מאמר שיטה

מודל עכברי של קולוניזציה נשקית משולבת של Candida albicans ו-Streptococcus agalactiae

59 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72557

⸱

21 באוגוסט 2026

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט שיטה לקולוניזציה נרתיקית משותפת של עכברים ב-Candida albicans וב-Streptococcus agalactiae. ניתן להשתמש בו כדי לחקור אינטראקציות פולימיקרוביאליות, אינטראקציות בין המאכסן למיקרובים, ותגובות של המאכסן לאורגניזמים אלה.

תקציר

מיקרובים מגוונים מבודדים מהמערכת הנרתיקית האנושית, ורבים מהאורגניזמים המאכלים נישה זו יכולים לעבור בין אורח חיים קומנסאלי (commensal) לאורח חיים פתוגני. גורמים, כולל הרכב הקהילה וסביבת המארח, משפיעים על תוצאות המחלה; עם זאת, המנגנונים הקובעים תוצאות אלו אינם מובנים היטב. במאמר זה, אנו מתארים מודל עכברי לחקירת אינטראקציות בין-מלכויות (interkingdom) ותגובת המארח ל-Candida albicans ול-Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus, GBS), פתוביונטים (pathobionts) המעמרים את דרכי השתן והמין הנשיים (FGT). ראיות עולות מציעות כי התעמרות של C. albicans היא גורם סיכון לנשיאות GBS בשל בידוד משותף תכוף שלהם. במהלך ההיריון, התעמרות GBS עלולה להוביל לתוצאות שליליות כולל כוריואמניוניטיס (chorioamnionitis) ולידה שקטה. GBS יכול להיות מועבר גם לעובר in utero או ליילוד במהלך הלידה, והוא מהווה סיבה מובילה למeningitis נבון (neonatal meningitis). התעמרות של דרכי הנתיק היא קדם-תנאי קריטי למחלת GBS, ונישה זו מפעילה לחצים סלקטיביים רבים, שחלקם עשויים להיות מושפעים מהתעמרות של C. albicans. פרוטוקול זה מתאר מודל של התעמרות נרתיקית משותפת וסימולטנית של C. albicans-GBS תוך שימוש בטיפול אנטיביוטי ובמנה בודדת של 17β-estradiol כדי לבסס את התעמרות של C. albicans, ולאחר מכן הסרת האנטיביוטיקה והזרקה של GBS. עומסים מיקרוביאליים בחלל הנרתיק נקבעים לאורך הניסוי באמצעות שטיפה (lavage), ועומסים לאורך ה-FGT נקבעים באמצעות נתיחה, הומוגניזציה וזריעה של הנרתיק, צוואר הרחם והרחם. שיטה זו תאפשר חקירה של המנגנונים שבהם אינטראקציות פולימיקרוביאליות ישירות ועקיפות משפיעות על אורח החיים והפתוגנזה של שני אורגניזמים אלו, וכן על הנוף החיסוני של המארח ב-FGT.

מבוא

Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus, GBS) הוא פתוביונט חיידקי גרם-חיובי המיישב מספר אתרים פולימיקרוביאליים, כולל מערכת העיכול והנקיבים הנרתיקיים. בעוד שיישוב נרתיקי הוא לרוב א-סימפטומטי, במהלך ההיריון, GBS עלול לעלות מהנקיבים הנרתיקיים אל הרחם ולחדור דרך קרומים שלמים, ובכך לגרום לזיהום של מי השפיר והשלשלית. לפיכך, הוא מהווה גורם סיכון עיקרי לתוצאות היריון שליליות, זיהום עוברי ומחלות ביילודים1,2. כגורם מוביל לזיהומים פולשניים ביילודים, קריטי לאפיין גורמים המשפיעים על הסיכון להעברה ולזיהום. פרופילקסה אנטיביוטית תוך-לידתי יכולה להפחית העברה אנכית ומחלות GBS בעת הלידה ביילודים3,4; עם זאת, היא נקשרה לעלייה בשיעורי העמידות לאנטיביוטיקה ולהשפעות פוטנציאליות ארוכות טווח הקשורות למתן אנטיביוטיקה לפני הלידה או בשלבי חיים מוקדמים5,6,7,8. גורמים אלו מחייבים פיתוח של התערבויות מונעות ומטפלות ממוקדות יותר.

ראיות עולות הוכירו כי הרכב המיקרוביום ואינטראקציות פולימיקרוביאליות משפיעים על ההומיאוסטזיס ועל הסבירות למחלה9. דומיננטיות של GBS במיקרוביום הנרתיקי האנושי נקשרה לירידה בשפע של Lactobacillus, ונצפו אינטראקציות ספציפיות למינים ולזנים עשויות להשפיע באופן מגוון על הקולוניזציה in vitro ו-in vivo10,11. בעבר, קבוצת המחקר שלנו פיתחה מודל עכברי של קולוניזציה נרתיקית של GBS כדי לבחון קורלטים של המארח והחיידק לכשירות (fitness) של GBS12. מודל זה כולל טיפול בעכברים במנה בודדת של 17β-estradiol, ולאחריה חדרת GBS תוך-נרתיקית ביום למחרת. מודל זה שימש לאפיון חשיבותן של חלבוני פני השטח של GBS, רשתות סיגנלינג רגולטוריות והפרשת רעלנים בשימור הקולוניזציה ובפלישה לרקמות ה-FGT. יתרה מכך, מצאנו ש-GBS מראה אינטראקציות מורכבות עם חיידקים אחרים בדרכי הנרתיק, כולל Akkermansia muciniphila ו-Enterococcus faecalis13,14,15, מה שמדגים כיצד אורח החיים וההישרדות של GBS מושפעים מנוכחותם של מיקרובים שכנים.

בעוד שדגם קיים זה הותאם למחקר של אינטראקציות בין-חיידקיות, נדרשו התאמות נוספות כדי לחקור מיקרובים אחרים. פטריות הן מרכיב שאינו נחקר מספיק במיקרוביום של הנרתיק, ובאמצעות הדגם המוצג כאן, ביקשנו לפתח כלי למחקר של קולוניזציה פטרייתית לצד אינטראקציות פטרייה-חיידק in vivo. הפטרייה השכיחה ביותר המבודדת מהנתיב הנרתיקי האנושי היא Candida albicans, המקולנזת מעל 70% מהאנשים16. C. albicans היא פולימורפית ויכולה לעבור מורפוגנזה כדי לעבור בין צורות של שמרים מנבטים לבין מורפוטייפים פילמנטריים (סיביים). פילמנטציה קשורה למערך ביטוי גנים מובחן17,18. על חלק מהגנים הספציפיים להיפות אלו דווח לאחרונה כי הם מעניקים יתרון כשירות (fitness) בהקשר של קולוניזציה פולימיקרוביאלית19,20,21.

מספר מחקרים דיווחו על בידוד משותף של C. albicans ו-GBS מטפטופי נסיינ (swabs) מהנרתיק האנושי, וקבוצת המחקר שלנו מצאה לאחרונה כי לאנשים שסובלים מקולוניזציה של C. albicans יש שיעורים גבוהים משמעותית של נשיאות GBS22. פיתחנו מערכת in vivo לבדיקת האינטראקציות השלושיות בין פטריות קומנסליות, חיידקים והמארח. מחקרים פטרייתיים בעכברים קונבנציונליים דורשים בדרך כלל טיפול אנטיביוטי כדי להתגבר על התנגדות לקולוניזציה המתווכת על ידי חיידקים ולהבסיר קולוניזציה עמידה23. כדי להשיג זאת מבלי לפגוע ביכולת של GBS להתנחל, אנו מטפלים בעכברים בתערובת אנטיביוטית, מחדירים להם C. albicans, ולאחר ביסוס הקולוניזציה, אנו מסירים את החשיפה לאנטיביוטיקה כדי לאפשר ל-GBS להתנחל לאחר מכן. תהליך זה עבר אופטימיזציה כך שגם C. albicans וגם GBS יתנחלו בנתיב הנרתיקי בעומסים דומים ובלוחות זמנים דומים, מה שמאפשר להתרחש אינטראקציות ישירות בתוך הנתיב הנרתיקי. פרוטוקול זה מתאר שיטה להכשרת עכברים באמצעות אנטיביוטיקה, מתן 17β-estradiol, ביסוס קולוניזציה של פטריות וחיידקים כאחד, ואיסוף דגימות שטיפה ורקמה לניתוח המשכי.

פרוטוקול

העבודה עם בעלי חיים המוצגת בכתב יד זה אושרה ובוצעה בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ולהגנה על בעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ תחת פרוטוקול מס' 00316. בציר הזמן להלן, יום 0 מתייחס ליום ההזרקה של S. agalactiae.

1. יש להעניק אנטיביוטיקה לפני ההחדרה.

  1. הכינו תמיסה רכזת של 50 mg/mL של כל אחד מהאנטיביוטיקה ampicillin, neomycin ו-gentamycin המומסים במי שתייה לעכברים. השתמשו במסנן 0.22 µm כדי לעקר את תמיסת האנטיביוטיקה.
  2. הוסיפו את תמיסת האנטיביוטיקה למי השתייה של העכברים בדילול של 1:100, על ידי הוספה של 1 mL מהתמיסה לכל 99 g של מים.
  3. לאחר 7 ימים, החליפו את המים על ידי חזרה על שלבים 1.1 ו-1.2.
  4. שמרו על מתן האנטיביוטיקה למשך 7–10 ימים לפחות לפני תחילת הניסוי, אך אל תחרגו מ-14 ימי טיפול באנטיביוטיקה בסך הכל.

2. סנכרון מחזורי הנסתר (estrus) בעכברים (יום 3-).

  1. הוסיפו למבחנה קונית סטרילית של 50 mL כמות של 0.5 mg לכל עכבר של 17β-estradiol, בתוספת כמות קטנה של עודף כדי לפצות על הידבקות של התמיסה לדפנות המבחנה. סגרו את המבחנה הקונית היטב וערבבו קצרת במערבל Vortex כדי לפרק גושים.
    זהירות: מכיוון ש-17β-estradiol עלול להיספג בגוף דרך מגע עם העור או הריריות, יש לטיפל בריאגנט זה בזהירות ולהשתמש בציוד מגן אישי מתאים.
  2. השתמשו במסנן 0.45 µm כדי לעקר 100 µL של שמן שומשום עבור כל 0.5 mg של 17β-estradiol, ישירות לתוך המבחנה הקונית המכילה את ה-17β-estradiol. הריכוז הוא 5 mg/mL. סגרו את המבחנה היטב וערבבו את התמיסה היטב במערבל Vortex כדי ליצור תמיססה הומוגנית.
  3. הכינו מזרקים סטריליים של 1 mL (מזרק אחד לכל עכבר) על ידי משיכת הבוכנה למטה עד לסימון של 0.15 mL, והעמידו אותם כך שהבוכנה פונה כלפי מטה והקצה מסוג luer lock פונה כלפי מעלה.
  4. שאבו את תמיססת ה-17β-estradiol למזרק סטרילי חדש של 10 mL עם מחט סטרילית 18G 1.5”, והשתמשו בו כדי למלא את מזרקי ה-1 mL שהוכנו ב-100 µL של התמיססה.
  5. סגרו כל מזרק של 1 mL עם מחט סטרילית 26G 0.5”.
  6. הכינו תמיססת שמן שומשום של 100 µL המכילה 0.5 mg של 17β-estradiol, והחדירו מנה אחת לכל עכבר בהזרקה תוך-פריטונית (intraperitoneal) יום אחד לפני הinoculation של C. albicans.

3. הזרקת C. albicans לעכברים (יום 2-).

  1. יום אחד לפני ההזרקה (באותו היום של מתן 17β-estradiol), גדלו תרבית לילה של 5 mL של C. albicans בתוך Yeast Peptone Dextrose Broth באינקובטור בטמפרטורה של 30 °C ובניעור של 250 rpm.
  2. ביום ההזרקה, העבירו מנה (aliquot) מהתרבית של הלילה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה סטרילית וסבבו בצנטריפוגה במהירות של ≤10,000 × g למשך 7–8 s או עד להיווצרות משקע (pellet).
  3. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע בתוך תמיסת phosphate-buffered saline (PBS) סטרילית.
  4. השתמשו בהמוציטומטר כדי לחשב את ריכוז התליה.
  5. העבירו מנה מהתליה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה סטרילית חדשה, צנטריפוגו שוב להיווצרות משקע, ותלו ב-PBS סטרילי טרי כדי להגיע לריכוז סופי של 109 תאי C. albicans/mL בנפח סופי של לפחות 10 µL לכל עכבר. לדוגמה, אם הריכוז הוא 2 × 108 cells/mL וישנם 10 עכברים, צנטריפוגו 500 µL ותלו מחדש ב-100 µL.
  6. הזריקו תוך-נרתיקית לכל עכבר 10 µL של C. albicans התלו ב-PBS בריכוז של 109 cells/mL (107 cells/mouse).
    1. רסנו כל עכבר על ידי קיבוע העור בעורף בין האגודל לאצבע המורה של היד הלא-דומיננטית, ואז סובבו את פרק כף היד כך שגבו של העכבר ינוח בכף היד. השתמשו באצבע הקטנה ובאצבע הטבעת כדי לקבע את הזנב.
    2. שאבו 10 µL של תליית C. albicans לתוך טיפ פ pipette סטרילי. הכניסו את הטיפ כ-5–10 mm לתוך הלומן הנרתיקי, תוך התאמת העומק למבנה האנטומי של העכבר.
    3. הזריקו את תרבית ה-C. albicans לנרתיק והוציאו את טיפ הפ pipette.
    4. לאחר שחרור העורף, החזיקו את העכבר בזנבו כדי להרים את הרבע האחורי. הליכו את העכבר על שתי כפות רגליו הקדמיות למשך כ-1 min או עד שתרבית ה-C. albicans אינה נראית יותר.

4. החלפת מי השתייה (יום 1-).

  1. יום אחד לאחר ההדבקה ב-C. albicans, המקביל ליום שלפני ההדבקה ב-S. agalactiae, העבירו את העכברים לכלובים נקיים.
  2. ודאו שהעכברים מקבלים מים טריים ללא אנטיביוטיקה.

5. כימות של עומס C. albicans בחלל הנרתיק (יום -1).

  1. ביום -1, הכינו מבחנה סטרילית למיקרוצנטריפוגה ו-100 µL של PBS סטרילי עבור כל עכבר.
  2. רסנו כל עכבר כפי שמתואר בשלב 3.6.1.
  3. שאבו 50 µL של PBS לתוך טיפ סטרילי. הכניסו את הטיפ לעומק של כ-1–5 mm אל תוך הלומן של הנרתיק ובצעו פיפטינג של כל נפח ה-PBS למעלה ולמטה 3–5 פעמים. העבירו את ה-PBS למבחנה סטרילית למיקרוצנטריפוגה.
  4. חזרו על שלב 5.3 כדי להפיק נפח כולל של 100 µL של נוזל שטיפה (lavage fluid).
  5. ערבבו את מבחנת המיקרוצנטריפוגה במערבל וורטקס, ולאחר מכן בצעו דילולות סדרתיות פי-10 עד לדילול של 1:10,000 ב-PBS סטרילי.
  6. פזרו 10 µL מהתמיסות המדוללות ו-25 µL מנוזל השטיפה שלא דולל על מצעי אגר כרומוגניים סלקטיביים ל-Candida.
  7. דגרו את המצעים בטמפרטורה של 30 °C למשך 48 h. מושבות של C. albicans ייראו חלקות ובצבע טורקיז או ירוק.

6. הדבקת העכברים ב- S. agalactiae (יום 0).

  1. יום אחד לפני ההזרקה (באותו היום שבו מחליפים את מי השתייה), גדלו תרבית לילה של 3 מ"ל של .S. agalactiae במצע Todd Hewitt Broth (THB) בתנאים סטטיים ב-37 °אינקובטור CO2.
  2. ביום ההחדרה,ומהיל את תרבית הלילה ביחס של 1:10 ב-4 מ"ל של THB והדגר בטמפרטורה של 37 מעלות ללא ניעור. °באינקובטור בטמפרטורה של °C עד להגעה לשלב הלוגריתמי המרכזי (צפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר [OD600(של 0.4–0.5) תוך כ-1.5–2 שעות.
  3. העבירו את תרבית ה-mid-log לפ menutup Sterilized 15 mL conical tube וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 3,000 × ג' במשך 5 דקות או עד להיווצרות משקע.
  4. הסר את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות שאיבה, ולאחר מכן השהה את המשקע ב-300 µליטר של PBS סטרילי.
  5. השתמשו במשקע שהושעה כדי להכין לפחות 100 µל- של *S. agalactiae* תליה לכל עכבר, בתוספת 500 נוספים µL, ב-PBS סטרילי בריכוז OD600 0.4 (בערך 108 יחידות יוצרות מושבות [CFU]/מ"ל; סה"כ ≥1.5 מ"ל עבור 10 עכברים).
    הערה: חלק מה- .S. agalactiae זנים עשויים להיות שונים ב-OD שלהם600יחס בין ה-OD ל-CFU/מ"ל. קבעו איזה OD600 מתאים ל-108 CFU/mL מראש.
  6. העבירו את התרחיף למבחנה קונית סטרילית חדשה בנפח 15 מ"ל וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 3,000 × ג למשך 5 דקות או עד להיווצרות משקע.
  7. שאבו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע ב-1/10th מהנפח הראשוני של PBS סטרילי (אם 1.5 מ"ל של התרחוף הועברו למשקע, השעה מחדש ב-150 µל). תחתית זו תהיה בריכוז של 109 CFU/mL וישמשו כאינוקולום החיידקי.
  8. בצעו דילול סדרתי והעבירו למצע גידול 50 µL מהתמיסה עם החומר הבלוע (inoculum) על מצע Todd Hewitt Agar, ולאחר מכן דגרו את הצלחותיות בטמפרטורה של 37 °בטמפר C למשך 24 שעות כדי לקבוע את ריכוז האינוקולום המדויק.
  9. החדירו באופן תו-נרתיקי לכל עכבר 10 µל' של *S. agalactiae* סספנסיים ב-PBS בריכוז 109 CFU/מ"ל (107 (CFU לעכבר) באמצעות אותה טכניקה כפי שבוצע בשלבים 3.6.1–3.6.4.

7. כימות עומסי C. albicans ו-S. agalactiae בחלל הנרתיק (החל מיום +1).

  1. החל מיום אחד לאחר ההחדרה של S. agalactiae, אספו 100 µL של נוזל שטיפה נרתיקי ובצעו דילול סדרתי באמצעות אותה טכניקה כפי שפורט בשלבים 5.1–5.5.
  2. הפיקו כפילויות על ידי זריעת 10 µL מהתמיסות המדוללות ו-25 µL מנוזל השטיפה הלא-מדולל על מצעי אגר כרומוגניים סלקטיביים ל-Candida ול-StrepB.
  3. דגרו את צלחות ה-Candida בטמפרטורה של 30 °C למשך 48 h. מושבות של C. albicans ייראו חלקות ויהיו בצבע טורקיז או ירוק.
  4. דגרו את צלחות ה-StrepB בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 h. מושבות של S. agalactiae ייראו חלקות ויהיו בצבע ורוד או סגול בהיר.
  5. חזרו על שלבים 7.1–7.4 מדי יום, או במרווחי זמן מתאימים, כדי לנטר את העומס המיקרוביאל בחלל הנרתיק.

8. כימות עומסי C. albicans ו- S. agalactiae ברקמות דרכי השתן והמין הנשיות (נקודת סיום ניסויית).

  1. הכינו שלושה מבחנות עם פקק הברגה בנפח 2 mL, הממולאות בכ-0.4–0.5 g של חרוזי זירקוניה בגודל 1 mm וב-500 µL של PBS סטרילי עבור כל עכבר, לצורך איסוף רקמות (נרתיק, צוואר הרחם ורחם). הכינו בנוסף מבחנת מיקרו-צנטריפוגה סטרילית אחת ו-100 µL של PBS סטרילי עבור כל עכבר לאיסוף שטיפה (lavage). רשמו את משקל כל מבחנת פקק ההברגה כדי לשמש כנקודת ייחוס בעת חישוב משקלי הרקמות.
  2. בצעו המתנזיה לעכבר בשיטה המאושרת על ידי המוסד, כגון חנק באמצעות CO2 ודיסלוקציה צווארית. השתמשו באתנול 70% לסטריליזציה של המספריים והפינצטה.
  3. הרימו את חלקו האחורי של העכבר מהזנב ואספו שטיפה נרתיקית באמצעות הטכניקה המפורטת בשלבים 5.3–5.4.
  4. רססו את בטנו של העכבר באתנול 70% והשתמשו במספריים הסטריליים כדי לפתוח את חלל הבטן. השתמשו בפינצטה כדי להסיט את העור ואת מערכת העיכול כדי לחשוף את רקמות דרכי הש omitting השתן והמין.
  5. השתמשו במספריים הסטריליים כדי להסיר את שלפוחית השתן, וכן את השומן הוויסרלי והקרומים המסתירים את הרחם. הפרדו את קרני הרחם מהשחלות על ידי חיתוך בין גוף הרחם לכל שחלה.
  6. באמצעות פינצטה סטרילית, אחזו את דרכי הנרתיק בנקודה שמתחת לצוואר הרחם. הרימו עד שכל דרכי הנרתיק גלויות, והשתמשו במספריים סטריליים כדי לבצע חיתוך רוחבי קרוב ככל האפשר לפרסום, תוך הימנעות מרקמות עור. הסירו את כל מערכת השמין והניחו בצלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 cm.
  7. השתמשו בלהב תער סטרילי כדי לבצע שני חיתוכים רוחביים, אחד מתחת ואחד מעל צוואר הרחם, ובכך הפרדו את הנרתיק, צוואר הרחם והרחם. קצצו כל אחת מהרקמות על ידי ביצוע 2–5 חיתוכים סגיטליים ורוחביים נוספים בכל אחת מהן. העבירו כל רקמה למבחנת פקק ההברגה המתאימה שהוכנה.
  8. שקלו כל מבחנת פקק הברגה וחשבו את משקל כל רקמה על ידי הפחתת הערך משלב 8.1. סגרו היטב את הפקק של כל מבחנה, בצעו Bead-beat במהירות 3,450 rpm למשך 1 min, הניחו את המבחנות על קרח למשך 1 min, ולאחר מכן בצעו Bead-beat שוב במהירות 3,450 rpm למשך 1 min.
  9. בצעו דילול סדרתי וזריעה של כל הומוגנאט רקמה ודגימת שטיפה בשיטה המתוארת בשלבים 5.5–5.6. דגרו את הצלחות כפי שמתואר בשלבים 7.3–7.4.

תוצאות

על מנת לאפיין את הקולוניזציה הנרתיקית של GBS ושל C. albicans, עכברים הוחדרו תוך-נרתיקית עם זן C. albicans SC5314 או עם PBS כביקורת, ולאחר מכן הוחדרו עם זן GBS COH1. זן זה מייצג את הסרוטיפ הקפסולרי III ההיפרו-וירולנטי, סוג רצף 17, אשר בידודים שלו קשורים בתדירות הגבוהה ביותר למחלה פולשנית ומנינגיטיס בילודים1. עכברים שלא עברו קולוניזציה של GBS יום אחד לאחר ההחדרה הוצאו מהניתוח. לאורך ציר זמן ניסויי של ארבעה ימים, עכברים שעברו קולוניזציה של GBS בלבד מפנים בהדרגה את ה-GBS מחלל הנרתיק. מרבית העכברים שעברו קולוניזציה משותפת עם C. albicans שומרים על עומסי GBS גבוהים (איור 1A,B). C. albicans מבצע קולוניזציה בחלל הנרתיק של העכבר למשך כארבעה ימים לפני שהוא מפונה (איור 1C). עבודות קודמות שהשתמשו במודל זה הדגימו כי עומסי GBS ברקמות ה-FGT, כולל הנרתיק, צוואר הרחם והרחם, גבוהים יותר גם בעכברים שעברו קולוניזציה משותפת בהשוואה לבעלי חיים שעברו קולוניזציה בודדת22.

גרפים של קולוניזציית GBS; השוואה סטטיסטית, עקומת הישרדות, ניתוח נתוני CFU/mL בסולם לוגריתמי.
איור 1. כימות קולוניזציה של Group B Streptococcus. עכברים מסוג CD-1 עברו קולוניזציה של C. albicans (SC5314) או טופלו במי מלח בופר פוספט (PBS) כביקורת, ולאחר מכן בוצע הזרקה נרתיקית של GBS (COH1). (A) עומס GBS בנוזל שטיפה נרתיקי, מוצגים חציונים. (B) אחוז העכברים שעברו קולוניזציה לאורך זמן, כפי שנמדד על ידי זיהוי GBS בנוזל שטיפה נרתיקי. (C) עומס C. albicans בנוזל שטיפה נרתיקי, מוצגים חציונים. שלושה ניסויים בלתי תלויים. n = 26-27 עכברים לקבוצה. * p < 0.05; ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0.001 על פי מבחני t מרובים עם מבחן השוואות מרובות של Holm-Sidak (A) או מבחן log-rank (B). קיצורים: GBS = Group B Streptococcus, Ca = Candida albicans, CFU = colony-forming units. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

התנחלות של GBS בנקין מהווה סיכון קריטי לבריאות האם, העובר והיילוד. מודלים של In vivo הם חיוניים להבנת הגורמים המכריעים להתנחלות ולפיתוח טיפולים מונעים. במאמר זה, אנו מתארים מודל עכברי להתנחלות משותפת נבלית של עכברים עם GBS ו- C. albicans, הערכת העומס המיקרוביאל בלומן הנקין וב-FGT, ואיסוף רקמות רלוונטיות לצורך אנליזות המשך. מודל זה פותח כדי לחקור אינטראקציות פטרייתיות-חיידקיות ואינטראקציות בין המאכסן למיקרוביום בהקשר של התנחלות נבלית פולימיקרוביאלית. קבוצת המחקר שלנו השתמשה במודל זה כדי להבהיר את המנגנונים התורמים לכך ש- C. albicans מקדם התנחלות נבלית של GBS וזיהום עולה22.

מודלים של בעלי חיים שימשו בהצלחה להבנת אינטראקציות בין מאחור למיקרובים; עם זאת, שילוב של קהילות פולימיקרוביאליות במודלים אלה עלול להציב מספר אתגרים ייחודיים. המטרות העיקריות בפיתוח מודל זה היו לבסס קולוניזציה פטרייתית, לאפשר זמן ל- C. albicans ליצור היפות (hyphae), ולהחדיר GBS כדי לנטר את דינמיקת הקולוניזציה לפני שאחד המיקרובים יסולק על ידי המאחור. כפטרייה פולימורפית, C. albicans יכולה להגיב למספר רמזים סביבתיים הקשורים למאחור על ידי התניית מורפוגנזה של היפות17. פילמנטציה in vivo הועדפה במודל  זה  בשל ראיות מצטברות לכך שאינטראקציות ספציפיות להיפות עם GBS מניעות סימביוזה ב-FGT. באמצעות זן של C. albicans המבטא את NRG1 תחת בקרת פרומוטור TetO הדיכיל, קבוצת המחקר שלנו הראתה בעבר ש-GBS מציג קו-אגרגציה גבוהה יותר והידבקות גבוהה יותר לאפיתל עם C. albicans נעול במצב היפות בהשוואה לזה הנעול במצב שמרים22. קו-אגרגציה עם C. albicans ואסוציאציה עם תאי אפיתל ואגינליים אנושיים הם גורמים קובעים חשובים לכושר ההישרדות של GBS בסביבת מאחור זו. חיידקים נוספים כולל Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, ומינים שונים של Streptococcus הראו כי הם מווסתים את ביטוי גנים הקשורים למורפוגנזה ב- C. albicans וכן מקיימים אינטראקציה מועדפת עם היפות24. בעתיד, ניתן יהיה לבחון את ההשלכות של פילמנטציה in vivo באמצעות שימוש במודל זה כדי ליישב עכברים עם זני C. albicans נעולים במצב היפות או שמרים.

מודלים עכבריים קיימים הכוללים הזרקה תוך-נמקית של C. albicans התמקדו בעיקר בכנדידה וולבו-וגינלית (VVC)25 ושימשו לאפיון המצב ההיפר-דלקתי הקשור לזיהום סימפטומטי26. המודל שלנו, המתואר במאמר זה, מייצג בצורה קרובה יותר מצב של קולוניזציה. עבודות קודמות של קבוצת המחקר שלנו הדגימו כי בשימוש במודל זה, קולוניזציה משותפת עם C. albicans מפחיתה את השפעות של ציטוקינים פרו-דלקתיים IL-6, CXCL1, CXCL2, ו-TNFα בהשוואה לקולוניזציה של GBS בלבד, וכי רמות חלבונים אלו בעכברים עם קולוניזציה משותפת דומות לאלו של בעלי חיים נאיביים22. דבר זה מעיד על כך שאיננו 관צפים את הסביבה ההיפר-דלקתית המאפיינת VVC, למרות התפתחות חוטים פטרייתיים (filamentation) בחלל הנמק. דווח כי עכברי CD-1 Outbred עמידים ל-VVC, ייתכן בשל בקרה חיסונית הולמת על הצמיחה הפטרייתית27. יתר על כן, עכברי CD-1 מפעילים סיגנלינג חיסוני חזק עם הזרקה תוך-נמקית של GBS, המספיק כדי לשלוט באוכלוסיית החיידקים בתוך כשבוע בהיעדר C. albicans28,29,30, אם כי בעבר חקרנו קולוניזציה וגינלית של GBS בזנים אחרים של עכברים12. המודל המתואר במאמר זה משקף את האופי החולף של קולוניזציית C. albicans ו-GBS הנצפה בבני אדם. בנוסף, קיימת שונות גבוהה בבני אדם הן ב-pH והן בהרכב המיקרוביום. למודל זה תנאי pH קרובים לניטרליים (~6.5)31. המיקרוביום הוגינלי של עכברי CD-1 נשלט על ידי Enterobacteriaceae ומיני Proteus13, הקשורים לאותם סוגי מצבי קהילה מיקרוביאלית וגינלית כמו GBS9,32.

על ידי טיפול בעכברים באנטיביוטיקה ובמנה בודדת של 17β-estradiol לפני הזרקת הפטריות, אנו מכינים את הסביבה כך שתהיה קולטת ל-C. albicans, ובכך מקלים על הקולוניזציה. הטיפול ב-Estradiol מקדם בנוסף את ההדירות בין הניסויים על ידי סנכרון של שלב הבעס (estrus), ובכך של הסביבה החיסונית המקומית, במועד ההזרקה. אנו מסנכרנים את העכברים לשלב ה-proestrus בעת הזרקת ה-C. albicans, דבר החופף לירידה בשכיחות הנויטרופילים ונמצא כי הוא מקדם עומסים פטרייתיים ב-FGT33,34. הסרת האנטיביוטיקה והחלפתה במים לשתייה טריים בשלב מוקדם של לוח הזמנים הניסויי לא רק מקלה על קולוניזציה של GBS, אלא גם מאפשרת למיקרובים מקומיים לאכלס מחדש את תעלת הנרתיק. יתרה מכך, הגבלת הטיפול ב-estradiol למנה מוקדמת בודדת מאפשרת לעכברים לחזור לדפוסי מחזור בעס טיפוסיים, למרות שהוכח כי מתן רציף של estradiol מקדם קולוניזציה12. הרכב תאי החיסון ב-FGT של עכברים משתנה לאורך מחזור הבעס, ותגובות חיסוניות ריריות הן רגישות מאוד להורמוני סטרואידים מיניים35,36,37. לפיכך, אנו עוקפים את המשתנה המבלבל של מתן estradiol חוזר כדי לבחון באופן ספציפי את ההשפעות של קולוניזציה מיקרוביאלית על סביבת המארח.

הנתונים המוצגים במחקר זה מייצגים את זן C. albicans SC5314 ואת זן ה-GBS COH1. בחרנו ב-SC5314 להקמת המודל בשל השימוש השכיח בו במיקולוגיה, השפע של כלים גנטיים הזמינים ברקע זה, וגוף ידע מבוסס על הביולוגיה והדינמיקה שלו in vitro ו-in vivo. קבוצת המחקר שלנו הראתה גם שזן C. albicans 529L יכול לקדם עומסי GBS ב-FGT22. זן ה-GBS COH1 שימש כנציג של שושלת serotype III sequence type 17, הקשורה לעמידות לאנטימיקרוביאליים ולמחלות פולשניות ברכך של רך-新生1,2. מודל זה משתמש במצעים סלקטיביים ודיפרנציאליים כדי לכמת את שכיחות ה-GBS ו-C. albicans בשטיפות נרתיקיות וברקמות. כדי להתאים מודל זה לשימוש עם מינים חיידקיים ופטריות אחרים, יהיה צורך לבצע אופטימיזציה של תנאי גדילה סלקטיביים מתאימים.

אינטראקציות בין פטריות לחיידקים מתגלות כמתווכות חשובות של אורח חיים מיקרוביאלי38,39. מספר מחקרים הדגימו כי אינטראקציות אלו יכולות לעצב באופן משמעותי קומנסליזם ופוטנציאל virulent. בנוסף, סביבת המאכסן מפעילה לחצים ייחודיים ויכולה להשפיע על גורמים כגון תכנות מטבולי, רגולונים של גורמי שעתוק ופרופילי עמידות לאנטיביוטיקה. לכן, חיוני להשתמש במודלים מייצגים in vivo כדי לאפיין את האופן שבו מיקרובים מקיימים אינטראקציה זה עם זה. ניתן להשתמש במודל העכברי המתואר בכתב יד זה כדי לבחון כיצד קולוניזציה וגינלית של חיידקים ופטריות רלוונטיים יכולה להשפיע על העומס המיקרוביאלי, ביטוי גנים ותגובת המאכסן.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים למשרד משאבי חיות מעבדה (Office of Laboratory Animal Resources) באוניברסיטת קולורדו אנשוטס (University of Colorado Anschutz), כולל מנהל המתקן וצוות הוויבאריום המסור. עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH R01AI153332 ו-R21AI188719 עבור K.S.D.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 µמסנן mSigma-AldrichSLGSR33SB
0.45 µמסנן mSigma-AldrichSLHAR33SB
מזרק 1 מ"ל עם Luer LockMcKesson16-S1C
חרוזי זירקוניה במידה של 1.0 ממ"סResearch Products International9835
מזרק עם חיבור לואר-לוק (Luer Lock) בנפח 10 מ"לMcKesson16-S10C
17βאסטרדיול-Sigma-AldrichE8875זהירות: 17β-אסטרדיול עלול להיספג דרך העור ודרך ריריות. יש להשתמש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים ולנקוט משנה זהירות בעת השימוש.
18G 1.5" מחטBD305196
מבחנה עם מכסה הברגה בנפח 2 מ"לFisher Scientific02-681-374
26G 0.5" מחטMcKesson16-N2605
אגרAlpha BiosciencesA01-102
אמפיסיליןResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
גנטמיציןVWR Life Science0304
ניאומיציןResearch Products InternationalN20040
תמיסת סלין בבופר פוספאט (PBS)Fisher ScientificBP2944
שמן שומשוםSigma-AldrichS3547
מצע Todd Hewitt BrothResearch Products InternationalT47500
ציר פפטון-דקסטרוז לשמריםBD242810

מקורות

  1. Megli CJ et al. Virulence and pathogenicity of group B Streptococcus.: virulence factors and their roles in perinatal infection. Virulence. 2025;16(1):2451173.
  2. Manuel G et al. Group B streptococcal infections in pregnancy and early life. Clin Microbiol Rev. 2025;38(1):e00154-22.
  3. Verani JR, McGee L, Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Recomm Rep. 2010;59(RR-10):1-36.
  4. Prevention of group B streptococcal early-onset disease in newborns: ACOG Committee Opinion Summary, Number 797. Obstet Gynecol. 2020;135(2):489-92.
  5. Hsu CY et al. Global patterns of antibiotic resistance in group B Streptococcu.s: a systematic review and meta-analysis. Front Microbiol. 2025;16:1541524.
  6. Sabroske EM et al. Evolving antibiotic resistance in group B Streptococci. causing invasive infant disease: 1970-2021. Pediatr Res. 2023;93(6):2067-71.
  7. Azad MB et al. Impact of maternal intrapartum antibiotics, method of birth and breastfeeding on gut microbiota during the first year of life: a prospective cohort study. BJOG. 2016;123(6):983-93.
  8. Duong QA, Curtis N, Zimmermann P. The association between prenatal antibiotic exposure and adverse long-term health outcomes in children: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 2025;90(1):106377.
  9. Mejia ME, Robertson CM, Patras KA. Interspecies interactions within the host: the social network of group B Streptococcus. Infect Immun. 2023;91(4):e00440-22.
  10. De Gregorio PR, Juárez Tomás MS, Leccese Terraf MC, Nader-Macías MEF. Preventive effect of Lactobacillus reuteri .CRL1324 on group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J Appl Microbiol. 2015;118(4):1034-47.
  11. Shiroda M, Aronoff DM, Gaddy JA, Manning SD. The impact of Lactobacillus. on group B streptococcal interactions with cells of the extraplacental membranes. Microb Pathog. 2020;148:104463.
  12. Patras KA, Doran KS. A murine model of group B Streptococcus .vaginal colonization. J Vis Exp. 2016;(117):e54708.
  13. Burcham LR et al. Interrelated effects of zinc deficiency and the microbiome on group B streptococcal vaginal colonization. mSphere. 2022;7(4):e00264-22.
  14. Marroquin SM, Cohen S, Neely MN, Doran KS. Akkermansia muciniphila impacts group B Streptococcus. vaginal colonization. mBio. 2026;17(6):e02868-25.
  15. Job AM, Doran KS, Spencer BL. A group B streptococcal type VII-secreted LXG toxin mediates interbacterial competition and colonization of the murine female genital tract. mBio. 2024;15(10):e02088-24.
  16. Beigi RH et al. Vaginal yeast colonization in nonpregnant women: a longitudinal study. Obstet Gynecol. 2004;104(5 Pt 1):926-30.
  17. Noble SM, Gianetti BA, Witchley JN. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nat Rev Microbiol. 2017;15(2):96-108.
  18. Schille TB et al. Commensalism and pathogenesis of Candida albicans .at the mucosal interface. Nat Rev Microbiol. 2025;23(8):525-40.
  19. Liang SH et al. The hyphal-specific toxin candidalysin promotes fungal gut commensalism. Nature. 2024;627(8004):620-7.
  20. Fróis-Martins R et al. Dynamic expression of candidalysin facilitates oral colonization of Candida albicans. in mice. Nat Microbiol. 2025;10(10):2472-85.
  21. Mauk KE et al. Commensal colonization of Candida albicans. in the mouse gastrointestinal tract is mediated via expression of candidalysin and adhesins. Microbiol Spectr. 2025;13(9):e00567-25.
  22. Cohen S et al. A fungal pathobiont promotes Streptococcus .vaginal persistence and pathogenesis through physical and metabolic interactions. Cell Host Microbe. 2026;34(6):1118-34.e7.
  23. Koh AY. Murine models of Candida .gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 2013;12(11):1416-22.
  24. Allison DL et al. Candida.-bacteria interactions: their impact on human disease. Microbiol Spectr. 2016;4(3):VMBF-0030-2016.
  25. Yano J, Fidel PL Jr. Protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of Candida .vaginitis. J Vis Exp. 2011;(58):e3382.
  26. Ardizzoni A, Wheeler RT, Pericolini E. It takes two to tango: how a dysregulation of the innate immunity, coupled with Candida. virulence, triggers VVC onset. Front Microbiol. 2021;12:692491.
  27. Yano J, Noverr MC, Fidel PL Jr. Vaginal heparan sulfate linked to neutrophil dysfunction in the acute inflammatory response associated with experimental vulvovaginal candidiasis. mBio. 2017;8(2):e00211-17.
  28. Patras KA et al. Group B Streptococcus. CovR regulation modulates host immune signaling pathways to promote vaginal colonization. Cell Microbiol. 2013;15(7):1154-67.
  29. Patras KA, Rösler B, Thoman ML, Doran KS. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 2015;8(6):1339-48.
  30. Spencer BL et al. Characterization of the cellular immune response to group B streptococcal vaginal colonization. J Innate Immun. 2025;17(1):566-78.
  31. Miao J, Willems HME, Peters BM. Exogenous reproductive hormones nor Candida albicans. colonization alter the near neutral mouse vaginal pH. Infect Immun. 2021;89(2):e00550-20.
  32. Rosen GH et al. Group B Streptococcus. and the vaginal microbiota. J Infect Dis. 2017;216(6):744-51.
  33. Latorre MC et al. Vaginal neutrophil infiltration is contingent on ovarian cycle phase and independent of pathogen infection. Front Immunol. 2022;13:1031941.
  34. Gómez-Oro C et al. Progesterone promotes CXCL2-dependent vaginal neutrophil killing by activating cervical resident macrophage-neutrophil crosstalk. JCI Insight. 2024;9(20):e177899.
  35. Winkler I et al. The cycling and aging mouse female reproductive tract at single-cell resolution. Cell. 2024;187(4):981-998.e25.
  36. Seavey MM, Mosmann TR. Estradiol-induced vaginal mucus inhibits antigen penetration and CD8+ T cell priming in response to intravaginal immunization. Vaccine. 2009;27(17):2342-9.
  37. Li S et al. Estrogen action in the epithelial cells of the mouse vagina regulates neutrophil infiltration and vaginal tissue integrity. Sci Rep. 2018;8(1):11247.
  38. Cohen S, Ost KS, Doran KS. Impact of interkingdom microbial interactions in the vaginal tract. PLoS Pathog. 2024;20(3):e1012018.
  39. MacAlpine J, Robbins N, Cowen LE. Bacterial-fungal interactions and their impact on microbial pathogenesis. Mol Ecol. 2023;32(10):2565-81.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Streptococcus B
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.