הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הפעלה מכנית של מקרופגים המושרית על ידי פריסטלטיקה

104 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72607

⸱

18 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג את ההקמה והתפעול של ביו-ראקטור רשום במטרה לבצע מחקרי מכנו-אימונו-מודולציה. כאן, באמצעות ביו-ראקטור מותאם אישית המשחזר כוחות פיזיולוגיים, אנו מדגימים כי מקרופאגים מפתחים תגובה פרו-דלקתית מובהקת לגירוי מכני.

תקציר

דלקת היא תהליך מורכב המניע מחלות חריפות וכרוניות כאחד. היא מווסתת על ידי רצפים של אותות ביוכימיים וביופיזיים המובילים להפעלת תאי מערכת החיסון. מקרופאגים הם סוג תאי חיסון מרכזי המעורב במצבים דלקתיים מרובים, כולל סרטן, פיברוזיס ומחלות אוטואימוניות. שיטות מסורתיות לחקר הפעלת מקרופאגים כוללות גירוי ביוכימי באמצעות אותות מוגדרים של ציטוקינים או קמיוקינים, המפעילים את המקרופאגים לעבר מצב פרו-דלקתי או אנטי-דלקתי. עדויות חדשות מצביעות על כך שגם לאותות ביופיזיים יש תפקיד בהפעלת מקרופאגים, בנוסף לאותות הביוכימיים ברקמות. אחד מאותם רמזים מכניים השכיחים הוא פריסטלטיקה, המורכבת ממאמץ רב-צירי וממאמץ גזירה, המתרחשת בדרכי העיכול, ברחם, בדרכי הנשימה המתפתחות ובשופכנים. כאן, בחנו את ההשערה שפריסטלטיקה עשויה להפעיל מקרופאגים. בפרוטוקול זה, מתואר השימוש בביוריאקטור פריסטלטי לחקר ההפעלה המכנית של מקרופאגים. ממברנות של Polydimethyl siloxane קוסינו בפיברונקטין כדי להגביר את היצמדות המקרופאגים. מקרופאגים ממח עצם של עכברים שהם תאים מוכנסי תמימות (iBMDM) נזרעו על ממברנות מצופות בפיברונקטין ונשמרו כביקורות סטטיות או נחשפו לפריסטלטיקה למשך 4 h. הפריסטלטיקה הפעילה את המקרופאגים, עם הבדלים משמעותיים בביטוי הגנים של Il6 (פי 50.9 לעומת ביקורות סטטיות; p < 0.0001, t-test) ו-Nos2 (פי 19.8 לעומת ביקורות סטטיות; p = 0.0046). באופן מעניין, לא נצפו שינויים משמעותיים ב-Chil3 (פי 1.22 לעומת ביקורות סטטיות; p = 0.9726) או ב-Mrc1 (פי 1.16 לעומת ביקורות סטטיות; p = 0.9810) בהשוואה לביקורות סטטיות, מה שמעיד על כך שהגורמים המכניים הניעו בעיקר הפעלה פרו-דלקתית. הממצאים הנוכחיים תומכים בקונספט של מכנו-אימונומודולציה של מקרופאגים, במיוחד בתגובה למכניקת פריסטלטיקה השכיחה ברקמות רבות המבוססות על שריר חלק.

מבוא

מקרופאגים הם תאי מערכת חיסון מולדת הממלאים תפקידים חיוניים בהגנת המאחס, בעיצוב מחדש של רקמות ובויסות הדלקת באמצעות פגוציטוזה והפרשת ציטוקינים1,2,3,4. בהתאם לגירויים בתוך המיקרו-סביבה in vivo, מקרופאגים לא מובחנים (M0) יכולים לעבור קיטוב פלסטי לעבר פנוטיפים פרו-דלקתיים (M1) או אנטי-דלקתיים/פרו-רגנרטיביים (M2)5,6. מודלים in vitro משמשים בדרך כלל לבידוד הגירויים השונים הללו, על מנת להבין טוב יותר את המכניזמים המורכבים המניעים את קיטוב המקרופאגים. מקרופאגים M1 המופעלים באופן קלאסי מודעים בדרך כלל in vitro על ידי גירויים ביוכימיים כגון ליפופוליסכריד (LPS) ואינטרפרון גמא (IFN-γ), מה שמוביל לביטוי מוגבר של מתווכים דלקתיים, כולל סינטטאז חנקן חמצני הניתן להשראה (iNOS), אינטרלוקין-6 (IL6) וגורם נמק גידול אלפא (TNF-α)7,8. מקרופאגים M2 המופעלים באופן חלופי מודעיםים בדרך כלל באמצעות חשיפה לאינטרלוקין-4 (IL-4) ולאינטרלוקין-13 (IL-13), המעודדים תגובות של עיצוב מחדש של רקמות וריפוי פצעים8,9. מקרופאגים M2 מחולקים בהמשך לפנוטיפים M2a, M2b ו-M2c, על בסיס מסלולי הפעלה נפרדים ופרופילים של ביטוי סמני פני שטח10,1. בעוד שהוויסות הביוכימי של קיטוב מקרופאגים אופיין רבות הן במערכות in vivo והן במערכות in vitro, מקרופאגים שוהים בתוך מיקרו-סביבות דינמיות מאוד המכילות גם גירויים ביופיזיים משמעותיים12. בנוסף לציטוקינים וכימוקינים מסיסים, מקרופאגים חשופים למטריצה חוץ-תאית ואינטראקציות בין-תאיות, קשיחות של תשתית, מאמץ גזירה של נוזלים, לחץ הידרוסטטי ועיוות רקמה מחזורי12,13,14. ככליים רגישים למכניקה, מקרופאגים יכולים לשנות את הפנוטיפים הדלקתיים שלהם בתגובה לרמזים פיזיים אלה, מה שמדגיש את חשיבותה של המכננביולוגיה בוויסות החיסוני.

גוף ספרות הולך וגדל הוכיח כי גירויים מכניים מבודדים in vitro יכולים להשפיע באופן משמעותי על מצבי הפעלה של מקרופאגים (איור 1). חשיפה לתשתיות קשיחות יותר הגבירה את הקיטוב למצב M1 ואת ייצור ציטוקינים דלקתיים בהשוואה לתשתיות רכות יותר, אשר השרו פנוטיפ פרו-רגנרטיבי15,16,17,18,19,20. באופן דומה, מאמץ גזירה של נוזלים מווסת את הפנוטיפ של המקרופאגים באופן התלוי בעוצמה, כאשר רמות נמוכות של זרימת נוזלים בינרקומיות מקדמות לרוב הפעלה פרו-רגנרטיבית21,2, בעוד שמאמצי גזירה גבוהים יותר, הדומים לערכים הנצפים בעורקים, עשויים להשריץ תגובות פרו-דלקתיות23,24,25,26,27,28. מודלים של מתיחה מחזורית in vitro שנועדו לחקות מכניקה של רקמות שלד-שריר, שריר לב, ריאה ומעי, הדגימו גם הם ביטוי מוגבר של מתווכים דלקתיים, אם כי התוצאות משתנות בהתאם לעוצמה, למשך, לתדירות ולמימדיות של הכוח המופעל29,30,31,32. יתרה מכך, הרגישות המכנית של מקרופאגים שונה בין מינים ומקור תאים שונים, דבר המדגיש את החשיבות של בחירת מודלים ניסיוניים מתאימים למחקרי מכנוביולוגיה13,14.

תרשים הפעלת מקפגים; גירויים ביוכימיים וביופיזיקליים; שינויים פנוטיפיים; גורמי דחק.
איור 1סכימה הממחישה את ה- in vitro גירויים ביוכימיים וביופיזיקליים להפעלת מקרופאגים למצבים פרו-דלקתיים או פרו-רגנרטיביים. ניתן לעורר מקרופאגים למצב פרו-דלקתי in vitro על ידי הוספת גירויים כימיים, ליפופוליסכריד (LPS), אינטרפרון גמא (IFN-γ), או חשיפה לגירויים מכניים, הכוללים מאמץ גזירה, קשיות מוגברת, מאמץ השרה הנגרם ממתיחה חד-צירית סטטית ומחזורית גבוהה, דחיסה ומאמץ השרה הנגרם מדחיסה רב-צירית. ניתן לעורר מקרופאגים למצב פרו-רגנרטיבי על ידי in vitro הוספה של גירויים כימיים, Interleukin-13 (IL-13) ו-IL-4. הם יכולים להפוך גם לפרו-רגנרטיביים (מעודדי התחדשות) כאשר הם נחשפים לגירויים מכניים בצורה של מאמץ גזירה תנודתי, זרימה אינטרסטיציאלית, תשתיות רכות או רמות נמוכות של מאמץ מחזורי חד-צירים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בנוסף לחקר גירויים מכניים מבודדים באופן עצמאי, חשוב להבס את העבודה הזו כדי להתחיל לבחון את ההשפעה של כוחות פיזיקליים משולבים, בהינתן שמאקרופאגים in vivo חשופים בדרך כלל לשילובים של כוחות סימולטניים. פריסטלטיקה מייצגת סביבה מכנית מורכבת אחת own כזו, המורכבת ממאמץ מחזורי רב-צירי וסרט ומסרטזזת של זרימה (fluid shear stress) הנוצרים כתוצאה מכיווץ שריר חלק33. מכניקות אלו קיימות במספר מערכות איברים, כולל מערכת העיכול, דרכי נשימה בהתפתחות, כלי דם, רחם ושופכנים34,35,36. באופן משמעותי, התפקוד הפריסטלטי לוקה לעיתים קרובות בבקרת לקויה במחלות דלקתיות, כולל פיברוזיס, מחלות מעיים דלקתיות, סרטן והפרעות של עיצוב מחדש של דרכי הנשימה (airway remodeling), אשר כולן כרוכות בדלקת משמעותית המתווכת על ידי מאקרופאגים3,37,38,39. למרות התפקיד המוכר של מאקרופאגים במחלות אלו, נותר פער קריטי בהבנה כיצד כוחות מכניים פריסטלטיים משפיעים ישירות על הפעלת מאקרופאגים.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת ביו-ריאקטור פריסטלטית לבדיקת אימונו-מודולציה מכנית של מקרופאגים תחת תנאים מכניים רלוונטיים פיזיולוגית. בהשוואה למערכות תרבית סטטיות קונבנציונליות או לפלטפורמות של גירוי מכני בכוח בודד, שיטה זו מאפשרת הפלה סימולטנית של מאמץ רב-צירי מחזורי ומאמץ גזירה של נוזלים, ובכך משחזרת באופן מדויק יותר את המיקרו-סביבה המכנית in vivo של רקמות המבוססות על שריר חלק. בפרוטוקול זה, מקרופאגים ממחיל העצם של עכבר שהונחלו (iBMDMs) וגודלו בביו-ריאקטורים תחת תנאים פריסטלטיים הפגינו עלייה בסמנים של הפעלת M1, בעוד שלא נצפו מגמות לעבר הפעלת M2. ממצאים אלו מוכיחים כי מכניקה פריסטלטית מספיקה כדי למשפיע על התנהגות דלקתית של מקרופאגים ותומכת במושג הרחב יותר של אימונו-מודולציה מכנית ברקמות החשופות לכוחות דינמיים המונעים על ידי שריר חלק. שיטה זו רלוונטית במיוחד לחוקרים הלומדים מכנו-ביולוגיה, דלקת, הנדסת רקמות, פיזיולוגיה של מערכת העיכול, התפתחות ריאות, פיברוזיס ומחלות אחרות שבהן מקרופאגים חשופים למיקרו-סביבות מכניות מורכבות. באמצעות הרכבה קפדנית, כיול עקבי וניטור שוטף, המשתמשים יכולים להבטיח ביצועי ביו-ריאקטור הדירים ולמנוע מגבלות נפוצות של טכניקה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול מתאר את ההרכבה והתפעול של מכשיר רשום כפטנט40 מערכת ביו-ריאקטור למחקרי מכנו-אימונומודולציה. הרכיבים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים ב- טבלת חומרים.

1. תרבית תאים

  1. יש לתחזק מקרופגים ממח עצם של עכברים המונחלים (iBMDMs) במצע RPMI 1640 מלא, המועשר ב-10% FBS שעבר נטרול חום, 1% בופר HEPES, 1% Pyruvate נתרן, ו-1% Penicillin-Streptomycin ב- 37 °C הושלם ב-5% CO2.

2. ייצור פולידימეთילסילוקסאן (PDMS)

  1. שקלו וערבבו את הבסיס ואת חומר המקשה של ערכת האלסטומר מסיליקון ביחס של 10:1 (משקל/משקל).
  2. ערבבו את התערובת במשך 5 דקות כדי להבטיח ערבוב אחיד.
  3. שפכו בזהירות את ה-PDMS המעורב לתוך צלחת פטרי ריבועית בגודל 10 mm x 15 mm עד שגובה ה-PDMS יגיע ל-3mm.
  4. הניחו את צלחות הפטרי עם ה-PDMS בתוך דסיקטור.
  5. בצעו דגזינג (Degas) תחת ואקום למשך 1 h כדי להסיר בועות אוויר.
  6. הוציאו את ה-PDMS מהדסיקטור וודאו שאין בועות אוויר שנותרו.
  7. העבירו את ממברנות ה-PDMS שטרם התקשחו לתנור שחומם מראש ל-60 ˚ C, והקשיחו למשך 4 h.
  8. הוציאו את ממברנות ה-PDMS מהתנור והניחו להן להתקרר על משטח העבודה למשך הלילה.
  9. לאחר 18–24 h, נתקו בזהירות את ממברנות ה-PDMS המקשחות מצלחות הפטרי וגזרו אותן ליצירת ממברנות PDMS בגודל 70 mm x 40 mm x 3 mm.

3. סטריליזציה של ממבצת ה-PDMS

  1. בתוך קבנט בטיחות ביולוגית, שטפו את ממбраנות ה-PDMS באתנול 70% והניחו אותן ישירות על משטח קבנט הבטיחות הביולוגית (BSC) (תוספות איור 1).
  2. עקרו באמצעות UV למשך 10 דקות, ולאחר מכן העבירו את ממבמי ה-PDMS לכלי תרבית בנפח 90 מ"מ שאינו מטופל לתרבית רקמות (non-tissue culture-treated), כאשר הצד שנחשף ל-UV פונה כלפי מעלה.
    הערה: ודא כי ה-PDMS נתפס מהצדדים ולעולם אין להעביר ידיים מעל ה-PDMS, וזאת כדי להפחית את הסיכון לזיהום.
  3. עבור ניסויי פריסטלזה, השתמש בממברנות ה-PDMS בממדיהן המקוריים.
  4. עבור תנאי תרבית סטטיים, חתכו כל ממברנת PDMS בגודל 70 מ"מ x 40 מ"מ לשני חצאים שווים בגודל 35 מ"מ x 40 מ"מ.

4. ציפוי של ממברנות PDMS בפיברונקטין

  1. בתוך קבלית בטיחות ביולוגית (BSC), הכין נפח מספיק של תמיסת פיברונקטין (fibronectin) סטרילית בריכוז 0.5 mg/mL בתוך סליין בבופר פוספט (PBS), כך שניתן יהיה להוסיף 10 µL לכל ממברנה.
  2. טפטף 10 µL מתמיסת הציפוי הזו למרכז כל ממברנת PDMS, תוך וידוא שהאזור המצופה תואם בדיוק לאזור המגע של הממברנה בין ה-PDMS לבורג.
    הערה: השתמש בקצה הפ pipette כדי לפרוס בעדינות את התמיסה לשכבה דקה ואחידה.
  3. השאר את ממברנות ה-PDMS המצופות בצלחת התרבית, ללא המכסה, למשך 45 דקות כדי לאפשר ספיחה.
    הערה: השאר את חלון ה-BSC פתוח כדי לשמור על זרימת אוויר רציפה.
  4. לאחר 45 דקות, שאב את שארית תמיסת הפיברונקטין מכל ממברנה.
  5. שטוף בעדינות את הממברנות עם 1 mL של PBS סטרילי.

5. זריעת תאי iBMDM על ממбраסת ה-PDMS

  1. כאשר התאי iBMDM המגודלים בבקבוק T25 מגיעים ל-70%–80% התמזגות (confluency), בצעו טריפסינציה לתאים כדי לנתק אותם מהמשטח.
  2. קביעת ריכוז תאים באמצעות המוציטומטר (hemocytometer) והכנת צפיפות תאים של 10,0 תאים/מ"ל במצע גידול.
  3. על כל ממברנת PDMS מצופה פיברונקטין, זרע 1 מ"ל מתרחיף התאים שהוכן לכל ממברנה.
  4. עבור כל ניסוי, זרע לפחות ממברנה סטטית אחת וממברנה פריסטלטית אחת כדי להבטיח השוואה מקבילית בין התנאים.
  5. הניחו את ממбраנות ה-PDMS הזרועות באינקובטור לח 37 °C עם 5% CO2 למשך 24 שעות לפחות כדי לאפשר היצמדות תאים הן עבור התנאים הסטטיים והן עבור התנאים הפריסטלטיים (נספח איור 1B).

6. ביו-ריאקטור

  1. יש לייצר את הביוראקטור באמצעות קבצי תכנון בעזרת מחשב (CAD) ומפרטים המופיעים בפטנט של הביוראקטור (US1252795)40, או להשיג יחידה מורכבת מראש מהמחברים.

7. הרכבה וכיול של מעגל Arduino

  1. בניית מעגל
    1. הרכיבו את מעגל הבקרה על לוח לחם (breadboard) באמצעות פוטנציומטרים, נגדים, טרנזיסטורים וחיווט מוליך, כפי שמוצג ב- תוספת איור 2.
    2. התקינו את ה-Arduino IDE במחשב ופתחו סקיצה (sketch) חדשה.
    3. הגדירו את מהירות המנוע ל-5 סיבובים לדקה (RPM) ואת משאבת הפריסטלטיקה ל-28 מ"ל לדקה.
    4. חבר את לוח ה-Arduino למחשב באמצעות USB והעלה את הקוד המסופק ב- קובץ משלים 1 באמצעות כפתור ה-Upload ב-IDE.
      הערה: נורית ה-LED של ה-Arduino תהיה בצבע כתום במהלך ההעלאה ותחזור לצבע ירוק ברגע שתהיה מוכנה להפעלה. לאחר השלמת ההעלאה, ה-Arduino יריץ את התוכנית באופן אוטומטי עם חיבור למקור מתח.
  2. כיול מנוע
    1. הפעילו את המנוע וספרו את מספר הסיבובים במשך דקה אחת באמצעות שעון עצר.
      הערה: התאם את פרמטר מהירות המנוע בקוד ה-Arduino לפי הצורך כדי להגיע ל-5 סל"ד (RPM).
    2. העלה מחדש את הקוד לאחר כל התאמה עד להשגת המהירות הרצויה.
  3. כיול המשאבה
    1. הפעילו את המשאבה למשך 30 שניות ומדדו את המסה שנאספה כדי לוודא קצב זרימה של 28 מ"ל/דקה (~14 גרם ב-30 שניות)
    2. כוון את הפוטנציומטר וחזור על הפעולה עד שפלט ה-30 שניות יהיה באופן עקבי קרוב ל-14 גרם.
  4. לאחר כיול המנוע והמשאבה, שייכו אותם ליחידת ביו-ריאקטור.
    הערה: מכלול המנוע-משאבה-ביוראקטור המכויל מוכן כעת לשימוש ניסיוני (איור 2).

תרשים ביו-ריאקטור להגדרת תרבית מקרופאגים; דימיון ואנליזת PCR לתוצאות מחקר תאים.
איור 2תרשים של הרכבת ביו-ראקטור פריסטלטי ואנליזה במערכת זרימה (downstream analysis). תאי iBMDM נזרעים על ממברנת PDMS מצופה פיברונקטין הממוקמת בתוך הביוריאקטור. לאחר חשיפה למשך 4 שעות לפריסטלזה או תחזוקה כביקורות סטטיות, התאים נאספים לניתוחים המשכיים, כולל qPCR, צביעה אימונופלורסצנטית ודימוג. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

8. הרכבה והגדרה של ביו-ריאקטור הפריסטלזה

  1. הכנת הרכיבים
    1. אספו את כל הרכיבים הדרושים, כולל בקבוק מצע, מכסה לבקבוק המצע, חלק עליון לבקבוק המצע בהדפסת תלת-ממד, חלק עליון לביוריאקטור בהדפסת תלת-ממד, חלק תחתון לביוריאקטור בהדפסת תלת-ממד, הברגה בהדפסת תלת-ממד, אזיקים (שלושה לכל ביוריאקטור), פלייר עם מפרק כדורי, פלייר אלכסוני, צלחות תרבית רקמה בנפח 150 mm, גריז סיליקון ותמיכה למנוע בהדפסת תלת-ממד. רסו כל פריט ב-70% אתנול לפני הצבתו בתוך ה-BSC.
    2. הניחו את מנוע ה-DC, את משאבת הפריסטלטיקה ואורך נוסף של צינורית משאבה בתוך ה-BSC.
    3. סגרו את מכסה ה-BSC והפעילו את קרינת ה-UV למשך 10 דקות כדי לעקר את כל הרכיבים (Supplementary Figure 1C).
  2. אימות היצמדות התאים וחיוניותם
    1. בחנו תחת המיקרוסקופ הן את ממברנות ה-PDMS הסטטיות והן את אלו המיועדות לפריסטלטיקה שבהן נזרעו תאים. ודאו היצמדות של >80% תאים על פני השטח של ה-PDMS המצופים בפיברונקטין ובחנו את מורפולוגיית התאים כדי לוודא את חיוניותם.
    2. צלמו תמונות מייצגות של התאים לפני ההרכבה במידת הצורך.
  3. הכנת בקרות סטטיות
    1. שאבו 1 mL של מצע RPMI מלא מכל ממברנה סטטית.
    2. הוסיפו 1 mL של מצע RPMI מלא טרי לכל ממברנה.
    3. סמנו את הצלחות כ"סטטיות" והחזירו אותן לאינקובטור.
  4. הרכבת הביוריאקטור הפריסטלטי
    1. הוסיפו 15 mL של מצע לכל בקבוק מצע המיועד לשימוש בביוריאקטור.
    2. חברו את מכסי המצע המצוידים בחלקים העליונים של הבקבוק בהדפסת תלת-ממד (הכוללים פתחי כניסה ויציאה) לבקבוקי המצע. הניחו אותם בצד (Supplementary Figure 1D).
    3. הרכיבו את בסיס הביוריאקטור.
      1. הכניסו את ההברגה בהדפסת תלת-ממד לתוך הבור המרכזי של החלק התחתון של הביוריאקטור.
      2. הכניסו את מנוע ה-DC לתוך חריץ המנוע בחלק התחתון של הביוריאקטור.
      3. ודאו שציר המנוע יושב בבטחה בתוך החור המרכזי של ההברגה בהדפסת תלת-ממד.
      4. החליקו את תומך המנוע למקומו כדי לייצב את המנוע.
  5. הניחו את הביוריאקטור המורכב חלקית בתוך צלחת תרבית רקמה בנפח 150 mm כדי להקל על ההעברה מה-BSC לאינקובטור לאחר ההרכבה (Supplementary Figure 1E).
  6. מרחו שכבה דקה של גריז סיליקון על חריצי ההברגה שבהם ממברנת ה-PDMS תבוא במגע עם ההברגה. הדבר מאפשר להברגה להסתובב בקלות ומפחית את החיכוך.
  7. טעינת ממברנת ה-PDMS עם התאים
    1. העבירו בזהירות את ממברנות ה-PDMS הפריסטלטיות עם התאים מהאינקובטור לתוך ה-BSC.
    2. שאבו את המצע מכל ממברנה והניחו את הממברנה בביוריאקטור כאשר הפני השטח עם התאים פונה כלפי מעלה, בצד הנגדי לממשק ההברגה המשומן.
    3. מקמו את החלק העליון של הביוריאקטור כך שהשקע של תא התאים יתיישר עם ממברנת ה-PDMS. החליקו את החלק העליון לתוך חריצי המדריך של החלק התחתון של הביוריאקטור.
  8. אבטחת הביוריאקטור
    1. אבטחו את החלק העליון והתחתון של הביוריאקטור באמצעות אזיקים ופלייר אלכסוני.
    2. גזרו את שאריות האזיקים באמצעות הפלייר.
  9. חיבורים פלואידיים והגדרת המערכת
    1. יישרו את משאבת הפריסטלטיקה כך שהמחבר המתכתי שלה יפנה לאותו כיוון של מחבר המנוע.
    2. חברו את צינורית המשאבה הקרובה ביותר לביוריאקטור לפתח הכניסה הקרוב ביותר למנוע בחלק העליון של הביוריאקטור. דחפו את הצינורית עד הסוף על פיית הכניסה.
    3. טבלו את הקצה השני של צינורית זו בתוך בקבוק המצע.
    4. באמצעות חתיכת צינורית משאבה נוספת, חברו קצה אחד לפיית היציאה של החלק העליון של הביוריאקטור, והניחו את הקצה השני בתוך בקבוק המצע מעל מפלס המצע כדי לאפשר רהיפוץ ללא זרימה חוזרת (Supplementary Figure 1F).
  10. אינקובציה והפעלה
    1. הניחו את כל מכלול הביוריאקטור (בתוך צלחת ה-150 mm) בתוך האינקובטור (Supplementary Figure 1G) והשאירו את לוח המעגלים/Arduino מחוץ לאינקובטור, מחובר למקור חשמל.
    2. חברו את תפס התניח
      1. משאבה: חיובי לחיובי, שלילי לשלי.
      2. מנוע: הפכו את הקוטביות בהתאם לתכנון המעגל.
    3. הניחו צלחות פטרי סטריליות ריקות באינקובטור לצורך איסוף דגימות מאוחר יותר.
    4. אפשרו למערכת הביוריאקטור הפריסטלטית לפעול למשך 4 שעות (או למשך זמן רצוי) (Supplementary Figure 1H) תחת תנאי תרבית סטנדרטיים באינקובטור.

9. פירוק הביוראקטור

  1. פתחו את האינקובטור והרימו את צינור הכניסה מבקבוק המצע כדי לאפשר לאוויר להיכנס למערכת ולרוקן לחלוטין את שאריות המצע מהביוריאקטור.
  2. ברגע שזרימת המצע פסקה, נתקו את כבלי המנוע ו/או המשאבה מלוח המעגלים כדי להפסיק את התנועה המכנית.
  3. העבירו את כל מכלול הביוריאקטור אל תוך ה-BSC, הסירו את הצינורות, חתכו את אזיקי הפלסטיק והסירו את מכסה הביוריאקטור.
  4. שאבו את שאריות המצע מממברנת ה-PDMS והעבירו את הממברנה בחזרה לאותה צלחת פטרי ששימשה במהלך ההכנה.
  5. בדקו את היצמדות התאים ואת חיוניותם על ידי הערכת מורפומטריה של התאים תחת מיקרוסקופ לתרביות תאים, ולאחר מכן המשיכו בניתוחים המשלימים לפי הצורך.

10. ניתוח המשך

  1. איסוף דגימות ל-qPCR
    1. בתוך תא הבטיחות הביולוגית (BSC), סמנו מבחנות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל במזהי דגימות, כולל סוג התא והתנאי הניסיוני.
    2. ודאו כי התאים עדיין נוכחים על ה-PDMS באמצעות מיקרוסקופ לתרביות תאים, הן בתנאים סטטיים והן בתנאי פריסטלזה.
    3. שאבו את המצע השארי מכל ממבצת PDMS.
    4. יש להכין רענן של תמיסת ליזיס ל-RNA על ידי הוספת $\beta$-mercaptoethanol לתמיסת RLT ביחס של 1:10.
    5. הוסף 370 µL של Buffer RLT + $\beta$-mercaptoethanol לכל ממברנת PDMS כדי לליזת התאים.
    6. באמצעות גורד תאים (cell scraper) סטרילי, גרדו בחוזקה את האזור שבו נזרעו התאים על ה-PDMS כדי לנתק את כל התאים.
    7. העברה ~350 µL של הליזאט (lysate) אל תוך הפרבובת של 1.5 מ"ל המתאימה.
    8. המשיכו למיצוי RNA או אחסנו את הדגימות ב-80 °C עד לשימוש נוסף.
    9. חטא את קבינת הבטיחות הביולוגית (BSC).
      הערה: יש לטיפל בבופר RLT וב-β-mercaptoethanol בהתאם לדפי הבטיחות (SDS) שלהם ולהשליכם למכלי הפסולת המתאימים.
  2. צביעה אימונופלואורסצנטית
    1. הוסיפו 1 מ"ל של פראפורמלידה (PFA) בריכוז 4% לכל ממבנה והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    2. שאבו את ה-PFA והשליכו אותו במיכל הייעודי לפסולת מסוכנת.
    3. הוסיפו 1 מ"ל של PBS לכל ממברנה כדי להסיר שאריות של חומר מקבע.
    4. המשך עם פרוטוקול הצביעה האימונופלואורסצנטית המתאימה לסמני המטרה.

1. ניקוי ביו-ריאקטורים ורכיבים נלווים

  1. רסס את כל רכיבי הביוריאקטור הבאים במגע עם מצע, תאים או ממברנות PDMS באתנול 70%, כולל פתחי הכניסה והיציאה של הביוריאקטור.
  2. שאב את שאריות המצע מבקבוק המצע, ולאחר מכן שטוף את הפנים על ידי ריסוס נדיב של אתנול 70% ושאיבה חוזרת.
  3. הוצא את כל הרכיבים שעברו חיטוי מה-BSC ואחסן אותם באזור נקי ייעודי.
  4. עבור בקבוקי מצע:
    1. נקה עם 20% bleach, סובב ושפוך את התוכן לכיור תחת זרימת מים.
    2. קרצף עם חומץ מהול ביחס של 1:10 ושטוף עם סבון ומים אולטרה-טהורים, לאחר מכן שטוף באתנול 70% וייבש כשהבקבוק הפוך.
    3. נקה את מכסי המצע ואת תושביות המשאבה באתנול 70%.
  5. ניקוי משאבות פריסטלטיות
    1. הכן כוסות כימיות של 250 mL עם (1) אתנול 70%, (2) מים אולטרה-טהורים, או (3) מכל פסולת ריק.
    2. חבר את המשאבה עם צינוריות בנתיב זרימה סגור והפעל אותה באמצעות לוח המעגלים הנשלט על ידי Arduino.
    3. הפעל את המשאבה באתנול 70% למשך 1 min, ולאחר מכן במים אולטרה-טהורים למשך 1 min כדי לשטוף את התוכן אל כוסת הפסולת הריקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה נועד להדגים שיטה הניתנת לשחזור לקביעת האופן שבו כוחות מכניים פריסטלטיים מושפעים באופן ישיר מאקטיבציה של מקרופאגים. לפני ניסויי הביוריאקטור, הוכשר כי iBMDMs עוברים קיטוב תקין בתגובה לתנאי גרייה ביוכימיים סטנדרטיים. בהתאם לפרוטוקול זה, ממברנות PDMS צופו בפיברונקטין ונזרעו עליהן iBMDMs. התאים הושארו להיקשר למשך 24 שעות לפני בדיקה ויזואלית לאישור היצמדות מוצלחת, פיזור אחיד על פני שטח הממברנה וחיוניות, כפי שנראה במורפולוגיית "ביצת מטוגנת" לא סדירה בהתאם לתיאור הספק (איור 3A,B<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההבנה הנוכחית לגבי האופן שבו כוחות פריסטלטיים משפיעים על תפקוד המקרופאגים נותרה מוגבלת, למרות השכיחות של פריסטלטיקה לא תקינה במחלות דלקתיות. בעוד שגירויים מכניים בודדים, כגון מאמץ גזירה ומתיחה מחזורית, ידועים כמעצבים של אקטיבציית מקרופאגים, ההשפעות של מתיחה רב-צירית וזרימת נוזלים בו-זמנית, המרכיבים יחד את הפריסטלטיקה, לא נחקרו באופן נרחב בהקשר של מכנוביולוגיה של מקרופאגים. הפרוטוקול המתואר כאן מספק פלטפורמה ניתנת לשחזור לבדיקת האופן שבו כוחות מכניים משולבים אלו מווסתים את ההתנהגות הדלקתית של מקרופאגים תחת תנאים רלוונטיים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (National Science Foundation), מספר מענק 2440798. איור 1 ו-איור 2 נוצרו באמצעות גרסה בעלת רישיון של BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% Trypsin- EDTAFisher25200056
מבחנות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mLUSA Scientific1615-5510
צלוחיות פטרי 100 mm x 15 mmFisher50-190-0276
צלוחיות תרבית 150 mmFisherFB012925
4% פאראפורמאלדהידSanta Cruzsc-281692
צלוחיות תרבית 90 mmFisherFB012923
נוגדן Alexa Fluor 488 Anti-F4/80Abcamab204266
נוגדן Alexa Fluor 647 Anti-CD40Abcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
לוח לחם (Breadboard)Amazon
בופר RLTQiagen79216
מגרדת תאים (Cell scraper)Fisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
דסיקטורMilliporeSigmaZ119008
פלייר אלכסוניAmazon
סרום עגל עוברי (FBS)Innovative Biosciences11-01-500
פיברונקטיןMilliporeSigmaF1141-1MG
בופר HEPESFisher (Gibco)15630080
iBMDMApplied Biological Materials Inc. (abm)T0673
מנוע RobotshopFT-SPARK16-360
נוגדן PE Anti-Ym-1 + Ym-2Abcamab211621
פניצילין-סטרפטומייציןFisher15140122
משאבה פריסטלטיתDigiKey1150
בופר סליין פוספט (PBS)Fisher14190250
פילמנט PLAAmazonB0D7ZYCVTY
פוטנציומטר B1K 1K OhmAmazon‎B0CZ747F6F
RPMI 1640Fisher11875085
גריז סיליקוןAmazonB000XBH9HI
פלייר עם מפרק מתכוונןAmazon
נתרן פירובטCytiva HycloneSH3023901
ערכה לאלסטומר סיליקון Sylgard 184FisherNC9285739
בקבוק תרבית T-25Fisher229331
טרנזיסטורDigiKeyIRF520NPBF-ND
חיווט/תפס תנימיםAmazon
אזיקי פלסטיק 18 אינץ'Amazon
β-מרקפטואתנולFisherAC125472500

מקורות

  1. Mass E, Nimmerjahn F, Kierdorf K, Schlitzer A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 2023;23(9):563-579.
  2. Kumar V, Kumar V. Macrophages: the potent immunoregulatory innate immune cells. In: Macrophage Activation - Biology and Disease. London: IntechOpen; 2019. doi:10.5772/intechopen.88013.
  3. Ross EA, Devitt A, Johnson JR. Macrophages: the good, the bad, and the gluttony. Front Immunol. 2021;12:708186.
  4. Sreejit G, Fleetwood AJ, Murphy AJ, Nagareddy PR. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 2020;9(12):e1222.
  5. Locati M, et al. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annu Rev Pathol. 2020;15:123-147.
  6. Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008;8(12):958-969.
  7. Boutilier AJ, Elsawa SF. Macrophage polarization states in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6995.
  8. Orecchioni M, Ghosheh Y, Pramod AB, Ley K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) versus classically and M2 (LPS−) versus alternatively activated macrophages. Front Immunol. 2019;10:1084.
  9. Huang X, Li Y, Fu M, Xin HB. Polarizing macrophages in vitro. Methods Mol Biol. 2018;1784:119-126.
  10. Gharavi AT, et al. The role of macrophage subtypes and exosomes in immunomodulation. Cell Mol Biol Lett. 2022;27(1):83.
  11. Peng Y, et al. Regulatory mechanism of M1/M2 macrophage polarization in the development of autoimmune diseases. Mediators Inflamm. 2023;2023:8821610.
  12. Clevenger AJ, Jha A, Moore E, Raghavan SA. Manipulating immune activity of macrophages: a materials and mechanics perspective. Trends Biotechnol. 2025;43(1):33-49.
  13. Khanmohammadi M, Mirzaalikhan Y, Baratchi S. Immunity in motion: the role of mechanics in macrophage biology. Cell Chem Biol. 2025;32(12). doi:10.1016/j.chembiol.2025.11.004.
  14. Adams S, et al. Mechano-immunomodulation: mechanoresponsive changes in macrophage activity and polarization. Ann Biomed Eng. 2019;47(11):2213-2231.
  15. Meizlish ML, et al. Mechanosensing regulates tissue repair program in macrophages. Sci Adv. 2024;10(11):adk6906.
  16. Lee M, Du H, Winer DA, Clemente-Casares X, Tsai S. Mechanosensing in macrophages and dendritic cells in steady-state and disease. Front Cell Dev Biol. 2022;10:1044729.
  17. Chen M, et al. Substrate stiffness modulates bone marrow-derived macrophage polarization through NF-κB signaling pathway. Bioact Mater. 2020;5(4):880-890.
  18. Blakney AK, Swartzlander MD, Bryant SJ. The effects of substrate stiffness on the in vitro activation of macrophages and in vivo host response to poly(ethylene glycol)-based hydrogels. J Biomed Mater Res A. 2012;100A(6):1375-1386.
  19. Sridharan R, Cavanagh B, Cameron AR, Kelly DJ, O'Brien FJ. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 2019;89:47-59.
  20. Previtera ML, Sengupta A. Substrate stiffness regulates proinflammatory mediator production through TLR4 activity in macrophages. PLoS One. 2015;10(12):e0145813.
  21. Song C, et al. Microfluidic three-dimensional biomimetic tumor model for studying breast cancer cell migration and invasion in the presence of interstitial flow. Chin Chem Lett. 2019;30(5):1038-1042.
  22. Li R, et al. Interstitial flow promotes macrophage polarization toward an M2 phenotype. Mol Biol Cell. 2018;29(16):1927-1940.
  23. Son H, et al. Shear stress induces monocyte/macrophage-mediated inflammation by upregulating cell-surface expression of heat shock proteins. Biomed Pharmacother. 2023;161:114566.
  24. Zhou H, Scatena M, Tu LN, Giachelli CM, Nigam V. Monocyte adhesion to and transmigration through endothelium following cardiopulmonary bypass shearing is mediated by IL-8 signaling. Front Cardiovasc Med. 2024;11:1454302.
  25. Jui E, et al. Shear stress induces a time-dependent inflammatory response in human monocyte-derived macrophages. Ann Biomed Eng. 2024;52(11):2690-2705.
  26. Castro-Núñez L, Dienava-Verdooold I, Herczenik E, Mertens K, Meijer AB. Shear stress is required for the endocytic uptake of the factor VIII-von Willebrand factor complex by macrophages. J Thromb Haemost. 2012;10(9):1929-1937.
  27. Cheng C, et al. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 2006;113(23):2744-2753.
  28. Seneviratne AN, et al. Low shear stress induces M1 macrophage polarization in murine thin-cap atherosclerotic plaques. J Mol Cell Cardiol. 2015;89(Pt B):168-172.
  29. Bonito V, de Kort BJ, Bouten CVC, Smits AIPM. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Eng Part A. 2019;25(17-18):1312-1325.
  30. Ballotta V, Driessen-Mol A, Bouten CVC, Baaijens FPT. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 2014;35(18):4919-4928.
  31. Dziki JL, et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Eng Part A. 2018;24(1-2):128-139.
  32. Wehner S, et al. Mechanical strain and TLR4 synergistically induce cell-specific inflammatory gene expression in intestinal smooth muscle cells and peritoneal macrophages. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010;299(5):G1187-G1197.
  33. Clevenger AJ, et al. Rapid prototypable biomimetic peristalsis bioreactor capable of concurrent shear and multiaxial strain. Cells Tissues Organs. 2023;212(1):57-72.
  34. Huizinga JD. Gastrointestinal peristalsis: joint action of enteric nerves, smooth muscle, and interstitial cells of Cajal. Microsc Res Tech. 1999;47(4):239-247.
  35. Kunz G, Leyendecker G. Uterine peristaltic activity during the menstrual cycle: characterization, regulation, function and dysfunction. Reprod Biomed Online. 2002;4(Suppl 3):5-9.
  36. Hosseini G, et al. A computational model of ureteral peristalsis and an investigation into ureteral reflux. Biomed Eng Lett. 2018;8(1):91-101.
  37. Clevenger AJ, et al. Peristalsis-associated mechanotransduction drives malignant progression of colorectal cancer. Cell Mol Bioeng. 2023;16(4):315-330.
  38. Leyendecker G, Kunz G, Wildt L, Beil D, Deininger H. Uterine hyperperistalsis and dysperistalsis as dysfunctions of the mechanism of rapid sperm transport in patients with endometriosis and infertility. Hum Reprod. 1996;11(7):1542-1551.
  39. Iwakiri K, et al. Mechanisms underlying excessive esophageal acid exposure in patients with gastroesophageal reflux disease. Esophagus. 2017;14(3):213-218.
  40. Raghavan S, Crawford LZ. 3D rapid prototypable tunable peristalsis bioreactor. United States patent. 2022: US12522795.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הפעלת מקרופאגיםמכניקה של פריסטלטיקההפעלת תאי חיסוןרמזים ביופיזיקלייםביו-ראקטור פריסטלטימקרופאגים ממח העצםציפוי פיברונקטיןביטוי גניםמכנו-אימונומודולציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.