הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תהליך תצוגת פני שטח של שמרים מותאם להתפתחות מכוונת של פרוטאזות

331 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72559

⸱

4 באוגוסט 2026

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה אופטימלי להתפתחות מכוונת של פרוטאזות ויראליות ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות מערכת בחירה מבוססת תצוגת שטח. הוא מתאר את עיצוב ספריית הכנסת DNA וקלטת הסובסטרט, אלקטרופורציה מותאמת ליעילות טרנספורמציה גבוהה, בחירה מבוססת מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה לחיתוך פרוטאז, וריצוף של וריאנטים מועשרים.

תקציר

אבולוציה מכוונת מחקה את תהליך האבולוציה הטבעי בסביבה מעבדתית מהירה ומבוקרת כדי לפתח חלבונים עם פונקציות או תכונות רצויות. סינון מאגר גדול של גנים מקודדי חלבון מוטנטים מאפשר בחירה פונקציונלית של וריאנטים רצויים ליישומים בביוטכנולוגיה, רפואה וביולוגיה סינתטית. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מבצעים אבולוציה מכוונת ב-Saccharomyces cerevisiae כדי להנדס וריאנטים של פרוטאז עם ספציפיות גבוהה עבור רצף סובסטרט לא טבעי. אנו מציגים את וריאציות הפרוטאז הללו על פני תאי השמרים כדי להקל על בחירת הווריאנטים הרצויים באמצעות מיון תאים מופעל-פלואורסצנציה (FACS) לאורך מספר סבבי העשרה. ארבעה מרכיבים מרכזיים בקסטת הסובסטרט מבוטאים יחד עם ספריית הפרוטאז: חלבון מיזוג המורכב מ-(i) תת-יחידת קולטני ההידבקות של השמרים Aga2, (ii) רצפי סלקציה ו-(iii) רצפי סובסטרט נגד-ברקה, (iv) רצפי תגי אפיטופים, ורצף אותות שחזור אנדופלזמי (ER) אופציונלי. תאי שמרים שבהם רק רצף תת-הבחירה נחתך מבודדים באמצעות FACS רב-צבעוני באמצעות נוגדנים אנטי-אפיטופים פלואורסצנטיים (פיקואריתרין/פלואורסאין איזותיוציאנאט מתויג). כאן אנו מספקים פרטים על הפרוטוקול האופטימלי, שלב אחר שלב, לביצוע קמפיין אבולוציית פרוטאז, כולל עיצוב ספריית הכנסות DNA ועיצוב קלטות תת-מצע, אלקטרופורציה של תאי שמרים עם יעילות טרנספורמציה גבוהה (עד 109 טרנספורמנטים למיקרוגרם DNA), ברירה מבוססת FACS, העשרה וריצוף של וריאנטים שהתפתחו. אנו מדגימה את פרוטוקול האבולוציה המכוון שלנו על ידי התפתחות וירוס הטבק עם חריטה גרעינית פרוטאז A (TEVp), מפיצול רצף הסובסטרט הטבעי שלו, ENLYFQ↓S, לפיצול רצף חדש, ENLYFE↓S.

מבוא

פרוטאזות ציסטאין ממשפחת Potyviridae, ובמיוחד פרוטאזות ההכללה הגרעינית A (NIa), מהוות מקור כמעט בלתי מנוצל של אנדופפטידאזות ספציפיות לרצף. עם יותר מ-3,800 בני משפחה מאופיינים, פרוטאזות NIa חותכות רצף מובחן של שבעה חומצות אמינו. משפחת הפוטיו-וירוס מציעה מגוון רחב של פרוטאזות להנדסת מערכות בקרה חלבונים מתוכנתות, בניית מעגלים גנטיים מבוססי פרוטאזות אורתוגונליים, ופיתוח כלים ביוטכנולוגיים ספציפיים לרצפים 1,2. למרות המגוון הטבעי הזה, רק שני פרוטאזות NIa, TEVp ופרוטאזות וירוס ריד טבק (TVMVp), אופינו והונדסו ביסודיות לשימוש מעבדה וביוטכנולוגי רחב 3,4. ערכת הכלים המוגבלת הזו מגבילה את מרחב התכנון למעגלים מרובי רכיבים הדורשים פעילויות פרוטאז אורתוגונליות5, ובכך מניעה מאמצים להרחיב ולאפיין פרוטאזות NIa באמצעות אבולוציה מכוונת 6,7.

תצוגת פני שטח שמרים הפכה לאחת הפלטפורמות החזקות ביותר לאבולוציה מכוונת, המאפשרות סקר ספריית חלבונים בתפוקה גבוהה באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS)6,7. לדוגמה, מערכת ה-YESS (YESS) של השמרים מחברת פעילות פרוטאז לתצוגת פני השטח דרך מסלול ההפרשה של S. cerevisiae 6,7. מערכת YESS יושמה להנדסת ייחודיות חדשה של פרוטאז-סובסטרט והוכיחה שימושיות בקמפיינים אבולוציונליים מכוונים מרובי סבבים. במערכת זו, וריאנטים של פרוטאז מבוטאים יחד עם חלבון מיזוג המכיל קלטת מצע חיתוך עם סמנים של אפיטופים, ועוגן פני השטח של Aga1p מתבטא בזן השמרים EBY100. תיוג דיפרנציאלי עם נוגדנים פלואורסצנטיים מבדיל בין קסטות סובסטרט לא מפורקות המוצגות על פני התא. מנגנון תצוגה תלוי פעילות זה תואם ישירות לבחירה איטרטיבית מבוססת FACS עבור ספריות של 10,7 וריאנטים 6,7 ומעלה.

תנאי יסוד לאבולוציה מכוונת הוא היכולת להכניס ספריות וריאנטים בקנה מידה מספק להשגת כיסוי מספק של מרחב הרצף היעד. עבור ספריות מוטגנזה ברוויה באתר המשתרעות על פני מספר מיקומים של חומצות אמינו, נדרשות תשואות טרנספורמציה של 108 עד 109 טרנספורמנטים ייחודיים כדי להבטיח שהמגוון המוכנס לספרייה ייוצג היטב באוכלוסייה הממוינת. קיימות מספר שיטות להכנסת DNA חיצוני ל-S. cerevisiae, כל אחת עם תקרות תפוקה מובחנות. שיטת הטרנספורמציה הכימית הקונבנציונלית עושה שימוש ב-DNA נושא ליתיום אצטט/חד-גדילי/פוליאתילן גליקול (LiAc/ssDNA/PEG) בשל פשטותה ונגישותה. עם זאת, הוא בדרך כלל משיג יעילות טרנספורמציה של רק 10יחידות יצירת מושבות (CFU) למיקרוגרם DNA, מה שאינו מגיע לשונות הרצף הנדרשת לקמפיינים גדולים של ספריות8. לעומת זאת, שיטת האלקטרופורציה מפעילה שדה חשמלי במתח גבוה כדי לחדור זמנית לממברנת התא ולהקל על קליטת DNA. אלקטרופורציה משיגה באופן עקבי את יעילות הטרנספורמציה הגבוהה ביותר בין שיטות הטרנספורמציה הזמינות, כאשר פרוטוקולים אופטימליים מדווחים על תפוקות של 108–109 CFU9. נצפה כי יעילות האלקטרופורציה ב-S. cerevisiae רגישה מאוד לשלב צמיחת התא, למסת DNA ולהרכב הבופר, ומספקת מסגרת שהותאמה מאז באופן נרחב לאבולוציה מכוונת בקנה מידהספרייתי.

הפרוטוקול המתואר כאן עושה שימוש בזן S. cerevisiae EBY100, זן מארח המאומץ באופן נפוץ להצגת פני השטח של השמרים. EBY100 תוכנן על ידי בודר וויטרופ על ידי שילוב קסטת ביטוי AGA1 תחת שליטת פרומוטר GAL1 המושרה גלקטוז לתוך לוקוס הכרומוזום AGA1 של זן ההורה החסר פרוטאז BJ546510. הזן זמין מסחרית מ-ATCC (קטלוג מס' MYA-4941; המפקיד K.D. Wittrup), נושא את הגנוטיפ MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). כתוצאה מכך, גם Aga1p וגם מיזוג הקסטה של Aga2p-sub מבוטאים מאותו פרומוטר המושרה על ידי גלקטוז, מה שמבטיח ששתי תת-היחידות יושרו יחד ויתאספו לקומפלקס Aga1p–Aga2p המקושר לדיסולפידים שמעגן את ההיתוך המוצג לדופן התא.

למרות השימוש הנרחב ב-EBY100 ביישומי תצוגת שמרים, אף פרוטוקול שפורסם לא אופטימיזציה שיטתית לאלקטרופורציה של זן זה בתפוקות בקנה מידה ספרייתי. פרמטרים ספציפיים ל-EBY100, כגון שלב הצמיחה האופטימלי בקציר, הרכב התווך במהלך תת-התרבות, והקשר הכמותי בין צפיפות אופטית התחלתית ב-600 ננומטר (OD600) ליעילות הטרנספורמציה, נותרו להיות מאופיינים ואופטימיזציה קפדנית. כאן, אנו מדווחים כי יעילות הטרנספורמציה ב-EBY100 עולה באופן מונוטוני עם OD600 של התרבית בקציר, כאשר תאים בשלב הלוגריתמי המאוחר מניבים שיעורי טרנספורמציה גבוהים משמעותית מאלו שנקטפו בשלב הלוג המוקדם. הערכנו פרמטרים קריטיים של הפרוטוקול, כולל ערכי OD600 הראשוניים בעת החיסון, שימוש ב-2 × Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) לתת-תרבויות, נוסחאות בופר אלקטרופורציה, ותנאי צמיחה לאחר האלקטרופורציה. הפרוטוקול המוצג כאן מספק תהליך עבודה אופטימלי שלב אחר שלב (איור 1A–C, איור 2, איור 3A–D, איור 4A–E) להכנת תאים EBY100 בעלי יכולת אלקטרוכשליות וביצוע אלקטרופורציה בספריית DNA ביעילות גבוהה, המניבה שיעורי טרנספורמציה עקביים מעל 109 CFU. כדי לאמת פרוטוקול זה, ערכנו קמפיין אבולוציוני מכוון מקיף להנדסת TEVp עם ספציפיות חיתוך משתנה בארבעה סבבים של בחירה והעשרה מבוססת FACS. ריצוף של וריאנטים מועשרים לפרוטאז אישר גיוון משמעותי בשאריות הממוקדות בתוך כיס קשירת הסובסטרט של הפרוטאז, מה שהראה כי הפרוטוקול מספק כיסוי ספרייה מספק של שטח הרצף לתמיכה בקמפיינים אבולוציונליים פרודוקטיביים. פרוטוקול זה יהיה בעל תועלת רחבה לחוקרים המשתמשים ב-EBY100 לאבולוציה מכוונת מבוססת תצוגת פני שטח שמרים ולסקר תואמי FACS ויעילים של פרוטאזות, נוגדנים9, קינאזות11 וקולטנים12, בין חלבונים נוספים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים שכללו את S. cerevisiae הרקומביננטי בוצעו בהתאם למדיניות ולנהלים של ועדת הבטיחות הביולוגית והבטיחות הכימית המוסדית באוניברסיטת טקסס בדאלאס. זני שמרים רקומביננטיים טופלו במסגרת הכלה ביו-בטיחותית רמה 1 (BSL-1) בהתאם לפרקטיקות מיקרוביולוגיות מוסדיות מבוססות. אלקטרופורציה, תרבית ומיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) בוצעו בהתאם לנהלים מאושרים לבטיחות ביולוגית מוסדית. תרביות שמרים וצרכנים מזוהמים נוקו וזוהרו כפסולת ביולוגית מסוכנת בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. הכנת וקטור והכנסה

  1. יצירת ספריות פרוטאז של פוטויראל באמצעות מוטגנזה רוויה באתר
    1. עיצוב באמצעות תוכנות עיצוב רצף החופפות בין 30 ל-50 מר, אוליגונוקלאוטידים קדימה ואחורה, ליצירת ספריית מוטנטים של פרוטאזות. החליפו את קודון הטיפוס הפראי באוליגונוקלאוטיד המתאים בקודון מנוון NNS, כאשר N מייצג A, T, G או C, ו-S מייצג G או C, עבור מיקומים המיועדים למוטגנזה.
    2. תכנן חפיפה של 3′ בין כל זוג אוליגונוקלאוטידים קדמי ואחורי עם טמפרטורת התכה (Tm) של 55–60 מעלות צלזיוס. תכננו את האוליגונוקלאוטידים הראשונים והאחרון שיכילו חפיפה של 50 NT עם וקטור התצוגה של פני השמרים מעבר לאתרי ההגבלה.
    3. ודא שלפחות קצה אחד של ההכנסה חופף בדיוק לקצה אחד של הווקטור הלינארי כדי לאפשר רקומבינציה הומולוגית13. הימנע מרווחים בין אוליגונוקלאוטידים סמוכים14.
    4. החזירו את האוליגו ל-100 מיקרומום עםH2O דה-יוניזציה. בצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל, משלבים 0.5 מיקרוליטר מכל אוליגו לנפח סופי של 200 מיקרוליטר (ריכוז סופי של 250 ננומטר לכל אוליגו).
    5. הגדר תגובת PCR עם הרכיבים המפורטים בטבלה 1 כדי להרכיב את ספריית הפרוטאז, תוך שימוש בתנאי התרמחזור בטבלה 2.
    6. הגדר תגובת PCR שנייה באמצעות האוליגואים הקדמיים והאחוריים החיצוניים ביותר (טבלה 3) תוך שימוש במוצר ה-PCR הראשון שהורכב כתבנית. הגביר את המכפלה כפי שמוצג בטבלה 4.
    7. הרץ את מוצר ה-PCR השני על ג'ל אגרוז 1% עם אתידיום ברומיד (0.5 מיקרוגרם/מ"ל) ב-240 וולט למשך 30 דקות. הסר את הרצועה המתאימה לאורך ה-DNA הצפוי.
      הערה: זהירות: אתידיום ברומיד הוא מוטגן ויש לטפל בו באמצעות ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל מעיל מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות. הימנעו ממגע עור ושאיפה. השליך את הג'לים, החומרים המכילים ברומיד אתידיום, חומרים מתכלים ומוצרי צריכה כפסולת כימית מסוכנת בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות.
    8. לטהר בעזרת ערכת חילוץ ג'ל. נוזל ב-50 מיקרוליטר שלH2O דה-יוני.
    9. מדדו את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. אחסן את ה-DNA בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
      הערה: כל תגובה של 50 מיקרוליטרשל ה-PCR השני תניב כ-0.5–1.0 מיקרוגרם DNA כולל. מכיוון שכל אלקטרופורציה דורשת 12 מיקרוגרם מספריית הפרוטאז (כלומר, הכנסה), הגדילו את התגובות בהתאם.
  2. מכלול קלטת מצע
    1. הכינו לוחות LB-אגר ומדיום נוזלי LB-כלוראמפניקול. ראו מתכונים בטבלה 5.
    2. תכנן סט של אוליגונוקלאוטידים חופפים של 30 מרים בכיוון קדימה ואחורה להרכבת קלטות המצע. תכנן את קצות 5′ של כל אוליגונוקלאוטיד הפוך ושל האוליגונוקלאוטיד הקדמי של השבר הבא כך שיתאימו ב-4 נוקלאוטידים.
    3. החזר את האוליגואים הליופילים ל-100 מיקרומום באמצעות H2Oדה-יוניזציה.
    4. ערבב חומרים כמו בטבלה 6.
    5. השתמשו בתוכנית האופניים בטבלה 7 כדי לאנל ולזרחן את תערובת האוליגו.
    6. אוליגו מחוסל מדולל 4-פי ב-H2 O דה-יוני כדילהגיע לריכוז סופי של 1.25 מיקרומון.
    7. משלבים את תערובת האוליגו המחוטשת עם הווקטור (למשל, pDD1523), לפי טבלה 8.
    8. בצע את הרכבת שער הזהב, בהתאם לתוכנית האופניים בטבלה 9.
      הערה: לדוגמה, לפלסמיד pDD1523 יש אתר הגבלה מסוג IIS (BsmBI) במורד הזרם של פרומוטר GAL1/10. הרכבה מוצלחת מאפשרת השראה גלקטוזית של קלטת המצע7.
    9. המרו את הפלסמיד המתקבל ל-E. coli.
    10. תאי לוחות על אגר LB עם האנטיביוטיקה המתאימה. דגרו ל-16–18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    11. בחר מושבות מבודדות וחסן אותן ב-5 מ"ל מדיום LB. דגרו במהלך הלילה (16–18 שעות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות (220 סל"ד).
    12. חלץ פלסמידים מתרביות לילה באמצעות ערכת מיני-פרפ של פלסמיד.
    13. מדוד את ריכוז הפלסמידים באמצעות ספקטרופוטומטר, ואז שלח לריצוף.
  3. ליניאריזציה של וקטור תצוגת שמרים
    1. לינאריזציה של פלסמיד תצוגת השמרים, לדוגמה, עכל pDD1524 עם אנזימי הגבלה SphI ו-PstI להכנת וקטור תצוגת השמרים המכיל את קסטת הסובסטרט לאלקטרופורציה. ערבבו את החומרים המפורטים בטבלה 10 ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעה.
    2. הרץ את מוצר העיכול ההגבלה על ג'ל אגרוז 1% ב-240 וולט למשך 30 דקות. להסיר את הרצועה המתאימה לאורך ה-DNA הצפוי ולטהר באמצעות ערכת חילוץ ג'ל.
      הערה: כל 50 מיקרוליטר של עיכול הגבלה יניב כ-0.5–1.0 מיקרוגרם של DNA כולל. מכיוון שכל אלקטרופורציה דורשת 4 מיקרוגרם של וקטור ליניארי, הגדילו את תגובות העיכול בהתאם.

2. אלקטרופורציה

הערה: יש לפעול לפי נהלי בטיחות מוסדיים לטיפול בחומרים ביולוגיים ותגובים, ללבוש ציוד מגן אישי מתאים ולהיפטר מפסולת ביולוגית וכימית בהתאם להנחיות המוסדיות.

  1. הכנת בופרים, לוחות ומדיה (יומיים לפני האלקטרופורציה)
    1. הכנת מדיה לצמיחה (1 × YPD; 2 × YPD; חומצות קסמינו סינתטיות דקסטרוז, SDCAA+; וחומצות קזמינו סינתטיות גלקטוז, SGCAA+), לוחות (YPD ו-SDCAA), בופר אלקטרופורציה ומים סטריליים בהתאם למתכונים בטבלה 5. אחסון ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת פלטה מפוספסת של EBY100.
    1. מרח שמרי EBY100 על אגר YPD ממלאי גליצרול. גדל בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
    2. אחסן את הצלחת בטמפרטורה של 4°C לאחר הצמיחה.
      הערה: צלחת עם פסים נשארת שמישה עד חודש אחד; סמן את תאריך הרצף על הצלחת.
  3. הכנת קדם-תרבות EBY100 (יום לפני האלקטרופורציה)
    1. הכן 125 מ"ל של 1 × YPD בבקבוק ארלנמאייר בנפח 500 מ"ל.
    2. הכן 25 מ"ל של 1 × YPD בצינור קונוסי של 50 מ"ל. באמצעות קצה מיקרופיפטה, אספו תאי EBY100 מהצלחת שגדלה במשך יומיים. לאחר מכן, העבירו את תאי השמרים מקצה הפיפטה לצינור הקוני המכיל 1 × YPD.
      הערה: הפס של התאים אמור ליצור מריחה באורך של כ-1–2 מ"מ.
    3. הסר את קצה המיקרופיפטה ומערבל את הצינור הקוני כדי להבטיח ערבוב מספק.
    4. הכינו קדם-תרבות של 150 מ"ל על ידי העברת 25 מ"ל של 1 × YPD המכילים את תאי השמרים לבקבוק 500 מ"ל המכיל 125 מ"ל של 1 × YPD. לסובב לערבב.
    5. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדדו אתה-OD 600 על ידי הכנת שני מיקרוקובטים באורך מסלול של 1 ס"מ: אחד עם 1 מ"ל של 1 × YPD כבקרה ריקה, ואחר עם 1 מ"ל של טרום-תרבית
    6. גדלו 150 מ"ל של טרום-תרבות בלילה (16–20 שעות) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות ב-270 סל"ד.
  4. הכנת תת-תרבות ב-OD600 הרצוי (ביום האלקטרופורציה)
    1. הכינו את בופר ההתניה ומדיום ההתפתחות, כפי שמתואר בטבלה 5.
    2. מדדו את מנת האורגז600 של הפרה-תרבעה הלילית (הצפוי של OD₆₀₀₀ הוא 17–22). כדי להיות בטווח הליניארי של הספקטרופוטומטר, יש למדוד דילול של 1:20 של הפרה-תרבות.
    3. חשב את נפח הפרה-תרבית הנדרש לחיסון תת-תרבית של 100 מ"ל. מומלץ לבצע תת-תרבות ראשונית OD600 של 3.0–4.0.
    4. דילל את התרביתל-OD הראשוני הרצוי 600 ב-100 מ"ל של 2 × YPD בבקבוק Erlenmeyer של 500 מ"ל.
    5. דגרו את תת-התרבית של 100 מ"ל בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות אורביטליות ב-270 סל"ד למשך 4 שעות.
  5. הכנת המדיה במהלך דגירה של 4 שעות
    1. שמור על בופר אלקטרופורציה קר ומים סטריליים מוכנים (מהשלב 2.1.1).
    2. הכינו בופר מרכך (100 מ"ל), לפי המתכון בטבלה 5. השתמש ב-20 מ"ל של בופר התניה בכל טרנספורמציה; הגדילו את הגודל בהתאם. אחסן בטמפרטורת החדר (20–23 מעלות צלזיוס).
      הערה: אזהרה: בופר מרכך מכיל דיתיותרייטול (DTT) ואצטט ליתיום (LiAc), שהם גירויים כימיים שעלולים לגרום לגירוי בעור ובעיניים. לבש ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעיל מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות, ולטפל בחומרים אלו בהתאם לנהלי בטיחות כימית מוסדיים. להשליך תמיסות לא בשימוש ובופרים משומשים כפסולת כימית בהתאם להנחיות המוסדיות.
    3. הכינו מדיום צמיחה (50 מ"ל): ערבבו 25 מ"ל של 2 × YPD ו-25 מ"ל של 1 מטר סורביטול יחד. השתמש ב-8 מ"ל של מדיה של צמיחה בכל טרנספורמציה. אחסן בטמפרטורת החדר (20–23 מעלות צלזיוס).
  6. הכנת תאי שמרים בעלי יכולת אלקטרופוטנציאלית לאחר 4 שעות דגירות.
    1. חלק תת-תרבות של 100 מ"ל לשני צינורות קונים של 50 מ"ל. אוספים תאים בצנטריפוגציה בטמפרטורה של 4°C ו-1,500 × גרם למשך 3 דקות, ואז משחררים את המדיום. שמרו על התאים על הקרח עד להשלמת שלב 2.6.4.
    2. החזירו בעדינות כל כדור תא עם 25 מ"ל מים קרים-סטריליים. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-1,500 × גרם למשך 3 דקות, ואז מפעילים את המדיה.
    3. חזור על שלב 2.6.2.
    4. החזירו בעדינות כל כדור תא עם 25 מ"ל של בופר אלקטרופורציה קר כקרח. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-1,500 × גרם למשך 3 דקות, ואז משחררים את המדיה.
    5. הסר את התאים מהקרח והשתה בעדינות כל כדור תא עם 10 מ"ל של בופר תלייה בטמפרטורת החדר (20–23 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, התאסף לתוך בקבוק אחד של Erlenmeyer בנפח 125 מ"ל ודגר בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידת מסלול ב-270 סל"ד למשך 30 דקות.
    6. שפוך את התאים לצינור של 50 מ"ל. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-1,500 × גרם למשך 3 דקות. פנה את התקשורת.
    7. החזירו בעדינות את כדור התא עם 50 מ"ל של בופר אלקטרופורציה קר כקרח. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-1,500 × גרם למשך 3 דקות, ואז מפעילים את המדיה.
    8. החזירו את כדור התא לנפח סופי של 1 מ"ל על ידי הוספת כ-100–200 מיקרוליטר של בופר אלקטרופורציה. שמור על התאים על קרח עד לאלקטרופורציה.
      הערה: תאים בעלי יכולת אלקטרופוטנציאלית יכולים להיות מוקפאים (כלומר, להניח במקפיא בטמפרטורה של –80 מעלות צלזיוס) ולהשתמש בהם מאוחר יותר ללא אובדן משמעותי ביעילות האלקטרופורציה.
  7. אלקטרופורציה, צמיחה וציפוי
    1. קובט אלקטרופורציה לפני קירור עם גודל רווח של 0.2 ס"מ על קרח.
    2. העבר 380 מיקרוליטר מהכדור התלוי מחדש לצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל. מערבבים עם 4 מיקרוגרם DNA פלסמיד או עם 4 מיקרוגרם של וקטור פלסמיד ליניארי ו-12 מיקרוגרם של אינסרט. ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג.
      הערה: כדי למקסם את מספר התאים האלקטרופוריים, ריכוזי ה-DNA הווקטורי וההוכנס צריכים להיות אידיאלית בין 700–800 ng/μL. אם הריכוזים נמוכים מזה, השתמש במרכז ואקום.
    3. העבר את המתלה לקובט האלקטרופורציה מקורר מראש. תשאיר על הקרח 5 דקות.
    4. נגב את דפנות הקובט אחרי 5 דקות עם מגבון מעבדה ללא סיבים כדי להיפטר מהלחות שנותרה, שעלולה לגרום לקשתות במהלך האלקטרופורציה. הימנע מבועות או תאים מעל לוחות המתכת בקובט, שכן הם עלולים לגרום לקשתות. כדי לשמור על טמפרטורת הקור של הקובט, אין לגעת באלקטרודות הלוחות.
    5. הכן 8 מ"ל של מדיום צמיחה בצינור קוני של 50 מ"ל.
    6. אלקטרופורט התאים בהגדרות הבאות: מתח של 2.5 קילווולט, קיבול של 25 מיקרופרה, והתנגדות של 200 Ω9. טווח הזמן הקבוע המקובל הוא 2.8–4.5 מילישניות.
      הערה: זהירות: אלקטרופורציה כוללת פולסים חשמליים במתח גבוה. ודאו שהקובטות יושבות כראוי ופעלו לפי הוראות ההפעלה של היצרן. השליכו את קובטות האלקטרופורציה המשומשות כפסולת ביו-מסוכנת לפי ההנחיות המוסדיות.
    7. הציפו את הקובטה מיד בכ-200 מיקרוליטר של מדיום צמיחה מהצינור הקוניקלי והעבירו תאים אלקטרופוריים לצינור הקוני של 50 מ"ל. הוסף עוד 200–350 מיקרוליטר של מדיום צמיחה עד שלא יישאר נוזל נראה לעין בקובטה.
    8. דגרו את צינור הקונוס של 50 מ"ל של תאים אלקטרופוריים ב-8 מ"ל של מדיום צמיחה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ללא ניעור במשך שעה. הפוך את הצינור כל 15 דקות כדי לערבב.
    9. איסוף תאים בצנטריפוגה ב-1,500 × גרם, 25 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. ואז לנקז את התקשורת.
    10. החזירו את התאים במדיות נפילת שמרים מתאימות כדי לשמור על הבחירה לתאים שעברו טרנספורמציה. לפלסמידים המכילים את סמן הבחירה TRP1, יש להשעות תאים ב-250 מ"ל SDCAA+ (שחסר בהם טריפטופן) כדי לשחזר באופן סלקטיבי שמרים ששמרו על הפלסמיד.
    11. דגרו בלילה (16–20 שעות) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלול ב-270 סל"ד.

3. השראה, צביעה ומיון ציטומטרי זרימה של תאי שמרים

  1. השראה של ספריית פרוטאז וקלטת מצע (יום אחד לפני המיון)
    1. מדד OD600 כפי שמופיע בשלב 2.4.2 לאחר צמיחה לילית של טרנספורמנטים במדיה שנשרתה.
    2. Aliquot 12 מ"ל שמרים וצנטריפוגה ב-3,200 × גרם למשך 5 דקות.
    3. הסר את הסופרנטנט והחזיר את כדור התא במדיום ההשראה SGCAA+ ל-OD600 של 0.5. חשב את נפח ההשעיה מחדש הנדרש באמצעות משוואת הדילול, C1V1 = C2V2.
    4. העברה לבקבוק Erlenmeyer בנפח 125 מ"ל וגדלה במהלך הלילה למשך 18–24 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות אורביטליות ב-270 סל"ד.
  2. צביעת נוגדנים פלואורסצנטיים (ביום המיון)
    1. מדד מנת חמצון600 של התאים לאחר האינדוקציה. השתמש בשני קובטים: אחד עם 1 מ"ל SGCAA+, והשני עם 950 מיקרוליטר SGCAA+ מעורבבים עם 50 מיקרוליטר תאים. הכפל את ערךה-OD 600 שנמדד ב-20 כדי לקבל אתה-OD 600 האמיתי של התאים שלאחר האינדוקציה.
    2. נרמול כל דגימה ל-3 ×-107 תאים לצביעת נוגדנים ומיון FACS. השתמש ב-C1V1 = C2V2 כדי לחשב את נפח התאים שיש להעביר מבקבוק ההשראה.
      הערה: עבור מוטגנזה רוויה של NNS בארבעה אתרים, גודל הספרייה התיאורטית הוא 106 וריאנטים. כדי לדגום מספיק את הספרייה, יש לסנן לפחות פי 10 מגודל הספרייה, או 10-7 תאים. לדוגמה: אם רצוי C1V1 = 3 × 107 תאים ו-C2 = OD לאחר האינדוקציה600 מתוך 6 (כלומר, 6 × 107 תאים/מ"ל), אז מחלקים 500 מיקרוליטר של תאים מושרים (כלומר, V2 = 3 × 107 תאים / 6 × 107 תאים/מ"ל = 500 מיקרוליטר).
    3. העבר נפח מחושב של תאים לצינור וצנטריפוגה של 1.5 מ"ל בצנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 5 דקות.
    4. הסר את הסופרנטנט ותשלים מחדש 500 מיקרו ליטר של מי מלח מפוזר פוספט (PBS) + 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA).
    5. צנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 5 דקות וחזרו על שלב 3.2.4.
    6. צנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 5 דקות, ובינתיים, להשלים את שלב 3.2.7.
    7. הכינו תערובת צבע נוגדנים בצינור בנפח 1.5 מ"ל המכילה אנטי-HA פלואורסצאין איזותיוציאנאט (FITC) (0.5 מיקרוגרםל-10 7 תאים), anti-FLAG phycoerythrin (PE) (0.05 מיקרוגרם/107 תאים), ו-PBS + 0.5% BSA (100 מיקרוליטר/107 תאים). תשאירו את הצינור על קרח.
    8. הסר את הסופרנטנט ותשהה מחדש עם תערובת הכתמים. השתמש ב-300 מיקרוליטר מתערובת הצבע לכל 3 ×-10-7 תאים. אל תסחרר את הצינור; רק הפוך או הפוך.
    9. השאר תאים על קרח בחושך במשך שעה אחרי ההשעיה מחדש.
  3. שטיפה לאחר צביעה
    1. הצנטריפוגה צבעה תאים בעוצמה של 5,000 × גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט והחזיר את הכדור ל-PBS המכיל 0.5% BSA באמצעות 0.5 מ"ל ל-1 ×-107 תאים (למשל, 500 מיקרוליטר ל-1 ×10 7 תאים או 1.5 מ"ל ל-3 × 107 תאים).
    2. צנטריפוגה ב-5,000 × גרם, 5 דקות. הסר סופרנאנט, תלה מחדש ב-750 מיקרוליטר PBS + 0.5% BSA.
    3. העבר עוד 750 מיקרוליטר של PBS + 0.5% BSA לצינור איסוף בנפח 10 מ"ל.
  4. FACS
    1. בצע את ההפעלה וההכנה הנדרשת של הציטומטר לניסוי חדש.
    2. צור שלושה גרשי נקודות. בתרשים הנקודה הראשון, בחר את שם ציר ה-X כדי להציג את ערוץ שטח הפיזור הקדמי (FSC-A) ואת שם ציר ה-Y כדי להציג את ערוץ אזור הפיזור הצדדי (SSC-A).
      הערה: זה יקל על בחירת התאים החיים.
    3. שמור על שם ציר ה-X כדי להציג ערוץ FSC-A תוך שינוי ערוץ ציר ה-Y להצגת גובה פיזור קדמי (FSC-H) בגרף הנקודה השני.
      הערה: זה יקל על בחירת סינגלטים.
    4. בחר את שם ציר ה-X כדי להציג את ערוץ ה-PE ואת שם ציר ה-Y כדי להציג את ערוץ ה-FITC על גרף הנקודה השלישי.
    5. הרץ שליטה שלילית על הציטומטר באמצעות ערוצי 530/30 ננומטר (FITC) ו-585/42 ננומטר (PE). בצע מיון באמצעות פיה של 70 מיקרון בלחץ מעטפת של 70 psi. רכוש דגימות במהירות של 4000–5000 אירועים לשנייה.
    6. צייר שער פוליגוני סביב האוכלוסייה העיקרית של תאי שמרים שלמים כדי להוציא פסולת וחלקיקים קטנים עם אותות FSC-A ו-SSC-A נמוכים בגרף הנקודה הראשון (FSC-A מול SSC-A).
    7. סינגלטים של שער בגרף FSC-H מול FSC-A בתוך שער זה, על ידי בחירת האוכלוסייה הליניארית המציגה יחס פרופורציונלי בין FSC-H ל-FSC-A. להוציא אירועים שסוטים מההתפלגות הליניארית ומתאימים לדאבלטים ולאגרגטים של תאים.
      הערה: גרף הנקודה השלישי בין PE ל-FITC יציג אשכול אלכסוני של נקודות עבור הבקרה השלילית (כלומר, תאי שמרים שמבטאים את קלטת הסובסטרט השלמה).
    8. הרץ דגימות ומיין תאי שמרים לפי ערכי PE/FITC הרצויים לצינור איסוף. נתח מספר תאים כולל התואם לפחות פי 10 מגודל הספרייה התיאורטית כדי להבטיח ייצוג מספק של כל הווריאנטים (למשל, ניתוח ~1 ×10 7 תאים עבור ספרייה עם מגוון תיאורטי של ~1 × 106 וריאנטים).
    9. מקם את שער המיון מתחת לאלכסון PE/FITC של אוכלוסיית הבקרה השלילית.
      הערה: שערים מחמירים יותר משפרים את העשרת הווריאנטים הרצויים אך מפחיתים את התאוששות התאים.
  5. לאחר FACS
    1. צינור איסוף צנטריפוגות בעוצמה של 3,200 × גרם למשך 5 דקות. הסר בזהירות את הסופרנאנט, השאיר 1 מ"ל, ותלווה מחדש ב-5 מ"ל של PBS.
      הערה: השאירו 1 מ"ל של סופרנאנט, שכן כדור התא בתחתית לא יהיה נראה לאחר הצנטריפוגה.
    2. תאי צנטריפוגה שוב ב-3,200 × גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט, והשאיר 1 מ"ל. השעתי מחדש עם 4 מ"ל SDCAA+.
    3. בבקבוק Erlenmeyer בנפח 250 מ"ל, הוסיפו 15 מ"ל SDCAA+. העבר את התאים התלויים משלב 3.5.2 לתוך הבקבוקון הזה.
    4. דגירה בלילה למשך 18–24 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות במסלול ב-270 סל"ד.
    5. חזור על שלבים 3.1, 3.2, 3.3 ו-3.4 בכל סבב של אבולוציה מכוונת.

4. שחזור וריצוף פלסמידים של שיבוטים בודדים

  1. לגדל מושבות בודדות
    1. צרו מלאי גליצרול על ידי ערבוב 500 מיקרוליטר מהתרבית הנוזלית לאחר שלב 3.5.4 ו-500 מיקרוליטר של גליצרול 50% סטרילי, מה שמוביל לתמיסת מלאי גליצרול של 25%. מערבוב כדי לערבב היטב את התאים.
    2. אחסן במקפיא בטמפרטורה של –80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחסון ארוך טווח, העבר לחנקן נוזלי.
    3. גרדו את מאגר הגליצרול באמצעות קצה סטרילי של 1000 מיקרוליטר וערבבו לתוך 100 מיקרוליטר SDCAA+. הצלחו את התערובת הזו על צלחת SDCAA ודגרו אותה הפוך בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    4. קטף מושבות אחרי 3 ימים, וגדל אותן בלילה ב-1.5 מ"ל SDCAA+ בצינורות של 14 מ"ל.
  2. בצע מיני-פרפ שמרים לחילוץ פלסמידים
    1. הפלטה של התרבית הלילית על ידי צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך דקה אחת והשעה מחדש ב-200 מיקרו ליטר של תמיסה 1 מערכת טיהור פלסמיד שמרים.
    2. מוסיפים 5 מיקרוליטר של תמיסת אנזימים ליזטית (5 U/μL).
    3. דגרו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות על מיקסר מקצה לקצה.
    4. בצע מחזור הקפאה-הפשרה על ידי הקפאה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות והפשרה בטמפרטורה של 42 מעלות למשך 10 דקות באמבט מים.
    5. הוסיפו 200 מיקרול תמיסה 2 מערכת טיהור פלסמיד שמרים, ערבבו על ידי הפיכה 2–3 פעמים, ותנו ל-5 דקות.
    6. הוסיפו 400 מיקרוליטר של תמיסה 3 מערכת טיהור פלסמיד שמרים וערבבו על ידי הפיכה של 2–3 פעמים. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 5 דקות.
    7. טיהור DNA של פלסמיד באמצעות ערכת טיהור עם קיבולת קישור DNA גבוהה.
      הערה: בשל כמות גדולה של DNA שמרי גנום שנגזר מהתאים המלוזרים, יש להשתמש בעמודה מבוססת סיליקה עם קיבולת קשירת DNA גבוהה יותר (35 מיקרוגרם) במקום עמודת טיהור DNA פלסמיד שמרים בעלת קיבולת נמוכה יותר (5 מיקרוגרם)15.
    8. מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. תפוקת ה-DNA היא 10–30 ng/μL.
  3. המרת פלסמידים מטוהרים לתאי E. coli מיומנים כימית
    1. הכינו מדיום SOC לפי המתכון בטבלה 5, וצלחות LB-כלוראמפניקול. כמו כן, חממו אמבט מים ל-42 מעלות צלזיוס.
    2. חממו צלחת LB-כלורמפניקול לכל פלסמיד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    3. הוצא צינור של תאים כימיים מהמקפיא בטמפרטורה של –80°C והפשיר על קרח.
    4. Aliquot 30 מיקרוליטר של תאים מיומנים לכל פלסמיד לצינור של 1.5 מ"ל על קרח.
    5. פיפטה של 3 מיקרוליטר פלסמיד לתאים מתאימים. מפעילים לערבב ותנו לזה לשבת 5 דקות על הקרח.
    6. בצע הלם חום על ידי דגירה קצרה של התאים באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות.
    7. לדגר על קרח למשך 2 דקות.
    8. הוסיפו 300 מיקרוליטר של מדיום SOC לתאים ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-220 סל"ד.
    9. פלטה בנפח 50–100 מיקרוליטר של תאים מתאימים שעברו טרנספורמציה על לוחות מחוממים מראש.
    10. דגר את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס הפוך למשך 18 שעות.
  4. איסוף מושבות
    1. הוסיפו 5 מ"ל מדיום נוזלי LB-כלורמפניקול לצינורות תרבית עגולים של 14 מ"ל.
    2. בחר מושבה עם קצה סטרילי של 1000 מיקרוליטר, והניח אותו לצינור תרבית.
    3. הניחו צינורות בשייקר (220 סל"ד, זווית 30°–45° למקסום האוורור) בטמפרטורה של 37°C למשך 18 שעות.
  5. הפקת פלסמיד מתרבות נוזל חיידקים
    1. צנטריפוגה את התרביות הנוזליות ב-3,200 × גרם למשך 4 דקות. דקנט הסופרנטנט.
    2. חלץ פלסמידים מתרביות לילה באמצעות ערכת טיהור פלסמידים.
    3. למדוד ריכוז של פלסמידים מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר.
  6. הגיש פלסמידים לצורך ריצוף
    הערה: השתמשו בשירותים כמו ריצוף ננו-נקבוביות מלא בפלסמיד, או, לחלופין, ריצוף סנגר עם פריימר שמקיף את האזור המוטאגן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בניית ספרייה יעילה היא קריטית להבטחת כיסוי מספק של מרחב המוטציה. כדי למנוע אובדן וריאנטים פונקציונליים נדירים, מספר הטרנספורמנטים צריך להגיע לפחות ל-10× עד 100× גודל הספרייה התיאורטית. מכיוון שיעילות הטרנספורמציה ב-S. cerevisiae מושפעת מריכוז התאים והיא הגבוהה ביותר בתאי פאזה מוקדמת עד אמצעית16, אופטימיזציה של צפיפות התא ההתחלתית לפני האלקטרופורציה. תרביות השמרים עברו תרבית משנה בערכי OD600 התחלתיים שנעו בין 1.0–4.0 ודגרו במשך 4 שעות (n = 2–4 נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אבולוציה מכוונת היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת במחזורים איטרטיביים של גיוון ובחירה כדי לזהות חלבונים עם תפקוד ביוכימי משופר או חדשני17. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים תהליך עבודה מותאם לפיתוח זיהוי סובסטרט של פרוטאז באמצעות מערכת תצוגה על פני תא ב-S. cerevisiae. מערכת תצוגת פני השטח ממפה פעילות פרוטאז לפנוטיפ מבוסס פלואורסצנציה שניתן לזהות, ומאפשרת העשרה מבוססת FACS של שיבוטים רצויים. אנו מספקים את השלבים המפורטים להרכבת קלטות ספריית פרוטאז ומצע, אלקטרופורצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים. הנתונים הגולמיים התומכים בפרוטוקול זה, כולל קבצי FASTQ של ריצוף ננופורים, קבצי ציטומטריית זרימה (FCS), ונתוני מקור ששימשו ליצירת האיורים והטבלאות, ופלסמידים pDD1523 ו-pDD1524, הופקדו בזנודו וזמינים לציבור במספר 10.5281/zenodo.20746804

תודות

אנו מודים לכל חברי המעבדה בדינגל על עצותיהם, המומחיות והדיונים שלהם. אנו גם מודים ל-UTD Flow Cytometry Core על התשתית והתמיכה. תואר M.B.L. נתמך על ידי מלגת התואר השני יוג'ין מקדרמוט של UTD. מחקר זה נתמך על ידי קרן הסטארטאפ של UTD ופרסי NIGMS של המכונים הלאומיים לבריאות (NIGMS) למעבדת P.C.D.P.D. (R35GM150967).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Reagents
10 mM dNTP MixNEBN0447SPCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4FisherBP3994Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction BufferNEBB9027SSold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, BactoBD Difco281230-500gSDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagentsBP160-500Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE AntibodyBioLegend637309FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]GenScriptA01621FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino AcidsBD Difco223120SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / TryptoneRPIT60060-10000.0LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction VSigma-Aldrich126575-10GM0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)NEBR0739SGolden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)Sigma-Aldrich21115-100mLElectroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating BeadsSigma-Aldrich71013-3Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-GalactoseThermo FisherA12813.30250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-SorbitolThermo Fisher1327300.10Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrousSigma-AldrichG8270-1KGYPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsSigmaY0626-250G6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)BD242820-500gPre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-1GConditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification KitOmega Bio-tekD6492-02PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction KitOmega Bio-tekD2500-01Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-tekD6942-02Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)FisherBP229-450% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate FisherBP906-5SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme MixNEBM0554SKinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction BufferNEBB0554AUsed with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)Sigma-AldrichL3022-1KGE. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)Thermo FisherA17921.30Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)RPIL24020-2000.0E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino AcidsSigma2240-500GMAlternative casamino acids source
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100XCorning30-002-CISDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)NEBR3140SVector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA PolymeraseNEBM0492SHigh-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC EnhancerNEBB9028AFor high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA PolymeraseNEBM0491LPCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)NEBB6004SSupplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HFNEBR3138LAdditional restriction enzyme
SOC MediumNEBB9020SPost-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)FisherS271-1LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)FisherS318-500Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)Sigma-AldrichS9763-500GSDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrousVWR (BDH)BDH4542-1KGPSD

מקורות

  1. Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471–487.
  2. Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.
  3. Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312–318.
  4. Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108–115.
  5. Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284–2301.
  6. Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167–174.
  7. Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63–71.
  8. Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31–34.
  9. Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155–159.
  10. Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553–557.
  11. Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22–28.
  12. Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651–5656.
  13. Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201–216.
  14. Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893–901.
  15. Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.
  16. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163–168.
  17. Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995–10000.
  18. Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229–7234.
  19. Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.
  20. Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510–518.
  21. Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.
  22. Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474–1483.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

234234PotyviridaeSaccharomyces cerevisiae

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.