הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

רוסקוגנין מעכב את התקדמות קרצינומה נזופרינגיאלית על ידי דה-רגולציה של KDM1A להשראה משותפת של פרופטוזיס ואפופטוזיס

60 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72523

⸱

3 בספטמבר 2026

1School of Stomatology and Optometry, Hubei University of Science and Technology

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה נועד להעריך את היעילות האנטי-גידולית של ruscogenin בתאי קרצינומה של נזון-לוע (nasopharyngeal carcinoma). הוא מפרט מתודולוגיות מקיפות – הכוללות בדיקות חיוניות, נדידה, אפופטוזיס ופרופטוזיס – כדי להסביר באופן שיטתי כיצד תרכובת זו משרה מוות תאי כפול על ידי מיקוד ודיכוי של KDM1A.

תקציר

קרצינומה של נזון-לוע (NPC) היא גידול ממאיר אגרסיבי ביותר. התרכובת הטבעית ruscogenin (Rus) מראה פוטנציאל אנטי-סרטני. מחקר זה שופך אור על מנגנון הפעולה הספציפי בקרצינומה של נזון-לוע (NPC) על ידי חקירת השפעותיה על תאי NPC והמסלול המולקולרי העומד בבסיסן. קו התאים של קרצינומה של נזון-לוע אנושית (NPC), C666-1, טופל בריכוזים שונים של Rus. סדרה של בדיקות in vitro בוצעו כדי להעריך את חיות התאים, השגשוג, הנדידה, הפלישה, האפופטוזיס והפרופטוזיס. תפקידו של lysine-specific demethylase 1A (KDM1A) נחקר באמצעות Western blot ודוקינג מולקולרי, ותפקידו המתווך תוקף באמצעות ניסויי הצלה של ביטוי יתר. Ruscogenin הפחית באופן תלוי-מינון את היכולות השגשוגיות, הקלונוגניות, הנדידה והפלישה של תאי C666-1. מבחינה מכניסטית, טיפול ב-Rus עורר הן אפופטוזיס, כפי שהוכח על ידי הפעלת executioner caspase-3 ומעבר לעבר סיגנלינג פרו-אפופטוטי באמצעות מאזן ה-Bax/Bcl-2, והן פרופטוזיס, שאופיין על ידי עלייה בפרוקסידציה של ליפידים וברמת הברזל התוך-תאית. השפעות אנטי-גידוליות אלו נמצאו במתאם חזק עם דה-רגולציה (downregulation) של KDM1A. באופן מכריע, ביטוי יתר מאולץ של KDM1A החליש באופן משמעותי את האפופטוזיס והפרופטוזיס המושרים על ידי Rus, והביא לביטול של דיכוי הפנוטיפים הממאירים, מה שמאשר את תפקידו המתווך הקריטי של KDM1A. Ruscogenin מעכב את ההתקדמות הממאירה של קרצינומה של נזון-לוע על ידי דה-רגולציה של KDM1A, ובכך מקדם אפופטוזיס ופרופטוזיס. ממצאים אלו מזהים את ציר ה-Rus-KDM1A כמטרה טיפולית מבטיחה לטיפול ב-NPC.

מבוא

סרטן הנזופרינקס (NPC) הוא סוג של סרטן הנגרם משילוב של גורמים גנטיים וסביבתיים1. למרות שהקרנורדיותרפיה הביאה להתקדמות ניכרת בטיפול, שיעור ההישרדות הכולל של חולי NPC נותר לא מספק. הדבר נובע ככל הנראה מכך שתאי NPC יכולים להתרבות במהירות ונוטים מאוד לגרור לקשרי לימפה אזוריים ולאיברים מרוחקים2. לכן, חיוני לחקור את המנגנונים המולקולריים המקדמים את התקדמות ה-NPC. לאחרונה נמצא כי פרופטוזיס (ferroptosis), מודם חדש של מוות תאי המהווה תהליך תלוי-ברזל המהווג על ידי Fe2⁺ ופרוקסידי ליפידים, מעורב באופן קריטי ב-NPC3. הראיות הקיימות הדגימו כי פרופטוזיס ממלא תפקיד חשוב ב-NPC, והשראתו עשויה לשפר את הטיפול בהקרנה בסרטן4,5.

בשל הרעילות המינימלית ותופעות הלוואי המועטות, פורמולות של צמחי מרפא סיניים משמשות באופן נרחב לטיפול בסרטן מזה אלפי שנים6,7. כסוג של תרופה רב-מרכיבית, רב-מטרית ובעלת אפקט סינרגי, מרשמים של רפואה סינית מסורתית (TCM) שימשו כטיפול משלים יעיל במניעה ובטיפול בסרטן, כולל NPC8,9,10. דווח כי Radix ophiopogonis (RO), השורש של הצמח הרב-שנתי Ophiopogon japonicus, מקל ביעילות על NPC כטיפול עזר11,12. דווח כי Ruscogenin (Rus), המרכיב העיקרי ב-RO, בעל השפעות אנטי-סרטניות חזקות13. במודלים של עכברים לסרטן המעי הגס והחלחולת, Rus יכול לשפר פגיעות בצומת המהדק (tight junction) ולעכב נדידת גידולים14. חשוב לציין כי Rus יכול גם להפחית את חיוניותם של תאי סרטן הלבלב על ידי השראת פרופטוזיס (ferroptosis). עם זאת, השפעתו של Rus על NPC עדיין אינה ברורה.

אפיגנטיקה היא תחום המחקר המרכזי של פתוגנזה של סרטן ומספקת טיפולים יעילים מרובים15. כמידת אפיגנטית נחקרת היטב, מתילציה של היסטונים מעורבת בהתפתחות סרטן ומהווה גם מטרה חשובה לתכנון תרופות16. ויסות דינמי של מתילציית היסטונים מתווך על ידי מתילטרנספראזים ודמתילאזים17. KDM1A הוא דמתילאז של ליזין בהיסטונים שנמצא כמעורב באופן קריטי בקרצינוגנזה בשל מעורבותו בוויסות אפיגנטי18. בנוסף, KDM1A נמצא כחלבון אונקוגני עם ביטוי גבוה בסוגי סרטן מרובים, כגון סרטן ריאה וסרטן הלבלב19. Guo וחב' דיווחו כי עלייה ב-KDM1A עשויה לדכא את הביטוי של phosphatase and tensin homolog (PTEN) ולהגביר את השגשוג והנדידה של תאי NPC תוך עיכוב אפופטוזיס20. במקביל, נמצא כי ויסות חיובי של KDM1A עשוי לדכא פרופטוזיס בסרטן ריאה21. ניתוח של מאגר הנתונים Super-PRED הצביע על כך ש-KDM1A הוא מטרה פוטנציאלית של Rus.

למרות הפוטנציאל האנטי-גידולי המוכר של Rus בסוגי סרטן אחרים, תפקידו הספציפי והמנגנונים המולקולריים שלו בקרצינומה של נספת ובלבוע (nasopharyngeal carcinoma) נותרו ללא ביסוס מלא, דבר המהווה פער מחקרי משמעותי. יתרה מכך, בעוד שדיווחים קודמים קישרו בנפרד את KDM1A לשגשוג גידולים ולעמידות לפרופטוזיס (ferroptosis), אף מחקר טרם בחן אם Targeting של KDM1A יכול להפעיל בו-זמנית מסלולי מוות תאיים מרובים ב-NPC. לפיכך, מחקר זה מספק רציונל חזק להשערה כי Rus עשוי לדכא את ההתקדמות הממאירה של תאי NPC על ידי דיוון (downregulating) ישיר של KDM1A.

מחקר זה נועד לגשר על פער זה באמצעות הערכה שיטתית של השפעת Rus על השגשוג, הנדידה והפלישה של תאי NPC. החידוש העיקרי של מחקר זה טמון בחשיפת אסטרטגיה של מנגנון כפול. הדגש הושם על יכולתו של Rus להשרות בו-זמנית הן אפופטוזיס קלאסי והן פרופטוזיס תלוי-ברזל. באמצעות תיקוף ציר הסיגנלינג החדש Rus-KDM1A, מחקר זה מקדם משמעותית את הידע הנוכחי בכך שהוא מדגים כיצד תרכובת טבעית אחת יכולה להתגבר על עמידות גידולים באמצעות חסימה סימולטנית של מספר מסלולים, ובכך מספק רציונל פרה-קליני מבטיח לטיפול ממוקד ב-NPC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תרבית תאים, טיפול וטרנספקציה

שורת תאי קרצינומה של הנזופרינקס (NPC) אנושית, C666-1 (RRID: CVCL_M597), ושורת תאי אפיתל של נזופרינקס אנושי שאינם ממאירים, NP69 (RRID: CVCL_F755), נרכשו מספק מסחרי. שתי שורות התאים אומתו באמצעות פרופיל Short Tandem Repeat (STR) ואושרו כנקיות מזיהום mycoplasma לפני השימוש. לתרבית שגרה, תאי C666-1 הורבו במצע RPMI 1640 מועשר ב-10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומייצין. תאי NP69 תורבתו במצע נטול סרום לקראטינוציטים מועשר ב-10% FBS, ‏10 ng/mL פקטור גדילה אפידרמלי רקומביננטי, ו-1% פניצילין-סטרפטומייצין. Ruscogenin ‏(Rus; טוהר ≥ 98%) נרכש מספק מסחרי. שתי שורות התאים נשמרו באינקובטור לח ב-37 °C תחת 5% CO₂. לצורך טיפולים, תאים נחשפו ל-Ruscogenin (Rus) בריכוזים שונים (10, 20, 50 µM) למשך 24 h22. לצורך טרנספקציה, פלסמידים המקודדים ל-lysine-specific demethylase 1A לביטוי יתר (oe-KDM1A) ווקטור ריק תואם כביקורת שלילית (oe-NC), שהושגו מספק מסחרי, הוטרנספקטו לתוך תאי C666-1 כאשר צפיפות התאים הגיעה ל-70–80%. באופן ספציפי, 2.5 µg של DNA פלסמידי ו-5 µL של ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים דוללו כל אחד ב-150 µL של מצע עם סרום מופחת, ערבבו בעדינות, דגרו למשך 20 min בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוספו לכל באר בלוח של 6 בארות בהתאם לפרוטוקול היצרן. תאים דגרו למשך 48 h ב-37 °C, ויעילות הטרנספקציה אומתה לאחר מכן.

בדיקת Cell counting kit-8 (CCK-8)

חיוניות התאים לאחר טיפול ב-Rus נמדדה באמצעות בדיקת CCK-8. לצורך הליך זה, התאים נזרעו תחילה בלוחות 96 בארות ותורבדו למשך לילה. הבדיקה הופעלה על ידי הוספת 10 µL של תמיסת CCK-8, ולאחר 2 h של אינקובציה, נמדד השינוי הצבעי שהתקבל כצפיפות אופטית (OD) ב-450 nm באמצעות קורא לוחות.

בדיקת יצירת מושבות

כדי להעריך הישרדות קלונוגנית, זרעו תאי C666-1 לתוך פלטות בעלות 6 בארות וגודלו במשך 14 ימים. לאחר תקופת האינקובציה, קבעו את המושבות שהתקבלו באמצעות 100% methanol למשך 10 min, ולאחר מכן הדגשו אותן באמצעות 0.5% crystal violet למשך 30 min. מספר המושבות הצבועות כומת לאחר מכן באמצעות דימוי מיקרוסקופי וספירה.

וסטרן בלוט (Western blot)

לצורך ניתוח Western blot, תחילה הופק חלבון כולל מהתאים באמצעות באפר RIPA, והליזטים שהתקבלו סובבו בצנטריפוגה (12,000 × g) לאיסוף הסופרנאטנט. לצורך כימות רמות החלבון נעשה שימוש בבדיקת BCA. כמויות שוות של חלבון כולל (30 µg לכל נתיב) הועמסו והופרדו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמידים עם סודיום דודציל סולפט (SDS-PAGE) בריכוז של 10%. לאחר ההפרדה, החלבונים הועברו לממברנות פוליבינילידן פלואוריד (PVDF) במתח קבוע של 100 V למשך 90 דקות על קרח. לאחר מכן, הממברנות נחסמו ב-5% אלבומין מסרום בקר (BSA) שהוכן ב-tris-buffered saline עם 0.1% Tween 20 (TBST) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הממברנות דגרו למשך לילה ב-4°C עם הנוגדנים הראשוניים הבאים, המדוללים בבאפר חסימה (כולם ביחס של 1:1000): Ki67, PCNA, MMP2, MMP9, Bcl-2, Bax, KDM1A, SLC7A11, GPX4, ACSL4, TFR1, ו-β-actin. לבסוף, לאחר דגירה של שעתיים עם נוגדנים שניוניים מצומדים ל-HRP, הפסים האימונוריאקטיביים הודגמו באמצעות ריאגנט גילוי של כימילומנסינציה מוגברת (ECL), וניתוח דנסיטומטרי בוצע באמצעות תוכנה לניתוח תמונות.

בדיקת שריטת פצע (Wound scratch assay)

עבור בדיקת ריפוי פצעים, תאי C666-1 גודלו עד להגעה ל-80% התמסחות (confluency) בצלחות 6 בארות. פצע אחיד נוצר בשכבת התאים (monolayer) על ידי גירוד באמצעות טיפ של פיפטה בנפח 200 µL. תאים שהסתרו הוסרו באמצעות שטיפה ב-PBS, ולאחר מכן הוחלף מצע הגידול במצע נטול סרום להדגרה של 24 h. תמונות של אזור הפצע צולמו ב-0 h וב-24 h באמצעות מיקרוסקופ אור כדי להעריך את נדידת התאים.

בדיקת Transwell

פלישת תאים הוערכה באמצעות תאי transwell (גודל נקבים 8-µm) ששולטו מראש ב-50 µL של basement membrane matrix. כושר הפלישה של תאי C666-1 נבדק באמצעות תאי Transwell. התאים זרעו בתוך ההכנסות העליונות כשהם תלויים במצע ללא סרום, בעוד שהבארות התחתונות הכילו DMEM עם 10% FBS. לאחר דגירה של 24-h, תאים שנותרו בצד האפיקלי של הממברנה הוסרו בזהירות. לצורך כימות, התאים על המשטח הבסולטרלי קובעו במתנול, נצבעו ב-0.1% crystal violet, ונספרו מתוך תמונות שצולמו במיקרוסקופ אור.

ציטומטריה של זרימה

כמות האפופטוזיס נקבעה באמצעות ציטומטריית זרימה. להכנת הדגימות, תאי C666-1 נאספו, נשטפו ב-PBS קר מאוד, ולאחר מכן הושעו מחדש ב-100 µL של תמיסת קישור (binding buffer). לאחר מכן, התאים נצבעו באופן משולב ב-Annexin-V-FITC (בריכוז 20 µg/mL) ובפרופידיום יודיד (PI). צביעה זו בוצעה במשך 15 min על קרח, תוך הגנה מאור. הנתונים נרכשו באופן מיידי בציטומטר זרימה כדי לקבוע את אחוז התאים האפופטוטיים.

זיהוי פעילות של caspase-3

פעילות Caspase-3 נמדדה באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, תאי C666-1 עברו ליזיס, והעלונות נאספו לאחר סבוב בצנטריפוגה במהירות של 14,000 × g. לאחר אינקובציה של 2 שעות עם הרכיב המסופק, נמדדה הבליעה (absorbance) של כל עלונות באורך גל של 405 nm.

RT-qPCR

RNA כולל טוהה מתאי C666-1 באמצעות ריאגנט מסחרי להפקת RNA. ה-RNA שהתקבל עבר שעתוק הפוך ל-cDNA של הגדיל הראשון באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן. ניתוח ביטוי גנים בוצע לאחר מכן באמצעות qPCR (quantitative PCR) במערכת PCR בזמן אמת עם תערובת מאסטר (master mix) המבוססת על SYBR Green. שיטת ה-Ct ההשוואתית (2⁻△△Ct) שימשה לקביעת רמות השחול (transcript) היחסיות. רצפי הפריימרים ששימשו להגברה היו: β-actin (Forward: 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'; Reverse: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3') ו-KDM1A (Forward: 5'-TGACCGGATGACTTCTCAAGA-3'; Reverse: 5'-GTTGGAGAGTAGCCTC AAATGTC-3').

בדיקת חומרים מגיבים לחומצה תיוברביטורית (TBARS)

למדידת פריקסדציה של ליפידים, הוכנו תחילה על-נוזלים מתאי C666-1 באמצעות שיקוע (15% TCA, 500 mM BHA) וסבוב בצנטריפוגה למשך 10 min במהירות של 10,000 × g. לאחר מכן, העל-נוזלים הגיבו עם 0.375% חומצה תיאו-ברביטורית, וחוממו ב-100 °C למשך 10 min כדי ליצור את תוצר ה-MDA-TBA. רמת תוצר זה, המעידה על פריקסדציה של ליפידים, נקבעה על ידי מדידת הבליעה ב-532 nm באמצעות קורא מיקרו-פלטות23.

זיהוי רדיקלים חופשיים של חמצן (ROS) ליפידים

פריאוקסידציה של ליפידים זוהתה באמצעות גשש פלואורסצנטי לפריאוקסידציה של ליפידים. תאי C666-1 נזרעו בלוחות בעלי 6 בארות, תורבדו למשך לילה, ולאחר מכן נחשפו לגשש הפלואורסצנטי (2 µM). גשש זה מראה הסטה של הפלואורסצנציה מאדום לירוק עם חמצון. יחס הפלואורסצנציה ירוק/אדום נותח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקת לייזר ותוכנה לניתוח תמונות. יחס הפלואורסצנציה ירוק/אדום שהופק שימש כסמן כמותי מוגדר לרמות הפריאוקסידציה של הליפידים24.

זיהוי של Fe2+

את רמת הברזל הפרוס (Fe2⁺) התוך-תאי מדדו באמצעות גשש פלואורסצנטי לברזל תוך-תאי. תאי C666-1 דגרו עם 10 µM מהגשש הפלואורסצנטי למשך 10 min. לאחר שטיפה עם PBS להסרת עודפי הגשש, התאים נותחו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

ניתוח עגינה מולקולרית (Molecular docking)

עגינה מולקולרית (Molecular docking) היא שיטה חישובית מרכזית המאפשרת תכנון של תרופות חדשות על ידי חיזוי זיקת הקשירה והאינטראקציה בין ליגנד לבין חלבון המטרה שלו, באמצעות הערכה של מצבי הקשירה שלהם25. מהדף של RCSB PDB (https://www.rcsb.org/), הושג המבנה התלת-ממדי של KDM1A (PDB ID: 6NQU). להכנת מבנה חלבון ה-KDM1A, הוסרו מולקולות מים וליגנדים קטנים שאינם רלוונטיים. סימולציית העגינה המולקולרית בוצעה באמצעות תוכנה לעגינה מולקולרית תוך שימוש ב-Lamarckian Genetic Algorithm, והויזואליזציה בוצעה באמצעות תוכנה לוויזואליזציה מולקולרית26.

ניתוח סטטיסטי

כל הניסויים בוצעו באמצעות שלושה חזרות ביולוגיות בלתי תלויות לפחות, והתוצאות מוצגות כממוצע ± סטיית תקן (SD). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי. הבדלים בין קבוצות מרובות הוערכו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA), ולאחריו מבחן פוסט-הוק להשוואות מרובות של Tukey. ערך P נמוך מ-0.05 נחשב כמצביע על הבדל מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Ruscogenin מעכב באופן סלקטיבי את החיות והשגשוג של תאי קרצינומה של נזון-לוע

המחקר בחן תחילה את השפעת ruscogenin (Rus) על חיוניותם של תאי אפיתל נורמליים של נזפרינקס (NP69) ותאי קרצינומה של נזפרינקס (NPC) (C666-1). כפי שנקבע באמצעות בדיקת CCK-8, טיפול ב-Rus בריכוזים של 10, 20 ו-50 µM לא הראה רעילות משמעותית כלפי תאי NP69 נורמליים. לעומת זאת, Ruscogenin (Rus) פגע באופן משמעותי בהישרדותם של תאי הסרטן C666-1 באופן התלוי הן בריכוז והן בזמן האינקובציה. הפעילות הציטוטוקסית הבולטת ביותר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קרצינומה נזופרינגיאלית (NPC) היא גידול ממאיר חמור המאופיין בשכיחות גבוהה של גרורות, מה שמסביר מדוע נדרשות התערבויות יעילות יותר באופן דחוף27. כאן מוצג כי ל-Ruscogenin (Rus), תוצר טבעי המופק כנגזרת של Radix ophiopogonis, השפעות אנטי-גידוליות חזקות על תאי NPC. כמו כן, ניתן להסיק כי Rus מונע את התקדמות ה-NPC על ידי דיכוי ההיסטון-דמתילאז KDM1A, אשר באופן עקיב מקדם שני סוגים שונים של מוות תאי מתוכנן, דהיינו, אפופטוזיס ופרופטוזיס. מאמר זה מפרט ציר סיגנלינג לא ידוע עד כה של Rus-KDM1A ב-NPC, כולל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים. המחברים מצהירים כי לא נעשה שימוש בכלי בינה מלאכותית גנרטיבית בתכנון המחקר, באיסוף הנתונים, בניתוח הנתונים או ביצירת האיורים. טכנולוגיות מסייעות מבוססות בינה מלאכותית שימשו אך ורק לעריכה לשונית קלה ולתיקון דקדוקי במהלך כתיבת כתב יד זה. המחברים נושאים באחריות מלאה לתוכן ולשלמות העבודה שפורסמה.

תודות

לא רלוונטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת 7500 Fast Real-Time PCRApplied Biosystems4351106ניתוח RT-qPCR
ערכה לבדיקת אפופטוזיס Annexin-V-FITC/PIBD Biosciences556547זיהוי אפופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה
נוגדן אנטי-ACSL4Abcamab155282נוגדן ראשוני עבור Western blot
נוגדן אנטי-BaxCell Signaling Technology (CST)5023נוגדן ראשוני עבור Western blot
נוגדן Anti-Bcl-2Cell Signaling Technology (CST)15071נוגדן ראשוני עבור Western blot
נוגדנים
נוגדן Anti-GPX4Abcamab125066נוגדן ראשוני עבור Western blot
נוגדן Anti-KDM1A (LSD1)Cell Signaling Technology (CST)2139נוגדן ראשוני עבור Western blot
נוגדן Anti-Ki67Abcamab16667נוגדן ראשוני עבור Western blot
נוגדן Anti-MMP2Abcamab92536נוגדן ראשוני עבור Western blot
נוגדן Anti-MMP9Abcamab76003נוגדן ראשוני עבור Western blot
נוגדן Anti-PCNACell Signaling Technology (CST)13110נוגדן ראשוני עבור Western blot
Anti-rabbit IgG, מקושר ל-HRPCell Signaling Technology (CST)7074נוגדן משני
נוגדן Anti-SLC7A11 (xCT)Abcamab175186נוגדן ראשוני עבור Western blot
נוגדן Anti-TFR1Abcamab84036נוגדן ראשוני עבור Western blot
אנטי-βנוגדן ל-actinCell Signaling Technology (CST)4970נוגדן ראשוני לבקרת טעינה
ערכות בדיקה
Autodock 4.2Scripps Research Instituteלא רלוונטיסימולציית עגינה מולקולרית
ערכה לבדיקת חלבון BCABeyotime BiotechnologyP0012כימות חלבונים
גשושית BODIPY 581/591 C11Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)D3861גילוי ROS ליפידיים (2 μM)
קו התאים C666-1iCell Bioscience Inc.iCell-h378שבט תאי קרצינומה של נזון-לוע אנושי
ערכה לבדיקת פעילות Caspase-3Beyotime BiotechnologyC1115הערכת אפופטוזיס
ערכה לבדיקת CCK-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04מדידת חיוניות תאים
כימיקלים & ריאגנטים
ציטומטר זרימה CytoFLEXBeckman CoulterCytoFLEXניתוח אפופטוזיס
ריאגנט גילוי ECLMilliporeSigmaWBKLS0500ויזואליזציה של Western blot (Immobilon)
ציוד
סרום עוברי בקר (FBS)Gibco (Thermo Fisher Scientific)10099141תוסף לתרבית תאים
GraphPad Prism 8.0תוכנת GraphPadלא רלוונטיניתוח סטטיסטי והצגת נתונים גרפית
תוכנת ImageJNIHלא רלוונטיניתוח דנסיטומטריה של תמונות
מצע לקרטינוציטים נטול סרוםiCell Bioscience Inc.iCell-019עבור תרבית תאי NP69
מיקרוסקופ קונפוקאלי סורק לייזרCarl ZeissLSM 880דימוי פלואורסצנציה באמצעות BODIPY C11
מיקרוסקופ אור / פלואורסצנציהOlympusIX73בדיקת שריטה (Wound scratch), Transwell & דימות Fe2+
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche Diagnostics4887352001PCR כמותי בזמן אמת
ריאגנט Lipofectamine 2000Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)11668019ריאגנט לטרנספקציית תאים
MatrigelCorning356234מטריצת קרום בסיס לבדיקת פלישה
קורא מיקרופלטהMolecular DevicesSpectraMax M5מדידת בליעה (405, 450, 532 נ"מ)
קו התאים NP69iCell Bioscience Inc.iCell-h431קו תאי אפיתל נריים נחירים אנושיים נורמליים
oe-KDM1A & פלסמידי oe-NCShanghai GenePharma Co., Ltd.סינתזה בהתאמה אישיתפלסמידים לביטוי יתר של KDM1A
גשושית Phen Green SK (PGSK)Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)P14312זיהוי Fe2+ תוך-תאי (10 μM)
Pymol 3.0שריבöדינגרלא רלוונטיויזואליזציה של עגינה מולקולרית
ערכה לשעתוק הפוךRoche Diagnostics4379012001ערכה לסנתזת cDNA של הגדיל הראשון Transcriptor
בופר ליזיס RIPASolarbio (בייג'ינג, סין)R0010מיצוי חלבון כולל
תוכית RPMI 1640iCell Bioscience Inc.iCell-0002עבור תרבית תאי C666-1
רוסקוגנין (Rus)MedChemExpress (MCE)HY-N0193טיפול תרופתי, טוהר ≥ 98%
תוכנה
ערכה לבדיקת TBARSCayman Chemical10009055מדידת פירוקסידציה של ליפידים
ריאגנט TRizolInvitrogen (Thermo Fisher Scientific)*15596026מיצוי RNA כולל

מקורות

  1. Zhou R, Qiu L, Zhou L, Geng R, Yang S, Wu J. P4HA1 activates HMGCS1 to promote nasopharyngeal carcinoma ferroptosis resistance and progression. Cell Signal. 2023;105:110609.
  2. Cao JY, Liu L, Chen SP, Zhang X, Mi YJ, Liu ZG, et al. Prognostic significance and therapeutic implications of centromere protein F expression in human nasopharyngeal carcinoma. Mol Cancer. 2010;9:237.
  3. Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012;149(5):1060-72.
  4. Liu S, Zhang HL, Li J, Ye ZP, Du T, Li LC, et al. Tubastatin A potently inhibits GPX4 activity to potentiate cancer radiotherapy through boosting ferroptosis. Redox Biol. 2023;62:102677.
  5. Amos A, Jiang N, Zong D, Gu J, Zhou J, Yin L, et al. Depletion of SOD2 enhances nasopharyngeal carcinoma cell radiosensitivity via ferroptosis induction modulated by DHODH inhibition. BMC Cancer. 2023;23(1):117.
  6. Jiang H, Li M, Du K, Ma C, Cheng Y, Wang S, et al. Traditional Chinese medicine for adjuvant treatment of breast cancer: Taohong Siwu decoction. Chin Med. 2021;16(1):129.
  7. Shang L, Wang Y, Li J, Zhou F, Xiao K, Liu Y, et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 2023;302(Pt A):115876.
  8. Yang CH, Tung KL, Wu YT, Liu C, Lin SC, Yang CC, et al. Qing Yan Li Ge Tang, a Chinese herbal formula, induces autophagic cell death through the PI3K/Akt/mTOR pathway in nasopharyngeal carcinoma cells in vitro. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:9925684.
  9. Ren T, Bai XY, Yang MZ, Xu N, Guo XZ, Qin LJ, et al. Gambogic acid suppresses nasopharyngeal carcinoma via rewiring the molecular network of cancer malignancy and immunosurveillance. Biomed Pharmacother. 2022;150:113012.
  10. Zhou T, Zhao S, Tang S, Wang Y, Wu R, Zeng X, et al. Guggulsterone promotes nasopharyngeal carcinoma cells' exosomal Circfip1L1 to mediate miR-125a-5p/VEGFA, affecting tumor angiogenesis. Curr Mol Pharmacol. 2023;16(8):870-80.
  11. Feng X, Shi H, Chao X, Zhao F, Song L, Wei M, et al. Deciphering the pharmacological mechanism of the herb Radix Ophiopogonis in the treatment of nasopharyngeal carcinoma by integrating iTRAQ-coupled 2-D LC-MS/MS analysis and network investigation. Front Pharmacol. 2019;10:253.
  12. Kim W, Lee WB, Lee J, Min BI, Lee H, Cho SH. Traditional herbal medicine as adjunctive therapy for nasopharyngeal cancer: a systematic review and meta-analysis. Integr Cancer Ther. 2015;14(3):212-20.
  13. Zhao J, He B, Seshadri VD, Xu S. Anticancer effect of ruscogenin in B(a)P-induced lung cancer in mice via modulation of proinflammatory cytokines and mitochondrial enzymes. Appl Biochem Biotechnol. 2022;194(12):5862-77.
  14. Rabitha R, Shivani S, Showket Y, Sudhandiran G. Ferroptosis regulates key signaling pathways in gastrointestinal tumors: underlying mechanisms and therapeutic strategies. World J Gastroenterol. 2023;29(16):2433-51.
  15. Feinberg AP, Koldobskiy MA, Göndör A. Epigenetic modulators, modifiers and mediators in cancer etiology and progression. Nat Rev Genet. 2016;17(5):284-99.
  16. Song Y, Wu F, Wu J. Targeting histone methylation for cancer therapy: enzymes, inhibitors, biological activity and perspectives. J Hematol Oncol. 2016;9(1):49.
  17. Zhang W, Ruan X, Li Y, Zhi J, Hu L, Hou X, et al. KDM1A promotes thyroid cancer progression and maintains stemness through the Wnt/β-catenin signaling pathway. Theranostics. 2022;12(4):1500-17.
  18. Ismail T, Lee HK, Kim C, Kwon T, Park TJ, Lee HS. KDM1A microenvironment, its oncogenic potential, and therapeutic significance. Epigenetics Chromatin. 2018;11(1):33.
  19. Hou X, Li Q, Yang L, Yang Z, He J, Li Q, et al. KDM1A and KDM3A promote tumor growth by upregulating cell cycle-associated genes in pancreatic cancer. Exp Biol Med (Maywood). 2021;246(17):1869-83.
  20. Guo D, Liu F, Zhang L, Bian N, Liu L, Kong L, et al. Long non-coding RNA AWPPH enhances malignant phenotypes in nasopharyngeal carcinoma via silencing PTEN through interacting with LSD1 and EZH2. Biochem Cell Biol. 2021;99(2):195-202.
  21. Lu C, Cai Y, Liu W, Peng B, Liang Q, Yan Y, et al. Aberrant expression of KDM1A inhibits ferroptosis of lung cancer cells through up-regulating c-Myc. Sci Rep. 2022;12(1):19168.
  22. Hua H, Zhu Y, Song YH. Ruscogenin suppressed the hepatocellular carcinoma metastasis via PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. Biomed Pharmacother. 2018;101:115-22.
  23. Sun Q, Zhen P, Li D, Liu X, Ding X, Liu H. Amentoflavone promotes ferroptosis by regulating reactive oxygen species (ROS) /5'AMP-activated protein kinase (AMPK)/mammalian target of rapamycin (mTOR) to inhibit the malignant progression of endometrial carcinoma cells. Bioengineered. 2022;13(5):13269-79.
  24. Carlsen CU, Kurtmann L, Brüggemann DA, Hoff S, Risbo J, Skibsted LH. Investigation of oxidation in freeze-dried membranes using the fluorescent probe C11-BODIPY(581/591). Cryobiology. 2009;58(3):262-7.
  25. Liu J, Yuan S, Yao Y, Wang J, Scalabrino G, Jiang S, et al. Network pharmacology and molecular docking elucidate the underlying pharmacological mechanisms of Houttuynia cordata in treating SARS-CoV-2 pneumonia. Viruses. 2022;14(7).
  26. Zhu W, Li Y, Zhao J, Wang Y, Li Y, Wang Y. The mechanism of triptolide in the treatment of connective tissue disease-related interstitial lung disease based on network pharmacology and molecular docking. Ann Med. 2022;54(1):541-52.
  27. Lee AWM, Ng WT, Chan JYW, Corry J, Mäkitie A, Mendenhall WM, et al. Management of locally recurrent nasopharyngeal carcinoma. Cancer Treat Rev. 2019;79:101890.
  28. Li BH, Ma H, Zhu J, Chen J, Dai YQ, Zhang XJ, et al. Semisynthesis and anti-cancer properties of novel honokiol derivatives in human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells. J Enzyme Inhib Med Chem. 2023;38(1):2244694.
  29. Qiao H, Zhang W, Liu P, Zhu R, Zhang J, Gao J, et al. Ropivacaine inhibits proliferation and invasion and promotes apoptosis and autophagy in bladder cancer cells via inhibiting the PI3K/AKT pathway. J Biochem Mol Toxicol. 2023;37(1):e23233.
  30. Zhao L, Han S, Hou J, Shi W, Zhao Y, Chen Y. The local anesthetic ropivacaine suppresses the progression of breast cancer by regulating miR-27b-3p/YAP axis. Aging (Albany, NY). 2021;13(12):16341-52.
  31. Ghasemi A, Khanzadeh T, Zadi Heydarabad M, Khorrami A, Jahanban Esfahlan A, Ghavipanjeh S, et al. Evaluation of BAX and BCL-2 gene expression and apoptosis induction in acute lymphoblastic leukemia cell line CCRFCEM after high-dose prednisolone treatment. Asian Pac J Cancer Prev. 2018;19(8):2319-23.
  32. Wadey KS, Johnson JL, George SJ. Monitoring cellular proliferation and apoptosis in atherosclerotic plaques and intimal thickenings. Methods Mol Biol. 2022;2419:507-19.
  33. Chen P, Wang D, Xiao T, Gu W, Yang H, Yang M, et al. ACSL4 promotes ferroptosis and M1 macrophage polarization to regulate nasopharyngeal carcinoma tumorigenesis. Int Immunopharmacol. 2023;122:110629.
  34. Forcina GC, Dixon SJ. GPX4 at the crossroads of lipid homeostasis and ferroptosis. Proteomics. 2019;19(18):e1800311.
  35. Zhao Y, Li Y, Zhang R, Wang F, Wang T, Jiao Y. The role of erastin in ferroptosis and its prospects in cancer therapy. Onco Targets Ther. 2020;13:5429-41.
  36. Sareddy GR, Nair BC, Krishnan SK, Gonugunta VK, Zhang QG, Suzuki T, et al. KDM1 is a novel therapeutic target for glioma treatment. Oncotarget. 2013;4(1):18-28.
  37. Ferrari-Amorotti G, Fragliasso V, Esteki R, Prudente Z, Soliera AR, Cattelani S, et al. Inhibiting the interactions between the lysine demethylase LSD1 and snail/slug blocks cancer cell invasion. Cancer Res. 2013;73(1):235-45.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טיפול ברוסקוגניןדה-רגולציה של KDM1Aהשראת פרופטוזיסהשראת אפופטוזיסתאי C666-1שגשוג תאיםWestern Blotפרוקסידציה של ליפידיםהפעלת Caspase-3
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.