מאמר מחקר

מידול פרוגנוסטי של סרטן השחלה המבוסס על גנים של מטרות תרופתיות הקשוריים להרדמה סביב הניתוח: גישה ביואינפורמטית

108 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72629

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Key Lab of Reproduction and Development, Shanghai Key Lab of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Obstetrics & Gynecology Hospital of Fudan University, 2Department of Critical Care Medicine, Aerospace Center Hospital, 3Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 4Department of Anesthesiology, Peking Union Medical College Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה משלב גנים של מטרות תרופות הקשורים להרדמה פרי-אופרטיבית עם נתוני מולטי-אומיקס של סרטן השחלה, במטרה לבנות ולתקף מודל פרוגנוסטי ולאפיין מאפיינים חיסוניים, מרחביים ורגולטוריים קשורים.

תקציר

ההטרוגניות של סרטן השחלה (OV) מציבה אתגרים משמעותיים לסיווג תתי-סוגים של המחלה, לדירוג סיכונים ולניהול קליני מותאם אישית. לכן, מחקר זה פיתח מודל פרוגנוסטי המבוסס על גנים będą targets של תרופות הקשורות להרדמה פרי-אופרטיבית (PARDTGs), כדי לבחון את המשמעות הקלינית של PARDTGs בחולי OV. מחקר זה ניתח באופן מקיף את ה-PARDTGs ב-OV על ידי שילוב נתוני מולטי-אומיקה, כולל נתוני טרנסקריפטומיקה מסתבכת (bulk), נתוני רצף RNA של תאים בודדים (scRNA-seq) ונתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית. בהתבסס על מאפייני הביטוי של PARDTGs, פיתחנו מאפיין פרוגנוסטי באמצעות מודל stepAIC Cox proportional hazards. מודל זה נבנה על בסיס מערך הנתונים TCGA-OV ותוקף באמצעות מערכי הנתונים GSE26193, GSE30161 ו-GSE63885. בנוסף, בנינו נומוגרמות המשלבות מאפייני PARDTG וגורמים קליניים. ניתחנו את המתאם בין ציוני הסיכון לבין העשרה תפקודית, מסלולי איתות ומיקרו-סביבה חיסונית של הגידול. זיהינו 17 PARDTGs הקשורים באופן חזק לפרוגנוזה של OV. החתימה הפרוגנוסטית, שתוּקפה בקבוצות TCGA-OV, GSE26193, GSE30161 ו-GSE63885, הראתה דיוק חיזוי חזק עבור OS. בהשוואה לחתימה הגנטית לבדה, הנומוגרמה המשלבת את המודל הפרוגנוסטי ופרמטרים קליניים הציגה ביצועי פרוגנוזה משופרים. בנוסף, ניתוח של מיקרו-סביבת הגידול חשף העשרה משמעותית של מסלולים הקשורים למערכת החיסון וציוני TIDE נמוכים יותר בחולים בסיכון נמוך, מה שמעיד כי חולים אלו עשויים להפיק תועלת רבה יותר מאימונו-תרפיה. המחקר מדגים הן את הרלוונטיות הפרוגנוסטית והן את התועלת הקלינית של PARDTGs בסרטן השחלה. שילוב מאפיינים גנטיים בבדיקות קליניות מבטיח שיפור בטיפול הקליני ובפרוגנוזה.

מבוא

סרטן שחלה (OV) הוא גידול ממאיר שכיח ואגרסיבי, המאופיין בתסמינים ראשוניים סמויים, פולשנות חזקה וסימנים קליניים מוקדמים שאינם ספציפיים. מחקרים הראו כי מרבית החולות כבר נמצאות בשלבים קליניים מאוחרים בעת האבחנה, עם שיעור הישרדות כולל של חמש שנים הנמוך מ-45%1. למרות התקדמויות בניתוחים, כימותרפיה וטיפולים ממוקדים, אתגרים כגון חזרת הגידול, עמידות לכימותרפיה והתחמקות ממערכת החיסון נמשכים ומגבילים את היעילות הטיפולית2. לפיכך, קיימת דחיפות לזיהוי סממנים מולקולריים (biomarkers) חדשים ולפיתוח כלים חסונים להערכת סיכונים, כדי להתמודד עם ההטרוגניות של הגידול ולתמוך באסטרטגיות קליניות מותאמות אישית.

כריתה כירורגית וניהול פרי-אופרטיבי נותרים אבן היסוד של הטיפול ב-OV. עם זאת, עדויות גוברות מצביעות על כך שמתח פיזיולוגי פרי-אופרטיבי, תגובות דלקתיות ומודולציה חיסונית עשויים להשפיע על ההתנהגות הביולוגית, ובכך להשפיע על הפרוגנוזה לטווח ארוך3. כמרכיב מרכזי בהתערבות הפרי-אופרטיבית, השפעותיהם של חומרי הרדמה חורגות מעבר לדיכוי של מערכת העצבים המרכזית. מחקרים עדכניים מצביעים על כך שטכניקות הרדמה ותרופות הרדמה יכולים למודולציה של תגובות נוירואנדוקריניות, קסקדות דלקתיות ופעילות של תאי אפקטור חיסוניים, ובכך לעצב מחדש את הסביבה המיקרוסקופית של הגידול לאחר הניתוח ולהשפיע על פוטנציאל הנדידה של תאי הגידול, על הניטור החיסוני ועל תהליכים הקשורים לגרורות4. באופן בולט, חומרי הרדמה ספציפיים משנים ישירות את גורל תאי הגידול: propofol מגביר את הישרדותם של תאי גידול במחזור הדם באמצעות דיכוי של ferroptosis המתווך על ידי Nrf2, ובכך מקדם גרורות5. Ketamine משרה ferroptosis בתאי קרצינומה של התאים הכבדיים על ידי בקרה של ציר lncPVT1/miR-214-3p/GPX4, מה שמרמז כי חומרי הרדמה יכולים להשפיע ישירות על קביעת גורל תאי הגידול6. בנוסף, benzodiazepines, כמודולטורים אלוסטריים חיוביים של רצפטורי GABA, עשויים להפחית את היעילות האנטי-גידולית של שילובי כימו-אימונותרפיה7. עם זאת, המחקר הנוכחי מתמקד בעיקר בחומרי הרדמה בודדים, וחסרה בו בחינה שיטית של השפעותיהם הפוטנציאליות ברמת רשת מטרות הגנים.

גנים będą targets לתרופות הקשורות להרדמה פרי-אופרטיבית (PARDTGs), כסובסטראטים מולקולריים ישירים של פעולת חומרי ההרדמה, משתתפים במספר מסלולי איתות מרכזיים, כולל ויסות קולטני מוליכים עצביים, שמירה על הומיאוסטזיס של סידן, דינמיקה של שלד התא מסיבי אקטין, ומשוב בציר העקה אנדוקריני8,9. תחת עיקה כירורגית פרי-אופרטיבית, מסלולים אלו עשויים להיות מופעלים או מדוכאים, ובכך להשפיע על קיטוב תאי מערכת החיסון ועל עיצוב מחדש של המיקרוסביבה הקשורה לגידול8,10. עם זאת, ב-OV, נוף הביטוי, המאפיינים הפונקציונליים והרלוונטיות הקלינית של PARDTGs נותרו עם אפיון דל. במקביל, הופעתם של scRNA-seq וטרנסקריפטומיקה מרחבית אפשרו פרופיל ביטוי גנים ברזולוציה תאית עם לוקליזציה מרחבית, ובכך סיפקו נקודות מבט חדשות על ההפצה המרחבית, ההעדפות המיקרוסביבתיות וההשפעות הספציפיות לתא של גנים המהווים מטרות להרדמה ברקמות גידוליות11.

במחקר זה, שילבנו PARDTGs עם מערכי נתונים מולטי-אומיים של OV, זיהינו באופן שיטתי גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי, ובנינו מודל סיכון פרוגנוסטי הניתן להכללה. ניתחנו לעומק את הבסיס הביולוגי של סיווג הסיכונים מנקודות מבט של חדירת תאי מערכת החיסון, מאפייני גזירות (stemness), נופי מוטציות ומסלולים פונקציונליים. באמצעות שילוב של נתוני רצף רב-מודאליים, הגדרנו מקורות של סוגי תאים ונישות אקולוגיות מרחביות, בנינו רשתות רגולטוריות של miRNA/גורמי שעתוק, וביצענו תיקוף פאן-סרטני כדי להוכיח משמעות חוצה-גידולים. עבודה זו מספקת ראיות מכניסטיות להבנת התפקיד הפוטנציאלי של רשתות מטרות הרדמה ב-OV ומציעה השלכות תרגומיות לסיווג סיכונים קליני, חיזוי פרוגנוסטי ואסטרטגיות לניהול פרי-אופרטיבי.

פרוטוקול

איסוף נתונים

סרקנו 120 גנים של מטרות תרופתיות הקשורות להרדמה פרי-אופרטיבית מתוך ספרות קודמת12 ופירטנו אותם ב-Supplementary Table S1. לאחר מכן, פרופילים של ביטוי גנים, מידע קליני ונתוני הישרדות הופקו ממשאב ה-UCSC Xena TCGA TARGET GTEx Toil recompute (http://xena.ucsc.edu/). מערך נתוני הביטוי כלל 420 דגימות ראשוניות של ovarian serous cystadenocarcinoma מתוך The Cancer Genome Atlas (TCGA-OV) ו-88 דגימות שחלה נורמליות מתוך פרויקט Genotype-Tissue Expression (GTEx). ערכי ביטוי הגנים הופקו כערכי RSEM gene-level FPKM שנוצרו על ידי ה-Toil pipeline13. תיאור מפורט של זרימת הדגימות הממחיש את הכללת דגימות TCGA עבור כל ניתוח המשך מופיע ב-Supplementary Table S2. בנוסף, לצורך תיקוף חיצוני, הורדנו את מערכי הנתונים GSE2619314 (n = 107 דגימות), GSE3016115 (n = 58 דגימות), ו-GSE6388516(n = 70 דגימות) ממאגר ה-GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) כדי לנתח את פרופילי ביטוי הגנים וההישרדות של החוליים התואמים. כדי להבטיח עקביות בנתונים, מזהי גנים של ENSEMBL הומרו לסמלי גנים רשמיים. גנים שביטוים הופיעו בפחות מחצית מהדגימות סוננו החוצה. בנוסף, השגנו את מערך נתוני הטרנסקריפטום של תא בודד לסרטן שחלה בבני אדם GSE15460017 ואת מערך נתוני הטרנסקריפטום המרחבי לסרטן השחלה GSE211956-GSM6506110-SP118 ממאגר ה-GEO.

עיבוד נתונים של רצף טרנסקריפטום מרחבי בסרטן השחלות

נתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית עובדו באמצעות Seurat19 (גרסה 5.4.0). נקודות (Spots) סוננו על פי אותם קריטריונים לבקרת איכות ששימשו בניתוח רצף ה-RNA של תאים בודדים (nFeature_RNA: 200–5,000; אחוז גנים מיטוכונדריאליים < 10%). לאחר נורמליזציה וזיהוי גנים בעלי שונות גבוהה, בוצעה הפחתת ממדים מבוססת PCA, והצבּרה (clustering) בוצעה באמצעות אלגוריתם ההצבּרה מבוסס הגרף של Seurat. תתי-קבוצות ותבניות ביטוי גנים הוצגו ויזואלית באמצעות הפונקציה SpatialFeaturePlot. בנוסף, רמות ביטוי גנים ברמת הטרנסקריפטום המרחבי הוצגו ויזואלית ונולתו באמצעות “AUCell”19 (גרסה 1.32.0).

ניתוח נתוני scRNA-seq

נתוני רצף RNA של תאים בודדים מ-GSE154600 נותחו באמצעות חבילת Seurat (גרסה 5.4.0)19. תאים באיכות נמוכה הוסרו על סמך קריטריונים של בקרת איכות. תאים עם פחות מ-200 או יותר מ-5,000 גנים שזוהו, או תאים שבהם שיעור הגנים המיטוכונדריאליים עלה על 10%, הוצאו מהניתוח. לאחר נורמליזציה באמצעות הפונקציה NormalizeData, זוהו 2,000 הגנים בעלי השונות הגבוהה ביותר באמצעות שיטת VST. בוצע PCA על בסיס הגנים המשתנים, ו-15 הרכיבים הראשיים הראשונים שימשו להקבצה (clustering) ולהפחתת ממדים. אשכולות תאים זוהו באמצעות FindNeighbors ו-FindClusters ברזולוציה של 0.5, ולאחריהם בוצעו ויזואליזציות באמצעות UMAP ו-t-SNE. הפונקציה FindAllMarkers שימשה לזיהוי גנים מסמנים (marker genes) עבור אשכולות תאים שונים. בנוסף, ביצענו אנוטציה לאשכולות התאים באמצעות מאגר הנתונים CellMarker 2.020 וביצענו ניתוח כמותי של פעילות גנים באמצעות פונקציית ssGSEA מחבילת GSVA (גרסה 2.4.9).

ניתוחי גנים המבטאים ביטוי שונה (DEG) וניתוחים פונקציונליים

ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בוצע באמצעות חבילת ה-“limma”21 (גרסה 3.56.2), בהתבסס על פרופילי הביטוי של PARDTGs בין רקמות של סרטן השחלה לרקמות שחלה נורמליות. לפני הניתוח, ערכי ביטוי FPKM עברו טרנספורמציה לוגריתמית (log2) באמצעות הנוסחה log2(FPKM+1). המודל הליניארי הסטנדרטי המיושם בחבילת limma שימש לזיהוי PARDTGs בעלי ביטוי דיפרנציאלי. גנים עם שיעור גילוי שגוי (FDR) < 0.05 ו- |log2 fold change (FC)| > 1 נחשבו כבעלי ביטוי דיפרנציאלי מובהק. העשרה של GO ו-KEGG בוצעה עבור PARDTGs בעלי ביטוי דיפרנציאלי באמצעות ClusterProfiler22 (גרסה 4.8.3). תרשימי Waterfall הופקו באמצעות “maftools”23 (גרסה 2.16.0) כדי לזהות מוטציות סומטיות ב-PARDTGs בסרטן השחלה. לאחר מכן, רשת PPI של PARDTGs הוקמה באמצעות מאגר STRING (גרסה 12.0) עם פרמטרי ברירת המחדל.

פיתוח של מערכת לניקוד סיכונים המבוססת על PARDTG

כדי לזהות את ה-PARDTGs האופטימליים, בוצע ניתוח רגרסיה של סיכונים פרופורציונליים של Cox בשיטה מדורגת (stepwise) כדי לסרוק גנים בעלי משמעות פרוגנוסטית מבין ה-PARDTGs שהביעו ביטוי דיפרנציאלי, ובכדי לקבוע את תרומתם להישרדות כללית בסרטן השחלה (OV). הנחת הסיכונים הפרופורציונליים של מודל רגרסיית Cox הרב-משתני הסופי נבדקה באמצעות מבחני שאריות של Schoenfeld שיושמו בפונקציה cox.zph של חבילת survival ב-R (גרסה 3.5.5). מדד סיכון פרוגנוסטי חושב על בסיס רמות הביטוי של גני החתימה ומקדמי רגרסיית Cox התואמים להם. בהינתן ההטרוגניות בין פלטפורמות טרנסקריפטומיות, מודלים פרוגנוסטיים הוערכו באופן בלתי תלוי בקבוצות TCGA-OV, GSE26193, GSE30161 ו-GSE63885. עבור כל קבוצה, פרופילי ביטוי של גני החתימה שימשו לחישוב מדדי סיכון ספציפיים לקבוצה, והחולים סווגו לקטגוריות של סיכון גבוה ונמוך תוך שימוש במדד הסיכון החציוני כנקודת חיתוך (cutoff). הישרדות כללית (OS) הושוותה בין שתי הקבוצות באמצעות ניתוח Kaplan–Meier, כאשר המובהקות הסטטיסטית נבדקה באמצעות מבחן log-rank. הערך הפרוגנוסטי הבלתי תלוי של מדד הסיכון הוערך לאחר מכן באמצעות ניתוחי רגרסיה של סיכונים פרופורציונליים של Cox, הן במישור החד-משתני והן במישור הרב-משתני.

פיתוח של מודל קליני פרוגנוסטי לסרטן השחלה

כדי לקבוע האם מדד הסיכון סיפק מידע פרוגנוסטי מעבר למשתנים קליניים קונבנציונליים, בוצעו ניתוחים של רגרסיית סיכונים פרופורציונלית של Cox חד-משתני ורב-משתני, ששילבו את מדד הסיכון יחד עם מאפיינים קליני פתולוגיים. לאחר מכן, נבנו נומוגרמות פרוגנוסטיות תוך שימוש במדד הסיכון המולקולרי ובמשתנים רלוונטיים קלינית, כגון שלב ודרגת הגידול, כפרמטרי קלט. המשתנים נבחרו על סמך הרלוונטיות הקלינית שלהם והמטרה של פיתוח מודל פרוגנוסטי משולב, ולא רק על סמך מובהקות סטטיסטית. הנומוגרמות הופקו באמצעות חבילת ה-“rms”24 (גרסה 6.7.1) כדי להעריך את ההסתברויות להישרדות כוללת למשך 1, 3 ו-5 שנים, בהסתמך על ציונים כוללים שנגזרו מהמשתנים האינדיבידואליים.

אפיון תכונות חיסוניות

הסנfiltration של תאי מערכת החיסון הוערך באמצעות אלגוריתם CIBERSORT עם מטריצת החתימות LM22. הניתוח בוצע באמצעות 1,000 פרמוטציות, ודגימות עם ערך P של דקונבולוציה < 0.05 נחשבו לאמינות מבחינה סטטיסטית. דיאגרמות מפל (Waterfall diagrams) הופקו באמצעות maftools (גרסה 2.16.0) כדי להדגים את השכיחות של גנים עם מוטציות רבות בסרטן השחלה. ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) בוצע באמצעות ClusterProfiler (גרסה 4.8.3) עם סף מובהקות של p < 0.05.

בניית רשת ceRNA

במחקר זה, נעשה שימוש ב-NetworkAnalyst 3.0 (https://www.networkanalyst.ca/)25 כדי לנתח את האינטראקציה בין גנים פרוגנוסטיים לבין גורמי שעתוק (transcription factors). רשת הבקרה המשותפת של miRNA-TF נבנתה באמצעות NetworkAnalyst 3.0.

דגימות רקמה של סרטן השחלה

רקמות של קרצינומה שחלותית ודגימות תואמות של רקמה נורמלית סמוכה (N = 6) נאספו מחולות שעברו כריתה כירורגית מתוכננת. פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של מחלקת המיילדות & בית החולים לגינקולוגיה של אוניברסיטת פודאן (2024-54-X1), והסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים. מחקר זה נערך בהתאם להצהרת הלסינקי.

ניתוח Western blot

חלבון כולל הופק מדגימות רקמה אנושיות באמצעות תמיסת ליזיס RIPA המכילה phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), תערובת מעכבי פרוטאז ומעכבי פוספטאז. ריכוזי החלבון נמדדו באמצעות בדיקת חלבון bicinchoninic acid (BCA). כמויות שוות של חלבון הופרדו באמצעות SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) לפני העברתן לממברנות polyvinylidene fluoride (PVDF). לאחר ההעברה, הממברנות נחסמו למשך 90 min בטמפרטורת החדר עם 5% חלב דל שומן שהוכן ב-TBS-T. לאחר מכן, הממברנות דוגרו למשך הלילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד Cytokeratin 81 (rabbit polyclonal, 1:2,000) או GAPDH (mouse monoclonal, 1:10,000). לאחר שטיפה, הופעלו הנוגדנים המשניים המתאימים למשך 90 min בטמפרטורת החדר. פסי חלבון הודגמו באמצעות רכיב זיהוי enhanced chemiluminescence (ECL) ונלכדו באמצעות מערכת הדמיה מסחרית. ניתוח דנסיטומטרי בוצע בתוכנת ImageJ, וביטוי KRT81 נורמל מול בקרת הטענה של GAPDH. הבדלים בביטוי חלבון בין דגימות מזווגות הוערכו באמצעות paired t-test, כאשר P < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

ניתוח פאן-סרטני (Pan-cancer analysis)

במחקר זה, נעשה שימוש ב-TCGAplot26 (גרסה 5.0.0) כדי לזהות את הקשרים בין רמות הביטוי של KRT81. ניתוח מתאם פירסון שימש לחישוב המתאמים הסטטיסטיים. הפרופיל המוטציוני של KRT81 בסוגי סרטן שונים נבחן באמצעות פלטפורמת cBioPortal (http://www.cbioportal.org/) (גרסה 7.0.6).

ניתוחים סטטיסטיים

כל ניתוחי הנתונים בוצעו באמצעות תוכנת R (גרסה 4.3.1). השוואות בין שתי קבוצות בוצעו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum, בעוד שהבדלים בין שלוש קבוצות או יותר הוערכו באמצעות מבחן Kruskal–Wallis. הישרדות כוללת נותחה בשיטת Kaplan–Meier, ומובהקות סטטיסטית בין עקומות הישרדות נקבעה באמצעות מבחן log-rank. אלא אם צוין אחרת, ערך P דו-זנבי < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית. רמות המובהקות מסומנות באופן הבא: P < 0.05 *, P < 0.01 **, P < 0.001 ***, ו-P < 0.0001 ****.

תוצאות

מאפיינים חיסוניים של גנים המהווים מטרות תרופתיות הקשורות להרדמה פרי-אופרטיבית בניתוחים מרחביים ובניתוחים טרנסקריפטומיים של תא בודד

SCTransform שימש לתיקון עומק הריצוף ולביצוע הפרוצדורות, ובסופו של דבר זיהה 11 סוגי תאים שונים. כדי להעריך את החשיבות של גנים המהווים מטרות לתרופות הקשורות להרדמה פרי-אופרטיבית (PARDTGs) בכל תת-אוכלוסייה של תאים, השתמשנו בחבילת ה-R ש-AUCell כדי לקבוע את הפעילות הקשורה ל-PARDTG בכל תת-אוכלוסייה של תאים (איור 1A,B). לאחר מכן, חישבנו את המתאם בין שכיחות התאים לבין הפעילויות הקשורות ל-PARDTG בכל הלוקוסים באמצעות מתאם הדרגות של Spearman. ראוי לציין כי פעילויות הקשורות ל-PARDTG היו במתאם שלילי עם תאי גידול (איור 1C). השגנו נתוני ריצוף RNA של תא בודד מ-5 חוליות עם OV, הכוללים סה"כ 41,367 תאים. על בסיס ביטוי של גנים מסמנים, התאים סווגו ל-11 צבירי תאים מרכזיים (איור 1D). רשתות האינטראקציה והחוזק עבור סוג התאים מוצגים ב-איור 1E. הערכנו את פעילות ה-PARDTG בכל התאים הבודדים על ידי דירוג הביטוי של 120 PARDTGs באמצעות ssGSEA ב-Seurat (איור 1F). באופן בולט, תאי גידול הראו פעילות נמוכה באופן ניכר מכל שאר סוגי התאים (איור 1G).

זיהוי ואפיון מולקולרי של גנים המהווים מטרות לתרופות הקשורות להרדמה פרי-אופרטיבית בסרטן השחלה

מתוך מאגר הנתונים TCGA, זיהינו 68 גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי הקשורים להרדמה פרי-אופרטיבית (PARDTGs), המוצגים ב-איור 2A (ראו גם טבלה משלימה S3). איור 2B מתאר את הביטוי של 68 גנים אלו בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEGs) הקשורים להרדמה פרי-אופרטיבית בקוהורט TCGA-OV. לאחר מכן, בנינו רשת PPI כדי להבהיר את הקשרים המורכבים בין חלבונים הקשורים ל-DEGs. זיהינו חמישה גנים מרכזיים (hub genes) פוטנציאליים — SLC6A4, CHRNA4, DRD2, SLC6A3, ו-GRIN2A — שעשויים להיות בעלי השפעות חשובות בפתוגנזה של סרטן השחלה (איור 2C). יתר על כן, חקרנו את פרופיל השינויים המולקולרי של 120 PARDTGs בסרטן השחלה, כאשר מוטציות nonsense היו סוג הווריאנט השכיח ביותר (איור 2D). הגנים עם שיעור המוטציות הגבוה ביותר היו SCN10A, DNMT1, GRIN2A, LTF, ו-SCN11A. בחנו את השכיחות של מוטציות מספר עותקים (CNV), והתוצאות גילו כי 20 ה-PARDTGs המובילים עם מוטציות הפגינו שינויי CNV משמעותיים (איור 2E). העשרת GO ו-KEGG הצביעה על כך ש-PARDTGs קשורים לאיתות ליגנדים נוירו-אקטיביים, נתיבי איתות סידן, איתות הורמונלי, התמכרות לאמפטמינים, התמכרות לקוקאין ואינטראקציות בין ליגנדים נוירו-אקטיביים לרצפטורים (איור 2F,G).

בנייה ותיקוף של מודל פרוגנוסטי המבוסס על גנים שהם מטרות של תרופות הקשורות להרדמה פרי-אופרטיבית

על מנת לצמצם את מורכבות המודל, נעשה שימוש ב-StepAIC להפחתת מערך הגנים, ובסופו של דבר נשמרו 17 PARDTGs לבניית המודל הפרוגנוסטי (Supplementary Table S4). מבחן שאנפלד (Schoenfeld) הגלובלי של השאריות לא הראה סטייה משמעותית מהנחת הסיכונים הפרופורציונליים (p = 0.265), מה שתומך באמינות של המודל הפרוגנוסטי בעל 17 הגנים. מדד הסיכון חושב באמצעות המשוואה הבאה: risk score = ADRA1D*(0.4452) + ADRB1*(-0.5347) + CHRNA4*(0.3495) + DBH*(-0.5765) + EPHA4*(0.2827) + EPHA7*(-0.5707) + EPHA8*(0.8765) + GABRB2*(0.5979) + GRIN2A*(-0.1750) + GRIN2D*(0.2746) + KCNA1*(2.2753) + KRT81*(0.1101) + OPRD1*(-3.2372) + SLC6A2*(1.4901) + SLC18A1*(4.2170) + SLC18A2*(-1.4600) + CHRNA1*(-0.1723). לאחר מכן, חולים חולקו לקטגוריות של סיכון נמוך וסיכון גבוה בהתאם למדדי הסיכון שלהם, כאשר קבוצת הסיכון הנמוך הראתה OS משופר באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הסיכון הגבוה ב-TCGA-OV (Figure 3A, p < 0.0001), בקוהורט GSE26193 (Figure 3B, p = 0.00021), בקוהורט GSE30161 (Figure 3C, p = 0.0017), ובקוהורט GSE63885 (Figure 3D, p = 0.0041). יתרה מכך, Figure 3E–H ממחישות את התפלגויות סטטוס ההישרדות ומדדי הסיכון בקוהורטות TCGA-OV, GSE26193, GSE30161 ו-GSE63885, ובכך מספקות ראיות עצמאיות ליציבות ולאמינות החיזוית של המודל הפרוגנוסטי ב-OV.

הקמה והערכה של מודל הישרדות מבוסס נומוגרמה

ניתוחי רגרסיית Cox חד-משתניים ורב-משתנים הדגימו כי מדד הסיכון שימש כגורם ניבוי עצמאי לפרוגנוזה בחוליות עם סרטן השחלה (איור 4A,B). התפלגות ביטוי הגנים של המודל, מדדי הסיכון התואמים והמאפיינים הקליניקופתולוגיים בעקבת TCGA-OV מוצגים באיור 4C. כדי לשפר את היישום הקליני, הוקם נומוגרם פרוגנוסטי המשלב את מדד הסיכון יחד עם גיל, שלב הגידול ודרגתו, להערכת ההישרדות הכוללת (OS) (איור 4D). בהשוואה לחתימה הגנטית לבדה, הנומוגרם המשולב השיג ביצועי ניבוי מעולים. ניתוח הישרדות הראה עוד OS ארוך באופן מובהק בקבוצת הסיכון הנמוך מאשר בקבוצת הסיכון הגבוה (איור 4E; P < 0.0001). המודל המשולב הניב ערכי AUC תלויי-זמן של 0.769, 0.690 ו-0.728 לניבוי OS (איור 4F). ניתוח עקומות החלטה תמך בתועלת הקלינית הפוטנציאלית של הנומוגרם על ידי הדגמת תועלת נטו גבוהה יותר על פני טווח של הסתברויות סף (איור 4G). יתרה מכך, גרפי כיול הצביעו על התאמה הדוקה בין הסתברויות ההישרדות החזויות לאלו שנצפו, מה שמעיד על כיול טוב של המודל (איור 4H). יחד, תוצאות אלו מעידות כי לנומוגרם המוצע יש יכולת ניבוי חזקה להערכת הפרוגנוזה של חוליות עם OV.

הקשר בין המודל הפרוגנוסטי המבוסס על PARDTG לבין חדרות חיסונית ומיקרו-סביבת החיסון של הגידול

כדי לאפיין את ההסנפירה החסונית, נכמתה השפעות של תאי מערכת החיסון על פני הדגימות. שבעה-עשר גנים זוהו כבעלי קשר מובהק לתאי מערכת חיסון המסתננים לגידול, ביניהם ADRA1D, KCNA1, ו-SLC18A2 הראו מתאמים חיוביים עם מקרופאגים מסוג M2 (איור 5A). לאחר מכן חקרנו את דפוסי הלוקליזציה התאית של גנים אלו. ניתוח dot plot גילה כי KRT81 התבטא בעיקר בתאי CD8Tex ו-Tprolif, בעוד שהביטוי של EPHA4 היה מועשר בעיקר בתאי אנדותל ובפיברובלסטים, מה שמרמז על מעורבותם הפוטנציאלית במדור תאיים מובחנים בתוך מיקרו-סביבת הגידול (איור 5B). בנוסף, הערכנו את מדדי ה-TIDE של המטופלים והבחנו כי לתת-אשכולה בעל הסיכון הגבוה היו מדדי TIDE גבוהים יותר ומתאם חיובי (איור 5C). יתרה מכך, מדדי העשרה של stemness היו גבוהים באופן מובהק בקבוצת הסיכון הגבוה מאשר בקבוצת הסיכון הנמוך (איור 5D). ניתוח מוטציות סומטיות גילה תדירות מוטציות כללית גבוהה בשתי קבוצות הסיכון (איור 5E,F). מתוחן, תדירויות המוטציות של CSMD3 ו-MUC16 היו גבוהות יותר בדגימות בסיכון גבוה.

ניתוח GSEA גילה כי מסלולים הקשורים למערכת החיסון, כולל עיבוד והצגת אנטיגנים ודחיית השתלה, היו מועשרים באופן משמעותי בקבוצת הסיכון הנמוך, בעוד שמסלולים הקשורים לפלישה ותנועתיות של גידולים, כגון ויסות של שלד האקטין, פרוטאוגליקנים בסרטן וחלבונים מוטוריים, היו מועשרים בעיקר בקבוצת הסיכון הגבוה (איור 5G,H). ממצאים אלו מרמזים כי מטופלים בקבוצת הסיכון הגבוה עשויים להפגין תגובה מוגבלת לאימונותרפיה.

זיהוי וניתוח רשתות של PARDTGs פרוגנוסטיים בסרטן השחלה

על מנת להבהיר את המנגנון, זיהינו 490 miRNAs ו-17 רשתות ויסות פוטנציאליות של סמנים ביולוגיים (איור 6A). ביניהם, ל- hsa-miR-27a-3p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-106b-5p ו- hsa-miR-20b-5p יש פוטנציאל לווסת את מרבית הגנים. בסופו של דבר, תוצאות המחקר שלנו זיהו 37 גורמי שעתוק שוויסתו את הגנים המועמדים לאבחון (איור 6B). בנוסף, נמצא כי ל- FOXC1 ישנן מספר פונקציות ויסות.

ניתוח של ביטוי KRT81 במגוון סוגי סרטן (Pan-cancer)

נתוני RNA-seq מ-TCGA הושגו כדי להעריך את ביטוי KRT81. התוצאות העלו כי הוא מבוטא ברמה גבוהה ברוב סוגי הסרטן, אך מבוטא ברמות נמוכות ב-GBM, LGG, SKCM, TGCT ו-THCA (איור 7A). כדי לאמת את התוצאה לפיה KRT81 מבוטא ברמה גבוהה בסרטן השחלה, כפי שנקבע בניתוח ביואינפורמטי, ביצענו ניסוי western blot. התוצאות הצביעו על כך שביטוי KRT81 היה מוגבר משמעותית ברקמות גידול בהשוואה לרקמות נורמליות, וכי הוא עולה במידה רבה עם נתוני הטרנסקריפטומיקה של TCGA (איור 7B, איור משלים S1, וטבלה משלימה S5). כדי להדגים את הקשרים בין KRT81 לסרטן, בחנו את ביטוי הגנים ואת חדירת תאי מערכת החיסון (איור 7C). הניתוח גילה כי ביטוי KRT81 נמצא במתאם חיובי עם חדירה של תאי T, Tregs ומקרופאגים מסוג M2 ברוב סוגי הסרטן. בנוסף, ביטוי KRT81 נמצא בקשר חיובי עם ציוני הסטרומה והחיסון ברוב סוגי הסרטן (איור 7D). יתרה מכך, ניתחנו את המתאם בין ביטוי KRT81 לבין מדד aneuploidy, ומתרשים הרדאר הראה כי KRT81 נמצא במתאם עם מדד aneuploidy ב-UCEC, SARC, LUAD, LIHC ו-KIRP (איור 7E). לאחר מכן ניתחנו את המתאם בין KRT81 לבין פלואידיות הגידול, ותרשים הרדאר הראה כי KRT81 נמצא במתאם עם פלואידיות הגידול ב-THCA, TGCT, SARC, MESO, LIHC ו-CESC (איור 7F). לאחר מכן, תרשים הרדאר הראה כי KRT81 נמצא במתאם עם SNV Neoantigens ב-UCEC, THYM, LUAD, LIHC, GBM ו-BRCA (איור 7G). יתר על כן, ניתוח מקוון ב-cBioPortal גילה כי השכיחות הגבוהה ביותר של מוטציה בגן KRT81 הייתה ב-UCEC, כאשר רוב הסוגים היו "מוטציה" ו"הגברה" (Amplification) (איור 7H,I). באמצעות ניתוח רגרסיית סיכונים פרופורציונלית של Cox חד-משתנית, זיהינו כי KRT81 מהווה מדד לניבוי OS ב-KIRC, LUAD ו-STAD (איור 7J).

זמינות נתונים:

מאגרי נתונים הזמינים לציבור שנותחו במחקר זה זמינים ב-TCGA, UCSC Xena ו-GEO. תמונות western blot המקוריות והנתונים הכמותיים התואמים שהופקו במהלך מחקר זה מופיעים בחומרי ההשלמה (Supplementary Figure S1 ו-Supplementary Table S5).

ניתוח טרנסקריפטומיקה מרחבית: מפות חום של ביטוי גנים, תרשימי מתאם, רשתות אינטראקציה בין תאים.
איור 1. מאפיינים הקשורים ל-PARDTG בניתוח מרחבי וב-scRNA-seq. (A,B) מיפוי מרחבי של עוצמת הביטוי של PARDTG (C), מתאם Spearman של פעילות הקשורה ל-PARDTG. (D) ניתוח של סוגי תאים. (E) ניתוח של מספר ועוצמת האינטראקציות בין סוגי תאים. (F) ערך העשירה של PARDTG בתאים. (G) התפלגות ה-PARDTG. קיצורים: PARDTG = perioperative anesthesia-related drug target genes; scRNA-seq = single-cell RNA sequencing. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים Volcano, מפת חום, תרשים רשת לניתוח ביטוי גנטי; נתוני מוטציות, CNV ומסלולים.
איור 2. נוף השינויים הגנטיים של PARDTGs בחוליות OV. (A) ויזואליזציה מסוג Volcano של ה-DEGs ב-OV (כחול: DEGs עם ביטוי מופחת; אדום: DEGs עם ביטוי מוגבר; אפור: גנים יציבים), FDR< 0.05 ו-|log2FC| > 1. (B) מפת חום הממחישה מאפיינים בעלי ביטוי שונה בין קבוצת ה-OV לקבוצה הנורמלית. כחול מייצג את הקבוצה הנורמלית, אדום מייצג את קבוצת ה-OV, ריבוע כחול מייצג ביטוי נמוך, וריבוע צהוב מייצג ביטוי גבוה. (C) רשת PPI של DEGs הקשורים להרדמה פרי-אופרטיבית, כפי שהופקה מאתר String. (D) 20 ה-PARDTGs המובילים בקוהורט TCGA. (E) שכיחות של הגברה ב-CNV, אובדן ב-CNV, ולא-CNV בקרב 20 ה-PARDTGs המובילים. (F) תרשים dotplot של GO עבור מונחי GO מועשרים. (G) תרשים עמודות של מסלולי KEGG מועשרים. OV = ovarian cancer; GO = Gene Ontology; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; PPI = protein–protein interaction. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

תרשימי ניתוח הישרדות קפלן-מייר המשווים נתוני זמן למאורע לצורך סיווג סיכונים של חולים.
איור 3. בנייה ותיקוף של חתימה פרוגנוסטית מבוססת PARDTG לסרטן השחלה. (A-D). OS בחולים בסיכון נמוך ובסיכון גבוה ב- (A) TCGA-OV, (B) GSE26193, (C) GSE30161, (D) GSE63885. (E-H) התפלגות ציון הסיכון הקשור ל-PARDTG באמצעות סטטוס ההישרדות והזמן ב- (E) TCGA-OV, (F) GSE26193, (G) GSE30161, (H) GSE63885. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח פרוגנוזה של סרטן באמצעות נומוגרמה; יחסי סיכון (hazard ratios), מפת חום, עקומת הישרדות, ROC, כיול.
איור 4בנייה ותיקוף של נומוגרמה פרוגנוסטית המבוססת על חתימת סיכון שנגזרה מ-PARDTG. (א, ב) המאפיינים הקליני פתולוגיים ומדדי הסיכון בקוהורט ה-TCGA-OV. (Cההפצה של מאפיינים קליניים והביטוי של גנים של המודל לפי ציון סיכון.ד'נומוגרמה לניבוי פרוגנוזה בחולות OV.ה_) ניתוחי קפלן-מייר עבור שתי קבוצות OV. (פֿ) ניתוח עקומת ROC ב-TCGA-OV. (ג'ניתוח עקומת החלטה (DCA) מראה את התועלתH נטו של הנומוגרמה ומאפיינים קליניים אחרים.ה( גרפי כיול מראים הישרדות כוללת (OS) ב-TCGA-OV. קיצורים: ROC = מאפיין תפעול של מקבל (receiver operating characteristic); DCA = ניתוח עקומת החלטה (decision curve analysis). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

מתאם ביטוי גנים במפת חום, תרשים נקודות ותרשים כינור, המציגים ניתוח סיכונים ותדירויות מוטציות.
איור 5. ניתוח מיקרו-סביבת הגידול בחולים עם סיכון נמוך וגבוה. (A) מתאם בין תאי חיסון המסננים את הגידול לבין גנים במודל הפרוגנוסטי הקשור ל-PA. (B) תרשים בועות המראה את הביטוי הממוצע והפרופורציה של סמנים פרוגנוסטיים בתתי-סוגי תאים שונים. (C) תרשים כינור של מדדי TIDE. (D) תרשים כינור של מדדי העשרה של stemness בגידול. (E,F) תרשים מפל המציג מאפייני מוטציות סומטיות בקטגוריות של (E) סיכון נמוך ו-(F) סיכון גבוה. (G,H) תוצאות GSEA של מסלולי KEGG בתת-קבוצת (G) סיכון נמוך ובתת-קבוצת (H) סיכון גבוה. קיצורים: TIDE = Tumor Immune Dysfunction and Exclusion; GSEA = Gene Set Enrichment Analysis. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים רשת אינטראקציית גנים הממחיש קשרי גנים ומסלולי קישוריות מורכבים.
איור 6ניתוח רשת אינטראקציות של סמנים פרוגנוסטיים. (A( רשת בקרה משותפת של סמנים פרוגנוסטיים מסוג miRNA. (Bרשת רגולציה משותפת של גורמי שעתוק ומסמנים פרוגנוסטיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מחקר סממנים ביולוגיים לסרטן; גרפים ומפות חום; סממני גידול, ביטוי גנים, ניתוח סטטיסטי.
איור 7. רמת ביטוי, מאפיינים חיסוניים ושינויים גנטיים של KRT81 בגידולי אדם. (A) ביטוי KRT81 בגידולי TCGA וברקמות סמוכות. (B) ניתוח Western blot של ביטוי חלבון KRT81 ברקמות נורמליות סמוכות ובגידולים מזווגים מששת מטופלים עם סרטן השחלה (n = 6). עצימויות פס יחסיות נורמלו ל-GAPDH, והנתונים נותחו באמצעות paired t-test. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD.   (C) מתאם בין KRT81 ליחס תאי החיסון מוצג במפת חום. (D) מתאם בין KRT81 לבין מדדי חיסון, סטרומה ו-ESTIMATE, מוצג במפת חום. (E-G) מתאם בין ביטוי KRT81 לבין (E) Aneuploidy Score, (F) Tumor Ploidy, (G) SNV Neoantigens במאגרי נתוני TCGA. (H) מוטציות ב-KRT81 בסוגי סרטן שונים ממאגר הנתונים cBioPortal. (I) התפלגות אתרי מוטציה של KRT81 ב-pan-cancer. (J) ניתוח רגרסיית Cox של KRT81 ב-Pan-cancer על פני סרטני TCGA. *p < 0.05; ***p < 0.001; ****p < 0.0001. קיצורים: SNV = Single Nucleotide Variant; N = נורמלי; T = גידול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה S1: גנים będą מטרה לתרופות הקשורות להרדמה פרי-אופרטיבית. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית S2: תיאור זרימת הדגימות.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה S3: גנים המהווים מטרות לתרופות הרדמה פרי- ואנטרה-אופרטיביים המבטאים ביטוי Differentially expressed.נא לחץ כאן להורדת הקובץ.

טבלה משלימה S4: גנים של מטרות תרופתיות הקשורים להרדמה פרי-אופרטיבית בעלי ערך פרוגנוסטי.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה נלווית S5: נתוני מקור של Western blot.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים S1: נתונים מקוריים של western blotting.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

כמרכיב בלתי נמנע מזרימות העבודה של טיפול בסרטן, הרדמה פרי-אופרטיבית עוררה תשומת לב גוברת בשל השפעותיה האימונו-מודולטוריות הפוטנציאליות, יכולתה לעיצוב מחדש של המיקרו-סביבה, והפוטנציאל שלה לקדם את התפשטות הגידול. ככל שסרטן מוכר יותר욱 כדלקת סיסטמית ואקולוגית ולא כנגע מוקדי המונע אך ורק על ידי גנים27, הפרה פיזיולוגית פרי-אופרטיבית, תגובות דלקתיות ומעקה מטבולי עשויים לעצב מחדש נישות מיקרו-סביבתיות ולהשפיע על מסלולי האבולוציה של הגידול. באמצעות אינטגרציה של טרנסקריפטום רב-שכבתי, מחקר זה תיאר באופן שיטתי את דפוסי הביטוי, הקשרים הביולוגיים והערך הפרוגנוסטי של PARDTGs ב-OV, ובכך סיפק רמזים פוטנציאליים להרדמה מדויקת פרי-אופרטיבית.

פרופיל טרנסקריפטומי מרחבי וברמת התא הבודד הדגישו שונות מרחבית ניכרת בפעילות של PARDTG, שהראתה פעילות מופחתת בתאי אפיתל של הגידול ופעילות מוגברת בתאים חיסוניים, אנדותליים ופיברובלסטים. תבנית זו של "העשרה בתאים שאינם תאי גידול" מרמזת כי רשת המטרה של חומר ההשכרה עשויה להפעיל את השפעותיה בעיקר על ידי ויסות מצבים של תאי סטרומה ותאי מערכת החיסון, ולא באמצעות מנגנונים פנימיים ישירים של תאי הגידול. תצפית זו עולה בקנה אחד עם התפיסה כי התקדמות הגידול מעוצבת במשותף על ידי תאי הגידול וסביבתם המיקרוסקופית במארח28. באופן בולט, דלקת חריפה המושרית על ידי ניתוח, דיכוי חיסוני זמני ושכתוב רקמות עשויים ליצור סביבה מיקרוסקופית קצרת מועד של ריפוי פצעים, אותה גידולים יכולים לנצל כדי להגביר את הסיכון להתפשטות ולהישנות29.

ניתוח נוסף של קוהורט ה-TCGA זיהה 68 PARDTGs עם ביטוי דיפרנציאלי המועשרים באופן משמעותי באינטראקציות של ליגנד-רספטור נוירו-אקטיביים, באיתות סידן ובמסלולים הקשורים להתמכרות. רשת ה-PPI שנבנתה הדגישה מספר גנים מרכזיים (hub genes) הקשורים למשאיבים ורספטורים של תמסורת עצבית, כגון DRD2, SLC6A3, ו-SLC6A430, מה שמרמז על תרומה רגולטורית נוספת של איתות נוירוטרנסמיטורים פרי-אופרטיביים בהתקדמות של OV. עבודה מהעת האחרונה הדגימה כי האנטגוניסט ל-DRD2, ONC206, מדכא פרוליפרציה ופלישה בתאי OV ובמודלים של עכברים טרנסגניים, ומשרה עצירה של מחזור התא ואפופטוזיס, דבר המדגיש את הפוטנציאל הטיפולי של ציר זה. CHRNA4 ו-GRIN2A מקודדים לחלבון רספטור כולנרגי ולחלבון הקשור לרספטור NMDA, בהתאמה; הפעלה של רספטורים אלו מקלה על זרימה תוך-תאית של Ca2⁺31,32, בעוד שהפרעה ברמות הסידן יכולה לעצב מחדש את השלד התאי ולהפעיל תוכניות שעתוק המעודדות גידול33. בנוסף, רספטורים הקשורים להתמכרות (למשל, רספטורים אופיואידיים מסוג µ) נקשרו להפעלת mTORC1 ולהתחמקות ממערכת החיסון34. יחד, ממצאים אלו מרמזים על קשר פוטנציאלי (crosstalk) בין מסלולי מטרה של חומרי הרדמה לבין הרשת הפרי-אופרטיבית של סטרס–נוירו–אימונו, ובכך משפיעים על פלסטיות הגידול ועל הסיכון לחזרה תוך כדי חלון פרי-אופרטיבי קצר.

מודל הסיכון בעל 17 הגנים הפגין ביצועי פרוגנוזה יציבים במספר קהלי מחקר עצמאיים. חולים בסיכון גבוה הראו העשרה במסלולים כגון “Regulation of actin cytoskeleton” ו-“Proteoglycans in cancer”, המרמזים על עיצוב מחדש מוגבר של השלד התאי ופוטנציאל מטאסטטי. פרופיל חיסוני חשף פרופורציות גבוהות יותר של מקרופאגים מסוג M2, ביטוי מוגבר של גנים הקשורים לנקודות בקרה חיסוניות (immune checkpoint), ומדדי TIDE גבוהים יותר בקבוצת הסיכון הגבוה. מקרופאגים מסוג M2 מקדמים חמיקה חיסונית, והפעלה דלקתית לאחר ניתוח עשויה להוביל לגיוס של תאים מדכאי חיסון ממקור מיאלואידי (MDSCs)35. באופן בולט, EPHA4 בוטא בעיקר בתתי-אוכלוסיות של תאי אנדותל ופיברובלסטים, דבר המצביע על מעורבותו הפוטנציאלית בבקרה וסקולרית, עיצוב מחדש של הסטרומה ואינטראקציות בסביבת הגידול. EPHA4 הוא חבר במשפחת קינאז הטירוזין של רצפטורי Eph ופועל כמתווך חשוב של תקשורת בין-תאית באמצעות סיגנל Eph/ephrin. הפעלתו של EPHA4 יכולה לווסת מסלולים זרימים המעורבים בארגון מחדש של השלד התאי, היצמדות תאים, נדידה וארגון המטריצה החוץ-תאית36. בסביבת הגידול, סיגנל לא מווסת של EPHA4 נקשר לקידום פלישת תאי גידול, תגובות אנגיוגניות, הפעלת סטרומה ואינטראקציות בין תאים ממאירים למרכיבי הסטרומה הסובבים37. ממצאים אלו מרמזים כי EPHA4 עשוי לתרום למאפיינים הביולוגיים האגרסיביים של חולים בסיכון גבוה על ידי ויסות התקשורת וסקולרית-סטרומלית ועיצוב מחדש של האקולוגיה של הגידול. במקביל, חולים בסיכון גבוה הראו תדירויות מוטציות גבוהות יותר בגנים כגון MUC16 ו-CSMD3, המעורבים באינטראקציות סטרומליות ובחמיקה חיסונית38,39. יחד, נראה כי חולים בסיכון גבוה מראים מאפיינים אקולוגיים ממאירים המתאפיינים בדינמיקה לא מווסתת של השלד התאי, סביבות מיקרו-חיסוניות מדכאות ועיצוב מחדש של המטריצה, מה שמצביע על כך ש-PARDTGs עשויים להיות קשורים לשינויים באקולוגיה של הגידול ולהתקדמות המחלה.

חומרי הרדמה עשויים לתכנת מחדש ביטוי של מספר גנים באמצעות מודולציה של רשתות RNA שאינן מקודדות, ובכך להשפיע על היצמדות תאי גידול, נדידה, עמידות לאפופטוזיס ושמירה על תכונות גזעיות (stemness), דבר שעשוי לשנות את הסיכון להישנות לאחר ניתוח40,41. ברשת הבקרה המרכזית שלנו של miRNA וגורמי שעתוק, miR-27a-3p, miR-34a-5p, ו-miR-106b-5p זוהו כמרכזי בקרה (regulatory hubs) פוטנציאליים, וראיות רבות תומכות במעורבותם בהתקדמות של OV ובתגובות פרמקולוגיות הקשורות להרדמה42,43,44. FOXC1, כגורם שעתוק מרכזי, ממלא תפקיד קריטי בקידום נדידה, פלישה ופנוטיפים של EMT ב-OV, והוא מווסת במעלה הזרם (upstream) על ידי מספר RNA שאינם מקודדים45.

ניתוח פאן-סרטני (Pan-cancer) בוצע כדי לחקור לעומק את המאפיינים הביולוגיים של KRT81 בסוגים שונים של גידולים ממאירים, ולא כדי לתקף את המודל הפרוגנוסטי לסרטן השחלה. בניתוח שלנו, KRT81 היה בעל ביטוי מוגבר (upregulated) באופן משמעותי ברוב סוגי הסרטן והיה במתאם עם אנאפלואידיות, חדירה חיסונית ומדדי סטרומה, מה שמרמז על מעורבות בעיצוב מחדש של הנישה האקולוגית ובחמקמקות חיסונית. כחבר במשפחת הקראטינים מסוג II, KRT81 מעורב בשמירה על שלמות השלד התאי האפיתליאלי, יציבות מכנית תאית והסתגלות למתח. ביטוי לא מווסת של KRT81 עשוי להשפיע על הפלסטיות של תאי הגידול על ידי השפעה על ארגון השלד התאי, דיפרנציאציה אפיתליאלית ואינטראקציות בין תאי הגידול לסביבה המיקרוסקופית המקיפה אותם. יתרה מכך, עיצוב מחדש אנומלי של קראטין נקשר להתקדמות הסרטן באמצעות ויסות של שגשוג תאים, נדידה, פלישה ותקשורת חיסונית-סטרומלית. מחקרים קודמים דיווחו כי KRT81 משמש כסמן ביולוגי לסיווג תתי-סוגים חיסוניים ושכוב פרוגנוסטי ב-OV46, ותורם להיווצרות סביבה מיקרוסקופית מדכאת חיסון ולניבוי תגובה לאימונותרפיה בסרטן שדיים שלישי-שלילי47. לפיכך, KRT81 עשוי להוות צומת מרכזית ברשתות הפלסטיות של הגידול בתקופה הפרי-אופרטיבית, בעלת רלוונטיות מכניסטית וטרנסלציונית.

בסיכומו של דבר, מחקר זה מספק את האפיון הראשון של אקולוגיית הביטוי של PARDTGs ברמה המרחבית וברמת התא הבודד ב-OV, ומדגים את הקשרים שלהם עם מיקרו-סביבות חיסוניות, מאפייני גזעיות (stemness) וחוסר יציבות גנומית, מה שמרמז כי גנים המהווים מטרות לתרופות הקשורות להרדמה פרי-אופרטיבית עשויים להיות קשורים למסלולי אבולוציה של הגידול. עם זאת, יש להכיר במספר מגבלות. ראשית, מחקר זה התבסס בעיקר על סטים של נתוני טרנסקריפטומיקה הזמינים לציבור, והבדלים במקורות הדגימות, בפלטפורמות הריצוף ובמאפייני הקוהורטות עלולים להביא לאפקטים של אצוות (batch effects) ולהשפיע על חוסנו של הממצאים. שנית, למרות שנעשה שימוש בקוהורטות חיצוניות לצורך תיקוף, המודל הפרוגנוסטי פותח מנתונים רטרוספקטיביים, ולא ניתן לשלול לחלוטין התאמת-יתר (overfitting) פוטנציאלית עקב גישות לבחירת מאפיינים. שלישית, למרות שניתוחים טרנסקריפטומיים של תא בודד וניתוחים מרחביים סיפקו תובנות לגבי התפקידים הביולוגיים של PARDTGs, ממצאים אלו התבססו בעיקר על הסקה חישובית ודורשים תיקוף ניסיוני נוסף. בנוסף, חלק מהניתוחים הגששיים, כולל ניתוחי פאן-סרטן וניתוחי קורלציה חיסונית, כללו השוואות מרובות, ויש לפרש קשרים פוטנציאליים של חיוביים-שגויים בזהירות. לבסוף, הרזולוציה המרחבית המוגבלת של הטרנסקריפטומיקה והיעדר תיקוף פונקציונלי של הרשתות הרגולטוריות החזויות מהווים מגבלות נוספות. מחקרים עתידיים המשלבים מודלים ניסיוניים ודגימות קליניות נדרשים כדי לתקף עוד יותר את המנגנונים שזוהו.

מחקר זה חשף כי PARDTGs ממלאים תפקידים אקולוגיים תעתוקיים חשובים ב-OV ועשויים להשתתף בפלישה ובהימנעות חיסונית המונעות על ידי המיקרו-סביבה לאחר הניתוח, ובכך מספקים ראיות מולקולריות חדשות להרדמה מדויקת סביב הניתוח, לסיווג סיכונים ולמניעת הישנות.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים

תודות

אנו מודים בכנות לחוקרים ששיתפו את מאגרי הנתונים היקריים שלהם במאגרי הנתונים TCGA ו-GEO, כולל TCGA-OV, GSE26193, GSE30161, GSE63885, GSE154600 ו-GSE211956.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן Anti-Cytokeratin 81 (ארנב פוליקלונלי)Proteintech, USA11342-1-AP
נוגדן Anti-GAPDH (מונוקלונלי לעכבר)Proteintech, USA60004-1-Ig
ערכה לבדיקת חלבון BCAThermo Fisher, USA23225
CIBERSORTאוניברסיטת סטנפורדhttps://cibersort.stanford.eduהסננה החיסונית | מטריצת חתימות LM22 | ניתוח הסננה של תאי מערכת החיסון
מאפיינים קליניים של חולי OVUCSC Xenahttp://xena.ucsc.edu/נתונים קליניים | 341 חולים | ניתוח קורלציה קלינית
חבילת clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfilerניתוח העשרה פונקציונלית | גרסה 4.8.3 | ניתוחי GO, KEGG ו-GSEA
חבילת ggplot2CRANhttps://cran.r-project.org/package=ggplot2ויזואליזציה של נתונים | גרסה 4.0.2 | ויזואליזציה של נתונים
GSE26193מאגר הנתונים GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE26193סט נתוני תיקוף | 107 דגימות | תיקוף חיצוני
GSE30161מאגר הנתונים GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE30161סט דאטה לתיקוף | 58 דגימות | תיקוף חיצוני
GSE63885מאגר הנתונים GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE63885סט נתונים לאימות | 70 דגימות | אימות חיצוני
חבילת GSVABioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVAניתוח העשרה של קבוצות גנים | גרסה 2.4.9 | ניתוח ssGSEA
חבילת limmaBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/limma/ניתוח ביטוי דיפרנציאלי | גרסה 3.56.2 | ניתוח DEG
מידע על הישרדות כוללת של חולי OVUCSC Xenahttp://xena.ucsc.edu/נתוני הישרדות | 353 חולים | בניית מודל פרוגנוסטי
ממברנת PVDFMillipore, USAIPVH00010
RR Foundation for Statistical Computinghttps://www.r-project.org/תוכנה לביואינפורמטיקה | גרסה 4.3.1 | ניתוחים סטטיסטיים
בופר RIPABeyotime, סיןP0013B
חבילת SeuratCRANhttps://satijalab.org/seurat/ניתוח תאיים בודדים | גרסה 5.4.0 | ניתוח single-cell RNA-seq
מאגר המידע STRINGקונסורציום STRINGhttps://string-db.orgמאגר נתוני אינטראקציית חלבונים | גרסה 12.0 | בניית רשת PPI
ערכת הישרדותCRANhttps://cran.r-project.org/package=survivalניתוח הישרדות | גרסה 3.5.5 | ניתוח הישרדות
נתוני ביטוי גנים של שחלה מ-TCGA, TARGET ו-GTEx (Toil)UCSC Xenahttp://xena.ucsc.edu/סט נתונים לאימון | 420 דגימות גידול מ-TCGA | קוהורטת אימון
נתוני רקמה נורמלית של שחלה מ-TCGA, TARGET ו-GTEx (Toil)UCSC Xenahttp://xena.ucsc.edu/סט נתונים נורמלי למסמך ייחוס | 88 דגימות נורמליות מ-GTEx | ניתוח ביטוי דיפרנציאלי

מקורות

  1. Caruso G, Weroha SJ, Cliby W. Ovarian cancer: a review. JAMA. 2025;334(14):1278-91.
  2. Konstantinopoulos PA, Matulonis UA. Clinical and translational advances in ovarian cancer therapy. Nat Cancer. 2023;4(9):1239-57.
  3. Horowitz M, Neeman E, Sharon E, Ben-Eliyahu S. Exploiting the critical perioperative period to improve long-term cancer outcomes. Nat Rev Clin Oncol. 2015;12(4):213-26.
  4. Piegeler T, Beck-Schimmer B. Anesthesia and colorectal cancer: the perioperative period as a window of opportunity. Eur J Surg Oncol. 2016;42(9):1286-95.
  5. Zhang B, et al. Anesthetic propofol inhibits ferroptosis and aggravates distant cancer metastasis via Nrf2 upregulation. Free Radic Biol Med. 2023;195:298-308.
  6. He GN, et al. Ketamine induces ferroptosis of liver cancer cells by targeting lncRNA PVT1/miR-214-3p/GPX4. Drug Des Devel Ther. 2021;15:3965-78.
  7. Montégut L, et al. Benzodiazepines compromise the outcome of cancer immunotherapy. Oncoimmunology. 2024;13(1):2413719.
  8. Wall T, Sherwin A, Ma D, Buggy DJ. Influence of perioperative anaesthetic and analgesic interventions on oncological outcomes: a narrative review. Br J Anaesth. 2019;123(2):135-50.
  9. Ponferrada A, et al. Anaesthesia and cancer: can anaesthetic drugs modify gene expression? Ecancermedicalscience. 2020;14:1080.
  10. Piegeler T, et al. Endothelial barrier protection by local anesthetics: ropivacaine and lidocaine block tumor necrosis factor-α-induced endothelial cell Src activation. Anesthesiology. 2014;120(6):1414-28.
  11. Xu J, et al. Single-cell RNA sequencing reveals the tissue architecture in human high-grade serous ovarian cancer. Clin Cancer Res. 2022;28(16):3590-602.
  12. Yu D, et al. Development and validation of a breast cancer survival prediction model based on perioperative anesthesia-related drug target genes and analysis of immune microenvironment and drug sensitivity. Comput Biol Chem. 2026;120(Pt 2):108681.
  13. Wang S, et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 2022;38(2):527-9.
  14. Gentric G, et al. PML-regulated mitochondrial metabolism enhances chemosensitivity in human ovarian cancers. Cell Metab. 2019;29(1):156-73.e10.
  15. Ferriss JS, et al. Multi-gene expression predictors of single-drug responses to adjuvant chemotherapy in ovarian carcinoma: predicting platinum resistance. PLoS One. 2012;7(2):e30550.
  16. Lisowska KM, et al. Gene expression analysis in ovarian cancer: faults and hints from DNA microarray study. Front Oncol. 2014;4:6.
  17. Liang L, et al. Integration of scRNA-seq and bulk RNA-seq to analyse the heterogeneity of ovarian cancer immune cells and establish a molecular risk model. Front Oncol. 2021;11:711020.
  18. Denisenko E, et al. Spatial transcriptomics reveals discrete tumour microenvironments and autocrine loops within ovarian cancer subclones. Nat Commun. 2024;15(1):2860.
  19. Quan W, et al. Single-cell analysis reveals the roles and regulatory mechanisms of type I interferons in Parkinson’s disease. Cell Commun Signal. 2024;22(1):212.
  20. Hu C, et al. CellMarker 2.0: an updated database of manually curated cell markers in human/mouse and web tools based on scRNA-seq data. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D870-6.
  21. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  22. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284-7.
  23. Mayakonda A, et al. Maftools: efficient and comprehensive analysis of somatic variants in cancer. Genome Res. 2018;28(11):1747-56.
  24. Zu S, et al. Development and validation of a recurrence risk prediction model for elderly schizophrenia patients. BMC Psychiatry. 2025;25(1):73.
  25. Zhou G, et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):W234-41.
  26. Liao C, Wang X. TCGAplot: an R package for integrative pan-cancer analysis and visualization of TCGA multi-omics data. BMC Bioinformatics. 2023;24(1):483.
  27. Swanton C, et al. Embracing cancer complexity: hallmarks of systemic disease. Cell. 2024;187(7):1589-616.
  28. Vendramin R, Litchfield K, Swanton C. Cancer evolution: Darwin and beyond. EMBO J. 2021;40(18):e108389.
  29. Demicheli R, et al. The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations. Ann Oncol. 2008;19(11):1821-8.
  30. Marinho V, et al. Genetic influence alters the brain synchronism in perception and timing. J Biomed Sci. 2018;25(1):61.
  31. Pan X, et al. Hepatocyte CHRNA4 mediates the MASH-promotive effects of immune cell-produced acetylcholine and smoking exposure in mice and humans. Cell Metab. 2023;35(12):2231-49.e7.
  32. Camp AJ, et al. Loss of Grin2a causes a transient delay in the electrophysiological maturation of hippocampal parvalbumin interneurons. Commun Biol. 2023;6(1):952.
  33. Sun Y, et al. Identification of potential diagnoses based on immune infiltration and autophagy characteristics in major depressive disorder. Front Genet. 2022;13:702366.
  34. Lennon FE, Moss J, Singleton PA. The µ-opioid receptor in cancer progression: is there a direct effect? Anesthesiology. 2012;116(4):940-5.
  35. Mohammadpour H, et al. β2-adrenergic receptor-mediated signaling regulates the immunosuppressive potential of myeloid-derived suppressor cells. J Clin Invest. 2019;129(12):5537-52.
  36. Bhatia S, et al. Effects of altered ephrin-A5 and EphA4/EphA7 expression on tumor growth in a medulloblastoma mouse model. J Hematol Oncol. 2015;8:105.
  37. Dong Y, et al. MicroRNA-335 suppresses the proliferation, migration, and invasion of breast cancer cells by targeting EphA4. Mol Cell Biochem. 2018;439(1-2):95-104.
  38. Li X, Pasche B, Zhang W, Chen K. Association of MUC16 mutation with tumor mutation load and outcomes in patients with gastric cancer. JAMA Oncol. 2018;4(12):1691-8.
  39. Zhao Y, et al. Patient-derived ovarian cancer organoid carries immune microenvironment and blood vessel keeping high response to cisplatin. MedComm (2020). 2024;5(9):e697.
  40. Jiang S, et al. Effects of propofol on cancer development and chemotherapy: potential mechanisms. Eur J Pharmacol. 2018;831:46-51.
  41. Wang ZT, et al. Propofol suppresses proliferation and invasion of pancreatic cancer cells by upregulating microRNA-133a expression. Genet Mol Res. 2015;14(3):7529-37.
  42. Li E, Han K, Zhou X. MicroRNA-27a-3p downregulation inhibits malignant biological behaviors of ovarian cancer by targeting BTG1. Open Med (Wars). 2019;14:577-85.
  43. Zhang Y, et al. Sevoflurane inhibits the apoptosis of hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocytes via regulating miR-27a-3p-mediated autophagy. J Pharm Pharmacol. 2021;73(11):1470-9.
  44. Zhao H, et al. Sevoflurane inhibits migration and invasion of glioma cells via regulating the miR-34a-5p/MMP-2 axis. Life Sci. 2020;256:117897.
  45. Wu Z, et al. Circ-PTK2 (hsa_circ_0008305) regulates the pathogenic processes of ovarian cancer via the miR-639 and FOXC1 regulatory cascade. Cancer Cell Int. 2021;21(1):277.
  46. Hu Y, et al. DNA methylation and transcription factor-driven immune subtypes in ovarian cancer. Discov Oncol. 2025;16(1):1646.
  47. Yan Z, et al. The prognostic marker KRT81 is involved in suppressing CD8+ T cells and predicts immunotherapy response for triple-negative breast cancer. Cancer Biol Ther. 2024;25(1):2355705.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.