תהליך תצוגת פני שטח של שמרים מותאם להתפתחות מכוונת של פרוטאזות

סיכום

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה אופטימלי להתפתחות מכוונת של פרוטאזות ויראליות ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות מערכת בחירה מבוססת תצוגת שטח. הוא מתאר את עיצוב ספריית הכנסת DNA וקלטת הסובסטרט, אלקטרופורציה מותאמת ליעילות טרנספורמציה גבוהה, בחירה מבוססת מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה לחיתוך פרוטאז, וריצוף של וריאנטים מועשרים.

תקציר

אבולוציה מכוונת מחקה את תהליך האבולוציה הטבעי בסביבה מעבדתית מהירה ומבוקרת כדי לפתח חלבונים עם פונקציות או תכונות רצויות. סינון מאגר גדול של גנים מקודדי חלבון מוטנטים מאפשר בחירה פונקציונלית של וריאנטים רצויים ליישומים בביוטכנולוגיה, רפואה וביולוגיה סינתטית. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מבצעים אבולוציה מכוונת ב-Saccharomyces cerevisiae כדי להנדס וריאנטים של פרוטאז עם ספציפיות גבוהה עבור רצף סובסטרט לא טבעי. אנו מציגים את וריאציות הפרוטאז הללו על פני תאי השמרים כדי להקל על בחירת הווריאנטים הרצויים באמצעות מיון תאים מופעל-פלואורסצנציה (FACS) לאורך מספר סבבי העשרה. ארבעה מרכיבים מרכזיים בקסטת הסובסטרט מבוטאים יחד עם ספריית הפרוטאז: חלבון מיזוג המורכב מ-(i) תת-יחידת קולטני ההידבקות של השמרים Aga2, (ii) רצפי סלקציה ו-(iii) רצפי סובסטרט נגד-ברקה, (iv) רצפי תגי אפיטופים, ורצף אותות שחזור אנדופלזמי (ER) אופציונלי. תאי שמרים שבהם רק רצף תת-הבחירה נחתך מבודדים באמצעות FACS רב-צבעוני באמצעות נוגדנים אנטי-אפיטופים פלואורסצנטיים (פיקואריתרין/פלואורסאין איזותיוציאנאט מתויג). כאן אנו מספקים פרטים על הפרוטוקול האופטימלי, שלב אחר שלב, לביצוע קמפיין אבולוציית פרוטאז, כולל עיצוב ספריית הכנסות DNA ועיצוב קלטות תת-מצע, אלקטרופורציה של תאי שמרים עם יעילות טרנספורמציה גבוהה (עד 10⁹ טרנספורמנטים למיקרוגרם DNA), ברירה מבוססת FACS, העשרה וריצוף של וריאנטים שהתפתחו. אנו מדגימה את פרוטוקול האבולוציה המכוון שלנו על ידי התפתחות וירוס הטבק עם חריטה גרעינית פרוטאז A (TEVp), מפיצול רצף הסובסטרט הטבעי שלו, ENLYFQ↓S, לפיצול רצף חדש, ENLYFE↓S.

מבוא

פרוטאזות ציסטאין ממשפחת Potyviridae, ובמיוחד פרוטאזות ההכללה הגרעינית A (NIa), מהוות מקור כמעט בלתי מנוצל של אנדופפטידאזות ספציפיות לרצף. עם יותר מ-3,800 בני משפחה מאופיינים, פרוטאזות NIa חותכות רצף מובחן של שבעה חומצות אמינו. משפחת הפוטיו-וירוס מציעה מגוון רחב של פרוטאזות להנדסת מערכות בקרה חלבונים מתוכנתות, בניית מעגלים גנטיים מבוססי פרוטאזות אורתוגונליים, ופיתוח כלים ביוטכנולוגיים ספציפיים לרצפים ^1,2. למרות המגוון הטבעי הזה, רק שני פרוטאזות NIa, TEVp ופרוטאזות וירוס ריד טבק (TVMVp), אופינו והונדסו ביסודיות לשימוש מעבדה וביוטכנולוגי רחב ^3,4. ערכת הכלים המוגבלת הזו מגבילה את מרחב התכנון למעגלים מרובי רכיבים הדורשים פעילויות פרוטאז אורתוגונליות⁵, ובכך מניעה מאמצים להרחיב ולאפיין פרוטאזות NIa באמצעות אבולוציה מכוונת ^6,7.

תצוגת פני שטח שמרים הפכה לאחת הפלטפורמות החזקות ביותר לאבולוציה מכוונת, המאפשרות סקר ספריית חלבונים בתפוקה גבוהה באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה ⁽FACS)^6,7. לדוגמה, מערכת ה-YESS (YESS) של השמרים מחברת פעילות פרוטאז לתצוגת פני השטח דרך מסלול ההפרשה של S. cerevisiae ^6,7. מערכת YESS יושמה להנדסת ייחודיות חדשה של פרוטאז-סובסטרט והוכיחה שימושיות בקמפיינים אבולוציונליים מכוונים מרובי סבבים. במערכת זו, וריאנטים של פרוטאז מבוטאים יחד עם חלבון מיזוג המכיל קלטת מצע חיתוך עם סמנים של אפיטופים, ועוגן פני השטח של Aga1p מתבטא בזן השמרים EBY100. תיוג דיפרנציאלי עם נוגדנים פלואורסצנטיים מבדיל בין קסטות סובסטרט לא מפורקות המוצגות על פני התא. מנגנון תצוגה תלוי פעילות זה תואם ישירות לבחירה איטרטיבית מבוססת FACS עבור ספריות של 10,⁷ וריאנטים ^6,7 ומעלה.

תנאי יסוד לאבולוציה מכוונת הוא היכולת להכניס ספריות וריאנטים בקנה מידה מספק להשגת כיסוי מספק של מרחב הרצף היעד. עבור ספריות מוטגנזה ברוויה באתר המשתרעות על פני מספר מיקומים של חומצות אמינו, נדרשות תשואות טרנספורמציה של 10⁸ עד 10⁹ טרנספורמנטים ייחודיים כדי להבטיח שהמגוון המוכנס לספרייה ייוצג היטב באוכלוסייה הממוינת. קיימות מספר שיטות להכנסת DNA חיצוני ל-S. cerevisiae, כל אחת עם תקרות תפוקה מובחנות. שיטת הטרנספורמציה הכימית הקונבנציונלית עושה שימוש ב-DNA נושא ליתיום אצטט/חד-גדילי/פוליאתילן גליקול (LiAc/ssDNA/PEG) בשל פשטותה ונגישותה. עם זאת, הוא בדרך כלל משיג יעילות טרנספורמציה של רק 10^{יחידות יצירת מושבות} (CFU) למיקרוגרם DNA, מה שאינו מגיע לשונות הרצף הנדרשת לקמפיינים גדולים של ספריות⁸. לעומת זאת, שיטת האלקטרופורציה מפעילה שדה חשמלי במתח גבוה כדי לחדור זמנית לממברנת התא ולהקל על קליטת DNA. אלקטרופורציה משיגה באופן עקבי את יעילות הטרנספורמציה הגבוהה ביותר בין שיטות הטרנספורמציה הזמינות, כאשר פרוטוקולים אופטימליים מדווחים על תפוקות של 10⁸–10⁹ CFU⁹. נצפה כי יעילות האלקטרופורציה ב-S. cerevisiae רגישה מאוד לשלב צמיחת התא, למסת DNA ולהרכב הבופר, ומספקת מסגרת שהותאמה מאז באופן נרחב לאבולוציה מכוונת בקנה מידה^{ספרייתי.}

הפרוטוקול המתואר כאן עושה שימוש בזן S. cerevisiae EBY100, זן מארח המאומץ באופן נפוץ להצגת פני השטח של השמרים. EBY100 תוכנן על ידי בודר וויטרופ על ידי שילוב קסטת ביטוי AGA1 תחת שליטת פרומוטר GAL1 המושרה גלקטוז לתוך לוקוס הכרומוזום AGA1 של זן ההורה החסר פרוטאז BJ5465¹⁰. הזן זמין מסחרית מ-ATCC (קטלוג מס' MYA-4941; המפקיד K.D. Wittrup), נושא את הגנוטיפ MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). כתוצאה מכך, גם Aga1p וגם מיזוג הקסטה של Aga2p-sub מבוטאים מאותו פרומוטר המושרה על ידי גלקטוז, מה שמבטיח ששתי תת-היחידות יושרו יחד ויתאספו לקומפלקס Aga1p–Aga2p המקושר לדיסולפידים שמעגן את ההיתוך המוצג לדופן התא.

למרות השימוש הנרחב ב-EBY100 ביישומי תצוגת שמרים, אף פרוטוקול שפורסם לא אופטימיזציה שיטתית לאלקטרופורציה של זן זה בתפוקות בקנה מידה ספרייתי. פרמטרים ספציפיים ל-EBY100, כגון שלב הצמיחה האופטימלי בקציר, הרכב התווך במהלך תת-התרבות, והקשר הכמותי בין צפיפות אופטית התחלתית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) ליעילות הטרנספורמציה, נותרו להיות מאופיינים ואופטימיזציה קפדנית. כאן, אנו מדווחים כי יעילות הטרנספורמציה ב-EBY100 עולה באופן מונוטוני עם OD₆₀₀ של התרבית בקציר, כאשר תאים בשלב הלוגריתמי המאוחר מניבים שיעורי טרנספורמציה גבוהים משמעותית מאלו שנקטפו בשלב הלוג המוקדם. הערכנו פרמטרים קריטיים של הפרוטוקול, כולל ערכי OD₆₀₀ הראשוניים בעת החיסון, שימוש ב-2 × Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) לתת-תרבויות, נוסחאות בופר אלקטרופורציה, ותנאי צמיחה לאחר האלקטרופורציה. הפרוטוקול המוצג כאן מספק תהליך עבודה אופטימלי שלב אחר שלב (איור 1A–C, איור 2, איור 3A–D, איור 4A–E) להכנת תאים EBY100 בעלי יכולת אלקטרוכשליות וביצוע אלקטרופורציה בספריית DNA ביעילות גבוהה, המניבה שיעורי טרנספורמציה עקביים מעל 10⁹ CFU. כדי לאמת פרוטוקול זה, ערכנו קמפיין אבולוציוני מכוון מקיף להנדסת TEVp עם ספציפיות חיתוך משתנה בארבעה סבבים של בחירה והעשרה מבוססת FACS. ריצוף של וריאנטים מועשרים לפרוטאז אישר גיוון משמעותי בשאריות הממוקדות בתוך כיס קשירת הסובסטרט של הפרוטאז, מה שהראה כי הפרוטוקול מספק כיסוי ספרייה מספק של שטח הרצף לתמיכה בקמפיינים אבולוציונליים פרודוקטיביים. פרוטוקול זה יהיה בעל תועלת רחבה לחוקרים המשתמשים ב-EBY100 לאבולוציה מכוונת מבוססת תצוגת פני שטח שמרים ולסקר תואמי FACS ויעילים של פרוטאזות, נוגדנים⁹, קינאזות¹¹ וקולטנים¹², בין חלבונים נוספים.

פרוטוקול

כל הניסויים שכללו את S. cerevisiae הרקומביננטי בוצעו בהתאם למדיניות ולנהלים של ועדת הבטיחות הביולוגית והבטיחות הכימית המוסדית באוניברסיטת טקסס בדאלאס. זני שמרים רקומביננטיים טופלו במסגרת הכלה ביו-בטיחותית רמה 1 (BSL-1) בהתאם לפרקטיקות מיקרוביולוגיות מוסדיות מבוססות. אלקטרופורציה, תרבית ומיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) בוצעו בהתאם לנהלים מאושרים לבטיחות ביולוגית מוסדית. תרביות שמרים וצרכנים מזוהמים נוקו וזוהרו כפסולת ביולוגית מסוכנת בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. הכנת וקטור והכנסה

1. יצירת ספריות פרוטאז של פוטויראל באמצעות מוטגנזה רוויה באתר
   1. עיצוב באמצעות תוכנות עיצוב רצף החופפות בין 30 ל-50 מר, אוליגונוקלאוטידים קדימה ואחורה, ליצירת ספריית מוטנטים של פרוטאזות. החליפו את קודון הטיפוס הפראי באוליגונוקלאוטיד המתאים בקודון מנוון NNS, כאשר N מייצג A, T, G או C, ו-S מייצג G או C, עבור מיקומים המיועדים למוטגנזה.
   2. תכנן חפיפה של 3′ בין כל זוג אוליגונוקלאוטידים קדמי ואחורי עם טמפרטורת התכה (Tm) של 55–60 מעלות צלזיוס. תכננו את האוליגונוקלאוטידים הראשונים והאחרון שיכילו חפיפה של 50 NT עם וקטור התצוגה של פני השמרים מעבר לאתרי ההגבלה.
   3. ודא שלפחות קצה אחד של ההכנסה חופף בדיוק לקצה אחד של הווקטור הלינארי כדי לאפשר רקומבינציה הומולוגית¹³. הימנע מרווחים בין אוליגונוקלאוטידים סמוכים¹⁴.
   4. החזירו את האוליגו ל-100 מיקרומום עם_H2O דה-יוניזציה. בצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל, משלבים 0.5 מיקרוליטר מכל אוליגו לנפח סופי של 200 מיקרוליטר (ריכוז סופי של 250 ננומטר לכל אוליגו).
   5. הגדר תגובת PCR עם הרכיבים המפורטים בטבלה 1 כדי להרכיב את ספריית הפרוטאז, תוך שימוש בתנאי התרמחזור בטבלה 2.
   6. הגדר תגובת PCR שנייה באמצעות האוליגואים הקדמיים והאחוריים החיצוניים ביותר (טבלה 3) תוך שימוש במוצר ה-PCR הראשון שהורכב כתבנית. הגביר את המכפלה כפי שמוצג בטבלה 4.
   7. הרץ את מוצר ה-PCR השני על ג'ל אגרוז 1% עם אתידיום ברומיד (0.5 מיקרוגרם/מ"ל) ב-240 וולט למשך 30 דקות. הסר את הרצועה המתאימה לאורך ה-DNA הצפוי.
      הערה: זהירות: אתידיום ברומיד הוא מוטגן ויש לטפל בו באמצעות ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל מעיל מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות. הימנעו ממגע עור ושאיפה. השליך את הג'לים, החומרים המכילים ברומיד אתידיום, חומרים מתכלים ומוצרי צריכה כפסולת כימית מסוכנת בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות.
   8. לטהר בעזרת ערכת חילוץ ג'ל. נוזל ב-50 מיקרוליטר של_H2O דה-יוני.
   9. מדדו את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. אחסן את ה-DNA בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
      הערה: כל תגובה של 50 מיקרוליטר^של ה-PCR השני תניב כ-0.5–1.0 מיקרוגרם DNA כולל. מכיוון שכל אלקטרופורציה דורשת 12 מיקרוגרם מספריית הפרוטאז (כלומר, הכנסה), הגדילו את התגובות בהתאם.
2. מכלול קלטת מצע
   1. הכינו לוחות LB-אגר ומדיום נוזלי LB-כלוראמפניקול. ראו מתכונים בטבלה 5.
   2. תכנן סט של אוליגונוקלאוטידים חופפים של 30 מרים בכיוון קדימה ואחורה להרכבת קלטות המצע. תכנן את קצות 5′ של כל אוליגונוקלאוטיד הפוך ושל האוליגונוקלאוטיד הקדמי של השבר הבא כך שיתאימו ב-4 נוקלאוטידים.
   3. החזר את האוליגואים הליופילים ל-100 מיקרומום באמצעות H2_Oדה-יוניזציה.
   4. ערבב חומרים כמו בטבלה 6.
   5. השתמשו בתוכנית האופניים בטבלה 7 כדי לאנל ולזרחן את תערובת האוליגו.
   6. אוליגו מחוסל מדולל 4-פי ב-H2 O דה-יוני כדילהגיע לריכוז סופי של 1.25 מיקרומון.
   7. משלבים את תערובת האוליגו המחוטשת עם הווקטור (למשל, pDD1523), לפי טבלה 8.
   8. בצע את הרכבת שער הזהב, בהתאם לתוכנית האופניים בטבלה 9.
      הערה: לדוגמה, לפלסמיד pDD1523 יש אתר הגבלה מסוג IIS (BsmBI) במורד הזרם של פרומוטר GAL1/10. הרכבה מוצלחת מאפשרת השראה גלקטוזית של קלטת המצע⁷.
   9. המרו את הפלסמיד המתקבל ל-E. coli.
   10. תאי לוחות על אגר LB עם האנטיביוטיקה המתאימה. דגרו ל-16–18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   11. בחר מושבות מבודדות וחסן אותן ב-5 מ"ל מדיום LB. דגרו במהלך הלילה (16–18 שעות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות (220 סל"ד).
   12. חלץ פלסמידים מתרביות לילה באמצעות ערכת מיני-פרפ של פלסמיד.
   13. מדוד את ריכוז הפלסמידים באמצעות ספקטרופוטומטר, ואז שלח לריצוף.
3. ליניאריזציה של וקטור תצוגת שמרים
   1. לינאריזציה של פלסמיד תצוגת השמרים, לדוגמה, עכל pDD1524 עם אנזימי הגבלה SphI ו-PstI להכנת וקטור תצוגת השמרים המכיל את קסטת הסובסטרט לאלקטרופורציה. ערבבו את החומרים המפורטים בטבלה 10 ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעה.
   2. הרץ את מוצר העיכול ההגבלה על ג'ל אגרוז 1% ב-240 וולט למשך 30 דקות. להסיר את הרצועה המתאימה לאורך ה-DNA הצפוי ולטהר באמצעות ערכת חילוץ ג'ל.
      הערה: כל 50 מיקרוליטר של עיכול הגבלה יניב כ-0.5–1.0 מיקרוגרם של DNA כולל. מכיוון שכל אלקטרופורציה דורשת 4 מיקרוגרם של וקטור ליניארי, הגדילו את תגובות העיכול בהתאם.

2. אלקטרופורציה

הערה: יש לפעול לפי נהלי בטיחות מוסדיים לטיפול בחומרים ביולוגיים ותגובים, ללבוש ציוד מגן אישי מתאים ולהיפטר מפסולת ביולוגית וכימית בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. הכנת בופרים, לוחות ומדיה (יומיים לפני האלקטרופורציה)
   1. הכנת מדיה לצמיחה (1 × YPD; 2 × YPD; חומצות קסמינו סינתטיות דקסטרוז, SDCAA+; וחומצות קזמינו סינתטיות גלקטוז, SGCAA+), לוחות (YPD ו-SDCAA), בופר אלקטרופורציה ומים סטריליים בהתאם למתכונים בטבלה 5. אחסון ב-4 מעלות צלזיוס.
2. הכנת פלטה מפוספסת של EBY100.
   1. מרח שמרי EBY100 על אגר YPD ממלאי גליצרול. גדל בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
   2. אחסן את הצלחת בטמפרטורה של 4°C לאחר הצמיחה.
      הערה: צלחת עם פסים נשארת שמישה עד חודש אחד; סמן את תאריך הרצף על הצלחת.
3. הכנת קדם-תרבות EBY100 (יום לפני האלקטרופורציה)
   1. הכן 125 מ"ל של 1 × YPD בבקבוק ארלנמאייר בנפח 500 מ"ל.
   2. הכן 25 מ"ל של 1 × YPD בצינור קונוסי של 50 מ"ל. באמצעות קצה מיקרופיפטה, אספו תאי EBY100 מהצלחת שגדלה במשך יומיים. לאחר מכן, העבירו את תאי השמרים מקצה הפיפטה לצינור הקוני המכיל 1 × YPD.
      הערה: הפס של התאים אמור ליצור מריחה באורך של כ-1–2 מ"מ.
   3. הסר את קצה המיקרופיפטה ומערבל את הצינור הקוני כדי להבטיח ערבוב מספק.
   4. הכינו קדם-תרבות של 150 מ"ל על ידי העברת 25 מ"ל של 1 × YPD המכילים את תאי השמרים לבקבוק 500 מ"ל המכיל 125 מ"ל של 1 × YPD. לסובב לערבב.
   5. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדדו את_{ה-OD 600} על ידי הכנת שני מיקרוקובטים באורך מסלול של 1 ס"מ: אחד עם 1 מ"ל של 1 × YPD כבקרה ריקה, ואחר עם 1 מ"ל של טרום-תרבית
   6. גדלו 150 מ"ל של טרום-תרבות בלילה (16–20 שעות) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות ב-270 סל"ד.
4. הכנת תת-תרבות ב-OD₆₀₀ הרצוי (ביום האלקטרופורציה)
   1. הכינו את בופר ההתניה ומדיום ההתפתחות, כפי שמתואר בטבלה 5.
   2. מדדו את מנת האורגז₆₀₀ של הפרה-תרבעה הלילית (הצפוי של OD₆₀₀₀ הוא 17–22). כדי להיות בטווח הליניארי של הספקטרופוטומטר, יש למדוד דילול של 1:20 של הפרה-תרבות.
   3. חשב את נפח הפרה-תרבית הנדרש לחיסון תת-תרבית של 100 מ"ל. מומלץ לבצע תת-תרבות ראשונית OD₆₀₀ של 3.0–4.0.
   4. דילל את התרבית_{ל-OD הראשוני הרצוי 600} ב-100 מ"ל של 2 × YPD בבקבוק Erlenmeyer של 500 מ"ל.
   5. דגרו את תת-התרבית של 100 מ"ל בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות אורביטליות ב-270 סל"ד למשך 4 שעות.
5. הכנת המדיה במהלך דגירה של 4 שעות
   1. שמור על בופר אלקטרופורציה קר ומים סטריליים מוכנים (מהשלב 2.1.1).
   2. הכינו בופר מרכך (100 מ"ל), לפי המתכון בטבלה 5. השתמש ב-20 מ"ל של בופר התניה בכל טרנספורמציה; הגדילו את הגודל בהתאם. אחסן בטמפרטורת החדר (20–23 מעלות צלזיוס).
      הערה: אזהרה: בופר מרכך מכיל דיתיותרייטול (DTT) ואצטט ליתיום (LiAc), שהם גירויים כימיים שעלולים לגרום לגירוי בעור ובעיניים. לבש ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות, ולטפל בחומרים אלו בהתאם לנהלי בטיחות כימית מוסדיים. להשליך תמיסות לא בשימוש ובופרים משומשים כפסולת כימית בהתאם להנחיות המוסדיות.
   3. הכינו מדיום צמיחה (50 מ"ל): ערבבו 25 מ"ל של 2 × YPD ו-25 מ"ל של 1 מטר סורביטול יחד. השתמש ב-8 מ"ל של מדיה של צמיחה בכל טרנספורמציה. אחסן בטמפרטורת החדר (20–23 מעלות צלזיוס).
6. הכנת תאי שמרים בעלי יכולת אלקטרופוטנציאלית לאחר 4 שעות דגירות.
   1. חלק תת-תרבות של 100 מ"ל לשני צינורות קונים של 50 מ"ל. אוספים תאים בצנטריפוגציה בטמפרטורה של 4°C ו-1,500 × גרם למשך 3 דקות, ואז משחררים את המדיום. שמרו על התאים על הקרח עד להשלמת שלב 2.6.4.
   2. החזירו בעדינות כל כדור תא עם 25 מ"ל מים קרים-סטריליים. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-1,500 × גרם למשך 3 דקות, ואז מפעילים את המדיה.
   3. חזור על שלב 2.6.2.
   4. החזירו בעדינות כל כדור תא עם 25 מ"ל של בופר אלקטרופורציה קר כקרח. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-1,500 × גרם למשך 3 דקות, ואז משחררים את המדיה.
   5. הסר את התאים מהקרח והשתה בעדינות כל כדור תא עם 10 מ"ל של בופר תלייה בטמפרטורת החדר (20–23 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, התאסף לתוך בקבוק אחד של Erlenmeyer בנפח 125 מ"ל ודגר בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידת מסלול ב-270 סל"ד למשך 30 דקות.
   6. שפוך את התאים לצינור של 50 מ"ל. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-1,500 × גרם למשך 3 דקות. פנה את התקשורת.
   7. החזירו בעדינות את כדור התא עם 50 מ"ל של בופר אלקטרופורציה קר כקרח. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-1,500 × גרם למשך 3 דקות, ואז מפעילים את המדיה.
   8. החזירו את כדור התא לנפח סופי של 1 מ"ל על ידי הוספת כ-100–200 מיקרוליטר של בופר אלקטרופורציה. שמור על התאים על קרח עד לאלקטרופורציה.
      הערה: תאים בעלי יכולת אלקטרופוטנציאלית יכולים להיות מוקפאים (כלומר, להניח במקפיא בטמפרטורה של –80 מעלות צלזיוס) ולהשתמש בהם מאוחר יותר ללא אובדן משמעותי ביעילות האלקטרופורציה.
7. אלקטרופורציה, צמיחה וציפוי
   1. קובט אלקטרופורציה לפני קירור עם גודל רווח של 0.2 ס"מ על קרח.
   2. העבר 380 מיקרוליטר מהכדור התלוי מחדש לצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל. מערבבים עם 4 מיקרוגרם DNA פלסמיד או עם 4 מיקרוגרם של וקטור פלסמיד ליניארי ו-12 מיקרוגרם של אינסרט. ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג.
      הערה: כדי למקסם את מספר התאים האלקטרופוריים, ריכוזי ה-DNA הווקטורי וההוכנס צריכים להיות אידיאלית בין 700–800 ng/μL. אם הריכוזים נמוכים מזה, השתמש במרכז ואקום.
   3. העבר את המתלה לקובט האלקטרופורציה מקורר מראש. תשאיר על הקרח 5 דקות.
   4. נגב את דפנות הקובט אחרי 5 דקות עם מגבון מעבדה ללא סיבים כדי להיפטר מהלחות שנותרה, שעלולה לגרום לקשתות במהלך האלקטרופורציה. הימנע מבועות או תאים מעל לוחות המתכת בקובט, שכן הם עלולים לגרום לקשתות. כדי לשמור על טמפרטורת הקור של הקובט, אין לגעת באלקטרודות הלוחות.
   5. הכן 8 מ"ל של מדיום צמיחה בצינור קוני של 50 מ"ל.
   6. אלקטרופורט התאים בהגדרות הבאות: מתח של 2.5 קילווולט, קיבול של 25 מיקרופרה, והתנגדות של 200 Ω⁹. טווח הזמן הקבוע המקובל הוא 2.8–4.5 מילישניות.
      הערה: זהירות: אלקטרופורציה כוללת פולסים חשמליים במתח גבוה. ודאו שהקובטות יושבות כראוי ופעלו לפי הוראות ההפעלה של היצרן. השליכו את קובטות האלקטרופורציה המשומשות כפסולת ביו-מסוכנת לפי ההנחיות המוסדיות.
   7. הציפו את הקובטה מיד בכ-200 מיקרוליטר של מדיום צמיחה מהצינור הקוניקלי והעבירו תאים אלקטרופוריים לצינור הקוני של 50 מ"ל. הוסף עוד 200–350 מיקרוליטר של מדיום צמיחה עד שלא יישאר נוזל נראה לעין בקובטה.
   8. דגרו את צינור הקונוס של 50 מ"ל של תאים אלקטרופוריים ב-8 מ"ל של מדיום צמיחה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ללא ניעור במשך שעה. הפוך את הצינור כל 15 דקות כדי לערבב.
   9. איסוף תאים בצנטריפוגה ב-1,500 × גרם, 25 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. ואז לנקז את התקשורת.
   10. החזירו את התאים במדיות נפילת שמרים מתאימות כדי לשמור על הבחירה לתאים שעברו טרנספורמציה. לפלסמידים המכילים את סמן הבחירה TRP1, יש להשעות תאים ב-250 מ"ל SDCAA+ (שחסר בהם טריפטופן) כדי לשחזר באופן סלקטיבי שמרים ששמרו על הפלסמיד.
   11. דגרו בלילה (16–20 שעות) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלול ב-270 סל"ד.

3. השראה, צביעה ומיון ציטומטרי זרימה של תאי שמרים

1. השראה של ספריית פרוטאז וקלטת מצע (יום אחד לפני המיון)
   1. מדד OD₆₀₀ כפי שמופיע בשלב 2.4.2 לאחר צמיחה לילית של טרנספורמנטים במדיה שנשרתה.
   2. Aliquot 12 מ"ל שמרים וצנטריפוגה ב-3,200 × גרם למשך 5 דקות.
   3. הסר את הסופרנטנט והחזיר את כדור התא במדיום ההשראה SGCAA+ ל-OD₆₀₀ של 0.5. חשב את נפח ההשעיה מחדש הנדרש באמצעות משוואת הדילול, C₁V₁ = C₂V₂.
   4. העברה לבקבוק Erlenmeyer בנפח 125 מ"ל וגדלה במהלך הלילה למשך 18–24 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות אורביטליות ב-270 סל"ד.
2. צביעת נוגדנים פלואורסצנטיים (ביום המיון)
   1. מדד מנת חמצון₆₀₀ של התאים לאחר האינדוקציה. השתמש בשני קובטים: אחד עם 1 מ"ל SGCAA+, והשני עם 950 מיקרוליטר SGCAA+ מעורבבים עם 50 מיקרוליטר תאים. הכפל את ערך_{ה-OD 600} שנמדד ב-20 כדי לקבל את_{ה-OD 600} האמיתי של התאים שלאחר האינדוקציה.
   2. נרמול כל דגימה ל-3 ×-10⁷ תאים לצביעת נוגדנים ומיון FACS. השתמש ב-C₁V₁ = C₂V₂ כדי לחשב את נפח התאים שיש להעביר מבקבוק ההשראה.
      הערה: עבור מוטגנזה רוויה של NNS בארבעה אתרים, גודל הספרייה התיאורטית הוא 10⁶ וריאנטים. כדי לדגום מספיק את הספרייה, יש לסנן לפחות פי 10 מגודל הספרייה, או 10-7 תאים. לדוגמה: אם רצוי C₁V₁ = 3 × 10⁷ תאים ו-C₂ = OD לאחר האינדוקציה₆₀₀ מתוך 6 (כלומר, 6 × 10⁷ תאים/מ"ל), אז מחלקים 500 מיקרוליטר של תאים מושרים (כלומר, V₂ = 3 × 10⁷ תאים / 6 × 10⁷ תאים/מ"ל = 500 מיקרוליטר).
   3. העבר נפח מחושב של תאים לצינור וצנטריפוגה של 1.5 מ"ל בצנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 5 דקות.
   4. הסר את הסופרנטנט ותשלים מחדש 500 מיקרו ליטר של מי מלח מפוזר פוספט (PBS) + 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA).
   5. צנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 5 דקות וחזרו על שלב 3.2.4.
   6. צנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 5 דקות, ובינתיים, להשלים את שלב 3.2.7.
   7. הכינו תערובת צבע נוגדנים בצינור בנפח 1.5 מ"ל המכילה אנטי-HA פלואורסצאין איזותיוציאנאט (FITC) (0.5 מיקרוגרם^{ל-10 7} תאים), anti-FLAG phycoerythrin (PE) (0.05 מיקרוגרם/10⁷ תאים), ו-PBS + 0.5% BSA (100 מיקרוליטר/10⁷ תאים). תשאירו את הצינור על קרח.
   8. הסר את הסופרנטנט ותשהה מחדש עם תערובת הכתמים. השתמש ב-300 מיקרוליטר מתערובת הצבע לכל 3 ×-^10-7 תאים. אל תסחרר את הצינור; רק הפוך או הפוך.
   9. השאר תאים על קרח בחושך במשך שעה אחרי ההשעיה מחדש.
3. שטיפה לאחר צביעה
   1. הצנטריפוגה צבעה תאים בעוצמה של 5,000 × גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט והחזיר את הכדור ל-PBS המכיל 0.5% BSA באמצעות 0.5 מ"ל ל-1 ×-10⁷ תאים (למשל, 500 מיקרוליטר ל-1 ×^{10 7} תאים או 1.5 מ"ל ל-3 × 10⁷ תאים).
   2. צנטריפוגה ב-5,000 × גרם, 5 דקות. הסר סופרנאנט, תלה מחדש ב-750 מיקרוליטר PBS + 0.5% BSA.
   3. העבר עוד 750 מיקרוליטר של PBS + 0.5% BSA לצינור איסוף בנפח 10 מ"ל.
4. FACS
   1. בצע את ההפעלה וההכנה הנדרשת של הציטומטר לניסוי חדש.
   2. צור שלושה גרשי נקודות. בתרשים הנקודה הראשון, בחר את שם ציר ה-X כדי להציג את ערוץ שטח הפיזור הקדמי (FSC-A) ואת שם ציר ה-Y כדי להציג את ערוץ אזור הפיזור הצדדי (SSC-A).
      הערה: זה יקל על בחירת התאים החיים.
   3. שמור על שם ציר ה-X כדי להציג ערוץ FSC-A תוך שינוי ערוץ ציר ה-Y להצגת גובה פיזור קדמי (FSC-H) בגרף הנקודה השני.
      הערה: זה יקל על בחירת סינגלטים.
   4. בחר את שם ציר ה-X כדי להציג את ערוץ ה-PE ואת שם ציר ה-Y כדי להציג את ערוץ ה-FITC על גרף הנקודה השלישי.
   5. הרץ שליטה שלילית על הציטומטר באמצעות ערוצי 530/30 ננומטר (FITC) ו-585/42 ננומטר (PE). בצע מיון באמצעות פיה של 70 מיקרון בלחץ מעטפת של 70 psi. רכוש דגימות במהירות של 4000–5000 אירועים לשנייה.
   6. צייר שער פוליגוני סביב האוכלוסייה העיקרית של תאי שמרים שלמים כדי להוציא פסולת וחלקיקים קטנים עם אותות FSC-A ו-SSC-A נמוכים בגרף הנקודה הראשון (FSC-A מול SSC-A).
   7. סינגלטים של שער בגרף FSC-H מול FSC-A בתוך שער זה, על ידי בחירת האוכלוסייה הליניארית המציגה יחס פרופורציונלי בין FSC-H ל-FSC-A. להוציא אירועים שסוטים מההתפלגות הליניארית ומתאימים לדאבלטים ולאגרגטים של תאים.
      הערה: גרף הנקודה השלישי בין PE ל-FITC יציג אשכול אלכסוני של נקודות עבור הבקרה השלילית (כלומר, תאי שמרים שמבטאים את קלטת הסובסטרט השלמה).
   8. הרץ דגימות ומיין תאי שמרים לפי ערכי PE/FITC הרצויים לצינור איסוף. נתח מספר תאים כולל התואם לפחות פי 10 מגודל הספרייה התיאורטית כדי להבטיח ייצוג מספק של כל הווריאנטים (למשל, ניתוח ~1 ×^{10 7} תאים עבור ספרייה עם מגוון תיאורטי של ~1 × 10⁶ וריאנטים).
   9. מקם את שער המיון מתחת לאלכסון PE/FITC של אוכלוסיית הבקרה השלילית.
      הערה: שערים מחמירים יותר משפרים את העשרת הווריאנטים הרצויים אך מפחיתים את התאוששות התאים.
5. לאחר FACS
   1. צינור איסוף צנטריפוגות בעוצמה של 3,200 × גרם למשך 5 דקות. הסר בזהירות את הסופרנאנט, השאיר 1 מ"ל, ותלווה מחדש ב-5 מ"ל של PBS.
      הערה: השאירו 1 מ"ל של סופרנאנט, שכן כדור התא בתחתית לא יהיה נראה לאחר הצנטריפוגה.
   2. תאי צנטריפוגה שוב ב-3,200 × גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט, והשאיר 1 מ"ל. השעתי מחדש עם 4 מ"ל SDCAA+.
   3. בבקבוק Erlenmeyer בנפח 250 מ"ל, הוסיפו 15 מ"ל SDCAA+. העבר את התאים התלויים משלב 3.5.2 לתוך הבקבוקון הזה.
   4. דגירה בלילה למשך 18–24 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות במסלול ב-270 סל"ד.
   5. חזור על שלבים 3.1, 3.2, 3.3 ו-3.4 בכל סבב של אבולוציה מכוונת.

4. שחזור וריצוף פלסמידים של שיבוטים בודדים

1. לגדל מושבות בודדות
   1. צרו מלאי גליצרול על ידי ערבוב 500 מיקרוליטר מהתרבית הנוזלית לאחר שלב 3.5.4 ו-500 מיקרוליטר של גליצרול 50% סטרילי, מה שמוביל לתמיסת מלאי גליצרול של 25%. מערבוב כדי לערבב היטב את התאים.
   2. אחסן במקפיא בטמפרטורה של –80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחסון ארוך טווח, העבר לחנקן נוזלי.
   3. גרדו את מאגר הגליצרול באמצעות קצה סטרילי של 1000 מיקרוליטר וערבבו לתוך 100 מיקרוליטר SDCAA+. הצלחו את התערובת הזו על צלחת SDCAA ודגרו אותה הפוך בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
   4. קטף מושבות אחרי 3 ימים, וגדל אותן בלילה ב-1.5 מ"ל SDCAA+ בצינורות של 14 מ"ל.
2. בצע מיני-פרפ שמרים לחילוץ פלסמידים
   1. הפלטה של התרבית הלילית על ידי צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך דקה אחת והשעה מחדש ב-200 מיקרו ליטר של תמיסה 1 מערכת טיהור פלסמיד שמרים.
   2. מוסיפים 5 מיקרוליטר של תמיסת אנזימים ליזטית (5 U/μL).
   3. דגרו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות על מיקסר מקצה לקצה.
   4. בצע מחזור הקפאה-הפשרה על ידי הקפאה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות והפשרה בטמפרטורה של 42 מעלות למשך 10 דקות באמבט מים.
   5. הוסיפו 200 מיקרול תמיסה 2 מערכת טיהור פלסמיד שמרים, ערבבו על ידי הפיכה 2–3 פעמים, ותנו ל-5 דקות.
   6. הוסיפו 400 מיקרוליטר של תמיסה 3 מערכת טיהור פלסמיד שמרים וערבבו על ידי הפיכה של 2–3 פעמים. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 5 דקות.
   7. טיהור DNA של פלסמיד באמצעות ערכת טיהור עם קיבולת קישור DNA גבוהה.
      הערה: בשל כמות גדולה של DNA שמרי גנום שנגזר מהתאים המלוזרים, יש להשתמש בעמודה מבוססת סיליקה עם קיבולת קשירת DNA גבוהה יותר (35 מיקרוגרם) במקום עמודת טיהור DNA פלסמיד שמרים בעלת קיבולת נמוכה יותר (5 מיקרוגרם)¹⁵.
   8. מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. תפוקת ה-DNA היא 10–30 ng/μL.
3. המרת פלסמידים מטוהרים לתאי E. coli מיומנים כימית
   1. הכינו מדיום SOC לפי המתכון בטבלה 5, וצלחות LB-כלוראמפניקול. כמו כן, חממו אמבט מים ל-42 מעלות צלזיוס.
   2. חממו צלחת LB-כלורמפניקול לכל פלסמיד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   3. הוצא צינור של תאים כימיים מהמקפיא בטמפרטורה של –80°C והפשיר על קרח.
   4. Aliquot 30 מיקרוליטר של תאים מיומנים לכל פלסמיד לצינור של 1.5 מ"ל על קרח.
   5. פיפטה של 3 מיקרוליטר פלסמיד לתאים מתאימים. מפעילים לערבב ותנו לזה לשבת 5 דקות על הקרח.
   6. בצע הלם חום על ידי דגירה קצרה של התאים באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות.
   7. לדגר על קרח למשך 2 דקות.
   8. הוסיפו 300 מיקרוליטר של מדיום SOC לתאים ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד.
   9. פלטה בנפח 50–100 מיקרוליטר של תאים מתאימים שעברו טרנספורמציה על לוחות מחוממים מראש.
   10. דגר את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס הפוך למשך 18 שעות.
4. איסוף מושבות
   1. הוסיפו 5 מ"ל מדיום נוזלי LB-כלורמפניקול לצינורות תרבית עגולים של 14 מ"ל.
   2. בחר מושבה עם קצה סטרילי של 1000 מיקרוליטר, והניח אותו לצינור תרבית.
   3. הניחו צינורות בשייקר (220 סל"ד, זווית 30°–45° למקסום האוורור) בטמפרטורה של 37°C למשך 18 שעות.
5. הפקת פלסמיד מתרבות נוזל חיידקים
   1. צנטריפוגה את התרביות הנוזליות ב-3,200 × גרם למשך 4 דקות. דקנט הסופרנטנט.
   2. חלץ פלסמידים מתרביות לילה באמצעות ערכת טיהור פלסמידים.
   3. למדוד ריכוז של פלסמידים מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר.
6. הגיש פלסמידים לצורך ריצוף
   הערה: השתמשו בשירותים כמו ריצוף ננו-נקבוביות מלא בפלסמיד, או, לחלופין, ריצוף סנגר עם פריימר שמקיף את האזור המוטאגן.

תוצאות

בניית ספרייה יעילה היא קריטית להבטחת כיסוי מספק של מרחב המוטציה. כדי למנוע אובדן וריאנטים פונקציונליים נדירים, מספר הטרנספורמנטים צריך להגיע לפחות ל-10× עד 100× גודל הספרייה התיאורטית. מכיוון שיעילות הטרנספורמציה ב-S. cerevisiae מושפעת מריכוז התאים והיא הגבוהה ביותר בתאי פאזה מוקדמת עד אמצעית¹⁶, אופטימיזציה של צפיפות התא ההתחלתית לפני האלקטרופורציה. תרביות השמרים עברו תרבית משנה בערכי OD₆₀₀ התחלתיים שנעו בין 1.0–4.0 ודגרו במשך 4 שעות (n = 2–4 ניסויים ביולוגיים עצמאיים), ולאחר מכן ערכי OD₆₀₀ הסופיים מופו לעקומת הגידול של S. cerevisiae כדי לאשר שהתאים נשארו בשלב הגידול הבינוני (איור 5A, איור משלים 1).

אלקטרופורציה של תרביות אלו עם DNA פלסמיד של 4 מיקרוגרם (n = 2 ניסויים ביולוגיים עצמאיים) הראתה כי יעילות הטרנספורמציה הייתה שונה משמעותית בתנאי OD₆₀₀ הראשוניים (ANOVA חד-כיווני, p = 8.92 × 10⁻⁷). בהשוואה לתרביות שהחלו ב-OD₆₀₀ = 1.0, כל צפיפויות התאים ההתחלתיות הגבוהות יותר יצרו יעילות טרנספורמציה גבוהה משמעותית (מבחן ההשוואות המרובות של דאנט; OD₆₀₀ = 1.5, p מותאם = 0.0020; OD₆₀₀ ≥ 2.0, p מותאם < 0.0001), כאשר יעילות ההמרה הגבוהה ביותר נצפתה ב-OD₆₀₀ התחלתי של 4.0. כדי לנצל את היכולת הטבעית של תאי השמרים לבצע רקומבינציה הומולוגית, גם אלקטרופורציה של 4 מיקרוגרם של וקטור הפלסמיד הלינארי ו-12 מיקרוגרם מהאינסרט (כלומר, ספריית פרוטאז) לתאי שמרים (n = 2 ניסויים ביולוגיים עצמאיים). יעילות הטרנספורמציה הייתה שונה משמעותית בין תנאי OD₆₀₀ הראשונים שנבדקו (ANOVA חד-כיווני, p = 0.0023). ביחס לתרביות שהחלו ב-OD₆₀₀ = 1.0, יעילות הטרנספורמציה הייתה גבוהה משמעותית_{ב-OD 600} = 3.0 ( p מותאם = 0.0018), 3.5 ( p מותאם = 0.0062), ו-4.0 ( p מותאם = 0.0024) (מבחן ההשוואות המרובות של דאנט). הבחינו ביעילות ההמרה הגבוהה ביותר בצפיפות תת-תרבית התחלתית מתונה (OD₆₀₀ = 3.0), מה שמעיד על איזון אופטימלי בין יכולת התא ליעילות הרקומבינציה בתנאים אלו (איור 5B). בהשוואה לטרנספורמציה של פלסמיד בלבד, אלקטרופורציה משותפת של וקטור ליניארי והוספת ספריית פרוטאז (n = 2 שכפולים ביולוגיים עצמאיים) הניבה יעילות טרנספורמציה גבוהה משמעותית בתנאי OD₆₀₀ הראשוניים שנבדקו (ANOVA דו-כיווני על יעילות טרנספורמציה עם log10, p = 9.40 × 10⁻¹²). בממוצע, קו-אלקטרופורציה יצרה עלייה ממוצעת של פי 121 ביעילות הטרנספורמציה (CI של 95%, פי 63–233) ביחס לטרנספורמציה בפלסמיד בלבד (איור 5B).

במהלך ריצת FACS של תאי שמרים המכילים את ספריית הפרוטאז המוטנטית וקסטת בחירת הסובסטרט (איור 6A), תאים יציגו או קלטת חתוכה או פרוטאז שעדיין חותך את תת-הנגד-סלקציה (Q1), יבטא וריאנטים לא פונקציונליים של פרוטאז (Q2), או יביע וריאנטים של פרוטאז שחותכים בהצלחה את סובסטרט הבחירה בלבד (Q3). תאי שמרים שהביעו וריאנטים לא פונקציונליים הופיעו כאוכלוסייה דומיננטית המפוזרת לאורך האלכסון בגרפים של PE לעומת FITC, המשקפת שמירה משותפת של שני האותות (איור 6A, Q2). לעומת זאת, וריאנטים פונקציונליים שחתכו את מצע הבחירה תוך שמירה על המצע הטבעי (נגד-סלקציה) יצרו אוכלוסייה מובחנת מחוץ לאלכסון המאופיינת בעוצמת אות FITC גבוהה ו-PE בינונית-נמוכה (איור 6A, Q3). יישום אסטרטגיית שער מחמירה לבידוד אוכלוסייה מחוץ לאלכסון הובילה להעשרה הדרגתית של וריאנטים פונקציונליים בסבבים עוקבים של מיון¹⁰. העשרה זו נצפית ויזואלית כאשכול תאים מוגדר יותר ויותר המופרד מהאשכול האלכסוני (איור 6B, משמאל לימין). אם לא נצפתה אוכלוסייה מובחנת מחוץ לאלכסון (לא באלכסון), הדבר עשוי להעיד על איכות ספרייה נמוכה, ביטוי לא מספק או תנאי צביעה לא אופטימליים. כביקורת שלילית, איור 6C,D מציג תאי שמרים אלקטרופוריים, מושרים ולא מוצבעים, וכן היסטוגרמות פלואורסצנציה של FITC ו-PE מתאימים.

בתוך האוכלוסייה העשירה מחוץ לאלכסון (מחוץ לאלכסון מועשר), ניתן לפתור תת-אוכלוסיות נוספות בהתבסס על עוצמת ה-FITC. תאים המציגים אות FITC בינוני יכולים להיות ממוינים בנפרד מאלה עם אות FITC נמוך. ריצוף אוכלוסיות שונות אלו חשף פרופילי מוטציה ייחודיים (טבלה 11), מה שמעיד כי יעילות חיתוך משתנה קשורה לווריאנטים שונים של פרוטאז.

איור 1: הכנת וקטור והכנסה. (א) יצירת ספריות פרוטאז של פוטיוראלים באמצעות מוטגנזה רוויה באתר. (B) הרכבת קלטת המצע ואינטגרציה בווקטור תצוגת שמרים (pDD1523). (ג) ליניאריזציה של וקטור תצוגת שמרים (pDD1524) באמצעות עיכול הגבלה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: אלקטרופורציה של קסטת הסובסטרט וספריית הפרוטאז המוטנטים המוגברים ב-PCR לתאי EBY100 מקצועיים. (קופסה מקווקשת) סירקולריזציה אינ-ביבו של הפלסמיד המכיל גם פרוטאז וגם קסטת סובסטרט. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: השראה, צביעה ומיון ציטומטרי זרימה של תאי שמרים. (א) השראה של ספריית פרוטאז וקלטת תת-קרקעית. (B) צביעת נוגדנים פלואורסצנטיים: צביעה בנוגדנים אנטי-HA פלואורסצאין איזותיוציאנאט (FITC) ואנטי-FLAG פיקואריתרין (PE). (ג) תאים מוצבעים ממוינים באמצעות מיון תאים מופעל-פלואורסצנציה (FACS). (D) שיקום תאים ממוינים לפי FACS במדיות הבחירה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: שחזור וריצוף תאי שמרים ממוינים בפלסמידים. (א) ציפוי של תאי שמרים ממוין. (ב) הפקת פלסמיד ממושבות שמרים בודדות. (C) טרנספורמציה של E. coli של פלסמידים שהופקו. (D) הפקת פלסמיד ממושבות E. coli בודדות. (ה) ריצוף ננופורי של פלסמידים שהופקו. סמלי פלאסק וצינורות הותאמו מ-DBCLS ו-Helicase 11, בהתאמה, באמצעות Bioicons (https://bioicons.com) והותאמו תחת תנאי רישיון Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC BY 4.0). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: עקומות גדילה של שמרים במדיות גדילה שונות והשפעת צפיפות אופטית התחלתית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) של תת-תרבית על יעילות האלקטרופורציה של השמרים. (א) עקומות גדילה של שמרים ב-1 × פפטון דקסטרוז שמרים (YPD), 2 × YPD, דקסטרוז סינתטי קסמינו אגר ללא אנטיביוטיקה (SDCAA-), וחומצות קזמינו סינתטיות עם אנטיביוטיקה (SDCAA+). (ב) יעילות הטרנספורמציה של שמרים האלקטרופורציה עם וקטור פלסמיד של 4 מיקרוגרם ב-OD₆₀₀ התחלתי של תת-תרביות, ויעילות הטרנספורמציה באמצעות וקטור ליניארי (4 מיקרוגרם) והכנסת ספריית פרוטאז (12 מיקרוגרם) באותם ערכי OD₆₀₀ התחלתיים. הנתונים ב-(A) מוצגים כ-OD₆₀₀ ± SD משני ניסויים ביולוגיים עצמאיים (n = 2). הנתונים ב-(B) מוצגים כמספר ממוצע של טרנספורנטים לכל אלקטרופורציה על ציר y לוגריתמי, כאשר שכפולים ביולוגיים בודדים מוצגים כמעגלים (n = 2). המשמעות הסטטיסטית לניסויי אופטימיזציה של פלסמיד וקטור-פלוס-אינסרט נקבעה באמצעות ANOVA חד-כיווני על יעילות אלקטרופורציה בטרנספורמציה log10, ואחריה מבחן ההשוואות המרובות של דאנט באמצעות OD₆₀₀ = 1.0 כביקורת. ns, לא משמעותי; p < 0.01 (**); עמוד < 0.0001 (****). המשמעות הסטטיסטית של ההבדל בין יעילות טרנספורמציה בפלסמיד בלבד לבין וקטור-פלוס-אינסרט נקבעה באמצעות ANOVA דו-כיווני על יעילות טרנספורמציה ב-log10. עמ' < 0.0001 (****). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: העשרה מבוססת פלואורסצנציה על מיון תאים מופעל (FACS) של שיבוטי שמרים. (א) ייצוג סכמטי של אסטרטגיית השער. התאים חולקו לשלושה אזורים: Q1, תאים נמוכים בפיקואריתרין (PE); Q2, תאים גבוהים ב-PE-גבוה/איזותיוציאנאט פלואורסיאן (FITC); ו-Q3, תאים בעלי PE גבוה עם פלואורסצנציה FITC נמוכה עד בינונית. תאים בתוך Q3 נאספו לצורך העשרה. (ב) גרפים מייצגים של FACS של קמפיין אבולוציוני עצמאי אחד המציגים סבבי מיון עוקבים עם קפדנות הולכת וגוברת של שערי FITC. תאים בדרגת FITC בינונית ונמוכה נאספו בנפרד לצורך ריצוף. אחוזים מציינים את החלק של תאי שמרים חיים בודדים בתוך האוכלוסייה הסגורה. (C) תרשים FACS מייצג המראה תאי שמרים אלקטרופוריים ולא מוצבעים כבקרה שלילית. (D) היסטוגרמות של עוצמות פלואורסצנציה של FITC-A (משמאל) ו-PE-A (מימין) התואמות לנתונים המוצגים ב-(C). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1: תערובת תגובה להגברת PCR בסבב הראשון של ספריית הפרוטאז. הרכב תגובת ה-PCR המשמשת להגברה בסבב הראשון של ספריית הפרוטאז, כולל הריכוזים והכמויות הסופיות של כל תגובה בתגובה של 50 מיקרוליטר. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: תנאי מחזור להגברת PCR בסבב הראשון של ספריית הפרוטאז. תוכנית המחזור התרמי שימשה להגברת PCR בסבב הראשון של ספריית הפרוטאז. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 3: תערובת תגובה להגברת PCR בסיבוב השני של ספריית הפרוטאז. הרכב תגובת ה-PCR המשמשת להגברה בסבב השני של ספריית הפרוטאז, כולל הריכוזים והכמויות הסופיות של כל מגיב בתגובה של 50 מיקרוליטר. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 4: תנאי מחזור להגברת PCR בסבב השני של ספריית הפרוטאז. תוכנית המחזור התרמי שימשה להגברת PCR בסבב השני של ספריית הפרוטאז. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 5: מדיה ותגובות לאלקטרופורציה וצמיחת שמרים. תיאור טבלאי של המסה הנדרשת מכל רכיב כימי כדי לגבש כמויות ספציפיות של 1 × ו-2 × פפטון דקסטרוז (YPD), בופר אלקטרופורציה, בופר התכלה, מדיום צמיחה, חומצות קזמינו סינתטיות עם אנטיביוטיקה (SDCAA+), חומצות קזמינו גלקטוז סינתטיות עם אנטיביוטיקה (SGCAA+), מדיום Lysogeny Broth (LB), מדיום LB-כלוראמפניקול, מדיום Super Optimal Broth (SOB), ומרק סופר אופטימלי עם מדיום Catabolite repression (SOC). הוראות להכנת תמיסות מלאי, כגון 2 M סורביטול, 1 M דיתיותרייטול (DTT), ו-2 M ליתיום אצטט (LiAc). הוראות נוספות להכנת לוחות אגר SDCAA, LB ו-YPD מסופקות. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 6: תערובת תגובה לחישון ופוספורילציה של אוליגו. הרכב תערובת התגובה המשמשת לחישוש ופוספורילציה סימולטנית של אוליגונוקלאוטידים להרכבת קסטות מצע (sub cassette). אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 7: תנאי מחזור לאנלינג ופוספורילציה של אוליגו. תוכנית טמפרטורה המשמשת לחישומי אוליגונוקלאוטידים ופוספורילציה להרכבת קלטות מצע (sub cassette). אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 8: תערובת תגובה להרכבת גולדן גייט של קסטת תת-קרקע ופלסמיד וקטורי. הרכב תגובת הרכבת גולדן גייט שימש לקישור קסטת המצע אל הפלסמיד הווקטורי. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 9: תנאי מחזור להרכבת גולדן גייט של קלטת תת-קרקע ופלסמיד וקטורי. תוכנית מחזור תרמי המשמשת להרכבת גולדן גייט. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 10: תערובת תגובה לליניאריזציה של פלסמיד וקטורי. הרכב תגובת עיכול ההגבלה שימש לליניאריזציה של הפלסמיד הווקטורי לפני בניית הספרייה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 11: תוצאות ריצוף ננופורים של וריאנטים של TEVp חותכים את ENLYFES. פלסמידים הופקו מתאי שמרים לאחר המפגש הרביעי והאחרון של FACS. מוטציות בכל שיבוט מוצגות ביחס לרצף מסוג פראי. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

איור משלים 1: הקשר בין צפיפות התרביות הראשונית לסופית של EBY100 במהלך תת-התרבות. תרביות EBY100 עברו תת-גידול בערכי OD₆₀₀ התחלתיים משתנים, וה-OD₆₀₀ הסופי נמדד לאחר דגירה בתנאי גדילה זהים (30°C, 220 סל"ד). צפיפות התרביות הסופית עלתה באופן ליניארי עם עלייה ב-OD_{ההתחלתי 600} (R² = 0.969, p = 5.77 × 10⁻⁵). נקודות הנתונים מייצגות ממוצעים ± SD של (n = 2–4) שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: עיצוב רציונלי של ספריית המוטגנזה של TEVp. ייצוג מצויר של TEVp (מזהה PDB: 1LVB) עם ארבע השאריות (זהב) <5Å הרחק משארית P1 (סגול) המיועדת למוטגנזה ברוויית האתר. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

אבולוציה מכוונת היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת במחזורים איטרטיביים של גיוון ובחירה כדי לזהות חלבונים עם תפקוד ביוכימי משופר או חדשני¹⁷. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים תהליך עבודה מותאם לפיתוח זיהוי סובסטרט של פרוטאז באמצעות מערכת תצוגה על פני תא ב-S. cerevisiae. מערכת תצוגת פני השטח ממפה פעילות פרוטאז לפנוטיפ מבוסס פלואורסצנציה שניתן לזהות, ומאפשרת העשרה מבוססת FACS של שיבוטים רצויים. אנו מספקים את השלבים המפורטים להרכבת קלטות ספריית פרוטאז ומצע, אלקטרופורציה יעילה, שער ומיון FACS, וריצוף סופי של גרסאות פרוטאז.

אחד הצעדים החשובים ביותר באבולוציה מכוונת הוא להבטיח גיוון מספק בספרייה וכיסוי של מוטציות פוטנציאליות¹⁷. ניסויי יעילות האלקטרופורציה שלנו מראים כי תת-תרבית ראשונית OD₆₀₀ של 3.0 מניבה את יעילות ההמרה הגבוהה ביותר, העולה על 10⁹ CFU. קנה מידה זה, שהושג באמצעות אלקטרופורציה אופטימלית של שמרים, עולה בהרבה על זה של שיטות טרנספורמציה כימית קונבנציונליות ומאפשר כיסוי מספק של ספריות קומבינטוריות גדולות ^8,9. גייטינג ומיון מדויק של FACS חיוניים להפרדת תאים שמציגים את תכונות החיתוך הרצויות לבין תאים שמציגים חיתוך לא ספציפי. במהלך סבבים מרובים של ברירה מבוססת FACS, אסטרטגיית הגייטינג הופכת למחמירה יותר ויותר כדי להעשיר באופן סלקטיבי את גרסאות הפרוטאז הרצויות. אם השער רחב מדי, תאים לא רצויים עלולים להיות ממוינים יחד עם הווריאנטים הרצויים. גייטינג מחמיר (למשל, ספים נמוכים יותר ויותר לאות FITC בין סבבים) מאפשר לאוכלוסיית התאים להתעשר עבור וריאנטים של פרוטאז עם ספציפיות ופעילות גבוהה יותר לעבר רצף הסובסטרט החדש¹⁰. בהתאם לקמפיינים^{קודמים 7,18}, ביצענו מוטגנזה של NNS-codon של ארבעה שאריות בכיס קשירת הסובסטרט של TEVp, שמגיבות עם שארית הסובסטרט P1, Q (T146, D148, H167, S170) (איור משלים 2). גרפים של FACS המוצגים באיור 6B מייצגים ניסוי מיון מייצג יחיד הממחיש את אסטרטגיית השער ותהליך ההעשרה. באופן מעניין, תוצאות הקמפיין שלנו הניבו וריאנטים של TEVp עם סט מוטציות שונה של חומצות אמינו (טבלה 11). תוצאות אלו תומכות בתכונה מרכזית של אבולוציית פרוטאז: מסלולים אבולוציוניים מרובים יכולים להוביל לאותה מטרה.

ייתכן ויידרשו שינויים ואסטרטגיות לפתרון תקלות בעת ביצוע הניסויים. לדוגמה, במהלך האלקטרופורציה, עבודה על קרח לפי הצורך והשעיה זהירה של כדורי התאים בכל שלב מבטיחה שהתאים יהיו חיים ובריאים לפני האלקטרופורציה. תאי השמרים רגישים לאורך שלבי האלקטרופורציה ועד שלב ההתאוששות מהצמיחה. בנוסף, ייתכן שיידרש שינוי נוזל מעטפת ה-FACS כדי למנוע התפרצות תאי שמרים. נוזל מעטפת נפוץ במכונות FACS ועלול להכיל חומרים משמרים המעכבים צמיחת חיידקים ופטריות. לכן, ניתן להחליף נוזל מעטפת ב-PBS טהור כדי למנוע מוות תאים במהלך המיון.

מערכת תצוגת פני השמרים דורשת חלבונים מקופלים כראוי כדי לעבור בהצלחה את מסלול ההפרשה. חלק מהוריאנטים של הפרוטאז עלולים לאבד פעילות עקב קיפול לא נכון, מה שמוביל לתוצאות חיוביות שגויות במהלך בחירת FACS הנגרמות על ידי חיתוך לא ספציפי או פלואורסצנציה רקעית. מקורות מאופיינים היטב של חיוביים שגויים ראויים לציון בקמפיינים מבוססי פלסמיד כמו זה. מכיוון שהפיצול נקרא כאובדן של תג האפיטופ בקצה C, כל מוטציה שמפריעה לתג הזה מניבה את אותו פנוטיפ FITC נמוך כמו אירוע חיתוך אמיתי; מוטציות תגיות כאלה מתעוררות במהלך הרקומבינציה ההומולוגית בקנה מידה גדול ויכולות להתעשר בסבבי מיון עוקבים. אינטגרציה כרומוזומלית של קסטת הסובסטרט הקבוע הוכחה לאחרונה כמפחתת בעיה זו¹⁹. הפרוטוקול מסתמך על שימוש בספריית הinsert תוך שמירה על הווקטור (המכיל את קלטת המצע) קבוע. לכן, פרוטוקול זה אינו מתאים למי שרוצה לפתח גם ספריות פרוטאז וגם ספריית סובסטרטים.

פלטפורמת YESS הייתה חלוצה במסלול כללי לתכנות מחדש של ספציפיות פרוטאז-סובסטרט¹⁸. השיפורים האחרונים כוללים: הוספת בקרה ניתנת לטיטרציה של אנזימים/סובסטרטים ב-YESS2.0⁷, קישור לרצף דור הבא, אפשרות פרופילינג ספציפיות^{ברזולוציה גבוהה 20}, ואינטגרציה כרומוזולית של המדווחים להפחתת רעש ביטוי וחיובים שגויים¹⁹. אסטרטגיות אורתוגונליות נוספות, כגון אבולוציה מתמשכת בסיוע פאג', יושמו גם הן בהנדסת ספציפיות פרוטאז למטרות טיפוליות²¹. כלים אלו מצאו יישומים מעבר להנדסת פרוטאז TEV, כגון פרופיל ברזולוציה גבוהה של הפרוטאז הראשי של SARS-CoV-2 כדי להנחות את עיצוב המעכב²². גורם קריטי בכל קמפיין כזה הוא יצירת מספיק טרנספורמנטים לכסות ספריות קומבינטוריות גדולות (>10⁹), שלא עברו אופטימיזציה שיטתית בזן EBY100 S. cerevisiae . על ידי הגדרת תנאי שלב הגדילה והאלקטרופורציה שמניעים את טרנספורמציית EBY100 מעל^10.9 CFU, פרוטוקול זה מסיר את צוואר הבקבוק הזה, ומאפשר סינון מקיף מבוסס FACS של מיליוני וריאנטים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software