מאמר שיטה

הכנת דגימות מח עצם מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפרפין עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית באמצעות דה-קלציפיקציה מבוססת EDTA

162 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72474

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

במאמר זה

סיכום

תהליך עבודה סטנדרטי להכנת דגימות עצם מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפרפין (FFPE) עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית כולל שלב דקלציפיקציה של 10 ימים באמצעות EDTA כדי לשמר את שלמות ה-RNA. נקודות בקרה מרכזיות לאיכות מסייעות לקבוע האם הדגימות עומדות בדרישות עבור ניתוח ביטוי גנים מרחבי בהמשך התהליך.

תקציר

מוח העצם (BM) הוא מבנה מורכב ודינמי שבו מערכות יחסים מרחביות משפיעות על התנהגות התאים, על האיתות ועל התפקוד. בשל כך, הבנת הדינמיקה המלאה של אינטראקציות תאיות דורשת טכניקות מרחביות משלימות המשמרות וממפות את ארכיטקטורת אוכלוסיות התאים in situ. למרות התקדמויות משמעותיות בטכנולוגיות של תא בודד שתרמו להבנת ההטרוגניות השעתוקית של רקמת BM בריאה וחולה, הארגון המרחבי של סוגי תאים שונים, תוכניות ויסות ספציפיות לנישה והאינטראקציות ביניהם עדיין דורשים מחקר נוסף. פיתוחים אחרונים בטרנסקריפטומיקה מרחבית אפשרו ניתוח ביטוי גנים לא מוטה עם הקשר מרחבי ברקמות שונות, מה שהופך טכנולוגיות אלו למשלימות לשיטות של תא בודד החסרות רזולוציה מרחבית. בעוד שטרנסקריפטומיקה מרחבית נמצאה בשימוש נרחב ברקמות רכות, השימוש בה ברקמות ממינרליזציה כגון BM נותר מוגבל בשל האתגרים הקשורים לעיבוד רקמת עצם. הפרוטוקול המוצג כאן שימש להכנת דגימות מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפראפין (FFPE) מרקמות בריאות וחולות של עכבר ובני אדם. שלב דה-קלציפיקציה (הסרת סידן) של 10 ימים המבוסס על ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) נכלל כדי לשמר את שלמות ה-RNA ולתמוך בשימוש בטרנסקריפטומיקה מרחבית בדגימות של עצמות ארוכות. פרוטוקול זה מתאר את הכנת דגימות BM לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי, כולל עיבוד רקמה, שימור וחיתוך, כמו גם שלבי הערכת איכות חיוניים, כגון הערכת שלמות החתך, מורפולוגיית הרקמה ואיכות ה-RNA. זרימת העבודה תומכת גם בזיהוי סוגי תאים ובאינטגרציה עם נתוני טרנסקריפטומיקה של תא בודד כדי לאפיין את ההרכב התאי, להגדיר אינטראקציות תא-תא, ולהדמיות של ההפצה המרחבית של תאים הטרוגניים שעתוקית במצבים בריאים וחולים. באופן כללי, זרימת עבודה זו מכינה רקמות בריאות וממאירות ממינרליזציה מלאה לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי תוך שימור ארכיטקטורת ה-BM.

מבוא

מח העצם (BM) הוא איבר מורכב מאוד ומחולק למדורים, המשמש כאתר העיקרי להמטופואזה ולהבשלה של תאי מערכת החיסון1,2. רקמה הטרוגנית זו כוללת מגוון רחב של שושלות תאים המטופואטיים, מזנכימליים, אנדותליאליים ותאי חיסון, אשרים קיימים יחד בנישה תלת-ממדית מאורגנת ומסובבת מאוד3,4. בתוך נישה זו, כל אוכלוסיית תאים תופסת טריטוריות אנטומיות נפרדות, וההקשר המרחבי ממלא תפקיד בסיסי בבקרת ההתנהגות התאית, באיתות ובתפקוד4,5. קרבה פיזית למבנים ספציפיים, כגון עצם טרבקולרית או רשתות כלי דם, מנהלת תהליכים פיזיולוגיים חיוניים, כולל שמירה על מצב של רדום (quiescence) של תאי גזע המטופואטיים (HSC) ועיצוב מחדש של העצם6,7. כתוצאה מכך, מיקרו-סביבה דינמית זו והאינטראקציות המבוקרות בקפידה בין מרכיביה התאיים והסטרומליים מעצבות את רשתות הבקרה השומרות על ההומאוסטזיס ומשפיעות על התקדמותן של מחלות המטולוגיות ממאירות8,9,10,11,12,13.

ההתקדמויות בריצוף RNA של תאים בודדים (scRNA-seq) חוללו מהפכה בהבנתנו את הגיוון התאי של מח העצם (BM), ואפשרו את גילוים של תתי-סוגי תאים שלא זוהו בעבר ואת האינטראקציות החזויות ביניהם בתוך הנישה3,10,11,12,14,15,16. עם זאת, טרנסקריפטומיקה של תאים בודדים, למרות שהיא מציעה מידע ברזולוציה גבוהה על המרכיבים האינדיבידואליים של הנישה ההמטופויטית, מוגבלת מטבעה על ידי תהליך עיכול הרקמה, המפריד את התאים מסביבתם הטבעית ועלול לשנות את מצבם הטבעי17, ועל ידי היעדר ההקשר המרחבי המגדיר את ארגון רקמת העצם4,18. אובדן זה של ההקשר המיקומי הופך את המיפוי המכריע של מקומם של אוכלוסיות ספציפיות המובחנות טרנסקריפציונית, או את האופן שבו הן מקיימות אינטראקציה עם תאים שכנים, לבלתי אפשרי19. יתרה מכך, רקמת עצם צפופה מופרדת לעיתים קרובות באופן חלקי בלבד, מה שמוביל לתת-ייצוג של אוכלוסיות תאים מרכזיות, כגון אוסטאוציטים ואדיפוציטים, במאגרי נתוני scRNA-seq ולייצוג מוטה של ההטרוגניות של הרקמה20,21. טרנסקריפטומיקה מרחבית מאפשרת את חקר ביטוי הגנים in situ, בתוך חתכי רקמה שנשמרו מרחבית, ובכך משחזרת מידע הקשרי ומענייה על המגבלות של טכנולוגיות תאים בודדים8,19,22,23,24,25,26. טכנולוגיה זו מהווה התקדמות חיונית בתחום, שכן היא מאפשרת מיקום מרחבי מדויק וארגון מבני של אוכלוסיות התאים השונות המרכיבות את ה-BM, דבר שאינו ניתן להשמטה להבנת האינטראקציות והתפקידים התפקודיים שלהן בתוך המיקרו-סביבה הטבעית שלהן8,26. יתר על כן, בהקשר של מחלה, טרנסקריפטומיקה מרחבית מאפשרת לחוקרים ולקלינאים לגשר על הפער בין פתולוגיה מסורתית לגנומיקה עם תפוקה גבוהה, מה שמאפשר להם להלביש נתונים מולקולריים על תמונות מורפולוגיות1,8. ניתן לסווג טכנולוגיות של טרנסקריפטומיקה מרחבית לשתי קבוצות עיקריות: שיטות מבוססות ריצוף ושיטות מבוססות דימוי17,24. פלטפורמות מבוססות ריצוף, כגון Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq), ו-Open-ST בקוד פתוח, לוכדות mRNA על מערכים או חרו지를 בעלי ברקודים מרחביים לפני ריצוף מהדור הבא. שיטות מבוססות דימוי, הכוללות Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX, ו-Xenium, מדמיות ישירות טרנסקריפטים in situ באמצעות היברידיזציה מרובת-ערוצים (multiplexed) או כימיה של פרובים מסוג padlock27,28. לחלופין, ניתן לסווג פלטפורמות כבעלות מטרה (targeted) או חסרות מטרה (untargeted), בהתאם לשאלה אם הן דורשות זיהוי מבוסס פרובים17,24.

שיטות של טרנסקריפטומיקה מרחבית יושמו בקלות ברקמות רכות, כגון המוח, הלב והכבד, שבהן יצירת חתכים היסטולוגיים שלמים היא פשוטה29,30,31. לעומת זאת, יישום של טרנסקריפטומיקה מרחבית בעצם הוא מאתגר הרבה יותר בשל טבעו המינרלי, הדורש תהליך של דה-קלציפיקציה (הסרת סידן)32,33, הסרה מבוקרת של סידן-פוספט, ההופכת את הרקמה לרכה מספיק לצורך חיתוך ואנליזות היסטולוגיות או מולקולריות המשך8,20,23,34. שיטות דה-קלציפיקציה מסורתיות המשמשות באופן שגרתי בפרקטיקה קלינית מסתמכות בדרך כלל על תמיסות חומציות חריפות כגון חומצה כלורית, חומצה חנקית, חומצהה פורמית או חומצה זרחתית, אשר פוגעות קשות בשלמות ה-RNA ומשבשת את המורפולוגיה התאית35,36. דגרדציה מולקולרית שכזו מפחיתה את יחס signal-to-noise בבדיקות מרחביות, מה שמוביל לעיתים קרובות לשיעורי זיהוי גנים נמוכים באופן בלתי קביל בהשוואה לרקמות רכות8,10. מגבלה זו מדגישה את הצורך בזרימות עבודה סטנדרטיות של דה-קלציפיקציה המשמרות באופן מהימן את שלמות ה-mRNA בדגימות מינרליות לצורך אנליזות מרחביות מבוססות ריצוף8,20.

פרוטוקול זה מציג תהליך עבודה סטנדרטי להכנת דגימות מח עצם (BM) מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפרפין (FFPE) עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית, כפי שיושם בעבר על ידי Muiños-Lopez et al.8. תהליך העבודה כולל שלב דקאלציפיקציה (הסרת סידן) של 10 ימים באמצעות ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ב-pH מבוקר. בניגוד לחומצות אגרסיביות, EDTA פועל ככלטור עדין המשמר את המבנה המיקרוסקופי ושומר על איכות החומצות הגרעיניות, ובכך תומך בשימושו ביישומים מולקולריים8,20,33,36,37. כהוכחה לקונספט, הפרוטוקול יושם על דגימות רקמת עצם ממודלים של עכברים בריאים ועכברים עם מיאלומה נפוצה (MM), וכן על דגימות מח עצם אנושיות מאנשים בריאים וחולים, ולאחר מכן הדגימות רצפו בפלטפורמת Visium Spatial Gene Expression38. תהליך העבודה כולל פרוצדורות סטנדרטיות לרכישת רקמה מדגימות עצם אנושיות ועכבריות, קיבוע, דקאלציפיקציה, דהידרטציה, הטמעה בפרפין וחיתוך, ולאחריהם תהליך בקרת איכות מקיף הכולל הערכת שלמות החתכים, צביעת hematoxylin and eosin (H&E), הערכת איכות RNA (DV200), ואימונופלואורסצנציה (IF) אופציונלית לאימות סוגי תאים. שלבים מקדימים אלו מבטיחים שרק חתכים באיכות גבוהה יעברו לתהליכי העבודה של טרנסקריפטומיקה מרחבית במורד הזרם, כולל עיבוד מקדים של חתכי הרקמה, בניית ספריות, רצוף ובקרת איכות וניתוח נתונים לאחר מכן.

פרוצדורה סטנדרטית זו תומכת בהכנה ובהערכת איכות של דגימות BM אנושיות ועכבריות לצורך ניתוח טרנסקריפטומי מרחבי. היא נועדה להקל על חקירת תוכניות בקרה ספציפיות לנישה בהפרעות המטולוגיות ושלדיות.

פרוטוקול

כל ניסויי בעלי החיים נערכו בהתאם להנחיה האירופית 2010/63/EU בדבר הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת נבארה (Comité de Ética para la Experimentación Animal; פרוטוקולים CEEA082-20 ו-CEEA039-20). הטיפול בבעלי החיים, המניפולציות וההמתת החסד בוצעו בהתאם לחקיקה הספרדית כדי למזער כאב וסבל.

המחקר בבני אדם אושר על ידי ועדת אתיקה במחקר של בית הספר לרפואה באוניברסיטת נבארה (Comisión de Ética de Investigación, CEI; פרויקטים 202.10mod1 ו-2023.172) ועל ידי ועדת אתיקה במחקר של שירותי הבריאות של נבארה (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_202/92 MS-1). כל ההליכים שכללו משתפים אנושיים בוצעו בהתאם לעקרונות האתיים של הצהרת הלסינקי. נתונים אישיים טופלו בסודיות בהתאם לחוק האורגני הספרדי 3/2018 להגנה על נתונים אישיים והבטחת זכויות דיגיטליות ולחוק הספרדי 14/207 על מחקר ביו-רפואי.

הערה: רשימה מפורטת של הרכיבים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעה ב- טבלת חומריםפsparsity של תהליך העבודה הניסויי המקיף ליישום טרנסקריפטומיקה מרחבית ברקמות עצם מוצגת באופן סכמטי ב- איור 1 ומאורגנים לשלושה שלבי ביצוע: רכישת דגימות, בקרת איכות (QC) ואפיון טרנסקריפטומי מרחבי. רכישת דגימות כוללת איסוף של רגמי עצם אנושיים או של עכברים, ולאחריהם קיבוע, דקלציפיקציה באמצעות EDTA, דהידרציה, הטמעה בפאראפין, חיתוך והכנת סליידים. שלב בקרת האיכות מעריך את השלמות ההיסטולוגית ואת שימור ה-RNA. חיתוכי עצם מאושרים עוברים לאחר מכן פרמבליזציה של הרקמה על גבי הסלייד, הכנת ספרייה, רצף וניתוח נתונים.

עיבוד רקמת עצם: קיבוע, דה-קלציפיקציה (הסרת סידן), דהידרטציה; תרשים זרימה של תהליך טרנסקריפטומיקה מרחבית.
איור 1תהליך איסוף דגימות והכנה מבוססת EDTA עבור רקמות עצם של עכברים ובני אדם. נאספים דגימות של עצמות רחב של עכברים ודגימות עצם אנושיות, אשר עוברות קיבוע, דקלציפיקציה ב-EDTA, דהידרציה, הטמעה בפראפין וחיתוך. איכות הדגימות מוערכת באמצעות H&צביעת H&E והערכת שלמות ה-RNA (DV20), ולאחריהן עיבוד מקדים של רקמה לטרנסקריפטומיקה מרחבית, הכנת ספרייה, ריצוף ובקרת איכות של הנתונים. קיצורים: BM = מחית עצם; DV20 = אחוז מקטעי ה-RNA הארוכים מ-20 נוקלאוטידים; EDTA = אתילנדיאמינטטרהאצטיקה; H&E = המטוקסילן ואוזין&E = המטוקסילין ואאוזין; QC = בקרת איכות. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. השגה ועיבוד של דגימות רקמת עצם

  1. איסוף עצמות עכברים
    1. הרדימו את בעלי החיים באמצעות 5% isoflurane ואשרו את היעלמות הרפלקסים.
    2. לאחר השגת הרדמה מלאה, בצעו הומטזיה באמצעות נתיקה צווארית בהתאם להנחיות המוסדיות והרגולטוריות.
      הערה: יש לבצע את ההמתה על ידי צוות מיומן, ויש לוודא את קביעת המוות לפני תחילת איסוף הרקמות.
    3. חטה את העור על ידי ריסוס אתנול 70% על פני השטח הגבי של העכבר, ובעזרת מספריים כירורגיים, בצע חתך קטן כדי להסיר בזהירות את העור ולחשוף את הגפיים האחוריות.
    4. בצעו דיסקציה של הגפיים האחוריות על ידי חיתוך מעל מפרק הירך והעבירו אותן למבחנה של 50 מ"ל המכילה 10 מ"ל של Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) קר. הניחו את המבחנה על קרח.
    5. הסיר שרירים ורקמת חיבור צמודים באמצעות פינצטה סטרילית וסכין מנתחים.
    6. העבירו את העצמות למכל סטרילי בנפח 50 מ"ל הממולא מראש ב-DPBS קר ונקי, ולאחר מכן הניחו את המכל על קרח.
    7. יש לבצע מיד קיבוע של דגימות הרקמה על מנת לשמר את שלמותן.
  2. טיפול בדגימות עצם אנושיות
    1. קבלו ביופסיות של גלי עצם או רסי עצם כירורגיים בתוך מכלים סטריליים בנפח 10 מ"ל.
    2. העבירו את רסי העצם למכל סטרילי ונקי בנפח 10 מ"ל, שמולא מראש ב-DPBS קר, ולאחר מכן הניחו אותו על קרח.
    3. יש לבצע מיד קיבוע של הדגימה על מנת לשמור על שלמות הרקמה.
      זהירות: יש לטפל בדגימות אנוש תחת תנאי BSL 2.
  3. קיבוע רקמת עצם
    1. קחו את המכל בנפח 50 מ"ל או 10 מ"ל המכיל את דגימת העצם והשליכו את ה-DPBS.
    2. סמנו את הקסטות מפלסטיק והכניסו את דגימות העצם לקסטות נפרדות. סגרו את המכסים היטב כדי למנוע אובדן רקמה במהלך שלבי העיבוד הבאים.
      הערה: עבור דגימות עכבר, יש להניח עצם אחת בכל קסטה. עבור דגימות עצם אנוש, במידת הצורך, השתמשו בסכין ניתוח (scalpel) סטרילית כדי לחתוך את הרקמה לשברים קטנים מספיק כדי שייכנסו לקסטות סטנדרטיות, והניחו שבר אחד בכל קסטה. אם דגימות עצם אנוש קשות מדי לחיתוך בשלב זה, ניתן להשאירן שלמות ולהעבירן לתמיסת דקלציפיקציה (הסרת סידן); לאחר הדקלציפיקציה, ניתן לחתוך את הרקמה שהתרככה לשברים בגודל מתאים ולהניחם בקסטות מסומנות.
    3. הוסף תמיסת פורמלידהيد עם בופר בריכוז 4% ביחס של 1:20 בין הדגימה למקבע, והדגרה את הדגימה למשך 24 שעות ב- 4 °C.
      זהירות: יש לטפל במקבע בתוך מCה מנדף כימיים בשל רעילותו ואדיו הנדיפים.
      הערה: הימנעו מקיבוע יתר (over-fixation)>(48 שעות), דבר המפחית את שלמות ה-RNA בתהליכי עבודה של FFPE39.
  4. דה-קלציפיקציה של רקמת עצם ממינראלית
    1. יש להשליך את הפורמלין ולשטוף את דגימת העצם במים אולטרה-טהורים. יש לשטוף במים, לנער קלות ולהשליך, כדי להסיר כל שארית פורמלין שנותרה.
    2. הכינו תמיסת EDTA בריכוז 0.25 M במים אולטרה-טהורים (ultrapure water) והתאימו את ה-pH ל-6.95.
      הערה: למרות שבפרוטוקולי דה-קלציפיקציה (הסרת סידן) מסורתיים נהוג לכוון את ה-EDTA ל-pH 8.0, זרימת עבודה זו משתמשת ב-EDTA ב-pH של כ-6.95, כדי לתמוך בקיレーション יעיל תוך שימור המורפולוגיה של הרקמה ואיכות ה-RNA.8.
    3. הוסיפו את תמיסת ה-EDTA למכל המכיל את דגימת העצם והדגירו למשך 10 ימים ב- 4 °C עם ערבוב עדין.
      הערה: עבור דגימות עכבר, כמות של כ-50 מ"ל של תמיסת EDTA היא בדרך כלל מספיקה. עבור דגימות עצם אנושיות, נעשה שימוש בכ-10 מ"ל בדרך כלל. עם זאת, ניתן להתאים נפח זה בהתאם לגודל העצם כדי להבטיח טבילה מלאה ודקלציפיקציה יעילה.
    4. לאחר 5 ימי דה-קלציפיקציה (הסרת סידן), יש להשליך את תמיסת ה-EDTA ולהחליפה בנפח זהה של EDTA טרי, מכיוון שקיבולת הקיליציה הופכת לרוויה עם הזמן. יש להמשיך בדגירה תחת אותם תנאים.
    5. לאחר 10 ימי דגירה, יש להשליך את תמיסת ה-EDTA ולהעריך האם תהליך דה-הסידן (decalcification) הושלם.
      1. בצעו חתך קטן באמצעות סכין מנתחים (scalpel) סטרילית או הכניסו מחט סטרילית דקה לפינה או לאזור פריפרי לרקמה, תוך בחירה תמידית באזור בעל רלוונטיות אנליטית נמוכה כדי להימנע משינוי של אזורי העניין. הניחו את העצם על צלחת פטרי סטרילית כדי לייצב את הדגימה במהלך החיתוך או החדרת המחט. אם ניתן לחתוך את הרקמה בקלות או אם המחט עוברת דרכה בהתנגדות מינימלית, הדגימה עברה דקאלציפיקציה (הסרת סידן) נאותה.
      2. במקרה של פמור (עצם ירך) של עכברים, כופפו בעדינות את העצם בעזרת פינצטה כדי להעריך את הגמישות שלה, המהווה אינדיקטור מהימן להסרה מלאה של המינרלים.
        הערה: משך שלב דה-הקלציפיקציה (הסרת הסידן) תלוי בגודל ובעובי דגימת העצם, וכן בנפח ה-EDTA שנעשה בו שימוש. אם העצם נותרת קשיחה לאחר תקופת הדגירה הראשונית, יש להמשיך בתהליך דה-הקלציפיקציה עד שהרקמה תהיה רכה מספיק כדי שניתן יהיה לחתוך אותה בקלות. הארכה מופרזת של התהליך עלולה לפגוע באיכות הרקמה וביציבות ה-RNA, ולכן יש להגביל את ההארכה לזמן המינימלי הנדרש להשגת ריכוך הולם.20.
  5. התייבשות
    1. שטפו על ידי הוספת מים היפר-טהורים (ultrapure water) למכל המכיל את דגימת העצם, ולאחר מכן הדגירו למשך 5 דקות ב- 4 °C עם ערבוב.
    2. שפכו את המים והחליפו אותם בתמיסת אתנול 70%. הדגירה תתבצע במשך שעה אחת ב- 4 °C.
      הערה: שלב זה יכול לשמש כנקודת עצירה. ניתן לאחסן דגימות באתנול 70% ב- 4 °C לפני המעבר לשלבים הבאים. משך האחסון המקסימלי לא תוקף ניסויית בפרוטוקול זה, ולכן על המשתמשים לפעול בהתאם לנהלי העבודה הסטנדרטיים במעבדתם.
    3. בצעו דהידרציה רצופית של הדגימה בריכוזים עולים של אתנול (70%, 80%, 96%; שעה אחת בכל ריכוז ב- 4 °C), ולאחר מכן ב-10% אתנול למשך לילה ב- 4 °C.
    4. יש להשליך את האתנול בריכוז 100% ולהחליפו בקסילן (xylene). יש להדגיר למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. יש להשליך את הקסילן ולהניח את קסטת הדגימה בכלי זכוכית המכיל פראפין נקי ומומס. יש להדגיר בפראפין מומס למשך לילה בטמפרטורה של 60 °C.
      הערה: ניתן להשתמש בזמני חדירה קצרים יותר כאשר קיימות מערכות עיבוד בסיוע ואקום, שכן מכשירים אלה מקלים על חדירה יעילה יותר של פאראפין40,41,42.
      אזהרה: יש לבצע את כל השלבים הכוללים שימוש בקסילן (xylene) ובתמיסות אתנול בריכוזים מדורגים בתוך מapay fume hood (מכסה כימית) כדי להבטיח אוור תקין ולמזער חשיפה לאדי רעילים ודליקים.
  6. טמיעה בפרפין
    הערה: נקו את משטחי תחנת הקיבוע (embedding station) באמצעות תמיסה לדה-קונטמינציה של RNase כדי למנוע פירוק של RNA.
    1. הפעל את תחנת ההטמעה וחמם מראש את מאגר הפרפין, את אמבט הפרפין לקסטות, את אמבט הפרפין לתבניות ואת פלטת חימום התבניות ל- 60 °Cהפעילו את הפלטה הקרה כדי לאפשר לה להתקרר לפני השקיעה.
    2. יש להמתין עד להמסה מלאה של הפרפין, ורק לאחר מכן להניח את הקסטות המכילות דגימות מחלחלות פרפין לאמבט הפרפין לקסטות. יש לדגור למשך 2 שעות כדי להבטיח סילוק מלא של הקסילן לפני השקיעה.
    3. הניחו את כל התבניות הדרושות באמבט הפרפין לתבניות.
      הערה: עבור דגימות אנושיות, השתמשו בתבניות שיכון מתכתיות סטנדרטיות. עבור דגימות עכברים, השתמשו בתבניות שיכון פלסטיות התואמות לפלטפורמת Visium, הכוללות חל ריבועי בממדים המתאימים להנחה נכונה של חתכים על שקופיות Visium. מכיוון שעצמות עכבר שלמות אינן נכנסות במלואן לחל הריבועי של תבניות אלו, חתכו את העצמות מיד לפני השיכון באמצעות סקלפל סטרילי כדי לקבל פרגמנטים בגודל מתאים. ניתן לשכן פרגמנט עצם אחד או שניים בכל תבנית, בהתאם לממדיהם.
    4. הוסיפו שכבה בסיסית דקה של פאראפין טרי על ידי מזיגת פאראפין מומס מפתח היציאה המרכזי של תחנת השקיעה.
    5. פתחו את הקסטרה והעבירו בעדינות את הרקמה מהקסטרה לתבנית באמצעות פינצטה חמה.
    6. הניחו את התבנית הממולאת פאראפין על פלטת חימום התבניות, ובזמן שהפאראפין נשאר נוזלי, כווינו את הרקמה למישור החיתוך הרצוי באמצעות פינצטה חמה.
    7. הניחו את התבנית על המשטח הקר של תחנת השיכון כדי לקבע לזמן קצר את מיקומו של שברי העצם.
    8. מלאו את התבנית באופן מלא בפראפין מומס מהמתקן, תוך וידוא שהרקמה מכוסה לחלוטין ושלא נותרו בועות אוויר גדולות.
    9. מקמו את הקסטה המסומנת מעל התבנית, כך שתהווה את בסיסו של בלוק הפרפין.
    10. העבירו את התבנית, כשהקסטה מחוברת אליה, אל הפלטה הקרה של תחנת ההטמעה. המתינו 10 דקות עד להתגבשות מלאה של הפרפין, עד שהבלוק יהיה אטום ומוצק.
    11. לאחר שהחומר התמצק, הוצא את בלוק הפרפין מהתבנית ואחסן אותו ב- 4 °C עד לשלב החיתוך.
      הערה: שלב זה יכול לשמש כנקודת עצירה. ניתן לאחסן את בלוק הפרפין ב- 4 °Cעם זאת, בכל פעם שהדבר אפשרי, יש לבצע את חיתוך הרקמה ואת ניתוחי התעתוק המרחביים (spatial transcriptomic analyses) העוקבים בהקדם האפשרי לאחר ההטמעה (embedding), כדי למזער את פירוק ה-RNA במהלך האחסון.43,44.
  7. חיתוך והכנת סמפיסלות
    הערה: יש לנקות את המיקרוטום ואת אמבט המים באמצעות תמיסה לדה-קונטמינציה של RNase כדי למנוע פירוק של RNA.
    1. מלאו את מקבץ המים במים מזוקקים וחממו אותו מראש ל- 42 °Cהפעילו את המיקרוטום והתקינו להב חדש. סמנו את הפלשריות של המיקרוסקופ באמצעות עיפרון.
    2. מקמו את בלוק הפרפין במחזיק הדגימות, תוך הבטחה כי הקסטה מכוונת בהתאם למישור החיתוך האורכי הרצוי.
      הערה: הכינו שקית פלסטיק מלאה בקרח, וכאשר החיתוך הופך לקושי עקב ריכוך הפרפין, הניחו את שקית הקרח ישירות על הבלוק בעודו מורכב במיקרוטום, והדקירו אותה באמצעות גומייה למשך מספר דקות כדי להקשיח את הפרפין ולשפר את איכות החיתוכים.
    3. כוון את עובי החתך במיקרוטום ל- 20 µm ובצע את חיתוכי הקיטום.
    4. שנה את הגדרת המיקרוטום ל- 5 µmאסוף ארבעה 5 µm לחלקים לתוך מבחורת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, המסומנת ונקיּה מ-RNase. יש לשמור את המבחורה על קרח יבש ולאחסן ב-80 °C.
    5. המשך את החיתוך ב- 5 µm והצופו את סרטי הרקמה במבן המים. לאחר שהחתך התרחב במלואו ונפש מקמטים, הסירו אותו בעזרת השקף המסומן.
      1. בכל מספר קבוע של חתכים (למשל, בכל 5-10 סרטים, בהתאם לגודל הרקמה), אספו 4 נוספים של 5 µm חלקים אל תוך מבחנה חדשה עם תווית בנפח 1.5 מ"ל. חזור על תהליך זה עד לקבלת סך הכל של שלוש מבחנות בנפח 1.5 מ"ל המכילות 5 µm סעיפים
        הערה: אם הרקמה נסדקת, נשברת, או שלא ניתן להוציא ממנה פסקיה רציפה, הדגימה אינה דה-קלציפית (בעלת הסרת סידן) באופן מלא ודורשת זמן דה-קלציפיקציה נוסף. השג את הדגימה בחזרה על ידי ביצוע הפוך שלבי העבודה עד להגעה לשלב הדה-קלציפיקציה. לשם כך, המס את בלוק הפרפין ב- 60 °C במשך כשעתיים, והעבירו את הדגימה לקסילן (xylene) (שעתיים). בצעו רהידרציה לדגימה באמצעות תמיסות אתנול בריכוזים מדורגים (100%, 96%, 80%, 70%) ולאחר מכן במים מזוקקים. החזירו את הדגימה שעברה רהידרציה ל-EDTA 0.25 M טרי (pH 6.95) והאריכו את תקופת הדה-קלציפיקציה (הסרת הסידן) לפי הצורך, לפני שתמשיכו בשלבי דהידרציה, הטמעה מחדש וחיתוך. יש להשתמש בהליך שחזור זה אך ורק כאפשרות אחרונה, שכן ביטול תהליך ה-FFPE עלול לפגוע בשלמות ה-RNA.
    6. הניחו את השקופיות בתוך 37 °C בתנור למשך לילה כדי לאדות כל שארית מים, ולאחר מכן אחסן אותם ב- 4 °C.
    7. כדי לשפר את היצמדות הרקמה, ניתן באופן רשות לאפות את השקופיות למשך 3 שעות ב- 42 °C לפני דגירה שלהם למשך לילה ב- 37 °C.
      הערה: שלב זה בדרך כלל אינו נחוץ בעת שימוש בעשויות הזכוכית המפורטות ב- טבלת חומריםכיוון ששקופיות אלו מספקות היצמדות חזקה והרקמה נותרת בדרך כלל קשורה היטב לאורך כל תהליך העיבוד. שלב זה יכול לשמש כנקודת עצירה. ניתן לאחסן את השקופיות ב- 4 °C; עם זאת, במידת האפשר, יש לבצע ניתוחים של טרנסקריפטומיקה מרחבית בשלב מאוחר יותר בהקדם האפשרי לאחר השיבוץ, כדי למזער את פירוק ה-RNA במהלך האחסון43,44.

2. הערכת איכות הדגימה

  1. הערכת איכות החתכים
    1. בחנו את כל החתכים one by one תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי במצב שדה בהיר (4x–10x). בדקו כל סרטה כדי לוודא שהחתכים אינם שבורים, ורשמו את איכותו של כל חתך.
      הערה: בדקו אם קיימים קיפולים, קמטים, דחיסות או סימני רעידה (chatter marks), אשר עשויים להעיד על בעיות בקשיות הפרפין, בחדות הלהב או בדקלקצציה (הסתייך) חלקית. ודאו שאין אזורי רקמה חסרים כתוצאה מהתנתקות במהלך החיתוך או בעת ההעברה לאמבט המים.
    2. בחרו את החתכים המשומרים ביותר עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית (השלמים ביותר, בעלי המורפולוגיה הטובה ביותר).
    3. זהה את המקטעים העוקבים הסמוכים לאלו שנבחרו ושמור אותם עבור H&צביעה אימונוהיסטוכימית (E staining) ואימונופלואורסצנציה (IF), תוך הבטחה שתמונת הצביעה תתאמה ככל האפשר לרקמה שתעבור ריצוף.
  2. ה&צביעת E לבדיקת שלמות הרקמה
    1. הניחו את השקופיות במערך צביעה לשקופיות זכוכית והדגירו אותן למשך 15 דקות ב- 60 °C.
    2. העבירו את המחזיק (rack) לצנצנות צביעה מזכוכית המכילות קסילן למשך 15 דקות.
    3. בצעו רהידרציה של החתכים על ידי העברת הרחף דרך צנצני צביעה המכילים אתנול בריכוזים של 10%, 96%, 80% ו-70%, עם דגירה של 5 דקות בכל תמיסה.
      אזהרה: את כל השלבים הכוללים שימוש בקסילן ובסדרות של תמיסות אתנול בריכוזים מדורגים יש לבצע בתוך מ𒀵 כימיקה כדי להבטיח אוור תקין ולמזער את החשיפה לאדים רעילים ודליקים.
    4. שטפו את השקופיות למשך 5 דקות בתוך כלי צביעה מלא במים.
    5. טבול את המתקן ב-hematoxylin למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטוף תחת מי ברז זורמים עד שמי השטיפה יהיו צלולים.
    6. טבול את הסטנד במים המכילים חמש טיפות של חומצה כלורית רכזת, תוך ערבוב עדין עד להופעת גוון אדמדמ.
    7. העבירו את הרכיב למים רווים בליתיום קרבונט עד להופעת גוון כחול יציב, ולאחר מכן שטפו קצרה במים.
    8. צבע את החתכים ב-eosin בריכוז 1% (משקל/נפח) למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטוף שוב במים.
    9. בצעו דהידרציה לשקופיות על ידי העברת המתקן דרך צנצנויות צביעה המכילות מים, אתנול בריכוזים של 70%, 80%, 96% ו-10%, תוך דגירה למשך 5 דקות בכל תמיסה.
    10. בצעו שקיפות של השקפים בקסילן למשך 15 דקות.
    11. ייבשו בעדינות את גבם של השקפים, מרחו מדיום קיבוע (mounting medium) על זכוכית כיסוי, וקבעו את החתכים. הניחו לשקפים להתייבש בטמפרטורת החדר (RT) למשך 24 שעות לפני הדימות.
    12. בצעו דימוי רקמה באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה בהגדלה של 20x.
      הערה: בצע H&צביעת H&E בחתכים סמוכים תחילה, כשלב של בקרת איכות להערכת התאמת הדגימה לטרנסקריפטומיקה מרחבית. לאחר הבחירה, בצע צביעת H&E שנייה&צבעו ישירות את הסניט שיועד לטרנסקריפטומיקה מרחבית, בהתאם להנחיות היצרן להכנת רקמה עבור פלטפורמת הביטוי הגנטי המרחבי המפורטת ב- טבלת חומרים.
  3. הערכת שלמות ה-RNA (DV20)
    הערה: עבור פרוטוקול ביטוי גנים מרחבי, מדד שלמות ה-RNA המסורתי (RIN) אינו יעיל, מכיוון ששיאי ה-RNA הריבוזומלי 18S ו-28S בדרך כלל אינם נוכחים ברקמות מקובעות. לכן, מדד ה-DV20, המוגדר כאחוז מקטעי ה-RNA הגדולים מ-20 נוקלאוטידים, משמש בדרך כלל כפרמטר איכות מספק יותר מאשר ה-RIN עבור דגימות קליניות מפורקות. עבור Visium v2, חברת 10x Genomics ממליצה להשתמש בבלוקים של FFPE עם ערך DV20 של 30% $\ge$ כדי להבטיח היברידיזציה יעילה של הפרובים וביצועי בדיקה אופטימליים. בחירת בלוקים של רקמה עם ערכי ה-DV20 הגבוהים ביותר הזמינים מסייעת במניעת נשירה של רצפים (sequencing dropouts) וממקסמת את הרגישות בנקודות (spots).
    1. הוציאו את המבחנות בנפח 1.5 מ"ל המכילות את ה- 5 µm את הפרוסות שנאספו במהלך שלב חיתוך הרקמה, והניחו אותן על קרח לצורך הפקת RNA.
    2. מיצוי RNA כולל. הליך סטנדרטי זה כולל הסרת פאראפין מהדגימה, עיכול באמצעות proteinase K להפיכת קשרי צלב של פורמלין, הסרת DNA גנומי באמצעות טיפול ב-DNase I, ואלוציה סופית של ה-RNA המפוהם במים נקיים מ-RNase.
    3. העריכו את שלמות ה-RNA באמצעות מערכת המבוססת על אלקטרופורזה קפילרית עם בדיקת RNA ברגישות גבוהה. סיכום של זרימת העבודה מוצג ב- קובץ משלים 142,45,46,47,48.
  4. צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) רשות לאימות סוג התא
    1. הניחו את שקופית ה-FFPE במערך צביעה לשקופיות זכוכית והדגירו אותה למשך 15 דקות ב- 60 °C.
    2. העבירו את המחזיק (rack) לצנצנות צביעה מזכוכית המכילות Ksylene למשך 15 דקות.
    3. בצעו רהידרציה של הפלח על ידי העברת המתקן דרך אתנול בריכוזים של 10%, 96%, 80% ו-70% למשך 2 דקות בכל שלב, ולאחר מכן למשך 5 דקות במים ו-5 דקות ב-PBS-Tween (מحلול PBS בריכוז 1x בתוספת 0.1% Tween-20).
      זהירות: יש לבצע את כל השלבים הכוללים שילין ואתנול בתוך מapay של מנדף כימי.
    4. בצעו חשיפה מחדש של האנטיגן (antigen retrieval) בהתאם להמלצות היצרן עבור הנוגדן הראשוני, תוך הבטחה כי בופר החשיפה, ה-pH ותנאי החימום תואמים את דף הנתונים (datasheet) של הנוגדן. הערה: בזרימת עבודה זו, החשיפה מחדש של האנטיגן מבוצעת באמצעות 10 mM Tris ו-1 mM EDTA, pH 9.0, במערכת חימום של סיר בישול למשך 30 דקות ב- 95 °Cלאחר מכן קיררו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. שטפו את השקופית פעמיים, במשך 10 דקות בכל פעם, ב-PBS-Tween.
    6. שרטטו מחסום הידרופובי סביב הרקמה באמצעות עט למחסום הידרופובי, ומנעו קישור לא ספציפי על ידי החלת 5% BSA ב-1x DPBS על חתיכות הרקמה למשך 40 דקות לפחות בטמפרטורת החדר, בתוך תא לח.
      הערה: את תא הלחות מכינים על ידי הנחת דף נייר סינון בתוך קופסת צביעה של שקופיות מפלסטיק, והרטבתו היטב במים מזוקקים כדי לשמור על סביבה לחה ויציבה במהלך דגירת הנוגדנים.
    7. הכינו את תמיסת הנוגדן הראשוני ב-1x DPBS בדילול המומלץ עבור כל נוגדן.
      הערה: במסלול עבודה זה, נעשה שימוש בנוגדנים ראשוניים נגד Emcn (V.7C7) ו-Cd271 (ME20.4) כדי לזהות תאי endothelial (EC) ותאי גזע מזנכיים (MSC) של עכבר, בהתאמה, בעוד שנוגדים נגד CD31 (JC70A) או PRRX1 (פוליקלונלי) שימשו לזיהוי המקבילים האנושיים שלהם, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    8. הסירו את תמיסת החסימה על ידי טפיחה עדינה של קצה השקיף על נייר סופג להסרת טיפות שאריות, לאחר מכן מרחו את תערובת הנוגדן הראשוני והדגירו את השקיף למשך הלילה ב- 4 °C בתא לח.
    9. שטפו את השקף פעמיים למשך 5 דקות ב-PBS-Tween והכינו את תמיסת הנוגדן המשני בדילול המומלץ על ידי היצרן, תוך וידוא שהפלואורופורים תואמים ספקטרלית ואינם חופפים.
      הערה: בזרימה זו נעשה שימוש בנוגדן שני המשוער ב-Alexa Fluor בדילול של 1:20.
    10. יש להחיל את תערובת הנוגדנים המשניים ולהדגיר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, תחת הגנה מאור ובתוך תא לח.
    11. שטפו את הפסלולה פעמיים למשך 5 דקות ב-PBS-Tween.
    12. יש להחיל דילול של 1:10 של תוכה לקיבוע המכיל DAPI (ראו את טבלת החומרים), שהוכן בתמיסת PBS-גליצרין ביחס של 1:1, ולהדגיר את הדגימה למשך 5 דקות.
    13. הצמידו את הסניט לזכוכית כיסוי ואטמו את הקצוות בלק ציפורניים כדי למנוע התייבשות.
    14. בצעו הדמיה של הרקמה הצבועה באמצעות פלטפורמה لديמות מולטי-ספקטרלית.

קובץ משלים 1: סיכום של שלבי הפרוטוקול להערכת שלמות ה-RNA ותהליך העבודה של Visium Spatial Transcriptomics. קובץ משלים זה מספק סיכום מפורט שלבי הפעולה שבוצעו בהתאם להוראות היצרן. הוא כולל: (i) את ה-High Sensitivity RNA ScreenTape Assay המשמש להערכת שלמות ה-RNA (DV20) כפי שמתואר בשלב 2.3.3 של הפרוטוקול הראשי, ו-(ii) סקירה כללית של תהליך העבודה של Visium CytAssist Spatial Gene Expression הכולל עיבוד מקדים של רקמה, הכנת ספרייה וריצוף (שלבים 3.1–3.3 של הפרוטוקול הראשי).אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

3. טרנסקריפטומיקה מרחבית

הערה: בצעו את זרימת העבודה של הטרנסקריפטומיקה המרחבית באמצעות הפלטפורמה והריאגנטים המפורטים ב- טבלת חומרים, בהתאם למדריכי המשתמש הרלוונטיים42,45,46. קובץ משלים 1 מסכם את השלבים העיקריים של עיבוד מקדימה של הרקמה, הכנת הספריה והריצוף.

  1. בקרת איכות של נתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית
    1. בצעו דה-מולטיפלקס (Demultiplex) לנתוני הטרנסקריפטומיקה המרחבית באמצעות צינור העיבוד הסטנדרטי עבור מערכי נתוני Visium (ראו טבלת חומרים).
    2. מפו את הקריאות (reads) לגנום הייחוס המתאים מ-Ensembl 105.
      הערה: נעשה שימוש ב-GRCh38 עבור דגימות אנוש וב-mm10 עבור דגימות עכבר.
    3. ייצרו את מטריצות התכונה-ברקוד (feature-barcode matrices) המסוננות באמצעות אותו צינור עיבוד, ויבואו אותן לסביבת הניתוח של תא בודד/מרחב (ראו טבלת חומרים).
    4. בחנו את תמונות ה-H&E בממשק הוויזואליזציה המסופק על ידי צינור העיבוד של הטרנסקריפטומיקה המרחבית (ראו טבלת חומרים), והסירו ידנית נקודות החופפות לאזור העצם הקורטיקלית או לרקמת עצם, בהתאם למערך הנתונים.
    5. נרמלו את מערכי הנתונים באמצעות שיטת טרנספורמציה למייצבי שונות (variance‑stabilizing transformation), המיושמת בדרך כלל בזרימות עבודה של ניתוח תא בודד (ראו טבלת חומרים).

תוצאות

כדי להעריך את ישימותו של זרימת העבודה זו, המבוססת על EDTA, בין מינים שונים ובהקשרי מחלה שונים, הוחל הפרוטוקול על ארבע דגימות של מחול השתלה (BM): שתי עצמות ירך של עכברים ושני דגימות עצם אנושיות המייצגות מצבים בריאים ומצבים של מיאלומה נבובת (MM) (טבלה 1 ו- איור 1).

זיהוי דגימותמיניםמיןגילמחלה
YFPcγ1עכברנקבה210 ימיםבריא
mMMעכברזכר314 ימיםMM
hHBMבן אנושזכר76 שניםבריא
hMMאדםנקבה50 שנהמילימטר (MM)

טבלה 1: דגימות עצם של עכברים ובני אדם שנכללו במחקר. עבור כל דגימה מצוינים המין, המין הביולוגי, הגיל ומצב הבריאות. קיצורים: hHBM = מחית עצם אנושית בריאה; hMM = מיאלומה מרובה אנושית; mMM = מיאלומה מרובה של עכברים; MM = מיאלומה מרובה; YFPcγ1 = עכבר ביקורת בריא.

הדגימות ששימשו במחקר זה אופיינו ודווחו בעבודות קודמות של קבוצת המחקר, ובפרט בעבודותיהם של Muiños-Lopez et al. ו-Cenzano et al., למעט דגימת העכבר MM. עבור הדגימות שדווחו בעבר, נתוני התעתקים מרחביים (spatial transcriptomics) והתוצאות מוצגים באותם מחקרים8,10. לפיכך, החומר המובא כאן משמש להערכת ההתאמה הטכנית של הפרוטוקול לתעתוקים מרחביים, ולא לצורך הצגת ממצאים ביולוגיים חדשים.

דגימות של עצם פמור מעכברים הושגו ממודל עכברי MM מהונדס גנטית מסוג BIC (BIcγ1), המשחזר את המאפיינים הקליניים והאימונולוגיים של חולי MM, ומעכברי ביקורת בריאים תואמים (YFPcγ1)8,49. פמור אחת מכל בעל חיים נגזרה, נוקתה ועובדה בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי (איור 2A). פמורים שימשו ספציפית לאנליזות אלו מכיוון שהן מספקות כמות שופעת של מחול עצם זמין, איכות נישה מעולה וקלות של עיבוד הדירות, מה שהופך אותן למתאימות מאוד לפלטפורמת טרנסקריפטומיקה מרחבית מבוססת ריצוף8,10. דה-קלציפיקציה מוצלחת של פמור עכבר הביקורת אושרה באופן מקרוסקופי על ידי עלייה בולטת בגמישות הרקמה במהלך מניפולציה ידנית עם פינצטה (איור 2B). לאחר מכן, מקטע עצם זה הוטמע ביעילות בפראפין באמצעות תבנית ייעודית התואמת לטרנסקריפטומיקה מרחבית, כדי לשמר את שלמות ה-RNA ואת ארכיטקטורת הרקמה עבור אנליזה מולקולרית בהמשך (איור 2C).

שתי דגימות מח עצם (BM) אנושיות עם היסטוריות עיבוד מנוגדות נותחו אף הן8,10. דגימת מח עצם אנושית טרייה ובריאה המטולוגית הופקה מפסולת כירורגית במהלך החלפה אורתופדית של מפרק הירך ב-Hospital Universitario de Navarra (איור 2D–F). כדי להדגים את התועלת הטרנסלציונית של הפרוטוקול, דגימה זו עובדה באופן דומה לדגימות עכבר. בדומה לתוצאות שנצפו ברקמת עכבר, דקלציפיקציה מוצלחת של עצם אנושית באמצעות EDTA אושרה באופן מאקרוסקופי על ידי ריכוך מלא של הרקמה, כפי שהוכח על ידי חדירת מחט ללא מאמץ (איור 2E). פרגמנט העצם האנושית לאחר הדקלציפיקציה הוטמע בהצלחה בפרפין באמצעות תבנית מתכת סטנדרטית לצורך עיבוד המשך (איור 2F). הדגימה האנושית השנייה consisted מביופסיות מח עצם FFPE מארכיון של רכס האיליאק (iliac crest) של חולה MM במחלקה הפתולוגית של ה-Clínica Universidad de Navarra (CUN). ראוי לציין כי דגימת ה-MM מארכיון זו עברה דקלציפיקציה קודמת באמצעות פרוטוקול קליני סטנדרטי הכולל חומצות חזקות36. דגימה זו מספקת ניגוד איכותי לדגימות שעובדו ב-EDTA; עם זאת, הבדלים במקור הרקמה, בהיסטוריית הקיבוע, באחסון ובדקלציפיקציה פירושם שלא ניתן לייחס את ההבדלים שנצפו אך ורק לחומר הדקלציפיקציה.

עיבוד רקמות היסטולוגי: שש דגימות רקמה עם סרגים; דימוי לצורך ניתוח במחקר.
איור 2דגימות עצם של עכברים ובני אדם במהלך הכנה מבוססת EDTA. (A(עצמות פמור של עכברי ביקורת שלמות לפני דקאלציפיקציה.)B(עצם ירך של עכבר בביקורת שעברה דקלציפיקציה, המציגה גמישות מוגברת. (C) רגמני עצם של עכברי ביקורת הטמיעים בפרפין. (ד'(מקטעי עצם אנושיים בריאים מניתוח בירך לפני דקלציפיקציה.)ה) אותו מקטע לאחר דקלציפיקציה (הסרת סידן) באמצעות EDTA, המראה חדירת מחט. (F) עצם אנושית בריאה שעברה דה-קלציפיקציה באמצעות EDTA ונטמנה בפראפין. סרגילי קנה מידה: (א', ב') 5 מ"מ; (C–F) 1 ס"מ. קיצור: EDTA = חומצה אתילנדיאמינטטרה-אצטית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של דמות זו.

כדי לנתח את ארכיטקטורת הרקמה הכללית, בוצע צביעת H&E (איור 3). השימור המורפולוגי הטוב יותר שנצפה בחתכים מהעכבר עשוי לשקף הבדלים בטיפול ובעיבוד הדגימות ולא תכונות 고חנתיות ספציפיות למין. עצמות הירך של העכברים נאספו במיוחד עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית ועובדו מיד כעצמות שלמות, ובכך נשמרה הארכיטקטורה שלהן (איור 3A, B). לעומת זאת, הדגימות האנושיות מקורן הוא או חומר שארי שהתקבל במהלך ניתוח להחלפת ירך (איור 3C) או ביופסיות עצם אבחנתיות של MM (איור 3D)), ושני המקורות עלולים להציג איכות רקמה קדם-אנליטית משתנה. כתוצאה מכך, ההבדלים המורפולוגיים בין הדגימה האנושית שעברה דה-קלציפיקציה באמצעות EDTA לבין הביופסיה של MM שעברה דה-קלציפיקציה בחומצה הם מזעריים, מכיוון ששתי הדגימות האנושיות כבר מראות מגבלות מבניות בסיות שנובעות לא רק מהדה-קלציפיקציה אלא גם מעיבוד רקמה כללי (איור 3C, D). לפיכך, הערכה מקיפה של איכות הדגימה עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית מחייבת בחינה של מספר פרמטרים נפרדים. ראשית, יש לנטר בקפידה את שלמות הרקמה, שכן השימור המבני עשוי להשתנות באופן משמעותי בהתאם לסוג הדגימה הספציפי ולא רק בהתאם לחומצה המשמשת לדה-קלציפיקציה. שנית, יש להעריך גם את איכות ה-RNA, מכיוון שתנאי הדה-קלציפיקציה עשויים להשפיע עליה20,35,36.

השוואה היסטולוגית של דגימות רקמה תחת מיקרוסקופ; קנה מידה של 50μm לניתוח מבני.
איור 3H&חתכים צבועים ב-H&E המשמשים להערכת איכות הרקמה. חתכים רצופים של FFPE תואמים ל-A) עכבר ביקורת בריא10, (B) עכבר עם MM, (Cעצם אנושית בריאה8,10, ו(ד') ביופסיה של MM אנושי8סרגי קנה מידה = 500 µmקיצורים: FFPE = מקובע בפורמלין ומוטמע בפאראפין; H&E = המטוקסילין ואוזין; MM = מיאלומה קשסית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

כדי להשלים את האנליזה ההיסטולוגית, הוערכה איכות ה-RNA. בעוד ש-H&צביעת E הניבה הבדלים מעורפלים, בעוד ששלמות ה-RNA הבדילה בבירור בין ההשפעות של שתי שיטות דה-קלציפיקציה (טבלה 2ערכי ה-DV20 הן של דגימות העכברים והן של דגימת עצם האדם הבריאה עלו מהסף המומלץ עבור בדיקות Visium FFPE, מה שמעיד על התפלגות אורכי מקטעי RNA מספקת להיברידיזציה של גששים (probes) ובניית ספרייה. דגימת העכבר הבריא עם YFP מראה DV20 של 82.5%, ודגימת עצם האדם הבריאה (hHBM) מגיעה ל-58%, שניהם גבוהים משמעותית מסף הקבילה של 30% שהגדירה 10x Genomics. דגימת העכבר עם MM (mMM) מראה DV20 של 31.3%, קרוב לגבול הקבילה התחתון, מה שעשוי לשקף אחסון ממושך של בלוק הפרפין ב- 4 °C לפני החיתוך, בין היתר, בקרב גורמים ספציפיים לדגימה. לעומת זאת, בביופסיה אנושית של מיילומא בשורה (hMM) שעברה דקלקציה בחומצה, נצפה DV200 של 8% בלבד, דבר שהיה קשור לשלמות RNA נמוכה באופן ניכר, גם כאשר ההידרדרות המורפולוגית פחות בולטת. לסיכום, ביצוע הערכות מבניות ומולקולריות כאחד הוא חשוב להערכת התאמת הדגימה לאנליזה מרחבית בהמשך התהליך.

זיהוי דגימהDV20 (%)1
YFPcγ182.5
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV20: אחוז מקטעי ה-RNA הכוללים > 20 נוקלאוטידים.
2דגימה זו עברה דקלציפיקציה באמצעות פרוטוקול קליני סטנדרטי הכולל חומצות חזקות.

טבלה 2: איכות ה-RNA של דגימות המחקר. DV20 הוא אחוז מקטעי ה-RNA הארוכים מ-20 נוקלאוטידים; ערכים של לפחות 30% נחשבו כמתאימים לביצוע Spatial transcriptomics בהמשך. קיצורים: hHBM = מחולל עצם אנושי בריא; hMM = מיאלומה מרובה אנושית; mMM = מיאלומה מרובה עכברית.

ניתן לבצע גם הערכות איכות נוספות. כדי לתקף באופן נוסף את שלמות הרקמה ולאשר את שימורה של מדורים תאיים ספציפיים לאחר דקאלציפיקציה ב-EDTA, בוצע צביעת IF אופציונלית על חתכים סמוכים של FFPE מרקמות עכבר ואדם. נוגדנים ל-Endomucin (Emcn) ו-Cd271 שימשו להדמיה של תאי אנדותל (EC) ותאים מזנכימליים (MSC), בהתאמה, בדגימת עכבר עם MM (איור 4A). צביעה זו הראתה כי רקמות שעברו עיבוד ב-EDTA הציגו מבנים וסקולריים מוגדרים היטב עם צביעת Emcn רציפה ורשתות סטרומליות שנשמרו, מה שמעיד על כך שהמרקרים שנבחנו נותרו ניתנים לזיהוי לאחר העיבוד. יתרה מכך, הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות מערכת הדמיה מולטיספקטרלית אוטומטית סיפקה ראיות נוספות לכך שהאנטיגנים שנבחנו נותרו ניתנים לזיהוי לצורך אימות סוג התא, ובכך סיפקה שכבה נוספת של בקרת איכות לפני ניתוח טרנסקריפטומי מרחבי. בנוסף, ממצאים אלו נצפו גם בדגימות של בני אדם קשישים בריאים, שבהן ביטוי של EC זוהה על ידי נוגדני CD31 ו-MSC על ידי נוגדני PRRX1 (Paired Related Homeobox 1), מה שמעיד על כך שמרקרי הנישה שנבחנו נותרו ניתנים לזיהוי לאחר דקאלציפיקציה ב-EDTA (איור 4B). לעומת זאת, ממצאים אלו לא הועתקו בביופסיות MM אנושיות שהוכנחו באמצעות פרוטוקולים שונים של דקאלציפיקציה מבוססת חומצה. כפי שצוין קודם לכן, שלמות ה-RNA בדגימות אלו הייתה נמוכה, מה שהגביל את הניתוח הטרנסקריפטומי העוקב. בשל אופיה המעובד/מ Nogד של דגימות אנושיות אלו, התועלת העוקבת שלהן הוגבלה לאפיון טרנסקריפטומי בסי8 ולהערכה אימונוהיסטוכימית (IHC) של תאי פלזמה (PC) ממאירים (איור 4C).

מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה של חיתוכי רקמה; צביעה רב-צבעית; ניתוח מבנה תאי.
איור 4: אימונופלואורסצנציה ואימונוהיסטוכימיה אופציונליות לאימות סוג התאים. (Aרקמת MM של עכבר המראה גרעינים המסומנים ב-DAPI (כחול), MSC חיוביים ל-CD271 (ירוק), ו-EC חיוביים ל-EMCN (אדום).B) עצם אנושית בריאה המראה גרעינים המסומנים ב-DAPI (כחול), תאי גזע מזנכימליים (MSCs) חיוביים ל-PRRX1 (ירוק), ותאי אנדותל (ECs) חיוביים ל-CD31 (אדום)10. (כ(ביופסיה של MM אנושי המראה PC ממאיר חיובי ל-CD138)8סרגי קנה מידה: (A) 250 µm (סקירה כללית), 20 µm (הגדלה ממוזגת), ו- 50 µm (תמונות בערוץ בודד); (B) 500 µm (סקירה כללית) ו- 20 µm (הגדלות של תמונות ממוזגות ותמונות בערוץ בודד); (C) 500 µmקיצורים: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EC = תא אנדותל(י); MM = מיאלומה מרובה; MSC = תא סטרומלי מזנכימי; PC = תא פלזמה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בסיכומו של דבר, מורפולוגיית הרקמה ותוצאות ה-DV20 תומכות בהתאמתן של דגימות שעובדו ב-EDTA לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי בהמשך. יישומים טרנסקריפטומיים מרחביים של זרימת העבודה של הכנה זו דווחו בעבר8,10.

דיון

על ידי שילוב של דקלציפיקציה מבוקרת המבוססת על EDTA, עיבוד FFPE סטנדרטי ונקודות ביקורת מחמירות לבקרת איכות, פרוטוקול זה מתגבר על רבות מהמגבלות הקשורות באופן מסורתי להכנת רקמת עצם עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית, ובמיוחד אלו הקשורות לפירוק RNA ולנזק מורפולוגי הנגרם משיטות דקלציפיקציה מבוססות חומצה חזקה8,10,20,33,36. השלב הקריטי ביותר בעיבוד דגימות מינרליזיות עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית הוא הדקלציפיקציה. דקלציפיקציה לא מספקת מובילה לעצם שנותרת קשיחה מדי לחיתוך, מה שהופך את השגתם של חתכים באיכות גבוהה עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית לבלתי אפשרית מבחינה פיזית8,20,23,37,50. כאשר רקמת העצם נשארת קשה מדי, היא נשברת או רוטטת כנגד להב המיקרוטום, מה שמוביל לחתכים קרועים או לחורים שאינם מייצגים במדויק את ארכיטקטורת ה-BM המקורית. חשוב לציין כי לא ניתן לאשר באופן מלא את הצלחת הדקלציפיקציה עד לשלב המיקרוטומיה: אפילו דגימות שנראות רכות באופן שטחי עשויות עדיין להכיל מינרלים שיריים שהופכים גלויים רק בעת ניסיון לחתוך חתכי FFPE דקים. מסיבה זו, ניטור קפדני של התקדמות הדקלציפיקציה הוא חיוני כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור.

תהליך העבודה משתמש ב-0.25 M EDTA ב-pH 6.95 למשך 10 ימים עם ערבוב קבוע והחלפת תמיסה ביום החמישי8,10. במהלך פיתוח הפרוטוקול, נבחנו EDTA לבדו, EDTA בתוספת polyvinylpyrrolidone, וחומצה פורמית (formic acid) בריכוז 10%, לצד משכי דקאלציפיקציה שונים ולוחות זמנים שונים להחלפת התמיסה; הנתונים ההשוואתיים אינם מוצגים כאן. משכים קצרים מ-10 ימים הביאו לעיתים קרובות לשבירת רקמה במהלך חיתוך דגימות עכברים, בעוד שדגימות אנושיות הראו התנהגות התלויה בדגימה. לפיכך, משך של 10 ימים משמש עבור עצמות ירך של עכברים, בעוד שדגימות אנושיות עשויות לדרוש דקאלציפיקציה ממושכת יותר בהתאם לצפיפות ולתוכן הטרבטולרי. יש להשתמש בנקודות בקרה פיזיות לאיכות לפני הטמעה בפרפין. אם מתגלה דקאלציפיקציה לא מספקת במהלך המיקרוטומיה, השתמשו בהליך העיבוד מחדש רק כצעד אחרון להצלת הדגימה, מכיוון שחשיפה נוספת לחום, לממסים ולרהידרציה עלולה לפגוע באיכות ה-RNA.

המגבלה העיקרית של שיטה זו היא זמן העיבוד הממושך, העומד בניגוד חריף לפרוטוקולים מהירים מבוססי חומצה הנפוצים בפתולוגיה קלינית20,36. אף שזמני עיבוד ארוכים יותר מקובלים בדרך כלל במסגרות מחקר, מחקרים אחרונים, כגון הפרוטוקול המתואר על ידי Miao et al., המשתמש בתמיסת Morse (22.5% formic acid ו-10% sodium citrate) לדקאלציפיקציה תוך 24 h, מדגישים את העניין הגובר בהאצת הכנת העצם עבור בדיקות מרחביות (spatial assays)20. עם זאת, שיטות מבוססות חומצה כרוכות היסטורית בסיכון גבוה בהרבה לדיגראדציה של RNA, מה שמפחית את ערכי ה-DV200 ובסופו של דבר מגביל את התאימות שלהן לטרנסקריפטומיקה מרחבית1,8,35,36. גישה זו, המבוססת על EDTA, מעדיפה את שימור ה-RNA על פני המהירות, ובכך מבטיחה תאימות לפלטפורמות מרחביות מבוססות ריצוף כגון Visium.

מגבלה פוטנציאלית של טרנסקריפטומיקה מרחבית של BM היא השפעות הגבוהה של תמלילי אימונוגלובולינים המופקים מ-PC, אשר עלולה להפחית את הגילוי של גנים בעלי שפעות נמוכה. בדומה לאסטרטגיות בקרת האיכות והסינון שיושמו במחקר קודם של קבוצת המחקר, הכוללות הסרה של נקודות באיכות נמוכה (<200 UMIs ו-<150 גנים שזוהו), סינון של סוגי תאים בעלי תרומה נמוכה (<20% לנקודה) במהלך ניתוחי דקונבולוציה, ובחירה של גני סמן שזוהו במערכי הנתונים של הטרנסקריפטומיקה המרחבית, ניתן לסנן חישובית גם תמלילי אימונוגלובולינים במהלך ניתוח המשך כדי למזער את השפעתם במידת הצורך8. גישות של טרנסקריפטומיקה מרחבית ממוקדת עשויות לשפר עוד יותר את הגילוי של תמלילים בעלי שפעות נמוכה ביישומים ספציפיים.

היישומים הפוטנציאליים עבור שיטה זו הם נרחבים. אינטגרציה עדכנית של נתונים מרחביים ונתוני תא בודד חשפה נישות אוסטאוגניות אנושיות מתמחות ומדרגי איתות מורכבים הקורנים מעצם טרבכולרית3,26. יתרה מכך, טרנסקריפטומיקה מרחבית הראתה כי הזדקנות מעצבת מחדש את מיקרו-הסביבה של ה-BM על ידי שינוי הארגון המרחבי והתקשורת של EC, מה שמוביל לפגיעה בתמיכה האוסטאוגנית ולהופעת רשתות איתות דלקתיות בתוך הנישה המזדקנת10. פרופיל מולטי-אומיק זיהה גם שכונות מיקרו-סביבתיות מובחנות, כגון אזורים ארטריו-אנדוסטאליים התומכים במיאלופואזה מוקדמת ואזורים פרי-אדיפוציטיים עשירים בתאי גזע ופרוגניטורים המטופואטיים3. בהקשר של MM, פרוטוקול זה מאפשר את השילוב של מסגרות טרנסקריפטומיות מרחביות ושל תא בודד כדי לאפיין את הרכב ה-BM חולה של עכברים ואינטראקציות בין תאים. עבודות קודמות חשפו התפלגויות מובחנות מרחבית של PC ממאירים וזיהו תוכניות חיסוניות ודלקתיות, כגון NETosis ואיתות IL-17, שהיו קשורות באופן הפוך לאזורים עשירים בגידול. בנוסף, עלייה בצפיפות של PC ממאירים נמצאה במתאם עם מעבר ממצבי תאי T אפקטורים למצבים של תאי T מותשים. ממצאים אלו תוקפו גם בדגימות BM אנושיות בשימור FFPE, מה שמעיד על הרלוונטיות התרגומית שלהם על פני עומסי מחלה משתנים8. בסופו של דבר, תהליך ההכנה זה מספק את התשתית הטכנית לחקר האינטראקציות התאיות המורכבות בתוך הארכיטקטורה המינרלית של ה-BM.

פלטפורמות לבדיקת ביטוי גנים מרחבי ברזולוציה גבוהה יכולות לספק פרופיל של כל הטרנסקריפטום ברזולוציה קרובה לרמה של תא בודד38,51,52. גישות אלו עשויות להרחיב את השימוש בתהליך ההכנה לניתוח ברזולוציה גבוהה יותר של מח העצם (BM) מאורגן מרחבית ושל מחלות המהימיה ממאירות. לפיכך, תהליך העבודה מספק בסיס טכני למחקרים עתידיים של המטופואזה פיזיולוגית וממאירה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים. פטנט על הידע והשימוש הניסויי במודלי העכברים MIcγ1 של MM הוענק ברישיון ל-MIMO Biosciences (בקשה מס' PCT/EP2023/071025).

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי Instituto de Salud Carlos III ומומננה במשותף על ידי ERDF A way of making Europe (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) ו-RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011; Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC ו-AIRC במסגרת תוכנית ה-Accelerator Award; The International Myeloma Foundation (Brian van Novis) ו-The Paula and Rodger Riney Foundation עבור FP. IAC נתמכה על ידי מענק מארי קורי (H2020- MSCA-IF-837491) מהנציבות האירופית, מענק כישרונות של AECC (INVES258003CALV), ו-Departamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03). MC נתמכה על ידי מלגת FPU (FPU22/03283) מה-Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. נבקש להודות לצוות מעבדת הגנומיקה המתקדמת ולמתקן בעלי החיים ב-CIMA Universidad de Navarra על סיועם הטכני והאינטלקטואלי שאין לו תחליף. אנו מודים גם למחלקות הפתולוגיה של Clínica Universidad de Navarra (CUN) ושל Hospital Universitario de Navarra על אספקת דגימות BM ועל שיתוף הפעולה המצוין שלהם. תודה מיוחדת מגיעה ל-José Ángel Martínez-Climent ו-Marta Larrayoz על מודלי העכברים שלהם ל-MM. תודה ל-Patxi San Martín-Uriz, Tania López, ו-Eduardo Larequi על תמיכתם המצוינת באופטימיזציה של טכנולוגיות, פיתוח פרוטוקולים ופתרון בעיות בעיבוד דגימות BM של עכברים ובני אדם לטובת טרנסקריפטומיקה מרחבית. אנו מודים גם ל-Beñat Ariceta ו-Asier Ullate על כל עבודתם החישובית בטרנסקריפטומיקה מרחבית. לבסוף, אנו אסירי תודה למטופלים ולתורמים הבריאים שהשתתפו בנדיבות במחקר זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנות של 1.5 מ"לEppendorf15625367
מכל סטרילי של 100 מ"ל deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991Aאלקטרופורזה נימיות–מערכת מבוססת לבחינת שלמות ה-RNA
מכל סטרילי בנפח 50 מ"ל IberoMedREOR001
מבחנה של 50 מ"ל FALCON352070
עט PAP מתקדםTed Pella 22309Z377821-1EAעט למחסום הידרופובי 
נוגדן Anti-PRRX1 שהופק בארנבSigma-AldrichHPA051084
BSA (אלבומין מסרום בקר)Sigma-AldrichA9418-50G
קסטות KartellLABWARE2921
נוגדן מונוקלונלי ל-CD271 (קולטן NGF) (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, תא אנדותליאלי (ריכוז) Clone JC70AAgilent DakoM0823
זכוכיות כיסויFisher Scientific12-544-EP50 מ"מ x 24 מ"מ
DAPI (תוסף קיבוע למניעת דהייה VECTASHIELD עם DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
תמיסה להסרת פראפיןQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals Phosphate-buffered saline (DPBS, 1×), פורמולת Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיום
חומר סגירה מסוג DPX להיסטולוגיהSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687חומצה אתילנדיאמיןטטרהאצטית, (EDTA), תמיסה בריכוז 0.5 M, בדרגת ביולוגיה מולקולרית, בטוהר גבוה במיוחד (Ultrapure)
תחנת הטמעה Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
נוגדן Emcn (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
גנום הייחוס של Ensembl ‏(GRCh38 / mm10, גרסה 105)EMBL-EBIלא רלוונטיגנום ייחוס ששימש ליישור קריאות.
אוסיןMillipore SigmaHT110116
אתנולMillipore SigmaE7023-500MLמספריים כירורגיים
אמבט מים להיסטולוגיה B-I מבית Falc InstrumentsFalc610.1030.00
פורמלין 4% PanReac AppliChem2524311315פורמאלדהיד 3.7%–4.0% משקל/נפח, מנוטרל ל-pH = 7 ומיוצב במתנול (CE-IVD) לאבחון קליני
מתקן צביעה לזכוכית* (סלייד)* WHEATONZ710970-3EA
צנצני צביעה מזכוכית מותגBR472200-10EAמסטרסייקלר (Mastercycler)  X50
גליצרולSigma-AldrichC3H8O3
נוגדן משני עיזים נגד IgG (H+L) של עכבר, ספח-ספיח (Cross-Adsorbed), Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
נוגדן משני עיזים נגד IgG (H+L) של עכבר, עבר ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
נוגדן משני ממקור עיזים נגד IgG של ארנבת (H+L), בעל ספיחה צולבת גבוהה, מסומן ב-Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
המטוקסילין Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579הערכת שלמות ה-RNA
סולם RNA ScreenTape ברגישות גבוההAgilent5067-5581הערכת שלמות ה-RNA
בפר ריאגנט לדגימות עבור High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5580הערכת שלמות ה-RNA
מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה Leica Biosystemsלא רלוונטיסורק Aperio CS2
חומצה הידרוכלורית (0.1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
פלטפורמת Illumina NextSeq 2000Illumina20038897
נוגדן משני Invitroge Goat anti-Rat IgG (H+L) שעבר ספיחה צולבת (Cross-Adsorbed), מסומן ב-Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
מספרי איריס - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009איזופלוראן
ליתיום קרבונט Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x Genomicsלא רלוונטיתוכנה המשמשת להדמיה של תמונות HE ואוצרות של נקודות Visium; פותחת קבצי .cloupe שנוצרו על ידי צינור הניתוח (analysis pipeline).
תבניות הטמעה ממתכתBio-Optica07-BM24256
זכוכיות מיקרוסקופAvantor631-0108זכוכיות מיקרוסקופ Superfrost Plus
להבי מיקרוטוםנוצהסיכום: בסרטון זה הודגנו כיצד לבצע בדיקת תאימות (compatibility assay) להערכת האינטראקציות בין רכיבי פורמולציה שונים לבין תרופות, במטרה להבטיח יציבות תרופתית ולמנוע שקיעות או אינטראקציות לא רצויות לפני מתן התרופה למטופל. במהלך הפרוטוקול, תרופות ומרכיבי פורמולציה נערבבו בריכוזים קצובים והושקיפו תחת תאורה מתאימה כדי לזהות שינויים ויזואליים מיידיים, כגון עכירות, שינויי צבע או היווצרות משקעים. הדגש הושם על שימוש בטכניקות סטריליות, דיוק בשקילה ובמדידה, ותיעוד מדויק של התוצאות. בדיקת תאימות זו היא שלב קריטי בפיתוח תרופות ובפרקטיקה קלינית, שכן היא מאפשרת לזהות חוסר תאימות כימית או פיזיקלית שעלולים לפגוע ביעילות התרופה או לגרום לתופעות לוואי מסוכנות.
מיקרוטום HM 340EEprediaלא רלוונטידגם HM 340E
מחטBD301156BD Microlanc 3 Needle 21 G 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052מיקרוסקופ אור בבבואת שדה בהירה
פרפין PanReac AppliChem256993פרפין עם נקודת התכה (M.P.) 55–58°C כדורי DMSO פלסטיקציה (CE-IVD) לאבחון קליני
צלחית פטרי CorningCLS430167-100EA
תבניות להטמעה בפלסטיק Bio-Optica07-MP7070
מלקחי פוטס-סמית' (Potts-Smith Forceps)F.S.T 11012-18פינצטה
פלואורומטר Qubit 3.0Invitrogen Q33216
מבחנות לבדיקת QubitInvitrogen Q32856
ערכה לבדיקת Qubit RNA HSInvitrogen Q32855
מבחנת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל נטולת RNAseThermo Scientific AM12400
מים נקיים מ-RNase MerkW4502
RNaseZap RnaseInvitrogen AM9780תמיסת דה-קונטמינציה
RNeasy FFPE Kit (50)Qiagen73504מיצוי RNA כולל
SCTransform (v0.3.5)מעבדת Satijaלא רלוונטישיטת נורמליזציה לייצוב שונות המיושמת ב-Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) מעבדת Satijaלא רלוונטיחבילת R המשמשת לניתוח טרנסקריפטומיקה של תא בודד וטרנסקריפטומיקה מרחבית.
Space Ranger (v2.0.1)10x Genomicsלא רלוונטיתוכנה המשמשת לדמולטיפלקסינג (demultiplexing), יישור (alignment) ויצירת מטריצות של תכונות-ברקוד (feature-barcode matrices) עבור מערכי נתונים של Visium.
סקלפל Stlime Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)מעבדת ברגןלא רלוונטיחבילת R המשמשת לוויזואליזציה ואינטגרציה של טרנסקריפטומיקה מרחבית.
להב סכין כירורגית מס' 23Swann-Morton210להבי סקלפל כירורגיים
מכשיר תגובות שרשרת פולימראז (Thermal cycler) Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455פלטפורמת דימוי רב-ספקטרלי לוויזואליזציה של IF
ערכת אביזרים Visium של 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
ערכה קטנה של גששים לטרנסקריפטום אנושי Visium מבית 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
ערכה קטנה של גששים לטרנסקריפטום של עכבר עבור Visium מבית 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
ערכה לשקופיות ביטוי גנים מרחבי Visium הכוללת 4 תגובות, 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
קסילןPanreac214736קסילן, תערובת איזומרים לניתוח, ACS, ISO

מקורות

  1. Cooper RA, et al. Spatial transcriptomic approaches for characterising the bone marrow landscape: pitfalls and potential. Leukemia. 2025;39(2):291-295.
  2. Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity. Nat Rev Immunol. 2012;12(1):49-60.
  3. Bandyopadhyay S, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. 2024;187(12):3120-3140.e29.
  4. Tikhonova AN, et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019;569(7755):222-228.
  5. Baccin C, et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 2020;22(1):38-48.
  6. Kunisaki Y, et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 2013;502(7473):637-643.
  7. Kusumbe AP, Ramasamy SK, Adams RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014;507(7492):323-328.
  8. Muiños-Lopez E, et al. Characterization of the bone marrow architecture of multiple myeloma using spatial transcriptomics. Commun Biol. 2025;8(1):1620.
  9. Gui G, et al. Single-cell spatial transcriptomics reveals immunotherapy-driven bone marrow niche remodeling in AML. Sci Adv. 2025;11(28):eadw4871.
  10. Cenzano I, et al. Single-cell profiling reveals RAB13+ endothelial cells and profibrotic mesenchymal cells in aged human bone marrow. Aging Cell. 2026;25(4):e70475.
  11. de Jong MME, et al. The multiple myeloma microenvironment is defined by an inflammatory stromal cell landscape. Nat Immunol. 2021;22(6):769-780.
  12. de Jong MME, et al. An IL-1β-driven neutrophil–stromal cell axis fosters a BAFF-rich protumor microenvironment in individuals with multiple myeloma. Nat Immunol. 2024;25(5):820-833.
  13. Cenzano I, et al. Stromal and endothelial transcriptional changes during progression from MGUS to myeloma and after treatment response. Nat Commun. 2026;17:74389.
  14. Ye J, et al. Deconvolution of the hematopoietic stem cell microenvironment reveals a high degree of specialization and conservation. iScience. 2022;25(5):104225.
  15. Chen L, et al. An inflammatory T-cell-stromal axis contributes to hematopoietic stem/progenitor cell failure and clonal evolution in human myelodysplastic syndrome. Nat Commun. 2025;16(1):10041.
  16. Prummel KD, et al. Inflammatory stromal and T cells mediate human bone marrow niche remodeling in clonal hematopoiesis and myelodysplasia. Nat Commun. 2025;16(1):10042.
  17. De Jonghe J, et al. scTrends: A living review of commercial single-cell and spatial 'omic technologies. Cell Genom. 2024;4(12):100723.
  18. van den Brink SC, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017;14(10):935-936.
  19. Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially resolved transcriptomes—next generation tools for tissue exploration. Bioessays. 2020;42(10):1900221.
  20. Miao J, et al. A practical protocol of processing mineralized tissue for Visium spatial transcriptomics. Mechanobiol Med. 2025;3(4):100163.
  21. Baldwin M, et al. A roadmap for delivering a human musculoskeletal cell atlas. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(11):738-752.
  22. Duan H, Cheng T, Cheng H. Spatially resolved transcriptomics: advances and applications. Blood Sci. 2023;5(1):1-12.
  23. Xiao X, et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 2023;11(1):59.
  24. Jain S, Eadon MT. Spatial transcriptomics in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2024;20(10):659-671.
  25. Tilburg J, et al. Spatial transcriptomics of murine bone marrow megakaryocytes at single-cell resolution. Res Pract Thromb Haemost. 2023;7(4):100158.
  26. Lin W, et al. Mapping the spatial atlas of the human bone tissue integrating spatial and single-cell transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2025;53(2):gkae1298.
  27. Marx V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 2021;18(1):9-14.
  28. Yue L, et al. A guidebook of spatial transcriptomic technologies, data resources and analysis approaches. Comput Struct Biotechnol J. 2023;21:940-955.
  29. Joglekar A, et al. A spatially resolved brain region- and cell type-specific isoform atlas of the postnatal mouse brain. Nat Commun. 2021;12(1):463.
  30. Madissoon E, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023;55(1):66-77.
  31. Wang F, et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023;9(24):eadf5464.
  32. Robinson MH, et al. Regulation of antigen-specific T cell infiltration and spatial architecture in multiple myeloma and premalignancy. J Clin Invest. 2023;133(15):e167303.
  33. Wehrle E, et al. Protocol for preparing formalin-fixed paraffin-embedded musculoskeletal tissue samples from mice for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 2024;5(2):103089.
  34. Sangeetha R, Uma K, Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J Oral Maxillofac Pathol. 2013;17(3):386-391.
  35. Yip RKH, et al. Profiling the spatial architecture of multiple myeloma in human bone marrow trephine biopsy specimens with spatial transcriptomics. Blood. 2025;146(15):1837-1849.
  36. Miquelestorena-Standley E, et al. Effect of decalcification protocols on immunohistochemistry and molecular analyses of bone samples. Mod Pathol. 2020;33(8):1505-1517.
  37. Ambrosi TH, et al. Human skeletal development and regeneration are shaped by functional diversity of stem cells across skeletal sites. Cell Stem Cell. 2025;32(5):811-823.e11.
  38. 10x Genomics. Visium Spatial Platform. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/platforms/visium#assays
  39. Amemiya K, et al. Influence of formalin fixation duration on RNA quality and quantity from formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissues. Pathol Int. 2023;73(12):593-600.
  40. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002;161(6):1961-1971.
  41. Nam SK, et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 2014;48(1):36-42.
  42. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000407, Revision E. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-ffpe/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe-user-guide
  43. Eccher A, et al. Pathology laboratory archives: conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 2024;14(4):333.
  44. Bai Z, et al. Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Cell. 2024;187(23):6760-6779.e24.
  45. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE—Tissue Preparation Guide. Document CG000518, Revision D. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/tissue-prep/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-for-ffpe-tissue-preparation-guide
  46. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000495, Revision G. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026. Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/library-construction/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe
  47. Agilent Technologies. High Sensitivity RNA ScreenTape assay for TapeStation systems quick guide. Version A.01.05. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/HS-RNA_QuickGuide.pdf
  48. Agilent Technologies. Agilent 4200 TapeStation system—System manual. Publication G2991-90000, Version A.02.02. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://download.chem.agilent.com/software/4200_tapestation_user_info_package_v2/tapestation%20user%20information/tapestation%20manuals/agilent%204200%20tapestation%20system%20manual_g2991-90000.pdf
  49. Larrayoz M, et al. Preclinical models for prediction of immunotherapy outcomes and immune evasion mechanisms in genetically heterogeneous multiple myeloma. Nat Med. 2023;29(3):632-645.
  50. Wang S. Resolving the bone – optimizing decalcification in spatial transcriptomics and molecular pathology. J Histotechnol. 2025;48(1):68-77.
  51. Oliveira MF, et al. High-definition spatial transcriptomic profiling of immune cell populations in colorectal cancer. Nat Genet. 2025;57(6):1512-1523.
  52. Bourgain-Chang E, Kuang X, Cang Z, Nie Q. Reconstructing single-cell resolution from spatial transcriptomics with CellRefiner. Nat Commun. 2026;17(1):3304.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דגימות FFPEדקלציפיקציה ב-EDTAחיתוך רקמותשלמות RNAזיהוי סוגי תאיםמורפולוגיה של רקמהניתוח ביטוי גניםאינטגרציה של תא בודד

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.