מאמר שיטה

פלטפורמת דיו מקריבה בהדפסת תלת-ממד להדמיה ברזולוציה גבוהה של תפקוד תאי אנדותל בכלי דם עקמומיים ובמפערי עורקים (אניוריזמות)

52 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72574

⸱

29 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Tissue Morphodynamics, Cell Biology and Physiology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Biomedical Engineering and Physical Science Shared Resource, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Center for Biomedical Engineering Technology Acceleration, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 4Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול מפרט כיצד לתכנן ולהרכיב כלי דם in vitro עם מקטעים מפותלים או מפרצת (aneurysm), באמצעות מדפסת אקסטרוזיה או יישום ידני של דיו הקרבתי מפוסטר, וכיצד לבחון זרימה המודינמית ותגובות של תאי אנדותל.

תקציר

פיתול כלי דם ואניוריזמות מהוות סיכונים בריאותיים משמעותיים במגוון רקמות אנושיות ובסוגים שונים של כלי דם. שינויים אלו במבנה כלי הדם גורמים לאנומליות בדינמיקת זרימת הדם, המשפיעות באופן משמעותי על התפקוד האנדותליאלי. מודלים חייים של מצבי מחלה וסקולריים אלו היו ממחים במקרים מסוימים, אך הם יקרים להקמה ומוגבלים לפיזיולוגיה של מיני בעלי החיים. כמענה לכך, מודלי in vitro תלת-ממדיים של איבר-על-שבב (OOC) הפכו לארגז כלים עוצמתי להערכת תפקוד וסקולרי ותגובות אנדותליאליות בתאים אנושיים. בעוד שלכל אחד ממודלי ה-OOC ישנם יתרונות, נדרשת מערכת נגישה לחקר חדירות כלי דם, מדד מרכזי לתפקוד וסקולרי בכלי דם מעוקלים ובאניוריזמות תחת קצב גזירה ולחץ פיזיולוגיים. כאן, המתודולוגיה המוצגת מאפשרת את חקר התגובות של תאי אנדותל אנושיים לאנומליות בזרימה במערכת מודל כלכית של כלי דם מעוקל, תוך שימוש במדפסת ביו-טכנולוגית בסיסית המייצרת כלי דם התואמים לקצבי זרימה של נוזלים פיזיולוגיים, למחקרי חדירות, למיקרוסקופיית אור ברזולוציה גבוהה, ולתמיכה במטריצה חוץ-תאית בעלת קשיחות פיזיולוגית.

מבוא

מורפולוגיה של כלי דם היא מדד חשוב לתפקוד התוורי (vascular function), שכן פיתול כלי דם ואניוריזמות הן סימני היכר מרכזיים למחלות שונות ולסיכוני בריאות. פיתול תוורי יכול להיות מולד, כפי שקורה בתסמונות כמו Marfan1, Turner2, ו-Loeys-Dietz3, או להתפתח בשלב מאוחר יותר בחיים כסימן למספר מחלות, כולל יתר לחץ דם, סוכרת, סרטן וייתכן שגם טרשעורקים (atherosclerosis)4,5,6. אניוריזמות של רקמות עורקיות, כולל עורקים קרטידיים7, כליליים (coronary)8, פמורליים9, אאורטליים10, ומוחיים11, קשורות לתחלואה ולסיכוני בריאות עקב דיסקציה ספונטנית או קרע. בנוסף לגרימת אי-סדירויות בזרימה ודלקת אנדותליאלית נלווית, פיתול תוורי ואניוריזמות עשויים להעיד על תפקוד לקוי של הרקמה ודלקת בבסיסם. לדוגמה, בילודים ובchildren, תסמונת של פיתול עורקי מהווה תחזית קלינית לשבץ ילדות12, יתר לחץ דם ריאתי עמיד, ודיסקציה של האאורטה4,13. במבוגרים, וסקוליטיס רטינלית מתבטאת בכלי דם רטינליים מפותלים שהופכים לפחות בולטים ככל שהדלקת הבסיס נרגעת14. האופן שבו פיתול מזוהה ומתורגם לאותות חריגים המניעים התקדמות של המחלה נותר תחום מחקר פעיל. תאי אנדותל המצפים את כלי הדם נחשבים למגשים הראשוניים בתהליך זה. זרימה מופרעת או איטית המושרית על ידי פיתול תוורי או אניוריזמות משנה את מאמץ הגזירה (shear stress), ובכך מעוררת שינויים אנדותליאליים באותות דלקתיים15 ובתפקוד מחסומי16. תאי אנדותל רגישים מאוד לזרימת נוזלים באמצעות מנגנונים הכוללים שערות ראשוניות (primary cilia)17, חלבוני הדבקה מכנו-סנסיטיביים18,19, ותעלות יונים20,21, המניעים סיגנלינג שעלול להפעיל דליפה, דלקת ותכנות מחדש של האנדותל22,23,24. לפיכך, שיטות לבחינת תגובות אנדותליאליות לגאומטריה תווריים של כלי דם הן חשובות לפיתוח טיפולים תווריים.

תפקודים אנדותליאליים במצבי מחלה וסקולרית מודלו באמצעות מודלים של בעלי חיים in vivo, מערכות איבר-על-שבב (OOC) וגישות של הדפסה ביומטרית. מודלים של עכברים מאפשרים שליטה על ביטוי של גנים ידועים הקשורים למחלות ומשלבים את המורכבות של ארכיטקטורת הרקמה והפיזיולוגיה, כולל מעורבות של תאי קיר ותאי מערכת החיסון. מודלים של עכברים לאתרוסקלרוזיס25, לתסמונת מרפאן26 ולמגוון מפוערים (אנוריזמות)27,28,29 מספקים תובנות לגבי פתולוגיות הקשורות לתפקוד לקוי של כלי דם. למרות יתרונות אלו, קשה להשיג תצפית ישירה, מניפולציה ניסיונית וכימות של תאים אנדותליאליים, מלבד שיטות גבאיות (bulk) כגון ריצוף RNA. יתרה מכך, מודלים של בעלי חיים מעמידים שיקולים אתיים וכלכליים והם מוגבלים על ידי פיזיולוגיה ספציפית למין.

פותחו מספר גישות in vitro של איבר על שבב (OOC) כדי לחקור תגובות של תאי אנדותל אנושיים לזרימה למינרית ומשובשת30,31,32במערכות דו-ממדיות (2D)33,34 ותלת-ממדיות (3D)35,36,37. הספרות הנרחבת על OOC38 הונעהה במידה רבה על ידי הנדסה ביו-רפואית, כאשר מאפייני התכנון נותנים מענה לשאלות ביו-רפואיות ספציפיות. מודלי OOC וסקולריים רבים משתמשים בתמיכות של פולידימეთילסילוקסאן (PDMS) כדי לשלוט בארכיטקטורה של כלי הדם38. מודלים אלו מספקים שליטה ברזולוציה גבוהה על גיאומטריות מורכבות ומאפשרים מידול של אינטראקציות בין איברים לכלי דם, כולל כאלו המערבות את הכבד39, המוח40 והריאה41. עם זאת, עדיין קיימות מגבלות. החדירות הנמוכה של PDMS ופולימרים דומים למולקולות גדולות (macromolecules) עלולה להגביל מחקרים של תפקוד מחסום וסקולרי. בנוסף, למרבית ה-PDMS המקשוח יש קשיות של כ- 0.8–10 MPa42, אם כי פורמולציות חלופיות יכולות להשיג טווחים פיזיולוגיים יותר של 8–200 kPa43. הערכות של קשיות קרומי הבסיס הוסקולריים נעות בין ~350 Pa44 ל- ~70 kPa45, תלוי בסוג כלי הדם ובמתודולוגיית המדידה, כאשר מרבית קרומי הבסיס הוסקולריים הבריאים נמצאים בטווח של 2–3 kPa46. כיוון שמחלות וסקולריות כגון טרשת עורקים ויתר לחץ דם קשורות בחלקן לעלייה בקשיות המטריצה החוץ-תאית (ECM)47,48,49,50,51, ותאי אנדותל מגיבים לקשיות ה-ECM, שליטה בקשיות בטווחים פיזיולוגיים היא חשובה במודלים in vitro. גישות OOC עדכניות יותר משתמשות בתשתיות פיזיולוגיות המאפשרות גיאומטריות מורכבות52,53, משלבות סוגי תאים מרובים כדי לשחזר תפקוד איברים39,54,55,56,57, או אינטראקציות חיסוניות-וסקולריות58, ממדלות מבנים וסקולריים ספציפיים למטופל59,60, ותומכות בפיתוח תרופות פרה-קליני61,62. במודלים מיקרו-וסקולריים רבים הכוללים אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים, תאי אנדותל יוצרים באופן ספונטני כלי דם בעלי גיאומטריות שאינן נשלטות יחסית63. לעומת זאת, מערכות OOC המאפשרות גיאומטריות מוגדרות של כלי דם תחת זרימה נשלטת דורשות לרוב תשתית הנדסית, חומרים ומומחיות משמעותיים53,64. לכן, נדרשות שיטות חסונות (robust) הנגישות למי שאינם מומחים כדי להקל על מחקרים של התנהגות תאים וסקולריים תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית.

פלטפורמות של הדפסה ביונית התואמות הידרוגלים של ECM פיזיולוגיים מספקות מודלים ורסטיליים in vitro לחקר תפקוד אנדותל במבנים וסקולריים שונים65. גישות אלו משתמשות באחד משני נתיבים: שיקוע מכוון של ג'לים המכילים תאי אנדותל בצורת כלי דם66, או שימוש בדיו שניתן להסרה (sacrificial ink) ליצירת לומנלים צינוריים פתוחים המוטמעים ב-ECM, אשר ניתן להמיסם לאחר מכן ולהשאיר לומן שניתן לזרע בו תאי אנדותל54. מצעי ECM התואמים ביולוגית, הכוללים ג'לטין, קולגן ופיברין, ניתנים לכיוונון לרמות קשיחות המקורבות לאלה של קרומי הבסיס הוסקולריים (1–3 kPa67) ומאפשרים בדיקות חדירות וסקולרית דומות לאלו המבוצעות in vivo. למרות שגישות אלו אינן משיגות את אותה רזולוציית צורה וגודל כפי שמתקבל בייצור PDMS, ניתן ליצור כלים מעוקלים, מסועפים וסטנוטיים52,66,68. לפיכך, פלטפורמות אלו מתאימות מאוד למידול גאומטריות וסקולריות, כולל כלים מפותלים ואנוריזמתיים.

השיטה המוצגת כאן משתמשת בגישת הדפסה תלת-ממדית המבוססת על אקסטרוזיה פנאומטית, מיקום תלת-ממדי ברמת מיקרון, בקרת טמפרטורה של משטח ההדפסה ושל ראש ההדפסה המכיל את הדיו, ודיו זמני (sacrificial ink) שפותח בעבר עבור אינטראקציות כליות-וסקולריות על שבב67,69. הדיו הזמני מודפס בגיאומטריה הוסקולרית הרצויה ומוטמע מיד בתוך ה-ECM. שינוי בטמפרטורה מסיר לאחר מכן את הדיו, ומותיר לומן פתוח ב-ECM שבו נזרעות תאי אנדותל אנושיים. ה-ECM הבסיסי מורכב מג'לטין ופיברין, מה שמאפשר ג'לציה מהירה ופולימריזציה של פיברין המתווכת על ידי תרומבין, תוך אספקת קשיחות מכנית המתאימה לממברנות בסיס וסקולריות רבות. ניתן לשלב רכיבי ECM נוספים, כולל למינין או פיברונקטין, כדי לדמות טוב יותר את הרכב ממברנת הבסיס הוסקולרית70,71,72ולעודד היצמדות של תאי אנדותל. המערכת מורכבת בתאי Rose רב-פעמיים73 המכילים תומכי מתכת, אטמי גומי סיליקון וזכוכית כיסוי למיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, מה שמאפשר חיבור למשאבת נוזלים באמצעות מחטים מסוג Luer-lock. לחלופין, ניתן לייצר את הפלטות העליונה והתחתונה באמצעות הדפסת תלת-ממד מחומר פולילקטית או חומר מחוזק בסיבי פחמן. המערכת המורכבת עומדת בלחצים הנוצרים מקצבי זרימה פיזיולוגיים של נוזלים. הליך פסטור נחלק משפר גם את הסטריליות של הדיו הזמני מבלי לשנות את תכוניו הפיזיים. בנוסף, גישה של תבנית-מחט וביו-דיו מאפשרת ייצור של כלי דם ישרים המכילים מפרצת (aneurysm) ללא צורך במדפסת ביולוגית. ניתן לבחון את כלי הדם המעוקלים או המפרצתיים בעלי האנדותל שנוצרו תחת זרימה פיזיולוגית באמצעות מיקרוסקופיית אור ברזולוציה גבוהה למשך כשבוע, מה שמאפשר חקירה של תגובות אנדותליאליות חריפות לשינוי בגיאומטריה הוסקולרית.

יתרון מרכזי של מערכת זו הוא התאימות שלה למיקרוסקופיה של אור. כלי דם In vitro שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מתאימים למספר שיטות דימות, והם מתאימים במיוחד למיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית מסוג spinning-disk או סריקת לייזר. בעת בחירת תנאי הדימות, יש להביא בחשבון את הרזולוציה המרחבית והזמנית, את הרגישות ואת מרחק העבודה של העדשה. עבור רוב כלי הדם שנוצרו במערכת זו, על לעדשת העצם להיות בעלת מרחק עבודה מספיק כדי להגיע לכ-100–300 µm מהזכוכית המכסה ולדמות דרך נקודת האמצע של כלי הדם. עדשות עצם בעלות מפתח מספרי גבוה נדרשות לדימוי ברזולוציה גבוהה של מבנים אנדותליאליים, כולל אבניקים ואדזיות תאיות, ולדימוי חי הדורש רזולוציה זמנית גבוהה, כגון מעקב אחר חלקיקי סימון (fiducial beads) תחת זרימה. ניתן לבצע חלק מהבדיקות הדורשות לכידת פוטונים פחות יעילה, כגון מדידות של מחסום אנדותלי המבוססות על פלואורסצנציה, באמצעות עדשות בעלות מפתח מספרי נמוך יותר, כגון עדשות אוויר 10–20×.

הפרוטוקול מתאר יצירה של כלי דם מפותלים ואנוריזמתיים המורכבים מתאי אנדותל אנושיים במערכת in vitro התומכת בזרימה פיזיולוגית של נוזלים ובמיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. זרימת העבודה כוללת תכנון של כלי הדם, ייצור התא, הכנת דיו הקרבה והדפסה בתלת-ממד, הכנת ה-ECM והסרת הדיו, זריעה של תאי אנדותל ותרביתם תחת זרימה, הערכת דליפה וסקולרית, מיפוי זרימה וצביעה אימונופלורסצנטית (איור 1).

פרוטוקול

1. תכנון הכלי

  1. בחרו מקטע כלי דם שמתאים לתא התואם למיקרוסקופ. עבור תא Rose, שמרו על מרחק של לא יותר מ-1.6cm בין מאגרי הכניסה והיציאה.
  2. ייבאו את תמונת ה-CT angiography בניגוד (איור 2A), ה-magnetic resonance angiography, או ה-fluoroscopic angiography לתוך ImageJ/FIJI או לתוכנה אחרת לניתוח תמונות.
  3. השתמשו בכלי למדידת נקודות כדי להגדיר את קואורדינאטות ה-XY לאורך המרכז האקסיאלי של כלי הדם. ייצאו את הקואורדינאטות לתוכנת גיליון אלקטרוני (איור 2B).
    הערה: ניתן לייבא קבצי STL המופקים מ-CT angiography ישירות לרוב התוכנות של המדפסות; עם זאת, הדפסה מבוססת פוליגונים עשויה לדרוש מעברים מרובים ולהוביל ליצירת כלי דם קלועים (Supplemental Figure 1). השתמשו ב-G-code ישיר להדפסה במעבר אחד. מסיבה זו, מיפוי קואורדינאטות ותכנון ב-G-code מועדפים. ראו דוגמת G-code בקבצים המשלמים (Supplemental Files).
  4. שנו את קואורדינאטות ה-XY בגיליון האלקטרוני כדי למקם את מרכז כלי הדם בראשית הגרפית. ייבאו את גבולות התא, במידת הצורך, כדי לוודא שההדפסה הסופית נכנסת לתא.
  5. השתמשו בקואורדינאטות ה-XY של כלי הדם כדי לתכנן את כלי הדם בשכבת ההדפסה הראשונה (איור 2C). הגדירו את גובה השכבה הראשונה, כולל כלי הדם ומאגרי הכניסה והיציאה הסמוכים, ל-200µm.
  6. צרו מאגרי כניסה ויציאה המאפשרים הכנסה נוחה של מחט. השתמשו במאגרים בצורת מעוין במידת הצורך כדי לכוון את הנוזל ביעילות לעבר פתח כלי הדם, ובכך למזער טורבולנציה בכניסה (איור 2).
  7. כללו את המאגרים בשכבת ההדפסה הראשונה כך שיישארו רציפים עם כלי הדם. הוסיפו 5–9 שכבות מעל שכבת הבסיס כדי לספק נפח מספיק להצבת מחטי הכניסה והיציאה. עבור תכנון ב-G-code, הפרטים הבאים חשובים:
    1. הגדירו את ראש ההדפסה ואת מיטת ההדפסה, כאשר בקרת טמפרטורה זמינה, ל-37°C באמצעות תוכנת המדפסת או פקודות G-code מתאימות בתחילת קובץ ההדפסה.
    2. ציינו את ראש ההדפסה או האקסטרודר ב-G-code כאשר זמינים מספר ראשי הדפסה. הגדירו את ה-G-code להשתמש בקואורדינאטות מוחלטות ובמרחקי אקסטרוזיה.
    3. כווננו את גובה השכבה בהתבסס על גודל וצורת המחט, לחץ זרימת הדיו ומהירות ראש ההדפסה. השתמשו בגובה שכבה של 200µm לכל שכבת מאגר מעל השכבה הראשונה עבור הדוגמאות המתוארות כאן.
    4. השתמשו בלחץ נגדי של 14–17psi ובמהירות ראש הדפסה של 6mm/s (G-code: F360) עבור המאגרים. הגבירו את מהירות ראש ההדפסה ל-15mm/s (G-code: F900) עבור כלי הדם.
  8. בחנו כל תכנון חדש של כלי דם על תבנית זכוכית ללא תא לפני הדפסת כלי הדם הסופי.

2. הכנת הדיו ההקרבתי

  1. הוסיפו 2.1g של polyethylene oxide (PEO) ל-60mL של מים סטריליים קרים כדי להכין תמיסה בריכוז 3.5% w/v בתוך כלי סטרילי מכוסה המכיל מגנט ערבוב סטרילי. ערבבו בטמפרטורה של 4°C למשך 48h לפחות, וודאו מדי פעם שכל האבקה התמוססה.
    הערה: יש לאחסן את תמיסת ה-PEO בכלי אטום בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש אחד.
  2. הוסיפו 17.5g של Pluronic F-127 ל-50mL של מים סטריליים קרים כדי להכין תמיסה בריכוז 35% בתוך כלי סטרילי מכוסה המכיל מגנט ערבוב סטרילי. ערבבו בטמפרטורה של 4°C למשך 48h לפחות וודאו מדי פעם שהאבקה נקלטה באופן מלא.
  3. ערבבו 11.4mL של PEO 3.5% קר עם 28.6mL של Pluronic F-127 35% קר בתוך מבחנה קונית סטרילית של 50mL. ערבבו למשך 24h לפחות בטמפרטורה של 4°C באמצעות מערבל סיבובי.
  4. הניחו את המבחנה במצב זקוף בטמפרטורה של 4°C למשך לילה כדי לאפשר לבועות אויר לעלות החוצה מהתמיסה.
  5. הניחו את המבחנה הקונית המכילה את הדיו באמבט מים והדגרירו בטמפרטורה של 63°C למשך 3h. השאירו את הפקק מעט פתוח במהלך החימום כדי לאפשר לאוויר המתפשט להישמר בחוץ.
  6. הוציאו את המבחנה מאמבט המים והניחו לה להצטנן בהדרגה לטמפרטורת החדר. הדקו את הפקק לאחר שהתמיסה התקררה.
  7. הניחו את הדיו שעבר פסטור על קרח למשך 2, תוךما ערבוב עדין מדי פעם ללא הכנסת בועות.
  8. הסירו את בוכנת המזרק, סגרו את פתח המחט ומלאו את המזרק עד ל-60%–70% מהקיבולת שלו. הכניסו את הבוכנה, הפכו את המזרק, הסירו את פקק פתח המחט והוציאו את כל האוויר הכלוא.
    הערה: יש לאחסן מזרקים מלאים בטמפרטורת החדר למשך עד חודש אחד.

3. בניית תא ה-Rose והכנת הצנרת

  1. ייצרו את לוחות התקיעה העליונים והתחתונים מאלומיניום או הדפיסו אותם בתלת-ממד באמצעות קבצי ה-CAD/STL המסופקים (איור 2). שלבו פתח תחתון חרוطي גדול מספיק למעבר של עדשה עם מפתח מספרי גבוה (NA גבוה) ושולי תמיכה לברגים שידחסו בבטחה את הזכוכיתים (coverslips) אל מול האטם.
    הערה: אלומיניום מספק העברה טובה יותר של חום במהלך מיקרוסקופיה עם במה מחוממת. חלקים מודפסי תלת-ממד מ-PLA או מחומרים מחוזקי סיבי פחמן מתאימים לבניית אב-טיפוס, אך עשויים לספק העברת חום פחותה ועשויים להתעוות במהלך חימום חוזר.
  2. גזרו את יריעת הסיליקון כך שתתאים ללוחות התקיעה בגודל 38mm × 51mm. צרו את חלון התצפית המרכזי באמצעות מחורר חורים של 18mm.
  3. קדחו חורים המתאימים לקוטר הברגים שנבחרו. שטפו היטב את האטם המוכן במים כדי להסיר שאריות סיליקון.
  4. עקרו באוטוקלאב את לוחות התקיעה המתכתיים, הברגים, האומים ואטמי הסיליקון בתוך שקיית נייר אלומיניום סגורה, במחזור ייבוש של 20min.
  5. טבלו לוחות מודפסי תלת-ממד באתנול 70% למשך 1min. ייבשו את הלוחות בסביבה סטרילית.
  6. הכינו צינורות באורך 10–30cm המצוידים במחברי Luer-lock ובסגורי צינורות (clamps) בקו התצורה, צינורות מתאימים למשאבה פריסטלטית, ברז תלת-כיווני (three-way stopcock), משכך פעימות (pulse dampener) ומאגר מדיה בעל שני פתחים (איור 3).
  7. עקרו רכיבי צינור ומאגר העמידים בחום באמצעות אוטוקלאב. עקרו רכיבים שאינם עמידים באוטוקלאב באמצעות חשיפה לאתנול.

4. הכנת ריאגנטים למטריצה החוץ-תאית

  1. הוסף 12.5mL של PBS חם ב-37°C ל-1g של fibrinogen מפלזמה אנושית כדי להכין תמיסת מלאי בריכוז 80mg/mL. דגירה ב-37°C תוך ערבוב עדין מדי פעם, ללא שימוש ב-vortex.
  2. המתן 1–2h עד להמסת ה-fibrinogen, עד להיווצרות תמיסה עכורה. חלק את התמיסה לאליקוטים במבחנות סטריליות ושמור ב-−20°C למשך עד 3 חודשים.
  3. הוסף 22.5g של ג'לטין ל-135mL של PBS סטרילי בתוך בקבוק סטרילי המכיל מגנט לערבוב. ערבב במשך 16h ב-70°C, תוך ניעור תקופתי של הבקבוק כדי להבטיח המסה מלאה.
  4. כוון את pH של תמיסת הג'לטין ל-7.5 באמצעות 1M NaOH. סנן את התמיסה בסינון ואקום בעודה חמה, חלק לאליקוטים ושמור ב-4°C למשך עד 6 חודשים.
    הערה: אפשר לג'לטין לעבור תהליך bloom למשך 16h לפחות לפני הסינון. שמור על התמיסה ועל מערכת הסינון ב-37°C במהלך סינון הוואקום כדי למזער סתימה של המסנן.
  5. המס thrombin מפלזמה אנושית ב-PBS סטרילי לריכוז של 1,000 U/mL. ערבב בעדינות, חלק לאליקוטים ושמור ב-−20 °C למשך עד שנה אחת.
  6. המס 300mg של transglutaminase ב-5 mL של PBS ודגירה ב-37°C למשך 1 h תוך ערבוב מדי פעם. סנן את התמיסה בסינון סטרילי למבחנה נקייה ושמור אותה בטמפרטורת החדר.
    הערה: הכן את תמיסת ה-transglutaminase טרייה מדי יום. שמור את ה-transglutaminase באבקה במצב מיובש ב-4°C.
  7. המס calcium chloride במים כדי להכין תמיסה בריכוז 1M. סנן את התמיסה בסינון סטרילי ושמור בטמפרטורת החדר למשך עד שנה אחת.

5. הכנה והפעלה של כיסויות הזכוכית

  1. טבול כיסויות זכוכית נקיים באתנול, ולאחר מכן העבר אותם בזהירות מעל להבת מבער בנזן כדי לאדות את האתנול.
    זהירות: אתנול הוא חומר דליק. הרחק כמויות גדולות של אתנול מהלהבה הפתוחה ובצע סטריליזציה באמצעות להבה בהתאם לנהלי בטיחות אש במעבדה.
  2. מקם את הכיסויות במעמד נירוקח ללא שבירה או סדקים בזכוכית.
  3. טבול את הכיסויות ב-0.5% (3-aminopropyl) trimethoxysilane המדולל במים למשך 30–60 דקות בטמפרטורת החדר. בצע ערבוב עדין במהלך האינקובציה.
    זהירות: טיפל ב-(3-aminopropyl) trimethoxysilane תוך שימוש בציוד מגן כימי ובבקרות הנדסיות מתאימות.
  4. שטוף את הכיסויות באמצעות שישה החלפות של מים עם ערבוב עדין. מנע מהכיסויות להשתחרר בזמן העברת המעמד.
  5. הוצא את המעמד מהמים, ספוג עודפי מים וייבש ב-50°C למשך 30 דקות.
  6. המת לקירור הכיסויות לטמפרטורת החדר בזמן הכנת 0.5% glutaraldehyde ב-PBS.
    זהירות: Glutaraldehyde הוא חומר רעיל ומגרה. הכן וטפל בתמיסה במכססה כימית מתאימה תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
  7. בצע אינקובציה לכיסויות ב-0.5% glutaraldehyde למשך 60 דקות עם ערבוב עדין כדי למזער הצטברות בועות ולקדם אקטיבציה אחידה.
  8. שטוף את הכיסויות באמצעות שלוש החלפות של מים סטריליים והמת להם להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.
    הערה: אחסן כיסויות מופעלות תחת ייבוש בוואקום למשך עד חודשיים.

6. ציפוי הזכוכיות במעטפת הבסיס של המטריצה החוץ-תאית

  1. חממו 1× PBS, תמיסת ג'לטין ותמיסת פיברינוגן ל-37°C למשך 30–60 דקות.
  2. רפדו צלחת פטרי סטרילית בגודל 15 ס"מ בפרפילם נקי, רססו את פני השטח ב-70% ethanol, נקו את העודפים והניחו למשטח להתייבש באוויר בתוך מabilis בטיחות ביולוגית.
  3. הוסיפו לרבוב קוני של 15 מ"ל, באופן רצופי, 1.68 mL של PBS חם, 2.5mL של תמיסת ג'לטין, 12.5µL של 1M CaCl₂, 625µL של תמיסת פיברינוגן ו-167µL של תמיסת טרנסגלוטמינאז.
  4. הניחו את תערובת ה-ECM באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
  5. הכינו עבור כל כיסוי זכוכית (coverslip) מבחנה אחת של 1.7 מ"ל המכילה 5µL של תמיסת תרומבין.
  6. הוסיפו 400µL מהכנת ה-ECM למבחנת התרומבין וערבבו באמצעות פיפוט פעם אחת, תוך מזעור היווצרות בועות.
  7. העבירו מיד 200µL מהתערובת על גבי הפרפילם הסטרילי והניחו כיסוי זכוכית מופעל אחד על הטיפה באמצעות פינצטה. לחצו בעדינות כדי להשיג כיסוי מלא.
    הערה: השלימו שלב זה תוך כ-20 שניות לאחר ערבוב תערובת ה-ECM עם התרומבין.
  8. כסו את צלחת הפטרי והדגירו את כיסויי הזכוכית המצופים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן למשך 2 שעות ב-37°C באינקובטור לח.
  9. קלפו בעדינות כל כיסוי זכוכית מהפרפילם על ידי כיפוף הפרפילם הרחק מהכיסוי.
  10. הניחו את כיסויי הזכוכית המצופים טריים בצלחת פטרי נקייה באינקובטור לח, כאשר צד הג'ל פונה כלפי מעלה, והשתמשו בהם תוך יום אחד.
  11. לחלופין, הדגירו את כיסויי הזכוכית המצופים למשך הלילה באינקובטור שאינו לח והשתמשו בהם תוך יומיים.

7. הדפסה בביו-דיו של הדיו המקריב והכלילתו ב-ECM

  1. בצעו הדפסות ניסיון לפני הדפסת הכלי כדי לוודא כי הדיו ופרמטרי ההדפסה מפיקים את ממדי הכלי הרצויים. טענו את קובץ ההדפסה לתוכנת המדפסת.
    הערה: מחט הזרקה קונית של 32 G עם דיו של 25% Pluronic F127/1% PEO מפיקה באופן עקבי קטרי כלי עד לכ-150µm תחת התנאים המתוארים כאן. בצעו אופטימיזציה למהירות ראש ההדפסה וללחץ הגב באמצעות הדפסת קווים פשוטים על זכוכית.
  2. הרכיבו את פלטת התפס התחתונה, כיסוי זכוכית תחתון מצופה ECM, אטם סיליקון, פלטת תפס עליונה ללא כיסוי זכוכית עליון, ושני ברגים. הניחו את המכלול בצלחת פטרי מכוסה של 100 mm ושמרו אותה בטמפרטורה של 37 °C עד לשימוש באותו היום.
  3. חברו את מחט ההדפסה למזרק הדיו והתקינו את המזרק במדפסת האקסטרוזיה הפנאומטית. חממו מראש את במה ההדפסה, ראש ההדפסה ופלטת חימום סמוכה ל-37 °C.
  4. הכינו את מטריצת ה-ECM כפי שמתואר בסעיף 6 ושמרו אותה באמבט מים של 37 °C. הכינו 1.5 mL של מטריצה לכל תא Rose במנות של 5 mL.
  5. העבירו 5 µL של תמיסת סטוק thrombin למבחנה סטרילית של 1.7 או 2 mL עבור כל תא. השאירו כיסויי זכוכית מופעלים ולא מצופים זמינים בתוך קבנית הביו-בטיחות.
  6. הניחו את התא המכיל את כיסוי הזכוכית מצופה ה-ECM על במת המדפסת ומרכזו בראשית ציר ה-XY. הורידו את המחט עד שהיא נוגעת ב-ECM או במשטח הזכוכית במרכז חלון התא, והגדירו מיקום זה כראשית ציר ה-XYZ.
  7. הרימו את המחט והפעילו לחץ מקסימלי כדי למלא אותה לחלוטין בדיו ולפלוט בועות נראות. נגבו את קצה המחט עם נייר ניגוב סטרילי למעבדה.
  8. הדפיסו את גיאומטריית הכלי והמאגר באמצעות קובץ ה-G-code שהועלה. הרימו מיד את המחט והוציאו את התא לאחר ההדפסה.
  9. בחנו את הכלי המודפס לאיתור בועות ונתקים. השליכו והדפיסו מחדש כל מבנה המכיל את אחד הפגמים הללו.
  10. הניחו את התא על פלטת החימום של 37 °C, הסירו את הברגים ואת פלטת התפס העליונה, וערבבו 1 mL של מטריצת ECM מוכנה עם מנת ה-thrombin באמצעות פיפוט פעם אחת.
  11. העבירו את תערובת ה-ECM המופעלת לתוך תא הכלי ללא הכנסת בועות, והניחו מיד כיסוי זכוכית מופעל עם הפנים כלפי מטה על ה-ECM. החזירו את פלטת התפס העליונה והדקו את הברגים עד שהם יחזיקו היטב ללא הידוק מוגזם.
  12. הניחו את התא המושלם בצלחת פטרי מכוסה של 100 mm והדגירו ב-37 °C למשך 2 h.

8. יצירת מפרצת באמצעות תבנית חוט

  1. החדירו מחטים בכיל 21 דרך הצדדים הנגדיים של אטם הסיליקון ויישרו אותן.
  2. בצעו סוניקציה לחוט מנדריל רפואי מפלדת אל-חלד 304 בקוטר 0.0190 אינץ' ב-PBS המכיל 1% BSA בתוך מבחנה קונית של 15 mL. הוציאו את החוט והניחו לו להתייבש באוויר בתוך צלחת פטרי סטרילית בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית.
  3. העבירו את החוט המצופה ב-BSA דרך שתי המחטים באטם (איור 2). כופפו מעט את אחד הקצוות הבולטים כדי להקל על הסיבוב המאוחר יותר.
  4. עקרו באוטוקלאב את מכלול האטם, המחט, החוט ולוחית התפסן בתוך שקית רבד.
  5. מקמו את מכלול המחט/אטם מעל כיסוי זכוכית (coverslip) מופעל ומצופה ב-ECM.
  6. חברו מחט 21 G למזרק המכיל דיו Pluronic/PEO שעבר פסטור.
  7. טפטפו טיפה קטנה של דיו הקרבה (sacrificial ink) על דופן החוט במרכז התא. מרחו טיפה קטנה של דיו בכל נקודת חיבור בין המחט לחוט כדי ליצור איטום.
  8. הכינו את תערובת ה-ECM והרכיבו את התא כפי שמתואר בסעיפים 7.10–7.12.
  9. לאחר שה-ECM התגבש, סובבו בעדינות את הקצה הכפוף של החוט כדי לשחררו מה-ECM ומדיו ההקרבה. משכו את החוט לאט מתוך המכשיר.
  10. מלאו את מחט הכניסה ב-PBS באמצעות פיפטה של 200 µL והניחו ל-PBS לזרום דרך הלומן. חזרו על הפעולה פעם אחת והמשיכו לסעיף 9.

9. שטיפת דיו ההקרבה מתא הכלי

  1. חברו צינורית למאגר המכיל PBS קר (4 °C) עם תוספת של אנטיביוטיקה, שלבו ברז תלת-כיווני (three-way stopcock), וסיימו את הצינורית באמצעות מחבר Luer-lock זכר ומחט סטרילית 23 G.
  2. מלאו את צינורית האספקה ב-PBS קר באמצעות מזרק הברז עד ש-PBS יוצא מחור המחט. סגרו את הצינורית באמצעות תסמיך (clamp).
  3. מלאו קטע צינורית שני ב-PBS וסיימו אותו עם מחט 23-G. סגרו את הצינורית באמצעות תסמיך והסירו את מזרק המילוי.
  4. החדירו את מחט האספקה דרך האטם אל מאגר הכניסה ואת מחט הניקוז אל מאגר היציאה. ודאו את המיקום הנכון באמצעות מיקרוסקופ הפוך או סטריאומיקרוסקופ.
  5. העבירו את המערכת ל-4 °C ומקמו את מאגר האספקה בגובה 30 cm מעל הכניסה. מקמו את היציאה בגובה 5–10 cm מתחת למחט היציאה של הכלי מעל מיכל פסולת.
  6. שחררו את התסמיכים והזרימו לפחות 250 mL של PBS קר דרך התא. בדקו את המערכת לאיתור דליפות ובועות במהלך ההזרמה.

10. ציפוי וטיפול מקדים של חלל הכלי ברכיבי ECM נוספים

  1. דללו fibronectin לריכוז של 20 µg/mL, laminin לריכוז של 10 µg/mL, או basement membrane matrix לדילול של 1:30 ב-3 mL של PBS.
  2. הוסיפו transglutaminase שהוכן טרי לרכיב ה-ECM המדולל.
  3. השאירו את הצינורות הסמוכים מידית לכלי מחוברים לכניסה וליציאה.
  4. הזריקו לאט את תמיסת ה-ECM/transglutaminase דרך הכלי באמצעות מזרק של 1 mL. חזרו על הפעולה עד שכל 3 mL יעברו דרך הכלי.
  5. סגרו את המחברים באמצעות תפסנים, אטמו את הכניסה והיציאה עם פקקי Luer סטריליים, והדגירו ב-37 °C למשך שעה אחת עד ללילה.
  6. שטפו את הכלי עם 100 mL של endothelial medium מלא המכיל penicillin/streptomycin. סגרו את מחברי הצינורות ואטמו את היציאות.
    הערה: אחסנו את הכלי המלא בתווך ב-4 °C למשך עד שבוע. ודאו שלא נותרו בועות בתוך הלומן.

11. זריעת תאים בכלי

  1. דגרו את התא המכיל את תבנית כלי ה-ECM בטמפרטורה של 37 °C למשך 2 h. חממו מצע אנדותל מלא המכיל penicillin/streptomycin ל-37 °C.
  2. בצעו טריפסינזציה לתאי אנדותל מתוך צלחת תרבית אחת של 10-cm או מבקבוק T75 אחד, ונטרלו את ה-trypsin באמצעות מצע מלא. העבירו את התסמין לשפופרת קונית של 15 mL והוציאו מנה (aliquot) לספירת תאים.
  3. סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1,000 × g למשך 5 min. השביו את המשקע להכנת 150 µL של תסמין תאים בריכוז של 5 × 106 cells/mL.
  4. חברו את צינור היציאה למאגר פסולת סטרילי והשאירו את תסביב הצינור סגור.
  5. נתקו את צינור הכניסה והסירו שאריות מצע מתוך בסיס מחט הכניסה. החזיקו את הכלי במצב אנכי והעבירו בעזרת פיפטה את תסמין התאים לבסיס המחט.
  6. שחררו את תסביב היציאה כדי לאפשר לתסמין התאים להיכנס לכלי. סגרו שוב את התסביב לאחר שכל התסמין נכנס ללומן.
  7. הוסיפו מצע מלא וחם לבסיס מחט הכניסה, ולאחר מכן סגרו אותו באמצעות פקק Luer סטרילי. נתקו וסגרו את היציאה עם פקק.
  8. דגרו את התא במצב זקוף בטמפרטורה של 37 °C למשך 3 h.
  9. חזרו על סעיפים 11.5–11.8 ודגרו את התא במצב הפוך בטמפרטורה של 37 °C למשך 3 h.
  10. שטפו בעדינות את הכלי עם 1 mL של מצע מלא ודגרו ב-37 °C למשך 3 h.
  11. אשרו את היצמדות תאי האנדותל באמצעות מיקרוסקופיה, שטפו בעדינות תאים שאינם תפוסים באמצעות מצע טרי, ודגרו ב-37 °C למשך 12–24 h.

12. גידול הכלי תחת זרימה

  1. חממו 200 mL של מצע מלא במשך שעה אחת ובצעו ניקוז גזים (degas) תחת ואקום באמצעות יחידת סינון סטרילית. חממו שוב את המצע באינקובטור CO₂ עם לחות.
  2. בתוך קביינט בטיחות ביולוגית סטרילי, חברו ברצף את יציאת מאגר המצע וברז תלת-כיווני (three-way stopcock), צינור המשאבה, משכך פולסים (pulse dampener), מלכודת בועות אופציונלית, צינור כניסה, תא הכלי, צינור יציאה וצינור חזרה למאגר המצע (איור 3).
  3. בצעו ה priming למעגל הזרימה כולו באמצעות המצע ואשרו שלא נותרו בועות או כיסי אוויר.
    הערה: מלאו את המחברים וטבעות המחטים בנוזל לפני החיבור מחדש. בועות אוויר החודרות לכלי עם תאים עלולות לגרום לאובדן תאי אנדותל בשל כוחות גזירה פתאומיים.
  4. העבירו את המערכת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C והפעילו קצב זרימה של 1 dyn/cm2 בתוך הכלי. שמרו על זרימה זו למשך 12 h.
  5. הגבירו את הזרימה כדי להגיע ל-12–16 dyn/cm2 ושמרו עליה למשך 18–24 h לפני ביצוע בדיקות המשך. כדי לחשב את קצב הזרימה הנדרש עבור הכלי שלכם, קבעו את אורך הכלי המודפס ואת קוטרו הממוצע. באמצעות מחשבון מקוון, השתמשו בפרמטרים שנקבעו והזינו חתך רוחבי מעגלי, מצע עם 10% סרום והתנגדות צינורות זניחה (קוטר הצינורות גדול בהרבה מקוטר הכלי המודפס).
    הערה: השתמשו בכלי בהקדם האפשרי לאחר התניית הזרימה (flow conditioning). תרבית מעבר לשבוע אחד עלולה להוביל להיווצרות מרווחים בין תאי האנדותל, מה שעשוי להיות קשור לאובדן תאים או לשינוי ב-ECM על ידי פרוטאזות של האנדותל.

13. ביצוע בדיקת דליפה כלי דמית (vascular leak assay)

  1. הוסיפו BSA המסומן ב-Alexa 647 או dextran במשקל 10 kDa המסומן ב-Alexa 647 ל-35 mL של מצע מלא כדי להגיע לריכוז סופי של 5 mg/mL. חממו את התמיסה ל-37 °C.
  2. בצעו דגירה מוקדמת של הכלי עם חומר הבדיקה, כגון 250 ng/mL TNFα, למשך 1–2 שעות, והוסיפו את אותו החומר למצע הבדיקה.
  3. הכינו אמבט מים ב-37 °C והמיקמו את המשאבה ליד המיקרוסקופ. הפעילו את המיקרוסקופ, את תוכנת הרכישה ואת מערכת חימום הבמה, והמתינו 30 דקות לאיזון טמפרטורת הבמה ל-37 °C לפני הצילום.
  4. עצרו את הזרימה באינקובטור, נתקו את מאגר מצע התרבית, והעבירו את התא ואת הצינוריות הנלוות לבמה המחוממת מראש של המיקרוסקופ.
  5. חברו את המשאבה לכ-20 cm של צינורית המצוידת במיקרופיפטה מזכוכית המכילה מצע לא מסומן. הכניסו את צינורית המיקרופיפטה לתוך מצע הדיווח הפלואורסצנטי והניחו את צינורית היציאה בכלי איסוף.
  6. הגדירו את המשאבה לספק קצב זרימה התואם ל-0.2 mL/min, ואל תתחילו את הזרימה עד שהצילום יהיה מוכן.
  7. בצעו פוקוס על קו האמצע של הכלי באמצעות הדמיית ניגודיות פאזה (phase-contrast) ועברו לערוץ הפלואורסצנציה של 647. התחילו את הזרימה בקצב שנקבע בסעיף 13.6 ורכשו תמונות כל 1–5 דקות בהתאם לזמן התגובה הצפוי.
  8. צרו קימוגרפים (kymographs) מהתמונות שנרכשו והתאימו שיפוע ליניארי לערכי עוצמה שעברו סף (thresholded). דווחו על הדליפה כמרחק ב-µm שעבר חומר הדיווח מפני השטח החיצוני של הכלי לדקה.

14. מיפוי זרימת נוזלים

  1. ערבבו במערבב Vortex את החרוזיים הפלורסצנטיים בגודל 10 µm למשך 1 דקה, ולאחר מכן חשפו אותם לעיבוד אולטרסאונד (sonication) במכשיר סוניקטור רחוב למשך 1 דקה. דללו את החרוזיים לריכוז של 1.8 × 105beads/mL ב-10 mL של מצע גידול מלא.
  2. הגדירו את מערכת הזרימה על במה המיקרוסקופ כפי שמתואר בסעיף 13 עבור בדיקת דליפה וסקולרית. הוסיפו כלי איסוף לזרימה היוצאת והגדירו את קצב הזרימה ל-0.2 mL/min.
  3. מקדו את המיקוד במישור המרכזי של הכלי באמצעות עדשה בעלת מרחק עבודה מתאים. רכשו תמונות בתדירות המקסימלית המעשית המותרת על פי זמן החשיפה, רגישות הגלאי, עוצמת העירור ויעילות איסוף האור.
  4. נתחו את רצף תמונות ה-time-lapse באמצעות תוכנה לוולוצימטריה של תמונות חלקיקים (Particle Image Velocimetry).

15. קיבוע וצביעה אימונוהיסטוכימית של כלי הדם המצופים באנדותל

  1. הכינו 40 mL של 4% פאראפורמלהיד ב-PBS המכיל 10 mM CaCl₂ ו-10 mM MgCl₂.
    אזהרה: פאראפורמלהיד הוא רעיל. הכינו וטפלו בתמיסות המכילות פאראפורמלהיד במabilis כימי מתאים תוךneath לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
  2. עצרו את הזרימה, סגרו את צינור הכניסה בעזרת תליב (clamp), נתקו אותו מהמשאבה וחברו אותו לצינור השאיבה המשמש לבדיקת דליפה וסקולרית. הכניסו את צינור השאיבה למקבע ותנו ל-35 mL לעבור דרך כלי הדם באמצעות כוח הכבידה.
  3. סגרו את הצינור בתליב והדגירו את כלי הדם במקבע בטמפרטורת החדר למשך 30 min.
  4. שטפו את כלי הדם בכוח הכבידה עם 25 mL של תמיסת חדירה (permeabilization buffer) המכילה 0.4% Triton, 20 mM PIPES ב-pH 6.1, 138 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM EGTA ו-5.5 mM גלוקוז. סגרו את הצינור בתליב והדגירו למשך 10 min בטמפרטורת החדר.
  5. שטפו את כלי הדם בתמיסת חסימה (blocking buffer) המכילה 1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Tris ב-pH 7.4, 140 mM NaCl ו-5 mM KCl. הדגירו למשך 2 h בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 °C.
  6. דללו את הנוגדן הראשוני שנבחר ביחס של 1:50–1:500 ב-100–500 µL של תמיסת חסימה. הסירו את צינור הכניסה והחדירו את תמיסת הנוגדנים לפי הפרוצדורה המתוארת בסעיף 11 לזריעת תאים.
  7. הדגירו את כלי הדם למשך לילה ב-4 °C.
  8. חברו מחדש את צינור הכניסה ושטפו את כלי הדם עם 20 mL של PBS.
  9. דללו את הנוגדיים המשניים המתאימים ביחס של 1:200–1:1,000 בתמיסת חסימה, ובמידת הצורך, הוסיפו פאלואידין פלואורסצנטי ביחס של 1:250. החדירו את התמיסה לפי הפרוצדורה המתוארת בסעיף 15.6 והדגירו למשך 2 h בטמפרטורת החדר.
  10. שטפו את כלי הדם עם 40 mL של PBS, סגרו את תליבי הצינורות ואטמו את הצינורות.
    הערה: אחסנו את כלי הדם הצבוע ב-4 °C ובצעו דימות תוך שבועיים.
  11. צבעו את F-actin באמצעות פאלואידין פלואורסצנטי, את מנגנון הגולג'י באמצעות anti-GM130 ואת הגרעינים באמצעות DAPI.
  12. נתחו את תמונות הפאלואידין באמצעות FibrilTool74 כדי לקבוע את האוריינטציה הממוצעת של סיבי מאמץ (stress fibers) של F-actin.
  13. קבעו את הציר שבין מרכזי המסה של כל גרעין ומנגנון הגולג'י. נתחו ושרטטו את האוריינטציות שהתקבלו בתוכנה לחישוב נומרי כפי שתואר בעבר75.

תוצאות

השימוש בדיו הקריב להדפסת רקמות צינוריות שונות בוסס היטב על ידי מספר קבוצות, ובעיקר במעבדת Lewis, שייצרה צינוריות כליה יחד עם כלי דם67,76. גישות דומות שימשו להדפסת מבני נמיקים (alveolar structures)77 וגידולים בעלי כלי דם (vascularized tumors)78. כאן, גישות אלו הותאמו ליצירת גיאומטריות של כלי דם לצורך חקירת תגובות אנדותליאליות תחת זרימה פיזיולוגית של נוזלים (איור 2). גיאומטריות של כלי דם הומרו מתמונה של כלי דם למפת קואורדינטות, ולאחר מכן לקוד G כדי להגדיר את נתיב ההדפסה (איור 2A–C). הגישה שהתקבלה אפשרה ייצור של תבניות כלי דם למחקר על האופן שבו תפקוד אנדותליאלי וארגון השלד התאי משתנים על ידי כלי דם מפותלים ומפרגמתיות (aneurysms) (איור 2D–G). תכנון של תא Rose הניתן להדפסה בתלת-ממד שולב גם הוא כדי לבטל את הצורך בשירותי עיבוד שבבים (איור 2H). דוגמה לקובץ G-code להדפסת כלי דם מסופקת ב-קובץ משלים 1, וקבצי ה-CAD התואמים של תא Rose ומעמדי השלב מסופקים ב-קובץ משלים 2 וב-קובץ משלים 3, בהתאמה. הדפסה מבוססת STL עשויה לדרוש מעברים מרובים של ראש ההדפסה, מה שמוביל לגיאומטריות של כלי דם קלועים עם לומנים (lumens) נפרדים (איור משלים 1). הפלטפורמה שהתקבלה תוכננה להיות נגישה לביולוגים של תאי כלי דם עם מומחיות מינימלית בביו-הנדסה, תוך תמיכה בלחצים ובקצבי זרימה פיזיולוגיים ואספקת גישה למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה (איור 2I).

לאחר ייצור כלי הדם והצלולריזציה, הוטמע התקן כלי הדם במערכת פרפוזיה במעגל סגור כדי לאפשר סירקולציה מבוקרת של המדיה (איור 3). המערכת כללה משאבה פריסטלטית, ברז עצירה תלת-כיווני המחובר למזרק ה priming, מלכודת בועות, משכך פעימות, את התקן כלי הדם ומאגר מדיה, שסודרו ברצף בתוך מעגל הזרימה (איור 3A). תצורה זו אפשרה למדיה להזרים באופן רציף דרך כלי הדם המהונדס, תוך שילוב של רכיבים לביצוע priming למערכת, הסרת בועות ושיכוך פעימות הנוצרות על ידי המשאבה הפריסטלטית. ניתן היה להפעיל את המערכת המורכבת כאשר התקן כלי הדם ממוקם בתוך המערך הניסיוני, כפי שמוצג באיור 3B, דבר המספק תצורה פרקטית לפרפוזיה עוקבת של כלי דם שעברו צלולריזציה תחת תנאי זרימה מבוקרים.

שינוי אחד בגישות הדיו ההקרבה שתוארו בעבר היה פסטור של הדיו לפני ההדפסה. שינוי זה היה נחוץ מכיוון שיישום פרוטוקולי הכנת דיו שפורסמו הוביל לתרביות מזוהמות בעובש. בדומה לדיו אחרים מבוססי Pluronic המשמשים ליישום זה, דיו ה-25% Pluronic F127/1% PEO נותר נוזלי בטמפרטורות נמוכות ועובר למצב של ג'ל מיצלארי דחוס עם עליית הטמפרטורה. לפורמולציה זו טמפרטורת מעבר של 15°C, דבר שנוח ליצירת תבניות של מבנים בטמפרטורות אינקובטור והסרת הדיו ב-4°C. בדומה ל-Pluronic טהור, חומר זה מראה גם הוא דילול גזירה (shear thinning) משמעותי בטמפרטורת ההדפסה (איור 4A). עם זאת, אפילו בטמפרטורות נמוכות, הדיו צמיגי מדי עבור סטריליזציה בסינון באמצעות מסנני תרביות רקמה סטנדרטיים וואקום. למרות שניתן לעקר את הדיו על ידי פסטור ב-70°C ומעלה למשך 20s, טמפרטורות אלו משנות את הדיו באופן בלתי הפיך ומפחיתות את הצמיגות שלו בטמפרטורת ההדפסה (נתונים לא מוצגים). פסטור בטמפרטורה נמוכה יותר ולמשך זמן ארוך יותר ב-63°C למשך >1 h מפחית את הזיהום על ידי פטריות ומיקרואורגניזמים אחרים מבלי לשנות את הצמיגות המורכבת של הדיו בטמפרטורות המתאימות להדפסה. אפיון ראולוגי באמצעות ראומיטר המצויד בגיאומטריית קונוס-ופלטה של 25 mm הראה שלדיו הגולמי והמדפסטר היו צמיגויות דומות בטווח של מהירויות דפורמציה בטמפרטורות הדפסה (איור 4B), מה שמוכיח שהפסטור אינו פוגע ביכולת ההדפסה. דיו מפוסטר מאפשר גם תרבית כלי דם לטווח ארוך יותר ללא צורך בתרופות אנטי-מיקוטיות, שעלולות לשנות את התפקוד האנדותליאלי.

לאחר שהכלי עבר תהליך של התאבייה (cellularization), תאי אנדותל קונפלואנטיים צריכים לצפות את הכלי כולו, כפי שמוצג ב- איור 5, עם השלכה של עוצמה מקסימלית ב- איור 5A והחתך הרוחבי ב- איור 5Bלאחר מכן ניתן להעלות את זרימת המצע לקצבי גזירה פיזיולוגיים, אותם ניתן להעריך עבור כלי דם מעגליים בקירוב באמצעות משוואת Hagen-Poiseuille.79בפועל, ניתן להעריך את קצב הזרימה הדרוש להשגת מאמץ גזירה רצוי על ידי התחשבות בצמיגות המדיום ובהתנגדות המיקרופלואידית. בתרבית דו-ממדית טיפוסית in vitro, זרימת מדיום ב-12 dyn/cm²2גורם לרוב סוגי התאים האנדותליאליים להתמצא לאורך ציר הזרימה. ניתן להדמיא תגובה זו באמצעות צביעה פלואורסצנטית של F-actin באמצעות פאלוידין (איור 5D,E) או על ידי ניתוח של הציר גולג'י-גרעין (איור 5D,F), שניהם מראים אוריינטציה אניזוטרופית העולה בקנה אחד עם קיטוב אנדותליאלי, כפי שתואר בעבר18אף על פי שמאמצי גזירה העולים על 40 dyn/cm2 להתרחש in vivoתנאים כאלה לא מודלו כאן.

תוצאה מרכזית של גיאומטריה משתנה של כלי דם היא זרימה משתנה של נוזלים, אליה מגיבים תאי אנדותל באמצעות מספר מסלולי סיגנלינג80,81. קיימות מספר שיטות לניטור מהירות זרימת הדם, כולל אולטרסאונד דופלר 4D82, דימות תהודה מגנטית (MRI) של זרימה ב-4D83, ודימות ספקל לייזר (laser speckle imaging)84. למרות שטכניקות אלו מציעות יתרונות חשובים in vivo, הפרדה של הבדלי זרימה מקומיים לאורך כלי דם בודד עלולה להיות מאתגרת. יכולת הדימות בעלת הממספר האפטורה הגבוה של פלטפורמה זו מאפשרת מעקב ישיר אחר חלקיקים פלואורסצנטיים (איור 6B) ומיפוי ברזולוציה מרחבית גבוהה של אנומליות זרימה המושרה על ידי קימור כלי הדם באמצעות ולוקימטריה של תמונות חלקיקים (particle image velocimetry) (איור 6C). לדוגמה, נצפית זרימה איטית יותר לאורך הקימור הפנימי של כלי הדם מאשר לאורך הקימור החיצוני (איור 6C), דבר שעשוי לתרום לתגובות אנדותליאליות משתנות85.

לאחר שנוצר כלי דם קונפלואנטי (confluent), ניתן להעריך את הפתוחות (patency) ואת תפקוד המחסום על ידי פרפוזיה של מקרו-מולקולות המסומנות פלואורסצנטית, כגון דקסטראנים או חלבונים, דרך הלומן. כלי דם פתוחים המרופדים בתאי HUVECs עומדים בפני מעבר של דקסטראנים המסומנים פלואורסצנטית (איור 6D,F). לעומת זאת, חשיפה לגירויים המשבשים את מחסום הדימום, כגון TNFα מגביר דליפה של כלי דם (איור 6H, ג'ניתן להמחיש שיעורי דליפה מקומיים באמצעות ניתוח קימוגרף (איור 6EG,I,K). מכיוון שהקימוגרף (kymograph) מייצג מרחק בציר ה-X וזמן בציר ה-Y, ניתן להשוות שיעורי דליפה יחסיים על ידי כימות השיפועים של קווים המותאמים לעוצמות פלואורסצנציה מקטעות (איור 6E,G,I,Kניתוחים אלו מאפשרים להעריך כיצד גאומטריית כלי דם מקומית משפיעה על תפקוד מחסום האנדותל בתגובה לגירויים מוגדרים.

יתרון מרכזי של פלטפורמה זו הוא גישה מיקרוסקופית משופרת בהשוואה למה שניתן להשיג in vivo. המערכת מקלה גם על אנליזה אימונוהיסטוכימית של הארגון המולקולרי האנדותליאלי, ובמיוחד של שלד התא האקטיני. תאי אנדותל הם דקים מאוד ומוקפים in vivo על ידי תאי שריר חלק, דבר שעלול לסבך את איתורם של מבני שלד התא באופן ספציפי בתוך האנדותל. פלטפורמה זו מאפשרת צביעה והדמיה פשוטות של מולקולות היצמדות ואקטין פילמנטרי בתאי אנדותל (איור 5) ותומכת באנליזות רב-רכיביות הקשות לביצוע in vivo, כולל הערכה של קיטוב ואנדותליאלי וחלוקה תחת זרימה פיזיולוגית (איור 5D–F). שילוב של בדיקות אלו בפלטפורמה אחת מאפשר בחינה ישירה של הקשרים בין גיאומטריית כלי הדם, זרימה משתנה, תפקוד מחסום, ארגון מולקולרי אנדותליאלי והיצמדות בין-תאית.

figure-results-1
איור 1: זרימת העבודה להדפסה ושימוש בכלי דם תלת-ממדיים על שבב. תרשים זרימה של הפרוטוקולים ליצירה ושימוש בכלי דם תלת-ממדיים על שבב. עיגולים שחורים מציינים את מספרי הפרוטוקול המתאימים. צבעי התיבות מציינים את הטמפרטורה שבה מבוצע כל פרוטוקול או את הטמפרטורה שבה הדגימה מוחדרת. זרימת העבודה כוללת מידול צורת כלי הדם, הכנת דיו, הכנת מטריצה חוץ-תאית (ECM), הכנת תא, הדפסת כלי דם, שטיפה וציפוי של כלי הדם, תאיזציה (cellularization), תרבית זרימה, בדיקות תפקודיות וניתוח היסטולוגי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

figure-results-2
איור 2הדפסת כלי דם ותכנון תא. ניתן לתכנן כלי דם מ- in vivo דימויים כליים לשחזור גיאומטריות כליות ספציפיות למטופל. (A) כלי דם כלילי קטן שצולם באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת (CT) עם חומר ניגוד, שוחזר באישור של Parekh et al.86 סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. (Bמפת קואורדינטות של נקודות ייחוס מחלק של כלי הדם המוצג בלוח A, שהופקה באמצעות רישום נקודות ב-FIJI.C) פלט G-code שהופק ממפת הקואורדינטות באמצעות תוכנת בקרה למדפסת. קואורדינטות X, Y ו-Z מצוינות בפינה הימנית התחתונה. (ד') סכמה של תא Rose המכיל כלי דם מודפס בביו-הדפסה. העיצוב עם ברגי האצבע העליונים תואם לתא המודפס בתלת-ממד מפולילקטית חומצה (PLA). (ה_) תא Rose המכיל כלי קיבול ומאגרים שהודפסו באמצעות דיו ביולוגי זמני (sacrificial bioink) על לבישי זכוכית (coverslip) מצופה ECM. סרגל קנה מידה = 9 מ"מ. (F(סכימה של תא Rose המותאם למודל של מפרצת. חוט המשולב דרך מחטי הכניסה והיציאה משמש כתבנית לכלי הדם, ודיו ביולוגי להקרבה המונח על החוט משמש כתבנית למפרצת. (ג'(תא רוז (Rose chamber) המכיל את התיל ואת תבנית הביו-דיו (bioink) ההקרבית על זכוכית כיסוי מצופה ב-ECM. (ה׳מתאם לבמה של מיקרוסקופ מדפוס בתלת-ממד מחומר PLA (שמאל) ותא Rose (ימין), המספקים חלופות לרכיבי אלומיניום מעובדים. סביבות מתכת על המתאם לבמה מקובעות ללוח המתאם. סרגל קנה מידה = 30 מ"מ.I) כלי מודפס שנשטף, בתוך תא Rose מאלומיניום המותקן על במה של מיקרוסקופ, עם מחטי כניסה ויציאה וצינוריות מחוברות. סרגל קנה מידה = 20 מ"מ. קיצורים: CT = טומוגרפיה ממוחשבת; ECM = מטריצה חוץ-תאית; PLA = חומצה פולילקטית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מערכת זרימת נוזלים עבור כלי דמי תאי (cellularized vessel) בתא Rose. (A) סכימה של תצורת הצנרת המשמשת להקמת זרימת נוזלים דרך תא Rose המכיל כלי דמי תאי. החיצים מצביעים על כיוון הזרימה. הרכיבים המסומנים במספרים הם (1) משאבה פריסטלטית, (2) ברזים שלוש-דרכי (three-way stopcock) עם מזרק להחלאה (priming), (3) מלכוד בועות, (4) משכך דופקים, (5) התקן הכלי, ו-(6) מאגר מצע. כל הרכיבים הבאים במגע עם מצע התרבית עוברים סטריליזציה לפני השימוש. (B) מערכת זרימת נוזלים המכילה כלי דמי תאי בתא Rose בתוך אינקובטור לתרביית רקמות. המספרים תואמים לרכיבים המוצגים בפאנל A. מחטי הכניסה והיציאה מקובעות בסרט דביק ליציבות. סרגל קנה מידה = 40 mm. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: אפיון ריאולוגי של הביו-דיו ההקרבתי. (A) צמיגות גזירה של דיו Pluronic F127 25%/polyethylene oxide (PEO) 1% לא פסטוריזציה כפונקציה של קצב הגזירה בטמפרטורות של 5 °C, 10 °C, 14.4 °C, 15 °C ו-23 °C. (B) צמיגות מורכבת כפונקציה של תדר זוויתי עבור דיו Pluronic F127/PEO פסטוריזציה ולא פסטוריזציה ב-25 °C ו-37 °C. קיצור: PEO = polyethylene oxide. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5דימות ואנליזה כמותית של כלי דם מקובעים וצבועים שעברו אנדותליזציה. (A) הקרנה של עוצמה מקסימלית (Maximum-intensity projection) של תמונות פלואורסצנציה במיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסקים מסתובבים (spinning-disk) של כלי דם שעבר סלולריזציה מלאה לאחר זריעה ראשונית ותרבית תחת מאמץ גזירה נמוך (1 dyn/cm2)2. הכלי נצבע עבור VE-cadherin (ירוק), F-actin (אדום), ו-DNA באמצעות DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 50 µm. (Bחתך רוחבי משוחזר במישור xz של z-stack של תמונות פלואורסצנציה במיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסקים מסתובבים (spinning-disk), של כלי דם שעבר תהליך של cellularization מלא וצבעו בפלואידין פלואורסצנטי לסימון F-actin (באדום). סרגל קנה מידה = 50 µm. (Cהטלה של עוצמה מקסימלית (Maximum-intensity projection) של z-stack של תמונות פלואורסצנציה במיקרוסקופ קונפוקאלי עם דיסקה מסתובבת (spinning-disk) של כלי דם תאי מלא לאחר 24 שעות של זרימה ב-12 dyn/cm²2. F-actin סומן באמצעות פאלואידין פלואורסצנטי (אדום). סרגל קנה מידה = 100 µm. (ד'תמונת פלואורסצנציה קונפוקלית בשיטת דיסק מסתובב (Spinning-disk) של אזור כלי דם לאחר 24 שעות של תרבית תחת מאמץ גזירה של 16 dyn/cm2הכלי נצבע עבור VE-cadherin (צהוב), F-actin (מגנטה), סמן הגולג'י GM130 (ירוק), ו-DNA באמצעות DAPI (כחול). החץ מציין את כיוון הזרימה. סרגל קנה מידה = 30 µm. (ה_) כימות מייצג של הת方向 הממוצע של סיבי מאמץ (stress-fibers) מערוץ ה-F-actin בפאנל D באמצעות FibrilTool74. רשת של 45 אזורים, שכל אחד מהם בעל שטח של 1,600 µm2, נותח, והכיון הממוצע של הסיבים מוצג כהיסטוגרמה רדיאלית ביחס לכיוון הזרימה. (F) כימות מייצג של ציר הגרעין-גולג'י מלוח D כמדד לקטביות של תאי אנדותל. וקטורים ממרכזו של כל גרעין למרכזו של מכשיר גולג'י התואם מוצגים כהיסטוגרמה רדיאלית ביחס לכיוון הזרימה; n = 75 וקטורים. קיצור: DAPI = 4′6-דיאמידינו-2-פנילינדול, DAPI אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

figure-results-6
איור 6: ניתוח זרימת נוזלים ודליפה וסקולרית. (A) תרשים של גאומטריית כלי הדם ששימשה לניתוחים בפאנלים B–K. אותיות מציינות את אזורי כלי הדם המקורבים המתאימים לפאנלים הרלוונטיים. (B) השלכה זמנית מקודדת בצבע של רצף תמונות פלואורסצנציה במיקרוסקופ קונפוקאלי עם דיסק מסתובב (spinning-disk) בשיטת time-lapse, המראה חרוצים פלואורסצנטיים נעים תחת זרימה דרך אזור כלי דם מעוקל. הצבע מציין את מספר הפריים מ-1 עד 100; הקימורים החיצוניים והפנימיים מסומנים. (C) ניתוח ולוסימטריית תמונת חלקיקים (PIV) המראה מהירות זרימה יחסית לאורך אזור כלי הדם המעוקל. צבעים מייצגים מהירות יחסית, וחצים מציינים את כיוון הזרימה ועוצמתה. סרגל קנה מידה = 50 µm. (D–G) בדיקת מחסום וסקולרי מייצגת של כלי דם לא מטופל שבו הוזרק דקסטראן 10 kDa המסומן ב-Alexa 647. (D,D′,D″) תמונות של אזור כלי דם ישר שצולמו ב-0, 70 ו-150 דקות, בהתאמה. הקו הלבן מציין את האזור ששימש לקיימוגרף בפאנל E. (E) קיימוגרף של האזור הישר בפאנל D המראה קצב דליפה של 0.39 µm/min, שהוא השיפוע של הקו המקווקו. (F,F′,F″) תמונות של אזור כלי דם מעוקל שצולמו ב-0, 70 ו-150 דקות. הקו הלבן מציין את האזור ששימש לקיימוגרף בפאנל G. סרגל קנה מידה = 150 µm. (G) קיימוגרף של האזור המעוקל בפאנל F המראה קצב דליפה של 1.01 µm/min, שהוא השיפוע של הקו המקווקו. (H–K) בדיקת מחסום וסקולרי מייצגת לאחר דגירה מוקדמת עם 250 ng/mL של tumor necrosis factor alpha (TNFα). (H,H′,H″) תמונות של אזור כלי דם ישר שצולמו ב-0, 200 ו-400 דקות, בהתאמה. הקו הלבן מציין את האזור ששימש לקיימוגרף בפאנל I. סרגל קנה מידה = 250 µm. (I) ניתוח קיימוגרף של אזור כלי הדם הישר בפאנל H מראה קצב דליפה של 2.1 µm/min, שהוא השיפוע של הקו המקווקו. (J,J′,J″) תמונות של אזור כלי דם מעוקל שצולמו ב-0, 200 ו-400 דקות. הקו הלבן מציין את האזור ששימש לקיימוגרף בפאנל K. סרגל קנה מידה = 250 µm. (K) ניתוח קיימוגרף של אזור כלי הדם המעוקל בפאנל J מראה קצב דליפה של 6.7 µm/min, שהוא השיפוע של הקו המקווקו. כוכביות בפאנלים D–K מסמנות את הקצוות המתאימים של הקווים ששימשו ליצירת הקיימוגרפים. קיצורים: PIV = particle image velocimetry; TNFα = tumor necrosis factor alpha. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: הדפסת כלי דם באמצעות תכנות מדפסת מבוסס STL. (A) תמונת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (Differential interference contrast) של כלי דם מודפס שנוצר באמצעות תכנות מדפסת מבוסס STL, המכוון את ראש המדפסת לבצע שתי מעברים, ובכך יוצר מבנה כלי דם קלוע. סרגל קנה מידה = 250 µm. (B) הדמיה תלת-ממדית של כלי הדם הקלוע לאחר שטיפה, המלאה ב-bovine serum albumin (BSA) המסומן ב-Alexa 647. ניתן לראות מרווח בין הלומנים של שני הגדילים הקלועים. סרגל קנה מידה = 100 µm. קיצורים: BSA = bovine serum albumin; STL = standard tessellation language. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 1: G-code להדפסת כלי המכיל. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: שרטוט CAD של תא ה-Rose. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים 3: שרטוט CAD של מתאם הרכבת הבמה. נא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

מתוארת מערכת חסונה למידול גיאומטריות של כלי דם הקשורות לזרימה מופרעת, כולל כלי דם מפותלים, מפרכיות (aneurysms) ונקודות פיצול. השיטה תומכת בדימות ברזולוציה גבוהה, במיפוי זרימה ובהערכת תפקוד מחסום כלי הדם בתוך פלטפורמה הנגישה לביולוגים של תאים עם ניסיון מוגבל בביו-הנדסה. אף על פי שהגישה העיקרית דורשת מדפסת ביו, מדפסות מבוססות דחיסה (extrusion) הזמינות מסחרית נעות בין מערכות בקוד פתוח לפלטפורמות מתקדמות יותר בעלות ראשי הדפסה מרובים. יכולות מפתח של המדפסת כוללות בקרה על טמפרטורת ראש ההדפסה והדיו, ויסות לחץ מדויק וטמפרטורת מיטת ההדפסה. בנוסף לכלי דם מפותלים ומסועפים שהודפסו בביו, השיטה כוללת גם מודל של מפרכית שניתן לייצר ללא מדפסת ביו. יחד, גישות אלו מקלות על חקירת תפקוד תאי אנדותל בכלי דם מפותלים באמצעות שיטות מיקרוסקופיה הזמינות בדרך כלל במעבדות לביולוגיה של תאים.

מערכות מודל in vitro רבות זמינות לחקר תפקוד כלי דם87,88, שלכל אחת מהן נקודות חוזק ומגבלות מובחנות. המערכת המתוארת כאן, המותאמת מעבודות קודמות54,67,69, מתאימה במיוחד לבחינת ההשפעות של עקמומיות כלי הדם (vascular tortuosity) על התפקוד האנדותליילי, מכיוון שהיא מאפשרת מידול ישיר של גאומטריה של כלי דם המופקת מחולים ושינוי שיטתי של עקמומיות כלי הדם בתוך התקן בודד. גישות אחרות מידלו כלי דם כליליים של חולים באמצעות ג'לטין מתאקרילט פוטו-פולימריזבילי כדי ליצור מבני כלי דם מוקטנים תחת זרימה פיזיולוגית60. מערכות כאלה מציעות מידול מדויק של כלי דם, ניתוח זרימה ואפשרות לשילוב שכבות של tunica media. עם זאת, גודלן הכללי והצורך בתמיכת זכוכית עלולים להגביל דימות ברזולוציה גבוהה ובדיקות דליפה מקומיות. לעומת זאת, מערכות קטנות יותר המבוססות על הרכבה עצמית של תאי אנדותל המופקים מ-iPSC מאפשרות דימות ברזולוציה גבוהה ויכולות לשלב הן תאי אנדותל והן תאי שריר חלק של כלי דם89. מודלים אלה, לעומת זאת, מספקים פחות שליטה על גאומטריית כלי הדם, ויצירת קצבי זרימה ומסחף (shear rates) גבוהים עלולה להיות מאתגרת. לפיכך, המערכת הנוכחית מייצגת גישה בינונית מעשית המשלבת גאומטריית כלי דם מוגדרת עם דימות ברזולוציה גבוהה של עקמומיות כלי הדם.

יתרון מרכזי של פלטפורמה זו הוא היכולת לייצר כלי דם המכילים אזורים מעוקלים וישרים כאחד, מה שמאפשר השוואה ישירה של גאומטריית כלי דם מקומית בתוך אותה דגימה בעוד שמשתנים ניסיוניים אחרים נותרים קבועים, כפי שמוצג ב-איור 6. יתרון נוסף הוא היכולת להשתמש בדימויים של כלי דם מהחולה, שהתקבלו באמצעות אנגיוגרפיה או CT עם חומר ניגוד. המגבלה העיקרית בשחזור של כלי דם של מטופלים היא הגודל. קשה להדפיס באופן הדיר כלי דם שקוטרם קטן מ-150µm, בעוד שקטעי כלי דם המשתרעים מעבר למספר סנטימטרים דורשים תאי הרכבה גדולים יותר. כמו כן, קטעי כלי דם צריכים להישאר שטוחים יחסית במימד השלישי כדי שניתן יהיה להדפיסם על שכבת מטריצת הבסיס ולשמרם בתוך מרחק העבודה של עדשת העדשה במהלך דימוי מיקרוסקופי.

בעבודות עתידיות, ניתן יהיה לשנות את המערכת המתוארת כאן כדי לדגמן מחלות כגון atherosclerosis, שבהן גיאומטריית כלי הדם עשויה לתרום לפתופיזיולוגיה. ניתן יהיה לשלב תאים אנדותליאליים שעברו שינוי גנטי או סוגי תאים נוספים, כולל תאי שריר חלק ותאי מערכת החיסון, כדי להגביר את המורכבות הפיזיולוגית. שילוב של תאי שריר חלק מתחת לשכבה האנדותליאלית, כפי שהודגם במערכות פשוטות יותר, עשוי לספק תובנה נוספת לגבי אינטראקציות בין שריר חלק לאנדותליום בעקמומיות של כלי דם ובמחלות90. שינויים נוספים עשויים לכלול תאי גידול כדי לחקור intravasation68,91, ואת השפעת העקמומיות על תהליך זה. ניתן להשתמש בפלטפורמה גם כדי לבחון כיצד זרימה מופרעת משנה תגובות דלקתיות92,93 ועשוי להשפיע על סיבוכים וסקולריים הקשורים לזיהומים כגון COVID-1994. בהתחשב במעורבות הרחבה של מערכת כלי הדם בבריאות ובמחלות אנושיות, מערכות נגישות כזו עשויות להקל על חקירה נוספת של התפקוד האנדותליאלי בהקשרים של מחלות מגוונות.

גילויים

התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health). המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים.

תודות

המחברים מעוניינים להודות לחברי המעבדה של Jennifer Lewis באוניברסיטת הרווארד על עצתם בשלבי החקירה המוקדמים של עבודה זו, ולחברי המעבדה של Waterman על המשוב והעצות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS), 97%Sigma-Aldrich281778משמש לסילניזציה ולהפעלה של לוחות כיסוי מזכוכית לפני הצמדת ECM.
מזרק סטרילי 1mLFisher Scientific14-823-434משמש להגשת ריאגנטים, ציפוי כלי והעברת נוזלים.
1xPhosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificJ61196.APמשמש להכנת ריאגנטים, שטיפה ושטיפת כלים.
מזרק סטרילי 10mLFisher Scientific14-955-459משמש להכנת ריאגנטים והעברת נוזלים.
מבחנות קוניות 15mL עם פקקFisher Scientific05-538-59Aמשמשות להכנת ריאגנטים, טיפול בתאים ואחסון תמיסות.
צלחת פטרי מפוליסטירן 150mmFisher ScientificFB0875714משמשת כמיכל עבודה או אינקובציה סטרילי.
מחט 21GFisher Scientific14-817-227משמשת להכנת תבנית כלי וגישה לתא.
מחט 23GFisher Scientific14-817-237משמשת לחיבורי כניסה ויציאה של הכלי במהלך שטיפה ופרפוזיה.
מחט חלוקה שקופה ומסועפת 27GNordson7018417משמשת להחצנת דיו מקריב וויזואליזציה של בועות אוויר במהלך ההדפסה.
מזרק סטרילי 3mLFisher Scientific14-955-459משמש להעברת נוזלים והגשת ריאגנטים. יש לאמת את מספר הקטלוג כיוון שהמספר שסופק מופיע גם עבור המזרק של 10 mL.
חוט מנדריל רפואי מפלדת אל-חלד 304, בקוטר 0.0190 inComponent SupplyGWX-0190-36משמש כתבנית נשלפת עבור הלומן הישר במודל המפרצת מבוסס החוט.
מבחנות קוניות 50mL עם פקקFisher Scientific05-526Bמשמשות להכנה, ערבוב, פסטוריזציה ואחסון של ריאגנטים.
Alexa 488 anti-mouse secondary antibodyThermo Fisher ScientificA32723TRנוגדן משני פלואורסצנטי המשמש לצביעה אימונוהיסטוכימית.
Alexa 555 anti-rabbit secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21428נוגדן משני פלואורסצנטי המשמש לצביעה אימונוהיסטוכימית.
Alexa 647-labeled bovine serum albuminThermo Fisher ScientificA34785סמן מקרו-מולקולרי פלואורסצנטי המשמש לבדיקות מחסום/דליפה וסקולאריתים.
Alexa 647-labeled dextran, 10 kDaThermo Fisher ScientificD22914סמן פלואורסצנטי המשמש להערכת תפקוד מחסום אנדותליאלי ודליפה וסקולאריתית.
Alexa 647-phalloidinThermo Fisher ScientificA22287משמש לסימון פלואורסצנטי של F-actin לצורך דימות של השלד התאי וניתוח אוריינטציה.
Albumin, bovine serum, Fraction V, fatty acid-freeSigma-Aldrich126575-10GMמשמש לחסימה והכנת תמיסות המכילות חלבון.
Antibiotic-Antimycotic, 100xThermo Fisher Scientific15240062תוסף אנטי-מיקרוביאלי אופציונלי עבור ECM ומצע גידול.
Anti-GM130 antibody, clone 4A3Sigma-AldrichMABT1363נוגדן ראשוני המשמש לסימון מנגנון גולג'י לצורך ניתוח קוטביות אנדותליאלית.
Anti-VE-cadherin rabbit monoclonal antibody, D87F2Abcam65707נוגדן ראשוני המשמש לוויזואליזציה של צומת תא-תא אנדותליאלי.
Calcium chlorideSigma-AldrichC7902משמש בהכנת ECM ובבופרי קיבוע. יש לוודא אם הריאגנט המיועד הוא סידן כלורי ללא מים (anhydrous) או הידרטי.
ערכת מחבריםWorld Precision Instruments504954מחברי Luer-to-tubing המשמשים להרכבת מעגל הפרפוזיה מיקרו-פלואידי.
מעמד לצביעת לוחות כיסויElectron Microscopy Sciences72240משמש להחזקת לוחות כיסוי במהלך ניקוי, סילניזציה, הפעלה ושטיפה.
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-100Gמרכיב של בופר הפרמבליזציה המשמש במהלך צביעה אימונוהיסטוכימית.
DAPIThermo Fisher Scientific62248צבע גרעיני פלואורסצנטי המשמש לדימות תאים וניתוח קוטביות.
פלטת חימום דיגיטליתFisher Scientific11-475-028משמשת לשמירת תא הכלי והריאגנטים בטמפרטורה של כ-37 °C במהלך ההרכבה.
EGTA tetrasodium saltSigma-AldrichE8145-10Gחומר קילטי המשמש בבופר הפרמבליזציה.
מחבר Luer נקבי עם שיניים עבור צינורית ב-ID של 1/16 inScientific Commodities Inc.BB330Aמשמש לחיבור צינוריות בתוך המעגל המיקרו-פלואידי.
Female Luer with 1/16 in ID barb, CrystalVu QCFisher Scientific01-000-123משמש לחיבורי צינוריות ותא-כלי.
FibrinogenSigma-AldrichF8630מרכיב ECM המשמש עם ג'לטין ותרומבין ליצירת ההידרוג'ל התומך בכלי. יש לוודא מקור: כתב היד מתאר פיברינוגן מפלזמה אנושית, בעוד שהטבלה שסופקה מציינת פלזמה בקרים.
משכך דופק נוזליDarwin MicrofluidicsSE-D1606-3NB-PC-31משמש להפחתת תנודות פולסטיליות הנוצרות על ידי משאבה פריסטלטית.
רצועת גומי סיליקון עמידה לטמפרטורות גבוהות לתעשיית המזוןMcMaster-Carr8417K51משמשת לייצור האטם עבור תא Rose.
Gelatin from porcine skin, gel strength 300, Type ASigma-AldrichG2500מרכיב ECM עיקרי המשמש ליצירת ההידרוג'ל המקיף את לומן הכלי.
לוח כיסוי מזכוכית, מס' 1.5VWREN-MAS-25X25-1-5-CSמצע למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה ומשטח תא.
Glutaraldehyde, 25%Electron Microscopy Sciences16220מהול לצורך הפעלת לוח הכיסוי לפני הצמדת ECM.
Growth Kit-BBEATCCPCS-100-040ערכת תוספים המשמשת עם מצע בסיסי לתאים וסקולאריים לתרבית תאים אנדותליאליים.
Growth Kit-VEGFATCCPCS-100-041תוסף לצמיחה אנדותליאלית המשמש עם מצע בסיסי לתאים וסקולאריים בעת הצורך.
Human plasma fibronectinSigma-AldrichFC010ציפוי ECM לומנלי אופציונלי המשמש לקידום הצמדה אנדותליאלית.
סגור צינוריות בקו (Inline)Sigma-AldrichZ503371-1PAKמשמש להפסקה וויסות של זרימה דרך צינוריות במהלך מניפולציה של התא ואינקובציה.
משאבה פריסטלטית Ismatec Reglo DigitalMasterflex78018-12משמשת ליצירת זרימה מבוקרת של נוזלים דרך כלים תאיים.
LamininSigma-AldrichL2020-1MGציפוי ECM לומנלי אופציונלי לשינוי של אדהזיה וקיטוב אנדותליאליים.
ערכה מגוונת של מחברי Luer-to-tubingWorld Precision Instruments504954משמשת לחיבור צינוריות, מזרקים ורכיבי כניסה/יציאה של התא. כפיל של מספר קטלוג של connector-kit; השאר רשומה אחת אם הן זהות.
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2393-100Gמרכיב של בופרי קיבוע והפרמבליזציה.
מחבר Luer זכרי עם שיניים עבור צינורית ב-ID של 1/16 inScientific Commodities Inc.BB329Aמשמש לחיבורי צינוריות מיקרו-פלואידיים.
מחבר Luer זכרי, 1/16 in IDWorld Precision Instruments13160-100משמש לחיבור צינוריות למזרקים ומרכיבי תא.
MatrigelSigma-AldrichCLS356234-1EAציפוי ECM לומנלי אופציונלי המשמש להצמדה אנדותליאלית.
פקקים לבקבוקי מדיהFisher Scientific05-719-310פקקים בעלי שני פתחים המשמשים לבניית מאגרי מצע גידול סטריליים עבור מעגל הזרימה.
Nalgene Pharma-Grade silicone tubing, 1/16 in IDThermo Fisher Scientific8600-0020צינוריות גמישות המשמשות במעגלי הפרפוזיה והשטיפה המיקרו-פלואידיים.
ParafilmElectron Microscopy Sciences70990-125משמש כמשטח לא-דביק במהלך פולימריזציה של ציפויי ECM על לוחות כיסוי.
PBS, 10x, pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044בופר מרוכז המשמש להכנת תמיסות PBS לעבודה.
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122תוסף אנטיביוטי המשמש במצע גידול אנדותליאלי ובתמיסות שטיפה.
PIPESSigma-AldrichP1851-25Gמרכיב בופר של תמיסת הפרמבליזציה.
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443מרכיב תגובתי לטמפרטורה של דיו ההדפסה המקריב.
ברז הפסקה תלת-כיווני מפוליקרבונט עם Luer זכריFisher ScientificNC9593742משמש להכנה (priming), החלפה ובקרת נתיבי נוזלים במעגל הפרפוזיה.
Polyethylene oxide (PEO)Sigma-Aldrich372781מרכיב פולימרי של פורמולציית הדיו המקריב.
מערבל סיבוביFisher Scientific88861050משמש לערבוב דיו מקריב PEO/Pluronic ב-4 °C.
צלחת צביעה ליחידות סליידMSE SuppliesDWK90020משמשת לשטיפה, צביעה או אינקובציה של ריאגנטים ללוחות כיסוי.
זכוכית כיסוי מרובעת, מס' 2, 25mm x 25mmSigma-AldrichCLS285525-1000EAלוח כיסוי לתא; זכוכית עבה יותר מס' 2 מספקת עמידות מוגברת לשבירה ותואמת לעדשות אוויר או מים מתאימות.
מחט חלוקה קהה מפלדת אל-חלד, 21 G, 1 inComponent SupplyNE-212PLמשמשת להגשת נוזלים או לבניית מודל כלי מבוסס תבנית חוט.
יחידות מסנן ואקום SteriflipMilliporeSigmaSE1M179M6משמשות לסינון סטרילי של ג'לטין חם ותמיסות תואמות אחרות.
מזרקים פלסטיים סטריליים 5mLAlleviPSYR5-Sמשמשים לטעינת דיו מקריב להדפסת החצנה פנאומטית.
Thrombin, human plasma, high activitySigma-Aldrich605195משמש להפעלת פולימריזציית פיברין במהלך יצירת ג'ל ECM.
TransglutaminaseMoo Gloo1201אנזים לקשירה המשמש במהלך הכנה ושינוי של ECM מסוג ג'לטין/פיברין.
Triton X-100Sigma-Aldrich648466דטרגנט המשמש להפרמבליזציה של תאים אנדותליאליים לפני צביעה אימונוהיסטוכימית.
TrypLE Express Enzyme, 1x, phenol redThermo Fisher Scientific12605010ריאגנט לפירוק תאים המשמש לקצירת תאים אנדותליאליים לפני זריעתם בכלי.
Tween 20Sigma-Aldrich11332465001מרכיב דטרגנט של בופר החסימה לצביעה אימונוהיסטוכימית.
Vascular Cell Basal MediumATCCPCS-100-030מצע בסיסי המשמש לתרבית תאים אנדותליאליים וניסויי פרפוזיה.

מקורות

  1. Franken R, et al. Increased aortic tortuosity indicates a more severe aortic phenotype in adults with Marfan syndrome. Int J Cardiol. 2015;194:7-12.
  2. Morris SA, et al. Vertebral artery tortuosity in Turner syndrome: is tortuosity a component of the aortopathy phenotype J Cardiovasc Magn Reson. 2014;16(Suppl 1):P115.
  3. Morris SA. Arterial tortuosity in genetic arteriopathies. Curr Opin Cardiol. 2015;30(6):587-593.
  4. Ciurică S, et al. Arterial tortuosity. Hypertension. 2019;73(5):951-960.
  5. Penta R, Ambrosi D. The role of the microvascular tortuosity in tumor transport phenomena. J Theor Biol. 2015;364:80-97.
  6. Bullitt E, et al. Abnormal vessel tortuosity as a marker of treatment response of malignant gliomas: preliminary report. Technol Cancer Res Treat. 2004;3(6):577-584.
  7. Fattahi M, et al. Influence of parent vessel feature on the risk of internal carotid artery aneurysm rupture via computational method. Sci Rep. 2023;13(1):1-12.
  8. Kawsara A, et al. Management of coronary artery aneurysms. JACC Cardiovasc Interv. 2018;11(13):1211-1223.
  9. Sokhal BS, Ma Y, Rajagopalan S. Femoral artery aneurysms. Br J Hosp Med. 2022;83(12).
  10. Golledge J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nat Rev Cardiol. 2019;16(4):225-242.
  11. Toader C, et al. Cerebral aneurysm: filling the gap between pathophysiology and nanocarriers. Int J Mol Sci. 2024;25(22):11874.
  12. Wei F, et al. Arterial tortuosity: an imaging biomarker of childhood stroke pathogenesis Stroke. 2016;47(5):1265-1270.
  13. Moceri P, et al. Arterial tortuosity syndrome: early diagnosis and association with venous tortuosity. J Am Coll Cardiol. 2013;61(7):783.
  14. Zhang X, et al. The relationship between retinal vascular tortuosity and retinal vasculitis. J Ophthalmic Inflamm Infect. 2025;15:65.
  15. Cuhlmann S, et al. Disturbed blood flow induces RelA expression via c-Jun N-terminal kinase 1: a novel mode of NF-κB regulation that promotes arterial inflammation. Circ Res. 2011;108(8):950-959.
  16. Sunderland K, Jiang J, Zhao F. Disturbed flow's impact on cellular changes indicative of vascular aneurysm initiation, expansion, and rupture: a pathological and methodological review. J Cell Physiol. 2022;237(1):278-300.
  17. Luu V, et al. Role of endothelial primary cilia as fluid mechanosensors on vascular health. Atherosclerosis. 2018;275.
  18. Vion AC, et al. Endothelial cell orientation and polarity are controlled by shear stress and VEGF through distinct signaling pathways. Front Physiol. 2021;11:623769.
  19. Petzold T, et al. Focal adhesion kinase modulates activation of NF-kappaB by flow in endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;297(4):C814-C822.
  20. Thodeti CK, et al. TRPV4 channels mediate cyclic strain-induced endothelial cell reorientation through integrin-to-integrin signaling. Circ Res. 2009;104(9):1123-1130.
  21. Beech DJ. PIEZO force sensing in vascular biology: an explosion of new knowledge, concepts and opportunity. Adv Sci (Weinh). 2025;12(41):e11774.
  22. Tamargo IA, et al. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023;20(11):738-753.
  23. Chiu JJ, Chien S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol Rev. 2011;91(1):327-387.
  24. Nakajima H, Mochizuki N. Flow pattern-dependent endothelial cell responses through transcriptional regulation. Cell Cycle. 2017;16(20):1893-1901.
  25. Zhao Y, et al. Small rodent models of atherosclerosis. Biomed Pharmacother. 2020;129:110426.
  26. Curry-Koski T, Curtin LP, Esfandiarei M, Thomas TC. Cerebral microvascular density, blood-brain barrier permeability, and support for neuroinflammation indicate early aging in a Marfan syndrome mouse model. Front Physiol. 2024;15:1457034.
  27. Thompson JW, et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurg Focus. 2019;47(1).
  28. Golledge J, Krishna SM, Wang Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. Br J Pharmacol. 2022;179(5):792-810.
  29. Noval Rivas M, Arditi M. Kawasaki disease: pathophysiology and insights from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 2020;16(7):391-405.
  30. He L, et al. Endothelial shear stress signal transduction and atherogenesis: from mechanisms to therapeutics. Pharmacol Ther. 2022;235:108152.
  31. Wang X, et al. Endothelial mechanobiology in atherosclerosis. Cardiovasc Res. 2023;119(8):1656-1675.
  32. Humphrey JD, Schwartz MA. Vascular mechanobiology: homeostasis, adaptation, and disease. Annu Rev Biomed Eng. 2021;23:1-27.
  33. Wang C, Lu H, Schwartz MA. A novel in vitro flow system for changing flow direction on endothelial cells. J Biomech. 2012;45(7):1212-1218.
  34. Sedlak J, Clyne A. Application of shear stress to endothelial cells using a parallel plate flow chamber. Methods Mol Biol. 2023;2600:81-90.
  35. Zhu J, et al. Advances in tissue engineering of vasculature through three-dimensional bioprinting. Dev Dyn. 2021;250(12):1717-1738.
  36. Kinstlinger IS, Miller JS. 3D-printed fluidic networks as vasculature for engineered tissue. Lab Chip. 2016;16(11):2025-2043.
  37. Werschler N, Quintard C, Nguyen S, Penninger J. Engineering next generation vascularized organoids. Atherosclerosis. 2024;398:118529.
  38. Shakeri A, et al. Engineering organ-on-a-chip systems for vascular diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023;43(12):2241-2255.
  39. Xie X, et al. Customizable microfluidic origami liver-on-a-chip (oLOC). Adv Mater Technol. 2022;7(5):2100677.
  40. Kawakita S, et al. Organ-on-a-chip models of the blood-brain barrier: recent advances and future prospects. Small. 2022;18(39):e2201401.
  41. Bai H, Ingber DE. What can an organ-on-a-chip teach us about human lung pathophysiology Physiology. 2022;37(5).
  42. Seghir R, Arscott S. Extended PDMS stiffness range for flexible systems. Sens Actuators A Phys. 2015;230:33-39.
  43. Hasler J, et al. Development and characterization of a tunable PDMS substrate model for investigating elastic properties and mechanical stretching in intervertebral disc cells. JOR Spine. 2025;8(4):e70140.
  44. Uroz M, et al. Differential stiffness between brain vasculature and parenchyma promotes metastatic infiltration through vessel co-option. Nat Cell Biol. 2024;26(12):2144-2153.
  45. Wood JA, Liliensiek SJ, Russell P, Nealey PF, Murphy CJ. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 2010;3(3):1620-1639.
  46. Peloquin J, Huynh J, Williams RM, Reinhart-King CA. Indentation measurements of the subendothelial matrix in bovine carotid arteries. J Biomech. 2011;44(5):815-821.
  47. McQueen A, Warboys CM. Mechanosignalling pathways that regulate endothelial barrier function. Curr Opin Cell Biol. 2023;84:102213.
  48. Hahn C, Orr AW, Sanders JM, Jhaveri KA, Schwartz MA. The subendothelial extracellular matrix modulates JNK activation by flow. Circ Res. 2009;104(8):995-1003.
  49. Xu Z, et al. Matrix stiffness, endothelial dysfunction and atherosclerosis. Mol Biol Rep. 2023;50(8):7027-7041.
  50. Lemarié CA, Tharaux PL, Lehoux S. Extracellular matrix alterations in hypertensive vascular remodeling. J Mol Cell Cardiol. 2010;48(3):433-439.
  51. Huveneers S, Daemen MJAP, Hordijk PL. Between Rho(k) and a hard place: the relation between vessel wall stiffness, endothelial contractility, and cardiovascular disease. Circ Res. 2015;116(5):895-908.
  52. Stankey PP, et al. Embedding biomimetic vascular networks via coaxial sacrificial writing into functional tissue. Adv Mater. 2024;36(36):e2401528.
  53. Sundaram S, et al. Sacrificial capillary pumps to engineer multiscalar biological forms. Nature. 2024;636(8042):361-367.
  54. Kroll KT, et al. A perfusable, vascularized kidney organoid-on-chip model. Biofabrication. 2024;16(4).
  55. Strobel HA, Moss SM, Hoying JB. Vascularized tissue organoids. Bioengineering. 2023;10(2):124.
  56. Servais B, et al. Engineering brain-on-a-chip platforms. Nat Rev Bioeng. 2024;2(8):691-709.
  57. Osaki T, Sivathanu V, Kamm RD. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 2018;8(1):5168.
  58. Maharjan S, Cecen B, Zhang YS. 3D immunocompetent organ-on-a-chip models. Small Methods. 2020;4(9):2000235.
  59. Fang JS, et al. A microphysiological system HHT-on-a-chip platform recapitulates patient vascular lesions. Nat Commun. 2026.
  60. Catano JA, et al. A patient-specific 3D printed carotid artery model integrating vascular structure, flow, and endothelium responses. Adv Healthc Mater. 2026;15(4):e02478.
  61. Li Z, Hui J, Yang P, Mao H. Microfluidic organ-on-a-chip system for disease modeling and drug development. Biosensors. 2022;12(6):370.
  62. Leung CM, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2(1):33.
  63. Campisi M, et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  64. Miller JS, et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nat Mater. 2012;11(9):768-774.
  65. Kong Z, Wang X. Bioprinting technologies and bioinks for vascular model establishment. Int J Mol Sci. 2023;24(1):891.
  66. Kolesky DB, et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 2014;26(19):3124-3130.
  67. Lin NYC, et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(12):5399-5404.
  68. Park W, et al. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 2023;14(1):7696.
  69. Kolesky DB, Homan KA, Skylar-Scott MA, Lewis JA. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(12):3179-3184.
  70. Xiao Y, Liu Q, Han HC. Buckling reduces eNOS production and stimulates extracellular matrix remodeling in arteries in organ culture. Ann Biomed Eng. 2016;44(9):2840-2850.
  71. Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Benton G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 2009;12(3):267-274.
  72. Qiu Y, et al. Microvasculature-on-a-chip for the long-term study of endothelial barrier dysfunction and microvascular obstruction in disease. Nat Biomed Eng. 2018;2(6):453-463.
  73. Rose GG, Pomerat CM, Shindler TO, Trunnell JB. A cellophane-strip technique for culturing tissue in multipurpose culture chambers. J Biophys Biochem Cytol. 1958;4(6):761-764.
  74. Boudaoud A, et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 2014;9(2):457-463.
  75. Fischer RS, et al. Contractility, focal adhesion orientation, and stress fiber orientation drive cancer cell polarity and migration along wavy ECM substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(22):e2021135118.
  76. Wolf KJ, et al. Perfusable 3D models of ureteric bud and collecting duct tubules. Cell Biomater. 2026;2(3):100297.
  77. Ren B, et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Appl Phys Rev. 2022;9(1).
  78. Hynes WF, et al. Examining metastatic behavior within 3D bioprinted vasculature for the validation of a 3D computational flow model. Sci Adv. 2020;6(35):eabb3308.
  79. Pisano A. From tubes and catheters to the basis of hemodynamics: viscosity and Hagen-Poiseuille equation. In: Physics for Anesthesiologists and Intensivists: From Daily Life to Clinical Practice. Springer; 2021:89-98.
  80. Gerhardt H, Betsholtz C. How do endothelial cells orientate EXS. 2005;(94):3-15.
  81. Baeyens N, et al. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. J Clin Invest. 2016;126(3):821-828.
  82. Lee J. Hemodynamics in Doppler ultrasonography. Ultrasonography. 2024;43(6):413.
  83. Kamada H, et al. Blood flow analysis with computational fluid dynamics and 4D-flow MRI for vascular diseases. J Cardiol. 2022;80(5):386-396.
  84. Postnov DD, Tuchin VV, Sosnovtseva O. Estimation of vessel diameter and blood flow dynamics from laser speckle images. Biomed Opt Express. 2016;7(7):2759.
  85. Dessalles CA, Leclech C, Castagnino A, Barakat AI. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 2021;4:764.
  86. Parekh P, Agrawal N, Vasavada A, Vinchurkar M. Extreme coronary artery tortuosity in association with tortuosity of the systemic arteries: a rare and challenging situation for the interventionist. BMJ Case Rep. 2014;2014:bcr2014204725.
  87. Vetter J, Palagi I, Waisman A, Blaeser A. Recent advances in blood-brain barrier-on-a-chip models. Acta Biomater. 2025;197:1-28.
  88. Liu Y, Lin L, Qiao L. Recent developments in organ-on-a-chip technology for cardiovascular disease research. Anal Bioanal Chem. 2023;415(18):3911-3925.
  89. Cuenca MV, et al. Engineered 3D vessel-on-chip using hiPSC-derived endothelial- and vascular smooth muscle cells. Stem Cell Reports. 2021;16(9):2159-2168.
  90. van Engeland NCA, et al. A biomimetic microfluidic model to study signalling between endothelial and vascular smooth muscle cells under hemodynamic conditions. Lab Chip. 2018;18(11):1607-1620.
  91. Sobrino A, et al. A tissue-engineered 3D microvessel model reveals the dynamics of mosaic vessel formation in breast cancer. Cancer Res. 2020;80(19).
  92. Riddle RB, Jennbacken K, Hansson KM, Harper MT. A multicellular vessel-on-a-chip model reveals context-dependent roles for platelets in inflammation and inflammatory hemostasis. Blood Vessels Thromb Hemost. 2024;1(2):100007.
  93. Rickman M, et al. Disturbed flow increases endothelial inflammation and permeability via a Frizzled-4-β-catenin-dependent pathway. J Cell Sci. 2023;136(6):jcs260449.
  94. Shevchuk O, et al. Vessel-on-a-chip: a powerful tool for investigating endothelial COVID-19 fingerprints. Cells. 2023;12(9):1297.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

כלי דם בהדפסת תלת-ממדעקמומיות כלי דםמפרצת בכלי דםאיבר על שבבחדירות כלי דםקצב גזירה פיזיולוגימיקרוסקופיה של אור
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.