דוח מהיר

מעורבות פוטנציאלית של ציר השליחון IL-6/STAT3/MMP12 בהשפעות אנטי-פיברוטיות המתווכות על ידי DMSO בסיליקוזיס ניסיוני

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72545

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, The First Hospital of Anhui University of Science and Technology, 2Anhui University of Science and Technology, 3Ningbo University

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מרמז כי dimethyl sulfoxide (DMSO) עשוי להקל על דלקת ריאות ופיברוזיס שנוצרו כתוצאה מחשיפה לסיליקה בעכברים. ניתוחים טרנסקריפטומיים וניסויים מעבירים כי השפעותיו המגנות עשויות להיות קשורות לדיכוי של מסלול האיתות IL-6/STAT3 ולהורדה של ביטוי MMP12, ובכך לספק תובנות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול בסיליקוזיס.

תקציר

מחקר זה נועד לבחון את ההשפעות האנטי-דלקתיות והאנטי-פיברוטיות של dimethyl sulfoxide (DMSO) במודל עכברים של סיליקוזיס, ובכך לבחון את ערכו הטיפולי הפוטנציאלי.

מודל עכבר של סיליקוזיס הוקם באמצעות instillion תוך-אפי, וטיפול ב-DMSO ניתן באמצעות זריקה תוך-פריטונית. הניסוי נערך לאורך תקופה של חודש אחד. רקמות ריאה נאספו מכל העכברים; תת-קבוצה הועמדה לניתוח טרנסקריפטומי, וגנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי זוהו באמצעות חבילת ה-limma. ניתוחי העשרה של Gene ontology (GO) ו-Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) בוצעו באמצעות ClusterProfiler כדי לחקור תפקודי גנים ומסלולים קשורים. הדגימות הנותרות הועמדו להערכה היסטופתולוגית באמצעות צביעת hematoxylin and eosin (HE) וצביעת Masson’s trichrome, בעוד שניתוח Western blot בוצע כדי לתקף את התוצאות הטרנסקריפטומיות.

מחקר זה מרמז כי DMSO עשוי להקל על התהליך הפיברוטי בסיליקוזיס על ידי ויסות ציר השליח IL-6/STAT3-MMP12. במודל עכברים לסיליקוזיס המושרה על ידי סיליקה, DMSO הפחית את ירידה במשקל הקשורה למחלה והפחית את השקיעה של קולגן. ניתוח טרנסקריפטומי העיד כי DMSO דיכא את הפעילות של מספר מסלולים הקשורים לפיברוזיס וזיהה 51 גנים מרכזיים, כולל MMP12, שביטויו הופחת באופן משמעותי. ניתוח Western blot אישש עוד את ההפחתה בביטוי של MMP12, בליווי ירידה ניכרת ברמות של IL-6 ו-p-STAT3, מה שמרמז כי למסלול IL-6/STAT3 עשוי להיות תפקיד מכריע בוויסות ביטוי MMP12.

DMSO עשוי להחליש תגובות דלקתיות ופיברוזיס ריאתי בסיליקוזיס על ידי עיכוב הפעלת נתיב השליח IL-6/STAT3, ובכך להפחית את ביטויו של MMP12.

מבוא

סיליקוזיס היא אחת הצורות העיקריות של פנוקוניוזיס תעסוקתי1, המאופיינת בדלקת ריאתית עקשנית ובפיברוזיס ריאתי בלתי הפיך כתוצאה מחשיפה ממושכת לאבק סיליקה2,3. הפתוגנזה של סיליקוזיס זו היא מורכבת מאוד. למרות שמחקרים קודמים הראו כי שפע של הפעלת מקרופאגים חריגה4, פרוליפרציה מוגברת של פיברובלסטים, מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי, ושקיעה לא תקינה של רכיבי מטריקס חוץ-תאית (ECM) הם תורמים קריטיים להתפתחות הפיברוזיס5,6. המנגנונים המולקולריים המרכזיים העומדים בבסיס המעגל המרושע של דלקת-פיברוזיס עדיין אינם מובנים במלואם. באופן בולט, משפחת המטריקס מטלופרוטאינאז (MMP) ממלאת תפקיד מכריע בעיצוב מחדש של ה-ECM ובהתקדמות של פיברוזיס פתולוגית7. בין אלה, מטריקס מטלופרוטאינאז 12 (MMP12), המופרש באופן ספציפי על ידי מקרופאגים, מפרק רכיבי ECM מרכזיים כגון אלסטין, פיברונקטין וקולגן מסוג IV, וממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות פיברוטיות, כולל מחלה ריאתית חסימה כרונית8. מחקרים אחרונים מצביעים עוד על כך ש-MMP12 שמקורו במקרופאגים עשוי לקדם עוד יותר את הפיברוזיס על ידי פגיעה בתאי אנדותל במהלך התהליך של פיברוזיס ריאתית9.

דימתיל סולפוקסיד (DMSO), תרכובת בעלת משקל מולקולרי נמוך עם פעילויות ביולוגיות מגוונות10, הדגימה השפעות נוגדות דלקת במספר מחלות דלקתיתות, כולל ציסטיטיס, ואושרה על ידי מינהל המזון והתרופות של ארה"ב (FDA) לטיפול בציסטיטיס בינסטריצית11. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ש-DMSO עשוי להאט במידה מסוימת את התקדמות הפיברוזיס על ידי עיכוב שחרור גורמי דלקת והפחתת תגובות של סטרס חמצוני12. מחקר שנערך על ידי Ingrid Elisia ואח' דיווח כי DMSO מעכב באופן ספציפי את הפעלת נתיבי השיגנלינג של ERK1/2, p38 MAPK, JNK ו-PI3K/Akt במונוציטים אנושיים במודלים של דם שלם, ובכך מפעיל את השפעותיו הנוגדות דלקת13.

למרות שהוכח כי משפחת ה-MMP ממלאת תפקיד מכריע בתהליך הפיברוזיס של סיליקוזיס, לא היו מחקרים שהוכיחו באופן חד-משמעי האם DMSO יכול להשפיע על ההתקדמות הפתולוגית של סיליקוזיס באמצעות ויסות של ביטוי MMP. לפיכך, מחקר זה מהווה בדיקה של ההשפעות האנטי-דלקתיות והאנטי-פיברוטיות של DMSO במודל עכברים לסיליקוזיס, במטרה לחשוף את רשת הגנים הרגולטורית המרכזית ואת המנגנון המולקולרי של התערבות DMSO, ולספק תמיכה תיאורטית לאסטרטגיות טיפול חדשניות המבוססות על MMP.

פרוטוקול

כל ניסויי בעלי החיים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה למדע וטכנולוגיה של אוניברסיטת אנחוי למדע וטכנולוגיה (מספר אישור GZ2025-048) והתבצעו בהתאם לתקנים הלאומיים לרווחת בעלי חיים במעבדה (GB/T 35892-2018) של סין. איור 1 מציג את מערך המחקר.

הכנת תמיסות​

הכנת תרחף סיליקה:

סיליקה גבישית (SiO₂, 80%, גודל חלקיקים 1–5 µm) עוקרה באמצעות אוטוקלאב. אבקת הסיליקה העקרה פוזרה לאחר מכן בתמיסת סליין סטרילית כדי להגיע לריכוז סופי של 10 mg/mL, והסספנסיה הומוגניזתה ביסודיות באמצעות הומוגנייזר אולטרסוניק מיד לפני המתן כדי להבטיח סספנסיית חלקיקים אחידה.

הכנת תמיסת DMSO:

תחת תנאים אספטיים, DMSO (≥99.9%) דולל במי מלח פיזיולוגיים סטריליים להכנת תמיסת DMSO בריכוז של כ-10% (v/v), אשר הומוגניזה באמצעות ערבול אולטרה-סוני. כל עכבר קיבל זריקה של תמיסת ה-DMSO במינון של 0.9 g/kg, כפי שתואר בעבר14,15.

בעלי חיים למחקר

במחקר זה נעשה שימוש בשלושים ושניים עכברים זכרים בריאים מסוג C57BL/6J בגילאי 8–12 שבועות, אשר עברו תקופת אקלמיזציה של שבוע אחד לפני תחילת הניסויים. העכברים חולקו באופן אקראי לארבע קבוצות ניסוייות (n = 8 לכל קבוצה) באמצעות שיטת רנדומיזציה ממוחשבת: קבוצת ביקורת, קבוצת DMSO, קבוצת סיליקה וקבוצת סיליקה+DMSO. גודל המדגם נקבע על בסיס מחקרים קודמים שהשתמשו באותו מודל עכברים לסיליקוזיס ובניסיוננו המוקדם, אשר הצביעו על כך ש-8 חיות לכל קבוצה מספיקות כדי לזהות הבדלים היסטופתולוגיים ומולקולריים בין הקבוצות. החיות שוכנו בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם טמפרטורה מבוקרת, מחזור אור/חושך של 12 שעות וגישה חופשית למזון ומים. נקודות סיום הומניטריות נקבעו לפני תחילת המחקר, ולא היו חיות שעמדו בקריטריונים שהוגדרו מראש להדרה מוקדמת (euthanasia).

הקמת מודל של סיליקוזיס והתערבות תרופתית

סיליקוזיס הושרה באמצעות טפטוף אינטראנזלי בודד של 60 µL של תגלי תליה של סיליקה גבישית סטרילית (10 mg/mL). לאחר השראה של הרדמה, העמדיים הוצבו במצב גב (supine). לאחר שנצפתה נשימה עמוקה ואיטית, 60 µL של תגלי התליה של הסיליקה טפטפו בזהירות לנחיריים, תוך מתן אפשרות לתגלי התליה להישאף באופן ספונטני לריאות16. עכברים בקבוצת המתן DMSO קיבלו זריקות אינטraperitoneal של תמיסת DMSO במינון קבוע פעמיים בשבוע, בהפרש של 3–4 ימים בין הזריקות, למשך חודש רצוף. עכברים בשאר הקבוצות טופלו באופן זהה בנפח שווה של תמיסת סליין סטרילית במקום זאת. ניטור יומי של משקל הגוף בוצע לאורך כל הניסוי. ביום ה-30 לאחר השראת המודל, כל העכברים הורדמו, ורקמות ריאה נאספו תחת תנאים סטריליים. ההמתה בוצעה על ידי פריקה של הצוואר לאחר מתן אינטraperitoneal של tribromoethanol (0.2 mL/10 g) להשראת הרדמה. רקמות ריאה חלקיות נשמרו בחנקן נוזלי לצורך ריצוף טרנסקריפטום. חלק מהרקמות קובעו ב-4% paraformaldehyde למשך 48 h לפני צביעה פתולוגית, והרקמות שנותרו אוחסנו ב-80 °C- לצורך ניסויים מולקולריים מאוחרים יותר. כל הפעולות בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות האתיקה המוסדיות לטיפול בבעלי חיים.

הערכה היסטופתולוגית, כולל מדד פיברוזיס של Ashcroft, בוצעה באופן בלתי תלוי על ידי שני חוקרים שלא היו מודעים להקצאה של הקבוצות הניסיוניות.

בדיקה פתולוגית של הריאות

רקמות ריאה מקובעות עברו דהידרציה, השקיפות והטמעה בבלוקים של פראפין, ולאחר מכן נחתכו לפרוסות בעובי של 5 µm.

צביעת המטוקסילן ואוזין (HE): את החתכים צבעו בהמטוקסילן למשך 3–5 דקות, ביצעו דיפרנציאציה בתמיסה חומצית, שטפו תחת זרם מים (bluing), וצבעו צביעת ניגוד באוזין למשך 5 דקות. לאחר התייבשות באמצעות סדרת ריכוזי אתנול, את החתכים ביצעו להם הבהרה בקסילן וחתמו אותם עם שרף ניטרלי17.

צביעת trichrome של Masson: חתכים נצבעו ברצף עם hematoxylin, Lichun Red–acid fuchsin, חומצה פוספו-מוליבדית ו-Bright Green. לאחר דיפרנציאציה חומצית, החתכים עברו דהידרציה, הבהרה ב-xylene והשכבה עם שרף ניטרלי18,19.

ריצוף טרנסקריפטום

רקמות ריאה של עכברים מארבע קבוצות הניסוי נאספו מיד לאחר ההקטלה והוקפאו במהירות בחנקן נוזלי. RNA כולל הופק באמצעות ריאגנט TRIzol בהתאם להוראות היצרן. ריכוז ה-RNA ודרגת הטוהר שלו נבדקו, ושלמות ה-RNA הוערכה באמצעות Bioanalyzer עם תוכנה מובנית. דגימות עם ערכי RIN הגבוהים מ-8.0 נחשבו לקבילות. הכנת הספריות כללה העשרה של mRNA poly(A) באמצעות חרוזי Oligo(dT), פרגמנטציה של ה-RNA, סינתזת cDNA, ליגציה של אדפטורים והגברה ב-PCR. הריצוף בוצע על פלטפורמת Illumina, והפיק כ-6.2–6.4 Gb של נתונים נקיים לכל דגימה. כל נתוני הריצוף הגולמיים שהופקו במחקר זה הופקדו במאגר הנתונים Gene Expression Omnibus (GEO) תחת מספר גישה GSE311671.

קריאות נקיות הותאמו לגנום הייחוס של Mus musculus (mm8) באמצעות ה-aligner STAR. רמות ביטוי הגנים כומתו כספירות קריאות גולמיות. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בוצע באמצעות חבילת limma ב-R. לפני מידול לינארי, נתוני הספירה הגולמיים הועברו טרנספורמציה באמצעות פונקציית voom כדי להעריך את קשר הממוצע-שונות ולהפיק משקלי דיוק. ערכי P גולמיים תוקנו עבור בדיקות מרובות באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg (BH), וגנים עם |log₂FoldChange| > 1.5 ושיעור גילוי שגוי (FDR) < 0.05 נחשבו כבעלי ביטוי דיפרנציאלי. ניתוחי העשרה תפקודיים בוצעו באמצעות חבילת clusterProfiler ב-R. ניתוח העשרת אונטולוגיה של גנים (GO) נערך כדי לזהות קטגוריות מועשרות באופן מובהק של תהליכים ביולוגיים (BP), רכיבים תאיים (CC) ותפקודים מולקולריים (MF), בעוד שניתוח העשרת מסלולים של Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) בוצע כדי לזהות מסלולי איתות מועשרים באופן מובהק. מובהקות ההעשרה הוערכה באמצעות מבחן היפראומטרי, וערכי P תוקנו עבור השוואות מרובות באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg. מונחי GO ומסלולי KEGG עם ערך P מתוקן (padj) < 0.05 נחשבו כמעשירים באופן מובהק20,21,22,23.

גילוי באמצעות Western blot

רקמת ריאה טרייה של עכבר נאספה והומוגניזה עם נפח מתאים של בופר ליזיס מסוג radioimmunoprecipitation assay (RIPA). לאחר צנטריפוגה, נאסף הנוזל העליון (supernatant), וריכוז החלבון נקבע באמצעות ערכת BCA protein assay. לאחר מכן, הדגימות ערבובו עם בופר טעינה (loading buffer) וחוממו בטמפרטורה של 100 °C למשך 10 min. הפרדת החלבונים בוצעה על ג'לים של 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) בזרם של 200 V למשך 30 min. לאחר מכן, החלבונים הועברו בהעברה חשמלית (electrotransfer) לממברנות polyvinylidene fluoride (PVDF) בזרם קבוע של 300 mA למשך 30 min. הממברנה נחסמה עם 5% חלב רזה, ולאחר מכן הודגרה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד β-Actin (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) ו-MMP12 (1:800). למחרת, הממברנה נשטפה עם TBST והודגרה עם נוגדן שני בטמפרטורת החדר למשך 1 h, ולאחר מכן נשטפה שוב עם TBST. פסי החלבון הודגמו באמצעות סובסטרט כימילומנסנטי, וכמות החלבון נקבעה באמצעות תוכנת ImageJ.

ניתוח Western blot בוצע באמצעות שלוש חזרות ביולוגיות עצמאיות מכל קבוצה ניסוייית. דגימות חלבון הוכנו מרקמות ריאה של עכברים בודדים, וכל חזרה ביולוגית ייצגה בעל חיים עצמאי אחד.

ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים הניסויים נותחו באמצעות GraphPad Prism 9.5. בדיקות לנורמליות ולהומוגניות של השונות בוצעו מראש. מבחן t של Student שימש להשוואה בין שתי קבוצות, ומבחן ANOVA חד-כיווני בשילוב עם מבחן post-hoc של Tukey אומץ להשוואה בין קבוצות מרובות. P ≤ 0.05 נחשב כמובהק סטטיסטית.

תוצאות

DMSO מקל על פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי סיליקה בעכברים (איור 2)

כדי להעריך את השפעות ה-DMSO על תהליכים פתולוגיים ושינויים ברקמת הריאה במודל של סיליקוזיס, הוקמו ארבע קבוצות ניסוי (איור 2A). שינויים במשקל הגוף נוטרו לאורך תקופה של חודש אחד.

התוצאות הדגימו כי עכברים בקבוצת ה-Silicosis הראו ירידה רציפה במשקל הגוף, בעוד שקבוצת ה-Silica+DMSO הראתה ירידה ראשונית במשקל ולאחריה התאוששות בעקבות התערבות ב-DMSO (איור 2F). לאחר 30 ימים של חשיפה לסיליקה, נאספו רקמות ריאה ונבחנו לשינויים בדלקת ובפיברוזיס באמצעות צביעת HE (איור 2B) וצביעת Masson’s trichrome (איור 2C). פיברוזיס ריאתי דורג בחתכים שנצבעו ב-HE באמצעות שיטת Ashcroft24, דבר שחשף ציון פיברוזיס נמוך יותר בקבוצת ה-Silica+DMSO בהשוואה לקבוצת ה-Silica (איור 2D). צביעת Masson הצביעה עוד על כך ששקיעת סיבי קולגן בקבוצת ה-Silica הייתה נרחבת וצפופה, ותפסה כ-40% משטח רקמת הריאה, נתון הגבוה מ-10% שנצפו בקבוצת הביקורת (איור 2E), מה שמרמז כי חשיפה לסיליקה גרמה לפיברוזיס ריאתי חמור. לעומת זאת, שקיעת הקולגן בקבוצת ה-Silica+DMSO פחתה ל-20%, דבר המצביע על כך ש-DMSO עשוי להקל על פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי סיליקה על ידי עיכוב הצטברות קולגן מוגברת.

ניתוח טרנסקריפטום מזהה גנים בעלי ביטוי Differentially Expressed הקשורים לטיפול ב-DMSO בעכברים שנחשפו לסיליקה

כדי לבחון את ההשפעות האנטי-דלקתיות והאנטי-פיברוטיות של dimethyl sulfoxide (DMSO) במודל של סיליקוזיס, בוצע ריצוף טרנסקריפטומי של דגימות רקמת ריאה שנאספו מעכברים ניסיוניים (איור 3). גנים בעלי ביטוי Differentially Expressed (DEGs) זוהו באמצעות אלגוריתם limma, כאשר קריטריוני הבחירה הוגדרו כ- |log2(fold change)| > 1.5 וערך P מתוקן (false discovery rate [FDR]) < 0.05.

ניתוח הטרנסקריפטום הדגימה כי בהשוואה לקבוצת הביקורת, קבוצת הסיליקה (Silica) הפגינה 132 גנים עם ביטוי דיפרנציאלי מובהק (איור 3A), כולל 117 גנים שהביטוי שלהם עלה ו-15 גנים שהביטוי שלהם ירד. בולטים במיוחד גנים כגון Saa3 ו-MMP12 שביטוים עלה באופן ניכר. דפוס ביטוי זה נתמך עוד יותר על ידי ניתוח מפת חום של צבירה היררכית (איור 3C), אשר הדגים פרופילים עקביים של ביטוי גנים בין הדגימות הבודדות.

בהשוואה בין קבוצות ה-Silica+DMSO וה-Silica, זוהו בסך הכל 3,054 גנים עם ביטוי דיפרנציאלי מובהק (איור 3B), הכוללים 1,399 גנים בעלי ביטוי מוגבר (upregulated) ו-1,655 גנים בעלי ביטוי מופחת (downregulated). מפת החום התואמת (איור 3D) חשפה שינויים טרנסקריפטומיים משמעותיים בעקבות הטיפול ב-DMSO, עם הפחתה בולטת בביטוי של גנים הכוללים את Lcn2 ו-MMP12. באופן ספציפי, גנים מרכזיים שהיו בעלי ביטוי מוגבר בקבוצת ה-Silica, כגון MMP12, Saa3 ו-Spp1, הראו הפחתה ניכרת בביטוי בקבוצת ה-Silica+DMSO. ממצאים אלו מרמזים כי DMSO עשוי להקל על הפתולוגיה הקשורה לסיליקוזיס על ידי דיכוי ביטויים של מתווכים פרו-דלקתיים ופרו-פיברוטיים.

ציר השליחויות IL-6/STAT3/MMP12 עשוי להיות מעורב בהשפעות המגנות של DMSO בפיברוזיס ריאתי המושרה על ידי סיליקה

כדי לחקור את הקשרים בין גנים בעלי ביטוי Differentially Expressed Genes (DEGs), נבנתה רשת אינטראקציות גנים בהתבסס על נתוני התרנסקריפטומיקה (איור 4A). נראה כי MMP12 תופס מיקום מרכזי בתוך הרשת. כדי לבחון באופן מעמיק יותר קשרי גומלין פוטנציאליים ברמת החלבון, נוצרה רשת חיזוי של אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI) באמצעות מאגר הנתונים STRING (איור 4B). ניתוח ה-STRING הצביע על קשרים פונקציונליים פוטנציאליים בין MMP12 למספר DEGs מרכזיים, כולל IL-6, STAT3, SPP1 ו-MMP19. מכיוון ש-STRING משלב ראיות ממקורות שונים, קשרים אלו הם קשרי גומלין פונקציונליים חזויים.

ניתוח Western blot בוצע כדי לכמת את רמות הביטוי החלבוני של IL-6, STAT3, p-STAT3 ו-MMP12 (איור 4C–F). התוצאות הראו כי בהשוואה לקבוצת הביקורת (Control), רמות הביטוי החלבוני של IL-6 ו-p-STAT3 היו גבוהות באופן מובהק בקבוצת הסיליקה (Silica), וגם הביטוי החלבוני של MMP12 הראה מגמה של עלייה בביטוי. בעקבות טיפול ב-DMSO, רמות הביטוי של שלושה חלבונים אלו פחתו באופן מובהק. ראוי לציין כי הביטוי החלבוני של STAT3 הכולל נשאר עקבי יחסית בכל הקבוצות הניסיוניות.

זמינות נתונים:

כל נתוני הריצוף הגולמיים שהופקו במחקר זה הופקדו במאגר הנתונים Gene Expression Omnibus (GEO) תחת מספר גישה GSE311671. התמונות הגולמיות של המחקר זמינות בתיקייה נלווית (קובץ נלווה 1).

תהליך ניסוי בעכברים; תרשים; מודל סיליקוזיס, התערבות DMSO, איסוף דגימות ריאה.
איור 1: תרשים של עיצוב המחקר. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.

מחקר פיברוזיס ריאתי מושרה על ידי סיליקה; תרשים ציר זמן, היסטולוגיה של רקמת ריאה, תרשים ציון פיברוזיס.
איור 2: DMSO מקל על פיברוזיס ריאתי בעכברים עם סיליקוזיס. (A) תרשים סכמטי של מערך הניסוי. חצים בצבעים שונים מייצגים משטרי מתן שונים. (B) צביעת hematoxylin and eosin של רקמת ריאה. בהגדלה של 200×, סרגל המידה הוא 50 µm; בהגדלה של 400×, סרגל המידה הוא 20 µm. (C) צביעת Masson של רקמת ריאה (כחול: סיבי קולגן; אדום: סיבי שריר). בהגדלה של 200×, סרגל המידה הוא 50 µm; בהגדלה של 400×, סרגל המידה הוא 20 µm. (D). ציוני פיברוזיס של קבוצות שונות בהתבסס על תוצאות צביעת HE. n = 8, P ≤ 0.0001. (E) שטח קולגן יחסי בצביעת Masson ברקמת הריאה של קבוצות שונות. n = 8, P ≤ 0.0001. (F) שינויים במשקל הגוף של העכברים במהלך 30 יום. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. השוואה בין מספר סדרות של נתונים בוצעה באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way ANOVA), ובדיקות post hoc בוצעו בשיטת Tukey. n = 8, P(time) ≤ 0.0001, P(group) ≤ 0.0001. N: קבוצת ביקורת; S: קבוצת סיליקה; SD: קבוצת סיליקה + DMSO; D: קבוצת DMSO. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח Volcano plot ומפת חום של נתוני ביטוי גנים; log2 fold change לעומת p-value.
איור 3: ריצוף טרנסקריפטום חושף את ויסות הגנים של DMSO בהקלה על סיליקוזיס. (A,B) Volcano plot של גנים המביעים ביטוי שונה בין קבוצת הסיליקה (S) לקבוצת הביקורת (N), ובין קבוצת הסיליקה + DMSO (SD) לקבוצת הסיליקה (S). (C,D) מפת חום של קבוצת הסיליקה (S) בהשוואה לקבוצת הביקורת (N), וקבוצת הסיליקה + DMSO (SD) בהשוואה לקבוצת הסיליקה (S). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

רשתות אינטראקציית חלבונים ותרשימי ניתוח Western blot עבור ביטוי של IL-6, MMP12, STAT3.
איור 4: DMSO מפחית את ביטוי החלבונים IL-6 ו-STAT3. (A) תרשים רשת של גנים עם ביטוי דיפרנציאלי מובהק. (B) תרשים אינטראקציית רשת STRING של MMP12 וגנים קשורים. (C–F) ניתוח Western blot של ביטוי החלבונים β-Actin, IL-6, MMP12, STAT3, ו-p-STAT3. ניתוח ערכי אפור של החלבונים β-Actin, IL-6 (*P = 0.0257, *P = 0.0195), MMP12 (**P = 0.0013, *P = 0.0318), STAT3 (P = 0.3205, P = 0.2347), ו-p-STAT3 (*P = 0.0123, **P = 0.0096) באמצעות Western blotting. ניתוח ה-Immunoblotting בוצע בשלוש חזרות (n = 3). N: קבוצת ביקורת; S: קבוצת סיליקה; SD: קבוצת סיליקה + DMSO; D: קבוצת DMSO. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ נלווה 1: נתונים גולמיים של מחקר זה.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

דיון

סיליקוזיס נותרת אחת ממחלות הריאה התעסוקיות החמורות ביותר ברחבי העולם, המאופיינת בדלקת מתמשכת ובפיברוזיס ריאתי פרוגרסיבי, הפוגעים באופן משמעותי בתפקוד הריאות ובאיכות חיי המטופל25. במחקר זה, תוך שימוש במודל עכברי המושרה על ידי סיליקה, אנו בוחנים באופן שיטתי את ההשפעות המגנות הפוטנציאליות של dimethyl sulfoxide (DMSO) בשלב מוקדם. הממצאים המוצגים כאן מצביעים על כך שטיפול ב-DMSO מפחית חדירה של תאי דלקת וממתן שינויים פתולוגיים פיברוטיים, מה שמרמז כי DMSO עשוי למלא תפקיד מווסת בשלבים המוקדמים של סיליקוזיס. מחקרים ניסיוניים קודמים הדגימו כי DMSO מפעיל השפעות מגנות נגד פיברוזיס ריאתי הן בחולדות והן בעכברים. Haschek et al. דיווחו כי DMSO הפחית שינויים פיברוטיים ריאתיים במודלים של בעלי חיים ניסיוניים, אף שהמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תופעה זו נותרו לא ברורים26. בדומה לממצאים אלו, ניתוחי התעתוק והבעת החלבון שלנו מרמזים עוד כי DMSO עשוי להקל על פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי סיליקה באמצעות ויסות של מסלולי איתות דלקתיים, ובכך לספק תובנה מנגנונית נוספת לגבי פעילותו האנטי-פיברוטית הפוטנציאלית.

DMSO הוא ממס א-פרוטי פולרי בעל חדירות גבוהה לרקמות27, ובעל תכונות נוגדות דלקת ואלגזיה מתועדות היטב, אשר יושם במגוון הפרעות הקשורות לדלקת, כולל ציסטיטיס אינטרסטיציאלית, דלקת מפרקים שיגית (rheumatoid arthritis) ואוסטאו-ארתריטיס28,29,30. בנוסף, מחקרים קודמים הדגימו כי DMSO מפחית פיברוזיס ריאתי ופגיעה ריאתית במודלים של בעלי חיים בניסוי, מה שמעיד על כך ש-DMSO בעל השפעות מגנות מפני מחלות ריאה פיברוטיות, ככל הנראה באמצעות תכונותיו נוגדות הדלקת ומסלקי הרדיקלים החופשיים26. ברמה המולקולרית, דווח כי DMSO מדכא את נתיבי הסיגנלינג של NF-κB ו-MAPK, מה שמוביל להפחתה בביטוי IL-6 במקרופגים מסוג RAW264.7 שעברו סטימולציה של LPS31. ראוי לציין שמינונים גבוהים של DMSO עלולים לגרום לרעילות מערכתית, כאשר דווח על נזק רב-איברי במינונים העולים על 8 g/kg14; לכן, אומץ פרוטוקול של מתן מינון נמוך וחוזר לבחינת השפעות טיפוליות ורעילות.

באמצעות שילוב של אנליזות טרנסקריפטומיות והיסטופתולוגיות, הבחנו כי טיפול ב-DMSO הפחית דלקת ריאתית ופיברוזיס בעכברים שנחשפו לסיליקה, בליווי דיוון (downregulation) של ביטוי IL-6. פרופיל טרנסקריפטומי העיד עוד על הפחתה בביטוי של MMP12 בעקבות הטיפול ב-DMSO. MMP12, המופרש בעיקר על ידי מקרופאגים32, קשור להתקדמות פיברוטית של סיליקוזיס, COPD ופגיעה ריאתית מושרית בבלאומיצין, באמצעות ויסות של מסלולים פרו-פיברוטיים הכוללים את TGF-β1, EGR1 ו-CYR6133,34,35. במחקר הנוכחי, הדיוון שנצפה ב-MMP12 מרמז על מעורבות פוטנציאלית שלו בהשפעות האנטי-דלקתיות והאנטי-פיברוטיות הקשורות לטיפול ב-DMSO. באופן חשוב, MMP12 מקדם פירוק של משקעי מטריקס חוץ-תאי עודפים במהלך רזולוציית הפיברוזיס, ובכך מקדם רמודלינג של הרקמה ופינוי צלקות36.

מקרופאגים הם גורמים מרכזיים לייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים בסיליקוזיס המושרה על ידי סיליקה37. מקרופאגים מופעלים מפרישים IL-6 ו-TNF-α, התורמים לדלקת ולפיברוזיס38. IL-6 נקשר לקומפלקס הקולטן gp130 כדי להפעיל את נתיב ה-JAK–STAT, ובמיוחד את STAT3, ובכך משפיע על הפנוטיפ של המקרופאג ומעודד תהליכים פרו-פיברוטיים39,40,41,42. במחקר זה, טיפול ב-DMSO הפחית באופן משמעותי את רמות הביטוי של IL-6, STAT3 ו-MMP12, מה שמעיד על כך ש-DMSO עשוי למשול את ציר ה-IL-6/STAT3 ולהוביל להסדרה שלילית עקיפה של MMP12. מחקרים קודמים הדגימו כי לציר ה-IL-6–STAT3 תפקיד רגולטורי מכריע במודלים שונים של פיברוזיס ריאתי, והפעלתו המתמשכת קשורה קשר הדוק לחומרת הפיברוזיס ולהתקדמות המחלה43,44. STAT3 הוצע כצומת איתות חשוב המקשר בין תגובות דלקתיות למידול פיברוטי, והפעלתו עשויה לווסת את MMP12, ובכך להגביר את פעילות השעתוק שלו45. בנוסף, איתות STAT3 מעורב בקיטוב של מקרופאגים, ומניע את המעבר של מקרופאגים מהפנוטיפ הפרו-דלקתי M1 לפנוטיפ הפרו-פיברוטי M246,47, בעוד שמקרופאגי M2 מהווים אחד המקורות התאיים העיקריים של MMP1248. לפיכך, ההסדרה השלילית הסימולטנית של STAT3 ו-MMP12 שנצפתה במחקר הנוכחי מרמזת כי DMSO עשוי להפחית את ביטוי MMP12, לפחות באופן חלקי, באמצעות ויסות של איתות STAT3. עם זאת, יש לציין כי המחקר הנוכחי תוכנן בעיקר כדי לזהות מנגנונים מולקולריים פוטנציאליים על בסיס פרופיל טרנסקריפטומי בשילוב עם תיקוף in vivo. למרות שהשינויים המתואמים ב-IL-6, STAT3 ו-MMP12 תומכים במעורבות של ציר האיתות IL-6/STAT3/MMP12 בהשפעות האנטי-פיברוטיות של DMSO, הראיות הנוכחיות אינן מבססות קשר סיבתי ישיר בין הפעלת STAT3 לבין ויסות MMP12. לכן, נדרשים מחקרים מנגנוניים נוספים כדי להבהיר יותר את האינטראקציות הרגולטוריות הישירות בתוך נתיב איתות זה.

למחקר זה מספר מגבלות. ראשית, מסקנות מחקר זה מבוססות על פרופיל טרנסקריפטומי בשילוב עם ניתוחים היסטופתולוגיים ובדיקות ביטוי חלבונים במודל עכברי של סיליקוזיס. למרות שממצאים אלו תומכים במעורבות של ציר הסיגנלינג IL-6/STAT3/MMP12, הם אינם מבססים קשר סיבתי ישיר בין הפעלת STAT3 לבין ויסות של MMP12. שנית, לא בוצע תיקוף מכניסטי, הכולל מחקרים in vitro מבוססי מקרופאגים וניסויי הצלה באמצעות מניפולציה גנטית או פרמקולוגית של נתיב IL-6/STAT3 ושל MMP12. בנוסף, לא נכללה בקרה אנטי-פיברוטית חיובית, מה שמגביל את ההשוואה הישירה של DMSO לטיפולים מבוססים. מחקרים עתידיים שישלבו תיקוף מכניסטי ותרופות אנטי-פיברוטיות רלוונטיות קלינית, כגון pirfenidone או nintedanib, יבהירו יותר את המנגנון המולקולרי ואת הפוטנציאל הטיפולי של DMSO בסיליקוזיס.

לסיכום, הממצאים מעידים כי DMSO מפחית דלקת ופיברוזיס המתווכות על ידי מקרופאגים בסיליקוזיס המושרה על ידי סיליקה, ייתכן על ידי ויסות של ציר השליחויות IL-6/STAT3/MMP12. ממצאים אלו מספקים ראיות ראשוניות התומכות במעורבות פוטנציאלית של ציר השליחויות IL-6/STAT3/MMP12 בהשפעות האנטי-פיברוטיות של DMSO, ומדגישים את MMP12 כמטרה מולקולרית פוטנציאלית למחקרים עתידיים.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים להגילוי.

תודות

המחברים מודים בכנות לפלטפורמה של Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd., ולפרופסור Deyong Ge ול-Lei Xu על התמיכה הטכנית שלהם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
SDS-PAGE בריכוז 10%ServicebioG2177
ערכה לבדיקת חלבון בשיטת BCAServicebioG2026
עכברי C57BL/6JChangzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.מס': SCXY(Su)2011-0003
סיליקה גבישיתSigma Aldrichמס' S5631
DMSOServicebioGC203006
IL-6Affinity BiosciencesDF6087
בופר טעינהBiotekeP0015L
MMP12ServicebioGB115475
p-STAT3ServicebioGB150001
בופר ליזיס RIPAServicebioG2002
נוגדן שניServicebioGB23303
חלב דל שומןServicebioGC310001
STAT3ServicebioGB11176
β-אקטיןServicebioGB11001

מקורות

  1. Leung, C. C., Yu, I. T. S., Chen, W. Silicosis. Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).
  2. Fazio, J. C., et al. Silicosis among immigrant engineered stone (quartz) countertop fabrication workers in California. JAMA Intern Med. 183 (9), 991-998 (2023).
  3. Tian, Y., et al. Nebulized inhalation of LPAE-HDAC10 inhibits acetylation-mediated ROS/NF-κB pathway for silicosis treatment. J Control Release. 364, 618-631 (2023).
  4. Hoy, R. F., Chambers, D. C. Silica-related diseases in the modern world. Allergy. 75 (11), 2805-2817 (2020).
  5. Zhou, Q., et al. Activation of Sirtuin3 by honokiol ameliorates alveolar epithelial cell senescence in experimental silicosis via the cGAS-STING pathway. Redox Biol. 74, 103224 (2024).
  6. Yang, S., et al. Single-cell transcriptome sequencing–based analysis: Probing the mechanisms of glycoprotein NMB regulation of epithelial cells involved in silicosis. Part Fibre Toxicol. 20, 29 (2023).
  7. Robert, S., et al. Involvement of matrix metalloproteinases (MMPs) and inflammasome pathway in molecular mechanisms of fibrosis. Biosci Rep. 36 (4), e00360 (2016).
  8. Dorjay Tamang, J. S., et al. An overview of matrix metalloproteinase-12 in multiple disease conditions, potential selective inhibitors, and drug designing strategies. Eur J Med Chem. 283, 117154 (2025).
  9. Zhou, X., et al. Macrophage-derived MMP12 promotes fibrosis through sustained damage to endothelial cells. J Hazard Mater. 461, 132733 (2024).
  10. De Abreu Costa, L., et al. Dimethyl sulfoxide (DMSO) decreases cell proliferation and TNF-α, IFN-γ, and IL-2 cytokine production in cultures of peripheral blood lymphocytes. Molecules. 22 (11), 1789 (2017).
  11. Kawasaki, Y., Katayama, H., Kato, S. Effectiveness of DMSO intravesical therapy for lower urinary symptoms of primary amyloidosis localized in the urinary bladder: A case report. Hinyokika Kiyo. 59 (7), 453-456 (2013).
  12. Taghavi, S., et al. Dimethyl sulfoxide as a novel therapy in a murine model of acute lung injury. J Trauma Acute Care Surg. 97, 32-38 (2024).
  13. Elisia, I., et al. DMSO represses inflammatory cytokine production from human blood cells and reduces autoimmune arthritis. PLoS One. 11 (3), e0152538 (2016).
  14. Aita, K., et al. Apoptosis in murine lymphoid organs following intraperitoneal administration of dimethyl sulfoxide (DMSO). Exp Mol Pathol. 79 (3), 265-271 (2005).
  15. Gad, S. C., et al. Tolerable levels of nonclinical vehicles and formulations used in studies by multiple routes in multiple species with notes on methods to improve utility. Int J Toxicol. 35 (2), 95-178 (2016).
  16. Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicol Lett. 353, 1-12 (2021).
  17. Zhou, X., et al. ANXA9 facilitates S100A4 and promotes breast cancer progression through modulating STAT3 pathway. Cell Death Dis. 15 (4), 260 (2024).
  18. Dong, L., et al. Hypoxic hUCMSC-derived extracellular vesicles attenuate allergic airway inflammation and airway remodeling in chronic asthma mice. Stem Cell Res Ther. 12, 4 (2021).
  19. Gentile, G., Tambuzzi, S., Boracchi, M., Andreola, S., Zoja, R. Paradoxal dyeing affinity's inversion of the connective tissue at Goldner's Masson trichrome staining as a peculiar characteristic of compressed and exsiccated cadaveric skin. Leg Med (Tokyo). 52, 101905 (2021).
  20. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 16 (5), 284-287 (2012).
  21. Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. Innovation (Camb). 2 (3), 100141 (2021).
  22. Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: Enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D325-D334 (2021).
  23. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Inoshiguro-Watanabe, M. KEGG: Integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D545-D551 (2021).
  24. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
  25. Liu, T., et al. Whole transcriptome sequencing identifies key lncRNAs, circRNAs, and mRNAs for exploring the pathogenesis and therapeutic target of mouse pneumoconiosis. Gene. 901, 148169 (2024).
  26. Haschek, W. M., Baer, K. E., Rutherford, J. E. Effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on pulmonary fibrosis in rats and mice. Toxicology. 54 (2), 197-205 (1989).
  27. Reimer, L., et al. Low-dose DMSO treatment induces oligomerization and accelerates aggregation of α-synuclein. Sci Rep. 12, 3737 (2022).
  28. Colucci, M., et al. New insights into dimethyl sulfoxide (DMSO) effects on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacol Res. 57 (6), 419-425 (2008).
  29. Obara, K., et al. Dimethyl sulfoxide enhances acetylcholine-induced contractions in rat urinary bladder smooth muscle by inhibiting acetylcholinesterase activities. Biol Pharm Bull. 46 (2), 354-358 (2023).
  30. Moss, N. P., et al. A prospective, randomized trial comparing intravesical dimethyl sulfoxide (DMSO) to bupivacaine, triamcinolone, and heparin (BTH) for newly diagnosed interstitial cystitis/painful bladder syndrome (IC/PBS). Neurourol Urodyn. 42 (3), 615-622 (2023).
  31. Han, H., Kang, J. K., Ahn, K. J., Hyun, C. DMSO alleviates LPS-induced inflammatory responses in RAW264.7 macrophages by inhibiting NF-κB and MAPK activation. BioChem. 3 (2), 91-101 (2023).
  32. Shapiro, S. D. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: Biological consequences. Curr Opin Cell Biol. 10 (5), 602-608 (1998).
  33. Kang, H. R., et al. Transforming growth factor (TGF)-β1 stimulates pulmonary fibrosis and inflammation via a Bax-dependent, Bid-activated pathway that involves matrix metalloproteinase-12. J Biol Chem. 282 (10), 7723-7732 (2007).
  34. Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37 (2), 210-221 (2007).
  35. Niu, H., et al. Matrix metalloproteinase 12 modulates high-fat diet-induced glomerular fibrogenesis and inflammation in a mouse model of obesity. Sci Rep. 6, 20171 (2016).
  36. Huang, Q., et al. Regulation of liver fibrosis by matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase and research advances in related therapeutic drugs. J Clin Hepatol. 38 (6), 1420-1425 (2022).
  37. Cao, Z., et al. A novel pathophysiological classification of silicosis models provides some new insights into the progression of the disease. Ecotoxicol Environ Saf. 202, 110834 (2020).
  38. Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. Int J Mol Sci. 22 (18), 10063 (2021).
  39. Pedroza, M., et al. Interleukin-6 contributes to inflammation and remodeling in a model of adenosine-mediated lung injury. PLoS One. 6 (7), e22667 (2011).
  40. Ataie-Kachoie, P., Pourgholami, M. H., Morris, D. L. Inhibition of the IL-6 signaling pathway: A strategy to combat chronic inflammatory diseases and cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 24 (2), 163-173 (2013).
  41. Robinson, M. B., et al. IL-6 trans-signaling increases expression of airways disease genes in airway smooth muscle. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (2), L129-L138 (2015).
  42. Garbers, C., Rose-John, S. Dissecting interleukin-6 classic and trans-signaling in inflammation and cancer. Methods Mol Biol. 2691, 207-224 (2023).
  43. Chakraborty, D., et al. Author correction: Activation of STAT3 integrates common profibrotic pathways to promote fibroblast activation and tissue fibrosis. Nat Commun. 12, 7259 (2021).
  44. O'Donoghue, R. J. J., et al. Genetic partitioning of interleukin-6 signalling in mice dissociates Stat3 from Smad3-mediated lung fibrosis. EMBO Mol Med. 4 (9), 939-951 (2012).
  45. Gao, Y., Zhou, X., Zhou, Y., Zhao, L. IL-9 and its receptor promote the progression of chronic obstructive pulmonary disease by activating macrophages through the STAT3 pathway. J China Med Univ. 52, 921-927 (2023).
  46. Wang, Y., et al. Xuanfei Baidu decoction protects against macrophage-induced inflammation and pulmonary fibrosis via inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway. J Ethnopharmacol. 283, 114701 (2022).
  47. Liu, T., Zhang, Z., Shen, W., Wu, Y., Bian, T. MicroRNA let-7 induces M2 macrophage polarization in COPD emphysema through the IL-6/STAT3 pathway. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 18, 575-591 (2023).
  48. Guo, X., et al. Involvement of M2 macrophage polarization in PM2.5-induced COPD by upregulating MMP12 via IL4/STAT6 pathway. Ecotoxicol Environ Saf. 283, 116793 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DMSOIL 6 STAT3MMP12Western Blot
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.