הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

Xiaoyao San משופר מקל על התנהגויות דמויות דיכאון ועל נמקרופטוזה עצבית במודל עכברים של סטרס מתון לא צפוי כרוני

82 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72522

⸱

21 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Collaborative Innovation Center of Research and Development on the Whole Industry Chain of Yu-Yao, Henan Province, Henan University of Chinese Medicine, 2Academy of Chinese Medical Sciences, Henan University of Chinese Medicine, 3Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Traditional Chinese Medicine, Shanghai Tenth People's Hospital, 5College of Chinese Medicine, Henan University of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים את הערכת Modified Xiaoyao San במודל עכברים של דיכאון המושרה על ידי סטרס מתון, כרוני ולא צפוי, הכולל הערכות התנהגותיות, היסטולוגיות ומולקולריות של נקרופטוזיס עצבית.

תקציר

אובדן ונזק נוירונליים הם מאפיינים פתולוגיים חשובים של דיכאון, ונקרופטוזיס הוצע כמנגנון פוטנציאלי למות תאי עצב. ניתוח של מאגרי נתונים מ-Gene Expression Omnibus (GEO) (מספרי המאגרים GSE54565, GSE54566 ו-GSE54568) העלה קשר בין דיכאון לנקרופטוזיס, מה שמרמז כי עיכוב של מסלול זה עשוי להוות אסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית. Modified Xiaoyao San (MXYS), פורמולציה משופרת של הרפואה הסינית המסורתית Xiaoyao San, פותחה על ידי שילוב של עשבים המנקים חום, מקרירים את הדם, משפרים קוגניציה ומקדמים התאוששות, במטרה לשפר את היעילות הטיפולית. עם זאת, השפעותיה על נקרופטוזיס נוירונלי ומרכיביה הפעילים המגיעים לרקמת המוח נותרו לא ברורים. נעשה שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים מאוד המשולבת עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה (UHPLC-HRMS) כדי לזהות באופן ראשוני את מרכיבי MXYS שזוהו ברקמת המוח. היעילות הטיפולית הוערכה במודל עכברים לדיכאון תחת סטרס קל בלתי צפוי כרוני (CUMS) באמצעות הערכות התנהגותיות, בדיקה היסטולוגית, אימונופלורסנציה, western blotting וניתוחים ביו-אינפורמטיים. מתן MXYS היה קשור לשיפור בהתנהגויות דמויות דיכאון, להפגתה של פגיעה פתולוגית במוח, ולהפחתה של פוספורילציה של receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) ושל mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL). ממצאים אלה מצביעים על כך ש-MXYS מפעילה השפעות דמויות נוגדות-דיכאון הקשורות להפחתה של סממנים לנקרופטוזיס נוירונלי, ובכך מספקת תמיכה ניסויית לבדיקה מעמיקה של MXYS כאסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית לדיכאון.

מבוא

דיכאון, הפרעה נפשית חמורה בתוך ספקטרום של הפרעות מצב רוח, מאופיין בעיקר במצב רוח נמוך מתמשך ומושפע מגורמים מרובים1. מבחינה קלינית, חולים עם דיכאון מראים בדרך כלל תסמינים כגון מצב רוח מדוכא, האטה קוגניטיבית, ירידה בתקשורת מילולית ובפעילות גופנית, ובמקרים חמורים, התנהגות פגיעה עצמית ומחשבות אובדניות2. בשל השכיחות הגבוהה שלו, נטיות לחזור, שיעורי הנכות וההתאבדות, הדיכאון הוא סיבה מובילה לנכות ברחבי העולם ומטיל נטל חברתי וכלכלי משמעותי3. על פי ארגון הבריאות העולמי, הצפי הוא שדיכאון יהפוך לגורם המרכזי בנטל המחלות העולמי עד שנת 2030, ויעקוף את הסרטן ומחלות לב וכלי דם ומחלות בכלי דם מוחיים3. בנוסף, מגפת מחלת הקורונה 2019 (COVID-19) הייתה קשורה לעלייה של 27.6% בשכיחות העולמית של הפרעה דיכאונית מז׳ורית4. בסין, השכיחות השנתית של דיכאון היא 3.6%, עם שכיחות לאורך החיים של 6.8%5. הפתוגנזה של הדיכאון נותרה לא מובנת במלואה בשל האטיולוגיה המורכבת שלה והגורמים התורמים הרבים. כתוצאה מכך, אפשרויות הטיפול נותרות מוגבלות, וכ-30%–40% מהחולים מפתחים דיכאון עמיד לטיפול עקב תגובה לא מספקת לנוגדי דיכאון הזמינים כיום6. יתרה מכך, תחילת הפעולה המאוחרת, תסמינים שיוריים, נוירוטוקסיות ותופעות לוואי הקשורות לנוגדי דיכאון קיימים ממשיכים להוות אתגרים טיפוליים משמעותיים7.

מוות תאי מתוכנן מהווה מוקד מרכזי במחקר ביו-רפואי מזה זמן רב. עדויות גוברות מצביעות על כך שדיכאון קשור ל-necroptosis8,9,10,11. Necroptosis, בדומה ל-apoptosis, הוא צורה של מוות תאי מתוכנן; עם זאת, בניגוד ל-apoptosis, הוא מעורר תגובות חיסוניות ודלקתיות מודגשות12. בהיעדר פעילות של caspase-8, גורם נמק גידול-α (TNF-α) נקשר לקולטן גורם נמק גידול 1 (TNFR1), מה שמוביל להפעלה של kinase 1 של חלבון המתרגב עם קולטן (RIPK1)13. RIPK1 פעיל מקשר עם kinase 3 של חלבון המתרגב עם קולטן (RIPK3) כדי ליצור את קומפלקס ה-necrosome, אשר לאחר מכן מפעיל חלבון דמוי דומיין kinase של שושלת מעורבת (MLKL)14. בעקבות אוליגומריזציה, MLKL עובר מהציטופלזמה לממברנת הפלזמה, מה שגורם לנפיחות של אברונים15,16, פגיעה בשלמות ממברנת התא, ושחרור של תכנים תוך-תאיים, כולל תבניות מולקולריות הקשורות לנזק (DAMPs) ומתווכי דלקת כגון TNF-α, interluekin (IL)-1 ו-IL-6, ובכך מחריף את תגובות הדלקת17. Necroptosis היה מעורב במספר רב של מחלות דלקתיות וניווניות של מערכת העצבים, כולל טרשת נגדית, דיכאון, נרעונוניקה (ALS), מחלת פרקינסון ומחלת אלצהיימר18,19,20. ניתוחים פרותיאומיים הראו כי דיכאון המושרה על ידי סטרס מתון בלתי צפוי כרוני (CUMS) קשור לביטוי מוגבר של RIPK3 ו-MLKL ולהפעלה של מסלול ה-necroptosis2. במודל עכברים אחר לדיכאון המושרה על ידי CUMS, fluoxetine הפגין השפעות דמויות נוגדות-דיכאון שהיו קשורות לעיכוב של necroptosis המתווך על ידי RIPK110. יתרה מכך, Nec-1s, מעכב של necroptosis, הראה שיפור בהתנהגויות דמויות דיכאון המושרות על ידי ליפופוליסכריד (LPS)21. מכיוון שפגיעה נוירונלית היא מאפיין פתולוגי חשוב של דיכאון, התמקדות ב-necroptosis עשויה להוות אסטרטגיה טיפולית מבטיחה לטיפול בדיכאון.

לרפואה הסינית המסורתית (TCM) היסטוריה ארוכה של טיפול בדיכאון. על פי תיאוריית ה-TCM, הכבד שולט בזרימה החופשית של ה-qi; לכן, דיכאון מיוחס בעיקר למצוקה רגשית המובילה לסטגנציה של ה-qi בכבד. בהתאם לכך, האסטרטגיה הטיפולית העיקרית היא להרגיע את הכבד ולהקל על הדיכאון. Xiaoyao San (XYS) היא מרשם צמחים קלאסי המשמש באופן נרחב למטרה זו, וראיות רבות תומכות בשימושו לטיפול בדיכאון22. יתרה מכך, דווח כי XYS בעל תכונות אנטי-נקרופטיות23,24. בהתבסס על מושגי ה-TCM של "דיכאון כבד שהופך לאש" ו"עליית yang צלול למוח", בוצע שינוי ב-XYS על ידי הוספת Moutan Cortex (Mudan Pi) ו-Gardeniae Fructus (Zhizi) כדי לפנות חום ולקרר את הדם, יחד עם Acori Tatarinowii Rhizoma (Shi Changpu) ו-Polygalae Radix (Yuan Zhi) כדי לקדם תפקוד קוגניטיבי והתעוררות. הפורמולה שהתקבלה כונתה Modified Xiaoyao San (MXYS) ופותחה כדי לספק השפעות טיפוליות משופרות בהתבסס על עקרונות ה-TCM. עם זאת, במחקר זה לא בוצעה השוואה ישירה מול פורמולת ה-XYS המקורית25. מחקרים קליניים הדגימו את היעילות הנוגדת דיכאון של MXYS26,27,28, והשפעותיו הטיפוליות עשויות להיות קשורות לוויסות של ציר ההיפותלמוס-היפופיזה-בלוטת התת-כי{|\}מה (HPA) ועכבה של דלקת נוירונית29,30,31. עם זאת, עדיין לא ברור אם MXYS קשור להפחתה בנקרופטוזה נוירונלית.

במחקר הנוכחי, נעשה שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים מאוד המשולבת עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה (UHPLC-HRMS) כדי לזהות באופן ראשוני תרכובים ממקור MXYS שזוהו ברקמת מוח. מאגרי נתונים זמינים לציבור מ-Gene Expression Omnibus (GEO) וניתוחים ביואינפורמטיים, כולל ניתוח רשת ביטוי גנים משוקלל (WGCNA), ניתוח ביטוי דיפרנציאלי וניתוח העשרה, שימשו לבדיקת הקשרים בין MXYS, דיכאון ונקרופטוזיס. על בסיס ממצאים אלו, שיערנו כי MXYS עשוי להפעיל השפעות דמויות-נוגדות דיכאון הקשורות להפחתה במרסמני נקרופטוזיס נוירונלית, כאשר נתיב ה-activating transcription factor 4 (ATF4)/cAMP response element-binding protein (CREB)/brain-derived neurotrophic factor (BDNF) מהווה מנגנון קורלטיבי מועמד. כדי להעריך השערה זו, תרכובים שזוהו ברקמת מוח זוהו באופן ראשוני באמצעות UHPLC-HRMS, בוצעו ניתוחים ביואינפורמטיים לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות, ונערכו ניסויי in vivo כדי לבחון האם טיפול ב-MXYS קשור לשינויים במרסמני נקרופטוזיס ובנתיב ה-ATF4/CREB/BDNF. ממצאים אלו מספקים ראיות ראשוניות התומכות ביישום טיפולי פוטנציאלי של MXYS בדיכאון, תוך הכרה בכך שעדיין נדרשים מחקרי השוואה עם פורמולציית XYS המקורית ותיקוף של תגובת מינון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת Henan לרפואה סינית (מספר אישור DWLLGZR202200023). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות והלאומיות לרווחת בעלי חיים ועמדו בהנחיות ARRIVE. חולדות זכר מסוג Sprague–Dawley (SD) הושגו מספק מורשה של חיות מעבדה. בעלי החיים שוכןו תחת טמפרטורה ולחות מבוקרות עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, וסופקו להם מזון סטנדרטי ומים באופן חופשי (ad libitum).

זיהוי הרכיבים של MXYS המצויים ברקמת המוח
הכנת אבקת MXYS מיובשת בהקפאה:
11 הצמחים של MXYS הושרו ב-10 נפחים של מים מזוקקים למשך 2 h ולאחר מכן הורתחו למשך 40 min. נענע הוספה במהלך 5 min האחרונים של הבישול. בישול שני הוכן באותה דרך תוך שימוש ב-8 נפחים של מים מזוקקים. שני התכשירי הבישול אוחדו, סוננו דרך גזה, רוכזו תחת לחץ מופחת לריכוז של 1 g/mL (שווה ערך לתרופה גולמית), ויובשו בהקפאה תחת ואקום למשך 48 h כדי לקבל אבקת MXYS מיובשת בהקפאה. ניצולת המיצוי הייתה 21.7% (w/w)25,29,31.

בעלי חיים ומתן MXYS:
שנים עשר חולדות SD זכרים חולקו באופן אקראי לשתי קבוצות וקיבלו MXYS או מים מזוקקים פעמיים ביום באמצעות הזנה רגביבית (oral gavage). שתי המנות היומיות ניתנו בשעה 8:00 בבוקר ובשעה 8:00 בערב (במרווח של 12 שעות). אבקת MXYS הומסה במים מזוקקים וניתנה במינון של 24.4 g/kg (בערך פי שניים מהמינון הקליני עבור חולדות)25. קבוצת הביקורת קיבלה מים מזוקקים בנפח שווה (10 mL/kg).

הכנת רקמת מוח המכילה MXYS:
לאחר 14 ימים, כל החולדות הורדמו באמצעות sodium pentobarbital (40 mg/kg, בהזרקה תוך-פריטוניאלית) שעתיים לאחר מתן ה-MXYS האחרון. רקמות מוח נאספו בעקבות פרפוזיה טרנס-קרדיאלית עם סליין נורמלי. מוחות שלמים הוצאו באופן מיידי והונחו על קרח כדי להשיג דגימות של רקמת מוח ביקורת ודגימות של רקמת מוח שעברה טיפול ב-MXYS.

תנאי כרומטוגרפיה/ספקטרומטריית מסות ומסד נתונים:
אבקת MXYS מיובשת בהקפאה, רקמת מוח ריקה עם תוספת של אבקת MXYS, רקמת מוח ריקה ותמציות מרקמת מוח המכילה MXYS נותחו באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC) המצוידת בעמודת HSS-T3 (במידות 100 × 2.1 mm, 1.8 μm) ששומרה בטמפרטורה של 35°C. הפאזות הניידות כללו מים המכילים 0.1% formic acid (פאזה ניידת A) ואצטוניטריל המכיל 0.1% formic acid (פאזה ניידת B). הדגימות הופרדו בקצב זרימה של 0.3 mL/min תוך שימוש במעבר הדרגתי (גרדיאנט) של 5% B למשך 1 min, עלייה ל-98% B לאורך 16 min, חזרה ל-5% B בתוך 0.5 min, והחזקה ב-5% B למשך 2.5 min.

ספקטרומי מס נרכשו הן במצב יינון של electrospray חיובי והן במצב שלילי, תוך שימוש ברכישת נתונים תלויה-נתונים (data-dependent acquisition) בטווח m/z של 90–1,300. ספקטרי MS/MS הופקו מ-10 יוני המוצא בעלי העוצמה הגבוהה ביותר, תוך שימוש באנרגיות התנגשות מדורגות של higher-energy collisional dissociation בערכים של 20, 40 ו-60 eV. טמפרטורת הנימי נשמרה על 320°C, וטמפרטורת מחמם הגשוש נקבעה ל-350°C.

ביצוע האנוטציה של התרכובות בוצע על ידי התאמה של מסה מדויקת, התפלגות איזוטופית וספקטרום MS/MS מול מאגר נתונים פנימי של רפואה סינית מסורתית ומול מאגרי הנתונים הציבוריים GNPS32, ReSpect33, ו-MassBank34. תרכובות בעלות התאמת MS/MS אמינה וצורות שיאים כרומטוגרפיות עקביות נשמרו. הרשימה המלאה של התרכובות שזוהו באופן זמני מוצגת ב-טבלה משלימה 1.

ביואינפורמטיקה
בחירת מערכי נתונים ועיבוד מקדים ממאגר ה-GEO:
המעורבות הפוטנציאלית של נקרופטוזיס בפתולוגיה של דיכאון נבחנה באמצעות חיפוש במאגר ה-GEO תחת מילת המפתח “depression”. בהתבסס על קריטריוני הבחירה, זוהו שלושה מערכי נתונים (GSE54566, GSE54565, ו-GSE54568) להמשך ניתוח. מערכי הנתונים הופקו מאזורים שונים במוח: GSE54565 (קליפת המוח החגורתית הקדמית), GSE54566 (אמיגדלה), ו-GSE54568 (קליפת המוח הפרה-פרונטלית הדורסולטרלית, BA9). כל מערכי הנתונים הופקו באמצעות פלטפורמת ה-Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array (GPL570) והורכבו מדגימות רקמת מוח לאחר המוות של מטופלים עם הפרעה דיכאונית מז'ורית (MDD) וביקורות שאינן פסיכיאטריות. מאפייני דגימה מפורטים עבור כל מערך נתונים מסוכמים ב-טבלה נספחת 2. מערכי נתונים אלו כללו נתונים טרנסקריפטומיים משלושה אזורי מוח המעורבים בדיכאון. ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי בוצע בין קבוצת ה-MDD לקבוצת הביקורת עבור כל מערך נתונים, וגנים שהראו ביטוי מוגבר או מופחת באופן עקבי שולבו באמצעות חבילת ה-R בשם Robust Rank Aggregation (RRA).

כל מערכי הנתונים עובדו מראש באמצעות אלגוריתם ה-robust multi-array average (RMA) לצורך תיקון רקע ונורמליזציה. לאחר נורמליזציית RMA, יושם אלגוריתם ComBat הממומש בחבילת ה-sva של R כדי לתקן השפעות של אצוות (batch effects) בין מערכי הנתונים, כאשר מקור מערך הנתונים הוגדר כמשתנה השיתופי (covariate) של האצווה. הליך זה הפחית את השונות הטכנית בין מערכי הנתונים ושיפר את יכולת ההשוואה לצורך ניתוחים המשכיים.

ניתוחים ביואינפורמטיים בוצעו באמצעות תוכנת R (גרסה 4.2.1). חבילות ה-R העיקריות ששימשו למחקר כללו את ClusterProfiler (גרסה 4.8.2) לצורך ניתוחי העשרה של Gene Ontology (GO) ו-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), את WGCNA (גרסה 1.72) לניתוח רשת ביטוי גנים משותף משוקלל, את RRA לאינטגרציה של גנים עם ביטוי דיפרנציאלי, ואת sva (גרסה 3.48.0) לתיקון אפקטים של סדרות (batch correction) באמצעות ComBat. זרימת העבודה האנליטית כללה רכישת נתונים, נורמליזציה בשיטת RMA, תיקון אפקטים של סדרות באמצעות ComBat, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי עם אינטגרציית RRA, בניית מודולים באמצעות WGCNA, ניתוחי העשרה של GO ו-KEGG עם שיעור גילוי שגוי (FDR) < 0.05, וחיזוי מטרות בשילוב ניתוח רשת אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI).

שימוש ב-WGCNA לבניית רשתות ביטוי גנים משותף וזיהוי מודולים הקשורים באופן מובהק לדיכאון ולנקר Completed פטוזיס:
WGCNA בונה רשתות משוקללות של ביטוי גנים משותף על ידי החלת חזקת סף רכה (ערך β) כדי לקרב את הטופולוגיה למבנה נטול קנה מידה (scale-free topology). ערך ה-β נבחר כאשר מקדם המתאם בין log(k) ל-log(p(k)) הגיע ללפחות 0.9. לאחר בחירת ערך ה-β, זוהו מודולים של גנים באמצעות שיטת dynamic tree cut. פרמטרים נוספים נקבעו באופן הבא: minModuleSize = 30, cutHeight = 0.25, ו-deepSplit = 2. ערך ה-β נבחר כאשר מקדם המתאם בין log(k) ל-log(p(k)) הגיע ללפחות 0.9. חזקת סף רכה של β = 7 שימשה לבניית הרשת. עבור כל מודול חושב ה-Module Eigengene (ME) כדי לסכם את דפוסי ביטוי הגנים ולהעריך קשרים עם תכונות ביולוגיות. לאחר מכן חושבו מובהקות הגן (GS) וחברותו של הגן למודול (MM), ומערכות היחסים בין המודול לתכונה הוערכו באמצעות מקדם מתאם (cor) וערך p תואם. מקדמי מתאם גבוהים יותר וערכי p נמוכים יותר הצביעו על קשרים חזקים יותר בין מודולי הגנים לבין התכונות הביולוגיות.

ניתוח העשרה תפקודי ובניית רשת PPI:
ClusterProfiler שימש לביצוע ניתוח העשרה של נתיבי KEGG. שיטת Benjamini–Hochberg FDR יושמה לצורך תיקון לבדיקות מרובות, וערך p מתוקנן (FDR) < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית. לאחר זיהוי המודול המטרה, בוצע חיתוך בין הגנים המרכזיים בתוך המודול לבין גנים הקשורים ל-MXYS ולנמקרופטוזיס (necroptosis). לאחר מכן, נבנתה רשת PPI באמצעות מאגר הנתונים STRING.

חיזוי מטרות עבור תרכובות שזוהו ברקמת מוח:
143 התרכובות שזוהו באופן ראשוני ברקמת מוח של חולדה לאחר מתן MXYS שימשו לחיזוי מטרות. עבור כל תרכובת, נשלפו מטרות פוטנציאליות ממאגר הנתונים GeneCards באמצעות פונקציית Related Targets עם ציון רלוונטיות > 5. מטרות כפולות מוזגו, ורק גנים אנושיים עם סמלי גנים רשמיים נשמרו, מה שהביא ל-3,164 מטרות ייחודיות. מטרות אלו הוכפפו לאנליזות העשרה של GO ו-KEGG באמצעות חבילת ה-R שנקראת ClusterProfiler, כאשר FDR < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית. קבוצת הגנים של הרקע כללה את כל הגנים המקודדים לחלבונים בבני אדם המאannotated במאגר הנתונים KEGG.

אימות ניסיוני
תרבית תאים:
תאי HT-22 התקבלו מ-Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (CL-0697, RRID: CVCL_0321) וגודלו במצע גידול מועשר ב-10% fetal bovine serum (FBS) וב-100 U/mL פניצילין/סטרפטומייצין. התאים תוחזקו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5% CO₂.

פעילות אנטי-נקרופטוטית של MXYS:
אבקת MXYS מיובשת בהקפאה הומסה במצע גידול תאים לריכוז של 1.0 g/mL, עומסטרילית באמצעות מסנן ממברנה של 0.22 μm, ואוחסנה ב-−20°C עד לשימוש. תאי HT-22 נזרעו בצפיפות של 8,000 תאים לבאר בפלטות של 96 בארות, עם שלוש בארות לכל קבוצה. MXYS דולל במצע גידול לריכוזים סופיים של 2, 4 ו-6 mg/mL. לאחר דגירה של 12 h, התאים טופלו ב-SM-164 hydrochloride (10 nM) ובמעכב הקספאז z-VAD-fmk (20 μM) למשך 30 min, ולאחר מכן עברו לגירוי באמצעות human tumor necrosis factor-α (h-TNF-α; 20 ng/mL) למשך 12 h נוספות. חיוניות התאים הוערכה באמצעות בדיקת חיוניות תאים לומניסנטית בהתאם להוראות היצרן. הלומניסנציה נמדדה באמצעות קורא מיקרופלטות. מורפולוגיית התאים נבחנה תחת מיקרוסקופ הפוך, ותמונות מייצגות נרכשו לצורך ניתוח.

בעלי חיים:
הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת חנאן לרפואה סינית (מספר אישור DWLLGZR202200023). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות והלאומיות לרווחת בעלי חיים ועמדו בהנחיות ARRIVE. לצורך הקמת מודל ה-CUMS נעשה שימוש בעכברי BALB/c זכרים בלבד, בגילאי 6–8 שבועות. בעלי החיים שוהו בתנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, וסופקו להם מזון סטנדרטי ומים באופן חופשי (ad libitum).

מודל דיכאון המושרה על ידי CUMS:
עכברים הוקצו באופן אקראי לקבוצת ביקורת או לקבוצת CUMS. לאחר שבוע של אקלימטציה, עכברים מקבוצת ה-CUMS נחשפו לגורמי עקה קלים, לסירוגין ולא צפויים, בעוד שעכברי הביקורת לא הופרעו. פרדיגמת העקה כללה 13 גורמי עקה שונים, ביניהם הטיית כלוב, ניעור כלוב, החלפת כלוב, מצע רטוב, מניעת מים, תאורה סטרובוסקופית, חשיפה לרעש, תאורה רציפה, חשיכה רציפה, תאורה לסירוגין, שחייה במים קרים (4°C), שחייה במים חמים (40°C), עקת הגבלה וגורמי עקה קלים אחרים. כל גורם עקה הופעל למשך 2–6 h למשמרת ברצף אקראי כדי לשמר את חוסר הצפויות. העכברים נחשפו לגורם עקה אחד או שניים שונים בכל יום בהתאם ללוח זמנים אקראי.

קבוצות וטיפול תרופתי:
לאחר שישה שבועות של חשיפה ל-CUMS, העכברים חולקו באופן אקראי לקבוצות הטיפול CUMS, MXYS, paroxetine או Nec-1. קבוצת ה-MXYS קיבלה אבקת MXYS מיובשת בהקפאה באמצעות זריקה פומית (oral gavage) במינון של 35.2 g/kg/day. קבוצת ה-paroxetine קיבלה paroxetine (במינון 20 mg/kg) באמצעות זריקה פומית, בעוד שקבוצת ה-Nec-1 קיבלה Nec-1 (במינון 10 mg/kg) באמצעות הזרקה תוך-peritoneal למשך ארבעה שבועות רצופים. במהלך אותה תקופה, קבוצת הביקורת וקבוצת ה-CUMS קיבלו נפח שווה של תמיסת סליין נורמלית באמצעות זריקה פומית.

ניסויים התנהגותיים:
העכברים חולקו באופן אקראי לקבוצות ניסוי באמצעות רצף מספרים אקראי שהופק במחשב לפני תחילת מתן התרופה. רצף ההקצאה האקראית הופק על ידי חוקר עצמאי שלא היה מעורב בניסויים הבאים או בניתוח הנתונים.

מבחנים התנהגותיים בוצעו על ידי חוקר שהיה סמיך (blinded) לקבוצות הטיפול. אותו חוקר ביצע דירוג התנהגותי מבוסס וידאו (זמן אי-תנועה, מרחק שנעבר וזמן שהייה במרכז) באמצעות תוכנת מעקב אוטומטית כדי למזער הטיות סובייקטיביות. לחוקר הסמיך לא הייתה גישה לקודים של הקצאת הקבוצות עד שכל הנתונים ההתנהגותיים נאספו ונרשמו.

ניתוחי אימונופלואורסצנציה בוצעו על ידי חוקר נפרד, שגם הוא היה מסומן (blinded) לגבי הקבוצות הניסיוניות. הדגימות סומנו באמצעות מזהים מקודדים, והקצאת הקבוצות נחשפה רק לאחר השלמת מדידות הדנסיטומטריה או עוצמת הפלואורסצנציה. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו על ידי חוקר שלישי, שהיה מסומן הן לקבוצות שהוקצו והן לתוצאות הניסיוניות המתאימות, עד שכל הנתונים הכמותיים נאספו.

מבחן העדפת סוכרוז (SPT): בדיקות התנהגותיות בוצעו לאחר מתן התרופה האחרון. לפני הבדיקה, העכברים הותאמו לתמיסת סוכרוז בריכוז של 1% באמצעות אספקת שני בקבוקים המכילים תמיסת סוכרוז 1% למשך 12 שעות, ולאחר מכן בקבוק אחד המכיל תמיסת סוכרוז 1% ובקבוק אחד המכיל מי שתייה למשך 12 שעות נוספות. לאחר מכן, העכברים היו בהרעבה ובצום ממים למשך 12 שעות לפני הבדיקה הרשמית. במהלך הבדיקה, לכל עכבר סופקו בקבוק אחד המכיל תמיסת סוכרוז 1% ובקבוק אחד המכיל מי שתייה. לאחר 12 שעות, נמדד הנפח שנצרך מכל בקבוק. העדפת הסוכרוז חושבה באופן הבא:

משוואת העדפת סוכרוז, מדד העדפת תזונה; נוסחה: תרשים יחס צריכת סוכרוז לעומת מים.

מבחן השעיית זנב (TST): זנבו של כל עכבר קובע לחלקו העליון של מכשיר הבדיקה באמצעות סרט דביק. התנהגות העכברים הוקלטה במשך 6 דקות באמצעות תוכנה להקלטה ולניתוח וידאו התנהגותי. משך חוסר התנועה במהלך 4 הדקות האחרונות של הבדיקה נמדד כמותית.

מבחן השטח הפתוח (OFT): כל עכבר הונח בנפרד במרכזו של מכשיר השדה הפתוח (open-field apparatus). הפעילות ההתנהגותית הוקלטה ונוליתה במשך 5 דקות באמצעות תוכנה למעקב התנהגותי, כולל מרחק התניידות ופעילות תנועתית. לאחר כל בדיקה, נוקה המכשיר באתנול 75%.

איסוף דגימות:
עכברים שמתו במהלך הליך ה-CUMS או הראו סימני מחלה קשה (למשל, איבוד משקל של >20% ממשקל הגוף, זיהום נראה לעין או חוסר יכולת תנועה) הוצאו מהמחקר. ההמתה בוצעה על ידי כוח אדם מוסמך באמצעות מינון יתר של sodium pentobarbital (במינון של 150 mg/kg, בהזרקה תוך-פריטוניאלית). לאחר אובדן ההכרה, בוצעה פריקה של חוליות הצוואר כשיטה משנית להבטחת המוות. לצורך צביעת Nissl ואנליזות של אימונופלואורסצנציה, נבחרו באופן אקראי שלושה עכברים מכל קבוצה. רקמות מההיפוקמפוס לאנליזת western blot הוצאו מיד על קרח והוקפאו בהקפאה מהירה (snap-frozen) בחנקן נוזלי.

צביעת ניסל (Nissl Staining):
עבור צביעת ניסל וניתוחי אימונופלואורסצנציה, עכברים הורדמו עמוקות באמצעות סודיום פנטוברביטל (150 mg/kg, בהזרקה תוך-peritoneal) ועברו דקפיטציה ללא פרפוזיה טרנס-קרדיאלית. המוחות הוצאו במהירות וקובעו ב-4% פאראפורמאלדהיד למשך 24–48 שעות לפני הטמעה בפרפין. חתכי פרפין נחתכו לעובי של 3 μm. חתכי הפרפין עברו דה-פראפיניזציה באמצעות אינקובציה רצפתית בתמיסת הסרת שעווה, אתנול מוחלט ואתנול 75% לפני שטיפה במים זורמים. חתכים קפואים, במידה והיו רלוונטיים, הובאו לטמפרטורת החדר, קובעו עם מקבע רקמות למשך 15 דקות ונשטפו במים זורמים. חתכי הרקמה נצבעו בתמיסת צביעת ניסל למשך 2–5 דקות, נשטפו במים, עברו דיפרנציאציה עם 0.1% חומצה אצטית קרחית, נשטפו לסיום התגובה, נבחנו מיקרוסקופית לבקרת הדיפרנציאציה, יובשו, עברו הבהרה ב-xylene למשך 10 דקות ונקבעו באמצעות מדיום קיבוע ניטרלי.

אימונופלואורסצנציה:
פרוצדורות אימונופלואורסצנציה בוצעו בשיטות סטנדרטיות. רקמת מוח קובעה ב-4% paraformaldehyde וטומנה בפרפין לצורך צביעה אימונופלואורסצנטית. חיתוכי רקמה הודגרו למשך לילה ב-4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד NeuN (1:200), MLKL (1:300), ATF4 (1:5000) ו-CREB (1:1000). לאחר ההדגרה עם הנוגדנים הראשוניים, החיתוכים נשטפו ארבע פעמים עם PBS והודגרו למשך שעה אחת בחושך עם הנוגדנים המשניים הפלואורסצנטיים המתאימים: נוגדן עיזים anti-mouse IgG המשורר ל-CY3 (1:300, Servicebio, GB21301) עבור נוגדן עכבר anti-ATF4; נוגדן עיזים anti-mouse IgG המשורר ל-Alexa Fluor 488 (1:400, Servicebio, GB25301) עבור נוגדן עכבר anti-MLKL; נוגדן עיזים anti-rabbit IgG המשורר ל-CY3 (1:300, Servicebio, GB21303) עבור נוגדן ארנב anti-NeuN; ונוגדן עיזים anti-rabbit IgG המשורר ל-Alexa Fluor 488 (1:400, Servicebio, GB25303) עבור נוגדן ארנב anti-CREB. לאחר מכן, החיתוכים נצבעו ב-DAPI למשך 10 min בטמפרטורת החדר, נשטפו ב-PBS, הורכבו באמצעות תכשיר הרכבה למניעת דהייה (antifade mounting medium), ותמונות פלואורסצנציה נרכשו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

Western Blot:
רקמות מוח הומוגניזרו בבופר ליזיס מסוג radioimmunoprecipitation assay (RIPA). ריכוזי החלבון נקבעו, ו-20 μg של חלבון כולל לכל נתיב הופרדו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד עם נתרן דודציל סולפט (SDS-PAGE) בריכוז 10%, לפני העברה לממברנות polyvinylidene fluoride (PVDF). לאחר חסימה, הממברנות דגרו למשך לילה ב-4°C עם נוגדנים ראשוניים (1:1000), ולאחר מכן דגרו עם נוגדנים שניוניים המשורשרים ל-horseradish peroxidase (HRP) למשך שעה אחת. פסי החלבון הודגמו באמצעות מערכת דימוי כימילומניסנציה, ועוצמת הפסים נכמתה באמצעות תוכנת ImageJ. עבור ניתוח western blot של רקמות היפוקמפוס, נותחו שני עכברים לכל קבוצה, והוצגו אימונובלוטיים מייצגים. עבור ניסויי תאי HT-22, ניתוח western blot בוצע פעם אחת כניסוי מייצג. נתונים אלה מוצגים כתצפיות על מגמה איכותית ולא כממצאים מכומתים סטטיסטית.

ניתוח סטטיסטי:
הבדלים בין קבוצות נותחו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA), ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). ערך p < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית.

זמינות נתונים:
מערכי הנתונים שהופקו ונותחו במהלך מחקר זה כלולים במאמר זה ובחומרים הנלווים אליו. תוצאות זיהוי התרכובות ב-UHPLC-HRMS מופיעות ב-טבלה נלווית 1, ומאפייני מערכי הנתונים של GEO ששימשו לניתוחים הביואינפורמטיים מסוכמים ב-טבלה נלווית 2. נתונים תומכים נוספים, הכוללים אימונופלואורסצנציה של GFAP (איור נלווה 1), צביעת אימונופלואורסצנציה של p-RIPK3 ו-p-MLKL (איור נלווה 2), את תכנון הניסוי וציר הזמן של הקצאת בעלי החיים (איור נלווה 3), ואת תמונות ה-western blot המקוריות ללא חיתוך (איור נלווה 4), זמינים בחומרים הנלווים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

WGCNA מזהה מודול גנים הקשור לדיכאון המועשר במסלול הנקרופטוזיס
חבילת RRA שימשה לשילוב של גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי שהיו בעלי רמות עלייה (upregulated) וירידה (downregulated) עקביות במערכי הנתונים GSE54566, GSE54565 ו-GSE54568, מה שהוביל לזיהוי של 2,513 גנים. מפת חום של גנים אלו מוצגת ב-איור 1A. שלושת מערכי הנתונים נגזרו מאזורי מוח שונים — קליפת המוח החגורתית הקדמית (anterior cingulate cortex), האמיגדלה (amygdala) וקליפת המוח הפרה-פרונטלית הדורסולטרלית (dorsolateral prefro...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מוות נוירונלי חריג ממלא תפקיד מכריע בפתוגנזה של דיכאון8. נקרופטוזיס (Necroptosis), צורה של מוות תאי מתוכנן, נחקר באופן נרחב, מה שהוביל להתקדמויות משמעותיות בפיתוח מעכבים המכוונים למסלול זה39. מאז הזיהוי של המעכב לנקרופטוזיס Nec-1 בשנת 200540, הושג התקדמות ניכרת בפיתוח תרכובות המכוונות לרכיבי מפתח במסלול השיגנול של הנקרופטוזיס. Nec-1 הדגים השפעות מגנות מפני נקרופטוזיס במודלים של מחלות נוירולוגיות, קרדיווסקולריות וכליתיות41. בנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ניגודים עניינים:
למחברים אין הצהרות לגבי ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המחקר המדעי המרכזי של מוסדות להשכלה גבוהה בהנאן, סין (מס' 26A360008), פרויקט המחקר המדעי של הרפואה הסינית המסורתית של מחוז הנאן (מס' 2025ZY3152), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82274496), פרויקט המחקר למדע וטכנולוגיה של מחוז הנאן (מס' 232301420018), ופרויקט הירושה והחדשנות של Zhang Zhongjing של מחלקת המדע והטכנולוגיה של המינהל הלאומי לרפואה סינית מסורתית (מס' GZY-KJS-2022-044-1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Acori Tatarinowii Rhizoma (Acorus tatarinowii Schott; Shi Changpu)Beijing Tongrentang Co., Ltd., ז'נגז'ו, סין231001רכיב צמחי (12 גרם)
סרט דביקלא רלוונטילא רלוונטימבחן השעיה של הזנב
Angelicae Sinensis Radix (Angelica sinensis (Oliv.) Diels; Dang Gui)Beijing Tongrentang Co., Ltd., ז'נג'ז'ו, סיןG01230507-16רכיב צמחי (10 גרם)
נוגדן Anti-ATF4 (אימונופלואורסצנציה)ServicebioGB111137נוגדן ראשוני
נוגדן Anti-ATF4 (וסטרן בלוט)MedChemExpressHY-P80486נוגדן ראשוני
נוגדן אנטי-BDNFMedChemExpressHY-P80567נוגדן ראשוני עבור Western blot
נוגדן Anti-CREBBeyotimeAF1018נוגדן ראשוני עבור ווסטרן בלוט (western blot) ואימונופלואורסנציה
נוגדן Anti-GAPDHAbcamab181602בקרת העמסה
נוגדן Anti-MLKLProteintech66675-1-Igנוגדן ראשוני עבור ווסטרן בלוט (Western blot) ואימונופלואורסצנציה
נוגדן Anti-NeuNServicebioGB11138נוגדן ראשוני עבור אימונופלואורסצנציה
נוגדן Anti-phospho-CREBBeyotimeAF5785נוגדן ראשוני
נוגדן Anti-phospho-MLKLBiossbsm-54104Rנוגדן ראשוני
נוגדן Anti-phospho-RIPK1BiolynxBX60008נוגדן ראשוני
נוגדן Anti-phospho-RIPK3Abcamab195117נוגדן ראשוני
נוגדן Anti-RIPK1טכנולוגיית העברת אותים תאיים3493Sנוגדן ראשוני
נוגדן Anti-RIPK3Proteintech17563-1-APנוגדן ראשוני
Atractylodes macrocephala (Atractylodes macrocephala Koidz.; Bai Zhu)Beijing Tongrentang Co., Ltd., ז'נגז'ו, סין230801רכיב צמחי (10 גרם)
תוכנה למעקב התנהגותי אוטומטיPanlab (Harvard Apparatus)לא רלוונטיתוכנת מעקב וידאו SMART 3.0 עבור מבחני שדה פתוח ותליית זנב
ערכה לבדיקת חלבון BCACWBIOCW0014Sכימות חלבונים
מערכת להקלטה התנהגותיתPanlab (Harvard Apparatus)SMART V3.0מבחני שטח פתוח ותליית זנב
מערכת דימוי כימילומינצנציה של Bio-RadBio-Rad12003154מערכת הדמיה ChemiDoc MP לגילוי של western blot באמצעות כימילומנסינציה
ערכה לבדיקת חיוניות תאים בלומניסנציה CellTiter-Lumi IIBeyotimeC0056XLבדיקת חיות תאים
מיקרוסקופ קונפוקליNikon Eclipse C1לא רלוונטידימוי אימונופלואורסצנציה
DAPIServicebioG1012צביעת גרעין
תמיסת הסרת שעווה ידידותית לסביבהServicebioG1128הסרת פאראפין (Deparaffinization)
סרום עגל עוברי (FBS)ביו-אינפורמטיקה (Bioinformatics)C04001-500תוסף לתרבית תאים
Gardeniae Fructus (Gardenia jasminoides J. Ellis; Zhi Zi)Beijing Tongrentang Co., Ltd., ז'נגז'ו, סין22102109רכיב צמחי (12 גרם)
Glycyrrhizae Radix (Glycyrrhiza uralensis Fisch.; Gan Cao)Beijing Tongrentang Co., Ltd., ז'נגז'ו, סין230301מרכיב צמחי (3 גרם)
goat anti-mouse IgG מצומד ל-CY3ServicebioGB21301נוגדן משני פלואורסצנטי לעכבר נגד ATF4 (IF, CY3, 1:300)
goat anti-mouse IgG המשורשר ל-Alexa Fluor 488ServicebioGB25301נוגדן שני פלואורסצנטי לעכבר נגד MLKL (IF, Alexa Fluor 488, 1:400)
anti-rabbit IgG משעיר, מצומד ל-CY3ServicebioGB21303נוגדן משני פלואורסצנטי עבור rabbit anti-NeuN ‏(IF, CY3, 1:300)
goat anti-rabbit IgG המשורשר ל-Alexa Fluor 488ServicebioGB25303נוגדן שני פלואורסצנטי עבור נוגדן שפנפני נגד CREB ‏(IF, Alexa Fluor 488, 1:400)
HRP goat anti-rabbit IgGאבסיןabs20040נוגדן משני עבור Western blot
נוגדן עכבר אנטי-שרשרת קלה של IgG של ארנב המשוער ל-HRPABclonalAS061נוגדן משני עבור Western blot
TNF- אנושיαNovoproteinC008משרה נקרופטוזה
תאי HT-22ProcellCL-0697RRID: CVCL_0321
מצע גידול HyCloneCytiva (HyClone)SH30022.01מצע לתרבית תאים
ImageJNIHתוכנה חופשיתכימות פסים
מיקרוסקופ הפוךNikonEclipse Ti-SRמורפולוגיה של תאים
חנקן נוזליHenan Jilai New Energy Technology Co., Ltd.מכיוון שלא סופק טקסט מקור לתרגום, אנא ספק את התוכן באנגלית שברצונך לתרגם לעברית.שימור רקמות
קורא פלטות (microplate reader) של Molecular DevicesMolecular DevicesSpectraMax M5מדידת לומניסנציה
Moutan Cortex (Paeonia suffruticosa Andr.; Mu Danpi)Beijing Tongrentang Co., Ltd., ז'נגז'ו, סין22121714רכיב צמחי (12 גרם)
Necrostatin-1 (Nec-1)SelleckS8037מעכב RIPK1
פאראפורמאלדהידServicebioG1101-500MLקיבוע רקמות
פרוקסטין הידרוכלוריד המיהידרטअलादीןP129711ביקורת חיובית
PBSServicebioG4202-500MLבופר שטיפה
נענע (Mentha haplocalyx Briq.; Bo He)Beijing Tongrentang Co., Ltd., ז'נגז'ו, סין230101מרכיב צמחי (6 גרם)
פניצילין–סטרפטומייסיןGibco15140-122אנטיביוטיקה לתרבית תאים
Polygalae Radix (Polygala tenuifolia Willd.; Yuan Zhi)Beijing Tongrentang Co., Ltd., ז'נגז'ואו, סין20221101מרכיב צמחי (12 גרם)
ממברנת פוליבינילידן פלואוריד (PVDF)Merck MilliporeISEQ00010וואסטרן בלוט (Western blot)
פוריה (Wolfiporia cocos; Fu Ling)Beijing Tongrentang Co., Ltd., ז'נגז'ו, סיןD23070601מרכיב צמחי (15 גרם)
בופר ליזיס עבור בדיקת שיקוע חיסוני רדיואקטיבי (RIPA)CWBIO (Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd.)CW2333Sמיצוי חלבונים
Radix Bupleuri (Bupleurum chinense DC.; Chai Hu)Beijing Tongrentang Co., Ltd., ז'נגז'ו, סין230801רכיב צמחי (12 גרם)
ריאגנטים ל-SDS-PAGESolarbio; Servicebio; Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.לא רלוונטיאקרילאמיד, ביס-אקרילאמיד, Tris, SDS, APS ו-TEMED שהוכנו במעבדה
סודיום פנטובארביטלSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.69020181חומר הרדמה
מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (Ultra-high-performance liquid chromatography)Thermo Fisher Scientificמערכת Vanquish UHPLCניתוח LC-MS
עמודת UHPLC HSS-T3 (100 × 2.1 מ"מ, 1.8 μמ)Waters186003539הפרדה כרומטוגרפית
z-VAD-fmkTargetMolT6013מעכב פאן-קאספז (Pan-caspase inhibitor)

מקורות

  1. Zhang Y, et al. Natural volatile oils derived from herbal medicines: A promising therapy way for treating depressive disorder. Pharmacol Res. 2021;164:105376.
  2. O’Connor EA, et al. Depression and suicide risk screening: Updated evidence report and systematic review for the US Preventive Services Task Force. JAMA. 2023;329(23):2068-85.
  3. World Health Organization. The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization; Geneva; 2008.
  4. Pedrosa-Naudín MA, et al. Non-adherence to antidepressant treatment and related factors in a region of Spain: A population-based registry study. Pharmaceutics. 2022;14(12):2696.
  5. Huang Y, et al. Prevalence of mental disorders in China: A cross-sectional epidemiological study. Lancet Psychiatry. 2019;6(3):211-24.
  6. Thase ME. New medications for treatment-resistant depression: A brief review of recent developments. CNS Spectr. 2017;22(S1):39-48.
  7. Monteggia LM, Malenka RC, Deisseroth K. Depression: The best way forward. Nature. 2014;515(7526):200-1.
  8. Cao H, et al. Hippocampal proteomic analysis reveals activation of necroptosis and ferroptosis in a mouse model of chronic unpredictable mild stress-induced depression. Behav Brain Res. 2021;403:113261.
  9. Sun Y, et al. Dysmyelination by oligodendrocyte-specific ablation of Ninj2 contributes to depressive-like behaviors. Adv Sci (Weinh). 2022;9(3):e2103065.
  10. Zeb S, et al. Necroptotic kinases are involved in the reduction of depression-induced astrocytes and fluoxetine’s inhibitory effects on necroptotic kinases. Front Pharmacol. 2022;13:1060954.
  11. Duan YW, Chen SX, Li QY, Zang Y. Neuroimmune mechanisms underlying neuropathic pain: The potential role of the TNF-α-necroptosis pathway. Int J Mol Sci. 2022;23(13):7191.
  12. Frank D, Vince JE. Pyroptosis versus necroptosis: Similarities, differences, and crosstalk. Cell Death Differ. 2019;26(1):99-114.
  13. Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular mechanisms of necroptosis: An ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(10):700-14.
  14. Linkermann A, Green DR. Necroptosis. N Engl J Med. 2014;370(5):455-65.
  15. Sun L, et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012;148(1-2):213-27.
  16. Cai Z, et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 2014;16(1):55-65.
  17. Kaczmarek A, Vandenabeele P, Krysko DV. Necroptosis: The release of damage-associated molecular patterns and its physiological relevance. Immunity. 2013;38(2):209-23.
  18. Wallach D, Kang TB, Kovalenko A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: A historical perspective. Nat Rev Immunol. 2014;14(1):51-9.
  19. Yuan J, Amin P, Ofengeim D. Necroptosis and RIPK1-mediated neuroinflammation in CNS diseases. Nat Rev Neurosci. 2019;20(1):19-33.
  20. Mitroshina EV, Saviuk M, Vedunova MV. Necroptosis in CNS diseases: Focus on astrocytes. Front Aging Neurosci. 2022;14:1016053.
  21. Gong Q, et al. RIPK1 inhibition mitigates neuroinflammation and rescues depressive-like behaviors in a mouse model of LPS-induced depression. Cell Commun Signal. 2024;22(1):427.
  22. Kwon TG, et al. A review of antidepressant and anxiolytic effects of Soyo-san (Xiaoyao-san) and modified Soyo-san in animal models. Phytomedicine. 2024;135:155387.
  23. Jiao H, et al. Xiaoyaosan ameliorates CUMS-induced depressive-like and anorexia behaviors in mice via necroptosis-related cellular senescence in the hypothalamus. J Ethnopharmacol. 2024;318(Pt A):116938.
  24. Yan ZY, et al. Antidepressant mechanism of traditional Chinese medicine formula Xiaoyaosan in a CUMS-induced depressed mouse model via RIPK1-RIPK3-MLKL-mediated necroptosis based on network pharmacology analysis. Front Pharmacol. 2021;12:773562.
  25. Wu M, et al. Integration of network pharmacology and experimental verification to reveal the active components and molecular mechanism of modified Danzhi Xiaoyao San in the treatment of depression. J Ethnopharmacol. 2025;337:118739.
  26. Chen X, et al. Therapeutic effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder combined with intravenous human umbilical cord mesenchymal stem cells on post-stroke depression. Chin J Pathophysiol. 2019;35(12):2274-79.
  27. Zhang J. Clinical observation of Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets in the treatment of 30 cases of depression. New J Tradit Chin Med. 2008;40(11):48-49.
  28. Zhang J, Zhang B. Thirty-five patients with post-stroke depression were treated with Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets. New J Tradit Chin Med. 2006;38(3):75-76.
  29. Su P, et al. Modified Xiaoyao San reverses lipopolysaccharide-induced depression-like behavior through suppressing microglial M1 polarization by enhancing autophagy via the PI3K/AKT/mTOR pathway in mice. J Ethnopharmacol. 2023;308:116659.
  30. Guo X, et al. Effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder on mineralocorticoid receptor and glucocorticoid receptor in the hippocampus of depression model rats. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 2014;20(11):119-22.
  31. Wang B, et al. Modified Danzhi Xiaoyaosan inhibits neuroinflammation by regulating the TRIM31/NLRP3 inflammasome in chronic unpredictable mild stress-induced depression. Exp Gerontol. 2024;187:112451.
  32. Wang M, et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nat Biotechnol. 2016;34(8):828-37.
  33. Sawada Y, et al. RIKEN tandem mass spectral database (ReSpect) for phytochemicals: A plant-specific MS/MS-based data resource and database. Phytochemistry. 2012;82:38-45.
  34. Horai H, et al. MassBank: A public repository for sharing mass spectral data for life sciences. J Mass Spectrom. 2010;45(7):703-14.
  35. Wang M, et al. Targeting programmed cell death in inflammatory bowel disease through natural products: New insights from molecular mechanisms to targeted therapies. Phytother Res. 2024;38:4587-611.
  36. Huang X, et al. Shikonin overcomes drug resistance and induces necroptosis by regulating the miR-92a-1-5p/MLKL axis in chronic myeloid leukemia. Aging (Albany NY). 2020;12(17):17662-80.
  37. Yuan J, Najafov A, Py BF. Roles of caspases in necrotic cell death. Cell. 2016;167(7):1693-704.
  38. Mu R, et al. Activation of TGR5 ameliorates streptozotocin-induced cognitive impairment by modulating apoptosis, neurogenesis, and neuronal firing. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:3716609.
  39. Gardner CR, et al. From (tool)bench to bedside: The potential of necroptosis inhibitors. J Med Chem. 2023;66(4):2361-85.
  40. Degterev A ,et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat Chem Biol. 2005;1(2):112-19.
  41. Cao L, Mu W. Necrostatin-1 and necroptosis inhibition: Pathophysiology and therapeutic implications. Pharmacol Res. 2021;163:105297.
  42. Vissers M, et al. Safety, pharmacokinetics and target engagement of the novel RIPK1 inhibitor SAR443060 (DNL747) for neurodegenerative disorders: Randomized, placebo-controlled, double-blind phase I/Ib studies in healthy subjects and patients. Clin Transl Sci. 2022;15(8):2010-23.
  43. Mo K, et al. Targeting HNRNPC suppresses thyroid follicular epithelial cell apoptosis and necroptosis through m6A-modified ATF4 in autoimmune thyroid disease. Pharmacol Res. 2023;195:106933.
  44. Liu J, et al. Brain-derived neurotrophic factor elevates activating transcription factor 4 (ATF4) in neurons and promotes ATF4-dependent induction of SESN2. Front Mol Neurosci. 2018;11:62.
  45. Tang H, Kang R, Liu J, Tang D. ATF4 in cellular stress, ferroptosis, and cancer. Arch Toxicol. 2024;98(4):1025-41.
  46. Pang BPS, et al. Deficiency of muscle-generated brain-derived neurotrophic factor causes inflammatory myopathy through reactive oxygen species-mediated necroptosis and pyroptosis. Redox Biol. 2024;74:103418.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל עכברים לדיכאוןסטרס כרוני בלתי צפויהערכה התנהגותיתWestern Blottingאנליזת אימונופלואורסצנציהפגיעה ברקמת מוחפוספורילציה של RIPK3UHPLC-HRMS
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.