מאמר שיטה

הכנת דגימות מח עצם מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפרפין עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית באמצעות דה-קלציפיקציה מבוססת EDTA

26 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72474

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

במאמר זה

סיכום

תהליך עבודה סטנדרטי להכנת דגימות עצם מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפרפין (FFPE) עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית כולל שלב דקלציפיקציה של 10 ימים באמצעות EDTA כדי לשמר את שלמות ה-RNA. נקודות בקרה מרכזיות לאיכות מסייעות לקבוע האם הדגימות עומדות בדרישות עבור ניתוח ביטוי גנים מרחבי בהמשך התהליך.

תקציר

מוח העצם (BM) הוא מבנה מורכב ודינמי שבו מערכות יחסים מרחביות משפיעות על התנהגות התאים, על האיתות ועל התפקוד. בשל כך, הבנת הדינמיקה המלאה של אינטראקציות תאיות דורשת טכניקות מרחביות משלימות המשמרות וממפות את ארכיטקטורת אוכלוסיות התאים in situ. למרות התקדמויות משמעותיות בטכנולוגיות של תא בודד שתרמו להבנת ההטרוגניות השעתוקית של רקמת BM בריאה וחולה, הארגון המרחבי של סוגי תאים שונים, תוכניות ויסות ספציפיות לנישה והאינטראקציות ביניהם עדיין דורשים מחקר נוסף. פיתוחים אחרונים בטרנסקריפטומיקה מרחבית אפשרו ניתוח ביטוי גנים לא מוטה עם הקשר מרחבי ברקמות שונות, מה שהופך טכנולוגיות אלו למשלימות לשיטות של תא בודד החסרות רזולוציה מרחבית. בעוד שטרנסקריפטומיקה מרחבית נמצאה בשימוש נרחב ברקמות רכות, השימוש בה ברקמות ממינרליזציה כגון BM נותר מוגבל בשל האתגרים הקשורים לעיבוד רקמת עצם. הפרוטוקול המוצג כאן שימש להכנת דגימות מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפראפין (FFPE) מרקמות בריאות וחולות של עכבר ובני אדם. שלב דה-קלציפיקציה (הסרת סידן) של 10 ימים המבוסס על ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) נכלל כדי לשמר את שלמות ה-RNA ולתמוך בשימוש בטרנסקריפטומיקה מרחבית בדגימות של עצמות ארוכות. פרוטוקול זה מתאר את הכנת דגימות BM לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי, כולל עיבוד רקמה, שימור וחיתוך, כמו גם שלבי הערכת איכות חיוניים, כגון הערכת שלמות החתך, מורפולוגיית הרקמה ואיכות ה-RNA. זרימת העבודה תומכת גם בזיהוי סוגי תאים ובאינטגרציה עם נתוני טרנסקריפטומיקה של תא בודד כדי לאפיין את ההרכב התאי, להגדיר אינטראקציות תא-תא, ולהדמיות של ההפצה המרחבית של תאים הטרוגניים שעתוקית במצבים בריאים וחולים. באופן כללי, זרימת עבודה זו מכינה רקמות בריאות וממאירות ממינרליזציה מלאה לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי תוך שימור ארכיטקטורת ה-BM.

מבוא

מח העצם (BM) הוא איבר מורכב מאוד ומחולק למדורים, המשמש כאתר העיקרי להמטופואזה ולהבשלה של תאי מערכת החיסון1,2. רקמה הטרוגנית זו כוללת מגוון רחב של שושלות תאים המטופואטיים, מזנכימליים, אנדותליאליים ותאי חיסון, אשרים קיימים יחד בנישה תלת-ממדית מאורגנת ומסובבת מאוד3,4. בתוך נישה זו, כל אוכלוסיית תאים תופסת טריטוריות אנטומיות נפרדות, וההקשר המרחבי ממלא תפקיד בסיסי בבקרת ההתנהגות התאית, באיתות ובתפקוד4,5. קרבה פיזית למבנים ספציפיים, כגון עצם טרבקולרית או רשתות כלי דם, מנהלת תהליכים פיזיולוגיים חיוניים, כולל שמירה על מצב של רדום (quiescence) של תאי גזע המטופואטיים (HSC) ועיצוב מחדש של העצם6,7. כתוצאה מכך, מיקרו-סביבה דינמית זו והאינטראקציות המבוקרות בקפידה בין מרכיביה התאיים והסטרומליים מעצבות את רשתות הבקרה השומרות על ההומאוסטזיס ומשפיעות על התקדמותן של מחלות המטולוגיות ממאירות8,9,10,11,12,13.

ההתקדמויות בריצוף RNA של תאים בודדים (scRNA-seq) חוללו מהפכה בהבנתנו את הגיוון התאי של מח העצם (BM), ואפשרו את גילוים של תתי-סוגי תאים שלא זוהו בעבר ואת האינטראקציות החזויות ביניהם בתוך הנישה3,10,11,12,14,15,16. עם זאת, טרנסקריפטומיקה של תאים בודדים, למרות שהיא מציעה מידע ברזולוציה גבוהה על המרכיבים האינדיבידואליים של הנישה ההמטופויטית, מוגבלת מטבעה על ידי תהליך עיכול הרקמה, המפריד את התאים מסביבתם הטבעית ועלול לשנות את מצבם הטבעי17, ועל ידי היעדר ההקשר המרחבי המגדיר את ארגון רקמת העצם4,18. אובדן זה של ההקשר המיקומי הופך את המיפוי המכריע של מקומם של אוכלוסיות ספציפיות המובחנות טרנסקריפציונית, או את האופן שבו הן מקיימות אינטראקציה עם תאים שכנים, לבלתי אפשרי19. יתרה מכך, רקמת עצם צפופה מופרדת לעיתים קרובות באופן חלקי בלבד, מה שמוביל לתת-ייצוג של אוכלוסיות תאים מרכזיות, כגון אוסטאוציטים ואדיפוציטים, במאגרי נתוני scRNA-seq ולייצוג מוטה של ההטרוגניות של הרקמה20,21. טרנסקריפטומיקה מרחבית מאפשרת את חקר ביטוי הגנים in situ, בתוך חתכי רקמה שנשמרו מרחבית, ובכך משחזרת מידע הקשרי ומענייה על המגבלות של טכנולוגיות תאים בודדים8,19,22,23,24,25,26. טכנולוגיה זו מהווה התקדמות חיונית בתחום, שכן היא מאפשרת מיקום מרחבי מדויק וארגון מבני של אוכלוסיות התאים השונות המרכיבות את ה-BM, דבר שאינו ניתן להשמטה להבנת האינטראקציות והתפקידים התפקודיים שלהן בתוך המיקרו-סביבה הטבעית שלהן8,26. יתר על כן, בהקשר של מחלה, טרנסקריפטומיקה מרחבית מאפשרת לחוקרים ולקלינאים לגשר על הפער בין פתולוגיה מסורתית לגנומיקה עם תפוקה גבוהה, מה שמאפשר להם להלביש נתונים מולקולריים על תמונות מורפולוגיות1,8. ניתן לסווג טכנולוגיות של טרנסקריפטומיקה מרחבית לשתי קבוצות עיקריות: שיטות מבוססות ריצוף ושיטות מבוססות דימוי17,24. פלטפורמות מבוססות ריצוף, כגון Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq), ו-Open-ST בקוד פתוח, לוכדות mRNA על מערכים או חרו지를 בעלי ברקודים מרחביים לפני ריצוף מהדור הבא. שיטות מבוססות דימוי, הכוללות Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX, ו-Xenium, מדמיות ישירות טרנסקריפטים in situ באמצעות היברידיזציה מרובת-ערוצים (multiplexed) או כימיה של פרובים מסוג padlock27,28. לחלופין, ניתן לסווג פלטפורמות כבעלות מטרה (targeted) או חסרות מטרה (untargeted), בהתאם לשאלה אם הן דורשות זיהוי מבוסס פרובים17,24.

שיטות של טרנסקריפטומיקה מרחבית יושמו בקלות ברקמות רכות, כגון המוח, הלב והכבד, שבהן יצירת חתכים היסטולוגיים שלמים היא פשוטה29,30,31. לעומת זאת, יישום של טרנסקריפטומיקה מרחבית בעצם הוא מאתגר הרבה יותר בשל טבעו המינרלי, הדורש תהליך של דה-קלציפיקציה (הסרת סידן)32,33, הסרה מבוקרת של סידן-פוספט, ההופכת את הרקמה לרכה מספיק לצורך חיתוך ואנליזות היסטולוגיות או מולקולריות המשך8,20,23,34. שיטות דה-קלציפיקציה מסורתיות המשמשות באופן שגרתי בפרקטיקה קלינית מסתמכות בדרך כלל על תמיסות חומציות חריפות כגון חומצה כלורית, חומצה חנקית, חומצהה פורמית או חומצה זרחתית, אשר פוגעות קשות בשלמות ה-RNA ומשבשת את המורפולוגיה התאית35,36. דגרדציה מולקולרית שכזו מפחיתה את יחס signal-to-noise בבדיקות מרחביות, מה שמוביל לעיתים קרובות לשיעורי זיהוי גנים נמוכים באופן בלתי קביל בהשוואה לרקמות רכות8,10. מגבלה זו מדגישה את הצורך בזרימות עבודה סטנדרטיות של דה-קלציפיקציה המשמרות באופן מהימן את שלמות ה-mRNA בדגימות מינרליות לצורך אנליזות מרחביות מבוססות ריצוף8,20.

פרוטוקול זה מציג תהליך עבודה סטנדרטי להכנת דגימות מח עצם (BM) מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפרפין (FFPE) עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית, כפי שיושם בעבר על ידי Muiños-Lopez et al.8. תהליך העבודה כולל שלב דקאלציפיקציה (הסרת סידן) של 10 ימים באמצעות ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ב-pH מבוקר. בניגוד לחומצות אגרסיביות, EDTA פועל ככלטור עדין המשמר את המבנה המיקרוסקופי ושומר על איכות החומצות הגרעיניות, ובכך תומך בשימושו ביישומים מולקולריים8,20,33,36,37. כהוכחה לקונספט, הפרוטוקול יושם על דגימות רקמת עצם ממודלים של עכברים בריאים ועכברים עם מיאלומה נפוצה (MM), וכן על דגימות מח עצם אנושיות מאנשים בריאים וחולים, ולאחר מכן הדגימות רצפו בפלטפורמת Visium Spatial Gene Expression38. תהליך העבודה כולל פרוצדורות סטנדרטיות לרכישת רקמה מדגימות עצם אנושיות ועכבריות, קיבוע, דקאלציפיקציה, דהידרטציה, הטמעה בפרפין וחיתוך, ולאחריהם תהליך בקרת איכות מקיף הכולל הערכת שלמות החתכים, צביעת hematoxylin and eosin (H&E), הערכת איכות RNA (DV200), ואימונופלואורסצנציה (IF) אופציונלית לאימות סוגי תאים. שלבים מקדימים אלו מבטיחים שרק חתכים באיכות גבוהה יעברו לתהליכי העבודה של טרנסקריפטומיקה מרחבית במורד הזרם, כולל עיבוד מקדים של חתכי הרקמה, בניית ספריות, רצוף ובקרת איכות וניתוח נתונים לאחר מכן.

פרוצדורה סטנדרטית זו תומכת בהכנה ובהערכת איכות של דגימות BM אנושיות ועכבריות לצורך ניתוח טרנסקריפטומי מרחבי. היא נועדה להקל על חקירת תוכניות בקרה ספציפיות לנישה בהפרעות המטולוגיות ושלדיות.

פרוטוקול

כל ניסויי בעלי החיים בוצעו בהתאם לדירקטיבה האירופית 2010/63/EU בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות ואושרו על ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת נבארה (Comité de Ética para la Experimentación Animal; פרוטוקולים CEEA082-20 ו-CEEA039-20). טיפול בבעלי החיים, תפעולם והדרה בוצעו בהתאם לחקיקה הספרדית כדי למזער כאב וסבל.

המחקר בבני אדם אושר על ידי ועדת אתיקה במחקר של בית הספר לרפואה באוניברסיטת נבארה (Comisión de Ética de Investigación, CEI; פרויקטים 2022.100mod1 ו-2023.172) וועדת אתיקה במחקר של שירותי הבריאות של נבארה (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1). כל ההליכים שכללו משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם לעקרונות האתיים של הצהרת הלסינקי. נתונים אישיים טופלו בסודיות ובהתאם לחוק האורגני הספרדי 3/2018 בדבר הגנה על נתונים אישיים והבטחת זכויות דיגיטליות ולחוק הספרדי 14/2007 בדבר מחקר ביו-רפואי.

הערה: רשימה מפורטת של הרכיבים והציוד שנעשה בהם שימוש במחקר זה מופיעה בטבלת החומרים. תהליך העבודה הניסויי המקיף ליישום טרנסקריפטומיקה מרחבית ברקמות עצם מוצג באופן סכמטי ב איור 1 ומאורגן לשלושה שלבי פעולה: השגת דגימות, בקרת איכות (QC), ואפיון טרנסקריפטומי מרחבי. השגת דגימות כוללת איסוף של שברי עצם אנושיים או עכבריים, ולאחריהם קיבוע, דה-קלציפיקציה באמצעות EDTA, דהידרטציה, טמיעה בפרפין, חיתוך והכנת סליידים. שלב בקרת האיכות מעריך את השלמות ההיסטולוגית ואת שימור ה-RNA. חיתוכי עצם מאושרים עוברים לאחר מכן פרמיליזציה של הרקמה על הסלייד, הכנת ספרייה, ריצוף וניתוח נתונים.

figure-protocol-1
איור 1: תהליך איסוף דגימות והכנה מבוססת EDTA עבור רקמות עצם של עכברים ובני אדם. עצמות ירך של עכברים ודגימות עצם של בני אדם נאספות, מקובעות, עוברות דה-קלציפיקציה ב-EDTA, דהידרטציה, הטמעה בפרפין וחיתוך. איכות הדגימה מוערכת באמצעות צביעת H&E והערכת שלמות ה-RNA (DV200), ולאחריהם עיבוד מקדים של הרקמות לטרנסקריפטומיקה מרחבית, הכנת ספרייה, ריצוף ובקרת איכות של הנתונים. קיצורים: BM = מחית עצם; DV200 = אחוז מקטעי ה-RNA הארוכים מ-200 נוקליאוטידים; EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid; H&E = hematoxylin and eosin; QC = בקרת איכות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. רכישה ועיבוד של דגימות רקמת עצם

  1. איסוף עצמות עכבר
    1. הרדימו את בעלי החיים באמצעות 5% איזופלוראן (isoflurane) ואשרו את היעלמות הרפלקסים.
    2. לאחר הרדמה מלאה, בצעו קטיל (euthanasia) באמצעות פריקה צווארית, בהתאם להנחיות המוסדיות והרגולטוריות.
      ​הערה: יש לבצע את ההמתה על ידי כוח אדם מיומן, ויש לוודא את מות בעל החיים לפני תחילת איסוף הרקמות.
    3. חטאו את העור על ידי ריסוס אתנול 70% על פניו הגביים של העכבר, ובעזרת מספריים כירורגיים, בצעו חתך קטן כדי להסיר בזהירות את העור ולחשוף את הגפיים האחוריות.
    4. נתקו את הגפיים האחוריות על ידי חיתוך מעל למפרק הירך והעבירו אותן לשפופרת של 50 מ"ל המכילה 10 מ"ל של Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline קר. (DPBS). הנח את המבחנה על קרח.
    5. הסר שרירים ורקמת חיבור צמודים באמצעות פינצטה סטרילית וסכין מנתחים.
    6. העבירו את העצמות למכל סטרילי של 50 מ"ל הממולא מראש ב-DPBS נקי וקר, ולאחר מכן הניחו את המכל על קרח.
    7. יש לבצע מיד קיבוע של דגימת הרקמה כדי לשמור על שלמות הרקמה.
  2. טיפול בדגימות עצם אנושיות
    1. קבלו ביופסיות גליליות של עצם או רסיסי עצם כירורגיים בתוך מכלים סטריליים של 100 מ"ל.
    2. העבירו את שברי העצם למכל נקי וסטרילי בנפח 100 מ"ל הממולא מראש ב-DPBS קר, ולאחר מכן הניחו אותו על קרח.
    3. יש לבצע קיבוע של הדגימה באופן מיידי כדי לשמור על שלמות הרקמה.
      זהירות: יש לטפל בדגימות אנושיות תחת תנאי BSL 2.
  3. קיבוע רקמת עצם
    1. קחו את המכל בנפח 50 מ"ל או 100 מ"ל המכיל את דגימת העצם והשליכו את ה-DPBS.
    2. סמנו את הקסטות מפלסטיק והכניסו את דגימות העצם לקסטות בודדות. סגרו את המכסים היטב כדי למנוע אובדן רקמה במהלך השלבים הבאים של העיבוד.
      ​הערה: עבור דגימות עכבר, יש להניח עצם אחת בכל קסטה. עבור דגימות עצם אנושיות, במידת הצורך, השתמשו בסקאלפל סטרילי כדי לחתוך את הרקמה למקטעים קטנים מספיק כדי שייכנסו לקסטות סטנדרטיות, והניחו מקטע אחד בכל קסטה. אם דגימות עצם אנושיות קשות מדי לחיתוך בשלב זה, ניתן להשאירן שלמות ולהעבירן לתמיסת הדקאלציפיקציה (הסרת הסידן); לאחר הדקאלציפיקציה, ניתן לחתוך את הרקמה שריכה למקטעים בגודל מתאים ולהניחם בקסטות מסומנות.
    3. הוסיפו תמיסת פורמאלדהיד מנוטרלת בריכוז 4% ביחס של 1:20 בין הדגימה למקבע, והדגירו את הדגימה למשך 24 שעות ב- 4 °C.
      זהירות: יש לטפל בחומר הקיבוע בתוך מופה כימית בשל רעילותו ואדיו הנדיפים.
      הערה: הימנעו מקיבוע יתר (>(48 שעות), דבר המפחית את שלמות ה-RNA בתהליכי עבודה של FFPE39.
  4. דה-קלציפיקציה של רקמת עצם ממינרלית
    1. יש להשליך את הפורמלין ולשטוף את דגימת העצם במים אולטרה-טהורים. יש לשטוף במים, לנער קלות ולהשליך את הנוזל כדי להסיר את שאריות הפורמלין שנותרו.
    2. הכינו תמיסת EDTA בריכוז 0.25 M במים אולטרה-טהורים וכווננו את ה-pH ל-6.95.
      הערה: אף על פי שבפרוטוקולי דה-קלציפיקציה (הסרת סידן) מסורתיים ה-pH של EDTA מכוון לעיתים קרובות ל-8.0, תהליך עבודה זה משתמש ב-EDTA ב-pH של כ-6.95 כדי לתמוך בקילאציה יעילה תוך שימור מורפולוגיית הרקמה ואיכות ה-RNA8.
    3. הוסיפו את תמיסת ה-EDTA למכל המכיל את דגימת העצם והדגירו למשך 10 ימים ב- 4 °C בעירבוב עדין.
      ​הערה: עבור דגימות עכבר, כמות של כ-50 מ"ל של תמיסת EDTA היא בדרך כלל מספקת. עבור דגימות עצם אנוש, נעשה בדרך כלל שימוש בכ-100 מ"ל. עם זאת, ניתן להתאים נפח זה בהתאם לגודל העצם כדי להבטיח טבילה מלאה ודה-קלציפיקציה (הסרת סידן) יעילה.
    4. לאחר 5 לאחר מספר ימים של דקלציפיקציה, יש לשפוך את תמיסת ה-EDTA ולהחליפה בנפח זהה של EDTA טרי, כיוון שקיבולת הקילציה נסaturated עם הזמן. המשך את האינקובציה באותם תנאים.
    5. לאחר 10 ימי דגירה, יש להסיר את תמיסת ה-EDTA ולהעריך האם תהליך דה-הסידן (decalcification) הושלם.
      1. בצעו חתך קטן באמצעות סכין מנתחים סטרילית או הכניסו מחט סטרילית דקה לפינה או לאזור היקפי של הרקמה, תוך בחירה תמידית של אזור בעל רלוונטיות אנליטית נמוכה כדי למנוע שינוי של האזורים הנחקרים. הניחו את העצם על צלחת פטרי סטרילית כדי לייצב את הדגימה במהלך החיתוך או החדרת המחט. אם ניתן לחתוך את הרקמה בקלות או אם המחט עוברת בהתנגדות מינימלית, הדגימה עברה דקלציפיקציה מספקת.
      2. במקרה של עצמות ירך של עכברים, כופפו בעדינות את העצם בעזרת פינצטה כדי להעריך את הגמישות, המהווה אינדיקטור מהימן להסרה מלאה של המינרלים.
        הערה: משך שלב דה-הסמכה (decalcification) תלוי בגודל ובעובי דגימת העצם, וכן בנפח ה-EDTA שנעשה בו שימוש. אם העצם נותרת קשיחה לאחר תקופת הדגירה הראשונית, יש להמשיך בתהליך דה-הסמכה עד שהרקמה תהיה רכה מספיק כדי שניתן יהיה לחתוך אותה בקלות. הארכה ממושכת מדי עלולה לפגוע באיכות הרקמה ובשלמות ה-RNA, ולכן יש להגביל את ההארכה לזמן המינימלי הדרוש להשגת ריכוך מספק.20.
  5. התייבשות
    1. שטפו על ידי הוספת מים אולטרה-טהורים למכל המכיל את דגימת העצם, ולאחר מכן הדגירו למשך 5 דקות ב- 4 °C עם ערבוב.
    2. שפכו את המים והחליפו אותם בתמיסת אתנול 70%. הדגירו למשך שעה אחת ב- 4 °C.
      הערה: שלב זה יכול לשמש כנקודת עצירה. ניתן לאחסן דגימות באתנול 70% ב- 4 °C לפני ההמשך לשלבים הבאים. משך האחסון המקסימלי לא תוקף ניסיונית בפרוטוקול זה, ולכן על המשתמשים לפעול בהתאם לנהלי העבודה הסטנדרטיים של המעבדה שלהם.
    3. בצעו דהידרציה רצפית לדגימה בריכוזים עולים של אתנול (70%, 80%, 96%; 1 כל אחד ב- 4 °C), ולאחר מכן ב-100% אתנול למשך לילה ב- 4 °C.
    4. יש להסיר את האתנול 100% ולהחליפו בקסילן (xylene). יש להדגיר למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. יש להשליך את הקסילן ולהניח את קסטת הדגימה בכלי זכוכית המכיל פראפין נקי מומס. יש להדגיר בפראפין מומס למשך לילה בטמפרטורה של 60 °C.
      הערה: ניתן להשתמש בזמני חדירה קצרים יותר כאשר קיימות מערכות עיבוד מסייעות בוואקום, שכן מכשירים אלו מקלים על חדירה יעילה יותר של פראפין40,41,42.
      CAUTION: All steps involving xylene and graded ethanol solutions must be performed inside a chemical fume hood to ensure proper ventilation and to minimize exposure to toxic and flammable vapors.
  6. טמיעה בפרפין
    ​הערה: נקה את משטחי תחנת ההטמעה (embedding station) באמצעות תמיסה לדיקונטמינציה של RNase כדי למנוע פירוק של RNA.
    1. הפעילו את תחנת ההטמעה וחממו מראש את מאגר הפרפין, את אמבט הפרפין לקסטות, את אמבט הפרפין לתבניות ואת פלטת החימום לתבניות ל- 60 °Cהפעל את פלטת הקירור כדי לאפשר לה להתקרר לפני השקיעה.
    2. יש להמתין להמסה מלאה של הפרפין, ורק לאחר מכן להניח את הקסטות המכילות דגימות שחודר אליהן פרפין לאמבט הפרפין לקסטות. יש להדגיר למשך שעתיים כדי להבטיח סילוק מלא של הקסילן לפני הכבישה.
    3. הניחו את כל התבניות הדרושות באמבט הפרפין לתבניות.
      הערה: עבור דגימות אנוש, השתמשו בתבניות הטמעה ממתכת סטנדרטיות. עבור דגימות עכבר, השתמשו בתבניות הטמעה מפלסטיק התואמות לפלטפורמת Visium, הכוללות חלל ריבועי בממדים המתאימים להנחה נכונה של חתכים על שקופיות Visium. מכיוון שעצמות עכבר שלמות אינן נכנסות במלואן לחלל הריבועי של תבניות אלו, חתכו את העצמות מיד לפני ההטמעה באמצעות סקלפל סטרילי כדי לקבל פרגמנטים בגודל מתאים. ניתן להטמיע פרגמנט עצם אחד או שניים בכל תבנית, בהתאם לממדיהם.
    4. הוסיפו שכבה בסיסית דקה של פראפין טרי על ידי מזיגה של פראפין מומס מהפתח המרכזי של תחנת ההטמעה.
    5. פתחו את הקסטה והעבירו בעדינות את הרקמה מהקסטה לתבנית באמצעות פינצטה חמה.
    6. הניחו את התבנית המלאה בפראפין על לוח חימום התבניות, ובזמן שהפראפין עדיין נוזלי, כווןו את הרקמה למישור החיתוך הרצוי באמצעות פינצטה חמה.
    7. הנח את התבנית על המשטח הקר של תחנת ההטמעה כדי לקבע לזמן קצר את מיקומו של שבב העצם.
    8. מלאו את התבנית במלואה בפרפין מותך מהדיספנסר, תוך הבטחה שהרקמה מכוסה לחלוטין ושלא נותרו בועות אוויר גדולות.
    9. מקם את הקסטה המסומנת מעל התבנית כך שתהווה את הבסיס של בלוק הפרפין.
    10. העבירו את התבנית עם הקסטה המחוברת אליה אל הפלטה הקרה של תחנת ההטמעה. המתינו 10 דקות עד שהפרפין יתגבש לחלוטין, ובלוק השעווה יהיה אטום ומוצק.
    11. לאחר שהתגבש, הוצא את בלוק הפרפין מהתבנית ואחסן אותו ב- 4 °C עד לשלב החיתוך.
      הערה: שלב זה יכול לשמש כנקודת עצירה. ניתן לאחסן את בלוק הפרפין ב- 4 °C; עם זאת, במידת האפשר, יש לבצע את חיתוך הרקמה ואת ניתוחי הטרנסקריפטומיקה המרחבית העוקבים בהקדם האפשרי לאחר הקיבוע בבלוק (embedding), כדי למזער את פירוק ה-RNA במהלך האחסון43,44.
  7. חיתוך דגימות והכנת סליידים
    הערה: יש לנקות את המיקרוטום ואת אמבט המים באמצעות תמיסה לדה-קונטמינציה של RNase כדי למנוע פירוק של RNA.
    1. מלאו את מקבץ המים במים מזוקקים וחממו אותו מראש ל- 42 °Cהפעילו את המיקרוטום והתקינו להב חדש. סמנו את שלביות המיקרוסקופ בעזרת עיפרון.
    2. מקמו את בלוק הפרפין במחזיק הדגימות, תוך וידוא שהקסיה מכוונת בהתאם למישור החיתוך האורכי הרצוי.
      ​הערה: הכינו שקית פלסטיק מלאה בקרח, וכאשר החיתוך הופך למאתגר בשל פראפין רך, הניחו את שקית הקרח ישירות על הבלוק בעודו מורכב במיקרוטום, וקבעו אותה בעזרת גומייה למשך מספר דקות כדי להקשיח את הפראפין ולשפר את איכות החתכים.
    3. הגדירו את עובי החיתוך של המיקרוטום ל-20 µm ובצעו את חיתוכי הקיצוף.
    4. שנו את הגדרת המיקרוטום ל-5 µmאסוף ארבעה 5 µm מקטעים לתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, המסומנת וחופשייה מ-RNase. יש לשמור את המבחנה על קרח יבש ולאחסן ב-80 °C.
    5. המשך את החיתוך ב-5 µm והניחו את סרטי הרקמה לצוף באמבט המים. ברגע שהחתך התפשט לחלוטין והוא נקי מקמטים, הסירו אותו באמצעות השקופית המסומנת.
      1. בכל מספר קבוע של חתכים (למשל, כל 5-10 סרטי רקמה, תלוי בגודל הרקמה), אספו 4 או 5 חתכים נוספים µm קטעים לתוך מבחנה מסומנת חדשה בנפח 1.5 מ"ל. חזור על תהליך זה עד לקבלת סך של שלוש מבחנות בנפח 1.5 מ"ל המכילות 5 µm סעיפים
        הערה: אם הרקמה נסדקת, נשברת, או שלא ניתן להשיג ממנה חיתוך רציף, הדגימה אינה דקלציפית (נטולת סידן) באופן מלא ודורשת זמן דקלציפיקציה נוסף. השב את הדגימה על ידי ביצוע הפוך של שלבי סבב העבודה עד להגעה לשלב הדקלציפיקציה. לשם כך, המס את בלוק הפרפין ב- 60 °C במשך כשעתיים, והעבר את הדגימה לקסילן (xylene) (שעתיים). בצע רהידרטציה לדגימה באמצעות תמיסות אתנול בריכוזים מדורגים (100%, 96%, 80%, 70%) ולאחר מכן במים מזוקקים. החזר את הדגימה שעברה רהידרטציה ל-EDTA 0.25 M טרי (pH 6.95) והארך את תקופת הדקאלציפיקציה לפי הצורך לפני המעבר לדהידרטציה, הטמעה מחדש וחיתוך. יש להשתמש בהליך שחזור זה אך ורק כאפשרות אחרונה, שכן ביטול תהליך ה-FFPE עלול לפגוע בשלמות ה-RNA.
    6. הנח את השקופיות ב... 37 °C בתנור למשך לילה כדי לאדות שאריות מים, ולאחר מכן אחסנו אותם ב- 4 °C.
    7. כדי לשפר את היצמדות הרקמה, ניתן במקרה הצורך לחמם את השקופיות למשך 3 שעות ב- 42 °C לפני דגירה שלהם למשך לילה ב- 37 °C.
      הערה: שלב זה בדרך כלל אינו נחוץ בעת שימוש בlamelles הזכוכית המפורטות ב- טבלת חומריםכיוון ששקופיות אלו מספקות היצמדות חזקה והרקמה בדרך כלל נותרת קשורה היטב לאורך כל תהליך העיבוד. שלב זה יכול לשמש כנקודת עצירה. ניתן לאחסן את השקופיות ב- 4 °C; עם זאת, במידת האפשר, יש לבצע ניתוחים טרנסקריפטומיים מרחביים במורד הזרם בהקדם האפשרי לאחר ההטמעה, כדי למזער את פירוק ה-RNA במהלך האחסון43,44.

2. הערכת איכות הדגימה

  1. הערכת איכות החתך
    1. בחן את כל החתכים one by one תחת מיקרוסקופ אור פשוט (brightfield) סטנדרטי (4×–10×). יש לבחון כל זכוכית כדי לוודא שהחתכים אינם מפוצלים ולתעד את איכותו של כל חתך.
      ​הערה: יש לבדוק אם קיימים קפלים, קמטים, דחיסות או סימני רטט (chatter marks), העלולים להעיד על בעיות בקשיות הפרפין, בחדות הלהב או בדקלקציפציה (הסתייך) לא מלאה. יש לוודא שאין אזורים חסרים ברקמה עקב ניתוק במהלך החיתוך או בזמן ההעברה לאמבט המים.
    2. בחר את החתכים השמורים ביותר עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית (השלמים ביותר, בעלי המורפולוגיה הטובה ביותר).
    3. זהה את המקטעים העוקבים הסמוכים לאלו שנבחרו ושמור אותם עבור H&צביעת E ו-IF, תוך הבטחה שהתמונה הצבועה תתאים באופן הדוק ככל האפשר לרקמה שתעבור ריצוף.
  2. ה&צביעת E לבדיקת שלמות הרקמה
    1. הניחו את השקופיות במעמד זכוכית לצביעת שקופיות והדגירו אותן למשך 15 דקות ב- 60 °C.
    2. העבירו את המתקן לצנצנות צביעה מזכוכית המכילות קסילן למשך 15 דקות
    3. בצעו רהידראציה לחתכים על ידי העברת המתקן דרך צנצנות צביעה המכילות אתנול בריכוזים של 100%, 96%, 80% ו-70%, עם דגירה של 5 דקות בכל תמיסה.
      ​זהירות: יש לבצע את כל השלבים הכוללים קסילן (xylene) ותמיסות אתנול בריכוזים מדורגים בתוך מנדף כימי כדי להבטיח אוורור תקין ולמזער את החשיפה לאדים רעילים ודליקים.
    4. שטפו את העגיות למשך 5 דקות בתוך צנצנת צביעה מלאה במים.
    5. טבול את המתקן ב-hematoxylin למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטוף תחת זרימת מים מהברז עד שמי השטיפה יהיו צלולים.
    6. טבל את התושבת במים המכילים חמש טיפות של חומצה כלורית מרוכזת, תוך ערבוב עדין עד להופעת גוון אדמדם.
    7. העבירו את המתקן למים הרוויים בליתיום קרבונט עד להופעת צבע כחול יציב, ולאחר מכן שטפו קצרה במים.
    8. צבע את החתכים ב-eosin בריכוז 1% (משקל/נפח) למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטוף שוב במים.
    9. בצעו דהידרטציה למשקופיות על ידי העברת המתקן דרך צנצנות צביעה המכילות מים, ואתנול בריכוזים של 70%, 80%, 96% ו-100%, עם דגירה של 5 דקות בכל תמיסה.
    10. בצע שקיפות של הנסכיים ב-xylene למשך 15 דקות דקות
    11. ייבשו בעדינות את גבם של השקופיות, מרחו חומר קיבוע (mounting medium) על זכוכית כיסוי, וקבעו את החתכים. הניחו לשקופיות להתייבש ב- טמפרטורת החדר למשך 24 שעות שעות לפני הדימות.
    12. בצעו דימוי רקמה באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה בהגדלה של 20x.
      הערה: בצע H&צביעת H&E על חתכים סמוכים ראשית כשלב של בקרת איכות להערכת התאמת הדגימה לטרנסקריפטומיקה מרחבית. לאחר הבחירה, בצע צביעת H&E שנייה&צבעו ב-E ישירות על החתך המיועד לטרנסקריפטומיקה מרחבית, בהתאם להנחיות היצרן להכנת רקמות עבור פלטפורמת הביטוי הגנטי המרחבית המפורטת ב- טבלת חומרים.
  3. הערכת שלמות ה-RNA (DV200)
    ​הערה: עבור פרוטוקול ביטוי גנים מרחבי, מדד מספר שלמות ה-RNA (RIN) המסורתי אינו יעיל, כיוון שפיקי ה-RNA ריבוזומלי 18S ו-28S חסרים בדרך כלל ברקמות מקובעות. לכן, מדד ה-DV200, המוגדר כאחוז מקטעי ה-RNA הגדולים מ-200 נוקלאוטידים, משמש בדרך כלל כפרמטר איכות מספק מידע רב יותר מאשר ה-RIN. עבור דגימות קליניות שעברו דגרדציה. עבור Visium v2, חברת 10x Genomics ממליצה להשתמש בבלוקי FFPE עם ערך DV200 של 30% $\ge$ כדי להבטיח היברידיזציה יעילה של הפרובים וביצועי בדיקה אופטימליים. בחירה בבלוקי רקמה עם ערכי ה-DV200 הגבוהים ביותר הזמינים מסייעת במניעת נשירות ברצף (sequencing dropouts) וממקסמת את הרגישות של הנקודות (spots).
    1. הוצא את מבחנות ה-1.5 מ"ל המכילות את ה- 5 µm את הפרוסות שנאספו במהלך שלב חיתוך הרקמה והנח אותן על קרח לצורך מיצוי RNA.
    2. מיצוי RNA כולל. הליך סטנדרטי זה כולל הסרת פאראפין מהדגימה, עיכול באמצעות proteinase K כדי לבטל קשרי צלב של פורמלין, הסרת DNA גנומי באמצעות טיפול ב-DNase I, ואלוציה סופית של ה-RNA המזוקק במים נקיים מ-RNase.
    3. הערכת שלמות ה-RNA באמצעות מערכת המבוססת על אלקטרופורזה קפילרית עם בדיקת RNA ברגישות גבוהה. סיכום של תהליך העבודה מוצג ב- קובץ משלים 142,45,46,47,48.
  4. צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) רשות לאימות סוג התא
    1. הנח את שקופית ה-FFPE במערך צביעה לשקופיות זכוכית והדגרה למשך 15 דקות ב- 60 °C.
    2. העבירו את המתקן לצנצנות צביעה מזכוכית המכילות ಕ್סילן למשך 15 דקות
    3. בצעו רהידרטציה לחתך על ידי העברת המתקן דרך אתנול בריכוזים של 100%, 96%, 80% ו-70%, למשך 2 דקות בכל ריכוז, ולאחר מכן למשך 5 דקות במים ו-5 דקות ב-PBS-Tween (מحلול 1x PBS בתוספת 0.1% Tween-20).
      CAUTION: All steps involving xylene and ethanol must be performed inside a chemical fume hood.
    4. בצעו שחזור אנטיגן (antigen retrieval) בהתאם להמלצות היצרן עבור הנוגדן הראשוני, תוך וידוא כי באפר השחזור, רמת ה-pH ותנאי החימום תואמים לדף הנתונים (datasheet) של הנוגדן. הערה: בתהליך עבודה זה, שחזור האנטיגן מבוצע באמצעות 10 mM Tris ו-1 mM EDTA, pH 9.0, במערכת חימום של סיר בישול למשך 30 דקות ב- 95 °C, ולאחר מכן קוררו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. שטפו את הפית השקופה פעמיים, למשך 10 דקות בכל פעם, ב-PBS-Tween.
    6. ציירו מחסום הידרופובי מסביב לרקמה באמצעות עט למחסום הידרופובי, ומנעו קישור לא ספציפי על ידי הנחת 5% BSA ב-1x DPBS על נתחי הרקמה למשך 40 דקות לפחות דקות בטמפרטורת החדר בתא לח**.
      הערה: את התא הלח יש להכין על ידי הנחת גיליון של נייר סינון בתוך קופסת צביעה של למסליידים מפלסטיק, והרטבתו היטב במים מזוקקים כדי לשמור על סביבה לחה ויציבה במהלך דגירת הנוגדנים.
    7. הכינו את תמיסת הנוגדן הראשוני ב-1x DPBS בדילול המומלץ עבור כל נוגדן.
      הערה: בזרימה זו, נעשה שימוש בנוגדנים ראשוניים נגד Emcn (V.7C7) ו-Cd271 (ME20.4) כדי לזהות תאי אנדותל (EC) ותאי גזע מזנכיים (MSC) של עכבר, בהתאמה, בעוד שנוגדנים נגד CD31 (JC70A) או PRRX1 (פוליקלונלי) שימשו לזיהוי המקבילות האנושיות שלהם, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    8. הסר את תמיסת החסימה על ידי טפיחה עדינה של קצה השקף על נייר סופג להסרת טיפות שאריות, ולאחר מכן מרח את תערובת הנוגדן הראשוני והדגר את השקף למשך הלילה ב- 4 °C בתא לחות.
    9. שטפו את הפלטה פעמיים למשך 5 דקות ב-PBS-Tween והכינו את תמיסת הנוגדן המשני בדילול המומלץ על ידי היצרן, תוך הבטחה שהפלואורופורים תואמים ספקטרלית ואינם חופפים.
      הערה: בתהליך עבודה זה, נעשה שימוש בנוגדן שני מצומד ל-Alexa Fluor בדילול של 1:200.
    10. יש להוסיף את תערובת הנוגדנים המשניים ולהדגיר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מאור בתא לח**.
    11. שטוף את הפיתוח פעמיים למשך 5 דקות ב-PBS-Tween.
    12. יש להחיל דילול של 1:10 של תוך המטבלה (mounting medium) המכיל DAPI (ראו טבלת חומרים), שהוכן בתמיסת PBS-גליצרול ביחס של 1:1, ולהדגיר את הדגימה למשך 5 דקות.
    13. הצמד את הסבך עם זכוכית כיס ואטום את הקצוות באמצעות לק ציפורניים כדי למנוע התייבשות.
    14. בצעו ויזואליזציה של הרקמה הצבועה באמצעות פלטפורמת דימוי רב-ספקטרלית.

קובץ משלים 1: סיכום של שלבי הפרוטוקול להערכת שלמות ה-RNA ותהליך העבודה של Visium Spatial Transcriptomics. קובץ משלים זה מספק סיכום מפורט של שלבי הפעולה שבוצעו בהתאם להוראות היצרן. הוא כולל: (i) את ה-High Sensitivity RNA ScreenTape Assay ששימש להערכת שלמות ה-RNA (DV200) כפי שמתואר בשלב 2.3.3 של הפרוטוקול הראשי, ו-(ii) סקירה כללית של תהליך העבודה של Visium CytAssist Spatial Gene Expression הכולל עיבוד מקדמי של רקמה, הכנת ספרייה וריצוף (שלבים 3.1–3.3 של הפרוטוקול הראשי).אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

3. טרנסקריפטומיקה מרחבית

הערה: בצע את תהליך העבודה של הטרנסקריפטומיקה המרחבית באמצעות הפלטפורמה והריאגנטים המפורטים ב- טבלת חומרים, בהתאם למדריכי המשתמש המתאימים42,45,46. קובץ משלים 1 מסכם את השלבים העיקריים של עיבוד מקדים של הרקמה, הכנת הספרייה והריצוף.

  1. בקרת איכות של נתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית
    1. בצע דה-מולטיפלקס (Demultiplex) לנתוני הטרנסקריפטומיקה המרחבית באמצעות צינור העיבוד הסטנדרטי למערכי נתונים של Visium (ראה טבלת חומרים).
    2. מפה את הקריאות לגנום הייחוס המתאים של Ensembl 105.
      הערה: עבור דגימות אנוש נעשה שימוש ב-GRCh38 ועבור דגימות עכבר ב-mm10.
    3. צור את מטריצות התכונה-ברקוד המסוננות באמצעות אותו צינור עיבוד וייבא אותן לסביבת ניתוח התאים הבודדים/הניתוח המרחבי (ראה טבלת חומרים).
    4. בחן את תמונות ה-H&E בממשק הוויזואליזציה המסופק על ידי צינור העיבוד של הטרנסקריפטומיקה המרחבית (ראה טבלת חומרים) והסר ידנית נקודות (spots) החופפות לאזור העצם הקורטיקלית או לרקמת עצם, בהתאם למערך הנתונים.
    5. נרמל את מערכי הנתונים באמצעות שיטת טרנספורמציה לייצוב שונות (variance‑stabilizing transformation) הנפוצה בתהליכי ניתוח של תאים בודדים (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

כדי להעריך את ישימותו של תהליך עבודה זה המבוסס על EDTA במגוון מינים והקשרי מחלה, הופעל הפרוטוקול על ארבע דגימות של מח עצם (BM): שתי פמוריות של עכברים ושתי דגימות עצם אנושיות המייצגות מצבים בריאים ומצבים של מיאלומת כוורת (multiple myeloma - MM) (טבלה 1 ו-איור 1).

זיהוי דגימותמיניםמיןגילמחלה
YFPcγ1עכברנקבה210 ימיםבריא
mMMעכברזכר314 ימיםMM
hHBMבן אדםזכר76 שניםבריא
hMMבן אדםנקבה50 שנהמיאלומת פולה (MM)

טבלה 1: דגימות עצם של עכברים ובני אדם שנכללו במחקר. עבור כל דגימה מצוינים המין, המין הביולוגי, הגיל ומצב הבריאות. קיצורים: hHBM = מחית עצם אנושית בריאה; hMM = מיאלומה מרובה אנושית; mMM = מיאלומה מרובה של עכברים; MM = מיאלומה מרובה; YFPcγ1 = עכבר ביקורת בריא.

הדגימות ששימשו במחקר זה אופיינו ודווחו בעבר בפרסומים קודמים של קבוצת המחקר, ובמיוחד בעבודותיהם של Muiños-Lopez et al. ו-Cenzano et al., למעט דגימת העכבר MM. עבור הדגימות שדווחו בעבר, נתוני התעתוק המרחבי (spatial transcriptomics) והתוצאות מוצגים באותם מחקרים8,10. לפיכך, החומר המוצג כאן משמש להערכת ההתאמה הטכנית של הפרוטוקול לתעתוק מרחבי, ולא להצגת ממצאים ביולוגיים חדשים.

דגימות של עצם הירך מעכברים הושגו ממודל עכברי MM מהונדס גנטית מסוג BIC (BIcγ1), המשחזר את המאפיינים הקליניים והאימונולוגיים של חולי MM, ומעכברי ביקורת בריאים תואמים (YFPcγ1)8,49. עצם ירך אחת מכל בעל חיים נלקחה, נוקתה ועובדה בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי (איור 2A). עצמות ירך שימשו ספציפית לאנליזות אלו מכיוון שהן מספקות כמות שפע של מח עצם זמין, איכות נישה מעולה וקלות בעיבוד הניתן לשחזור, מה שהופך אותן למתאימות מאוד לפלטפורמה של טרנסקריפטומיקה מרחבית מבוססת ריצוף8,10. דה-קלציפיקציה מוצלחת של עצם הירך של עכבר הביקורת אושרה באופן מאקרוסקופי על ידי עלייה ניכרת בגמישות הרקמה במהלך מניפולציה ידנית עם פינצטה (איור 2B). לאחר מכן, מקטע עצם זה הוטמע ביעילות בפרפין באמצעות תבנית מיוחדת התואמת לטרנסקריפטומיקה מרחבית, על מנת לשמר את שלמות ה-RNA ואת ארכיטקטורת הרקמה לצורך אנליזה מולקולרית בהמשך (איור 2C).

שתי דגימות מחית גרמית (BM) אנושיות עם היסטוריות עיבוד מנוגדות נותחו גם הן8,10. דגימה טרייה של מחית גרמית אנושית מבריאה מבחינה המטולוגית הושגה מפסולת ניתוחית במהלך החלפת מפרק ירך אורתופדית ב-Hospital Universitario de Navarra (איור 2D–F). כדי להדגים את התועלת התרגומית של הפרוטוקול, דגימה זו עובדה כדגימות עכבריות. בהתאמה לתוצאות שנצפו ברקמת עכבר, דה-קלציפיקציה מוצלחת של עצם אנושית באמצעות EDTA אושרה מקרוסקופית על ידי ריכוך מלא של הרקמה, כפי שבא לידי ביטוי בחדירה חסרת מאמץ של מחט (איור 2E). מקטע העצם האנושית לאחר דה-קלציפיקציה הוטמע בהצלחה בפרפין באמצעות תבנית מתכת סטנדרטית לצורך עיבוד המשכי (איור 2F). הדגימה האנושית השנייה consisted מביופסיות מחית גרמית בשימור FFPE שנשמרו בארכיון מרכס האיליאק (iliac crest) של חולה MM במחלקה הפתולוגית של Clínica Universidad de Navarra (CUN). ראוי לציין שדגימת MM ארכיונית זו עברה בעבר דה-קלציפיקציה באמצעות פרוטוקול קליני סטנדרטי הכולל חומצות חזקות36. דגימה זו מספקת ניגוד איכותי לדגימות שעובדו ב-EDTA; עם זאת, הבדלים במקור הרקמה, בהיסטוריית הקיבוע, באחסון ובדה-קלציפיקציה פירושם כי לא ניתן לייחס את ההבדלים שנצפו לסוכן הדה-קלציפיקציה בלבד.

figure-results-1
איור 2: דגימות עצם של עכברים ובני אדם במהלך הכנה מבוססת EDTA. (A) עצמות ירך של עכברי ביקורת שלמות לפני דה-קלציפיקציה. (B) עצם ירך של עכבר ביקורת לאחר דה-קלציפיקציה, המראה גמישות מוגברת. (C) רגבי עצם של עכבר ביקורת הטמעים בפרפין. (D) רגבי עצם אנושיים בריאים מניתוח ירך לפני דה-קלציפיקציה. (E) אותו רגב לאחר דה-קלציפיקציה באמצעות EDTA, המראה חדירת מחט. (F) עצם אנושית בריאה לאחר דה-קלציפיקציה ב-EDTA, הטמעה בפרפין. סרגלי קנה מידה: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. קיצור: EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לנתח את ארכיטקטורת הרקמה הכללית, בוצע צביעת H&E (איור 3). השימור המורפולוגי הטוב יותר שנצפה בחתכים של העכבר עשוי לשקף הבדלים בטיפול ובעיבוד הדגימות ולא תכונות מולדות ספציפיות למין. עצמות הירך של העכברים נאספו במיוחד עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית ועובדו מיד כעצמות שלמות, ובכך נשמרה הארכיטקטורה שלהן (איור 3A, B). לעומת זאת, הדגימות האנושיות מקורן הוא חומר שאריות שהתקבל במהלך ניתוח להחלפת מפרק הירך (איור 3C) או ביופסיות עצם אבחנתיות של MM (איור 3D)), ששתיהן עשויות להיות בעלות איכות רקמה קדם-אנליטית משתנה. כתוצאה מכך, ההבדלים המורפולוגיים בין הדגימה האנושית שעברה דקלציפיקציה ב-EDTA לבין ביופסיות ה-MM שעברו דקלציפיקציה בחומצה הם מזעריים, שכן שתי הדגימות האנושיות כבר מראות מגבלות מבניות בסיסיות שנוצרו לא רק כתוצאה מהדקלציפיקציה אלא גם כתוצאה מעיבוד רקמה כללי (איור 3C, D). לפיכך, הערכה מקיפה של איכות הדגימה עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית דורשת בחינה של מספר פרמטרים נפרדים. ראשית, יש לנטר בקפידה את שלמות הרקמה, שכן השימור המבני עשוי להשתנות באופן משמעותי בהתאם לסוג הדגימה הספציפי ולא רק בהתאם לחומצת הדקלציפיקציה שנעשה בה שימוש. שנית, יש להעריך גם את איכות ה-RNA, מכיוון שתנאי הדקלציפיקציה עשויים להשפיע עליה20,35,36.

figure-results-2
איור 3: חתכים צבועים ב-H&E ששימשו להערכת איכות הרקמה. חתכי FFPE עוקבים תואמים ל (A) עכבר בקבוצת ביקורת בריאה10, (B) עכבר עם MM, (C) עצם אנושית בריאה8,10, ו (D) ביופסיה של MM אנושית8. סרגי קנה מידה = 500 µm. קיצורים: FFPE = formalin-fixed, paraffin-embedded; H&E = hematoxylin and eosin; MM = multiple myeloma. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

כדי להשלים את הניתוח ההיסטולוגי, הוערכה איכות ה-RNA. בעוד שצביעת H&E הניבה הבדלים מעומעמים, שלמות ה-RNA הבחינה בבירור בין ההשפעות של שתי שיטות דה-קלציפיקציה (טבלה 2). ערכי DV200 הן מהדגימות של העכברים והן מדגימת עצם האדם הבריאה עלו מהסף המומלץ עבור בדיקות Visium FFPE, מה שמעיד על התפלגות אורך מקטעי RNA מספקת עבור היברידיזציה של גששים ובניית ספרייה. דגימת העכבר הבריא YFP מראה DV200 של 82.55%, ודגימת עצם האדם הבריאה (hHBM) מגיעה ל-58%, שניהם גבוהים בהרבה מסף הקבלה של 30% שהגדירה 10x Genomics. דגימת עכבר ה-MM (mMM) מראה DV200 של 31.3%, קרוב לגבול התחתון של הקבלה, דבר שעשוי לשקף אחסון ממושך של בלוק הפרפין ב-4 °C לפני החיתוך, לצד גורמים ספציפיים לדגימה. לעומת זאת, ביופסיית MM אנושית שעברה דה-קלציפיקציה חומצית (hMM) מראה DV200 של 8% בלבד, מה שהיה קשור לשלמות RNA נמוכה באופן משמעותי, גם כאשר ההרס המורפולוגי פחות בולט. לסיכום, ביצוע הערכות מבניות ומולקולריות כאחד הוא חשוב להערכת התאמת הדגימה לניתוח מרחבי בהמשך התהליך.

זיהוי דגימותDV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200: אחוז מקטעי ה-RNA הכוללים > 200 נוקלאוטידים.
2דגימה זו עברה דקאלציפיקציה באמצעות פרוטוקול קליני סטנדרטי הכולל חומצות חזקות.

טבלה 2: איכות ה-RNA של דגימות המחקר. DV200 הוא אחוז מקטעי ה-RNA הארוכים מ-200 נוקלאוטידים; ערכים של לפחות 30% נחשבו למתאימים לטרנסקריפטומיקה מרחבית בהמשך. קיצורים: hHBM = מח העצם אנושי בריא; hMM = מיאלומה נפוצה אנושית; mMM = מיאלומה נפוצה עכברית.

ניתן לבצע גם הערכות איכות נוספות. כדי לתקף עוד יותר את שלמות הרקמה ולאשר את שימורם של מדורים תאיים ספציפיים לאחר דה-קלציפיקציה ב-EDTA, בוצע צביעת IF אופציונלית על חתכי FFPE סמוכים מרקמות עכבר ובני אדם. נוגדנים ל-Endomucin (Emcn) ול-Cd271 שימשו להדמיית תאים אנדותליאליים (EC) ותאים מזנכימליים (MSC), בהתאמה, בדגימת עכבר עם MM (איור 4A). צביעה זו הראתה שרקמות שעברו עיבוד ב-EDTA הציגו מבני כלי דם מוגדרים היטב עם צביעת Emcn רציפה ורשתות סטרומה שמורות, מה שמעיד על כך שהמרקרים שנבדקו נותרו ניתנים לגילוי לאחר העיבוד. יתרה מכך, הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות מערכת הדמיה מולטי-ספקטרלית אוטומטית סיפקה ראיות נוספות לכך שהאנטיגנים שנבדקו נותרו ניתנים לגילוי לצורך אימות סוג התא, ובכך סיפקה שכבה נוספת של בקרת איכות לפני ניתוח טרנסקריפטומי מרחבי. בנוסף, ממצאים אלו נצפו גם בדגימות של בני אדם קשישים בריאים, שבהן ביטוי של EC זוהה על ידי CD31 וביטוי של MSC על ידי נוגדני PRRX1 (Paired Related Homeobox 1), מה שמוכיח שמרקרי הנישה שנבדקו נותרו ניתנים לזיהוי לאחר דה-קלציפיקציה ב-EDTA (איור 4B). בניגוד לכך, ממצאים אלו לא הושגו בביופסיות של MM מבני אדם שהוכפפו לפרוטוקולי דה-קלציפיקציה שונים מבוססי חומצה. כפי שצוין קודם לכן, שלמות ה-RNA בדגימות אלו הייתה נמוכה, מה שהגביל את הניתוח הטרנסקריפטומי הבא. בשל אופיים הניווני של דגימות אנושיות אלו, התועלת העתידית מהן הוגבלה לפרופיל טרנסקריפטומי בסיסי8 ולהערכה אימונוהיסטוכימית (IHC) של תאי פלזמה (PC) ממאירים (איור 4C).

figure-results-3
איור 4: אימונופלורסצנציה ואימונוהיסטוכימיה אופציונליות לאימות סוג התאים. (A) רקמת MM של עכבר המראה גרעינים המסומנים ב-DAPI (כחול), MSC חיוביים ל-CD271 (ירוק), ו-EC חיוביים ל-EMCN (אדום). (B) עצם אנושית בריאה המראה גרעינים המסומנים ב-DAPI (כחול), MSC חיוביים ל-PRRX1 (ירוק), ו-EC חיוביים ל-CD31 (אדום)10. (C) ביופסיית MM אנושית המראה PC ממאירים חיוביים ל-CD1388. סרגלי קנה מידה: (A) 250 µm (מבט כללי), 20 µm (הגדלה ממוזגת), ו-50 µm (תמונות בערוץ בודד); (B) 500 µm (מבט כללי) ו-20 µm (הגדלות ממוזגות ובערוץ בודד); (C) 500 µm. קיצורים: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EC = endothelial cell; MM = multiple myeloma; MSC = mesenchymal stromal cell; PC = plasma cell. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

יחד, מורפולוגיית הרקמה ותוצאות ה-DV200 תומכות בהתאמתם של דגימות שעובדו ב-EDTA לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי בהמשך. יישומים טרנסקריפטומיים מרחביים של זרימת עבודה זו של הכנה דווחו בעבר8,10.

דיון

על ידי שילוב של דקלציפיקציה מבוקרת המבוססת על EDTA, עיבוד FFPE סטנדרטי ונקודות ביקורת מחמירות לבקרת איכות, פרוטוקול זה מתגבר על רבות מהמגבלות הקשורות באופן מסורתי להכנת רקמת עצם עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית, ובמיוחד אלו הקשורות לפירוק RNA ולנזק מורפולוגי הנגרם משיטות דקלציפיקציה מבוססות חומצה חזקה8,10,20,33,36. השלב הקריטי ביותר בעיבוד דגימות מינרליזיות עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית הוא הדקלציפיקציה. דקלציפיקציה לא מספקת מובילה לעצם שנותרת קשיחה מדי לחיתוך, מה שהופך את השגתם של חתכים באיכות גבוהה עבור טרנסקריפטומיקה מרחבית לבלתי אפשרית מבחינה פיזית8,20,23,37,50. כאשר רקמת העצם נשארת קשה מדי, היא נשברת או רוטטת כנגד להב המיקרוטום, מה שמוביל לחתכים קרועים או לחורים שאינם מייצגים במדויק את ארכיטקטורת ה-BM המקורית. חשוב לציין כי לא ניתן לאשר באופן מלא את הצלחת הדקלציפיקציה עד לשלב המיקרוטומיה: אפילו דגימות שנראות רכות באופן שטחי עשויות עדיין להכיל מינרלים שיריים שהופכים גלויים רק בעת ניסיון לחתוך חתכי FFPE דקים. מסיבה זו, ניטור קפדני של התקדמות הדקלציפיקציה הוא חיוני כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור.

תהליך העבודה משתמש ב-0.25 M EDTA ב-pH 6.95 למשך 10 ימים עם ערבוב קבוע והחלפת תמיסה ביום החמישי8,10. במהלך פיתוח הפרוטוקול, נבחנו EDTA לבדו, EDTA בתוספת polyvinylpyrrolidone, וחומצה פורמית (formic acid) בריכוז 10%, לצד משכי דקאלציפיקציה שונים ולוחות זמנים שונים להחלפת התמיסה; הנתונים ההשוואתיים אינם מוצגים כאן. משכים קצרים מ-10 ימים הביאו לעיתים קרובות לשבירת רקמה במהלך חיתוך דגימות עכברים, בעוד שדגימות אנושיות הראו התנהגות התלויה בדגימה. לפיכך, משך של 10 ימים משמש עבור עצמות ירך של עכברים, בעוד שדגימות אנושיות עשויות לדרוש דקאלציפיקציה ממושכת יותר בהתאם לצפיפות ולתוכן הטרבטולרי. יש להשתמש בנקודות בקרה פיזיות לאיכות לפני הטמעה בפרפין. אם מתגלה דקאלציפיקציה לא מספקת במהלך המיקרוטומיה, השתמשו בהליך העיבוד מחדש רק כצעד אחרון להצלת הדגימה, מכיוון שחשיפה נוספת לחום, לממסים ולרהידרציה עלולה לפגוע באיכות ה-RNA.

המגבלה העיקרית של שיטה זו היא זמן העיבוד הממושך, העומד בניגוד חריף לפרוטוקולים מהירים מבוססי חומצה הנפוצים בפתולוגיה קלינית20,36. אף שזמני עיבוד ארוכים יותר מקובלים בדרך כלל במסגרות מחקר, מחקרים אחרונים, כגון הפרוטוקול המתואר על ידי Miao et al., המשתמש בתמיסת Morse (22.5% formic acid ו-10% sodium citrate) לדקאלציפיקציה תוך 24 h, מדגישים את העניין הגובר בהאצת הכנת העצם עבור בדיקות מרחביות (spatial assays)20. עם זאת, שיטות מבוססות חומצה כרוכות היסטורית בסיכון גבוה בהרבה לדיגראדציה של RNA, מה שמפחית את ערכי ה-DV200 ובסופו של דבר מגביל את התאימות שלהן לטרנסקריפטומיקה מרחבית1,8,35,36. גישה זו, המבוססת על EDTA, מעדיפה את שימור ה-RNA על פני המהירות, ובכך מבטיחה תאימות לפלטפורמות מרחביות מבוססות ריצוף כגון Visium.

מגבלה פוטנציאלית של טרנסקריפטומיקה מרחבית של BM היא השפעות הגבוהה של תמלילי אימונוגלובולינים המופקים מ-PC, אשר עלולה להפחית את הגילוי של גנים בעלי שפעות נמוכה. בדומה לאסטרטגיות בקרת האיכות והסינון שיושמו במחקר קודם של קבוצת המחקר, הכוללות הסרה של נקודות באיכות נמוכה (<200 UMIs ו-<150 גנים שזוהו), סינון של סוגי תאים בעלי תרומה נמוכה (<20% לנקודה) במהלך ניתוחי דקונבולוציה, ובחירה של גני סמן שזוהו במערכי הנתונים של הטרנסקריפטומיקה המרחבית, ניתן לסנן חישובית גם תמלילי אימונוגלובולינים במהלך ניתוח המשך כדי למזער את השפעתם במידת הצורך8. גישות של טרנסקריפטומיקה מרחבית ממוקדת עשויות לשפר עוד יותר את הגילוי של תמלילים בעלי שפעות נמוכה ביישומים ספציפיים.

היישומים הפוטנציאליים עבור שיטה זו הם נרחבים. אינטגרציה עדכנית של נתונים מרחביים ונתוני תא בודד חשפה נישות אוסטאוגניות אנושיות מתמחות ומדרגי איתות מורכבים הקורנים מעצם טרבכולרית3,26. יתרה מכך, טרנסקריפטומיקה מרחבית הראתה כי הזדקנות מעצבת מחדש את מיקרו-הסביבה של ה-BM על ידי שינוי הארגון המרחבי והתקשורת של EC, מה שמוביל לפגיעה בתמיכה האוסטאוגנית ולהופעת רשתות איתות דלקתיות בתוך הנישה המזדקנת10. פרופיל מולטי-אומיק זיהה גם שכונות מיקרו-סביבתיות מובחנות, כגון אזורים ארטריו-אנדוסטאליים התומכים במיאלופואזה מוקדמת ואזורים פרי-אדיפוציטיים עשירים בתאי גזע ופרוגניטורים המטופואטיים3. בהקשר של MM, פרוטוקול זה מאפשר את השילוב של מסגרות טרנסקריפטומיות מרחביות ושל תא בודד כדי לאפיין את הרכב ה-BM חולה של עכברים ואינטראקציות בין תאים. עבודות קודמות חשפו התפלגויות מובחנות מרחבית של PC ממאירים וזיהו תוכניות חיסוניות ודלקתיות, כגון NETosis ואיתות IL-17, שהיו קשורות באופן הפוך לאזורים עשירים בגידול. בנוסף, עלייה בצפיפות של PC ממאירים נמצאה במתאם עם מעבר ממצבי תאי T אפקטורים למצבים של תאי T מותשים. ממצאים אלו תוקפו גם בדגימות BM אנושיות בשימור FFPE, מה שמעיד על הרלוונטיות התרגומית שלהם על פני עומסי מחלה משתנים8. בסופו של דבר, תהליך ההכנה זה מספק את התשתית הטכנית לחקר האינטראקציות התאיות המורכבות בתוך הארכיטקטורה המינרלית של ה-BM.

פלטפורמות לבדיקת ביטוי גנים מרחבי ברזולוציה גבוהה יכולות לספק פרופיל של כל הטרנסקריפטום ברזולוציה קרובה לרמה של תא בודד38,51,52. גישות אלו עשויות להרחיב את השימוש בתהליך ההכנה לניתוח ברזולוציה גבוהה יותר של מח העצם (BM) מאורגן מרחבית ושל מחלות המהימיה ממאירות. לפיכך, תהליך העבודה מספק בסיס טכני למחקרים עתידיים של המטופואזה פיזיולוגית וממאירה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים. פטנט על הידע והשימוש הניסויי במודלי העכברים MIcγ1 של MM הוענק ברישיון ל-MIMO Biosciences (בקשה מס' PCT/EP2023/071025).

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי Instituto de Salud Carlos III ומומננה במשותף על ידי ERDF A way of making Europe (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) ו-RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011; Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC ו-AIRC במסגרת תוכנית ה-Accelerator Award; The International Myeloma Foundation (Brian van Novis) ו-The Paula and Rodger Riney Foundation עבור FP. IAC נתמכה על ידי מענק מארי קורי (H2020- MSCA-IF-837491) מהנציבות האירופית, מענק כישרונות של AECC (INVES258003CALV), ו-Departamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03). MC נתמכה על ידי מלגת FPU (FPU22/03283) מה-Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. נבקש להודות לצוות מעבדת הגנומיקה המתקדמת ולמתקן בעלי החיים ב-CIMA Universidad de Navarra על סיועם הטכני והאינטלקטואלי שאין לו תחליף. אנו מודים גם למחלקות הפתולוגיה של Clínica Universidad de Navarra (CUN) ושל Hospital Universitario de Navarra על אספקת דגימות BM ועל שיתוף הפעולה המצוין שלהם. תודה מיוחדת מגיעה ל-José Ángel Martínez-Climent ו-Marta Larrayoz על מודלי העכברים שלהם ל-MM. תודה ל-Patxi San Martín-Uriz, Tania López, ו-Eduardo Larequi על תמיכתם המצוינת באופטימיזציה של טכנולוגיות, פיתוח פרוטוקולים ופתרון בעיות בעיבוד דגימות BM של עכברים ובני אדם לטובת טרנסקריפטומיקה מרחבית. אנו מודים גם ל-Beñat Ariceta ו-Asier Ullate על כל עבודתם החישובית בטרנסקריפטומיקה מרחבית. לבסוף, אנו אסירי תודה למטופלים ולתורמים הבריאים שהשתתפו בנדיבות במחקר זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנות של 1.5 מ"לEppendorf15625367
מכל סטרילי של 100 מ"ל deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991Aאלקטרופורזה נימיות–מערכת מבוססת לבחינת שלמות ה-RNA
מכל סטרילי בנפח 50 מ"ל IberoMedREOR001
מבחנה של 50 מ"ל FALCON352070
עט PAP מתקדםTed Pella 22309Z377821-1EAעט למחסום הידרופובי 
נוגדן Anti-PRRX1 שהופק בארנבSigma-AldrichHPA051084
BSA (אלבומין מסרום בקר)Sigma-AldrichA9418-50G
קסטות KartellLABWARE2921
נוגדן מונוקלונלי ל-CD271 (קולטן NGF) (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, תא אנדותליאלי (ריכוז) Clone JC70AAgilent DakoM0823
זכוכיות כיסויFisher Scientific12-544-EP50 מ"מ x 24 מ"מ
DAPI (תוסף קיבוע למניעת דהייה VECTASHIELD עם DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
תמיסה להסרת פראפיןQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals Phosphate-buffered saline (DPBS, 1×), פורמולת Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיום
חומר סגירה מסוג DPX להיסטולוגיהSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687חומצה אתילנדיאמיןטטרהאצטית, (EDTA), תמיסה בריכוז 0.5 M, בדרגת ביולוגיה מולקולרית, בטוהר גבוה במיוחד (Ultrapure)
תחנת הטמעה Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
נוגדן Emcn (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
גנום הייחוס של Ensembl ‏(GRCh38 / mm10, גרסה 105)EMBL-EBIלא רלוונטיגנום ייחוס ששימש ליישור קריאות.
אוסיןMillipore SigmaHT110116
אתנולMillipore SigmaE7023-500MLמספריים כירורגיים
אמבט מים להיסטולוגיה B-I מבית Falc InstrumentsFalc610.1030.00
פורמלין 4% PanReac AppliChem2524311315פורמאלדהיד 3.7%–4.0% משקל/נפח, מנוטרל ל-pH = 7 ומיוצב במתנול (CE-IVD) לאבחון קליני
מתקן צביעה לזכוכית* (סלייד)* WHEATONZ710970-3EA
צנצני צביעה מזכוכית מותגBR472200-10EAמסטרסייקלר (Mastercycler)  X50
גליצרולSigma-AldrichC3H8O3
נוגדן משני עיזים נגד IgG (H+L) של עכבר, ספח-ספיח (Cross-Adsorbed), Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
נוגדן משני עיזים נגד IgG (H+L) של עכבר, עבר ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
נוגדן משני ממקור עיזים נגד IgG של ארנבת (H+L), בעל ספיחה צולבת גבוהה, מסומן ב-Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
המטוקסילין Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579הערכת שלמות ה-RNA
סולם RNA ScreenTape ברגישות גבוההAgilent5067-5581הערכת שלמות ה-RNA
בפר ריאגנט לדגימות עבור High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5580הערכת שלמות ה-RNA
מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה Leica Biosystemsלא רלוונטיסורק Aperio CS2
חומצה הידרוכלורית (0.1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
פלטפורמת Illumina NextSeq 2000Illumina20038897
נוגדן משני Invitroge Goat anti-Rat IgG (H+L) שעבר ספיחה צולבת (Cross-Adsorbed), מסומן ב-Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
מספרי איריס - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009איזופלוראן
ליתיום קרבונט Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x Genomicsלא רלוונטיתוכנה המשמשת להדמיה של תמונות HE ואוצרות של נקודות Visium; פותחת קבצי .cloupe שנוצרו על ידי צינור הניתוח (analysis pipeline).
תבניות הטמעה ממתכתBio-Optica07-BM24256
זכוכיות מיקרוסקופAvantor631-0108זכוכיות מיקרוסקופ Superfrost Plus
להבי מיקרוטוםנוצהסיכום: בסרטון זה הודגנו כיצד לבצע בדיקת תאימות (compatibility assay) להערכת האינטראקציות בין רכיבי פורמולציה שונים לבין תרופות, במטרה להבטיח יציבות תרופתית ולמנוע שקיעות או אינטראקציות לא רצויות לפני מתן התרופה למטופל. במהלך הפרוטוקול, תרופות ומרכיבי פורמולציה נערבבו בריכוזים קצובים והושקיפו תחת תאורה מתאימה כדי לזהות שינויים ויזואליים מיידיים, כגון עכירות, שינויי צבע או היווצרות משקעים. הדגש הושם על שימוש בטכניקות סטריליות, דיוק בשקילה ובמדידה, ותיעוד מדויק של התוצאות. בדיקת תאימות זו היא שלב קריטי בפיתוח תרופות ובפרקטיקה קלינית, שכן היא מאפשרת לזהות חוסר תאימות כימית או פיזיקלית שעלולים לפגוע ביעילות התרופה או לגרום לתופעות לוואי מסוכנות.
מיקרוטום HM 340EEprediaלא רלוונטידגם HM 340E
מחטBD301156BD Microlanc 3 Needle 21 G 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052מיקרוסקופ אור בבבואת שדה בהירה
פרפין PanReac AppliChem256993פרפין עם נקודת התכה (M.P.) 55–58°C כדורי DMSO פלסטיקציה (CE-IVD) לאבחון קליני
צלחית פטרי CorningCLS430167-100EA
תבניות להטמעה בפלסטיק Bio-Optica07-MP7070
מלקחי פוטס-סמית' (Potts-Smith Forceps)F.S.T 11012-18פינצטה
פלואורומטר Qubit 3.0Invitrogen Q33216
מבחנות לבדיקת QubitInvitrogen Q32856
ערכה לבדיקת Qubit RNA HSInvitrogen Q32855
מבחנת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל נטולת RNAseThermo Scientific AM12400
מים נקיים מ-RNase MerkW4502
RNaseZap RnaseInvitrogen AM9780תמיסת דה-קונטמינציה
RNeasy FFPE Kit (50)Qiagen73504מיצוי RNA כולל
SCTransform (v0.3.5)מעבדת Satijaלא רלוונטישיטת נורמליזציה לייצוב שונות המיושמת ב-Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) מעבדת Satijaלא רלוונטיחבילת R המשמשת לניתוח טרנסקריפטומיקה של תא בודד וטרנסקריפטומיקה מרחבית.
Space Ranger (v2.0.1)10x Genomicsלא רלוונטיתוכנה המשמשת לדמולטיפלקסינג (demultiplexing), יישור (alignment) ויצירת מטריצות של תכונות-ברקוד (feature-barcode matrices) עבור מערכי נתונים של Visium.
סקלפל Stlime Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)מעבדת ברגןלא רלוונטיחבילת R המשמשת לוויזואליזציה ואינטגרציה של טרנסקריפטומיקה מרחבית.
להב סכין כירורגית מס' 23Swann-Morton210להבי סקלפל כירורגיים
מכשיר תגובות שרשרת פולימראז (Thermal cycler) Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455פלטפורמת דימוי רב-ספקטרלי לוויזואליזציה של IF
ערכת אביזרים Visium של 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
ערכה קטנה של גששים לטרנסקריפטום אנושי Visium מבית 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
ערכה קטנה של גששים לטרנסקריפטום של עכבר עבור Visium מבית 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
ערכה לשקופיות ביטוי גנים מרחבי Visium הכוללת 4 תגובות, 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
קסילןPanreac214736קסילן, תערובת איזומרים לניתוח, ACS, ISO

מקורות

  1. Cooper RA, et al. Spatial transcriptomic approaches for characterising the bone marrow landscape: pitfalls and potential. Leukemia. 2025;39(2):291-295.
  2. Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity. Nat Rev Immunol. 2012;12(1):49-60.
  3. Bandyopadhyay S, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. 2024;187(12):3120-3140.e29.
  4. Tikhonova AN, et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019;569(7755):222-228.
  5. Baccin C, et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 2020;22(1):38-48.
  6. Kunisaki Y, et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 2013;502(7473):637-643.
  7. Kusumbe AP, Ramasamy SK, Adams RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014;507(7492):323-328.
  8. Muiños-Lopez E, et al. Characterization of the bone marrow architecture of multiple myeloma using spatial transcriptomics. Commun Biol. 2025;8(1):1620.
  9. Gui G, et al. Single-cell spatial transcriptomics reveals immunotherapy-driven bone marrow niche remodeling in AML. Sci Adv. 2025;11(28):eadw4871.
  10. Cenzano I, et al. Single-cell profiling reveals RAB13+ endothelial cells and profibrotic mesenchymal cells in aged human bone marrow. Aging Cell. 2026;25(4):e70475.
  11. de Jong MME, et al. The multiple myeloma microenvironment is defined by an inflammatory stromal cell landscape. Nat Immunol. 2021;22(6):769-780.
  12. de Jong MME, et al. An IL-1β-driven neutrophil–stromal cell axis fosters a BAFF-rich protumor microenvironment in individuals with multiple myeloma. Nat Immunol. 2024;25(5):820-833.
  13. Cenzano I, et al. Stromal and endothelial transcriptional changes during progression from MGUS to myeloma and after treatment response. Nat Commun. 2026;17:74389.
  14. Ye J, et al. Deconvolution of the hematopoietic stem cell microenvironment reveals a high degree of specialization and conservation. iScience. 2022;25(5):104225.
  15. Chen L, et al. An inflammatory T-cell-stromal axis contributes to hematopoietic stem/progenitor cell failure and clonal evolution in human myelodysplastic syndrome. Nat Commun. 2025;16(1):10041.
  16. Prummel KD, et al. Inflammatory stromal and T cells mediate human bone marrow niche remodeling in clonal hematopoiesis and myelodysplasia. Nat Commun. 2025;16(1):10042.
  17. De Jonghe J, et al. scTrends: A living review of commercial single-cell and spatial 'omic technologies. Cell Genom. 2024;4(12):100723.
  18. van den Brink SC, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017;14(10):935-936.
  19. Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially resolved transcriptomes—next generation tools for tissue exploration. Bioessays. 2020;42(10):1900221.
  20. Miao J, et al. A practical protocol of processing mineralized tissue for Visium spatial transcriptomics. Mechanobiol Med. 2025;3(4):100163.
  21. Baldwin M, et al. A roadmap for delivering a human musculoskeletal cell atlas. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(11):738-752.
  22. Duan H, Cheng T, Cheng H. Spatially resolved transcriptomics: advances and applications. Blood Sci. 2023;5(1):1-12.
  23. Xiao X, et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 2023;11(1):59.
  24. Jain S, Eadon MT. Spatial transcriptomics in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2024;20(10):659-671.
  25. Tilburg J, et al. Spatial transcriptomics of murine bone marrow megakaryocytes at single-cell resolution. Res Pract Thromb Haemost. 2023;7(4):100158.
  26. Lin W, et al. Mapping the spatial atlas of the human bone tissue integrating spatial and single-cell transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2025;53(2):gkae1298.
  27. Marx V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 2021;18(1):9-14.
  28. Yue L, et al. A guidebook of spatial transcriptomic technologies, data resources and analysis approaches. Comput Struct Biotechnol J. 2023;21:940-955.
  29. Joglekar A, et al. A spatially resolved brain region- and cell type-specific isoform atlas of the postnatal mouse brain. Nat Commun. 2021;12(1):463.
  30. Madissoon E, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023;55(1):66-77.
  31. Wang F, et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023;9(24):eadf5464.
  32. Robinson MH, et al. Regulation of antigen-specific T cell infiltration and spatial architecture in multiple myeloma and premalignancy. J Clin Invest. 2023;133(15):e167303.
  33. Wehrle E, et al. Protocol for preparing formalin-fixed paraffin-embedded musculoskeletal tissue samples from mice for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 2024;5(2):103089.
  34. Sangeetha R, Uma K, Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J Oral Maxillofac Pathol. 2013;17(3):386-391.
  35. Yip RKH, et al. Profiling the spatial architecture of multiple myeloma in human bone marrow trephine biopsy specimens with spatial transcriptomics. Blood. 2025;146(15):1837-1849.
  36. Miquelestorena-Standley E, et al. Effect of decalcification protocols on immunohistochemistry and molecular analyses of bone samples. Mod Pathol. 2020;33(8):1505-1517.
  37. Ambrosi TH, et al. Human skeletal development and regeneration are shaped by functional diversity of stem cells across skeletal sites. Cell Stem Cell. 2025;32(5):811-823.e11.
  38. 10x Genomics. Visium Spatial Platform. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/platforms/visium#assays
  39. Amemiya K, et al. Influence of formalin fixation duration on RNA quality and quantity from formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissues. Pathol Int. 2023;73(12):593-600.
  40. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002;161(6):1961-1971.
  41. Nam SK, et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 2014;48(1):36-42.
  42. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000407, Revision E. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-ffpe/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe-user-guide
  43. Eccher A, et al. Pathology laboratory archives: conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 2024;14(4):333.
  44. Bai Z, et al. Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Cell. 2024;187(23):6760-6779.e24.
  45. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE—Tissue Preparation Guide. Document CG000518, Revision D. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/tissue-prep/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-for-ffpe-tissue-preparation-guide
  46. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000495, Revision G. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026. Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/library-construction/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe
  47. Agilent Technologies. High Sensitivity RNA ScreenTape assay for TapeStation systems quick guide. Version A.01.05. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/HS-RNA_QuickGuide.pdf
  48. Agilent Technologies. Agilent 4200 TapeStation system—System manual. Publication G2991-90000, Version A.02.02. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://download.chem.agilent.com/software/4200_tapestation_user_info_package_v2/tapestation%20user%20information/tapestation%20manuals/agilent%204200%20tapestation%20system%20manual_g2991-90000.pdf
  49. Larrayoz M, et al. Preclinical models for prediction of immunotherapy outcomes and immune evasion mechanisms in genetically heterogeneous multiple myeloma. Nat Med. 2023;29(3):632-645.
  50. Wang S. Resolving the bone – optimizing decalcification in spatial transcriptomics and molecular pathology. J Histotechnol. 2025;48(1):68-77.
  51. Oliveira MF, et al. High-definition spatial transcriptomic profiling of immune cell populations in colorectal cancer. Nat Genet. 2025;57(6):1512-1523.
  52. Bourgain-Chang E, Kuang X, Cang Z, Nie Q. Reconstructing single-cell resolution from spatial transcriptomics with CellRefiner. Nat Commun. 2026;17(1):3304.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FFPEEDTARNA
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים