מאמר שיטה

סבב עבודה מקיף מקצה לקצה על פלטפורמה כפולה לפרופיל מטבולי של מיקרו-דגימות דם מיובשות

60 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72533

⸱

6 באוקטובר 2026

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, 2Biomic AUTh, Center for Interdisciplinary Research and Innovation (CIRI-AUTH), 3School of Medicine, Aristotle University of Thessaloniki, 4ThetaBiomarkers

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה מקיפה ומלאה למטבוליזציה לא ממוקדת (untargeted metabolomics) באמצעות התקני דגימה מיקרוסקופית סופגת נפחית (VAMS). המטרה היא לנתח ביעילות את הדגימה באמצעות מיצוי בודד בשתי פלטפורמות אנליטיות משלימות (RP-LC-MS ו-GC-MS), ובכך לבסס מסגרת חסונה למחקרים קליניים מבוזרים בהיקף נרחב.

תקציר

דגימת מיקרו של דם (BµS) התגלתה כחלופה חזקה ופולשנית באופן מינימלי לניקור ורידים מסורתי, המאפשרת איסוף של דגימות בנפח נמוך מחוץ למסגרות קליניות רגילות. באמצעות תמיכה בדגימה מבוזרת ושיפור היענות המטופלים, ניתן לשלב מכשירים אלו עם טכנולוגיות אומיקה מתקדמות כדי להקל על תכנוני מחקרים רחבי היקף וארוכי טווח. עם זאת, יישום מוצלח דורש אופטימיזציה של מספר שלבים קריטיים, החל מאיסוף הדגימות ואחסונן ועד לחילוצן ולהכנה אנליטית. בעבודה זו, אנו מציעים זרימת עבודה מקיפה מקצה לקצה למטבולומיקה לא מכוונת עבור BµS, עם דגש על פרמטרים מרכזיים השולטים בהכנת הדגימות ובביצועים אנליטיים. מכשירים לדגימת מיקרו סופגת נפחית (VAMS) הוערכו באמצעות שתי פלטפורמות משלימות: כרומטוגרפיה נוזלית במצב פאזה הפוכה המשולבת עם ספקטרומטריית מסות, וכרומטוגרפיה גזית המשולבת עם ספקטרומטריית מסות. יישום של זרימת העבודה המופתמת הדגים כיסוי מטבולומי רחב על פני מחלקות כימיות מגוונות, דבר המדגיש את הפוטנציאל של דגימה מבוססת VAMS לתמוך במחקרי מטבולומיקה מבוזרים ובני-הרחבה תוך שמירה על חוסן אנליטי, הדירות ורלוונטיות ביולוגית.

מבוא

מטבוליזום (Metabolomics), המחקר הסיסטמטי של מולקולות בעלות משקל מולקולרי נמוך במטריצות ביולוגיות, זכה למעמד בולט ככלי קריטי להבנת פנוטיפים תאיים ומצבים מטבוליים דינמיים1,2. במסגרת קלינית, מטבוליזום של דם טומן בחובו פוטנציאל רב לשיפור היעילות האבחנתית ולאפשר הערכה מקיפה יותר של סיכוני מחלה, תוך שהוא מגשר לעיתים קרובות על פערים שנותרו על ידי אמצעי אבחון קונבנציונליים. עם זאת, לכידה של המטבולום המלא היא מאתגרת מטבעה. לאור המורכבות הכימית העצומה וטווחי הריכוזים המגוונים של מטבוליטים אנדוגניים, אף פלטפורמה אנליטית אחת אינה יכולה להשיג כיסוי מלא, מה שהופך את השימוש בטכניקות אנליטיות משלימות לחיוני לצורך מקסום הסקירה המטבולית.

מיקרו-דגימת דם (BµS) היא טכניקה לפקיעת דגימות באופן זעיר-פולשני הכוללת איסוף של מספר µL של דם. רכישת הדגימה המפושטת מבטלת את הצורך בפלבוטומיה, מה שמאפשר איסוף ביתי ומשפר את נוחות המטופל. יתרה מכך, הוכח כי המעבר ממטריקס נוזלי למטריקס מיובש משפר את היציבות של מטבוליטים לביליים שונים ומפשט את הלוגיסטיקה של ההובלה והאחסון, מאחר שאין צורך בטמפרטורות קרות3,4,5. בעוד ש-BµS נמצאת בשימוש כבר עשורים, בעיקר כנקודות דם מיובשות (DBS) לאבחון הפרעות מטבוליות מולדות, לטכניקה קלאסית זו ישנם כמה חסרונות אנליטיים. הליך האיסוף אינו מאפשר איסוף דגימות כמותי, מה שהופך את הטכניקה לרגישה ל"אפקט ההמטוקריט", שבו שינויים בצמיגות הדם משנים את התפלגות הדם, ובכך פוגעים בדיוק הכמותי. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחו מכשירים ל-BµS כמותי. מיקרו-דגימה ספיגה נפחית (VAMS) היא טכנולוגיית BµS עדכנית המשתמשת בקצה פולימרי שתוכנן לדגום נפח מדויק של דם ולהתגבר על המגבלות של DBS מסורתי6,7,8.

כתוצאה מכך, הפרופיל המטבולי הגלובלי של BµS עורר עניין גובר בשנים האחרונות9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. עבודות שפורסמו המשוות בין BµS למטריצות מסורתיות משתמשות במספר טכניקות אנליטיות, המכסות טווח רחב של קוטביות, החל מ-Capillary Electrophoresis17 (CE) ו-Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography18,19(HILIC) המשולבים עם ספקטרומטריית מסות (MS) עבור מינים קוטביים, ועד ל-Reversed-Phase-Mass-Spectrometry18,19,21(RP-MS) עבור מטבוליטים וליפידים בעלי קוטביות בינונית. שיטות מיצוי מסורתיות ניצבות בפני צוואר בקבוק בסיסי: אופטימיזציה למכשיר בודד פירושה לעיתים קרובות השמטה של פראקציות כימיות קריטיות ואובדן של נתונים מטבוליים. כאשר נפחי הדגימות מוגבלים מאוד, ביצוע מספר אנליזות נפרדות הוא מאתגר. לכן, פיתוח פרוטוקול מיצוי יחיד התואם למספר פלטפורמות אנליטיות נותר מכשול משמעותי.

מסלול עבודה זה מפרט את הפרוצדורות לניתוחים כפולים ב-RP-LC-MS ובכרומטוגרפיה של גזים (GC) של התקני VAMS. למיטב ידיעתנו, זהו מסלול העבודה הראשון לפרופיל מטבולי לא-ממוקד של BµS המשלב את שתי הפלטפורמות האורתוגונליות הללו באמצעות פרוצדורה אחת של מיצוי דגימה. יתרה מכך, הוא מדגיש את השלבים הקריטיים ביותר הנדרשים כדי להבטיח רכישה אמינה וניתנת לשחזור של פרופיל מטבולי לא-ממוקד ומקיף.

פרוטוקול

כל המשתתפים סיפקו הסכמה מודעת בכתב להשתתף. המחקר אושר על ידי ועדת אתיקה במחקר של אוניברסיטת אריסטו של סלוניקי (#306272/2022).

1. איסוף דגימות

  1. שטפו את ידי הנבדק במים חמימים כדי להסיר מזהמים פוטנציאליים ולהגביר את זרימת הדם.
  2. נקו את האצבע באמצעות תמיסת אתנול 70%. המתינו עד שהתמיסה תתאדה באופן טבעי.
    הערה: שימוש בחומרי חיטוי מבוססי יוד או בסבון עלול להפריע לאנליזות LC-MS.
  3. סובבו והסירו את המכסה של לנקט סטרילי, חד-פעמי המופעל במגע (עומק 1.5 mm). הצמידו אותו למרכז קצה האצבע ולחצו.
  4. נגבו את טיפת הדם הראשונה והמתינו להיווצרות טיפה חדשה.
    הערה: בשל זיהום אפשרי על ידי נוזל חוץ-תאי מקומי, ייתכן שהטיפה הראשונה לא תשקף את הרמות במחזור המערכתי.
  5. מבלי להוציא את המכשיר מתוכו מחזיקו, השמילו את קצה ה-20 µL של מכשיר ה-VAMS לטיפת הדם. המכשיר צריך להיות ממוקם בצורה אנכית מעל הדגימה. הימנעו מטבילה מלאה של הקצה בדם, שכן הדבר עלול להוביל לדגימה מופרזת.
    הערה: בעת דגימה ממבחנה המכילה דם ורידי, כפי שעשוי להידרש בסביבת מעבדה, ודאו שהקצה נוגע רק בפני השטח של הנוזל, מבלי להטביעו, כדי למנוע דגימה מופרזת.
  6. לאחר רוויית הקצה, המושגת כאשר הוא הופך כולו לאדום, החזיקו אותו במקומו למשך שתי שניות נוספות, ולאחר מכן הסירו אותו מדגימת הדם.
  7. הניחו את הדגימות בקופסאות המקוריות שלהן על משטח שטוח ונקי, הרחק מאור שמש ישיר או מחום, תוך מניעת מגע של הקצה עם כל חפץ חיצוני, והניחו להן להתייבש למשך 2 h בטמפרטורת החדר ובלחות הסביבה.
  8. אחסנו את הדגימות בשקית עם חומר מייבש בטמפרטורה של −80 °C עד למועד האנליזה. ההובלה חייבת להתבצע תחת קרח יבש.
    הערה: במקרים של אנליזה מכוונת של BµS שבה יציבות האנליט כבר נחקרה, ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך הזמן המומלץ. עם זאת, עבור אנליזה לא מכוונת, מומלץ אחסון ב-–80 °C, שכן חלק מהאנליטים עדיין נוטים להתפרק גם במטריצה מיובשת. טבלת פתרון בעיות עבור הבעיות הנפוצות ביותר באיסוף דגימות מוצגת ב-טבלה 1.

2. פרוצדורת מיצוי מטבוליטים

  1. נתקו את כל הקצה מהמחזיק הפלסטי והניחו אותו בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה בעגולה (השתמשו במכסה של מבחנת מיקרו-צנטריפוגה כדי לנתק את הקצה מהמחזיק).
  2. בצעו רהידרציה על ידי הוספה של 50 µL של מים אולטרה-טהורים ישירות על הקצה.
  3. הוסיפו 400 µL של מתנול המכיל תערובת IS (למשל, D-Myristic acid מסומן איזוטופית) כדי למצות את המטבוליטים ולעודד שקיעת חלבונים.
    הערה: זהירות: מתנול הוא רעיל ודליק מאוד. יש לטפל בו במCתא מlyיחול/מכסה עשן.
  4. בצעו סוניקציה לדגימות באמבט קרח למשך 10 min תחת פעולה רציפה (עוצמה מומלצת 215/860 W, תדר 35 kHz).
  5. הוציאו בזהירות את הקצה באמצעות פינצטה, תוך ניקוי שלה במתנול בין דגימות.
  6. סבבו בצנטריפוגה במהירות 6720 x g למשך 10 min בטמפרטורה של 4 °C.
  7. העבירו 150 µL מהעליון (supernatant) למבחנות חדשות. השתמשו באותו נפח עבור כל דגימה. השתמשו במבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה עבור אנליזת RPLC, ובבקבוק זכוכית חדש בנפח 1.5 mL עבור אנליזת GC.
  8. העבירו 50 µL מכל עיליון של דגימה לבקבוק יחיד כדי להכין דגימת QC מאוחדת (pooled) למחקר.
  9. בצעו וורטקס קצר כדי להבטיח הומוגניזציה מלאה ולאחר מכן חלקו לאליקוואוטים מרובים בנפח זהה לדגימות המחקר. השתמשו במבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה עבור אנליזת RPLC, ובבקבוק זכוכית חדש בנפח 1.5 mL עבור אנליזת GC.
  10. אידו את העליונים עד ליובש מלא באמצעות מרכז ריכוז בוואקום, במצב אידוי מימי, תחת רמת ואקום של −600 mmHg (−800 mbar), בסיבוב של 1400 rpm, בטמפרטורת החדר. הדגימות מתייבשות תוך כ-2 h.
    הערה: עקבו בזהירות אחר האידוי והוציאו את הבקבוקים מהמרכז כדי למנוע אובדן של תרכובות נדיפות ברגע שהממס התאדה לחלוטין. נקודת עצירה: ניתן להקפיא את הדגימות בטמפרטורה של −80 °C בצורתן היבשה למשך לילה עד לביצוע האנליזה.

3. פרוצדורה לפני ניתוח LC-MS

  1. המיסו מחדש את השארית היבשה ב-100 µL של ממס להמסה מחדש, כגון הפאזה הניידת הראשונית (למשל, 5–10% methanol במים).
    הערה: ניתן להתאים את הנפח ואת ממס ההמסה מחדש בהתאם לתנאי הכרומטוגרפיה.
  2. המיסו מחדש את ה-QC באותו ממס ובאותו נפח כשל דגימת המחקר (שמרו תמיד על יחס קבוע בין נפח הדגימה לנפח הממס).
  3. ערבבו קצרות ב-Vortex והעבירו לצנטריפוגה למשך 10 min במהירות של 6720 x g בטמפרטורה של 4 °C.
  4. העבירו את העילג (supernatant) לבקבוק עבור דגשן (autosampler vial) עם רכיב פנימי (insert).

4. פרוצדורה לפני ניתוח GC-MS

הערה: את כל השלבים הבאים יש לבצע במנדף כימי.

  1. הכינו את חומר המתוקסיאמינציה על ידי המסה של 40 mg של methoxyamine hydrochloride ב-1 mL של pyridine.
    הערה: זהירות: Pyridine הוא רעיל. יש לטפל בו במCב מנדף.
  2. הכינו את חומר הנגזרת (derivatization agent) על ידי הוספת 10 µL של trimethylchlorosilane (TMCS) ל-1 mL של N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (MSTFA).
    הערה: זהירות: גם TMCS וגם MSTFA הם רעילים. יש לטפל בהם במCב מנדף.
  3. הוסיפו 10 µL של חומר המתוקסיאמינציה (Methoxyamine hydrochloride בריכוז 40 mg/mL ב-pyridine) לתוך השאריות המיובשות של דגימות הבדיקה ודגימות ה-QC.
  4. ערבבו את הדגימות באמצעות vortex לזמן קצר כדי להבטיח ערבוב מלא של הרכיב.
  5. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 30 °C למשך 90 min. הדגירה תבוצע באופן סטטי.
  6. המתינו עד שהדגימות יתקררו לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוסיפו 90 µL של חומר הנגזרת (MSTFA 1% TMCS).
  7. החליפו את מכסי הבקבוקונים באחרים חדשים וערבבו את הדגימות באמצעות vortex למשך 30 s כדי להבטיח תערובת הומוגנית.
  8. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 min. הדגירה תבוצע באופן סטטי.
  9. המתינו עד שהדגימות יתקררו לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוסיפו 10 µL של סטנדרט הזרקה (למשל, pentadecane בריכוז 6.25 mg/L ב-pyridine) לכל דגימה.
  10. החליפו את מכסי הבקבוקונים באחרים חדשים, ערבבו ב-vortex לזמן קצר, והעבירו את התערובת הסופית לבקבוקוני כרומטוגרפיה מזכוכית עם micro-inserts.
  11. הכניסו את הבקבוקונים למגש הדגימה האוטומטי (autosampler tray).
  12. אפשרו לדגימות להגיע לשיווי משקל ב-autosampler למשך 4 h בטמפרטורת החדר לפני ההזרקה הראשונה.
    הערה: תהליך הנגזרת מושלם לאחר 4 h, והמטבוליטים יציבים בטמפרטורת החדר עד 24 h לאחר השלמת תהליך הנגזרת. התאימו את מספר הדגימות בכל סדרה כך שהדגימות לא יישארו ב-autosampler למשך יותר מ-28 h (לאחר הוספת MSTFA 1% TMCS). סכימות של שיטות הכנת הדגימות מוצגות ב-Figure 1A–C.

5. הגדרות RP-LC-MS

  1. הכינו את תמיסאות השטיפה ואת האלואנטים (eluents) של ה-RP בהתאם ל- טבלה 2.
    הערה: זהירות: חומצה פורמית ואיזופרופנול הם חומרים דליקים. חומצה פורמית היא גם רעילה. יש לטפל בשניהם במנדף כימיים.
  2. התקינו את עמודת ה-HSS T3 C18 (100 ממ"ק x 2.1 ממ"ק, 1.7 µm) עמודה בתנור העמודות.
  3. הכנס את כל הקווים לערוץ המתאים ורוקן כל ערוץ בהתאם.
  4. הגדירו את טמפרטורת העמוד ל- 40 °C.
  5. התחילו לשטוף את העמודה עם תערובת של 100% A:0% B בקצב זרימה של 0.1 מ"ל/דקה.
  6. העלה את קצב הזרימה במדרגות של 0.1 מ"ל/דקה, תוך המתנה להתייצבות לחץ העמודה בין המדרגות, עד להגעה לקצב זרימה של 0.35 מ"ל/דקה. בדוק אם קיימות דליפות.
  7. השגה שיווי משקל בעמודה בתנאי ההתחלה של הגרדיאנט (0% B) למשך כ-30 דקות.
    הערה: יש לנטר את לחץ העמודה ולוודא שהוא נשאר בטווח הצפוי (5000–6000 psi).
  8. התחל את רצף הדגימה.

6. הגדרות GC-MS

  1. התקינו את עמודת הנימי DB-5 (5% phenyl-methyl-polysiloxane) בתנור העמודה.
  2. הגדר את העמודה לטמפרטורה התחלתית של 60 °C.
  3. כוון את מזרק ה-PTV לטמפרטורה ראשונית של 110 °C.
  4. התחל את רצף הדגימה.

תוצאות

תוצאות מייצגות מהניתוח הלא-ממוקד של מכשירים מסוג VAMS, שבוצע בהתאם לנוהל המתואר לעיל, מוצגות כאן.

הנתונים מהניתוח המשולש של דגימה מאוחדת שהוכנה מדם ורידי של 10 אנשים, שנדגמו באמצעות VAMS, הוערכו, ומאפייני טביעות האצבע המטבוליות שהתקבלו מוצגים. איכות הנתונים והמידע שנלכד ממכשירי ה-VAMS הוערכו באמצעות שני קריטריונים עיקריים: המספר הכולל של המאפיינים הכימיים שזוהו והשחזוריות של המאפיינים (n = 3), שהובעה כסטיית תקן יחסית באחוזים (%RSD). המספר הכולל של המאפיינים שימש להערכת רוחב המיצוי והכיסוי הכימי של הממס, בעוד שה-%RSD נוטר כדי להבטיח את הדיוק הטכני והחוסן של השיטה; %RSD נמוך יותר מעיד על תהליך מיצוי בעל שחזוריות גבוהה הממזער את הרעש האנליטי.

לאחר חילוץ ועיבוד של הנתונים הגולמיים, התקבלה מטריצה של מאפייני m/z-זמן שהייה (RT), יחד עם העוצמות שלהם. רק מאפיינים עם אות גילוי בשניים מתוך שלושה שיכורים נלקחו בחשבון, לאחר שלבי עיבוד מקדמי וסינון בלאנקים מתאימים. איור 2A,B מציג גרפים של m/z לעומת RT עבור אותה דגימה שנותחה על פי הפרוטוקולים המתוארים הן עבור LC-MS והן עבור GC-MS.

המספר הגבוה של תכונות שנשטפו מוקדם במהלך ריצת ה-RPLC מיוחס למטבוליטים הידרופיליים מאוד שחולצו באמצעות הפרוטוקול המיושם, אך לא נשמרו היטב בעמודת הפאזה ההפוכה. למרות שמטבוליטים שנשטפים מוקדם מציבים אתגרי זיהוי, עדיין ניתן לבצע השמות מדויקות באמצעות שימוש בנתוני פרגמנטציה של MS/MS לצד השוואות עם מאגרי נתונים ספקטרליים ותקני ייחוס פנימיים. יתרה מכך, חלק משמעותי מfracציה הידרופילית זו צפוי להילכד באמצעות אנליזת GC-MS. בסופו של דבר, הדבר מייצג מגבלה מובנית של התחום, שכן המורכבות העצומה של המטבולום מחייבת שימוש במספר פלטפורמות אנליטיות.

הערכה רב-פלטפורמית של התמציות המתנוליות מדגימה בבירור את אופיהם המשלימי מאוד של תהליכי העבודה האנליטיים של LC ו-GC, כאשר מדדי הביצועים נמצאים בטווח הצפוי לפרופיל מטבוליזום מקיף. איור 3A,B מציג את מספר המאפיינים הכולל ואת התפלגות ה-RSD% עבור כל פלטפורמה. פלטפורמת ה-LC סיפקה כיסוי כימי נרחב, תוך הפרדה של 4,169 מאפיינים, דבר התואם את יכולתה המוכרת ללכידת מגוון רחב של תרכובות פולריות, חצי-פולריות ותרכובות שאינן נדיפות. במקביל, פלטפורמת ה-GC הראתה תת-קבוצה קטנה יותר של מאפיינים, בסך 187. תוצאה זו הייתה צפויה, שכן GC יכולה לזהות רק תרכובות נדיפות הניתנות לנגזרת.

בכל הנוגע לחזרתיות, כפי שמוצג בתרשים כינור (violin plot), ההתפלגות והפיזור הכלליים של ערכי ה-RSD% דומים להפליא בין LC-MS ל-GC-MS. ה- %RSD הממוצע היה טיפוסי עבור שתי הפלטפורמות, כ-29.7% עבור LC (2,655 מתוך 4,169 היו בעלי %RSD נמוך מ-30%) ו-32.3% עבור GC (114 מתוך 187 היו בעלי %RSD נמוך מ-30%). למרות שמספר קטן של מאפיינים הראה ערכי RSD גבוהים יותר בשני הצדדים, שונות זו נפוצה וצפויה במטבולימיקה לא ממוקדת (untargeted metabolomics). ערכים גבוהים אלה שייכים בדרך כלל למטבוליטים בריכוז נמוך הנמצאים קרוב לסף הגילוי של המכשיר. באופן כללי, פרופילי ההתפלגות הצפופים מאשרים חזרתיות מספקת עבור שתי מערכות האנליזה.

ניתן לבחון את המרחב הכימי של המטבוליטים שנלכדו באמצעות הפרוטוקול על ידי בחינת ההערות (annotations) של המטבוליטים. תרכובות שונות זוהו באמצעות LC-MS ו-GC-MS, כצפוי בהינתן המשלימות המובנית של שתי הפלטפורמות. רשימה מלאה של הערות מטבוליטים עבור התקני VAMS מופיעה ב-Supplementary Table 1 וב-Supplementary Table 2. בסך הכל, 97 מטבוליטים זוהו ואופיינו (רמות 1 ו-2, כפי שהוצע על ידי Sumner et al. (2007)22) באמצעות פרוטוקול זה בשתי הטכניקות, בנוסף לתרכובות אחרות ברמה 3 שאופיינו באופן משוער. הערות ה-GC אושרו עוד יותר על ידי השוואת מדדי זמן השהייה (retention indexes) הניסיוניים – שהתקבלו באמצעות השוואה ל-FAMES – למדדים המופיעים בטבלאות23. Figure 4A,B מציגה את התפלגות תתי-הסוגים של המטבוליטים שאופיינו עבור שתי השיטות, בעוד ש-Figure 4C מציגה את החפיפה בין הטכניקות, ומדגישה את השלמיות ביניהן. ניתן לבצע תיקוף צולב (cross-validation) למספר מטבוליטים ביניים מרכזיים באמצעות שתי הטכניקות, בעוד שמאפיינים ייחודיים מבחינה מבנית או ספציפיים לפלטפורמה יכולים למלא פערים במסלולי חילוף החומרים המרכזיים של הפחמן ובמסלולים מטבוליים משניים. למרות שחומצות אמינו ופפטידים הם המחלקות הכימיות העיקריות בשני הניתוחים, רק מספר קטן של מטבוליטים חופפים בין הטכניקות. מחלקות מטבוליטים רבות הן ספציפיות למכשיר, כגון acyl carnitines ב-LC-MS והקסוזים (hexoses) ב-GC-MS.

כדי להדגים את יעילותו של מתנול כממס מיצוי עבור שתי הטכניקות, בוצעו ניסויי השוואה על דגימות VAMS באמצעות מערכות ממסים שונות, ולאחריהם אנליזות LC-MS ו-GC-MS. שלוש מערכות ממסים נבדקו בהשוואה למתנול בשלוש חזרות: אצטוניטריל טהור (ACN), תערובת מתנול-מים (60:40, v/v), ותערובת אצטוניטריל-מתנול (70:30, v/v). הבחירה בממסים ובתערובות אלו התבססה על ניסויי מקדימה שבוצעו על ידי הקבוצה שלנו, וכן על ספרות שפורסמה בעבר13,14,24,25. יעילות המיצוי של כל מערכת הוערכה באמצעות שלושה פרמטרים מרכזיים: המספר הכולל של התכונות (features) שזוהו, עוצמת התכונות הכללית, והשחזוריות של התכונות, שהובאה כסטיית תקן יחסית (RSD, %).

עבור תהליך העבודה של LC-MS, המספר הגבוה ביותר של תכונות (features) זוהה באמצעות MeOH-H2O (60:40, v/v), עם ממוצע של 4,514 תכונות בשלוש חזרות, ואחריו בקוצר MeOH טהור (4,169 תכונות). תערובת ACN–MeOH (70:30, v/v) הניבה ממוצע של 3,502 תכונות, בעוד ש-ACN טהור הניב את ממוצע ספירת התכונות הנמוך ביותר, 2,836. ייצוג גרפי של ספירות תכונות אלו לכל חזרה מוצג ב-איור 5A.

כדי לבחון את מאפייני הדיוק עבור כל תנאי מיצוי, נותחו עוצמות התכונות וערכי ה-RSD (%) מהזרקות בשלוש חזרות. השוואה בין השפע הכולל של התכונות לבין ה-%RSD הממוצע לכל ממס מיצוי עבור LC-MS מוצגת באיור 5A. התפלגויות אות ה-log2 היו דומות עבור כל הממסיים, כאשר MeOH-H2O 60:40 (v/v), ACN ו-MeOH הניבו שפע גבוה מעט יותר מאשר ACN-MeOH 70:30 (v/v). MeOH הניב %RSD ממוצע כולל נמוך יותר, מה שמעיד על כך שהמיצוי היה בעל הדירות גבוהה יותר עם ממס זה.

הערכה דומה של יעילות מערכת ממס המיצוי בוצעה בנתוני ה-GC-MS. פעם נוספת, לצורך הערכת מספר המאפיינים, נשקלו רק אלו שזוהה עבורם אות בלפחות שניים מתוך שלושה חזרות. הממס שהניב את מספר המאפיינים הגבוה ביותר היה ACN-MeOH 70:30 (v/v) (216 מאפיינים), ואחריו בתוצאה קרובה MeOH (187 מאפיינים). איור גרפי של מספר המאפיינים שזוהו לכל ממס מיצוי ו-BµS מוצג ב-איור 5B.

בכל הנוגע לשפע הכללי של המאפיינים שזוהו, MeOH נראה כי הוא היעיל ביותר והניב שפע גבוה יותר, כפי שמוצג ב-איור 5B. MeOH-H₂O 60:40 (v/v) היה השני בטיבו, ואחריו ACN-MeOH 70:30 (v/v). ACN היה הממס הפחות יעיל. בכל הנוגע ל-%RSD של המאפיינים, MeOH-H₂O 60:40 (v/v) סיפק את ערכי ה-RSD הנמוכים ביותר עבור VAMS (RSD = 38.57%), ואחריו בתוצאות דומות ACN (42.65%), MeOH (44.14%), ו-ACN-MeOH 70:30 (v/v) (49.14%). ערכים אלו מוצגים ב-איור 5B.

התוצאות לעיל תואמות היטב לספרות שפורסמה בעבר. Couacault et al. (2026)19 דיווחו על מספר תכונות (features) דומה בניתוח RP-LC-MS של DBS ו-VAMS תוך שימוש בהרכב ממס מיצוי דומה (רהידרציה עם 80 µL של מים, ולאחר מכן הוספה של 320 µL של MeOH). באופן דומה, Cala et al. (2017)11 זיהו מספר תכונות דומה (153) באמצעות ניתוח GC-MS של קצוות VAMS. למרות שרוב המחקרים הקיימים לא העריכו את הדיוק של ניתוחים ממכשירים אלו, הממצאים הכלליים שלנו תואמים את הציפיות עבור ניתוח לא ממוקד (untargeted analysis). יתרה מכך, תוצאות ה-LC תואמות לאלו שדווחו על ידי Bossi et al. (2025)26 עבור ניתוח HILIC של מיקרו-דגימות DBS ו-qDBS, שבהן לרוב התכונות שזוהו היו RSDs < 30%.

באופן כללי, תוצאות אלו מדגימות כי מיצוי מבוסס מתנול מספק איזון חסון בין מספר המאפיינים, העוצמה והדיוק (RSD ממוצע, %) עבור ניתוחי LC-MS ו-GC-MS של דגימות VAMS. לפיכך, פרוטוקול מיצוי מתנול יחיד יכול לייעל את הכנת הדגימה הכפולה, להקל על רכישה מקבילה של פרופילים מטבוליים משלימים, ולמקסם את תפוקת המידע.

תרשים להכנת דגימות למטבוליזואניקה; שלבי כרומטוגרפיה, מתוקסימציה ודריבטיזציה.
איור 1: סכימות של הפרוטוקול המציגות (A) פרוטוקול מיצוי דגימות, (B) הרכבה מחדש ל-LC-MS, ו-(C) דריבטיזציה ל-GC-MS/MS. נוצר ב-BioRender. Marques, D. (2026) https://BioRender.com/dprdv18, https://biorender.com/xu2qh34, https://biorender.com/7ztz2qv. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

כרומטוגרם של ספקטרומטריית מסות, זמן שהייה מול m/z, ניתוח התפלגות שיאים, תוצאת ניסוי.
איור 2: השוואות של m/z ו-rt עבור דגימה מייצגת בבדיקות של (A) LC-MS ו-(B) GC-MS. כל נקודה מייצגת אות בודד לפני קיבוצו למאפיינים (features). הצבעים מייצגים את עוצמת אות ה-MS1 עבור מאפיין נתון, כאשר העוצמה עולה מכחול לאדום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשימי כיסוי מאפיינים ושחזור; ניתוח LC מול GC; גרפי עמודות וגרפי כינור.
איור 3: כיסוי מאפיינים ושחזור בין פלטפורמות אנליטיות. (A) כיסוי מאפיינים: מספר כולל של מאפיינים ייחודיים שזוהו על ידי LC (טורקיז) ו-GC (כתום), כאשר הספירה המדויקת רשומה מעל כל עמודה. (B) שחזור מאפיינים: גרפי כינור המראים את צפיפות ההתפלגות של סטיות תקן יחסיות (RSD%) עבור כל המאפיינים. גרפי קופסה מוטמעים מציינים את החציונה ואת טווחי הרבעונים; נקודות נתונים בודדות הושמטו לצורך בהירות ויזואלית. אנא לחץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

סוגי מחלקות כימיות ב-LC/GC, דיאגרמות עמודות ודיאגרמות ון, השוואת מספר מטבוליטים.
איור 4: היסטוגרמות המראות את מספר התרכובות מהמחלקות הכימיות השונות שזוהו על ידי (A) LC-MS ו-(B) GC-MS. (C) חפיפה של מטבוליטים שסווגו ברמות 1 ו-2 בין הפלטפורמות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

השוואת ממסי לכרומטוגרפיה; תרשים עמודות; % RSD; יעילות מיצוי אנליטים; ויזואליזציה של נתונים.
איור 5: תוצאות ממסי מיצוי מניתוחי LC-MS (A) ו-GC-MS (B>) של התקני VAMS. תרשימי העמודות בחלק העליון של האיור מייצגים את מספר המאפיינים (features) שהתקבלו מכל ממס מיצוי שיושם על התקני VAMS לכל חזרה. התרשימים בחלק התחתון של האיור מראים את סכום העוצמות ואת ה-RSD (%) הממוצע עבור כל ממס מיצוי ששימש את התקן VAMS. גודל העיגול מייצג את סכום העוצמות הכולל של המאפיינים שזוהו בסולם log2, המשקף את יעילות המיצוי. מדרג הצבעים מעיד על הדיוק האנליטי, המבוטא כסטיית תקן יחסית (RSD), כאשר צהוב מייצג דיוק גבוה יותר ואדום מעיד על שונות רבה יותר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

טבלה 1: טבלת פתרון בעיות. סקירה של בעיות דגימה נפוצות, סיבותיהן ופתרונות לדגימה באמצעות מכשירי VAMS. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה 2: תמיסות שטיפה ואלואנטים ל-RP. סקירה של הרכבי הפאזות הניידות, תמיסות שטיפת האטם, ממס הניקוי (purge) וממס השטיפה ששימשו לניתוח הכרומטוגרפי. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 1: פרטים ניסיוניים נוספים. פרמטרי LC-MS ו-GC-MS. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 1: הערות LC-MS. תרכובות שזוהו באמצעות הפרוטוקול הנוכחי בפלטפורמת LC-MS. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית 2: הערות GC-MS. תרכובות שזוהו באמצעות הפרוטוקול הנוכחי בפלטפורמת GC-MS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

מטבולומיקה לא ממוקדת (Untargeted metabolomics) מספקת תובנה ייחודית לגבי ההרכב הכימי של דגימות ביולוגיות. עם זאת, בהינתן המגוון הכימי הרחב של המטבולום, שום טכניקה אינה יכולה לאפיין באופן מלא את המולקולות הקטנות הנוכחות בדם. לכן, השימוש בטכניקות משלימות הוא הכרחי כדי להגדיל את כיסוי המטבוליטים ולשפר את המידע הכולל המתקבל ממחקרים אלו. עם זאת, הנפח הקטן של מיקרו-דגימות דם, כגון VAMS, הופך את הכנת הדגימות עבור אנליזות שונות לאתגר.

בפרוטוקול זה מוצג זרימת עבודה מקיפה לפרופיל מטבולי של קצות VAMS באמצעות מיצוי כפול ושתי טכניקות אנליטיות משלימות. למרות שפורסמו עבודות קודמות שביצעו אנליזה לא מכוונת (untargeted analysis) של דגימות VAMS11,12,13,15,17,18,19,20,21,27, כל אחת מהן מתמקדת בטכניקה אנליטית אחת בלבד. זהו הפרוטוקול הראשון ההתאמה את המיצוי ממכשירי VAMS לתמיכה באנליזות LC ו-GC-MS בתוך זרימת עבודה אחת.

פרוטוקול זה מספק נפחים ספציפיים של ממסים ותמציות כדי להשיג את התוצאות המוצגות; ניתן לבצע התאמות קלות בהתאם למערכים אינדיבידואליים על בסיס רגישות הציוד, נפחי ההזרקה הזמינים ודרישות דגימות ה-QC. לדוגמה, ניתן לשנות את נפח המים להשקה בשלב 2.2 מ-50 ל-80 µL, כדי להבטיח שהקצה רטוב לחלוטין. ניתן להגדיל את נפח המתנול בשלב 2.3 מ-400 ל-500 µL כדי לקבל נפח תמצית גדול יותר לצורך חלוקה למספר רב יותר של דגימות QC. עם זאת, יש לשים לב כי הגדלת נפח הממס תוביל לדילול גבוה יותר של האנליטים. יתרה מכך, ניתן להתאים את הנפחים המוקצים לניתוח ולדגימות ה-QC בשלבים 2.7 ו-2.8, בהתאמה (מ-150 ל-200 µL בשלב 2.7 ומ-20 ל-50 µL בשלב 2.8) כדי להתאים לנפח הרצוי עבור כל דגימה. ראוי לציין כי ניתן להתאים נפחי ממסים אלו בחופשיות ללא צורך בשינוי פרופורציונלי. למרות שיחס סטנדרטי של 3:1 בין הממס לדגימה מספיק בדרך כלל להפקה מלאה, שיטה זו משתמשת בעודף גדול יותר של ממס כדי להבטיח שמכשיר ה-BµS יישאר טבול לחלוטין, מה שהופך את הפרוטוקול ליציב ובעל ישימות ישירה עבור כל הנפחים המוצעים.

ניתן לנתח נתונים הן מ-LC-MS והן מ-GC-MS באמצעות כלי תוכנה שונים בקוד פתוח. במקרה זה, תוצאות ה-LC-MS התקבלו באמצעות זרימת העבודה של Metabonaut28 באמצעות XCMS. עבור דגימות ה-GC-MS, עיבוד הנתונים בוצע באמצעות MSDial גרסה 5.5.260323ניתן למצוא מדריכים בכתובת (https://systemsomicslab.github.io/mtbinfo.github.io/MS-DIAL/tutorial.html). פרמטרים מפורטים לעיבוד נתונים של LC-MS ו-GC-MS מסופקים ב- קובץ משלים 1.

מומלץ לעבד כל סט נתונים באופן נפרד, תוך שימוש בדגימות ה-QC במנה נפרדת כדי למטב את פרמטרי העיבוד לפני החלתם על כל סט הנתונים. יש לבצע נרמול לאחר עיבוד מקדימה של הנתונים. הן ב-XCMS והן ב-MSDial קיימים כלים מובנים לנרמול. בעבודה הנוכחית, הנרמול בוצע באמצעות התוכנה בקוד פתוח QCMXP29, תוך שימוש במודל ליניארי המבוסס על תגובות ה-QC.

יש להדגיש מספר שלבים קריטיים, בעיקר בחלק של הכנת הדגימות, כדי להבטיח שהתוצאות יהיו מהימנות.

הפרוטוקול הנוכחי פותח באמצעות מערכת LC המחוברת לספקטרומטר מסות מסוג quadrupole time-of-flight (LC-QTOF-MS) ומערכת כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסות (GC-MS), כאשר הפרמטרים מפורטים בחומרים המשלימים S1. במידה ומסוג LC או GC אחר נעשה שימוש, יש לבצע אופטימיזציה של הפרמטרים עבור ההגדרה הספציפית. בניתוחי מטבוליזום המבוססים על GC-MS ו-LC-MS, יש לתזמן הזרקות של דגימות ריק (blank) בתחילת ובסוף הסדרה האנליטית. לפני הזרקת דגימות QC כלשהן, יש להזריק דגימות conditioning QCs בין 10 ל-15 פעמים במערכת ה-LC-MS ובין 5 ל-10 פעמים במערכת ה-GC-MS כדי להכשיר את העמודה עם המטריקס המיועד לניתוח. יש להכין את דגימות ה-conditioning QCs לפי אותו הליך שבו הוכנו שאר דגימות ה-QC. יש להזריק דגימות intra-study QC באופן מחזורי, והן צריכות להוות כ-10% מהתמיסות המוזרקות.

הטיפול בטיפים של VAMS הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר בזרימה זו. חשוב שהטיפ לא יגע באף משטח מלבד הפנים של מבחנת המיקרוצנטריפוגה, שכן הדבר עלול לגרום לאובדן אנליטים. יתרה מכך, שלב קדם-ההידרציה חיוני להפקה תקינה של האנליטים: בעוד שנראה כי הידרציה ראשונית משפרת את השחזור על ידי הקלה על שחרור האנליטים לפני השקיעה, ההשערה היא שהוספה ישירה של ממסים אורגניים גורמת לשקיעה מיידית של חלבונים בתוך מבנה הטיפ, מה שיוצר מחסום פיזי המגביל את הפקת המטבוליטים העוקבת.

בנוסף, יש לוודא כי הטיפ הוסר לפני שלב הסרכזוגציה. למרות שפעולה זו עשויה להוביל לאובדן קטן של התמיסה, אי-ביצועה פוגע בהשבת הנוזל העליון. הטיפ עלול לערבב מחדש את המשקע, ובכך להפוך את איסוף הנוזל העליון הנקי לבלתי אפשרי.

יש להעלות מספר דגשים כלליים בנוגע ליציבות כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר. ראשית, יש לאחסן את הדגימות בקירור, רצוי ב-−80 °C עד למועד האנליזה. מומלץ להפשיר את הדגימות באמבט קרח או במקרר. כדי למנוע דגרדציה, מומלץ להזריק את הדגימה למערכת הכרומטוגרפית בהקדם האפשרי. עם זאת, אם ההזרקה אינה אפשרית בשל מגבלות זמן, ניתן להקפיא את התמצית המיובשת למשך לילה ללא פגיעה משמעותית ביציבות.

יש להדגיש מספר שלבים בתהליך העבודה של GC-MS. תהליך הנגזרתיזציה (derivatization) מורכב משני שלבים. השלב הראשון הוא מתוקסיאמינציה (methoxyamination), המגנה על קבוצות קטון שעשויות לסבול מאובדן קרבוקסיל כפחמן דו-חמצני אם לא יוגנו. לאחר מכן מתבצע טרימתילסילילציה (trimethylsilylation). ה-MSTFA מגיב עם מולקולות המכילות פרוטונים חומציים, הנפוצים בקבוצות קרבוקסיל, הידרוקסיל, אמינו, אימינו וסולפוניל. תגובה זו מפחיתה את פולריות האנליט ומכניסה קבוצה גדולה ומסייגת, ובכך מורידה את נקודת הרתיחה שלהם23. חיוני שהדגימה תהיה יבשה לחלוטין לפני הוספת מתוקסיאמין, שכן מים עלולים להפריע להגנה על האנליט. כמו כן, יש להקפיד על ייצוב הדגימות בטמפרטורת החדר לאחר הוצאתן מהתנור, מאחר שפתיחת הבקבוק לפני כן עלולה לגרום לאובדן של מטבוליטים נדיפים. יתרה מכך, מכסי ה-GC עלולים להתרחב בעקבות החימום, מה שעלול להוביל לאטימה לקויה של הבקבוק ולאובדן אנליטים עם הזמן. מסיבה זו, מומלץ להחליף את מכס ה-GC לאחר כל שלב דגירה.

עם זאת, בנוגע לפרוטוקול GC-MS, יש להביא בחשבון מספר שיקולים לגבי זמן הנגזרת (derivatization). הוכח כי מטבוליטים ממשיכים להגיב גם לאחר הוצאתם מהתנור, ומגיעים למישור ריכוז (plateau) לאחר 4 h. מישור זה יציב עד 24 h לאחר השלמת תהליך הנגזרת30,31. לכן, חשוב מאוד לארגן את הכנת הדגימות כך שדגימות שעברו נגזרת יישארו באוטו-סמפלר למשך לא יותר מ-28 h לאחר התגובה עם MSTFA. עבור סדרות אנליטיות גדולות, מומלץ להכין את כל הדגימות בו-זמנית כדי להפחית שונות בין-יומית (inter-day variability) בהכנת הדגימות ולהבטיח שניתן יהיה לאחד אליקוטיות מכל דגימה לתוך תערובת ה-QC. ניתן לאחסן את הדגימות כשאריות מיובשות ב-−80 °C, ורק את אלו המיועדות לניתוח ב-24 h הקרובות יש להפשיר ולבצע להן נגזרת27. כמו כן, מומלץ לכסות את המבחנות בנייר דבק למעבדה (laboratory film) כדי למנוע מהדגימה לספוג לחות במקפיא. לבסוף, מומלץ להשתמש בתמיסות נגזרת שהוכנו טרי, ולפעול לפי ההנחיות הכלליות להבטחת איכות בניתוחי מטבולומיקה בשתי המתודולוגיות כדי להבטיח תוצאות מהימנות32.

בעוד שהשוואת זרימת העבודה הנוכחית לניתוח פלזמה מסורתי חורגת מהיקף עבודה זו, נושא זה נחקר רבות בספרות17,18,19,20,21,27. באופן כללי, התקני VAMS מספקים פרופילים איכותיים הניתנים להשוואה לפלזמה, אך השפעיות משתנות בין המטריצות באופן התלוי באנליט, גם בנפחים שוויים (20 µL). הבדלים אלו נובעים ככל הנראה מהמרכיב התאי הנוכח ב-BµS, מהבדלים בין דם נימי לדם ורידי, או מהפרעה של המטריצה המיובשת במהלך הניתוח. דבר זה מחייב תיקוף של הממצאים מהתקני BµS לפני יישומם בפרקטיקה קלינית.

כדי להתאים את הפרוטוקול המוצע לתהליכי עבודה שגרתיים במעבדות בעלות תפוקה גבוהה (high-throughput), ניתן ליישם מספר שינויים ואסטרטגיות לפתרון בעיות. ראשית, ניתן להגדיל את נפחי ממס המיצוי, במיוחד בעת הכנת מנות גדולות יותר של דגימות QC. עם זאת, יש לזכור כי הגדלת נפח המיצוי מדללת מטבעה את הדגימה, מה שעלול להפחית את העוצמה אלא אם כן נפח הreconstitution העוקב מותאם באופן פרופורציונלי. בנוסף, ניתן למטב את הרכב ממס הreconstitution עבור כרומטוגרפיה נזילה כדי להתאימו למדרג הפאזה הניידת הראשוני של תצורות מכשירים ספציפיות.

המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא גודל הדגימה הקטן. מכיוון שדגימה אחת של 20 µL מפוצלת לניתוח בשתי מערכות שונות, תרכובות בשכיחות נמוכה עלולות לרדת מתחת לסף הגילוי במכשיר הפחות רגיש. עם זאת, חיסרון זה מתגמה על ידי הנוחות של איסוף הדגימות המוצעת על ידי BµS והכיסוי הכימי הרחב יותר המסופק על ידי טכניקות משלימות. בנוסף, בעוד ששלב האידוי בפרוטוקול עשוי תיאורטית לגרום לאובדן של תרכובות נדיפות, השפעתו הממשית על חומרים נדיפים לא הוערכה. למרות זאת, כיוון שאידוי חיוני לנגזרת של הדגימה (derivatization) ומאפשר הרכבה מחדש בנפח קטן יותר להגברת הרגישות של ה-LC, ייתרונותיו המעשיים עולים על כל אובדן פוטנציאלי של אות. למרות שמעמדות קודמות עסקו בניתוח לא ממוקד של מיקרו-דגימות7,11,12,13,15,17,18,19,20,27, פרוטוקול זה הוא, למיטב ידיעת המחברים, זרימת העבודה המלאה הראשונה לניתוח התקני של דגימה מיקרוסקופית סופגת נפחית (VAMS) באמצעות ניתוחי LC ו-GC-MS מתוך מיצוי בודד.

יתרה מכך, הערכה של מדדים נוספים תחזק עוד יותר ממצאים אלה. ראשית, תיקוף התוצאות באמצעות השוואה בין מספר מעבדות תוך שימוש באותו פרוטוקול זוג-פלטפורמות בדיוק, יאשרו את חוסנו של השיטה ויבחנו את ביצועיה במכשירי LC-MS ו-GC-MS שונים. בנוסף, המחקר הנוכחי לא העריך את השונות בין מפעילים במהלך הכנת הדגימות או איסוף הדגימות. לבסוף, ניתוח נוסף שיבחן את השפעות האחסון על שלמות הדגימה ואת השפעת ההמטוקריט מהוואים תחומים מרכזיים שבהם ניתן להרחיב את המחקר הנוכחי. בהתחשב בכך שבניתוח לא ממוקד (untargeted analysis), אנו נותנים עדיפות לרוחב כיסוי המטבוליטים ולהשוואות יחסיות בין דגימות, הבדלים אישיים במטבוליטים ספציפיים על פני מחלקות כימיות מגוונות אינם פוגעים בתוקף הנתונים. לפיכך, יש לבחון את השפעות ההמטוקריט והאחסון מהיבט זה. נתונים כאלה הם נדירים, למעט מחקר של Volani et al. (2023), אשר הראה שמכשירי VAMS נשארים יציבים ב-−80 °C למשך 6 חודשים24.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם הרלוונטיים לתוכן מאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי HUMAN-HORIZON-MSCA-2021-DN-01. הפרויקט מומן על ידי האיחוד האירופי Horizon 2020, Marie Curie Actions, מספר מענק 101073062. המחברים מבקשים להודות ל-Dominiki Gallou על תמיכתה במהלך צילומי הווידאו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנות זכוכית בנפח 1.5 מ"לפתרונות מעבדהACSV0902Aמשמש להעברה ואידוי של פракציית ה-GC, לביצוע תגובות נגזרת (derivatization) ולהזרקה סופית ל-GC.
אצטוניטריל (AcN)VWR BDA ChemicalsBDH92497.320בדרגת LC-MS. הוערך כמרכיב בממס מיצוי.
D27-חומצה מיריסטיתSigma Aldrich366889נוסף לממס המיצוי במתנול כדי לנטר את יעילות המיצוי ואת הביצועים האנליטיים.
עמודת נימי DBS-5 (5% פניל-מתיל-פוליסילוקסאן)Agilent Technologies122-5332UIעמודת נימי לכרומטוגרפיית גז המותקנת בתנור ה-GC לצורך אנליזת GC-MS.
Eppendorf Concentrator plusEppendorf5.3E+09משמש לאידוי של על-נוזלי דגימות עד ליובש מוחלט לפני אחסון או הרכבה מחדש/נגזרת.
תערובת סטנדרט של מתיל אסטרים של חומצות שומןSigma AldrichSMB00937-1MLמשמש לקבלת מדדי האחזקה (retention indexes) של המטבוליטים לצורך השמה (annotation) ב-GC.
חומצה פורמיתכימיקלים של VWR BDAPI85178בדרגת LC-MS. משמש כתוסף בריכוז של 0.1% ב phaסות ניידות A ו-B עבור RP-LC-MS.
עמודת HSS T3 C18 (100 מ"מ x 2.1 מ"מ, 1.7 µm)Waters Corporation1.9E+08עמודת כרומטוגרפיה נוזלית במצב הפוך (Reversed-phase) המותקנת בתנור העמודה לצורך אנליזת RP-LC-MS/MS.
איזופרופנולמעבדה לכימיהCL00.0926.2500בדרגת LC-MS. מרכיב של תמיסת שטיפת האטם (H2איזופרופנול 80:20 נפח/נפח).
סרטון מעבדהParafilmPM-996משמש לעטיפה ולכיסוי של המבחנות במהלך אחסון בטמפרטורה של -80°C כדי למנוע ספיגת לחות.
מתנול (MeOH)VWR BDA ChemicalsAA47192-K2בדרגת LC-MS או GC-MS. משמש לאופטימיזציה של ממס המיצוי, להכנת סטנדרט פנימי ולפאזות ניידות.
מתוקסיאמין הידרוכלורידSigma Aldrich89803משמש להכנת חומר המתוקסיאמינציה (40 מ"ג/מ"ל בפירידין) להגנה על קבוצות קטון/קרבוניל.
מיקרו-אינסרטים (Micro-Inserts)פתרונות מעבדהACIV300ICמשמש להחזקת התמיסה לפני ההזרקה.
דגימה זעירה של דם בשיטת Mitra (BµS) מכשירים 20 µLNeoteryx / Trajan Scientific and Medical200004טיפים פולימריים לדגימה מיקרוסקופית סופגת נפחית (VAMS), המשמשים לאיסוף מדויק של דגימות דם בנפח נמוך.
N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (MSTFA)Restek35601ריאגנט סיליליציה המשמש להפחתת קוטביות האנליט ונקודות הרתיחה שלו על ידי תגובה עם פרוטונים חומציים.
תנורהראלאוס8.1E+09משמש לתגובות נגזרת: מתוקסיאמינציה ב- 30°C במשך 90 דקות וטרימתילסיליציה ב- 37°C במשך 30 דקות.
פנטדקאןSigma AldrichK2015Rהוכן בריכוז של 6.25 מג/ליטר. הוסף לכל דגימה לפני ההעברה הסופית לבקבוכון ה-GC כדי לוודא את איכות ההזרקה.
צנטריפוגה מקוררת Pro-Researchמעבדות Centurion ScientificCL00.1688.2500מסוגל לקירור עד 4°C והגעה למהירויות של עד 10,000 x g.
פירידיןSigma Aldrich23053בדרגת אנहाइडרוס (נטול מים). ממס המשמש להמסה של methoxyamine hydrochloride עבור שלב הגזירה הראשון.
מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בעלות תחתית עגולהFL MedicalTS-88530משמש לניתוק ולאחסון של קצה ה-VAMS במהלך רהידרציה, מיצוי וסרטיפוגציה.
טרימתילכלורוסיליאן (TMCS)Alfa Aesarלא רלוונטיזרז לנגזרת. מתווסף ל-MSTFA ביחס של 1% נפח/נפח.
פינצטהלא רלוונטיבמידה ולא סופק טקסט למקור, לא ניתן לבצע תרגום. נא לספק את הטקסט באנגלית המיועד לתרגום.משמש להוצאה זהירה של קצות ה-VAMS מהמבחנות. יש לנקות במתנול בין דגימות.
מים בר-טהרה (H₂O)2סגורממסמנר Hydrolab (Straszyn, פולין)לא רלוונטי18.2 MΩ·נתיב התנגדות של cm. משמש להידרטציה מחדש של קצה הטיפ, תערובות מיצוי ופאזה ניידת A.
אמבט אולטרה-סוניק Sonorex Digitec DTבנדליןלא רלוונטי*בשימוש עם אמבט קרח לאפשרות של מיצוי למשך 10 דקות, במקום שימוש בשולחן ערבוב למשך 30-60 דקות.
עט דקירה חד-פעמי המופעל במגע (עומק 1.5 מ"מ)[חברה — אנא אשר/י[מספר קטלוגי # — אנא אשרמשמש לביצוע דקירה באצבע לצורך איסוף דם קפילרי (שלב 1.3).
תמיסת אתנול (70%)[חברה — אנא אשרו[מספר קטלוגי # — אנא אשר/ימשמש לחיטוי קצה האצבע לפני הדגימה (שלב 1.2).
מערכת LC-QTOF-MS (מערכת Bruker Elute LC המחוברת לספקטרומטר מסות מסוג quadrupole time-of-flight)Bruker[מספר קטלוגי # — אנא אשרו]מערכת LC-MS בפאזה הפוכה המשמשת לניתוח RP-LC-MS (סעיף 5); הוזכרה קודם לכן ישירות בטקסט של הדיון ללא רישום בטבלת החומרים.
מערכת GC-MS (Bruker EVOQ-456)Bruker[מספר קטלוגי # — אנא אשר/ימערכת כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסות המשמשת לניתוח GC-MS (סעיף 6); צוינה קודם לכן ישירות בטקסט של הדיון ללא  רשימת חומרים.

מקורות

  1. Gertsman I, Barshop BA. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. J Inherit Metab Dis. 2018;41(3):355-366.
  2. Gika H, Theodoridis G, Plumb RS, Wilson ID. Metabolic phenotyping (metabonomics/metabolomics) by liquid chromatography-mass spectrometry. In: Fanali S, Chankvetadze B, Haddad PR, Poole CF, Riekkola ML, editors. Liquid Chromatography. 3rd ed. Amsterdam: Elsevier; 2023. p. 403-429.
  3. Bossi E, et al. Revolutionizing blood collection: innovations, applications, and the potential of microsampling technologies for monitoring metabolites and lipids. Metabolites. 2024;14(1):46.
  4. Nys G, Kok MGM, Servais AC, Fillet M. Beyond dried blood spot: current microsampling techniques in the context of biomedical applications. TrAC Trends Anal Chem. 2017;97:326-332.
  5. Londhe V, Rajadhyaksha M. Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: special focus on DBS and VAMS. J Pharm Biomed Anal. 2020;182:113102.
  6. Denniff P, Spooner N. Volumetric absorptive microsampling: a dried sample collection technique for quantitative bioanalysis. Anal Chem. 2014;86(16):8489-8495.
  7. de Sá e Silva DM, et al. Volumetric absorptive microsampling in the analysis of endogenous metabolites. Metabolites. 2023;13(10):1038.
  8. Thaitumu M, Gkanali V, Theodoridis G, Gika H. Connecting the dots: bridging microsamples and conventional blood matrices in metabolic biomarker analysis. Anal Sci Adv. 2025;6(2):e70044.
  9. Chiu HH, et al. A comparative study of plasma and dried blood spot metabolomics and its application to diabetes mellitus. Clin Chim Acta. 2024;552:117655.
  10. Tobin NH, et al. Comparison of dried blood spot and plasma sampling for untargeted metabolomics. Metabolomics. 2021;17(7):62.
  11. Cala MP, Meesters RJW. Comparative study on microsampling techniques in metabolic fingerprinting studies applying gas chromatography-MS analysis. Bioanalysis. 2017;9(17):1329-1340.
  12. Shen X, et al. Multi-omics microsampling for the profiling of lifestyle-associated changes in health. Nat Biomed Eng. 2024;8(1):11-29.
  13. Volani C, et al. VAMS-based blood capillary sampling for mass spectrometry-based human metabolomics studies. Metabolites. 2023;13(2):146.
  14. Drolet J, et al. Integrated metabolomics assessment of human dried blood spots and urine strips. Metabolites. 2017;7(3):35.
  15. Petrick LM, et al. Effects of storage temperature and time on metabolite profiles measured in dried blood spots, dried blood microsamplers, and plasma. Sci Total Environ. 2024;912:169383.
  16. Kong ST, Lim SH, Ching J, Ho PCL. GC-MS uncovers unique metabolic markers of drug-resistant epilepsy in capillary but not venous dried blood spots. J Pharm Biomed Anal. 2025;253:116561.
  17. Londoño-Osorio S, et al. Integrating blood microsampling devices with CE-MS for untargeted analysis of polar metabolomics. Microchem J. 2025;218:115278.
  18. Avella D, et al. An LC-MS untargeted metabolomic comparison between three blood microsampling devices, whole blood, and plasma. Metabolomics. 2026;22(3):89.
  19. Couacault P, Witting M. RPLC- and HILIC-based non-targeted metabolomics workflow for blood microsamples. Metabolomics. 2026;22(2):23.
  20. Londoño-Osorio S, et al. Deep insights into microsampling technologies for global lipidomic profiling of human whole blood using high-throughput LC-MS. Microchem J. 2025;213:113760.
  21. Thaitumu MN, et al. LC-MS-based global metabolic profiles of alternative blood specimens collected by microsampling. Metabolites. 2025;15(1):62.
  22. Sumner LW, et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 2007;3(3):211-221.
  23. Fiehn O. Metabolomics by gas chromatography-mass spectrometry: combined targeted and untargeted profiling. Curr Protoc Mol Biol. 2016;114(1):30.4.1-30.4.32.
  24. Volani C, et al. Pre-analytic evaluation of volumetric absorptive microsampling and integration in a mass spectrometry-based metabolomics workflow. Anal Bioanal Chem. 2017;409(26):6263-6276.
  25. Want EJ, et al. Solvent-dependent metabolite distribution, clustering, and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry. Anal Chem. 2006;78(3):743-752.
  26. Bossi E, et al. Pre-analytic assessment of dried blood and dried plasma spots: integration in mass spectrometry-based metabolomics and lipidomics workflow. Anal Bioanal Chem. 2025;417(9):1791-1805.
  27. Marques de Sá e Silva D, et al. Toward minimally invasive metabolomics: GC-MS metabolic fingerprints of dried blood microsamples in comparison to plasma. Analyst. 2025;150(24):5445-5456.
  28. Louail P, et al. rformassspectrometry/Metabonaut: v1.1.0. Zenodo. 2025. Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.15190305
  29. Broadhurst D. broadhurstdavid/QC-MXP: QC:MXP version 2.0. Zenodo. 2025. Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.15233092
  30. Moros G, et al. Investigation of the derivatization conditions for GC-MS metabolomics of biological samples. Bioanalysis. 2017;9(1):53-65.
  31. Ioannidis M, et al. Analytical workflow for comprehensive blood metabolomics analysis by GC-MS: application to children with ventilator-associated pneumonia. J Chromatogr A. 2025;1753:465924.
  32. Kirwan JA, et al. Quality assurance and quality control reporting in untargeted metabolic phenotyping: mQACC recommendations for analytical quality management. Metabolomics. 2022;18(9):70.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מיקרו-דגימה של דםמיקרו-דגימה ספיגה נפחיתדגימות דם מיובשותמטבולומיקה לא מכוונתהכנת דגימותכרומטוגרפיה נוזליתספקטרומטריית מסותכרומטוגרפיה של גזיםדגימה מבוזרת

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.