הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

דיווח מקרה

דיווח מקרה של שושלת עם נוירופתיה מוטורית תורשתית דיסטלית הגרמה על ידי וריאנט הומוזיגוטי c.1124G>A בגן VRK1 (Vaccinia-Related Kinase 1)

55 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72503

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2The First Clinical Medical College, Yunnan University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מדווח על שجرة תאבונים סינית עם נישואי קרבה, הסובלת מנוירופתיה מוטורית תורשתית דיסטלית (dHMN) עם הופעה בבגרות, הנגרמת על ידי וריאנט הומוזיגוטי c.1124G>A בגן של vaccinia-related kinase 1 (VRK1). הממצאים מרחיבים את הספקטרום הפנוטיפי-קליני והגנטי של dHMN הקשורה ל-VRK1 באוכלוסייה הסינית.

תקציר

מחקר זה נועד לנתח את הפנוטיפים הקליניים, את המאפיינים הנוירופיזיולוגיים ואת הפתוגניות של וריאנטים גנטיים בשושלת עם נוירופתיה מוטורית תורשתית דיסטלית (dHMN) הנגרמת על ידי וריאנטים ב-VRK1, ולספק ראיות לתמיכה באבחנה קלינית ובייעוץ גנטי למחלה זו. אנו מדווחים על משפחה סינית קונסנגווינית עם dHMN הנגרמת על ידי וריאנט הומוזיגוט c.1124G>A בגן VRK1. נתונים קליניים ואלקטרופיזיולוגיים של הפרובנד נאספו. ריצוף אקסום מלא (WES) ואימות באמצעות ריצוף סנג'ר בוצעו כדי לזהות את אתר הווריאנט, ופירוש הפתוגניות בוצע בהתאם להנחיות של ה-American College of Medical Genetics and Genomics/Association for Molecular Pathology (ACMG/AMP). הפרובנד היה גבר בן 24 שהופיע עם חולשה ואטרופיה פרוגרסיביות במשך שנתיים בגפיים התחתונות הדיסטליות, בליווי גפיים עליונות דקיקות וללא הפרעה תחושתית. בדיקה אלקטרופיזיולוגית הראתה ירידה באמפליטודת פוטנציאל הפעולה השרירי המורכב (CMAP) בעצבים המוטוריים של שתי הגפיים העליונות והתחתונות, מה שמעיד על נזק נוירוגני פריפריאלי, בעוד שהולכת העצבים התחושתיים הייתה תקינה. בדיקה גנטית זיהתה וריאנט הומוזיגוט c.1124G>A (p.Trp375Ter) בגן VRK1. הוריו ואחיותיו הגדולות היו נשאיים הטרוזיגוטים, והשושלה תאמה לירושה אוטוסומלית רצסיבית. על פי הנחיות ACMG, וריאנט זה סווג כפתוגני (ראיות: PVS1, PM2, PP1). וריאנט הומוזיגוט VRK1 c.1124G>A גורם ל-dHMN עם הופעה בבגרות, ולא להיפופלזיה פונטו-צרבלרית סוג 1A (PCH1A) כפי שמופיע בחלק מהמאגרי הגנטיים. שושלת זו מציגה פנוטיפים ייחודיים, כולל גפיים עליונות דקיקות וירידה דיפוזית באמפליטודות CMAP הן בגפיים העליונות והן בתחתונות, ובכך מרחיבה את הספקטרום הקליני והגנטי של dHMN הקשורה ל-VRK1 באוכלוסיות סיניות.

מבוא

נוירופתיה מוטורית תורשתית דיסטלית (dHMN) מהווה קבוצה גנטית הטרוגנית של הפרעות תורשתיות של מערכת העצבים ההיקפית, המוגדרת פתולוגית על ידי דגנרציה תלוית-אורך של נוירונים מוטוריים תחתונים ואקסונים שלהם. מבחינה קלינית, מטופלים מציגים חולשה פרוגרסיבית ואטרופיה של שרירי הגפיים הדיסטליים, בעוד שתפקודי החושים נשארים במידה רבה תקינים ברוב המקרים1. ביטויים ראשוניים משפיעים בדרך כלל על הגפיים התחתונות הדיסטליות, כולל חולשה בכפיפת האצבעות ואטרופיה של שריר הגסטרוכנמי우스 (gastrocnemius) ושרירי כף הרגל הפנימיים, עם התקדמות הדרגתית המערבת את השרירים הבין-גרמיים של היד ואת שרירי התנאר וההיפותנאר ככל שהמחלה מתקדמת2. דפוסי ההורשה משתנים בין תתי-הסוגים, כאשר תוארו צורות דומניננטיות אוטוזומליות ורצסיביות אוטוזומליות כאחד. נכון להיום, למעלה מ-50 גנים פתוגניים קושרו ל-dHMN, אך הגורם הגנטי הבסיסי נותר לא מזוהה ביותר ממחצית מהאנשים המושפעים3.

בשל ההומוגניות הגנטית הבולטת והחפיפה הפנוטיפית הנרחבת עם מצבים נוירו-מוסקולריים אחרים, אבחנה של dHMN המבוססת אך ורק על הערכה קלינית היא לרוב אינה מהימנה4. גישות אבחנתיות שלביות קונבנציונליות, המתקדמות מפנוטיפ קליני לריצוף גנים מועמדים, אינן יעילות וסובלות מבחירה אבחנתית נמוכה, במיוחד במקרים ספורדיים או אטיפיים פנוטיפית1,2. פאנלים גנטיים ממוקדים מציעים חלופה יעילה יותר מבחינת עלות, אך הם מוגבלים לרשימות גנים מוגדרות מראש ועשויים להחמיץ וריאנטים פתוגניים נדירים או חדשים. ריצוף גנום מלא מציע את הכיסוי הגנומי המקיף ביותר, אך הוא מוגבל על ידי עלות גבוהה, זמן עיבוד אנליטי ממושך וכמויות גדולות של וריאנטים בעלי משמעות לא ידועה במסגרות קליניות שגרתיות5. במחקר הנוכחי, השתמשנו במסגרת אבחנתית משולבת המשלבת הערכה קלינית שיטתית, בדיקה נוירופיזיולוגית, ריצוף אקסום מלא (WES) ואנליזת הפרדה משפחתית. בדיקה נוירופיזיולוגית מסייעת לאשר מעורבות של עצבים פריפריים מוטוריים טהורים ולאפיין את התהלוכיות של פגיעת העצב, ובכך לצמצם את האבחנה המבדלת. WES מאפשר בחינה סימולטנית של כל הגנים הידועים הקשורים ל-dHMN, זיהוי של וריאנטים פתוגניים חדשים פוטנציאליים, ואנליזת הפרדה משפחתית עוקבת, ובכך לסנן הלאה וריאנטים מקריים שפירים ולחזק את הראיות לפתוגניות של וריאנטים מועמדים, תוך השגת איזון פרגמטי בין התנובה האבחנתית, העלות והיכולת הפרשנית.

הגן המקודד לקינאז 1 הקשור לווקסיניה (VRK1) מקודד לקינאז סרין/תראונין המשתתף במסלולי העברת אותות גרעיניים ובמסלולי תיקון נזקי DNA, ותפקידו הפיזיולוגי חיוני לשמירה על הומיאוסטזיס והישרדות של נוירונים6. וריאנטים פתוגניים ב-VRK1 מובילים למגוון קליני רחב: היפופלזיה פונטו-צרבלארית סוג 1A (PCH1A) עם הופעה בינקות, המאופיינת במיקרוצפליה, היפוטוניה חמורה ועיכוב התפתחותי מוטורי עמוק; dHMN עם הופעה בבגרות המאופיינת בעיקר במעורבות של קצוות הגפיים; ומצבים נדירים יותר הכוללים פאראפלגיה ספסטית תורשתית (HSP) ופנוטיפים דמויי טרשת נגדית לצדית (ALS)7,8,9. באופן ספציפי, הווריאנט הבלתי-מגמתי (nonsense) ההומוזיגוט c.1124G>A (p.Trp375Ter) ב-VRK1 תועד במספר אילני יוחסין עצמאיים של dHMN עם תבנית הורשה אוטוזומלית רצסיבית עקבית, מה שתומך בקשר הסיבתי המוכר שלו ל-dHMN10. וריאנט זה מציג קודון סיום מוקדם באזור הקידוד של הקצה C-טרמינלי של VRK1, וצפוי לגרום לאובדן תפקוד של החלבון, בין אם באמצעות ייצור חלבון קטוע ובין אם באמצעות הפעלת פירוק mRNA מתווך-nonsense. בעוד שהמנגנון הפתולוגי המדויק לא תוקף תפקודית עבור וריאנט ספציפי זה, קיימת השערה שפגיעה בפעילות הקינאז של VRK1 עלולה לשבש את תיקון ה-DNA הנוירונלי ואת רשראות האיתות התו-תאיות, ובכך לתרום לניוון של נוירונים מוטוריים ולהתפתחות של dHMN.

בפרקטיקה קלינית, יש לתת עדיפות לבדיקה גנטית של VRK1 בתרחישים הבאים: מטופלים עם חשד קליני ל-dHMN המתבטא בחולשה מוטורית דיסטלית ואטרופיה תלויות-אורך עם תחושה שנשמרה, ובמיוחד אלו עם היסטוריה משפחתית של תורשה אוטוזומלית רצסיבית או הופעת המחלה בבגרות; אנשים ממשפחות עם נישואים קרבים המציגים נוירופתיה מוטורית דיסטלית לא מוסברת; מטופלים עם ביטויים חופפים של מערכת העצבים המרכזית והפריפרית שאינם מיוחסים להפרעות גנטיות ידועות אחרות; ומקרים של dHMN או מחלת שרקו-מרי טוות סוג 2 (CMT2) שהבדיקות בהם לשכין וריאנטים פתוגניים של גנים היו שליליות11,12. יש להכיר בכמה מגבלות חשובות של גישה אבחנתית זו. ראשית, dHMN הקשור ל-VRK1 חולק דמיון פנוטיפי משמעותי עם הפרעות נוירו-מוסקלריות אחרות, כולל ניוון שרירים ספיינלי (SMA), CMT2, HSP ו-ALS בשלבים מוקדמים, דבר שעלול להוביל לסיווג אבחנתי שגוי. שנית, פרשנות של וריאנטים נדירים של VRK1 נשארת מאתגרת, שכן לרובם חסר תיקוף תפקודי והם נשענים במידה רבה על כלי חיזוי in silico, מה שמוביל לסיווג פתוגניות לא ודאי עבור תת-קבוצה של וריאנטים. שלישית, מאחר שמדובר במחקר של שושלת אחת, היכולת להכליל את ממצאינו היא מוגבלת, וקורלציות בין גנוטיפ לפנוטיפ דורשות אישור נוסף בקוהורטים גדולים יותר של מטופלים.

נכון להיום, דיווחים על dHMN הקשורה ל-VRK1 באוכלוסיות סיניות נותרו נדירים, וההטרוגניות הפנוטיפית המלאה והמאפיינים הקליניים של מצב זה טרם מופו במלואם. במחקר זה, אנו מדווחים על משפחה סינית קונסנגוអ៊ីנית עם dHMN הנגרמת על ידי ואריאנט הומוזיגוטי c.1124G>A בגן VRK1. באמצעות שילוב של ממצאים קליניים, אלקטרופיזיולוגיים וגנטיים, אנו מאפיינים את התכונות הפנוטיפיות והגנוטיפיות של שושלת זו, ובכך מספקים נתוני ייחוס לתמיכה באבחנה קלינית מדויקת ובייעוץ גנטי עבור dHMN הקשורה ל-VRK1.

הצגת מקרה:

הפרובנד (III₁) היה גבר בן 24 מביג'י, מחוז גוויג'ו, שנולד להורים שהם בני דודים ראשונים. אילן היוחסין המשפחתי לשלושה דורות מוצג ב-איור 1 ועולה בקנה אחד עם דפוס תורשה אוטוסומלי רצסיבי. II₁ ו-II₂ (הוריו של הפרובנד) היו שניהם נשאיים הטרוזיגוטים לווריאנט VRK1 c.1124G>A ולא הראו תסמינים. הפרובנד (III₁) היה הומוזיגוטי לווריאנט והראה תסמינים קליניים. III₂ ו-III₄ (אחיותיו הבכורות של הפרובנד) היו נשאיות הטרוזיגוטיות ללא פנוטיפ קליני. III₃ (אחותו הבכורה השלישית של הפרובנד) אומצה בילדותה ודיווחה על חולשה דומה בגפיים התחתונות ואטרופיה של השרירים, אך אישור גנטי לא היה זמין.

ביטויים קליניים

תלונה עיקרית: חולשה וניוון פרוגרסיביים של שתי הגפיים התחתונות במשך שנתיים.

היסטוריה של המחלה הנוכחית: שנתיים קודם לכן, פיתח המטופל חולשה ללא כאבים בגפיים התחתונות הדיסטליות ללא גורמים מעוררים ברורים. הוא דיווח על נפילות קלות בעת הליכה על קרקע מישורית, אך היה מסוגל לשבת ברכיכות ולקום ללא סיוע. המטופל ובני משפחתו שמו לב להידלדלות הדרגתית של הרגליים מתחת לברכיים. הוא דיווח על סבילות נמוכה למאמץ מאז הילדות, עם קשיים בריצה ובקפיצה. לא נרשמו תחושת נימול, כאב או הפרעות בחוש הטמפרטורה בגפיים, לא נצפתה חולשה ברורה בגפיים העליונות, ולא היו תסמינים בולבריים. ביכולותיו השכליות לא נמצאו פגמים, והוא עבד באופן עצמאי כספר.

בדיקה נוירולוגית

כוח שרירים (סולם MRC): כפיפת ירך 5/5, פשיטת ברך 4+/5, דורסיפלקסיה של הקרסול 4/5, פלנטארפלקסיה של הקרסול 3+/5 דוצדדית; שרירים פרוקסימליים של הגפיים העליונות 5/5, פשיטת שורש כף היד 4+/5, כפיפת אצבעות 4/5, שרירים אינטרינסיים של כף היד 4/5 דוצדדית.

טוני ביוסיא (Muscle tone): תקין בכל ארבעת הגפיים; ללא עלייה או ירידה בטוניה.

מסה שרירית: נצפתה אטרופיה ניכרת של שרירי הגפיים התחתונות הדיסטליים (gastrocnemius, tibialis anterior ושרירי כף הרגל הפנימיים) (איור 2A). הגפיים העליונות נראו דקיקות, עם אטרופיה קלה של שרירי כף היד הפנימיים (איור 2B).

פסיקולציות: לא נצפו פסיקולציות גלויות בשרירי הגפיים או הגו.

רפלקסים של הגיד: רפלקסים של הגפה העליונה היו מופחתים; רפלקסים של גידי הגפה התחתונה (רפלקס הברך והקרסול) היו חסרים באופן דו-צדדי.

סימנים פתולוגיים: סימני Babinski ו-Chaddock דו-צדדיים היו שליליים.

בדיקה תחושתית: תחושה שטחית (כאב, מגע, טמפרטורה) ותחושה עמוקה (רטט, מיקום) היו תקינות בכל הגפיים.

קוורדינציה: בדיקת אצבע-אף ובדיקת עקב-ברך-שוק היו תקינות באופן דו-צדדי.

עצבים קרניאליים: אישונים שווים ומגיבים לאור; תנועות עיניים חיצוניות מלאות; סימטריה פנימית; הרמה תקינה של החיך הרך; תנועת לשון תקינה ללא אטרופיה או פסיקולציות; ללא דיספגיה או דיסארתריה.

הליכה: הליכת מדרגות (Steppage gait) דו-צדדית.

בדיקות מעבדה משלימות: רמות הקריאטין קינאז (CK) בנסיוב, רמת ויטמין B₁₂ ובדיקות תפקודית של בלוטת התריס (TSH, FT3, FT4) היו כולן בטווחים נורמליים.

דימות עצבי: לא בוצעו בדיקות תהודה מגנטית (MRI) של הגולגולת ועמוד השדרה במטופל זה.

אבחנה מבדלת

PCH1A: נשלל. למטופל הייתה מחלה שהחלה בבגרות, ללא מיקרוצפליה, היפוטוניה, דיספלזיה של המוח הקטן או עיכוב התפתחותי, דבר שאינו עולה בקנה אחד עם הפנוטיפ הקלאסי של PCH1A בינקות.

SMA: נשללה. למטופל הייתה הופעת המחלה בגיל הבגרות עם מעורבות דיסטלית בלבד וכוח שרירים פרוקסימלי תקין בגפיים, ללא דפוס החולשה הטיפוסי של SMA המאופיין בעדיפות פרוקסימלית.

CMT2: נשללה על ידי נוירופיזיולוגיה. למטופל הייתה מעורבות עצבית מוטורית בלבד, עם פוטנציאלי פעולה של עצבי חישה תקינים לחלוטין, ולכן הוא לא עמד בקריטריונים האבחנתיים ל-CMT2.

ALS: נשלל. לא נמצאה מעורבות של נוירונים מוטוריים עליונים, לא הופיעו תסמינים בולבבריים ולא נצפו פסיקולציות בשרירי הצוואר או בשרירים המעצבבים את הבולבז; המהלך הכרוני הפרוגרסיבי עם מעורבות דיסטלית בלבד היה אתיפי עבור ALS.

HSP: נשלל. למטופל לא הייתה ספסטיות, לא הייתה היפררפלקסיה ולא היו סימנים פתולוגיים, עם מעורבות של נוירונים מוטוריים תחתונים בלבד.

מחלת קנדי (ניוון שרירים ספיינלי ובולברי, SBMA): נשללה. לא הייתה מעורבות בולברית, לא נצפו פסיקולציות פרי-אוראליות ולא היו ביטויים אנדוקרינולוגיים; דפוס ההורשה לא היה עקבי עם תורשה הקשורה לכרומוזום X.

אבחנה, הערכה ותוכנית טיפול

אבחנה

1. dHMN, שאובחן על ידי וריאנט פתוגני הומוזיגוט c.1124G>A (p.Trp375Ter) בגן VRK1 (הורשה אוטוסומלית רצסיבית).

2. נוירופתיה פריפרית אקסונלית מוטורית טהורה, הפוגעת בעיקר בגפיים התחתונות הדיסטליות.

הערכה

המטופל הגיע עם חולשה מוטורית דיסטלית הדרגתית ואטרופיה של השרירים תוך שימור תחושה, ממצאים העולים בקנה אחד עם הפנוטיפ הקלאסי של dHMN הקשורה ל-VRK1 המופיע בבגרות.

ממצאים נוירופיזיולוגיים הצביעו על פגיעה אקסונלית מוטורית דיפוזית עם הולכה תחושתית תקינה, דבר התומך באבחנה של נוירופתיה מוטורית טהורה.

חומרת המחלה הייתה קלה עד מתונה בעת הפנייה הנוכחית: המטופל נותר נייד ומסוגל לבצע פעולות יומיומיות באופן עצמאי, ללא מעורבות בולברית או נשימתית.

אילן היוחסין הראה תורשה אוטוזומלית רצסיבית, כאשר נשאי גן ההטרוזיגוטים נותרו ללא תסמינים.

תוכנית טיפול ומעקב

1. טיפול תסמיני: יש לרשום סדים לקרסול וכף הרגל לשיפור יציבות ההליכה ומניעת פציעות כתוצאה מנפילות; יש להפנות לרפואה שיקומית לתוכניות אימון כוח ומתיחות מותאמות אישית לשמירה על טווח התנועה של המפרקים ומניעת קונטרקטורות.

2. מעקב סדיר: קבעו תור להערכות נוירולוגיות שנתיות, כולל בדיקות הולכה עצבית חוזרות, כדי לנטר את התקדמות המחלה.

3. ייעוץ גנטי: העניקו ייעוץ גנטי מפורט לפרובנד (proband) ולבני המשפחה בנוגע לסיכון לחזרתיות, אפשרויות לתכנון רבייתי ובדיקות גנטיות טרום-סימפטומטיות לקרובי משפחה הנמצאים בסיכון.

4. הדרכת המטופל: יש להמליץ על הימנעות מתרופות נוירוטוקסיות ומעייפות מוגברת; יש לספק תמיכה פסיכולוגית לטיפול בחרדה הקשורה למחלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הפרובינציאלי לרפואה סינית מסורתית של יוננאן (מספר אישור: YYLW-2026-006). הסכמה מדעית בכתב התקבלה מהפרובנד ומכל בני המשפחה המשתתפים לפני הגיוס למחקר.

1. הכנת המשתתפים והערכה קלינית

  1. הפרובנד ובני משפחה זמינים גויסו למחקר לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב.
  2. מידע דמוגרפי מפורט, היסטוריה של המחלה, היסטוריה משפחתית ומידע על נישואים מקריבים נאספו באמצעות שאלון סטנדרטי.
  3. בוצע בדיקה נוירולוגית שיטתית, שכללה הערכות של כוח שרירים, טונוס שרירים, רפלקסים של גידים, תפקוד תחושתי, קואורדינציה, הליכה ותפקוד של עצבי הגולגולת.
  4. כוחן של כל קבוצות השרירים העיקריות תועד באמצעות סולם ה-Medical Research Council (MRC).
  5. צולמו תמונות קליניות של הגפיים לאחר קבלת הסכמה בכתב מהמשתתף.
    הערה: כל ההערכות הקליניות בוצעו על ידי נוירולוג מומחה המוסמך על ידי הוועדה, המתמחה בהפרעות נוירומסקולריות, על מנת להבטיח עקביות אבחנתית.

2. בדיקה נוירופיזיולוגית

  1. הכנת המטופל
    1. המשתתף הונחה להימנע מצריכת קפאין וממאמץ גופני רב למשך 2 h לפחות לפני הבדיקה.
    2. טמפרטורת חדר הבדיקה נשמרה על 24–26ºC, וטמפרטורת העור בגפה נשמרה מעל 32ºC באמצעות מנורת חימום בעת הצורך.
    3. המשתתף הושכב במצב גב (supine) בחדר בדיקה שקט עם תאורה עמומה.
  2. בדיקת מהירות הולכה עצבית
    1. העור באתרי האלקטרודות נוקה באמצעות מקלוני אלכוהול כדי להפחית את העכבה (impedance).
    2. אלקטרודות רישום שטחיות הונחו מעל הנקודה המוטורית של השריר המטרה, ואלקטרודת הייחוס הונחה דיסטלית מעל הגיד התואם.
    3. אלקטרודות גירוי הונחו לאורך מסלול העצב בנקודות ציון אנטומיות סטנדרטיות.
    4. בדיקות הולכה עצבית מוטורית בוצעו בעצבים המדיאניים, האולנריים, הטיביאליים והפרוניאליים המשותפים בשני הצדדים. נמדדו השהיה דיסטלית (distal latency), אמפליטודה של פוטנציאל פעולה שרירי مرکב (CMAP) ומהירות הולכה מוטורית.
    5. בדיקות הולכה עצבית תחושתית בוצעו בעצבים המדיאניים, האולנריים, הפרוניאליים השטחיים והסוראליים בשני הצדדים, תוך שימוש בטכניקות אורתודרומיות או אנטי-דרומיות, לפי הצורך. נמדדו אמפליטודה של פוטנציאל פעולה עצבי תחושתי (SNAP) ומהירות הולכה תחושתית.
    6. פס הסינון (filter bandpass) נקבע ל-20 Hz–10 kHz לבדיקות מוטוריות ו-20 Hz–2 kHz לבדיקות תחושתיות. מהירויות סריקה של 2 ms/division ו-1 ms/division שימשו לבדיקות מוטוריות ותחושתיות, בהתאמה.
  3. אלקטרומיוגרפיה במחט
    1. אלקטרודת מחט קונצנטרית הוכנסה לכל שריר מטרה בתנאים סטריליים.
    2. נבחנה פעילות ספונטנית במצב מנוחה, כולל גלי חדות חיוביים (positive sharp waves), פוטנציאלים של פיברילציה ופוטנציאלים של פסיקולציה.
    3. מורפולוגיית פוטנציאל יחידת מוטורית (MUP) הוערכה במהלך כיווץ רצוני קל. נמדדו משך, אמפליטודה ופוליפזיה.
    4. תבנית הגיוס (recruitment pattern) הוערכה במהלך כיווץ רצוני מרבי.
    5. השרירים tibialis anterior, medial gastrocnemius, abductor hallucis, first dorsal interosseous, deltoid ו-rectus femoris נבחנו בשני הצדדים. כמו כן נבחנו השרירים sternocleidomastoid ו-T10 paraspinal.
      הערה: כל הבדיקות הנוירופיזיולוגיות בוצעו על ידי אלקטרומיוגרף מנוסה. עכבת העור נשמרה מתחת ל-5 kΩ כדי להבטיח את איכות הרישום. השחזור של כל צורמות הגל אומת לאורך לפחות שני גירויים עוקבים.

3. איסוף דגימות דם פריפריאלי והפקת DNA גנומי

  1. דם ורידי פריפריאלי (3–5 mL) נאסף מכל משתתף לשפרוret EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) למניעת קרישה.
  2. דגימות הדם אוחסנו ב-4ºC מיד לאחר האיסוף ועובדו תוך 24 שעות.
  3. DNA גנומי הופק לויקוציטים של דם פריפריאלי באמצעות ערכה להפקת DNA גנומי.
  4. ריכוז ה-DNA וטוהרתו נמדדו באמצעות ספקטרופוטומטר.
  5. שלמות ה-DNA הוערכה באמצעותת אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1%.
    הערה: דגימות DNA עם יחס A260/A280 של 1.8–2.0 וריכוז של ≥50 ng/µL התקבלו. דגימות שלא עמדו בקריטריוני בקרת האיכות הופקו מחדש.

4. רצף כלל האקסום (Whole-exome sequencing)

  1. הכנת הספריה
    1. DNA גנומי (1 μg) שובש למקטעים של 150–200 bp באמצעות סוניקציה.
    2. תיקון קצוות, A-tailing וליגציה של אפדפטורים בוצעו בהתאם לפרוטוקול של ערכת הכנת הספריה.
    3. אזורים אקסוניים הועשרו באמצעות ערכת לכידת כל האקסומים של בני אדם בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    4. הספריה שנלכדה הועשירה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), והתוצרים שהתקבלו טוהרו.
  2. ריצוף
    1. ריצוף Paired-end בוצע בפלטפורמת ריצוף בעלת תפוקה גבוהה תוך שימוש באורך קריאה של 150 bp.
    2. נקבע יעד לעומק ריצוף ממוצע של ≥100 Χ לאורך האקסום המטרה, כאשר ≥98% מהבסיסים במטרה כוסו בעומק של ≥10Χ ו-≥95% כוסו בעומק של ≥20Χ.
    3. הערה: ריכוז ספריה של ≥2 nM והתפלגות גודל אינסרט של 250–350 bp אומתו לפני הריצוף. מדדי Q30, תכולת GC ועומק הכיסוי הוערכו לאחר הריצוף כדי לאשר את איכות הנתונים.

5. ניתוח ביו-אינפורמטי וסינון וריאנטים

  1. בוצע ניתוח נתונים ראשוני, כולל קריאת בסיסים (base calling), הערכת איכות וקיצוץ מתאמים (adapter trimming).
  2. קריאות נקיות שוייכו לגנום האנושי הייחוס GRCh37 (hg19) באמצעות תוכנה ליישור רצפים.
  3. בוצע זיהוי וריאנטים (variant calling) כדי לאתר וריאנטים של נוקלאיד בודד (SNVs) והכנסות ומחיקות קטנות (indels).
  4. הוריאנטים אנוטטו באמצעות מאגרי מידע ציבוריים, כולל Genome Aggregation Database (gnomAD), פרויקט 1000 Genomes, ClinVar ו-Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM).
  5. הוריאנטים סוננו ותיעודפם לפי הקריטריונים הבאים:
    1. וריאנטים הממוקמים באזורים אקסוניים או באזורי שחבור קנוניים נשמרו.
    2. וריאנטים נפוצים עם תדירות אלל מינורי (MAF) של >0.01 במאגרי מידע של אוכלוסיות הוצאו.
    3. וריאנטים מסוג Nonsense, frameshift, splice-site ו-missense שנחזו כגורמים לנזק (deleterious) תועדפו.
    4. גנים מועמדים הושוו לרשימות גנים ידועות של הפרעות נוירו-מוסקולריות. גנים העולים בקנה אחד עם דפוס העברה אוטוסומלי רצסיבי תועדפו יותר.
    5. הטרנסקריפט NM_003384.3 של VRK1 שימש כרצף הייחוס עבור נומנקלטורת הווריאנטים.

6. אישור באמצעות ריצוף סנגר ואנליזה של הפרדה משפחתית

  1. פריימרים ל-PCR המקיפים את אתר הווריאנט המועמד תוכננו באמצעות תוכנה לעיצוב פריימרים.
  2. האזור הגנומי המטרה מתוך ה-DNA של כל אחד מבני המשפחה הועשר באמצעות PCR.
  3. תוצרי ה-PCR טוהרו, ובמקום זאת בוצע ריצוף סנגר (Sanger sequencing) דו-כיווני.
  4. כרומטוגרמות הריצוף הותאמו לרצף הייחוס באמצעות תוכנה ליישור רצפים (sequence-alignment software).
  5. הגנוטיפ של כל בן משפחה אומת, ונבחנה השתייכות משותפת (cosegregation) של הווריאנט עם הפנוטיפ של המחלה באילן היוחסין.
    הערה: אושרו כרומטוגרמות נקיות עם שיא בודד ללא רעש רקע. הגברת ה-PCR והריצוף חזרו עבור דגימות שהניבו תוצאות מעורפלות.

7. סיווג פתוגניות של וריאנטים ואישור אבחנתי

  1. הוריאנט המאומת סווג על פי הסטנדרטים וההנחיות של 2015 של המכללה האמריקאית לגנטיקה רפואית וגנומיקה (ACMG).
  2. פנוטיפים קליניים, ממצאים נוירופיזיולוגיים, תוצאות בדיקות גנטיות ונתוני הפרדה משפחתית שולבו כדי לקבוע את האבחנה המולקולרית הסופית.
  3. למשפחה ניתן ייעוץ גנטי בנוגע לסיכון לחזור, אפשרויות רבייה ופרוגנוזה לטווח ארוך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ממצאים גנטיים

בוצע WES לפרובנד, עם עומק ממוצע של אזור המטרה של 112 ×; 98.7% מבסיסי המטרה כוסו בעומק של ≥10 ×, ו-96.2% בעומק של ≥20 ×. לאחר סינון ותעדוף של וריאנטים, זוהה וריאנט nonsense הומוזיגוטי c.1124G>A (p.Trp375Ter) ב-VRK1 gene (טרנסקריפט NM_003384.3, גרסת גנום GRCh37/hg19) כוריאנט הפתוגני המועמד.

ריצוף סנגר (Sanger sequencing) אישר כי הפרובנד נשא את הווריאנט ההומוזיגוטי (איור 3A), בעוד שאביו (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, יישמנו זרימת עבודה אבחנתית משולבת המשלבת פנוטיפ klinisch, בדיקה נוירופיזיולוגית, WES ואנליזה של הפרדה משפחתית כדי לזהות וריאנט פתוגני הומוזיגוט VRK1 c.1124G>A במשפחה סינית בעלת נישואים פנימיים עם dHMN המופיע בבגרות. אילן יוחסין זה מרחיב את הספקטרום הפנוטיפי של הפרעות הקשורות ל-VRK1 ומספק נתוני ייחוס לאבחון dHMN באוכלוסייה הסינית.

שיקולים מתודולוגיים עבור זרימת העבודה האבחנתית

תהליך העבודה האבחנתי עבור dHMN הקשור ל-VRK1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים להגילוי.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט הלאומי לבניית התמחות יתרונית ב-TCM לשנת 2026 (אנצפלופתיה) (Yuncaishe [2025] No. 219), ותוכנית המחקר הבסיסי של מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז יוננאן (מענק מספר 202401AZ070001-057).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים &חומרים מתכלים
מבחנה לאיסוף דם בוואקום עם נוגדם קרישה EDTA (5 מ"ל)BD Biosciences (Becton, Dickinson and Company)367861
ערכה למיצוי DNA גנומי (בפורמט של עמודת ספין) מדם פריפרי)QIAGEN; QIAamp DNA Blood Mini Kit51106
ערכה להגברה של גשושים תלויה באיגור רב-שלבי (MLPA)MRC Hollandערכת גשים מותאמת אישית עבור גן מטרה
ערכה להגברת PCR (כוללת Taq polymerase, dNTPs ותמיסת באפר לתגובה)Takara Bio; LA Taq PCR KitRR002A
אבקת אגרוז (בדרגת אלקטרופורזה)Biowest111860
ערכה לתגובת ריצוף סנגר (BigDye Terminator v3.1)Thermo Fisher Scientific; Applied Biosystems4337455
ערכה לטיהור תוצרי ריצוףThermo Fisher Scientific; ערכה לטיהור BigDye XTerminator4376484
בופר TAE לאלקטרופורזהבדרגה מסחרית / בהכנה מעבדתית—
שפופרות PCR של 8 יחידות (strips), שפופרות צנטריפוגה וחומרים מתכלים שגרתיים אחריםAxygen—
<חזק>מכשירים &ציוד
מנתח גנטי באמצעות אלקטרופורזה קפילרית (פלטפורמה לריצוף סנגר)Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific3500 Dx
מכשיר תגובות שרשרת פולימראז (PCR) עם מעגל תרמי בעל מדרג טמפרטורות (Gradient thermal cycler)Bio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
ספקטרופוטומטר אולטרה-מיקרו (לכימות חומצות גרעין)NanoDrop One, Thermo Fisher ScientificND-ONE-W
מערכת אלקטרופורזה של ג'ל אגרוזה אופקיתBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYY-6C
מערכת לתיעוד וניתוח ג'ליםBio-Rad LaboratoriesGelDoc Go
צנטריפוגה מקוררת מהירה לשולחן המעבדהEppendorf5424 R
מערכת לבדיקת מהירות הולכה עצבית / אלקטרומיוגרפיה (NCV/EMG)Natus Medicalנקודת מפתח 9033A07
מקלחת מתכת בטמפרטורה קבועה / מקלחת מיםDLAB Scientific—
<חזק>תוכנה לניתוח
<קישור ל-"https://link.wtturl.cn/?target=https://Coffalyser.Net&scene=im&aid=497858&lang=zh" כותרת="קישור אוטומטי">תוכנה לניתוח נתוני MLPA (Coffalyser.Net)MRC Hollandגרסה 140
תוכנה לניתוח שיאי רצף של ריצוף סנגר והשוואת רצפיםApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientificניתוח רצף v6.0
תוכנה לעיצוב פריימריםPremier BiosoftPrimer Premier 6
כלים ליישור רצפים ו לפירוש וריאנטיםNCBI BLAST (מקוון), מאגר הנתונים ClinVar—

מקורות

  1. Tazir M, Nouioua S. Distal hereditary motor neuropathies. Rev Neurol (Paris). 2024;180(10):1031–6.
  2. Frasquet M, Sevilla T. Hereditary motor neuropathies. Curr Opin Neurol. 2022;35(5):562–70.
  3. Rossor AM. Broadening the genetic spectrum of distal hereditary motor neuropathy. Eur J Neurol. 2021;28(4):1104–5.
  4. Devic P, Petiot P. Les amyotrophies spinales distales [distal hereditary motor neuropathy]. Rev Neurol (Paris). 2011;167(11):781–90.
  5. Dick KJ, et al. Refinement of the locus for distal hereditary motor neuronopathy VII (dHMN-VII) and exclusion of candidate genes. Genome. 2008;51(11):959–62.
  6. Lazo PA. Nuclear functions regulated by the VRK1 kinase. Nucleus. 2024;15(1):2353249. doi:10.1080/19491034.2024.2353249.
  7. El-Bazzal L, et al. Loss of Cajal bodies in motor neurons from patients with novel mutations in VRK1. Hum Mol Genet. 2019;28(14):2378–94.
  8. Feng SY, Li LY, Feng SM, Zou ZY. A novel VRK1 mutation associated with recessive distal hereditary motor neuropathy. Ann Clin Transl Neurol. 2019;6(2):401–5.
  9. Marcos AT, et al. VRK1 (Y213H) homozygous mutant impairs Cajal bodies in a hereditary case of distal motor neuropathy. Ann Clin Transl Neurol. 2020;7(5):808–18.
  10. Lazo PA, Morejón-García P. VRK1 variants at the cross road of Cajal body neuropathogenic mechanisms in distal neuropathies and motor neuron diseases. Neurobiol Dis. 2023;183:106172. doi:10.1016/j.nbd.2023.106172.
  11. Capponi S, et al. HSPB1 and HSPB8 in inherited neuropathies: study of an Italian cohort of dHMN and CMT2 patients. J Peripher Nerv Syst. 2011;16(4):287–94.
  12. Luigetti M, et al. A novel HSPB1 mutation in an Italian patient with CMT2/dHMN phenotype. J Neurol Sci. 2010;298(1–2):114–17.
  13. Curthoys IS. A critical review of the neurophysiological evidence underlying clinical vestibular testing using sound, vibration and galvanic stimuli. Clin Neurophysiol. 2010;121(2):132–44.
  14. Simon AJ, et al. Whole exome sequencing (WES) approach for diagnosing primary immunodeficiencies (PIDs) in a highly consanguineous community. Clin Immunol. 2020;214:108376. doi:10.1016/j.clim.2020.108376.
  15. Miller DT, et al. ACMG SF v3.2 list for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing: a policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2023;25(8):100866. doi:10.1016/j.gim.2023.100866.
  16. Tan L, et al. A 9-month-old Chinese patient with Gabriele-de Vries syndrome due to novel germline mutation in the YY1 gene. Mol Genet Genomic Med. 2021;9(2):e1582. doi:10.1002/mgg3.1582.
  17. Xu K, et al. Novel VRK1 variants and a founder effect in axonal polyneuropathy. Neurol Genet. 2026;12(3):e200381. doi:10.1212/NXG.0000000000200381.
  18. Campos-Díaz A, et al. Pathogenic effects of Leu200Pro and Arg387His VRK1 protein variants on phosphorylation targets and H4K16 acetylation in distal hereditary motor neuropathy. J Mol Med (Berl). 2024;102(6):801–17.
  19. Greenbaum L, et al. Identification of a homozygous VRK1 mutation in two patients with adult-onset distal hereditary motor neuropathy. Muscle Nerve. 2020;61(3):395–400.
  20. Bos R, et al. Altered action potential waveform and shorter axonal initial segment in hiPSC-derived motor neurons with mutations in VRK1. Neurobiol Dis. 2022;164:105609. doi:10.1016/j.nbd.2021.105609.
  21. Martín-Doncel E, Rojas AM, Cantarero L, Lazo PA. VRK1 functional insufficiency due to alterations in protein stability or kinase activity of human VRK1 pathogenic variants implicated in neuromotor syndromes. Sci Rep. 2019;9(1):13381. doi:10.1038/s41598-019-49821-7.
  22. Vinograd-Byk H, Renbaum P, Levy-Lahad E. Vrk1 partial knockdown in mice results in reduced brain weight and mild motor dysfunction, and indicates neuronal VRK1 target pathways. Sci Rep. 2018;8(1):11265. doi:10.1038/s41598-018-29215-x.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גן VRK1וריאנט הומוזיגוטינוירופתיה פריפריתריצוף כל الاكסומיםריצוף סנגרהורשה אוטוזומלית רצסיביתבדיקה אלקטרופיזיולוגיתפוטנציאל פעולה שרירי תרכובוריאנט פתוגני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.