של מחלות, והרחבה להקשרים אחרים של אינטראקציות בין מאחס למיקרוביוטה. זרימת העבודה מוגדרת במפורש כמסגרת להצגת היפותזות ותיעדוף מבני, הפועלת אך ורק על משאבי אומניקה ומשאבים מבניים הזמינים לציבור, ואינה מסיקה ריכוזי מטבוליטים משתנים, מצבי הפעלה של רצפטורים, שינויים בביטוי חלבונים, פעילות סיגנלינג במורד הזרם או משמעות קלינית מתוצאות חישוביות בלבד. כאן, אנו מדגימים את הפרוטוקול כדוגמה מעשית באמצעות תשעה מטבוליטים המופקים ממיקרוביוטת המעי או משתנים על ידיה, ומתוך מערך הנתתים הטרנסקריפטומיים הציבוריים GSE36701 של רירית הרקטום ב-IBS-C, במטרה לזהות MAGs ולתעדף קומפלקסים של מטבוליט–חלבון לצורך מעקב ניסויי בהמשך.

פרוטוקול

הניתוח השתמש אך ורק בנתוני טרנסקריפטומיקה מזוהים באופן אנונימי שהיו זמינים לציבור מ-GSE36701, ובמאגרי מידע כימיים, חלבוניים ומבניים שהיו זמינים לציבור. הגישה למאגרי המידע התבצעה בין ינואר למאי 2026. כל תאריך גישה מאוחר יותר תועד ב- טבלת חומרים נפרדת.

1. דרישות תכנון המחקר, חומרה ותוכנה

1. הגדירו את זרימת העבודה לפני תחילת הניתוח. השתמשו בשמונה שלבים: בחירת מטבוליטים, חיזוי מטרות, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, חפיפה בין מטרות לגנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEG), העשרה של מסלולים/אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI), עגינה מולקולרית (molecular docking), סימולציית MD, והערכת MM-PBSA.
2. רשמו כי עגינה, MD ו-MM-PBSA הם כלי תיעדוף מבניים בלבד. אין לפרש פלטים אלו כראיה ניסויית לקשירה, להפעלת רצפטור, לשינוי בשפע של חלבון, ליעילות טיפולית או לסיבתיות של מחלה.
3. אשרו את חומרת המחשוב לפני הרצת סימולציות MD. השתמשו במערכת הפעלה Linux של 64-ביט, מעבד עם 6 ליבות ומעלה, פלטפורמת האצה באמצעות GPU עם ≥8 GB VRAM, או פלטפורמת האצה מקבילה עם ≥8 GB VRAM, מינימום 32 GB RAM, ולפחות 200 GB שטח אחסון פנוי לכל מערכת MD.
4. רשמו את התוכנות המרכזיות: מנוע דינמיקה מולקולרית, תוכנה לעגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבוני מטרה, תוכנה להמרת פורמט של קבצים כימיים¹², תוכנה ליצירת ליגנדים תלת-ממדיים, תוכנה להכנת ליגנדים, ערכת כלים להכנת קלט לעגינה, תוכנה לעגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבוני מטרה, סביבת תכנות כללית, סביבת מחשוב סטטיסטי עם תשתית תוכנה לביואינפורמטיקה, וחבילה לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי.
5. רשמו את כלי הניתוח המבני: כלי מבוסס רשת לבניית מערכות ממבנה, שירות פרמטריזציה של ליגנדים תואם CHARMM, כלי לחישוב אנרגיית קשירה באמצעות מכניקה מולקולרית/ממס Solvent רציף, ספרייה להמרת פרמטרים וטופולוגיה מולקולרית, תוכנה לוויזואליזציה מולקולרית תלת-ממדית, וכלי לוויזואליזציה מולקולרית ולדיאגרמת אינטראקציות דו-ממדית 2021 (ראו טבלת חומרים עבור קישורי הורדה ומידע על גרסאות).
6. רשמו בטבלת החומרים/קובץ הסביבה את מזהי הגרסאות המדויקים של שדה הכוח החלבוני שבו נעשה שימוש לסימולציות דינמיקה מולקולרית, CGenFF, CHARMM-GUI, תשתית תוכנת R/ביואינפורמטיקה, וכלי לחישוב אנרגיית קשירה באמצעות מכניקה מולקולרית/ממס Solvent רציף. סמנו מזהים חסרים כ-"not recoverable"; אל תסיקו אותם.

2. בחירת מטבוליטים ואפיון כימואינפורמטי

1. הגדירו את פאנל המטבוליטים לפני חיזוי המטרה. כללו butyrate (PubChem CID: 264), propionate (CID: 1032), chenodeoxycholic acid (CID: 10133), lithocholic acid (CID: 9903), ursodeoxycholic acid (CID: 31401), tryptamine (CID: 1150), indole-3-propionic acid (CID: 3744), indole-3-lactic acid (CID: 92904), ו-urolithin A (CID: 5488186).
2. שלופו את ה-SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System) הקנוני ואת ה-PubChem CID עבור כל מטבוליט. ודאו שמות נרדפים ומבנים כפולים לפני חיזוי המטרה. שמרו את המזהים הסופיים בגיליון המטבוליטים הראשי.
3. הזינו את מחרוזות ה-SMILES הקנוניות לכלי הרשת לחיזוי תכונות פיזיקו-כימיות ו-ADME¹³ (ראו טבלת חומרים). רשמו את המשקל המולקולרי, שטח הפנים הפולרי הטופולוגי (TPSA), consensus logP, תורמי קשרי מימן, מקבלי קשרי מימן, קשרים סיבוביים, ספיגה גסטרו-אינטסטנלית חזויה, חיזוי P-glycoprotein, והתרעות Lipinski, Veber, Ghose, Egan, Muegge ו-PAINS.
4. שמרו מטבוליטים עם זיהוי מבנה מוצלח, משקל מולקולרי ≤500 Da, וללא התרעות PAINS. רשמו כל קריטריון שלא עמד בדרישות ואת ההחלטה לשמר או להסיר את המטבוליט.
5. קבעו את מצבי היונון לפני חיזוי המטרה ועגינה (docking). השתמשו בקבוצות קרבוקסילט דה-פרוטוניות עבור butyrate ו-propionate, בצורות חומצה קרבוקסילית ניטרליות עבור חומצות מרה, באמוניום פרוטוני עבור tryptamine, ובצורות ניטרליות עבור שאר המטבוליטים.

3. חיזוי מטרות אנושיות פוטנציאליות

1. פתחו כלי לחיזוי מטרות אינטראקציה בין כימיקלים לחלבונים¹⁴ (ראו טבלת החומרים). הזינו את שם כל מטבוליט או את ה-PubChem CID שלו, בחרו ב-Homo sapiens (מזהה טקסונומיה: 9606), והגדירו את ציון האינטראקציה המשולב המינימלי ל-≥0.700.
2. תעדפו ערוצי ראיות של ניסויים ומסדי נתונים מאושרים (curated) בכלי לחיזוי מטרות אינטראקציה בין כימיקלים לחלבונים. הורידו את טבלת השיוּך המלאה של החלבונים עבור כל מטבוליט.
3. פתחו תוכנה לעגינה מולקולרית (molecular docking)¹⁵ (ראו טבלת החומרים). הזינו כל מחרוזת SMILES קנונית כאשר נבחר Homo sapiens, ושמרו מטרות עם הסתברות של ≥0.70.
4. מזג את התוצאות של כלי חיזוי מטרות האינטראקציה בין כימיקלים לחלבונים ותוכנת העגינה המולקולרית כקבוצת איחוד עבור כל מטבוליט. שמרו כל מטרה שעומדת באחד מספי השבירה של מסדי הנתונים והסירו כניסות כפולות של סמלי גנים זהים.
5. סטנדרטו את רשומות החלבונים לסמלי גנים מאושרים על ידי ועדת השמות של הגנים האנושיים (HGNC) באמצעות מיפוי מזהי חלבונים לסמלי גנים סטנדרטיים מאושרים על ידי HGNC או באמצעות מסד הנתונים המשולב למידע על גנים אנושיים (ראו טבלת החומרים). פתרו כינויים (aliases), סמלים מיושנים והערות איזופורמים לסמל גן אחד לכל חלבון.
6. סווגו כל מטרה כקולטן ממברנה, קולטן גרעיני, אנזים, חלבון איתות תוך-תאי, הורמון פפטידי, חלבון הקשור להורמונים או חלבון תוך-תאי אחר. רשמו את הסיווג בטבלת המטרות.

4. מערך נתונים טרנסקריפטומי וניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי

1. גשו למספר GSE36701 באמצעות הכלי המקוון של NCBI לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי^16,17 (ראה טבלת חומרים). רשום כי מערך הנתונים כולל נתוני ביטוי של ביופסיות של רירית הרקטום מקבוצות של IBS-C, תסמוימת המעי הרגיז עם שלשול (IBS-D), IBS לאחר זיהום ומתנדבים בריאים.¹⁸.
2. חפשו ב-GEO וב-ArrayExpress קבוצת תיקוף (validation cohort) בלתי תלויה. השתמשו בשילובים של IBS-C, תסמוכת המעי הרגיז עם דומיננטיות של עצירות (constipation-predominant irritable bowel syndrome), רירית הרקטום (rectal mucosa), רירית המעי הגס (colonic mucosa), ביופסיה, טרנסקריפטום, מערך מיקרו (microarray) ו-RNA-seq. רשמו את המאגרים, את מונחי החיפוש, את תאריך החיפוש והאם זוהה מערך נתונים להשוואה לצורך תיקוף.
3. הפעל את הכלי המקוון לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי מרשומת GSE36701 (ראה טבלת חומריםהקצו את 18 דגימות ה-IBS-C לקבוצת ה-IBS-C, הקצו את 40 המתנדבים הבריאים לקבוצת הביקורת, והשאירו את דגימות ה-IBS-D וה-IBS לאחר זיהום ללא הקצאה.
4. בצעו ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות מסגרת חבילת הניתוח לביטוי גנים דיפרנציאלי עם תיקון שיעור גילוי שגוי (FDR) לפי שיטת Benjamini-Hochberg¹⁹הורד את טבלת התוצאות המלאה הכוללת את מזהה הגשוש (probe ID), סמל הגן (gene symbol), שם הגן (gene title), ערך logFC, ביטוי ממוצע (AveExpr), סטטיסטי t ממותנת (moderated t-statistic), ערך P גולמי וערך P מתוקנן.
5. אחד את הגששים (probes) לכניסות ברמת הגן. הסר גששים שחסרים להם סמלי גנים; עבור סמלים כפולים, שמור את הגשש בעל ה-FDR הנמוך ביותר; ובמקרה של תיקו, השתמש בערך ה-logFC המוחלט הגבוה יותר.

5. ניתוח חפיפת מטרה-דרג (target-deg) והערכה סטטיסטית

1. בצעו חיתוך (Intersect) בין כל רשימת המטרות החזויות הספציפיות למטבוליט לבין רשימת ה-DEG ברמת הגן ב-FDR < 0.05. רשמו את הגנים החופפים, המטבוליט ממנו מקורם, את ה-logFC, את ה-P-value המתוקנן ואת כיוון הביטוי.
2. מזגו את רשימות החפיפה הספציפיות למטבוליטים לרשימת MAG לא-redundant. ספרו את סך המטרות החזויות, את החפיפות הספציפיות למטבוליטים ואת סך ה-MAGs הייחודיים.
3. העריכו את העקביות הכיוונית ברמת הגש (probe-level) עבור גנים עם מספר גשים. סמנו כל גן שבו הגשים אינם תואמים בכיוון הביטוי.
4. בנו את טבלת הסמיכות לבדיקת Fisher’s exact test באמצעות סך הEntries המאוחדים ברמת הגן, סך ה-DEGs, סך המטרות החזויות הייחודיות ו-MAGs שנצפו. חשבו את ה-P-value החד-צדדי, את יחס הסיכויים (odds ratio) ואת רווח הסמך של 95% באמצעות יישום ה-Fisher’s exact test.
5. אם שיעור ה-DEG ברקע עולה על 50%, דווחו על החפיפה כתיאורית ולא כהעשרה (enrichment) המהווה תיקוף עצמאי. התייחסו להורדה אחידה בביטוי (uniform downregulation) כדפוס כיווני תיאורי, אלא אם בוצע מבחן כיווניות נפרד.

6. ניתוח רשת אינטראקציות חלבון-חלבון והעשרה של מסלולים

1. העבירו את רשימת ה-MAG הייחודית והמלאה לבניית רשת אינטראקציות בין חלבונים ולהעשרת מסלולים²⁰ (ראו טבלת חומרים). בחרו ב-Homo sapiens והגדירו את ציון האינטראקציה המינימלי ל-0.700.
2. ייצאו את הרשת המשולבת של בניית רשת אינטראקציות בין חלבונים והעשרת מסלולים ואת טבלת האינטראקציות המלאה. אם כריית טקסט (text-mining) מייצרת טופולוגיה צפופה באופן מלאכותי, בטלו את הבחירה בטקסט-מיינינג והשאירו את הערוצים הניסויים, ערוצי הביטוי המשותף (co-expression) וערוצי מסדי הנתונים.
3. ייצרו תתי-רשתות של מחלקות מטבוליטים עבור MAGs הקשורים ל-SCFA, לחומצות מרה ולטריפטאמין/סרוטונין. השתמשו באותן הגדרות של אורגניזם ורמת ביטחון כפי שהוגדרו בבניית רשת אינטראקציות בין חלבונים והעשרת מסלולים.
4. הריצו בנייה של רשת אינטראקציות בין חלבונים והעשרת מסלולים מול Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)²¹, Reactome²², ו-Gene Ontology (GO) Biological Process^23,24. החילו Benjamini–Hochberg BH FDR <0.05 וייצאו את כל טבלאות ההעשרה.

7. עגינה מולקולרית (Molecular docking)

1. שלוף מבני רצפטורים שנקבעו ניסיונית ממאגר החלבונים של Research Collaboratory for Structural Bioinformatics RCSB PDB²⁵ (ראה טבלת חומרים). השתמש ב-VDR/1DB1, NR1H4/FXR/3DCT, CASP3/2DKO, ו-HTR2A/6A93 עבור חמשת קומפלקסי החלבון-ליגנד בעדיפות גבוהה.
2. הכן כל רצפטור על ידי השארת שרשרת A והסרה של מים, ליגנדים שגובשו יחד, קו-פקטורים, יונים ורשומות HETATM שאינן חלבון. עבור 6A93, הסר את סגמנט היתוך ה-T4 lysozyme לפני הכנת הרצפטור.
3. הוסף מימנים פולריים, הקצה מטעני Gasteiger, ושמור כל רצפטור כ-PDBQT באמצעות ערכת כלי המבנה המולקולרי. בחן את מצבי הפרוטונציה של ההיסטידין באתר הקשירה לפני ההמרה ל-PDBQT ותעד את המצבים שנבחרו.
4. צור מבנה תלת-ממדי עבור כל ליגנד בערכת כלי המרת קבצי המבנה הכימי. בצע מזעור אנרגיה עם Universal Force Field (UFF) למשך 500 שלבים, הקצה מצב יינון עבור pH 7.4, הקצה מטעני Gasteiger, ושמור כ-PDBQT.
5. הגדר תיבת עגינה (docking box) בגודל 25 Å x 25 Å x 25 Å הממורכזת על המרכז (centroid) של הליגנד שגובש יחד. השתמש במרכזים (10, 19, 33) עבור VDR, (137, 31, 78) עבור FXR, (37, 34, 32) עבור CASP3, ו-(12, −1, 61) עבור HTR2A.
6. הרץ עגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבונים המטרה^26,27 עם exhaustiveness = 8, seed = 42, num_modes = 9, ו-energy_range = 3 kcal/mol. רשום את ציון ה-Vina הגבוה ביותר וערכי Root-mean-square deviation (RMSD) עבור כל הפוזות (poses).
7. בחר את mode 1 עבור כל קומפלקס בעדיפות גבוהה. צור דיאגרמות דו-ממדיות של ליגנד-שארית באמצעות כלי הדמיה מולקולרית וכלי דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, ותצוגות תלת-ממדיות של רצפטור-ליגנד בתוכנה להדמיה מולקולרית תלת-ממדית.
8. בצע בקרות של עגינה חוזרת (redocking) עבור VDR/1DB1 ו-FXR/3DCT. קבל את הגדרות העגינה של הרצפטור כאשר RMSD של האטומים הכבדים הוא <2.0 Å ביחס לפוזה הקריסטלוגרפית.
9. בצע בקרות עגינה צולבת (cross-docking) על ידי עגינה של Lithocholic acid (LCA) לתוך CASP3 ושל tryptamine לתוך VDR. השווה בין ציונים קוגנאטיים ולא קוגנאטיים ורשום מקרים שבהם הפרש הציונים הוא <1.0 kcal/mol.

8. סימולציית דינמיקה מולקולרית

1. הפק פרמטרי ליגנד באמצעות שירות פרמטריזציה של ליגנדים התואם ל-CHARMM²⁸ (ראה טבלת חומרים). בחן את כל ציוני העונש (penalty scores) וסמן כל פרמטר עם עונש >50.
2. המיר קבצי זרם (stream files) של הליגנד לקבצי .itp ו- .prm התואמים למנוע הדינמיקה המולקולרית באמצעות סקריפט להמרה של טופולוגיית שדה הכוחות. שלב את קבצי הטופולוגיה של הליגנד והחלבון עבור כל קומפלקס.
3. בצע חלוקה מחדש של מסת המימן (hydrogen mass repartitioning) באמצעות ספריית המרה של טופולוגיה מולקולרית ופרמטרים. הפק טופולוגיות מימיות עם שדה הכוחות של החלבון ששימש לסימולציות דינמיקה מולקולרית²⁹ ומודל מים מפורש בעל שלושה אתרים³⁰.
4. בצע סולבציה (solvate) לקומפלקסים המימיים בתיבה דודקאהדרלית עם מרווח של לפחות 1.2 nm בין הממס לקצוות. נטרל את המערכות והוסף NaCl עד לריכוז של 0.15 M.
5. בנה את מערכת ממברנת ה-tryptamine-HTR2A באמצעות כלי בניית מערכת ממברנה מבוסס רשת^31,32,33 (ראה טבלת חומרים). השתמש בקואורדינטות רצפטור המיושרות למסד נתונים של אוריינטציית ממברנה-חלבון³⁴ (ראה טבלת חומרים), שכבת דו-שכבתית של POPC טהור, שכבות מים של 22.5 Å ו-0.15 M NaCl.
6. בצע מינימום אנרגיה לכל המערכות בשיטת steepest descent עד ל-50,000 צעדים. אשר התכנסות ב-Fmax <1000 kJmol^-1nm^-1 לפני שלב השיווי.
7. בצע שיווי (equilibration) למערכות המימיות בשלבי אנסמבל של מספר חלקיקים, נפח וטמפרטורה קבועים (NVT) ואנסמבל של מספר חלקיקים, לחץ וטמפרטורה קבועים (NPT). בצע שיווי למערכת הממברנה באמצעות זרימת עבודה מבוססת רשת להכנה ושיווי של מערכות מולקולריות רב-שלבית בת ששב שלבים עם שחרור הדרגתי של אילוצים.
8. הרץ סימולציית MD ייצור למשך 200 ns עבור כל חמשת הקומפלקסים. השתמש בצעד זמן (timestep) של 4 fs עם חלוקת מסת מימן (HMR), תרמוסטט V-rescale ב-310 K, ברוסטט Parrinello-Rahman ב-1 bar, אלקטרוסטטיקה של Particle mesh Ewald (PME)³⁵ ואילוצי LINCS³⁶.
9. נתח את המסלולים (trajectories) הסופיים באמצעות כלי ניתוח מסלולי דינמיקה מולקולרית. חשב RMSD של השלד (backbone), תנודה ממוצעת ריבועית (RMSF) של Cα, רדיוס גירהציוני, שטח פנים נגיש לממס (SASA) וקשרי מימן בין חלבון לליגנד, כאשר 150 ns האחרונים ישמשו כחלון הניתוח העיקרי.

9. הערכת אנרגיה חופשית של קישור בשיטת MM-PBSA

1. חלץ צילומי מסך (snapshots) של המסלול עבור אנליזת MM-PBSA. השתמש ב-2,001 פריימים עבור כל קומפלקס מימי וב-201 פריימים מעובדים עבור תת-המערכת של HTR2A המוטמעת בממברנה.
2. הפעל את הכלי לחישוב אנרגיית קישור באמצעות מכניקה מולקולרית/ממס solvent רציף³⁷ עם סולבציה מסוג Poisson-Boltzmann, קבוע דיאלקטרי פנימי = 1, קבוע דיאלקטרי חיצוני = 80, סולבציה לא פולרית מבוססת SASA, וללא תיקון אנטרופיה. דווח על ממוצע האנרגיה החופשית של הקישור ועל סטיית התקן.
3. בצע פירוק לפי שארית (per-residue decomposition) עבור כל חמשת הקומפלקסים. דווח על השאריות המייצבות והמערערות בעלות תרומה מוחלטת של ≥0.5 kcalmol⁻¹.

    

תוצאות

מטרות פוטנציאליות הקשורות למטבוליטים

תשעת המטבוליטים הניבו סטים הטרוגניים של מטרות חזויות באמצעות תוכנית לניבוי מטרות של אינטראקציית כימיקל-חלבון ותוכנית לעגינה מולקולרית (molecular docking). Propionate, tryptamine, חומצות מרה ו-urolithin A הניבו מספר מטרות בעלות רלוונטיות ידועה לאיתות במערכת העיכול. נוף המטרות החזויות כלל רצפטורי ממברנה קנוניים, רצפטורים גרעיניים, אנזימים תוך-תאיים, חלבוני איתות וחלבונים הקשורים להורמונים פפטידיים. לפיכך, תוצאות במורד המסלול מתוארות כגנים הקשורים למטבוליטים (MAGs) ולא כממצאים של רצפטורים בלבד (טבלה 1).

ביצוע השוואה (Benchmarking) מול אינטראקציות Metabolite-protein שדווחו

כדי לבצע השוואת ביצועים (benchmarking) של פלט חיזוי המטרות אל מול ידע ניסיוני קיים, סווגו קשרי מטה-בוליטים ומטרות חזויים לשלוש רמות של ראיות: (i) אינטראקציות ישירות או קרובות ברמת המחלקה בין מטה-בוליט לחלבון הנתמכות ניסיונית, שבהן דווח כי המטה-בוליט או מטה-בוליט אנדוגני קרוב קושר, מפעיל, מעכב או מווסת פונקציונלית את החלבון המקודד; (ii) אינטראקציות הנתמכות על ידי מסלול או מחלקת מטרות, שבהן המטרה החזויה שייכת למסלול תגובתי למטה-בוליטים או למשפחת קולטנים מבוססת, אך ראיות ישירות עבור הזוג הספציפי של מטה-בוליט-חלבון הן מוגבלות; ו-(iii) קשרים חישוביים בלבד שבעבורם לא זוהתה אינטראקציה ניסיונית ישירה בספרות שנסקרה. השוואת ביצועים זו שימשה כדי להקשיר (contextualize), ולא כדי לתקף, את ה-MAGs החזויים.

מספר תחזיות שכילו ביולוגיה שדווחה בעבר. הקשר Propionate-FFAR2 נחשב כנתמך ניסיונית מכיוון ש-FFAR2/GPR43 הוא קולטן קנוני לחומצות שומן קצרות-שרשרת. הקשר Butyrate-HDAC3 סווג כנתמך ניסיונית או על בסיס מחלקה, מכיוון שבוטיראט הוא מעכב מוכר של היסטון דה-אצטילאז, והחפיפה החזויה כללה חבר במשפחת ה-HDAC. תחזיות הקשורות לחומצות מרה הכוללות את NR1H4/FXR ו-VDR נחשבו כנתמכות על ידי ביולוגיה מבוססת של קולטני גרעיניים של חומצות מרה, במיוחד עבור חומצות מרה הידרופוביות כגון LCA; תחזיות FXR הקשורות לחומצה אורסודאוקסיכולית (UDCA) פורשו בזהירות מכיוון ש-UDCA היא בדרך כלל ליגנד חלש יותר של FXR או תלויה בהקשר. תחזיות HTR1B, HTR2A, HTR2B ו-HTR6 הקשורות לטריפטאמין סווגו כנתמכות על ידי מסלול סרוטונינרגי ולא כאינטראקציות ישירות מאוששות וספציפיות לקולטן, מכיוון שטריפטאמין הוא מונואמין מיקרוביאלי נגזר טריפטופאן וקולטני סרוטונין הם רגולטורים מבוססים של מוטיליות והפרשה במערכת העיכול. הקשר Urolithin A-CASP3 נחשב כנתמך על ידי מסלול בשל קשרים שפורסמו בין urolithin A לתגובות אפופטוטיות/קשורות לקספז, אך לא על סמך ראיות ישירות לקשירה של CASP3. הקשרים Indole-3-lactic acid-KYAT1 ו-indole-3-propionic acid-KYAT1 נשמרו כהיפותזות חישוביות בלבד, מכיוון שהספרות הרחבה תומכת באיתות של המארח על ידי נגזרות אינדול מיקרוביאליות, אך לא בקשירה ישירה של KYAT1 על ידי מטבוליטים ספציפיים אלה^7,8,38,39,40.

בהתאם לכך, טבלה 1 מבדילה בין מינוי המטרות החישובי לבין רמת התמיכה הניסויית או התמיכה במסלול שהיו קיימות קודם לכן. היא מספקת גם, עבור כל מטרה, את מקור התחזית (תחזית מטרה של אינטראקציית כימיקל-חלבון, תוכנת עגינה מולקולרית (molecular docking), או שניהם), את ציון האינטראקציה המשולב עבור תחזית מטרת אינטראקציית כימיקל-חלבון, ואת ההסתברות של תוכנת העגינה המולקולרית כאשר המטרה זוהתה על ידי תוכנית עגינה מולקולרית. מטרות שנחזו ללא ראיות ניסוייות ישירות קודמות מתוארות כגנים מועמדים הקשורים למטבוליטים, הדורשים תיקוף עצמאי ברמת החלבון ותגובת ליגנד.

חפיפה בין מטרות חזויות לבין גנים המבטאים ביטוי Differentially Expressed ב-IBS-C

החיתוך בין רשימות המטרות החזויות המשולבות לבין תוצאות הביטוי הדיפרנציאלי ברמת הגן זיהה 17 גנים ייחודיים החזויים כקשורי מטבוליטים, אשר הראו ביטוי דיפרנציאלי מובהק בהשוואה בין IBS-C למתנדבים בריאים. כל 17 הגנים היו בעלי ביטוי מופחת (downregulated). הקבוצה כללה רצפטורים ממברנליים וגרעיניים (CASR, FFAR2, GPR68, HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6, NR1H4, TBXA2R, VDR) וחלבונים שאינם רצפטורים (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, HDAC3, KYAT1, MLN) (טבלה 1, איור 2A,B).

כל 17 ה-MAGs עמדו בסף שיעור גילוי שגוי (FDR) נמוך מ-0.05; 16 מתוך 17 עמדו בסף מחמיר יותר של FDR < 0.001, כאשר הגן הנותר (HTR1B) היה מובהק ב-FDR < 0.05. שבעה מתוך 17 המטרות (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, HDAC3, TBXA2R) עמדו הן ב-FDR < 0.001 והן בשינוי קיפול (fold change) מוחלט של log₂ העולה על 1.0 (טווח logFC בין 1.34− ל-1.10−), מה שמעיד על דה-רגולציה (downregulation) חזקה ועקבית עבור תת-קבוצה זו. שאר המטרות הראו דה-רגולציה מתונה אך מובהקת סטטיסטית (טווח |logFC| בין 0.45 ל-0.97). דפוס תיאורי אחיד זה פורש בזהירות, בהתחשב במאפייני הביטוי של מערך הנתונים ברמת הגנום כולו (ראו הערכה סטטיסטית להלן).

הערכה סטטיסטית של החפיפה ב-DEG המטרה

כדי להעריך באופן פורמלי את המובהקות הסטטיסטית של החפיפה בין 17 הגנים, הופעל מבחן מדויק של פישר (Fisher’s exact test) חד-זנבי, כאשר 17 הגנים שהחזויו כגנים מטרה שימשו כקבוצת השאילתה וכל 18,296 הרשומות הייחודיות לאחר קיפול גנים (gene-collapsed) שזוהו ב-GSE36701 שימשו כרקע הגנומי. מתוך רקע זה, 17,296 גנים (94.5%) היו בעלי ביטוי דיפרנציאלי ב-FDR < 0.05, מה שמעיד על דיכוי שעתוק כמעט אוניברסלי בהשוואה של רירית הרקטום ב-IBS-C. כל 17 הגנים החזויים כמטרות היו בין הגנים בעלי הביטוי הדיפרנציאלי (חפיפה נצפית 17/17, 100%). בהינתן שיעור ביטוי דיפרנציאלי של 94.5% ברקע, החפיפה הצפויה עבור כל קבוצה אקראית של 17 גנים היא 16.1 גנים. מבחן פישר המדויק הניב p = 0.384 עם יחס סיכויים מתוקנן לרציפות (continuity-corrected odds ratio) של 2.03 (רווח בר סמך של 95% הוא 0.12–33.73), תוצאה שלא הייתה מובהקת סטטיסטית ב-α = 0.05 (איור 3A–C).

תוצאה זו מעידה על כך שהחפיפה שנצפתה של 17/17 אינה עולה על החפיפה הצפויה במקרה תחת פרופיל הביטוי הגנומי של מערך נתונים זה. בהתאם לכך, ממצאים אלו מפורשים כדפוס כיווני תיאורי, שבו כל 17 המטרות החזויות הראו ביטוי נמוך (downregulation) באופן עקבי ומובהק ברקמת רירית של רקטום ב-IBS-C, ולא כראיה להעשרה סטטיסטית או לתיקוף עצמאי על רקע גנומי. בדיקת העשרה פורמלית תדרוש שכפול במערכי נתונים טרנסקריפטומיים עם פרופילי ביטוי דיפרנציאלי סלקטיביים יותר, שבהם פחות ממחצית מכלל הגנים מגיעים למובהקות. יש להדגיש כי הביטוי הנמוך האחיד של כל 17 הגנים החופפים הוא תצפית תיאורית ולא תוצאה סטטיסטית שתוקפה בנפרד, מכיוון שהרקע של הביטוי הדיפרנציאלי במערך נתונים זה הוא עצמו ברובו בעל ביטוי נמוך; לכן, כיוון יורד משותף בין הגנים החופפים הוא צפוי ולא הוכפף לבדיקת כיווניות פורמלית. כיוון אחיד זה לא צריך, אם כן, להתפרש כראיה סטטיסטית עצמאית לוויסות מתואם וספציפי למטבוליטים.

דפוסי ספציפיות למטבוליטים

לפרופיאונט היה המספר הגבוה ביותר של גנים חופפים, כולל CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN ו-TBXA2R, מה שמרמז על מעורבות אפשרית של סיגנלינג תגובתי לחומצות שומן קצרות שרשרת וסיגנלינג הקשור ל-Gq. בוטיראט חפף ל-HDAC3, בהתאם לביולוגיה של היסטון דאצטילאז הקשורה לבוטיראט, אם כי הורדה בביטוי mRNA לבדה אינה מבססת תגובתיות משתנה לבוטיראט. חפיפות הקשורות לחומצות מרה כללו את הרצפטורים הגרעיניים VDR ו-NR1H4, שניהם אפקטורים מוכרים של סיגנלינג חומצות מרה במעי^38,39. טריפטמין חפף ל-HTR1B, HTR2A, HTR2B ו-HTR6, מה שמעיד על סיגנלינג סרוטונינרגי כמודול מועמד, מערכת בעלת תפקידים מבוססים בתנועיות והפרשה במערכת העיכול⁴⁰. חומצה אינדול-3-לקטית וחומצה אינדול-3-פרופיונית חפפו ל-KYAT1, ואורוליתין A חפף ל-CASP3.

העשרה של מסלולים

ניתוח העשרה פונקציונלית של 17 הגנים החופפים זיהה מסלולים הקשורים לאיתות במורד של קולטנים המצומדים לחלבון G (GPCR), איתות Gαq, קישור ליגנדים ל-GPCR, סינפסה סרוטונינית, אינטראקציית ליגנד-קולטן נוירו-אקטיבית, העברת אותות סידן, איתות cAMP והפרשת הורמונים פפטידיים. תוצאות אלה עקביות עם הרכב מערכת הגנים ותומכות בקוהרנטיות הביולוגית שלה, אך הן משקפות את האנוטציה הפונקציונלית של הגנים שהוגשו ולא מהוות ראיה עצמאית לפעילות ברמת המסלולים.

מבנה רשת אינטראקציות חלבון-חלבון

בניית רשת אינטראקציות בין חלבונים ואנליזת העשרה של מסלולים פוענחו על פני שלוש רשתות משלימות. במטא-רשת המשולבת של 17 גנים (רשת 1), המבנה הברור ביותר הנתמך על ידי אנוטציות היה רכיב סיגנלינג של GPCR/Gαq הממרכז את GNAQ ומקשר אותו לגנים הקשורים לקולטנים, ביניהם TBXA2R, CASR, HTR2A ו-HTR2B. נשמרה גם קישוריות מוגבלת של קולטני סרוטונין, בולטת בעיקר בין HTR2A ל-HTR2B, בעוד שמספר גנים אחרים נותרו מבודדים או מקושרים באופן חלש בסף הביטחון שנבחר. הרשת הספציפית לפרופיאונט (רשת 2) הראתה טופולוגיה מצומצמת יותר, שבה GNAQ שמר על קישורים הנתמכים באנוטציות ל-CASR ו-TBXA2R, בעוד ש-FFAR2, GPR68, GCG, GPHN ו-MLN היו מבודדים או מקושרים באופן חלש. רשת הטריפטאמין/סרוטונין (רשת 3) כללה את HTR1B, HTR2A, HTR2B ו-HTR6; בתוך תת-קבוצה זו, HTR2A ו-HTR2B הראו את הקישור העיקרי הנתמך באנוטציות, בעוד ש-HTR1B ו-HTR6 לא היו מקושרים ישירות בסף שנבחר (איור 4A–C).

סימולציית עגינה מולקולרית (Molecular docking)

ביצוע עגינה מולקולרית (Molecular docking) בוצע על חמישה קומפלקסים נבחרים של מטבוליט-חלבון. זוגות של חומצות מרה-קולטן גרעיני הראו ציוני Vina נוחים יותר מאשר urolithin A-CASP3 ו-tryptamine-HTR2A. ל-LCA-VDR היה הציון הטוב ביותר, −10.0 kcal/mol, ואחריו LCA-NR1H4/FXR (−9.9 kcal/mol) ו-UDCA-NR1H4/FXR (−9.4 kcal/mol). ל-urolithin A-CASP3 ול-tryptamine-HTR2A היו ציונים נמוכים יותר אך עדיין סבירים של −7.1 kcal/mol (טבלה 2).

עבור קומפלקס ה-LCA-VDR (מזהה PDB: 1DB1), התנוחה החזויה נתמכה על ידי קשר מימן קונבנציונלי בין חמצן הקרבוקסילאט של ה-LCA לבין Ser278 (4.29 Å), יחד עם מגעים הידרופוביים נרחבים הכוללים את Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233 ו-His397, ומגעים נוספים של ואן-דר-ואלס עם Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275 ו-Phe150. לתנוחה בעלת הדירוג הגבוה ביותר היה ציון Vina של −10.0 kcal/mol, גודל חלל של 2055 ų, ומרכז גריד של (10, 19, 33) (טבלה 3, איור 5A,B).

עבור קומפלקס ה-LCA-NR1H4/FXR (מזהה PDB: 3DCT), ציון העגנה (docking score) של −9.9 kcal/mol לווה בקשרי מימן חזויים המערבים את His294 ו-Ile335, אינטראקציית π-Sigma עם His294, ומגעים הידרופוביים מסוג Alkyl או π-Alkyl המערבים את Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, ו-His447, כאשר מגעים נוספים מסוג van der Waals תמכו בהתאמת השלד הסטרואידי בתוך כיס ה-FXR (טבלה 4, איור 6A,B).

התנוחה החזויה של קומפלקס UDCA-NR1H4/FXR (מזהה PDB: 3DCT) הראתה קשר מימן קונבנציונלי עם His447 (3.66 Å), קשר מימן נוסף עם Gly322 (3.46 Å), אינטראקציית π-Anion עם Val325 (4.96 Å), וקשר פחמן-מימן עם Trp469 (4.51 Å). מפת האינטראקציות זיהתה גם מגעים לא מועדפים מסוג תורם-תורם (donor-donor) עם Arg395 (3.89 Å) ו-Gln396 (3.40 Å), מה שמרמז כי ציון ה-Vina הנמוך יותר של UDCA בהשוואה ל-LCA באותו כיס קולטן עשוי לנבוע מגיאומטריה מקומית או אלקטרוסטטיקה פחות מועדפות (טבלה 5, איור 7A,B).

בקומפלקס urolithin A-CASP3 (מזהה PDB: 2DKO), מצב הקישור החזוי כלל קשרי מימן קונבנציונליים עם Gln161 (3.78 ו-4.19 Å), Ser120 (3.95 Å), ו-Arg207 (3.05 ו-3.77 Å), והתייצב עוד יותר באמצעות אינטראקציות π-Cation עם Arg207, קשר מימן מסוג π-Donor עם Cys163, ומגעי π-Alkyl ו-van der Waals נוספים המערבים את Arg64, Ala162, His121, Ser205, ו-Trp206 (טבלה 6, איור 8A,B).

עבור קומפלקס ה-tryptamine-HTR2A (מזהה PDB: 6A93), הפוזה החזויה התייצבה על ידי גשר מלח אלקטרוסטטי בין האמין הפרוטוני של ה-tryptamine לבין Asp155, aspartate השמור בספירלה התוך-ממברנלית 3 (D3.32 לפי מיספור Ballesteros-Weinstein) המעגן את האמין הפרוטוני של ליגנדים אמינרגיים ברחבי קולטני סרוטונין וקולטנים קשוריים^41,42,43, יחד עם קשרי מימן עם Thr160 ו-Ser159, מגעים ארומטיים עם Phe340 ו-Trp336, ואינטראקציות π-Alkyl עם Val156 ו-Ile163. מגעים נוספים של ואן דר ואלס עם Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332, ו-Leu123 תמכו בתבנית קישור לכיס האורתוסטרי (טבלה 7, איור 9A,B).

תיקוף פרוטוקול עגינה (Docking)

כדי להעריך את מהימנות פרוטוקול העגינה (docking), בוצעו שני ניסויי בקרה משלימים. עבור בקרות עגינה חוזרת (חיוביות), ליגנדים שהיו במבנה גבישי משותף הופקו ממבני ה-X-ray הייחוס שלהם ועוגנו מחדש באתרי הקשירה הטבעיים שלהם. התנוחה (pose) החזויה בעלת הדירוג הגבוה ביותר עבור אנלוג הוויטמין D ‏VDX ב-VDR/1DB1 סטתה ב-0.87 Å מהמיקום הגבישי, والليגנד הגבישי המשותף WAY-362450 ב-FXR/3DCT סטה ב-1.79 Å; שני הערכים היו נמוכים מסף הקבלה המקובל של 2.0 Å, מה שתומך בתקינות הגאומטרית של פרוטוקול העגינה עבור מערכות רצפטורים אלו (איור 10A,B). עבור בקרות עגינה צולבת (שליליות), חומצה ליטוכולית עוגנה לתוך caspase-3 (2DKO), פרוטאזה של ציסטאין שאינה ליגנד ידוע עבורה, מה שהניב ציון חזוי (−8.3 kcal/mol) חלש יותר ב-1.7 kcal/mol מאשר במטרתה ההומולוגית VDR (−10.0 kcal/mol), דבר העולה בקנה אחד עם הסלקטיביות החזויה של אתר הקשירה. עגינה של Tryptamine ב-VDR הניבה ציון חזוי של −6.4 kcal/mol בהשוואה ל-−7.1 kcal/mol במטרתו ההומולוגית HTR2A, הפרש של 0.7 kcal/mol שנמצא בטווח אי-הוודאות המדווח של ציוני עגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבונים מטרה, ולכן מעיד על סלקטיביות חזויה מתונה בלבד עבור ליגנד קטן זה (איור 10C). יחד, בקרות אלו מעידות כי פרוטוקול העגינה משחזר גאומטריות קשירה ידועות ומבחין בין זוגות הומולוגיים לבלתי הומולוגיים תחת התנאים שנבדקו, בעודם נותרים תחזיות חישוביות שאינן מהוות תחליף למדידות זיקה (affinity) ניסיוניות (טבלה 8).

סימולציית דינמיקה מולקולרית

סימולציות דינמיקה מולקולרית בוצעו עבור חמשת הקומפלקסים שתועדפו, לאורך מסלולי ייצור של 200 ns. ארבעת הקומפלקסים של הקולטנים המסיסים והגרעיניים סומללו בממס מימי מפורש, בעוד שהקומפלקס tryptamine-HTR2A סומלל בשכבת ליפידים מפורשת של POPC כדי לספק סביבת ממברנה מתאימה פיזיולוגית עבור קולטן זה המשויך לחלבון G. ניתוחים בדקו את היציבות הדינמית של תנוחות העגינה (docked poses) תחת תנאים תלויי-זמן ואפשרו השוואה של התנהגות מבנית יחסית בין הקומפלקסים (טבלה 9).

פרופיל ה-RMSD של קומפלקס ה-LCA-VDR/1DB1 הראה תקופת שיווי משקל קצרה במהלך 10 ns הראשונים, ולאחריה מישור יציב, עם תנודות בעיקר בטווח של 0.20–0.28 nm (איור 11A). ערכי ה-RMSF היו נמוכים, ותנודות השלד היו < 0.15 nm עבור רוב השאריות (איור 11B). ניתוח קשרי מימן הראה רשת עמידה של 2–5 קשרי מימן, עם עליות מזדמנות ל-7 (איור 11C). רדיוס הגירציה (Rg) נשמר בטווח של 1.25–1.75 nm, ושטח הפנים החשוף לממס (SASA) נשמר סביב 130 nm² (איור 11D,E).

קומפלקס ה-urolithin A-CASP3/2DKO הפגין פעילות דינמית רבה יותר. ה-RMSD עלה בתחילה ולאחר מכן תנוד בטווח שבין 0.4 ל-0.7 nm, עם אירוע קצר של סטייה גבוהה סביב 165 ns (איור 12A). ניתוח RMSF הראה ניידות גבוהה ברמת השאריות, כאשר התנודות הגדולות ביותר נצפו באזור הלולאה הגמישה סביב שארית 175 (איור 12B). ניתוח קשרי מימן חשף רשת נרחבת ראשונית של כ-2–5 קשרים במהלך 30–40 ns הראשונים, ולאחריה בעיקר 0 עד 2 קשרים לסירוגין (איור 12C). פרופילי רדיוס הגירציה (radius-of-gyration) ו-SASA התואמים מוצגים ב-איור 12D,E.

עבור מערכות חומצות המרה NR1H4/FXR (3DCT), פרופיל ה-RMSD של השלד נשאר בטווח צר יחסית לאורך רוב המסלול (איור 13A), בעוד שפרופיל ה-RMSF הראה ניידות נמוכה יותר באזורי הליבה ותנודתיות גבוהה יותר באזורים גמישים (איור 13B). קומפלקס ה-LCA-3DCT שמר על כשלוש עד ארבע קשרי מימן עקביים לאורך המסלול, בעוד שקומפלקס ה-UDCA-3DCT הראה תנודתיות רבה יותר בקשרי המימן והפחתה במספר קשרי המימן לאחר כ-125 ns. פרופילי רדיוס הג'ירוס (Radius-of-gyration) עבור המערכות הקשורות ל-LCA ו-UDCA מוצגים באיור 13C,D, בהתאמה, ופרופילי ה-SASA התואמים מוצגים באיור 13E,F.

דינמיקה מולקולרית של ממברנה עבור קומפלקס tryptamine-HTR2A

קומפלקס ה-tryptamine-HTR2A/6A93 סומלה למשך 200 ns בתוך שכבה ליפידית מפורשת של POPC המורכבת מ-258 מולקולות ליפיד, מודל מים מפורש בעל שלושה אתרים, ו-0.15 M NaCl, עבור גודל מערכת כולל של כ-100,925 אטומים^33,44,45. הרצפטור נשאר מוטמע באופן יציב בשכבה לאורך כל המסלול (איור 14). ה-RMSD של השלד עלה מכ-0.10 nm למישור יציב סביב 0.15–0.20 nm בתוך 100 ns הראשונים ונשאר יציב לאחר מכן, כאשר כל הערכים היו נמוכים מ-0.25 nm, מה שמעיד על כך שהרצפטור שמר על קונפורמציה יציבה בסביבת הממברנה ללא פריסה גלובלית (איור 15A). ה-RMSF לכל שארית הראה תנודות נמוכות בליבה הספירלית החוצת-ממברנה עם ניידות גבוהה יותר כמצופה באזורי הלולאות והקצוות, דבר העולה בקנה אחד עם הגמישות הטיפוסית של GPCR (איור 15B). רדיוס הג'ירוס (radius of gyration) היה מוגבל באופן הדוק בין כ-2.06 ל-2.12 nm, וה-SASA תנוד בטווח צר ללא סחיפה הדרגתית, ושני המדדים אישרו את השמירה על הצבר החוצה-ממברנה הדחוס (איור 15C,D).

קשרי מימן בין החלבון לליגנד נשמרו לאורך כל המסלול (איור 15E), עם תנודות משמעותיות במספר קשרי המימן, שנעו בין 1 ל-3. כדי להעריך באופן ספציפי את העמידות של האינטראקציה היונית המרכזית, נוטרר לאורך כל המסלול המרחק המינימלי בין חנקן האמוניום הפרוטוני של ה-tryptamine לבין אטומי החמצן של הקרבוקסילאט ב-Asp155 (D3.32). מרחק זה נשאר מרוכז סביב ממוצע של 0.270 nm (מינימום 0.247 nm, מקסימום 0.424 nm), ומגע גשר המלח (< 0.4 nm) נשמר ב-99.9% מהסימולציה עם שתי סטיות חולפות וקצרות בלבד, וללא אירוע דיסוציאציה ממושך (איור 16). תוצאות אלו מצביעות על כך שהאינטראקציה היונית השמורה של Asp155 הספיקה כדי לייצב את ה-tryptamine בתוך הכיס האורתוסטרי של HTR2A לאורך סימולציית הממברנה.

אנרגיית קישור חופשית בשיטת MM-PBSA ופירוק לפי שארית

ניתוח MM-PBSA בוצע כדי להוסיף שכבת תיעדוף אנרגטית נוספת לחמשת הקומפלקסים (טבלה 10). עבור ארבעת הקומפלקסים המימיים, פירוק לפי שארית (per-residue decomposition) זיהה את התורמים האנרגטיים העיקריים עבור כל מצב קישור שנחזה. בקומפלקס LCA-VDR/1DB1, לליגנד ול-Gln317 הייתה תרומה חיובית, בעוד ש-Trp286 הפגין תרומה לא חיובית. בקומפלקס urolithin A-CASP3/2DKO, השאריות Arg64 ו-Arg207 הראו תרומות שליליות חזקות לפי שארית, מה שמעיד על ייצוב פולרי או אלקטרוסטטי משמעותי; עם זאת, המסלול (trajectory) התואם נותר דינמי מאוד, מה שמוכיח כי אנרגטיקה חיובית ברמת השאריות לבדה אינה מבטיחה יציבות מתמשכת של הקומפלקס. עבור מערכות ה-3DCT, הקישור של LCA הונע בעיקר על ידי Arg331, בעוד שהקישור של UDCA כלל רשת אנרגטית מפוזרת יותר הכוללת את Glu326, Asp394, Arg395, Arg441 ו-Asp470. בארבע המערכות המימיות, פירוק ה-MM-PBSA תמך בתיעדוף היחסי של הקומפלקסים המבוססים על LCA.

עבור קומפלקס tryptamine-HTR2A/6A93 המוטמע בממברנה, בוצע ניתוח MM-PBSA על תת-מערכת החלבון-ליגנד שהופקה ממסלול השכבה הכפולה^46,47. נצפו תרומות חיוביות עבור הליגנד ו-Asp155 (D3.32), שהיה התורם המייצב הדומיננטי ביותר ברמת השאריות, באופן העולה בקנה אחד עם אינטראקציית הגשר המלוחי שזוהתה הן בניתוח העגינה (docking) והן בניתוחי המרחקים של המסלול. Trp137 הראה את התרומה השלילית הגדולה ביותר לכל שארית מבין השאריות הסובבות את התהום האורתוסטרית (Ser86, Phe87, Phe133, Phe140, Phe141, Val156, Ser159, Thr160, Ile163, Val167, Tyr171), שביחד הן יוצרות את רשת המגעים הארומטית והפולרית המבטנת את תהום הקשירה. ערכים אלו מייצגים הערכות חישוביות יחסיות לצורך תיעדוף מבני ואינם מהווים זיקות קשירה ניסיוניות.

איור 1: זרימת עבודה חישובית לתיעדוף גנים של המאכסן הקשורים למטבוליטים ב-IBS-C. ייצוג סכמטי של זרימת עבודה בת שמונה שלבים המשלבת בחירת מטבוליטים, חיזוי מטרות, ביטוי שוני טרנסקריפטומי, ניתוח חפיפה, העשרה של רשתות ומסלולים, עגינה מולקולרית (molecular docking), סימולציית דינמיקה מולקולרית וניתוח אנרגיית קישור חופשית בשיטת MM-PBSA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח ביטוי דיפרנציאלי וחפיפה בין מטבוליטים למטרות ברירית ה-IBS-C. (A) תרשים Volcano של ביטוי דיפרנציאלי ברמת הגן ב-GSE36701. נקודות כחולות, גנים עם ביטוי מופחת משמעותית; נקודות אדומות, גנים עם ביטוי מוגבר משמעותית; נקודות אפורות, גנים שאינם משמעותיים. גנים נבחרים הקשורים למטבוליטים המופיעים בחפיפה מסומנים. (B) דיאגרמת ונ המראה את החפיפה בין 330 מטרות מטבוליטים ייחודיות שנחזו לבין גנים עם ביטוי מופחת ב-GSE36701; 17 גנים היו משותפים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הערכה סטטיסטית של 17 הגנים מטרת המטבוליטים שנחזו אל מול GSE36701. (A) שינוי קיפול (log2 fold change) לכל גן עבור כל 17 הגנים, צבוע לפי רמת מובהקות. (B) שיעור ביטוי דיפרנציאלי של גני רקע לעומת המטרות שנחזו, באמצעות מבחן Fisher’s exact. (C) טבלת התניה של שני על שני משמשת למבחן Fisher’s exact. כל 17 המטרות הראו ביטוי נמוך (downregulated) באופן מובהק; החפיפה מפורשת כדפוס כיווני תיאורי ולא כהעשרה סטטיסטית. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: בניית רשת מורכבת של אינטראקציות בין חלבונים והעשרה של מסלולים ברשתות אינטראקציות בין חלבונים של גנים חופפים הקשורים למטבוליטים. (A) רשת 1: מטא-רשת משולבת של כל 17 הגנים. (B) רשת 2: רשת ספציפית ל-propionate של שמונה גנים (CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN, TBXA2R). (C) רשת 3: רשת tryptamine/serotonin של ארבעה גנים (HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6). הרשתות הופקו עבור Homo sapiens בלפחות, תוך שימוש בבניית רשת אינטראקציות בין חלבונים והעשרת מסלולים ברמת ביטחון ≥ 0.700. קצוות מייצגים קשר תפקודי נתמך על ידי אנוטציה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

איור 5: ייצוג מבני תלת-ממדי ודו-ממדי של חומצה ליתוכולית בקומפלקס עם VDR (PDB ID: 1DB1). (A) ייצוג שטח וסרטון תלת-ממדי כאשר חומצה ליתוכולית מוצגת ככדורים. (B) מפת אינטראקציה דו-ממדית המראה את קשר המימן של Ser278 ואת מגעי הוואן-דר-ואלס והמגעים ההידרופוביים מסביבו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6. ייצוג מבני תלת-ממדי ודו-ממדי של חומצה ליתוכולית בקומפלקס עם NR1H4/FXR (מזהה PDB: 3DCT). (A) ייצוג תלת-ממדי של פני השטח ובמבנה סרט (cartoon). (B) מפת אינטראקציות דו-ממדית המראה קשרי מימן עם His294 ו-Ile335, אינטראקציית π-Sigma ומגעים היקפיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

איור 7: ייצוג מבני תלת-ממדי ודו-ממדי של חומצה ursodeoxycholic בקומפלקס עם NR1H4/FXR (מזהה PDB: 3DCT). (A) ייצוג פני שטח וסרטון בתלת-ממד. (B) מפת אינטראקציה דו-ממדית המראה קשרי מימן עם His447 ו-Gly322, אינטראקציית π-Anion עם Val325, קשר פחמן-מימן עם Trp469, ומגעים בלתי מועדפים מסוג תורם-תורם (donor-donor) עם Arg395 ו-Gln396. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: ייצוג מבני תלת-ממדי ודו-ממדי של urolithin A בקומפלקס עם CASP3 (מזהה PDB: 2DKO). (A) ייצוג תלת-ממדי של פני השטח ובסגנון cartoon. (B) מפת אינטראקציות דו-ממדית המראה קשרי מימן עם Gln161, Ser120 ו-Arg207, אינטראקציות π-Cation עם Arg207, קשר מימן מסוג π-Donor עם Cys163 ומגעים היקפיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: ייצוג מבני תלת-ממדי ודו-ממדי של tryptamine בקומפלקס עם HTR2A (PDB ID: 6A93). (A>) ייצוג פני שטח וסרטונים תלת-ממדי שהופק בתוכנה לוויזואליזציה מולקולרית תלת-ממדית. (B>) מפת אינטראקציות דו-ממדית שהופקה בכלי לוויזואליזציה מולקולרית ובכלי לדיאגרמות אינטראקציות דו-ממדיות, הממחישה את גשר המלח של Asp155 ואינטראקציות נוספות באתר הקישור. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: תיקוף פרוטוקול העגנה (Docking). (A,B) עגנה חוזרת (Redocking) של ליגנדים שעברו קריסטליזציה משותפת לתוך VDR/1DB1 (RMSD 0.87 Å) ו-FXR/3DCT (RMSD 1.79 Å); התנוחות הקריסטלוגרפיות והתנוחות מהעגנה החוזרת מוצגות בחפיפה, שתיהן מתחת לסף הקבלה של 2.0 Å. (C) סלקטיביות בעגנה צולבת (Cross-docking): ציוני Vina של ליגנדים תואמים לעומת לא תואמים עבור lithocholic acid ו-tryptamine. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11. ניתוח מסלול דינמיקה מולקולרית של קומפלקס LCA-VDR/1DB1 לאורך 200 ns. (A) פרופיל RMSD. (B) פרופיל RMSF. (C) ספירת קשרי מימן. (D) פרופיל רדיוס ג'יレーション. (E) פרופיל SASA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 12: ניתוח מסלול דינמיקה מולקולרית של קומפלקס urolithin A-CASP3/2DKO לאורך 200 ns. (A) פרופיל RMSD המראה תנודות קונפורמציוניות רחבות ואירוע חריגה גבוה חולף בסביבות 165 ns. (B) פרופיל RMSF המראה גמישות בולטת ברמת השאריות סביב שארית 175. (C) ספירת קשרי מימן. (D) פרופיל רדיוס גיration. (E) פרופיל SASA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

איור 13: ניתוח מסלולי דינמיקה מולקולרית של מערכות חומצות מרה NR1H4/FXR (3DCT) לאורך 200 ns. (A) פרופיל Backbone RMSD עבור קומפלקס ה-3DCT. (B) פרופיל Backbone RMSF. (C) פרופיל רדיוס גירציה עבור 3DCT-LCA. (D) פרופיל רדיוס גירציה עבור 3DCT-UDCA. (E) פרופיל SASA עבור 3DCT-LCA. (F) פרופיל SASA עבור 3DCT-UDCA. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 14: קומפלקס ה-tryptamine-HTR2A מוטמע בשכבה ליפידית מפורשת של POPC. הרצפטור מוצג כשרטוט (cartoon) החוצה את השכבה הליפידית, ליפידי POPC מוצגים כקווים עם הדגשה של קבוצות הראש הפוספטיות, ו-tryptamine נמצא בתוך הכיס האורתוסטרי. מים מוצגים מעל ומתחת לממברנה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

איור 15: ניתוח מסלול דינמיקה מולקולרית של קומפלקס tryptamine-HTR2A/6A93 לאורך 200 ns בשכבה לבידית מפורשת של POPC. (A) פרופיל RMSD של השלד (Backbone). (B) פרופיל RMSF לכל שארית. (C) פרופיל רדיוס גירציה (Radius-of-gyration). (D) פרופיל SASA. (E) ספירת קשרי מימן בין החלבון לליגנד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

איור 16: התמדה של האינטראקציה היונית בין tryptamine ל-Asp155 (D3.32) לאורך מסלול הממברנה של 200 ns. המרחק המינימלי בין חנקן האמוניום של ה-tryptamine לבין אטומי החמצן של הקרבוקסילאט ב-Asp155 מוצג כפונקציה של זמן; הקו המקווקו מסמן את סף המגע של הגשר המלוחי ב-0.4 nm. המגע נשמר במשך 99.9% מהסימולציה. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סמל הגן	מטבוליט(ים) מקור	קטגוריה תפקודית	log2FC	FDR (adj. P-value)	רמת מובהקות
GCG	Propionate	חלבון הקשור להורמון פפטידי	−1.342	1.97e−7	FDR <0.001 & |logFC > 1
HDAC3	Butyrate	אנזים	−1.234	2.44e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
CASP3	Urolithin A	אנזים	−1.198	6.66e−7	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPR68	Propionate	קולטן ממברנה	−1.137	4.35e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GNAQ	Propionate	חלבון סיגנלינג תוך-תאי	−1.122	1.05e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPHN	Propionate	חלבון תוך-תאי אחר	−1.109	1.13e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
TBXA2R	Propionate	קולטן ממברנה	−1.104	4.04e−7	FDR <0.001 & |logFC| > 1
HTR6	Tryptamine	קולטן ממברנה	−0.967	2.17e−5	FDR <0.001
VDR	Lithocholic acid	קולטן גרעיני	−0.942	5.73e−7	FDR <0.001
HTR2A	Tryptamine	קולטן ממברנה	−0.937	4.99e−6	FDR <0.001
FFAR2	Propionate	קולטן ממברנה	−0.889	1.44e−4	FDR <0.001
NR1H4	Lithocholic acid / Ursodeoxycholic acid	קולטן גרעיני	−0.861	3.68e−6	FDR <0.001
HTR2B	Tryptamine	קולטן ממברנה	−0.702	1.29e−4	FDR <0.001
MLN	Propionate	חלבון הקשור להורמון פפטידי	−0.605	7.39e−5	FDR <0.001
KYAT1	Indole-3-lactic acid / Indole-3-propionic acid	אנזים	−0.530	3.61e−4	FDR <0.001
CASR	Propionate	קולטן ממברנה	−0.483	4.05e−4	FDR <0.001
HTR1B	Tryptamine	קולטן ממברנה	−0.455	3.18e−2	FDR <0.05

טבלה 1: גנים מטרה חזויים הקשורים למטבוליטים החופפים לגנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי במערך הנתונים של רירית הרקטום ב-IBS-C. כל הגנים החופפים המפורטים היו בעלי ביטוי מופחת (downregulated). טבלה 1 מוגשת בנפרד כטבלת גיליון אלקטרוני ומפרטת, עבור כל מטרה, את המטבוליט(ים) ממנו מקורו, קטגוריה פונקציונלית, מקור חיזוי המטרה (חיזוי מטרה של אינטראקציית כימיקל-חלבון, תוכנת עגינה מולקולרית (molecular docking), או שניהם), ציון אינטראקציה משולב של חיזוי מטרה של אינטראקציית כימיקל-חלבון, וההסתברות של תוכנת העגינה המולקולרית, ובמידה וזמינים, את דרגת החיזוי, log2 fold change ו-FDR עם דרגת מובהקות הביטוי. מקור: ערכי ביטוי הגנים התקבלו מטבלת הביטוי הדיפרנציאלי GSE36701 המקובצת לפי גנים (הגס/פרובה עם ה-FDR הנמוך ביותר לכל גן). מקור חיזוי המטרה וערכי הביטחון נאספו מפלט של חיזוי מטרה של אינטראקציית כימיקל-חלבון ומתוכנת עגינה מולקולרית, תוך שימוש בסף של ציון אינטראקציה משולב של חיזוי מטרה של אינטראקציית כימיקל-חלבון ≥ 0.700 והסתברות של תוכנת עגינה מולקולרית ≥ 0.70. ציוני חיזוי מטרה של אינטראקציית כימיקל-חלבון הם ציונים משולבים בסולם של 0–1; STP מציין הסתברות של תוכנת עגינה מולקולרית. Tier 1 = תמיכה קפדנית של חיזוי מטרה של אינטראקציית כימיקל-חלבון; Tier 1+ = תמיכה קפדנית של חיזוי מטרה של אינטראקציית כימיקל-חלבון הנתמכת באופן הצלבי על ידי תוכנת עגינה מולקולרית.

קומפלקס	חלבון (PDB ID)	ליגנד	ציון Vina (kcal/mol)	גודל חלל (A^3)	מרכז רשת X,Y,Z (A)	תיבת חיפוש (A)
LCA-VDR	VDR (1DB1)	חומצה ליתוכולית	−10.0	2055	10, 19, 33	25 x 25 x 25
LCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	חומצה ליתוכולית	−9.9	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
UDCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	חומצה אורסודאוקסיכולית	−9.4	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
Urolithin A-CASP3	CASP3 (2DKO)	Urolithin A	−7.1	233	37, 34, 32	25 x 25 x 25
Tryptamine-HTR2A	HTR2A (6A93)	טריפטמין	−7.1	3238	12, −1, 61	25 x 25 x 25

טבלה 2: תוצאות סימולציית עגינה מולקולרית (Molecular docking): ציוני העגינה המדורגים במיקום הגבוה ביותר של ליגנדים מטבוליים לחלבונים מטרה ופרמטרי חלל עבור חמשת קומפלקסי החלבון-ליגנד בעדיפות גבוהה. גודל החלל מדווח ב-ų. מקור: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx, גיליון 'Original_Docking_Scores'. סימולציית עגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבונים מטרה; exhaustiveness = 8, seed = 42 (קבוע), num_modes = 9 עבור כל הקומפלקסים; דווחה התנוחה המדורגת במיקום הגבוה ביותר (mode 1).

סוג אינטראקציה	שאריות (Residue)	מרחק (A)	הערות
קשר מימן קונבנציונלי	Ser278	4.29	חמצן קרבוקסילאט של LCA
מגע הידרופובי / Pi-Alkyl	Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233, His397	-
מגע ואן-דר-ואלס	Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275, Phe150	-

טבלה 3: מצבי קישור שנוצרו עבור עגינה (docking) של חומצה ליתוכולית עם VDR (מזהה PDB: 1DB1). מקור: כלי ויזואליזציה מולקולרית וכלי לדיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות בין ליגנד לשייר, כפי שדווח בתוצאות כתב היד (עגינה מולקולרית). '-' מציין שערך מרחק לא דווח באופן פרטני עבור מגע זה.

סוג האינטראקציה	שאריש(ים)	מרחק (A)	הערות
קשר מימן	His294	-
קשר מימן	Ile335	-
אינטראקציית Pi-Sigma	His294	-
Alkyl / Pi-Alkyl (הידרופובית)	Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, His447	-
מגע ואן דר ואלס	שארישי כיס נוספים (לא צוינו בנפרד במקור)	-	תומך בהתאמה של שלד סטרואידי

טבלה 4: מצבי קישור שנוצרו עבור עגינה (docking) של חומצה ליתוכולית עם NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT).

מקור: כלי לוויזואליזציה מולקולרית וכלי לדיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות בין ליגנד לשאריות, כפי שדווח בכתב היד בפרק תוצאות (Molecular docking). הסימן '-' מציין כי לא דווח ערך מרחק בנפרד עבור מגע זה.

סוג האינטראקציה	שארית (שאריות)	מרחק (A)	הערות
קשר מימן קונבנציונלי	His447	3.66
קשר מימן	Gly322	3.46
אינטראקציית Pi-Anion	Val325	4.96
קשר פחמן-מימן	Trp469	4.51
מגע תורם-תורם לא מועדף	Arg395	3.89
מגע תורם-תורם לא מועדף	Gln396	3.40

טבלה 5: מצבי קישור שנוצרו עבור עגינה (docking) של חומצה אורסודאוקסיכולית עם NR1H4/FXR (מזהה PDB: 3DCT). מקור: כלי ויזואליזציה מולקולרית וכלי לדיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות בין ליגנד לשאריות, כפי שדווח בתוצאות כתב היד (עגינה מולקולרית). '-' מציין שערך מרחק לא דווח באופן פרטני עבור מגע זה.

סוג האינטראקציה	שארית/ים	מרחק (A)	הערות
קשר מימן קונבנציונלי	Gln161	3.78
קשר מימן קונבנציונלי	Gln161	4.19	מגע שני
קשר מימן קונבנציונלי	Ser120	3.95
קשר מימן קונבנציונלי	Arg207	3.05
קשר מימן קונבנציונלי	Arg207	3.77	מגע שני
אינטראקציית פאי-קטיון	Arg207	-
קשר מימן מסוג תורם-פאי (Pi-Donor hydrogen bond)	Cys163	-
מגע פי-אלקיל / ואן דר ואלס	Arg64, Ala162, His121, Ser205, Trp206	-

טבלה 6: מצבי קישור שהופקו עבור דוקינג של urolithin A עם CASP3 (PDB ID: 2DKO).מקור: כלי ויזואליזציה מולקולרית וכלי לדיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות בין ליגנד לשארית, כפי שדווח בתוצאות כתב היד (Molecular docking). '-' מעיד על כך שערך המרחק לא דווח באופן פרטני עבור מגע זה.

סוג אינטראקציה	שאריות (Residues)	מרחק (A)	הערות
גשר מלח אלקטרוסטטי	Asp155 (D3.32)	-	אמין פרוטוני של טריפטמין
קשר מימן	Thr160	-
קשר מימן	Ser159	-
מגע ארומטי	Phe340, Trp336	-
אינטראקציית Pi-Alkyl	Val156, Ile163	-
מגע ואן-דר-ואלס	Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332, Leu123	-

טבלה 7: מצבי קישור שנוצרו עבור עגינה (docking) של טריפטמין עם HTR2A (PDB ID: 6A93). מקור: כלי ויזואליזציה מולקולרית וכלי לדיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות, דיאגרמות אינטראקציה דו-ממדיות בין ליגנד לשאריות, כפי שדווח בסעיף התוצאות של כתב היד (עגינה מולקולרית). '-' מציין כי ערך המרחק לא דווח באופן פרטני עבור מגע זה.

(A) תיקוף על ידי דוקינג חוזר (ביקורות חיוביות)
מזהה PDB	חלבון	ליגנד של קו-גביש	ציון Vina (kcal/mol)	RMSD (Å)	סף (A)	תוצאה
1DB1	VDR	VDX (אנלוג של ויטמין D)	−13.0	0.87	2.0	עבור (PASS)
CT תלת-ממדי	FXR	WAY-362450 (064)	−11.9	1.79	2.0	עגיבה
(B) תיקוף מסירה ישירה (ביקורות שליליות)
ליגנד	מטרה הומולוגית (PDB)	ציון קוגנט (kcal/mol)	מטרה שאינה קוגנטית (PDB)	ציון אי-הומולוגיה (kcal/mol)	דלתא (kcal/mol)	סלקטיביות
חומצה ליתוכולית	VDR (1DB1)	−10.0	CASP3 (2DKO)	−8.3	1.7	מאושר
טריפטאמין	HTR2A (6A93)	−7.1	VDR (1DB1)	−6.4	0.7	צנוע (במסגרת אי-הוודאות של Vina בטווח של 0.5–1.0±)

טבלה 8: תוצאות תיקוף פרוטוקול העגינה (Docking): ערכי RMSD של עגינה חוזרת (ביקורות חיוביות) ומדדי עגינה צולבת (ביקורות שליליות).מקור: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx ו-Docking_Validation/Logs/*.log (עגינה מולקולרית של ליגנדים מטבוליים לחלבונים מטרה, exhaustiveness = 8, seed = 42, תיבה של 25 Å × 25 Å × 25 Å). RMSD חושב לפי התאמת אטומים כבדים ושמות אטומים (ללא סופרפוזיציה).

קומפלקס	RMSD (nm), ממוצע + / –SD (טווח)	Rg (nm), ממוצע + / – SD (טווח)	SASA (nm^2), ממוצע + / – SD (טווח)	קשרי מימן, ממוצע + / –SD (טווח)	RMSF (nm), ממוצע (מקסימום)
LCA-VDR/1DB1	0.230 + / – 0.025 (0.167–0.296)	1.889 + / − 0.009 (1.863–1.919)	130.4 + / − 2.3 (122.3–137.4)	1.9 + / − 0.9 (0–7)	0.093 (max 0.600 בשארית 120)
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.824 + / − 0.008 (1.804–1.849)	129.7 + / − 2.3 (121.9–138.1)	3.8 + / − 0.7 (1–6)	0.113 (max 0.298)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.834 + / − 0.013 (1.809–1.921)	131.0 + / −3.4 (121.6–143.5)	1.1 + / − 1.1 (0–5)	0.113 (max 0.298)
Urolithin A-CASP3/2DKO	0.521 + / – 0.058 (0.244–0.755)	1.892 + / − 0.024 (1.839–1.984)	134.9 + / − 3.0 (126.4–146.4)	0.6 + / − 0.7 (0–3)	1.172 (max 2.532 בשארית 175)
Tryptamine-HTR2A/6A93 (ממברנה)	0.177 + / –0.017 (0.131–0.227)	2.089 + / − 0.007 (2.070–2.116)	165.1 + / − 2.7 (156.–172.7)	1.7 + / − 0.7 (0–4)	0.090 (max 0.319)

טבלה 9: סיכום התנהגות סימולציית דינמיקה מולקולרית של 200 ns עבור חמשת קומפלקסי החלבון-ליגנד שקיבלו עדיפות, כולל מערכת tryptamine-HTR2A המוטמעת בממברנה.מקור: קבצי כלי ניתוח מסלולים של דינמיקה מולקולרית (.xvg) — gmx rms, gmx gyrate, gmx sasa, gmx hbond, gmx rmsf — שחושבו על פני 150 ns האחרונים (50–200 ns) של כל הרצה של 200 ns, בהתאם לשלב 8.8 בפרוטוקול. RMSD/Rg הותאמו לשלד החלבון (backbone-fitted); רדיוס גשש SASA הוא 0.14 nm; סף תורם-מקבל לקשר מימן (H-bond) הוא 0.35 nm / 30 °. LCA-3DCT ו-UDCA-3DCT חולקים מסלול שלד חלבון אחד (RMSD, RMSF) עם Rg/SASA/H-bonds ספציפיים לליגנד.

Tryptamine-HTR2A/6A93 (ממברנה) — פירוק כמותי לכל שארית
שארית	תרומה כוללת של ddG (kcal/mol), ממוצע + / − SD	כיוון
Asp155 (D3.32)	−89.94 + / − 6.81	מייצב (דומיננטי)
Tryptamine (ליגנד)	−13.01 + / − 6.22	מייצב
Tyr171	13.62 + / − 4.54	דסטביליזציה
Val167	23.32 + / − 3.96	דסטביליזציה
Val156	20.03 + / − 3.81	דסטביליזציה
Thr160	4.86 + / − 3.64	דסטביליזציה
Ser159	24.16 + / − 3.48	דסטביליזציה
Ser86	24.48 + / − 3.65	דסטביליזציה
Phe87	35.18 + / − 4.04	דסטביליזציה
Phe133	32.80 + / −3.70	דסטביליזציה
Phe140	30.63 + / − 3.84	דסטביליזציה
Phe141	35.25 + / − 3.55	דסטביליזציה
Ile163	27.64 + / − 3.71	דסטביליזציה
Trp137	53.77 + / − 4.32	דסטביליזציה (הבלתי נוח ביותר)
ארבעת הקומפלקסים האחרים — שאריות שזוהו בפירוק לכל שארית (איכותני)
קומפלקס	שארית	כיוון
LCA-VDR/1DB1	ליגנד (LCA)	נוח
LCA-VDR/1DB1	Gln317	נוח
LCA-VDR/1DB1	Trp286	בלתי נוח
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg331	נוח (דומיננטי)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Glu326	רשת מעורבת/מפוזרת
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp394	רשת מעורבת/מפוזרת
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg395	רשת מעורבת/מפוזרת
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg441	רשת מעורבת/מפוזרת
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp470	רשת מעורבת/מפוזרת
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg64	נוח מאוד (פולרי/אלקטרוסטטי)
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg207	נוח מאוד (פולרי/אלקטרוסטטי)

טבלה 10: פירוק MM-PBSA לכל שארית (RESIDUE) תקציר קצר: שאריות מייצבות ומדסטביליזציה (תרומה מוחלטת של ≥ 0.5 kcal mol⁻¹) עבור כל אחד מחמשת קומפלקסי החלבון-ליגנד שתועדפו, כולל מערכת ה-tryptamine-HTR2A השקועה בממברנה.מקור: Membrane Simulation/03_MMPBSA/results/FINAL_DECOMP_MMPBSA.dat (כלי לחישוב אנרגיית קישור במכניקה מולקולרית/ממס רציף, פירוק Generalized Born (GB) לכל שארית, 'Complex: Total Energy Decomposition'). מספרי השאריות הומרו מהמספור הפנימי של המערכת שנבנתה ב-CHARMM-GUI (היסט של +68) למספור המקורי של PDB 6A93 המשמש במקומות אחרים בכתב יד זה.

מקור: נתוני סימולציית MD קודמים/1DB1,2KD0, LCA & UDCA_3DCT}/mmpbsa_*/Decomposition_NORMAL_GB_Complex_TDC*.svg ותוצאות כתב היד (אנרגיית קישור חופשית בשיטת MM-PBSA ופירוק לפי שארית). עבור ארבעה קומפלקסים אלו אין פלט מספרי של .dat/.csv לפי שארית בספריית הפרויקט (קיימים רק גרפי SVG מרונדרים עם טקסט בנתיב וקטורי שאינו ניתן לחילוץ ממוחשב); רק זהות השארית והכיוון המועדף/שאינו מועדף, כפי שצוין בטקסט של כתב היד, מדווחים. תרומות מדויקות ב-kcal/mol עבור ארבעה קומפלקסים אלו אינן זמינות במאגר המקור.

דיון

מחקר חישובי גשש זה מדגים תהליך עבודה (workflow) משולב וניתן לשחזור לתעדוף גנים של המארח הקשורים למטבוליטים מיקרוביאליים ומכלולי חלבון-ליגנד, אשר יושם כאן על מערך נתונים טרנסקריפטומי של רירית הרקטום מחולים עם IBS-C ממאגר נתונים ציבורי. באמצעות תהליך עבודה זה, תת-קבוצה של גנים שנחזו כקשורים למטבוליטים מיקרוביאליים חפפה לגנים שהיו במצב של ביטוי מופחת (downregulated) באופן עקבי במערך הנתונים, והם התקבצו בתוך מסלולים של GPCR, מערכות סרוטונירגית, איתות סידן, ליגנד-רספטור נוירו-אקטיבי ורספטורים גרעיניים, מערכות המעורבות יותר ויותר בתקשורת בין המיקרוביוטה למארח^48,49. ממצאים אלה יש לפרש אך ורק כיוצרי היפותזות: הניתוח אינו מודד ריכוזי מטבוליטים מיקרוביאליים, שפע של חלבוני רספטור, קישור ליגנדים, הפעלת רספטורים, איתות במורד המסלול, מוטיליות, הפרשה, תגובות כאב או תוצאים קליניים. המסקנה החזקה והנתמכת ביותר היא שהגנים והמסלולים שזוהו הם מועמדים לאישור ניסויי ולא מנגנוני מחלה מאושרים.

החשיבות הקריטית של פרוטוקול זה, ביחס לעבודות קודמות שבחנו זוגות בודדים של מטבוליט-רצפטור בבידוד, טמונה בשילוב של חיזוי מטרות, טרנסקריפטומיקה ציבורית, ניתוח רשתות, עגינה (docking) עם בקרות תיקוף, דינמיקה מולקולרית ו-MM-PBSA לכדי צינור סדרה (pipeline) אחד לתעדוף. כל שלב מצמצם ומספק הקשר לקבוצת המועמדים שהופקה בשלב הקודם, והסינון הסדרתי הוא זה שהופך את רשימת המועמדים הסופית לניתנת לבדיקה ניסיונית. מודול ה-GPCR הממוקד ב-GNAQ והמודול הקשור לרצפטור הסרוטונין שזוהו כאן הם סבירים מבחינה ביולוגית, בהתחשב בתפקידו של שגשוג Gq בהפעלה של phospholipase C, ייצור של inositol 1,4,5-trisphosphate, גיוס סידן, הפרשה ותפקוד אנטרואנדוקריני, ובשל התפקידים המוכרים של איתות המבוסס על חומצות שומן קצרות שרשרת ועל טריפטופן בהומאוסטזיס של הרקמה הרירית, ושל איתות סרוטונירגי בניידות מערכת העיכול, בהפרשה, ברגישות ויסצרלית ובתקשורת בין המעי למוח^10,18,50,51.

מאפיין מתודולוגי מרכזי של מחקר זה הוא הטיפול ברצפטור HTR2A המשובץ בממברנה. מכיוון שסימולציה בשלב מומס אינה יכולה לשחזר את סביבת הליפידים השולטת בהתנהגות הקונפורמציונית של רצפטור המצומד לחלבון G, קומפלקס tryptamine-HTR2A סומולץ בשכבה כפולה מפורשת של POPC. בסביבת ממברנה זו, הרצפטור נשאר יציב מבנית לאורך כל מסלול הסימולציה של 200 ns, וגשר המלח בין קבוצת האמוניום של ה-tryptamine ל-Asp155 (D3.32) נשמר למעשה לאורך כל הסימולציה. העובדה ששלוש הוכחות בלתי תלויות – תנוחת העגינה (docking pose), מרחק המגע העקבי לאורך המסלול, והתרומה הדומיננטית של כל שארית בחישוב MM-PBSA – מתכנסות לאותה אינטראקציה שמורה עם D3.32, מעניקה עקביות פנימית למודל קישור ה-tryptamine שנחזה, המשחזר את גיאומטריית הקישור הקנונית של ליגנדים אמינרגיים ברצפטורים של סרוטונין.

ישנם מספר שיקולים מתודולוגיים שיש להביא בחשבון בעת שחזור תהליך עבודה זה. שגיאות במבנה הקנוני או תרכובות המסומנות כ-Pan-assay interference compounds ((PAINS)) מופצות דרך חיזוי מטרות ועגינה (docking), מה שדורש בחירה מדויקת של מטבוליטים ואוצרות כימואינפורמטית. יש לצמצם סטים של מטרות המונעות על ידי רעש באמצעות החלה עקבית של קריטריוני הביטחון (חיזוי מטרות של אינטראקציית כימיקל-חלבון: ≥0.700; תוכנת עגינה מולקולרית: ≥0.70; בניית רשת אינטראקציית חלבון-חלבון והעשרה של מסלולים: ≥0.700). יש לקבץ את המטרות החזויות לפי קטגוריה תפקודית כדי למנוע אפיון שגוי של כל הגנים הקשורים למטבוליטים כרצפטורים. עיבוד מקדים מדויק של מבני PDB, מינימום אנרגיה של ליגנדים ומיקום רשת (grid) סביב שאריות קשירה ידועות הם היבטים חיוניים של העגינה, ובקרות ה-redocking וה-cross-docking המוצגות כאן מספקות מדד אובייקטיבי לנכונותה של מתודולוגיית העגינה. מעטפת השחזור בדינמיקה מולקולרית מוגדרת על ידי שילוב של פרמטריזציה של שדה כוחות (force-field), סולבציה תקינה או בניית ממברנה, שיווי משקל מדורג ודגימת ייצור נאותה.

התאמות טיפוסיות וצעדי פתרון בעיות כוללים הקלה בספי thresholds אם החיזוי של המטרה אינו מחזיר תוצאות, בדיקת העקביות הכיוונית ברמת הפרובה עבור גנים עם מספר פרובות, ופירוש של קשרי רשת בודדים בבניית רשת אינטראקציית חלבון-חלבון וצמתים של העשרה מסלולית ככאלה התלויים ב-threshold ולא כבלתי רלוונטיים ביולוגית. עבור רצפטורים של ממברנה, יש להשתמש בסימולציית שכבה דו-שומנית (lipid bilayer) מפורשת במקום בסימולציית תמיסות מימיות, כפי שמוסבר כאן בשיטת HTR2A. במקרים שבהם נדרש פירוק אנרגיה לכל שארית (per-residue energy decomposition), יש לבצע את החישוב באמצעות מנוע המסוגל לבצע פירוק, ויש להתאים את מספור השאריות המדווח למספור הרצפטור המקורי כדי למנוע דו-משמעות. אנו מציעים כי תוצאות של העשרה מסלולית יטופלו בצורה הטובה ביותר כהקשר ארגוני עבור רשימת המועמדים, ולא כתיקוף ברמת המסלול. מבחינה מכנית, העשרה של מונחי GPCR, serotonergic או איתות סידן תקרה בכל פעם שרשימת הגנים תכיל מספר גנים של רצפטור סרוטונין, ללא קשר לוויסות משותף (co-regulation) ברמת החלבון. יש לפרש את ערכי RMSD, Rg ו-RMSF עבור מערכת HTR2A המוטמעת בממברנה תוך התחשבויות בשכבה הדו-שומנית: ירידה ב-Rg במסלול (trajectory) המאוחר עשויה לשקף התאמה קונפורמציונית של צרור הטרנס-ממברנלי המונעת על ידי השכבה הדו-שומנית ולא פריסה גלובלית, ויש לפרש קשרי מימן עמידים בין הליגנד לחלבון יחד עם יציבות ה-RMSD הכללית.

המגבלות של מחקר זה הן משמעותיות ומגבילות את הפרשנות. המחקר התבסס על מערך נתונים ציבורי אחד קטן יחסית, וחיפוש במאגרי התמלול הציבוריים המרכזיים (כלי ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי מבוסס רשת ו-ArrayExpress) לא זיהה מערך נתונים עצמאי של תמלול רירית רקטום של IBS-C בעל עיצוב ופלטפורמה דומים שיכול היה לשמש כקבוצת שכפול במועד הניתוח. היעדר שכפול תמלול עצמאי הוא מגבלה מרכזית, ואין לפרש කිසි מההצהרות בכתב יד זה כתיקוף חיצוני של הממצאים ממערך הנתונים הבודד. מערך הנתונים מראה ביטוי דיפרנציאלי כמעט אוניברסלי (כ-94.5% מהגנים הם מובהקים, כאשר רובם המכריע הם בעלי ביטוי מופחת), תכונה ההופכת סטטיסטיקות העשרה קונבנציונליות לבלתי אינפורמטיביות ומונעת מסקנות לגבי הספציפיות של הפחתת הביטוי של גני מטרה ביחס לרקע הגנומי; לפיכך, החפיפה מדווחת כדפוס כיווני תיאורי ולא כהעשרה סטטיסטית. תמלול רירית מסוג Bulk אינו יכול להבחין בין ויסות גנים ממשי לבין שינויים בהרכב התאים. ביטוי mRNA אינו קובע את שפע החלבון או את התגובה התפקודית. מאגרי נתונים לחיזוי מטרות סובלים מהטיית אנוטציה, ותוצאות של docking, MD ו-MM-PBSA תלויות בבחירת השדה של הכוח (force field), פרמטריזציה של הליגנד, נקודת ההתחלה, זמן הסימולציה ומספיקות הדגימה. מזהי גרסה/בנייה מדויקים עבור חלק מרכיבי שרתי הרשת והחבילות, כולל שירות פרמטריזציה של ליגנדים תואם CHARMM, CHARMM-GUI וסביבת מחשוב סטטיסטי

גרסאות החבילות (package builds) והגרסאות המשניות של כלי חישוב אנרגיית הקשירה בשיטת המכניקה מולקולרית/ממס solvent-continuum לא היו ניתנות לשחזור מלא מרשומות הפרויקט שנשמרו, ויש לדווח עליהן כזמינות בטבלת החומרים הנפרדת. ערכי MM-PBSA הם הערכות יחסיות, אינם כוללים איבר מפורש של אנטרופיה קונפיגורציונית, ואין לפרשם כאפיניות ניסויית. המחקר חסר נתונים מטבוליים ואינו יכול לקבוע האם הזמינות של ליגנדים משתנה ב-IBS-C, או האם השינויים שנצפו בביטוי הם סיבות, תוצאות, תגובות פיצוי או קורלציות חסרות רלוונטיות.

יישומים עתידיים של שיטה זו צריכים לכלול שחזור טרנסקריפטומי עצמאי, תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ותיקוף ברמת החלבון, מיקום סוגי תאים באמצעות טרנסקריפטומיקה של תא בודד או טרנסקריפטומיקה מרחבית, פרופיל מטבולומי של מחלקות המטבוליטים הרלוונטיות, ובדיקות תגובה פונקציונליות לליגנדים בקולונידים המופקים מחולים, תרביות של רקמת רירית (explants) או מודלים דומים. השוואות עם קבוצות של IBS עם דומיננטיות לשלשול, IBS מעורב, מחלות מעי דלקתיות ועצירות שאינה קשורה ל-IBS^1,2 יעזרו בביסוס הספציפיות למחלה. עבור הרכיב המבני, שחזור מסלולי MD, ביצוע אנליזות רגישות עם תנוחות התחלה חלופיות, ותיעוד מלא של הפקדת הטופולוגיה, המסלולים וקבצי הקלט והפלט של MM-PBSA יחזקו עוד יותר את השחזוריות. בדיקות תגובה ניסיוניות לליגנדים נותרות הכרחיות כדי לקבוע האם הקומפלקסים שקיבלו עדיפות הם רלוונטיים מבחינה פונקציונלית; התוצאות הנוכחיות אינן תומכות בטענות קליניות או טיפוליות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AutoDock Vina	Scripps Research / קוד פתוח	v1.2.7; https://vina.scripps.edu/	עגינה מולקולרית (Molecular docking) של ליגנדים מטבוליים לחלבונים מטרה.
CGenFF/ParamChem	SilcsBio / אוניברסיטת מרילנד	v4.6; https://cgenff.com/	פרמטריזציה של שדה כוחות לליגנדים עבור דינמיקה מולקולרית.
CHARMM36m force field	מפתחי CHARMM / קוד פתוח	CHARMM36m; https://www.charmm.org/charmm/resources/charmm-force-fields/	שדה כוחות לחלבונים המשמש לסימולציות של דינמיקה מולקולרית.
CHARMM-GUI Membrane Builder	CHARMM-GUI / אוניברסיטת ליהיי	שרת רשת; גרסה מדויקת אינה ניתנת לשחזור; https://www.charmm-gui.org/?doc=input/membrane	בנייה והגדרת שיווי משקל של מערכת ממברנת POPC מפורשת.
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA (Dassault Systèmes)	2021; https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download	ניתוח דו-ממדי של אינטראקציות בין ליגנד לשאריות חלבון.
GEO2R	NCBI Gene Expression Omnibus	כלי רשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/	ניתוח ביטוי דיפרנציאלי של GSE36701.
GeneCards	מכון ויצמן למדע	מאגר נתונים ברשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.genecards.org/	אימות סמלי גנים ומידע על גנים במהלך סטנדרטיזציה של מטרות.
gmx_MMPBSA	קוד פתוח (Valdés-Tresanco et al.)	1.5.x; https://valdes-tresanco-ms.github.io/gmx_MMPBSA/	הערכת אנרגיית קשירה חופשית בשיטת MM-PBSA ופירוק לפי שארית.
GROMACS	צוות פיתוח GROMACS / קוד פתוח	2024.2; https://www.gromacs.org/	מנוע לסימולציית דינמיקה מולקולרית.
GSE36701 transcriptomic dataset	NCBI Gene Expression Omnibus	GSE36701; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36701	מאגר נתוני ביטוי ציבורי של רירית רקטום IBS-C.
Open Babel	קוד פתוח	3.2.0; https://openbabel.org/	המרה של פורמטים של קבצים כימיים, יצירת ליגנדים תלת-ממדיים והכנת ליגנדים.
OPM database	אוניברסיטת מישיגן	מאגר נתונים ברשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://opm.phar.umich.edu/	קואורדינטות של Orientation of Proteins in Membranes המשמשות ליישור של HTR2A.
ParmEd	מפתחי ParmEd / קוד פתוח	4.x; https://parmed.github.io/ParmEd/html/index.html	חלוקה מחדש של מסת מימן ועיבוד טופולוגיה לסימולציה מולקולרית.
PyMOL	Schrödinger / קוד פתוח	2.x; https://www.pymol.org/	ויזואליזציה מבנית תלת-ממדית ואיורי רספטור-ליגנד.
RCSB Protein Data Bank	RCSB PDB	מאגר נתונים ברשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.rcsb.org/	מקור למבני חלבונים ניסיוניים וקואורדינטות PDB.
STITCH	קונסורציום STITCH (EMBL)	v5.0; https://stitch.embl.de/	חיזוי מטרות לאינטראקציות כימי-חלבוניות.
STRING	קונסורציום STRING / ELIXIR	v12.0; https://version-12-0.string-db.org/	בניית רשת אינטראקציות חלבון-חלבון והעשרה של נתיבים.
SwissADME	SIB Swiss Institute of Bioinformatics / אוניברסיטת לוזאן	כלי רשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.swissadme.ch/	דסקריפטורים כימואינפורמטיים, תחזיות פרמקוקינטיות והערכת PAINS.
SwissTargetPrediction	SIB Swiss Institute of Bioinformatics / אוניברסיטת לוזאן	כלי רשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.swisstargetprediction.ch/	חיזוי מטרות חלבון אנושי המבוסס על ליגנדים.
UniProt ID Mapping	קונסורציום UniProt	שירות רשת; נגיש בינואר-מאי 2026; https://www.uniprot.org/id-mapping	מיפוי מזהי חלבונים לסמלי גנים סטנדרטיים מאושרים על ידי HGNC.
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; גרסת CUDA/דרייבר לא צוינה במאמר	מעבד גרפי תומך CUDA ששימש לסימולציות של דינמיקה מולקולרית.
CUDA-compatible GPU	NVIDIA Corporation	גרסת CUDA toolkit לא צוינה במאמר; ≥8 GB VRAM	GPU תומך CUDA עם ≥8 GB VRAM; תחנת העבודה דרשה גם ≥32 GB RAM ומעבד בעל 6 ליבות.
Ubuntu Linux	Canonical Ltd. / קוד פתוח	22.04 LTS	מערכת הפעלה לינוקס 64 סיביות.
Python 3.9	Python Software Foundation	3.9	סביבת תכנות למטרות כלליות ששימשה לכתיבת סקריפטים של זרימת עבודה וניתוח.
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI / הספרייה הלאומית לרפואה של ארה"ב	מאגר רשת ציבורי; גרסת תוכנה לא צוינה במאמר	מאגר נתוני גנומיקה פונקציונלית ציבורי.
AutoDockTools/MGLTools	מעבדה לגרפיקה מולקולרית, Scripps Research	1.5.7	ערכת כלים להכנת מבנה מולקולרי וקלט לעגינה.
GROMACS analysis tools	צוות פיתוח GROMACS / קוד פתוח	2024.2	כלי עזר לניתוח מסלולי דינמיקה מולקולרית.
CHARMM-GUI six-step protocol	CHARMM-GUI / אוניברסיטת ליהיי	פרוטוקול רשת; גרסה מדויקת אינה ניתנת לשחזור	תהליך עבודה רב-שלבי מבוסס רשת להכנה ושיווי משקל של מערכות מולקולריות.
cgenff_charmm2gmx_py3.py	סקריפט המרה בקוד פתוח; המקור לא צוין במאמר	גרסה לא צוינה במאמר	סקריפט להמרת טופולוגיה של שדה כוחות.
Python	Python Software Foundation	3.9	סביבת תכנות למטרות כלליות.
SciPy	קהילת SciPy / קוד פתוח	גרסה לא צוינה במאמר	ספריית מחשוב מדעי.
scipy.stats.fisher_exact	קהילת SciPy / קוד פתוח	גרסת SciPy לא צוינה במאמר	מימוש של מבחן פישר המדויק (Fisher’s exact test).
R	R Foundation for Statistical Computing	4.3.x	סביבת מחשוב סטטיסטי.
Bioconductor	פרויקט Bioconductor / קוד פתוח	3.18	מסגרת תוכנה לביואינפורמטיקה.
limma	פרויקט Bioconductor / קוד פתוח	גרסה לא צוינה במאמר	חבילה לניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי.
Benjamini–Hochberg procedure	שיטה סטטיסטית	לא רלוונטי (הליך סטטיסטי)	שיטת התאמה של שיעור התגליות השגויות (FDR).
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; גרסת CUDA/דרייבר לא צוינה במאמר	מעבד גרפי עם לפחות 8 GB של זיכרון וידאו.
CUDA-compatible GPU	NVIDIA Corporation	גרסת CUDA toolkit לא צוינה במאמר; ≥8 GB VRAM	מעבד גרפי התומך בחישוב מקבילי למטרות כלליות.
Ubuntu Linux 22.04 LTS	Canonical Ltd. / קוד פתוח	22.04 LTS	מערכת הפעלה לינוקס 64 סיביות.
TIP3P	מפתחי שדה כוחות CHARMM / קוד פתוח	TIP3P; גרסת תוכנה לא רלוונטית	מודל מים מפורש בעל שלושה אתרים.
MM/PBSA	מפתחי gmx_MMPBSA / קוד פתוח	gmx_MMPBSA 1.5.x	שיטת אנרגיית קשירה של מכניקה מולקולרית/שטח פני פואסון–בולצמן.