מאמר שיטה

שיטה מבוססת עכבה בזמן אמת, ללא סימון, לסריקת תרופות אנטי-ויראליות בתסריף גבוה

0 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72539

⸱

3 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, 2Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, 3Department of Pathology, Microbiology and Immunology, 4Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

במאמר זה

סיכום

גישת ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA) המבוססת על עכבה (אימפדנס) מאפשרת כימות ללא סימון ובזמן אמת של אפקטים ציטופתיים המושרים על ידי וירוסים, ובכך מספקת שיטה מהירה להערכת תרכובים אנטי-ויראליים ונוגדנים מונוקלונליים באמצעות זרימת עבודה של בדיקה משולבת המונעת על ידי תוכנה.

תקציר

טכנולוגיות מבוססות עכבה (Impedance) מספקות אמצעי חסון ואובייקטיבי לכימות השפעות ציטופתיות (CPE) בשכבות Ein-cell של תרביות תאים, ובכך גוברות על המגבלות של בדיקות מסורתיות המבוססות על נקודת סוף או על הערכה ויזואלית סובייקטיבית. וירוסים ציטוליטיים משרים בדרך כלל שינויים מורפולוגיים בולטים ומוות תאי בתרביות מזוהמות, מה שהופך את מדידות העכבה, המשקפות שינויים בהיצמדות התאים, במורפולוגיה ובחיוניות, לאינדיקטור רגיש ודינמי לזיהום נגיפי ולהתקדמותו. כתוצאה מכך, קריאות מבוססות עכבה מציעות גישה עוצמתית ויעילה להערכת ההשפעות המגנות של התערבויות אנטי-ויראליות. מחקר זה מציג פלטפורמת סריקה בזמן אמת, ללא סימון (label-free), המנצלת מערכות מתקדמות למדידת עכבה כדי לנטר באופן רציף CPE המושרה על ידי וירוסים. גישה זו מאפשרת הערכה כמותית ומהירה של יעילות אנטי-ויראלית עבור תרופות של מולקולות קטנות וגם עבור נוגדנים מונוקלונליים, ללא צורך בשלבי סימון או צביעה נוספים. הפרוטוקול מפרט את זרימת העבודה המלאה של הבדיקה, החל מזריעת התאים והזיהום הנגיפי ועד לרכישת נתונים וניתוחם. יתרה מכך, התוכנה המשולבת במערכת, המותאמת במיוחד ליישומים בתחום הווירולוגיה, מייעלת את עיבוד הנתונים והפרשנות שלהם, ומקלה על קביעת עוצמת הסילוק של נוגדנים מונוקלונליים ועל פעילותם של תרכובות אנטי-ויראליות.

מבוא

בעת התמודדות עם איום של התפרצות נגיפית, חיסונים ותרופות נוגדות נגיפים מהווים את האסטרטגיות העיקריות להגבלת ההעברה הנגיפית ולטיפול בחולים נגועים1. חיסונים מונעים זיהום על ידי הכשרת מערכת החיסון לזיהוי פתוגנים ומספקים הגנה פרואקטיבית וארוכת טווח. לתרופות נוגדות נגיפים יש שימושים מגוונים התלויים במודליות ובמבנה התרופה. בדומה לחיסונים, נוגדנים מונוקלונליים יכולים לספק הגנה פרואקטיבית וממושכת (שבועות עד חודשים רבים) ויכולים לשמש גם ככלי לבקרה לאחר חשיפה. הן נוגדנים מונוקלונליים והן תרופות נוגדות נגיפים מולקולות קטנות משמשים לטיפול בזיהומים קיימים על ידי התמקדות ישירה או עיכוב של רכיבים נגיפיים, ובכך מפחיתים את חומרת המחלה ומשמשים כהתערבות תגובתית לטווח קצר.

הגישה המקובלת להערכה תפקודית של פעילות אנטי-ויראלית במערכות ביולוגיות היא מבחן נטרול להפחתת נגיפים (VRNT), המכמת הפחתות ביצירת פלאקים במבחני נטרול להפחתת פלאקים (PRNT), מוקדי זיהום via צביעה אימונוהיסטוכימית במבחן נטרול להפחתת מוקדים (FRNT), או אפקטים ציטופתים (CPE) באמצעות בדיקות המבוססות על חיוניות תאים. ה-PRNT נחשב לשיטה הפנוטיפית שהיא "סטנדרט הזהב" לקביעת הפעילות העיכובית של חומרים אנטי-ויראליים נגד מגוון רחב של זיהומים ויראליים2. עם זאת, ה-PRNT גוזל זמן ודורש עבודה מאומצת, ופירוש התוצאות עשוי להיות סובייקטיבי, במיוחד כאשר מתרחשת צמיחת יתר של פלאקים או התמזגות במהלך דגירה ממושכת. ניתן לשפר את האובייקטיביות של קריאת הבדיקה באמצעות FRNT, הנשען על זיהוי אנטיגנים ספציפיים לנגיף או ביטוי גן דגל. עם זאת, גישה זו עשויה להיות מוגבלת על ידי הזמינות והביצועים של נוגדנים או אנזימי זיהוי באיכות גבוהה. מספר ריאגנטים ופרוטוקולי בדיקה מבוססים ונפוצים להערכת חיוניות תאים, המודדים היבטים מסוימים של CPE. חיזור אנזימטי של ריאגנט הצבעי MTT (מלח מונו-טטראזוליום, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) על ידי דהידרוגנזות מיטוכונדריאליות בתאים חיים מייצר אות צבעי מדיד הנגרם מהתוצר הצבעוני פורמזאן. ריאגנט בדיקת החיוניות (המעמיד ליזיס של תאים ומשחרר ATP תוך-תאי המניע תגובה המזורזת על ידי לוסיפראז, הממירה את הסובסטראט לוסיפרין לאוקסילוסיפרין) הוא בדיקה לומניסנטית הומוגנית. בדיקות חיוניות תאים אלו יכולות לשמש לכימות הירידה ב-CPE במהלך סריקת חומרים אנטי-ויראליים3. עם זאת, שיטות אלו דורשות גם הן מספר שלבי שטיפה וצביעה, ובדומה לבדיקות PRNT ו-FRNT, הן מהוות בדיקות נקודת-סוף (endpoint assays). כתוצאה מכך, חומרים אנטי-ויראליים בעלי יעילות חלקית המפעילים השפעות מאוחרות על זיהום ויראלי עלולים להיעלם אם הבדיקה האנטי-ויראלית תסתיים בנקודת זמן שאינה אופטימלית. לפיכך, קיים צורך עז בבדיקה אוטומטית בעלת תפוקה בינונית עד גבוהה, המאפשרת ניטור בזמן אמת של תגובות תאיות לזיהומים ויראליים.

מערכות לניתוח תאים בזמן אמת (RTCA) מאפשרות ניטור רציף של התפתחות אפקט ציטופתי (CPE) ותגובות אנטי-ויראליות במודלים של תאים רגישים, באמצעות קריאת עכבה (impedance) שאינה פולשנית וללא סימון. CPE המושרה על ידי נגיפים כולל לא רק מוות של תאים, אלא גם שינויים במורפולוגיה ובאיחוז התאי, שכולם ניתנים לזיהוי רגיש באמצעות שינויים בעכבה החשמלית4,5. מדידות עכבה אלו מתקבלות באמצעות חיישני מיקרו-אלקטרודות מזהב המוטמעים בצלחת תרבית תאים ייעודית בעלת 96 בארות, המאפשרת הערכה כמותית של תגובות תאיות דינמיות ללא צורך בסימונים או בביטוי של גנים מדווחים. טכנולוגיית RTCA דווחה בהרחבה לזיהוי CPE במגוון מודלים של תאים המודבקים בנגיפים ממשפחות רבות, ועבור הערכת פעילות נטרול של נוגדנים6–10.

כאן מוצגים השלבים הקריטיים של שיטה זו, המבוססת על עכבה (אימפדנס), ללא סימון ובזמן אמת. במבחנה (in vitro) הוגדרו בדיקות אנטי-ויראליות. גישה זו התבססה על מחקרים קודמים שכללו סריקה של תרכובים אנטי-ויראליים בתאי HEK293A שהודבקו באדנווירוס 5 (adenovirus 5) והערכה של נוגדנים מנטרלים באמצעות וירוס סטומטיס וסיקולרי רקומביננטי בעל יכולת שכפול המבטא את הגליקופרוטאין של וירוס הלסה (rVSV-LASV(Lin IV)) בתאי Vero CCL-81.11כל הניסויים הללו בוצעו במערכת RTCA MP, התומכת בהרצה של עד 6× לוחיות בעלות 96 בארות בו-זמנית. מטרת עבודה זו הייתה להניח תשתית לסריקה אנטי-ויראלית מבוססת עכבה (impedance). ניתן להרחיב את השיטה בקלות למגוון רחב של מודלים של וירוס-תא, לאחר שיוגדרו תנאי בדיקה אופטימליים באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן.

פרוטוקול

הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים ומעבר תאים תומכים (Permissive)

הערה: בפרוטוקול זה, תאי Vero CCL-81 משמשים לנטרול נוגדנים, בעוד שתאי HEK293A משמשים לסריקה של תרכובות אנטי-ויראליות. כדי להפחית שונות בין ניסויים, מומלץ מאוד להכין בנק תאים של תאים רגישים (permissive cells) מאותו מעבר (passage) עבור הבדיקה.

  1. יש לחמם מראש את מצע גידול התאים — Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) מועשר ב-10% fetal bovine serum (FBS) ו-1% penicillin–streptomycin — במבחנה במכשיר חימום (water bath) בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
  2. יש להפשיר מבחנה של תאים פסיביים (permissive cells) קפואים במכשיר חימום בטמפרטורה של 37°C עד שנותר רק פיס קטן של גביש קרח; אין לטבול את הפקק במכשיר החימום. 
  3. יש להעביר את המבחנה המכילה את התאים שהוחזרו לחיים אל תוך קבינת בטיחות ביולוגית (BSC) לאחר ניגוב החלק החיצוני ב-70% ethanol.
  4. יש להעביר בעדינות את התאים למבחנה קונית חדשה של 50 mL ולהוסיף טיפה אחר טיפה 9 mL של מצע גידול חם לתאים. יש לערבב בעדינות.
  5. יש לסובב את תגלי התאים ב-200 × g למשך 5 min בטמפרטורת החדר (RT).
  6. יש להעביר את התאים המשוחזרים ב-5 mL של מצע גידול שחומם מראש לבקבוק T-25 חדש.
  7. יש לגדל את התאים עד להגעה ל-80%–90% confluency באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 לפני תתי-התרבית הבאים של התאים. 
  8. ביצוע מעבר (Passage) לתאים.
    1. יש לשאוב את המצע ולשטוף בעדינות את שכבת התאים (cell monolayer) פעמיים עם 3 mL של 1× calcium- and magnesium-free Phosphate-Buffered Saline (PBS) כדי להסיר שאריות של מצע הגידול.
    2. יש להוסיף לבקבוק 2 mL של 0.25% trypsin-EDTA לכיסוי התאים.
    3. לאחר 2–5 min של דגירה בטמפרטורה של 37°C, יש לנטרל את ה-trypsin על ידי הוספת נפח פי 5 של מצע גידול שחומם מראש.
    4. יש לשחזר את התאים על ידי פיפוט עדין של תגלי התאים למעלה ולמטה כנגד דופן הבקבוק.
    5. יש לזרוע את התאים בצפיפות הזריעה הרצויה או ביחס הפיצול הרצוי עם מצע טרי. 
      הערה: צפיפות זריעת התאים הרצויה נקבעת באופן אמפירי לפי קצב גידול התאים, תדירות המעבר (passage) וה-confluency המטרה בזמן ביצוע המעבר. לדוגמה, זריעה של תאי Vero CCL-81 בצפיפות מינימלית של 0.4 × 104 cells/cm2 מאפשרת לבצע מעבר לתאים מדי 3 ימים לפני הגעתם ל-90% confluency.

2. סריקת חומרים אנטי-ויראליים

הערה: איור 1 ממחיש את זרימת העבודה של בדיקת הסריקה האנטי-ויראלית המבוססת על עכבה (impedance). בקצרה, תאים חדירים (permissive cells) נזרעים לתוך מיקרו-פלטות בעלות 96 בארות המשלבות מיקרו-אלקטרודות, וביצועי התאים מנוטרים למשך כ-24 שעות לפני הבדיקה. עבור בדיקות נטרול נוגדנים, וירוסים בריבוי הדבקה (MOI) קבוע מערבבים עם נוגדנים ועוברים דגירה מוקדמת למשך שעה אחת לפני הוספתם לתאים. לעומת זאת, בסריקה של תרכובות אנטי-ויראליות, וירוסים ב-MOI קבוע ותרכובות מתווספים לתאים בו-זמנית. אפקט ציטופתי וירוסלי (CPE) מנוטר באופן רציף באמצעות קריאות המבוססות על עכבה, וניתן לבצע ניתוח נתונים במהלך הבדיקה או לאחר השלמתה.

  1. יום 0: מדידת רקע של הפיתח והזריעה של תאים מתירים (permissive cells)
    1. כדי להתחיל בניסוי, פתחו את התוכנה של המכשיר (RTCA Pro) ובחרו את המעמד הרצוי עבור הבדיקה. לאחר מכן, בחרו את ה- וירוסולוגיה מודול לפני תחילת הניסוי.
    2. הזן כל הערה רלוונטית ב- הערות ניסוי לשונית (למשל, שם הניסוי, מספר סידורי של המכשיר, סוג המכשיר, או פרטים רלוונטיים אחרים). שדות אלו הם רשות וניתן להשאירם ריקים אם אינם רלוונטיים.
    3. נווט אל ה- פריסה סמנו והגדירו את הבארות המשמשות לניסוי. אם בארות מסוימות לא יהיהו בשימוש, בחרו את הבארות שאינן בשימוש, לחצו לחיצה ימנית בתוך ממשק פריסת הפלטה ובחרו ב- כיבוי באר/בארי מהתפריט הנפתח כדי להחריגם מהבדיקה.
    4. מדידת הרקע של פלטת מיקרו בעלת 96 בארות עם מיקרו-אלקטרודות משולבות
      1. הנפק / דלול / העבר (בהתאם להקשר המעבדתי) 50 µL של מצע הבדיקה לכל באער בלוח באמצעות פיפט רב-ערוצי במצב שאיבה הפוכה (reverse pipetting) כדי למזער היווצרות בועות.
        הערה: יש לבצע אופטימיזציה של בחירת מצע הבדיקה לפני הסריקה כדי למזער הפרעות לרגישות הבדיקה ולהבטיח הערכה מדויקת של יעילות הטיפול. לדוגמה, בדיקות נטרול נוגדנים בוצעו ב-DMEM המכיל 2% FBS ו-1% פניצילין-סטפטרומיצין, בעוד שבבדיקות סריקה של תרכובות אנטיויראליות נעשה שימוש במצע גידול תאים, DMEM המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטפטרומיצין.
      2. הנח את הפלטה אל תוך תושבת המכשיר הממוקמת בתוך ה- 37 °C אינקובטור עם 5% CO22וודאו כי הפלטה מונחת בכיוון הנכון, כאשר באר A1 ממוקמת כפי שצוין. לאחר מכן, בדקו את לשונית ההודעות (Message) לאיתור התראות על שגיאות.
        הערה: בכל פעם שהצלחת מונחת במעמד, ודאו כי מופיעה ההודעה "Plate scanned. Connections okay". אם מופיעה שגיאה, הוציאו את הצלחת והניחו אותה שוב במעמד.
      3. נווט אל ה- לוח זמנים לשונית; שלב 1 מופיע כברירת מחדל, כיוון שהוא שלב נדרש למדידת רקע הפלטה. לחצו על ה- התחלה לחצן להפעלת הקלטה מהבארות. השלב מסתיים באופן אוטומטי לאחר שנמדדה מדידה בודדת של עכבה ברקע.
        הערה: יש לבצע שלב רקע זה לפני כל ניסוי. כל הבארים המשמשות בניסוי צריכות להכיל רק את מצע הבדיקה (כלומר, לפני זריעת התאים).
    5. זריעת תאים במצב מאפשר (Permissive) לתוך פלטה בעלת 96 בארות עם מיקרו-אלקטרודות משולבות
      1. בצעו טריפסינציה לתאי התאימות (permissive cells) בבקבוק ה-T25, בהתאם לשלבים המתוארים בסעיף העברת תאי התאימות.
      2. ספרו את התאים שהושהו מחדש במדיום הבדיקה ובצעו את החישובים הבאים:
        1. חשב את המספר הכולל של תאים חיוניים בתמיסתו בעזרת צפיפות התאים החיוניים: מספר תאים חיוניים כולל = צפיפות תאים חיוניים × נפח התסמיך
        2. התאימו את תרחיף התאים לצפיפות סופית (למשל, 0.30–0.35 × 106 תאים/מ"ל עבור Vero CCL-81, שווה ערך לכ-15,000–18,000 תאים ל- 50 µL, או 0.12 × 106 תאים/מ"ל עבור HEK293A, שווה ל-6,000 תאים ל- 50 µL).
          הערה: צפיפויות זריעה אלו נקבעו בעבר כאופטימליות עבור כל מודל של וירוס–תא. צפיפות זריעה נכונה של התאים היא חיונית, שכן שימוש במספר רב מדי או מעט מדי של תאים עלול להשפיע על רגישות הבדיקה.
      3. הוצא את הפלטה המכילה 50 µL של מצע הבדיקה מהמכשיר והעבר אותו לתא הבטיחות הביולוגית (BSC) לצורך זריעת תאים.
      4. העבר/העבר/הנפק (בהתאם להקשר: העברת נוזל/חומר או הנפקת תרופה) 50 µL של תרחיף התאים לכל באער בלוח באמצעות פפיטה רב-ערוצית במצב פפיטה הפוכה (reverse pipetting) כדי למזער היווצרות בועות, כך שהנפח הסופי בכל באער יהיה 100 µL.
    6. לאחר הוספת התאים, השאירו את הפלטה בתוך קב不可נט הסטרטילי (BSC) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, כדי לאפשר התפלגות אחידה של התאים בתחתית כל באר.
    7. החזירו את הפלטה למעמד המכשיר הנמצא בתוך ה- 37 °C אינקובטור עם 5% CO22.
      הערה: אם נעשה שימוש במספר פלטות, יש לסמן כל פלטה בבירור ולהבטיח שהיא תחזור לאותו מעמד ששימש במהלך מדידת הרקע.
    8. נווט אל ה- פריסה לחצן ופתח את ה- תא לשונית משנית. בחרו את הבארים המתאימות, הזינו את התאי המאפשרים שם ו- מספר, ולחץ על יישום על מנת לשמור את המידע. ניתן להזין או לעדכן מידע על התאים בכל שלב במהלך הניסוי.
    9. הוסף את שלב 2 ב- לוח זמנים לשונית תוך שימוש בהגדרות ההקלטה ברירת המחדל (100 סריקות והפסקה של 15 דקות), ולאחר מכן לחצו על התחל כדי להתחיל ניטור רציף של היצמדות תאים ושגחה במהלך הלילה.
      הערה: שלב זה משמש כמדד לבקרת איכות (QC) של התאים לפני ההדבקה בנגיף. מכיוון שמדד התאים (Cell Index - CI) משקף את היצמדות התאים ואת השגשוגם, ערכי ה-CI המתקבלים במהלך תקופת 18–24 השעות לאחר הזריעה משמשים כמטריקת בקרת איכות מרכזית. התנהגות תאים עקבית בין ניסויים שונים חיונית להשגת הדירות אופטימלית של הבדיקה. ראוי לציין כי הן אמפליטודת ה-CI והן פרופילי הקינטיקה הם ספציפיים לסוג התא. לדוגמה, לאחר תרבית לילה, תאי Vero CCL-81 בריאים שנזרעו בריכוז של 18,000 תאים לבאר מציגים בדרך כלל מדד תאים של 6–8, בעוד שתאי HEK293A בריאים שנזרעו בריכוז של 6,000 תאים לבאר מציגים בדרך כלל מדד תאים של 0.8–1.2.
  2. יום 1: סריקת חומרים אנטי-ויראליים מבוססת עכבה (אימפדנס)
    הערה: לפני ביצוע בדיקת הסריקה, יש לבצע טיטרציה מתאימה של הווירוס כדי לקבוע את מהולל העבודה האופטימלי. שלב זה קובע ריכוז וירוס התומך בביצועי בדיקה חזקים וניתנים לשחזור, תוך עמידה בדרישות המוגדרות על ידי המשתמש, כגון משך הזמן הרצוי לבדיקה. לדוגמה, בפרוטוקול לנטרול נוגדנים11נבחרה ריבוי זיהום (MOI) של 0.01 עבור בדיקת הניטרול, מאחר שהדבר הוביל להשפעה ציטופתית (CPE) מלאה (100%) בתוך 40 שעות לאחר ההחדרה. בבדיקה המבוססת על עכבה (impedance), CPE מלאה מודגשת על ידי ירידה של מדד התאים (Cell Index) או מדד התאים הנורמל (Normalized Cell Index) לאפס. במהלך סריקת תרכובות אנטי-ויראליות נעשה שימוש ב-MOI של 1, ונצפתה CPE של 100% בתוך 70 שעות לאחר ההחדרה. פרוטוקול תיתוּר הנגיף בוצע על פי נהלים מבוססים שתוארו בדו"ח קודם.12במידה ונעשה שימוש בנגיפים זיהומיים בבדיקה, ודאו שכל אמצעי הבטיחות הרלוונטיים מיושמים. עיינו בסעיף ההנחיות לבטיחות בטיפול בנגיפים זיהומיים.
    1. הכינו את הנגיף בריכוז שנקבע מראש והכינו דילולים סדרתיים של הנוגדן או של התרכובת האנטי-ויראלית במדיום הבדיקה.
    2. עבור בדיקות נטרול של נוגדים מונוקלונליים, ערבב 60 µL של נגיף ב-4× ריכוז הבדיקה הסופי עם 60 µL של נוגדן בריכוז 4× הריכוז הסופי של הבדיקה והדגירה ב- 37 °C במשך שעה אחת לפני ההוספה לתאים החדירים (permissive cells). לאחר הערבוב, הווירוס והנוגדן נמצאים ב-2× ריכוזי הסופיים שלהם במבחן. לעומת זאת, במסכי בדיקה של תרכובות אנטי-ויראליות, אין צורך בדגירה מוקדמת של הווירוס והתרכובת.
    3. נווט אל ה- פריסה לחץ על לשונית ובחר את ה- טיפול לשונית משנית להזנת מידע על הטיפול בחומרים אנטי-ויראליים בבארים המתאימות.
    4. בחרו את הבארים עבור אותו טיפול, ולאחר מכן הזינו את ה- שם של הסוכנים והזן את נקודת ההתחלה דילול או ריכוזלדוגמה, אם ריכוז ההתחלה הוא 10 µg/mLהכנס/י 10 ובחר µg/mL כ-"יחידה. הזן 3 ככל ש- מקדם דילול וציינו את ה- כיוון של דילול (למשל, מלמעלה למטה).
      הערה: לאחר לחיצה על החלף / יישם, ריכוזי הסוגנים האנטי-ויראליים או הדילולים שלהם יחושבו וישמרו באופן אוטומטי על בסיס פריסת הפלטה שהוזנה, ויוצגו בבארות המתאימות. הערכים שחושבו נשמרים גם לצורך ניתוח נתונים מאוחר יותר. הזנת מידע על הוירוס (למשל, שם ו- דילול) הוא אופציונלי, שכן הבדיקה משתמשת ב-MOI קבוע יחיד עבור כל הבארים שעובדו עם נגיף.
    5. הגדירו את הבארים שעברו טיפול בנגיף בלבד כביקורות חיוביות על ידי בחירת הבארים המתאימות ובחירה ב... ביקורת חיובית מתחת סוג באר.
    6. הגדירו בארות שאינן נגועות כביקורות שליליות על ידי ביצוע השלב שתואר לעיל ובדיקה ביקורת שלילית מתחת סוג באר.
      הערה: הקצאה נכונה של בארות המכילות וירוס בלבד ובארות שאינן מזוהמות כ- ביקורת חיובית ו- בקרה שלילית, בהתאמה, באמצעות ה- סוג הבאר הגדרת המערך היא קריטית, שכן ערכי ה-CI מבארים אלו משמשים בכל החישובים הקשורים לסנטרליזציה (למשל, %Neutralization). עבור חישובים הקשורים ל-CPE (למשל, %CPE), נדרשות בארות שהוגדרו במפורש כבקרה שלילית. עבור בדיקות נטרול נוגדנים, מומלץ מאוד לכלול הן נוגדני בקרה חיוביים והן נוגדני בקרה שליליים באותה פלטה, כדי להבטיח פרשנות מדויקת של הנתונים. עם זאת, נוגדני בקרה אלו צריכים להיות מוגדרים כ- דגימות מתחת סוג באר.
    7. כאשר הבדיקה מוכנה להוספת החומר האנטי-ויראלי, לחץ על ה- בטל שלב נוכחי לחצן לדלג על שאר הסריקות בשלב 2 ולהמשיך לשלב הבא.
    8. לחץ על ה- שחרור פלטה לחצן, ולאחר מכן הוצא את הפלטה מהמעמד והנח אותה ב-BSC.
    9. הסבב בעדינות / העבר בעדינות 100 µL של תערובת הווירוס–נוגדן או תערובת הווירוס–תרכובת נוגדת-ווירוסים לכל באער באמצעות פיפטה רב-ערוצית, כך שנפח הבאר הסופי יהיה 200 µLהאינוקולום מכיל וירוס ונוגדן או תרכוב אנטי-ויראלי בריכוז 2× ריכוזי המסה הסופיים שלהם, המדוללים לריכוזי העבודה הסופיים עם הוספתם לתאים.
    10. לאחר החזרת הפלטה למעמד, נווט אל ה- לוח זמנים לחצן tab והוסף שלב 3. הגדר את מספר ה- סריקות ו-"ה- אינטרוואל (Interval)בין סריקות. ודאו שמשך הסריקה הכולל (מספר הסריקות × (מרווח) עולה על משך הטיפול הצפוי. לחץ על התחלה כדי לחדש את איסוף הנתונים ולהמשיך בניסוי.
      הערה: הגדרת שלב נפרד (לדוגמה, שלב 3) לאחר הוספת החומר נוגד הנגיפים מקלה על זיהוי תקופת הניטור שלאחר הטיפול. תכננו תמיד כל שלב (למעט שלב 1) כך שירוץ למשך זמן ארוך יותר ממשך הבדיקה הצפוי. אם יושג זמן הריצה המתוכנן, המכשיר יפסיק לרכוש מדידות, דבר שיוביל לאובדן נקודות נתונים.
  3. יום 1 ואילך: ניתוח נתונים
    1. כדי לבחון את ההקלטה בזמן אמת ו/או את הניתוח של תגובות תאיות במהלך רכישת הנתונים, נווט אל ה- ניתוח נתונים לשונית, בחרו נקודת זמן ספציפית או מרווח זמן, ולאחר מכן בחרו והוסיפו את הבארים שיכלול הניתוח להצגה על גרף התרשים.
    2. בחר פרמטרים מה- ציר Y תפריט נפתח. כאשר מדד תאים מנורמל (Normalized Cell Index) במידה ונבחר (NCI), הגדירו את ה- זמן נורמליזציה, נקודת הזמן מיד לפני הטיפול, מרשימת הדרופ-דאון (dropdown) של הזמן. %CPE או %ניטרול ניתן להציג זאת גם על ידי בחירת האפשרות המתאימה מהתפריט הנפתח של ציר ה-Y.
      הערה: המכשיר משתמש בפרמטר חסר יחידות, מדד תאים (Cell Index - CI), כדי לייצג עכבה (impedance). מומלץ להשתמש במדד תאים מנורמל (Normalized Cell Index - NCI) להערכת הבדלים בטיפולים תוך מזעור ההשפעה של שונות טבעית בין באריות.
    3. נווט אל ה- פרמטר חלק על ה- ניתוח נתונים לשונית לחישוב ולהפקה של סוגים שונים של איורים, כגון תרשים עמודות ועקומות תגובה למספר (dose-response) של רגרסיה לוגיסטית בעלת 4 פרמטרים (4PL, שיפוע משתנה) בנקודת זמן ספציפית (למשל, בנקודת האמצע או בסוף הבדיקה). לחלופין, ה-IC₅₀ מדד המופק מהשטח תחת העקומה (AUC) של מדד התא (Cell Index) או מדד התא המנורמל לאחר הטיפול, מספק מדד לתגובה הכוללת למינון של חומרים אנטי-ויראליים לאורך תקופת הטיפול.
    4. בסיום הבדיקה, לחץ על השהיהלאחר מכן, לחץ על ה- שחרור פלטה לחצן. הוציאו את הפלטה מהמעמד ובאופן אלקטרוני שחרור זה באמצעות ה- פיתח תפריט

3. הנחיות בטיחות לטיפול בנגיפים מידבקים

  1. הלבשו ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, הכולל כפפות כפולות, מגן פנים וחלוק מעבדה. הדבר מומלץ מאוד בעת עבודה עם וירוסים.
  2. טפלו בחומרים המכילים וירוס והוסיפו אותם לצלחות אך ורק בתוך תא בטיחות ביולוגית (BSC) פעיל.
  3. העבירו את מבחנאות הווירוס וכל צלחת המכילה וירוסים אל תא הבטיחות הביולוגית וממנו בתוך נשאי בטיחות ביולוגית אטומים.
  4. לפני ואחרי טיפול בחומרים המכילים וירוס בתוך תא הבטיחות הביולוגית, רססו היטב את כל המשטחים הפנימיים בחומרי חיטוי והמתינו 5 min של זמן מגע כדי להבטיח השבתה וירוסית מלאה. נגבו את המשטחים עד לניקיון ולאחר מכן חטאו אותם ב-70% ethanol כדי להסיר שאריות של חומרי חיטוי.
  5. עם השלמת בדיקת הסריקה האנטי-ויראלית מבוססת העכבה (impedance), הוציאו את כל הצלחות מהמכשיר והעבירו אותן באמצעות נשאי בטיחות ביולוגית אטומים ישירות לתוך תא בטיחות ביולוגית נקי.
  6. הכינו תמיסת אקונומיקה (bleach) טרייה בריכוז 20% והוסיפו לכל באר בצלחות הבדיקה. המתינו 10 min לפני שאיבת הנוזלים מכל הבארים והשלכת הצלחות.
  7. בצעו דקונטמינציה לכל צלחות הבדיקה, הפיפטות הסרולוגיות, טיפי הפיפטה, המבחנות וכל פלסטיקה חד-פעמית אחרת שייתכן ובאה במגע עם הווירוס באמצעות אקונומיקה, והשליכו אותן לשקיות פסולת ביולוגית מסומנות.
  8. רססו פלסטיקה שאינה חד-פעמית, כגון רסקי מעבדה לפיפטות, בחומרי חיטוי ונגבו אותם.

תוצאות

קריאת עכבה (impedance) בזמן אמת ללא סימון חושפת CPE המושרה על ידי וירוס והגנה אנטי-ויראלית
כפי שמוצג ב-Figure 2A, תאי מאכסן HEK293A נזרעו בלוח 96 בארות עם מיקרו-אלקטרודות משולבות בצפיפות של 6,000 תאים לבארה13. לאחר דגירה של 24 שעות, הוסף אדנו-וירוס מסוג 5 ב-MOI של 1 בנוכחות או בהיעדר תרכובות אנטי-ויראליות. תגובות תאיות לזיהום ויראלי ולטיפול אנטי-ויראלי נוטרו באופן רציף באמצעות מדידות עכבה בזמן אמת ללא סימון. בהיעדר הווירוס, התאים התרבו באופן רציף לאורך תקופת הניטור של 80 שעות, והגיעו למצב של התמזגות (confluence) כפי שעולה מעלייה עקבית בעכבה ואחריה מישור (plateau). זיהום באדנו-וירוס אפשר בתחילה צמיחה תאית למשך כ-20 שעות, שלאחר מכן נצפה CPE בולט, שהוביל לירידה מהירה של אות העכבה לרמת הבסיס עד כ-65 שעות לאחר הזיהום. לטיפול ב-stavudine (50 µM) או ב-ribavirin (20 µM) הייתה השפעה מינימלית על ה-CPE המושרה על ידי הווירוס, כאשר עקומות העכבה דמו מאוד לאלו של תאים שזוהמו בווירוס בלבד. Ganciclovir (50 µM) הפגין פעילות אנטי-ויראלית מתונה, כפי שהוכח על ידי התאוששות חלקית של ה-Normalized Cell Index. לעומת זאת, cidofovir (50 µM) ו-brincidofovir (1 µM) החלישו באופן ניכר את ה-CPE, והפיקו פרופילי עכבה הדומים לאלו שנצפו בתאי ביקורת שליליים שאינם מזוהמים. ראוי לציין כי אף אחת מהתרכובות לא השפיעה באופן משמעותי על ה-Cell Index בהשוואה לביקורות שטופלו בנשא (vehicle) בריכוזים שנבדקו במחקרים מקדימים (נתונים לא מוצגים).

בבדיקת נטרול נוגדנים מבוססת עכבה (impedance), תאי Vero CCL-81 נזרעו בצפיפות של 18,000 תאים לבאר בתוך פלטה בעלת 96 בארות עם מיקרו-אלקטרודות משולבות, וגודלו למשך 24 h לפני ההדבקה. ביום הבדיקה, נוגדנים מונוקלונליים עברו דגירה מוקדמת עם rVSV–LASV בריכוז MOI של 0.01 למשך 1 h לפני הוספתם לתאים. נצפו פרופילי נטרול שונים בין הנוגדנים המונוקלונליים (mAbs) שנבדקו. לצורך ההמחשה, איור 2B מציג תוצאות מייצגות של נוגדנים שהפגינו פעילות נטרול חזקה, חלקית או חסרה. נוגדנים שאינם מנטרלים גרמו ל-CPE מלא, כאשר עקומות העכבה חפפו לאלו של בקרות הווירוס בלבד. נוגדנים בעלי פעילות נטרול בינונית הפחיתו באופן חלקי את הציטוטוקסיות המושרה על ידי הווירוס, מה שהוביל ל-CPE מופחת אך גילוי. לעומת זאת, נוגדנים מנטרלים באופן מלא עיכבו לחלוטין את ה-CPE, ושמרו על אותות עכבה הדומים לבקרות של תאים שאינם מדובקים. יחד, פרופילי עכבה אלה אפשרו בידול ברור בין נוגדנים מונוקלונליים שאינם מנטרלים, מנטרלים חלקית ומנטרלים באופן מלא.

כימות ואפיון של פעילות אנטי-ויראלית
לאחר שהוכשרו את יכולתו של מבחן ה-RTCA מבוסס העכבה (impedance) לזהות "פגיעות" (hits) מתוך ספרייה של תרופות ונוגדנים חד-סגמיים (mAbs), ביקרה המחקר בשלב הבא לאפיין את היעילות של התרכובות והנוגדנים המובילים. העלייה ההדרגתית בריכוזו של התרופה האנטי-ויראלית brincidofovir מ-15.6 nM ועד 1,000 nM גורמת לעלייה מדורגת באות העכבה; ככל שריכוז התרופה גבוה יותר, כך התנהגות התאים דומה יותר לזו של ביקורת הבלתי-מודבקת (איור 3Aבנוסף, טיפול ב-brincidofovir לבדו הוביל לעלייה שולית ב-NCI רק בריכוז הגבוה ביותר שנבדק (1100 nM). עם זאת, בריכוזים נמוכים מ-1100 nM, ה-NCI ירד באופן מתון, אם כי השפעה זו לא הייתה תלויה במינון. תוצאה זו מעידה כי ההתאוששות של מדד התאים (Cell Index) נבעה אך ורק מהפעילות האנטי-ויראלית של התרופה ולא מהגברה ישירה של התרבות או היצמדות התאים (איור 3Bשרטוט השטח תחת מדד התאים הנורמלי (AUC) כפונקציה של ריכוז ה-brincidofovir מניב את עקומת התגובה למינון, המספקת התאמה מצוינת (R2 של 0.99) ומעיד על IC50 של 265 nM (איור 3C). במבחן נטרול הנוגדנים, בסיום המבחן (כ-50 שעות לאחר הטיפול), תוכנת המערכת חישבה באופן אוטומטי את אחוזי הנטרול בכל ריכוז של mAb, ואת ה-IC50 הערכים נגזרו לאחר מכן. כפי שמוצג ב- איור 3Dבניגוד לנוגדן הבקרה השלילית rANDV-5, שלושת ה-mAbs האחרים, r37.2D, r25.1C ו-r12.1F, הדגימו יעילות אנטי-ויראלית גבוהה, עם IC₅₀ ערכים של 4,315 ng/mL, 83 ng/mL או 232 ng/mL, בהתאמה14,15.

figure-results-1
איור 1: איור סכימטי של זרימת העבודה עבור בדיקת סריקה אנטי-ויראלית המבוססת על עכבה (impedance). יום 0, שלב 1: תאים רגישים (permissive cells) נזרעו לתוך מיקרו-פלטות, וצמיחת התאים נוטרה במעמד המכשיר בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2 למשך כ-24 שעות. יום 1, שלב 2: הוכן הנגיף ב-MOI קבוע ודילולים סדרתיים של סוכנים אנטי-ויראליים. עבור בדיקות ניטרול נוגדנים, הנגיף עבר דגירה מוקדמת עם נוגדנים ב-37 °C למשך שעה אחת לפני הוספת התערובת לתאים. שלב 3: תערובות של נגיף וסוכנים אנטי-ויראליים נוספו לתאים. יום 1 ומכאן ואילך, שלב 4: ה-CPE המושרה על ידי הנגיף נוטר באופן רציף באמצעות מדידות מבוססות עכבה לאורך מספר ימים. שלב 5: הנתונים נותחו בזמן אמת או לאחר השלמת הבדיקה. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2ניטור בזמן אמת של פעילות אנטי-ויראלית באמצעות מדידות מדד תאים (Cell Index) מבוסס עכבה. (Aסריקת תרופות אנטי-ויראליות שנבחנה באמצעות אנליזה של עכבה. כל התרכובות נבחנו ב- 50 µM, למעט ריבבירין (20 µM) וברינסידופוביר (1 µM) בנוכחות אדנו-וירוס מסוג 5 בריבוי זיהום (MOI) של 1. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן משלוש בארות חזור. האיור מותאם מ-Zhang et al.13. (B) בדיקת נטרול של נוגדנים מונוקלונליים מבוססת עכבה (Impedance). מוצגים פרופילי מדד תאים (Cell Index) מייצגים עבור נוגדנים מונוקלונליים המראים היעדר נטרול (CPE מלא, אדום), נטרול חלקי (CPE חלקי, כתום), או נטרול חזק (ללא CPE גלוי, שחור). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: כימות של פעילות אנטי-ויראלית באמצעות עכבה (impedance). (A) שינויים דינמיים של מדד תאי מנורמל (Normalized Cell Index) בזמן אמת בעקבות טיפול בריכוזים עולים של brincidofovir בשילוב עם זיהום של adenovirus type 5 ב-MOI של 1. (B) שינויים דינמיים של מדד תאי מנורמל בזמן אמת בעקבות טיפול בריכוזים עולים של brincidofovir בלבד. (C) השטח תחת עקומות העכבה שורטט כפונקציה של brincidofovir כדי להפיק עקומת תגובה-מנה. (A) ו-(C) הותאמו מתוך Zhang et al.13. (D) עקומות ניטרול מייצגות של rVSV–LASV Lineage IV (Josiah) עבור הנוגדנים המונוקלונליים r37.2D, r25.1C, r12.1F, כאשר rANDV-5 נכלל כביקורת שלילית. הנוגדנים המונוקלונליים 37.2D, 25.1C, 12.1F ו-ANDV-5 הופקו באופן רקומביננטי על בסיס ספרות קיימת (ראו פרק תוצאות). הנתונים המוצגים הם עקומות מייצגות משני ניסויים בלתי תלויים ומדווחים כממוצע ± SD משלוש בארות חוזרות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

בדומה לכל הבדיקות מבוססות התאים, בדיקת הסריקה האנטי-ויראלית בשיטת RTCA דורשת אופטימיזציה עבור כל מערכת של נגיף–תא. מכיוון שהבדיקה מזהה CPE המושרה על ידי נגיף באמצעות שינויים בעכבה (impedance), היא תלויה במודל תאים חדיר התומך בשכפול נגיפי וב-CPE מדיד. נגיפים שאינם יוצרים CPE שניתן לגלות באמצעות עכבה עשויים שלא להתאים לגישה זו; במקרים כאלה, ניתן להשתמש בשיטות חלופיות כגון FRNT כאשר קיימים נוגדנים ספציפיים לנגיף. שיקול חשוב נוסף הוא ששינויים ב-Cell Index אינם נגרמים אך ורק מציטוליזה המושרית על ידי נגיף. שינויים במורפולוגיה של התאים, בהיצמדות, בשגשוג ובקיבוע יכולים גם הם להשפיע על אותות העכבה ועלולים להטעות את הערכת הפעילות האנטי-ויראלית. לכן, יש להעריך את ההשפעות של סוכנים אנטי-ויראליים על ה-Cell Index במחקרי מקדמים או באמצעות בקרים מתאימים של סוכן בלבד. במחקר הנוכחי, כדי למקסם את מספר הסוכנים המוערכים לכל פלטה, נבחנו בקרים של סוכן אנטי-ויראלי בלבד לפני בדיקת הסריקה, כדי לקבוע את השפעות הבסיס של כל מועמד בהיעדר זיהום נגיפי. ביצועי הבדיקה מושפעים גם מגורמים כגון צפיפות זריעת התאים, עיתוי ההדבקה בנגיף ותנאי המצע, העלולים להשפיע על גדילת התאים, השכפול הנגיפי, התפתחות ה-CPE והשחזור של הבדיקה7,10,16. כתוצאה מכך, אופטימיזציה שיטתית היא חיונית לסריקה אנטי-ויראלית חסונה ואמינה המבוססת על RTCA.

לאחר קביעת תנאי הבדיקה האופטימליים, יישום מוצלח של בדיקות אנטי-ויראליות בזמן אמת מבוססות עכבה (impedance) מחייב זריעה עקבית של תאים, תאים בריאים ותנאי בדיקה יציבים. שונות גבוהה בין בארות נגרמת לרוב מחלוקה לא אחידה של תאים או מפיפוט לא מדויק; לכן, יש לערבב תרחיפי תאים ביסודיות לפני הזריעה, ויש להשאיר את הפלטות ב-RT למשך 30 דקות לאחר הזריעה כדי לעודד שקיעה אחידה של התאים ולהפחית אפקטי שוליים. מומלץ להשתמש בשלוש חזרות לפחות עבור כל טיפול, ומומלץ מאוד להוסיף חזרות עבור בקרות שליליות (לא מזוהמות) וחיוביות (וירוס בלבד), שכן ערכים אלו משמשים כנקודות ייחוס לחישוב %CPE ו-%Neutralization בכל תנאי הטיפול. אם ה-CPE המושרה על ידי הווירוס הוא חלש או לא עקבי, יש לוודא את איכות מלאי הווירוס ואת בריאותן של התאים הרגישים. כדי לשמור על זיהומיות ויראלית, יש להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים על ידי הכנת מנות (aliquots) של וירוס לשימוש חד-פעמי עבור כל ניסוי. לבסוף, מומלץ מאוד להשתמש בבנק תאים המכיל תאים רגישים במספר מעבר (passage number) עקבי, כדי למזער שונות ניסויית ולשפר את השחזור של הבדיקה. אם ה-Cell Index שנמדד מיד לפני ההדבקה (בדרך כלל כ-24 שעות לאחר הזריעה) נמוך מהמדד שנקבע עבור סוג התאים הרגישים, דבר המעיד על בריאות או צמיחה תת-אופטימלית של התאים, יש להפסיק את הניסוי. במקרים כאלה, יש להפשיר מבחנה חדשה של תאים קריופרסרביים ולחזור על בדיקת הסריקה האנטי-ויראלית.

כאשר בדיקת הסריקה האנטי-ויראלית מבוצעת תחת תנאים אופטימליים ובקרים היטב, כפי שמוצג בנתוני הסריקה כאן, הבדיקה המבוססת על עכבה (impedance) יכולה לכמת במדויק ובזמן אמת את ההפחתה של CPE על ידי סוכנים אנטי-ויראליים. בניגוד לגישות מסורתיות המסתמכות על מדידות נקודת-סוף (endpoint) הת demand עבודה מאומצת, קריאת העכבה הרציפה והלא-פולשנית מאפשרת ניטור אורך של מלוא קשת הנזק התאי המושרה על ידי הווירוס ושל הפרופילים הקינטיים של התגובות האנטי-ויראליות. יכולת מדידה זו בזמן אמת מקלה על זיהוי חלונות זמן אופטימליים לגילוי השפעות אנטי-ויראליות, לא רק אלו הפועלות בשלב מוקדם אלא גם אלו שמופיעות בעיכוב, אשר בדיקות נקודת-סוף קונבנציונליות עלולות להחמיץ.

יתרה מכך, פרוטוקול ה-RTCA המתואר כאן מספק זרימת עבודה מהירה ופשוטה משמעותית לסריקת חומרים אנטי-ויראליים בהשוואה לשיטות מסורתיות. הבדיקה דורשת רק שלב ראשוני של זריעת תאים, ולאחריו הוספת נגיף בנוכחות או בהיעדר סוכנים אנטי-ויראליים. אין צורך בטיפול נוסף או בעיבוד לאחר הבדיקה. ההגדרה הניסיונית וניתוח הנתונים מופשטים עוד יותר באמצעות מודול תוכנת ה-Virology המותאם אישית של המערכת, המאפשר חישוב אוטומטי של פרמטרים הנפוצים ב-VRNT, כולל %CPE, %neutralization, והדילול הגבוה ביותר או הריכוז הנמוך ביותר של סוכן אנטי-ויראלי המשיג רמת נטרול המוגדרת על ידי המשתמש. יחד, יתרונות אלו מאפשרים סריקה מהירה ומקבילה של הרבה יותר תנאי בדיקה (השוואות תרופות, דילולים מורחבים וכו') מכפי שניתן בדרך כלל להשיג באמצעות שיטות מסורתיות.

אף על פי שהבדיקה המתוארת כאן פותחה בפורמט של פלטה בעלת 96 בארות, עם תנאי הבדיקה המתאימים המתוארים לעיל, ניתן להתאימה לפורמט של פלטה בעלת 384 בארות. כדי לתמוך בבדיקה זו, המבוססת על עכבה ובעלת תפוקה גבוהה יותר, ניתן להשתמש במערכת RTCA אוטומטית מבוססת עכבה, המאפשרת עיבוד סימולטני של עד ארבע פלטות בעלות 384 בארות.

מעבר לסריקת תרופות אנטי-ויראליות, ניתן ליישם שיטת RTCA זו במחקרי טיפול משולב, בסרולוגיה ובחקירה של בריחה חיסונית ויראלית. באמצעות מדידת היכולת של נוגדנים טיפוליים או סרומי חיסון למנוע CPE מושרה-ויראלי, הבדיקה מספקת הערכה בזמן אמת, ללא סימון, של פעילות נטרול ותגובות חיסוניות מגינות לאחר זיהום או חיסון. בנוסף, השוואה של פרופילי נטרול בין וריאנטים ויראליים שונים יכולה לחשוף שינויים ברגישות הקשורים לבריחה חיסונית. בשילוב עם ריצוף גנומי, גישה זו עשויה להקל על זיהוי וריאנטים העמידים לנוגדנים ולתמוך בפיתוח חיסונים מהדור הבא, טיפולים בנוגדנים ואסטרטגיות אנטי-ויראליות.

גילויים

J.E.C. סיפק ייעוץ ל-Moderna ול-Merck, הוא המייסד של IDBiologics, ומקבל תמלוגים מ-UpToDate. המעבדה של J.E.C. קיבלה הסכמי מחקר ממומנים שאינם קשורים למחקר זה מ-IDBiologics במהלך ביצוע המחקר.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים U19 AI181979 ו-U19AI181930 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של המכוניים הלאומיים לבריאות (NIH) בארה"ב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אדנו-וירוס-GFPVector Biolabs 1060
Brincidofovir (CMX001)AdooQA13326
CaviCideMetrex13-5024חומר חיטוי 
צידופוביר (Cidofovir)Selleck S1516
מצע דאלבקו המודגש של איגל (DMEM)ATCC30-2002
E-Plate 96Agilent5232368001פלטה בעלת 96 בארות עם מיקרו-אלקטרודות משולבות
סרום עוברי בקרAvantor97068-085
גנסיקלוביב נתרן Selleck S5065
תאי HEK293AThermo Fisher Scientific  R70507
Viaflo רב-ערוציINTEGRAVIAFLO 96
תמיסת פניסילין-סטריפטומייציןGibco10378016
סלקושל פוספט (1x)HyCloneSH30256.01
נוגדנים מונוקלונליים (mAbs) רקומביננטייםמעבדת קרואו (Crowe Lab)מכיוון שלא סופק טקסט מקור לתרגום, אנא הזן את התוכן הדרוש כדי שאוכל להתחיל בתרגום המקצועי לעברית בהתאם להנחיות.
ריבב antiviral-ריבב (Ribavirin)Selleck S2504
rVSV-LASV (Lin IV)מעבדת קרואו (Crowe Lab)לא רלוונטי
סטבודין (Stavudine) Selleck S1398
0.25% Trypsin 0.53 mM EDTA  (1x)ATCC30-2101
מאגרי ריאגנטים בעלי 12 תעלותVistaLab Technologies3054-1011
Vero CCL-81ATCCCCL-81
מודול וירולוגיהAgilentS2807-90089
מערכת xCELLigence RTCA MPAgilent380601040

מקורות

  1. Pardi N, Weissman D. Development of vaccines and antivirals for combating viral pandemics. Nat Biomed Eng. 2020;4(12):1128-1133.
  2. Rocha VPC, Quadros HC, Fernandes AMS, Gonçalves LP, Badaró R, Soares MBP, et al. An overview of the conventional and novel methods employed for SARS-CoV-2 neutralizing antibody measurement. Viruses. 2023;15(7). doi:10.3390/v15071552.
  3. Chen CZ, Shinn P, Itkin Z, Eastman RT, Bostwick R, Rasmussen L, et al. Drug repurposing screen for compounds inhibiting the cytopathic effect of SARS-CoV-2. Front Pharmacol. 2021;11:592737.
  4. Giaever I, Keese CR. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 1993;366(6455):591-592.
  5. Giaever I, Keese CR. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(17):7896-7900.
  6. Suryadevara N, Shrihari S, Gilchuk P, VanBlargan LA, Binshtein E, Zost SJ, et al. Neutralizing and protective human monoclonal antibodies recognizing the N-terminal domain of the SARS-CoV-2 spike protein. Cell. 2021;184(9):2316-2331.e15.
  7. Charretier C, Saulnier A, Benair L, Armanet C, Bassard I, Daulon S, et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 2018;252:57-64.
  8. Ebersohn K, Coetzee P, Venter EH. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 2014;199:25-28.
  9. Marlina S, Shu MH, Abubakar S, Zandi K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasit Vectors. 2015;8:240.
  10. Teng Z, Kuang X, Wang J, Zhang X. Real-time cell analysis—a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. J Virol Methods. 2013;193(2):364-370.
  11. Suryadevara N, Gilchuk P, Zost SJ, Mittal N, Zhao LL, Crowe JE Jr, et al. Real-time cell analysis: a high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 2022;3(2):101387.
  12. Zhang J, Abassi YA, Li N, Wang X, Zhang X. A streamlined, label-free real-time 50% tissue culture infectious dose (TCID50) assay using impedance for automated viral titer quantification. J Vis Exp. 2026;(227). doi:10.3791/73686.
  13. Zhang J, Giang C, Li N, Abassi YA, Lamarche BJ. Screening and characterizing antiviral drugs in real time using xCELLigence RTCA eSight's combination of impedance and imaging. Agilent Technologies; 2022.
  14. Engdahl TB, Kuzmina NA, Ronk AJ, Mire CE, Hyde MA, Kose N, et al. Broad and potently neutralizing monoclonal antibodies isolated from human survivors of New World hantavirus infection. Cell Rep. 2021;35(5):109086.
  15. Robinson JE, Hastie KM, Cross RW, Yenni RE, Elliott DH, Rouelle JA, et al. Most neutralizing human monoclonal antibodies target novel epitopes requiring both Lassa virus glycoprotein subunits. Nat Commun. 2016;7:11544.
  16. Piret J, Goyette N, Boivin G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. J Clin Microbiol. 2016;54(8):2120-2127.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.