מאמר שיטה

מדידת תיקון שברים דו-גדיליים ב-DNA באמצעות בדיקת DR-white ב-Drosophila melanogaster

58 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72635

⸱

14 באוגוסט 2026

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

במאמר זה

סיכום

בדיקת DR-white היא בדיקת דוח (reporter) גנטית רב-גונית לזיהוי תוצאות תיקון של שברים דו-גדיליים ב-DNA באורגניזם רב-תאי מסוג Drosophila melanogaster.

תקציר

מחקרים מסורתיים בתיקון שברים דו-גדיליים (DSB) של DNA מוגבלים לעיתים קרובות לחקירות ביוכימיות או למערכות חד-תאיות (למשל, תאים, שמרים). כדי להקל על מחקרים של תיקון DSB באורגניזם רב-תאי, אנו משתמשים בבדיקת ה-DR-white ב-Drosophila melanogaster. בדיקת ה-DR-white היא בדיקת דגמי-דיווח (reporter assay) פשוטה אך ורסטילית לתיקון DSB, הנושאת רצף זיהוי יחיד של I-SceI, שניתן לחתוך על ידי ביטוי של המגנוקלאז I-SceI. ניתן להשרות ביטוי של I-SceI באופן קוסטטיבי, באמצעות הלם תרמי, או תחת פרומוטורים אחרים, מה שמאפשר חקירה של תיקון ספציפי לרקמה או לשלב התפתחותי. יתרון מרכזי של הבדיקה הוא שהיא יכולה להבחין בין תוצאות תיקון הכוללות רקומבינציה הומולוגית (HR), חיבור קצוות לא הומולוגי (NHEJ) וחיבור גדיל יחיד (SSA). מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לבדיקת ה-DR-white המבוססת, כולל תהליך עבודה שלב-אחר-שלב להשראת DSBs בקו הנבט הפרה-מיוטי וניתוח תופעתי של אירועי התיקון על ידי דירוג צאצאים. הוא מתאר גם ניתוח מולקולרי של אירועי תיקון באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ריצוף, וסקריפט R של Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). פרוטוקול זה מספק כלי שימושי לחקירת המנגנונים הגנטיים והמולקולריים של תיקון DNA במודל אורגניזמי.

מבוא

השלמות הגנומית מאוימת תכוף על ידי נגעים ב-DNA, שביניהם שברים של שני הגדילים (DSBs) הם רעילים במיוחד. אם שברים אלה אינם מתוקנים, הם עלולים להוביל לאובדן גנטי, לארגון מחדש של כרומוזומים ולמוות של תאים1. לכן, תאים פיתחו מסלולים מרובים לתיקון DSBs. חיבור קצוות לא הומולוגי (NHEJ) מחבר ישירות את שני הקצוות של ה-DSB, מה שעלול להוביל להכנסת indels באתר השבר; חיבור גדיל בודד (SSA) מנצל רצפים משלימים המקיפים את אתר השבר לצורך תיקון, מה שגורם למחיקות באתר השבר; בעוד שרקומבינציה הומולוגית (HR) משתמשת ברצף הומולוגי כתבנית לתיקון2,3.

היסטורית, מחקרים של תיקון DSB היו מוגבלים לבדיקות ביוכימיות4 או למערכות של תא בודד, כגון חיידקים5,6, שמרים7,8, ותרביות תאי יונקים9,10. בעוד שמודלים אלו היו מכריעים בזיהוי חלבוני תיקון מרכזיים ומנגנוניהם, הם חסרים את המורכבות הביולוגית של אורגניזם רב-תאי. Drosophila melanogaster הפכה למודל רב-תאי פופולרי לחקר תיקון DNA. עם זאת, בדיקות רבות כיום מותאמות למסלולי תיקון ספציפיים11; משתמשות בסטיות כרומוזומליות גדולות, כגון חיתוך P-element12; או דורשות ניתוחים מולקולריים הגוזלים זמן רב13. בדיקת ה-DR-white נותנת מענה לאתגרים אלו על ידי אספקת רפורטר גנטי פשוט לתיקון DNA ב-Drosophila14. מחקר זה מספק סבב עבודה מלא, מעשי ומפורט שלב אחר שלב לביצוע בדיקות גנטיות ומולקולריות למדידת תיקון DNA DSB באמצעות בדיקת ה-DR-white המוכרת.

הבדיקה משתמשת בשני חזרות ישירות של ה- דרזופילה לבן (והגן, המקנה את צבע העין האדום של סוג הבר (wild-type) (איור 1). שני העותקים אינם תפקודיים: הראשון, Sce.whiteמכיל השבלה הנושאת את רצף הזיהוי של המגנוקליאז I-SceI באתר SacI מסוג בר (wild-type) ומחדירה קודון עצירה מוקדם; השני, לבן, קטוע הן בקצה '5 והן בקצה '3 ומשמש כתבנית לתיכון באמצעות רקומבינציה הומולוגית (HR). A דרוזופילה צהוב טרנסגן (י+), המקנה את צבע הגוף החום של סוג הבר (wild-type), נמצא בין השניים לבן חזרות. מאחר ש-DR-לבן הקסטה משולבת בתוך נראה שהטקסט שהזנת אינו מכיל תוכן לתרגום. אנא ספק את הטקסט המדעי באנגלית שברצונך לתרגם לעברית. רקע מוטנטי, DR-לבן הזבובים הם בעלי פנוטיפ של גוף חום מסוג בר ועיניים לבנות מוטנטיות.

ניתן להשרות DSBs ב-Sce.white על ידי הכלאת זבובים מסוג DR-white עם זבובים הנושאים טרנסגן I-SceI. ניתן למדוד תיקון של DSBs בקו הנבט הפרה-מיוטי על ידי דירוג צאצאים של הכלאת בדיקה. תיקון על ידי NHEJ מוביל לפנוטיפ ההורי של גוף חום ועיניים לבנות (איור 1A), בעוד שתיקון על ידי HR משחזר את רצף ה-white של הטיפוס הפראי ומוביל לצאצאים בעלי גוף חום ועיניים אדומות (איור 1B). תיקון SSA של ה-DSB או קרוס-אובר מיטוטי מובילים לאובדן של טרנסגן ה-yellow המתווך, מה שגורם לזבובים בעלי גוף צהוב ועיניים לבנות (איור 1C). כדי לנתח את תוצאות התיקון בתאים סומטיים, התאמנו את אלגוריתם ה-Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) לזיהוי NHEJ עם עיבוד ותיקון HR באופן ספציפי בבדיקת DR-white 15,16.

בדיקת ה-DR-white מציעה מספר יתרונות על פני בדיקות תיקון DNA שבוססו בעבר ב-Drosophila. מכיוון שהשברים נוצרים ומתוקנים בקו הנבט, ניתן לזהות את תוצאות התיקון בקלות באמצעות אנליזה פנוטיפית. במקביל, הבדיקה היא ורסטילית ביותר. בעוד שהבדיקה תוכננה בעיקר למדידת תיקון מסוג HR, היא יכולה לזהות את שלושת נתיבי התיקון. פיתחנו בנוסף שתי תבניות תיקון פונקציונליות נוספות (איור 2). תבנית ה-iwhite.mu מכילה 28 פולימורפיזמים של נוקלאיד בודד (SNPs) שקטים ויוצרת צאצאים בעלי עיניים אדומות (איור 2A), מה שמקל על מחקרים של אורכי מקטעי המרת גנים (GCT) ותיקון HR בין רצפים מובחנים14. תבנית ה-iwhiteΔ9 מכילה מחיקה של תשעה זוגות בסיסים באתר SacI מסוג wild-type וגורמת לצאצאים בעלי עיניים כתומות (איור 2B). תכונה זו מאפשרת לחוקרים לעקוב אחר תיקון HR מתבניות נפרדות, תכונה הייחודית לבדיקת ה-DR-white15.

פרוטוקול

1. בדיקת DR-white

  1. הכלאות גנטיות (איור 3A)
    הערה: עבור סטנדרטי דרוזופילה לפרוטוקולי תרבית וגנטיקה, פנה אל "דחיפת זבובים: התאוריה והפרקטיקה של גנטיקה של Drosophila" מאת Ralph J. Greenspan17מידע על הגנוטיפ של המאגר מסופק ב- טבלת חומרים.
    1. יש לשמור את הזבובים בטמפרטורה של 25 °C במחזורי אור/חושך של 12 שעות על מצע סטנדרטי בקרב זבוב הפירות (Drosophila) מזון, מפחוח בשמרים פעילים.
    2. הכינו חמישה מבחנות להלם תרמי על ידי העברת 8–10 DR-לבן נקבות בתולות ל-3–5 זכרים הנושאים I-SceI טרנסגן (הכלאה 1, איור 3A) לכל מבחנה.
      הערה: שונה I-SceI ניתן להשתמש בטרנסגנים בהתאם ליישום. בפרוטוקול זה, ה- hsp70-I-SceI הטרנסגן שימש להשראה באמצעות הלם תרמי11כדי למנוע דליפה I-SceI ביטוי בדורות מוקדמים יותר, חשוב לוודא ש-DR-לבן ו- I-SceI הטרנסגנים משולבים באותה זבוב רק בדור זה.
    3. באותו היום, הכין בקבוקי הרחבה של a נא לספק את טקסט המקור באנגלית לתרגום. מלאי. אלו יהיו זבובים לבדיקה (tester flies). שלושה בקבוקי הרחבה מספיקים לכ-60–80 הכלאות בדיקה.
    4. תרביתו מבחנות הלם תרמי ו- y w בקבוקי הרחבה ב-25 °C למשך 3 ימים.
    5. ביום השלישי, הפכו את מבחנות ההלם התרמי ו- י ו בקבוקי הרחבה למזון טרי שישמשו כסט גיבוי.
  2. השראת הלם תרמי/שבירה דו-גדילית (DSB)
    הערה: אם לא נעשה שימוש במערכת הניתנת להשראה על ידי הלם תרמי I-SceI טרנסגן, דלגו לשלב 1.2.5, שמתבצע בדרך כלל 3 ימים לאחר שלב 1.1.5.
    1. המתינו עם מבחנות ההלם התרמי במשך 3 שעות ב-25 °C כדי להבטיח שכל הצאצאים עברו את המעבר האימהי-זיגוטי.
    2. בצעו הלם חום למבחנות המקוריות באמבט מים בטמפרטורה של 38 °C למשך שעה אחת. ודאו שגובה המים מגיע לפחות עד לתחתית כדור הצמר, כדי שהזחלים לא יזחלו מעל קו המים.
    3. יש לנטר את טמפרטורת מקבץ המים בכל 15 דקות ולשמור אותה על 38 ± 0.5 °C, כיוון שתוצאות ההשראה והתיקון תלויות במשך ובטמפרטורה של הלם החום.
    4. החזירו את המבחנות לטמפרטורה של 25 °C.
    5. ביום למחרת, הוסיפו למזון שליש ממגבון מעבדה מקופל כדי לספוג לחות עודפת. אם המזון יבש, הוסיפו כ-100 µL של מים למגבון המעבדה. הוסיפו פתיל צמר גפן ל- y w בקבוקי התרחבות.
    6. טרבטו את המבחנות שעברו הלם תרמי למשך 6 ימים נוספים ב-25 °C, או עד שהזבובים יתחילו לבקוע.
    7. יש לנקות את מבחנות הגיבוי ובקבוקי ההתרחבות 3 ימים לאחר ההפיכה. יש להוסיף כדור צמר למבחנת הגיבוי. y w בקבוקי הרחבה כ-4 ימים לאחר הפינוי.
      הערה: במידת הצורך, ניתן לבצע הלם תרמי למבחנות גיבוי כפי שמתואר בשלבים 1.2.1 עד 1.2.6 ולעבד אותן כפי שמתואר להלן.
  3. הכלאות מבחן
    1. אספו זבובים שעברו הלם תרמי הנושאים את ה-DR-לבן ו- I-SceI טרנסגנים למשך 4–5 ימים לאחר תחילת הבקיעה כדי להפחית את ההטיה של שלבי הפיתוח.
      הערה: זבובים שעברו הלם תרמי בהצלחה ונושאים את DR-לבן ו- I-SceI הטרנסגן נוכח עם עיניים פסיפסאיות (mosaic eyes) עקב אירועי תיקון בשלבים העובריים והזחליים שהתפתחו לרקמות בוגרות. מידת הפסיפסאיות אינה תואמת תמיד לאירועי תיקון בקו הנבט, ולכן אין לראות בה גורם מכריע בבחירת זבובים ניסיוניים להכלאות בדיקה (שלב 1.3.3).
    2. אסוף y w נקבות בתולות למשך 5 ימים. אסוף 5 נקבות בתולות עבור כל מספר דגימות צפוי. אסוף מבקבוקי הרחבה רזרביים ברגע שהן מתחילות בבקיעה.
    3. הכינו מבחנות בדיקה על ידי הצלבת זכר אחד שעבר הלם תרמי עם 4–5 y w נקבות בתולות (הכלאה 2; איור 3A). בחרו זכרים באופן אקראי מתוך המאגר המאוחד משלב 1.3.1 כדי לצמצם הטיות הנובעות משלב ההתפתחות. גדלו את הצלבי הבדיקה (tester crosses) בטמפרטורה של 25 °C.
      הערה: כדי למנוע הצטלבות של DR-לבן ו- I-SceIבדרך כלל מנתחים קווי נבט זכריים; עם זאת, ניתן לנתח גם צאצאים נקביים. במקרה של ניתוח צאצאים נקביים, מבקיאים מבחנות בדיקה של הכלאה 2 ביחס של 2:5 נקביות:y w יחס זכרים ותירגול למשך 5–6 ימים (השלב הבא) כדי להבטיח פרודוקטיביות.
    4. בדקו את הפרודוקטיביות 4 ימים לאחר הכנת מבחנות הבדיקה כדי להעריך מתי יש לפנות אותן.
      הערה: יש לוודא שהוטלו מספיק ביצים כדי להבטיח לפחות 20 צאצאים שניתן לדירוג, אך אין לאפשר לתרביות לגדול יתר על המידה, שכן הזבובים עלולים להידבק למצע המזון.
    5. כאשר מבחנות הבדיקה מוכנות (עד 4–5 ימים לאחר הקמת הכלאות הבדיקה), יש להסיר את הזבובים ולהוסיף למצע המזון שליש ממגבון מעבדה מקופל כדי לספוג לחות עודפת.
      הערה: ניתן לאסוף זכרים בשלב זה במידה ונדרשים ניתוחים נוספים (כלומר, גנוטיפיקה מולקולרית).
    6. דגרו את מבחנות הבדיקה למשך 5–6 ימים נוספים בטמפרטורה של 25 °C.
  4. דירוג
    הערה: עבור כל תנאי בכל ניסוי גנטי (למשל, מוטנטים הומוזיגוטים וביקורות הטרוזיגוטית), מוכנים כ-25 מבחנות בדיקה. כל ניסוי גנטי חוזר על עצמו 2–3 פעמים, והנתונים מכל מבחנה נקבצים יחד.
    1. דרג את הצאצאים של הכלאה 2 (איור 3Aבמשך כ-9 ימים לאחר תחילת הבקיעה של הזבובים הראשונים.
    2. הרדמת זבובים באמצעות CO22 או על ידי העברת הזבובים למבחנה ריקה ללא מזון והקפאה בטמפרטורה של 20°C- למשך 30 דקות לפחות.
      הערה: אם הזבובים הוקפאו, ניתן לבצע את הדירוג (scoring) עד מספר ימים מאוחר יותר.
    3. הניחו את הזבובים על משטח זבובים (fly pad) ובדקו אותם לאיתור פנוטיפים מתאימים (איור 3A). הכלילו במערך הנתונים רק מבחנות שבהן נספרו לפחות 20 זבובים.
      1. על מנת לבצע את הדירוג, יש תחילה למיין את הזבובים הנושאי את ה-DR-לבן קסטה (תוך שימוש בפלואורסצנציה של חלבון פלואורסצנטי אדום חיובי [RFP+] כסמן), ולאחר מכן יש לבחון ולדרג את צבע העין והגוף.
      2. ה- י+ טרנסגן מקושר ל-DR-לבן הקסטה גורמת לצבע גוף חום בינוני שאינו מסוג ברי מלא. כדי להבחין בין היעדר DSB/NHEJ (גוף חום; י+ ו-) ו-SSA (גוף צהוב; y- ו-), השווה זבובים ל- y w צאצאים שאינם בעלי ה-DR-לבן כרומוזום (RFP-). לאירועי SSA יהיה אותו גוון צהוב כמו לזבובים אלה. סווג זבובים כהים יותר (חומים יותר) מאלה כ-No DSB/NHEJ.
        הערה: סטיות מהפנוטיפים המתוארים ב- איור 3A עשוי להעיד על זיהום, ובמקרה זה אין לבצע סקורינג של המבחנה. ניתן לבצע סקורינג לזבובים מתים שלמים, אך יש להשליך זבובים פגומים אם לא ניתן לקבוע את הפנוטיפים שלהם.

2. ניתוח TIDE (איור 4)

  1. מיצוי DNA גנומי (gDNA)18
    1. אסוף זבובים (או זחלים) שעברו הלם תרמי ונושאים הן את DR-לבן ו- I-SceI טרנסגן, כפי שמופיע בצאצאים של הכלאה 1 (איור 3A).
    2. העבירו זבובים בודדים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ובצעו הקפאה מהירה (flash freeze) (למשל, באמבט של קרח יבש ואתנול או בחנקן נוזלי).
      אזהרה: יש לטפל בקרח יבש, חנקן נוזלי, אתנול, איזופרופנול ובכימיקלים אחרים תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים ובהתאם לנהלי הבטיחות המוסדיים.
      נקודת עצירה:  ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של 80°C- ולעבד אותן מאוחר יותר במידת הצורך. בבחינת זבובים או זחלים, יש להשתמש בזבוב אחד או בזחל אחד לכל דגימה. בבחינת רקמות קטנות יותר (למשל, מוחות, דיסקים אימגינליים), יש לאגregate דגימות כדי להגדיל את תבואת ה-DNA.
    3. הומוגניזרו כל דגימה ב-50 µL של Buffer A (100 mM Tris-Cl, pH 7.5; 100 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA]; 100 mM sodium chloride; 0.5% sodium dodecyl sulfate [SDS]) באמצעות הומוגנייזר חשמלי.
    4. דגרו את הדגימות במקלט מים בטמפרטורה של 65 °C למשך 30 דקות.
    5. הוסיפו 100 µL של Buffer B (1.4 M אצטט פוטסיום, 4.3 M ליתיום כלוריד) לכל דגימה וערבבו קצרה על ידי היפוך המבחנות.
      הערה: בשימוש בזבובים שלמים, ייתכן שיידרשו נפחים גדולים יותר כדי להומוגניזציה מלאה של הדגימות. במקרה כזה, יש לשמור על יחס נפחי של 1:2 בין Buffer A ל-Buffer B.
    6. דגרו את הדגימות על קרח למשך 30 דקות לפחות.
    7. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של כ-16,000 x ג במשך 15 דקות ב-4 °C.
    8. העבירו 125 µL של עליון (supernatant) צלול למבחנות מיקרוצנטריפוגה חדשות בנפח 1.5 מ"ל. הימנעו מהעברת משקעים כלשהם.
    9. הוסיפו 100 µL של איזופרופנול 100% בטמפרטורת החדר לכל 125 µL של עליון (supernatant), וערבבו קצרות על ידי הפיכת המבחנות.
    10. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של כ-16,000 x ג' במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    11. שאבו את הנוזל העליון (supernatant), תוך הקפדה לא להפריע למשקע ה-DNA.
      הערה: ייתכן שמשקע ה-DNA לא יהיה נראה בשלב זה. שימו לב לכיוון השפופרות בעת הכנסתן למיקרוצנטריפוגה, ובצעו שאיבה מהצד הנגדי למקום שבו צפוי להימצא המשקע.
    12. שטפו את המשקעים עם 250 µL של אתנול 70% קר (בטמפרטורת קרח), ולאחר מכן ערבבו קצרה על ידי הפיכה עדינה של המבחנות.
    13. סובב את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של כ-16,000 x ג' במשך 5 דקות ב-4 °C.
    14. שאבו את הנוזל העליון (supernatant), תוך הקפדה שלא להפריע למשקע (pellet).
      הערה: המשקע עשוי להיות נראה בבירור יותר לאחר השטיפה באתנול. אם לא, רשאי/ראו הערה עבור שלב 2.1.11.
    15. השאירו את המבחנות ללא פקק בטמפרטורת החדר כדי לאפשר התאיידות של שאריות אתנול. הימנעו מייבוש יתר של המשקע, שכן הדבר עלול למנוע את המסה המלאה שלו.
    16. הוסיפו 20 µL של מים נקיים מנוקלאז (nuclease-free water) והניחו למשקעים להתרחב (reconstitute) למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.
      נקודת עצירה: אם משקע ה-DNA לא התמוסס לחלוטין, ניתן להוסיף מים.
    17. בשלב הבא, למחרת, הפו בעדינות את המבחנות ומדדו את ריכוז ה-DNA. במידה והדגימות אינן מעובדות באופן מיידי, יש לאחסן אותן בטמפרטורה של 20°C-.
      הערה: עבור מיצוי מזבוב בודד, התנובה היא בדרך כלל כ-100 ננוגרם למולילטר (ng/µL). דגימות באיכות גבוהה הן חשובות.260/A280 הבליעה צריכה להיות בין 1.7 ל-2.0. ערכים מחוץ לטווח זה מעידים על מזהמים כגון חלבונים. A260/A230 הערך צריך להיות בין 2.0 ל-2.2. ערכים מחוץ לטווח זה מעידים על מזהמים כגון אתנול ומלחים של תמיסת בופר. דגימות בעלות תנובת נמוכה ואיכות ירודה עלולות להוביל להגברה לקויה של PCR.
  2. תגובת שרשרת פולימראז (PCR)
    1. הגברה לרוחב Sce.white באמצעות PCR תוך שימוש ב-100 ננוגרם של gDNA ובפריימרים DR-לבן_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) ו-DR-לבן_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) בהתאם להוראות היצרן. כלול DR-לבן דגימת זבוב ביקורת (כלומר, DR-לבן מלאי הורי, ללא I-SceI (הטרנסגן נוכח). השתמשו בתנאי המחזור הבאים: 94 °C למשך 3 דקות; {94 °C למשך 30 שניות; touchdown ב-66 °C (בשיעור של 0.5 °C- למחזור) למשך 30 שניות; 72 °C למשך 30 שניות} x 16 מחזורים; {94 °C למשך 30 שניות; 58 °C למשך 30 שניות; 72 °C למשך 30 שניות} x 20 מחזורים; 72 °C למשך 5 דקות; שמירה ב-12 °C.
      הערה: במידה ובשימוש בריאגנט אחר, ייתכן שיהיה צורך להתאים את תנאי המחזור.
    2. הרץ כ-2 µL מתוצר ה-PCR על ג'ל אגרוז אבחנתי בריכוז של 1% בבופר tris-acetate-EDTA (TAE), כדי לאשר את הגבירתו של Sce.לבןגודל האמפליקון הצפוי הוא כ-1.7 kb.
    3. טיהור PCR Sce.white אמפליקונים ומדידת ריכוז ה-DNA.
    4. בצע ריצוף של תוצר PCR מנוקה באמצעות הפריימר DR-לבן_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC).
      הערה: בדרך כלל אנו מרצפים 40 ננוגרם (ng) של תוצר PCR מטוהר, אך נתון זה עשוי להשתנות בהתאם להוראות של שירות הריצוף.
  3. ניתוח TIDE
    הערה: ניתן לייחס את מרבית השגיאות הנובעות מהשימוש בסקריפט TIDE R לעיצוב קוד שגוי.
    1. הורידו את חבילות ה-R הנדרשות (כלומר, sangerseqR ו-Biostrings) מ-Bioconductor.org. השתמשו בשורת החיפוש כדי לאתר את הגרסה העדכנית ביותר של כל חבילה.
    2. נתחו כרומטוגרמות של רצפים כדי לוודא שהן באיכות טובה. נתחו רק כרומטוגרמות עם רקע מועט או ללא רקע לפני אתר השבירה.
    3. הורידו את קובצי ה-trace של הרצף (בסיומת קובץ .ab1) והניחו את כל קובצי ה-trace של הרצף בתיקייה אחת במחשב. פשטו את שמות קובצי הרצף ככל האפשר (לדוגמה, F1, Het2, Hom3) כדי להקל על עריכת הסקריפטים בשלבים הבאים.
    4. פתחו את סקריפט ה-R של TIDE (קובץ נלווה 1) בסביבת הפיתוח המשולבת (IDE; ראו את ה-) RStudio טבלת חומרים). בחלונית המקור (Source pane), אתר את השורה המתחילה ב-Control <- (קובץ משלים 2A) והזינו את שם הקובץ של רצף הביקורת בדיוק כפי שנשמר, כולל סיומת ה-.ab1, בתוך מרכאות.
      הערה: "רצף הביקורת" הוא רצף ה-PCR מה-DR- ההורילבן מלאי ללא I-SceI טרנסגן או אינדוקציה.
    5. אתר את השורה המתחילה ב-samplename <- הקלידו (c( והזינו את שם הקובץ של רצף כל דגימה בתוך הסוגריים (קובץ משלים 2A). כלול את הסיומת .ab1, הנח כל שם קובץ בתוך גרשיים נפרדים, והפרד בין שמות הקבצים באמצעות פסיקים.
    6. שמרו את קובץ סקריפט ה-TIDE R הערוך באותה תיקייה שבה נמצאות הרצפים המיועדים לניתוח. השתמשו בשם קובץ פשוט כדי למנוע שגיאות בשלבים הבאים.
    7. ב-IDE, נווט אל תיקיית TIDE באמצעות לשונית הקבצים (Files) בחלונית הפלט (Output pane) (קובץ משלים 2B).
    8. לחץ על ה- עוד בחר מהתפריט הנפתח פתח טרמינל חדש כאן (קובץ משלים 2C). חלון טרמינל חדש ייפתח בחלונית הקונסולה (Console pane) (למטה משמאל).
    9. בטרמינל (Terminal) שנפתח acabado, הקלידו “R" ולחץ הזן (קובץ משלים 2D).
    10. ברגע ש-R פועל בטרמינל, הפעל את סקריפט ה-R של TIDE על ידי הקלדת source("TIDE_analysis.R") ולחץ הכנס (קובץ נלווה 2E). הטרמינל יריץ את הסקריפט ויפיק ייצוג גרפי (קובץ משלים 2F) וקובץ .csv המכיל את הנתונים הגולמיים עבור כל דגימה (קובץ משלים 2G ו- קובץ משלים 3קבצי הפלט נשמרים באותה תיקייה שבה נמצאים סקריפט ה-R וקבצי הרצפים.
      הערה: אם סקריפט R זה יורץ שוב, כל קבצי ה-.csv החדשים שיוצרו ידריסו את הקבצים הישנים. במקרה של ביצוע מספר ניתוחים על אותם קבצים, יש ליצור עותק של התיקייה.
    11. נתחו את הנתונים על ידי פתיחת כל קובץ .csv.
      1. פרש את הנתונים הגולמיים כפרופורציות של אינדלים (indels) ברצף הדגימה. המרה גנטית באמצעות רקומבינציה הומולוגית מרצף הזיהוי של I-SceI לרצף SacI מסוג wild-type מייצרת את המחיקה הקנונית של 23 זוגות בסיסים (bp); הסקריפט מדווח על ערך HR זה בשורה נפרדת בתחתית הפלט (קובץ משלים 2G). ערך ה-0-indel מייצג היעדר DSB או NHEJ ללא indel. יש לסכום את כל ערכי ה-indel האחרים כדי לקבל NHEJ עם עיבוד (processing). הסכום של NHEJ עם עיבוד ו-HR הוא המספר הכולל של אירועי תיקון DSB הניתנים לזיהוי.
      2. חשבו את פרופורציות נתיבי התיקון מבין אירועי תיקון DSB הניתנים לגילוי באמצעות המשוואות הבאות:
        שיעור NHEJ עם עיבוד = (NHEJ עם עיבוד) / (NHEJ עם עיבוד + HR)
        פרופורציית HR = (HR) / (NHEJ עם עיבוד + HR)
        הערה: עבור כל תנאי בכל ניסוי גנטי (לדוגמה, מוטנטים הומוזיגוטים וביקורות הטרוזיגוטיות), נעשה שימוש ב-10–15 דגימות בקירוב. כל ניסוי גנטי חוזר על עצמו 2–3 פעמים, והנתונים האינדיבידואליים מאוגדים.

תוצאות

Drosophila צורך ב-Rad51 לצורך תיקון באמצעות רקומבינציה הומולוגית

ניסויי germline מוצלחים מניבים את מחלקות הפנוטיפ הצפויות המוצגות ב-איור 3A ולפחות 20 צאצאים שניתן לדירוג לכל מבחנה. פנוטיפים בלתי צפויים או פחות מ-20 צאצאים שניתן לדירוג מעידים על זיהום או על פריון לא מספק ויש להסירם כפי שצוין בשלב 1.4.3. עבור ניתוח TIDE, דגימות מוצלחות מניבות amplicon באורך של כ-1.7 kb וכרומטוגרמות עם רקע נמוך לפני אתר השבירה; DNA בעל תפוקה נמוכה או מזוהם וכרומטוגרמות רועשות הם תת-אופטימליים ואין לנתחם.

בשימוש במבחן DR-white עם מקור I-SceI הניתן להשראה על ידי הלם תרמי, תדירות תיקון ה-HR בזבובים מסוג בר (wild-type) היא 38.5 ± 1.2% (ממוצע ± SEM), בעוד ש-SSA מתרחשת בשיעור של כ-3.2 ± 0.35% (איור 3B ו קובץ משלים 4). חלבון Rad51 (המקודד על ידי ההומולוג spnA ב-Drosophila) נחוץ לשלב פלישת הגדיל ברקומינציה הומולוגית14,19. לפיכך, אובדן של Rad51 אמור להוביל ל-HR לא יעילה. ואכן, ברקע של DmRad51-/-, תיקון ה-HR פוחת ל-1.3 ± 0.4%, עם עלייה נלווית בתיקון SSA (34.5 ± 1.8%; איור 3B ו קובץ משלים 4)14. הדבר נובע ככל הנראה מכך שאירועי תיקון שהיו אמורים להסתיים ברקומינציה הומולוגית תוקנו באופן חלופי על ידי single-strand annealing של רצפי החזרות של white.

Drosophila תרומת CtIP לתיקון HR יעיל ברקמות סומטיות

אלגוריתם ה-TIDE מאפשר מדידה של בחירת נתיב התיקון בתאים סומטיים. ברקע שאינו מוטגני, NHEJ עם עיבוד מתרחש ב-59.0% מאירועי התיקון הניתנים לזיהוי, ו-HR מתרחש ב-41.0% (איור 4B ו-קובץ משלים 4). ל-CtIP תפקיד חשוב ביצירת תיקון HR על ידי קידום כריתה של קצות ה-DNA20. בהתאם לכך, ברקע של DmCtIP-/- , בחירת נתיב ה-HR מופחתת באופן ניכר בתאים סומטיים, מ-41.0% בביקורות הטרוזיגוטית ל-10.9% במוטנטים הומוזיגוטים (איור 4B ו-קובץ משלים 4)16. דבר זה מרמז כי ב-Drosophila, CtIP תורם לתיקון HR, אך אינו חיוני עבורו.

דיאגרמת בדיקת DR-white המראה מסלולי תיקון DNA; שיטות HR, NHEJ, SSA עם רכיבי הגן Sce.white.
איור 1: בדיקת הדיווח DR-white ל-DSB ותוצאות התיקון. בדיקת ה-Direct Repeat of white מכילה שני עותקים לא תפקודיים של הגן white: Sce.white (עם הכנסה של 23-bp המכילה את אתר הזיהוי של I-SceI ומכניסה קודון עצירה מוקדם) ו-iwhite (רצף תור מקוצץ בקצוות 5′ ו-3′). הכלאת זבובים הנושאים את DR-white וטרנסגן I-SceI יוצרת DSB ספציפי לאתר שניתן לניתוח פנוטיפי או מולקולרי. הפנוטיפים המתקבלים הם (A) צאצאים בעלי עיניים לבנות (y+ w−), המעידים על היעדר DSB, HR בין אחיות, או NHEJ; (B) צאצאים בעלי עיניים אדומות (y+ w+), המעידים על HR תוך-כרומוזומלי המשחזר את רצף ה-wild-type SacI מהתור iwhite; ו-(C) צאצאים בעלי גוף צהוב ועיניים לבנות (y− w−), המעידים על SSA או CO מיטוטי. האיור עובד על בסיס Do et al.14. קיצורים: CO = crossover; DR-white = Direct Repeat of white; DSB = double-strand break; HR = homologous recombination; NHEJ = nonhomologous end joining; SSA = single-strand annealing. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

דיאגרמה של עריכה גנטית: רקומבינציה הומולוגית, ביקוע I-SceI, DR-white.mu, DNA, iwihiteΔ9, אתרי SacI.
איור 2: נגזרות של בדיקת DR-white. (A) בדיקת DR-white.mu מכילה 28 SNP שקטים ברצף התורכן של iwhite.mu, מה שיוצר שונות של 1.4% ברצף בין החזרים הישירים. המרת גנים של פולימורפיזמים בודדים משתנה בין אירועי HR וניתן לקבוע אותה באמצעות ריצוף. (B) DR-white עם תורכן iwhiteΔ9 מבדיל בין רקומבינציה בין-הומולוגית לרקומבינציה תוך-כרומוזומלית. HR מהתורכן התוך-כרומוזומלי iwhite משחזר את רצף ה-SacI מסוג הפרא ומייצר צאצאים בעלי עיניים אדומות. HR מהתורכן הבין-הומולוגי iwhiteΔ9 מייצר צאצאים בעלי עיניים כתומות מכיוון שהמחיקה של 9-bp מפחיתה את ביטוי white. האיור עובד על פי Do et al.14 ו-Fernandez et al.15. קיצורים: DSB = שבירה של גדיל כפול; HR = רקומבינציה הומולוגית; SNP = פולימורפיזם של נוקלאוטיד בודד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מסלולי תיקון גנים ב-Drosophila, תרשים הכלאות גנטיות, ניתוח גרף עמודות של התפלגות צאצאים.
איור 3: זרימת עבודה ניסויית לזיהוי תוצאות תיקון DSB בקו הנבט הפרה-מיוטי. (A) הכלאה 1 משלבת את רפורטר DR-white (או נגזרת שלו) עם טרנסגן I-SceI (בדוגמה זו, על הכרומוזום השני). צאצאים המכילים הן את מערך ה-DR-white והן את טרנסגן I-SceI שומרים על אירועי תיקון ברקמות קו הנבט והרקמות הסומטיות שלהם. כדי לנתח אירועי תיקון בודדים בקו הנבט הפרה-מיוטי, צאצאים הנושאים את שני הטרנסגנים מוכלאים עם זבובים בודקים y w (הכלאה 2), והצאצאים נספרים כפי שמתואר באיור 1. (B) אירועי תיקון DSB בודדים בקו הנבט בזבובים מסוג בר (n = 106 קווי נבט) ובמוטנטים הומוזיגוטים ל-DmRad51 (n = 46 קווי נבט). **P < 0.01; ****P < 0.0001 לפי two-way ANOVA ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Sidak. העמודות מייצגות ממוצעים; פסי השגיאה מייצגים SEM. הנתונים נותחו מחדש מתוך Do et al.14. קיצורים: ANOVA = analysis of variance; CO = crossover; DSB = double-strand break; HR = homologous recombination; NHEJ = nonhomologous end joining; SEM = standard error of the mean; SSA = single-strand annealing. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

תהליך עריכה גנטית באמצעות ריצוף סנגר עם אנליזת TIDE; כולל תרשים השוואת שיטות תיקון.
איור 4: זרימת עבודה ניסיונית לזיהוי תוצרי תיקון DSB באמצעות Tracking of Indels by DEcomposition. (A) זבובים הנושאים DR-white וטרנסגן I-SceI מושרה נבדקים באמצעות מיצוי gDNA, הגברת PCR על פני אתר ה-DSB, ריצוף סנגר ואנליזת TIDE באמצעות סקריפט R. (B) נתונים מייצגים ממוטנטים DmCtIP-/- (n = 23) וביקורות הטרוזיגוטים DmCtIP+/-  (n = 31). אירועי תיקון הניתנים לזיהוי מחושבים כ-HR פלוס NHEJ עם עיבוד, למעט מקרים ללא DSB/NHEJ ללא indels. ****P < 0.0001 לפי two-way ANOVA ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Sidak. סרגים מייצגים ממוצעים; סרגי שגיאה מייצגים SEM. הנתונים נותחו מחדש מתוך Thomas et al.16. קיצורים: ANOVA = analysis of variance; DSB = double-strand break; gDNA = genomic DNA; HR = homologous recombination; NHEJ = nonhomologous end joining; PCR = polymerase chain reaction; SEM = standard error of the mean; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: סקריפט TIDE בשפת R לזיהוי החסרות והוספות בكرומטוגרמות של רצפים ביחס לבקרת no-DSB. שם קובץ הבקרה, שמות קובצי הדגימות ורצף המטרה של I-SceI, הניתנים לעריכה על ידי המשתמש, מסומנים לקראת סוף הסקריפט. הקלטים הנדרשים, קובצי הפלט והפירוש מתוארים בסעיף 2.3. נדרשות החבילות sangerseqR ו-Biostrings.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: מדריך צילומי מסך שלב-אחרי-שלב לזרימת העבודה של סקריפט TIDE R. הפאנלים ממחישים את פעולות התוכנה המתוארות בסעיף 2.3.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 3: דוגמה לפלט TIDE וחישובי אירועי תיקון. הערך 0-indel מייצג היעדר DSB או NHEJ ללא indels; השורה הנפרדת עבור HR מייצגת את תוצר המחיקה הקנוני של 23-bp; וכל אחוזי ה-indel הנותרים מסוכמים כ-NHEJ עם עיבוד. סך התיקון הניתן לגילוי מחושב כ-HR פלוס NHEJ עם עיבוד.נא ללחוץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: נתונים גולמיים העומדים בבסיס איור 3B ואיור 4B, מאורגנים בגיליונות עבודה נפרדים שניתנים לעריכה. נתונים אלו נותחו מחדש מתוך מחקרים שפורסמו בעבר ואשר מצוטטים במקראי האיורים המתאימים.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

הורסטיליות של מערכת ה-DR-white היא גורם קריטי התורם להשפעתה בעבר ובעתיד בתחום תיקון ה-DNA. ראשית, רצף האינטגרציה attB בתוך מבנה הדיווח (reporter construct) של DR-white מאפשר לחוקרים להכווין את הדיווח למספר מיקומים בתוך הגנום של Drosophila21, כאשר מספר קווים מכוונים כבר זמינים22. שנית, הזמינות של טרנס-גנים שונים של I-SceI, כגון ביטוי תלוי הלם תרמי באמצעות מקדם hsp70 (מחקר זה), ביטוי קונסטיטוטיבי באמצעות מקדם ubiquitin23, וביטוי בקו הנבט לפני המיוזה באמצעות מקדם Bam24, מספקת הקשרים התפתחותיים ורקמתיים ספציפיים רבים לבחינת תיקון DSB. ללא קשר לטרנס-גן של  I-SceI שבו נעשה שימוש, יש לתכנן את ההכלאות הגנטיות בזהירות כדי להבטיח שהטרנס-גן של I-SceI יוכנס רק בהכלאה הסופית כדי להבטיח השראה נכונה של DSB. חשוב לציין שתדירויות התיקון עשויות להשתנות באופן משמעותי בהתאם למיקום הגנומי של DR-white ו/או לטרנס-גן של I-SceI שבו נעשה שימוש. ניסויים עתידיים יוכלו להשוות עוד יותר בין מיקומים גנומיים ובין טרנס-גנים של I-SceI כדי לקבוע האם ההקשר הגנומי או הספציפיות הרקמתית הם המניעים את תיקון ה-DSB.

יתרון מסוים של בדיקת ה-DR-white ונגזרותיה הוא היכולת שלהן לזהות תיקון של DSBs באמצעות רקומינציה הומולוגית, NHEJ עם עיבוד, ובמרבית המקרים, SSA. למרות שהמערכת תוכננה לזיהוי פנוטיפי של אירועי תיקון בתאי נבט, היא מאפשרת גם ניתוח של רקמות סומטיות באמצעות ניתוח אלגוריתמי של TIDE. למרות יתרונות אלו, ישנן מספר מגבלות של בדיקה זו שיש לקחת בחשבון. ראוי לציין כי בדיקת ה-DR-white עלולה להמעיט בערכם של שיעורי ה-HR. כפי שקורה בבדיקות דגישן גנטיות אחרות המשתמשות ב-DSBs המושרים על ידי נוקליאז, תיקון באמצעות HR מכרומטידה אחות (intersister HR) אינו ניתן להבחנה מאירוע ללא DSB או מ-NHEJ ללא עיבוד. לכן, לפחות חלק מהמחלקה של No DSB/NHEJ עשויים להיות אירועי HR. בהתחשב במגבלה זו, יש לנהוג בזהירות בתוצאות המשוות גורמים גנטיים (כגון שורות מוטנטיות). מגבלות נוספות של הבדיקה כוללות חוסר יכולת להעריך אירועים פרה-מיוטיים שלא הניבו צאצאים בריאים. לדוגמה, אירועי DSB שייתכן ולא תוקנו והובילו למות התא לא ייספרו בצאצאים. בעוד שפוריות כללית עשויה להוות מדד איכותני למות תאי נבט, ייתכן שיהיה צורך בבדיקות מבוססות תאים (כגון TUNEL). בנוסף, ניתוח סקריפט ה-TIDE מספק רק את הפרופורציה של אירועים ניתנים לגילוי באוכלוסיית תאים. כדי לקבוע תוצאות רצף ספציפיות של indel, נדרש ריצוף של אירועי תיקון בודדים באמצעות ריצוף DNA מולטיפלקס.

בדיקת ה-DR-white כבר השפיעה עמוקות על חקר תיקון DSB. יישומה זיהה גורמים התורמים לתיקון DSB באורגניזמים רב-תאיים, כולל גיל25, מין26, מיקום ה-DSB22,26, מיקום רצף התורם15, מחזור התא וסוג הרקמה26. בנוסף, השתמשנו בבדיקה כדי לזהות מספר חלבונים המניעים גם הם את בחירת נתיב התיקון ו/או תיקון של רצפים מורחקים ב-Drosophila, כולל Msh627, Blm28, Rif116, ו-CtIP16,29. ואכן, השימוש המבוסס ב-Drosophila כאורגניזם מודל גנטי עם חלבוני תיקון DNA שמורים מספק מערכת רב-תאית פשוטה לחקר הגורמים הגנטיים, התאיים והאורגניזמיים התורמים לתיקון DSB בהקשרים ביולוגיים מורכבים.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים כספיים או שאינם כספיים להצהיר עליהם.

תודות

שיטה זו פותחה בעוד J.R.L. היה מקבל מענק מחקר של AFAR מה-American Federation for Aging Research. עבודה זו נתמכה גם על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (1R15GM110454 ו-1R15GM129628) עבור J.R.L. האיורים פותחו בסיוע של BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עלי פסטל (pestles) בנפח 0.5 מ"ל, נקיים מ-RNAse/DNAseFisher Scientific12141363להומוגניזציה של דגימות לצורך מיצוי gDNA
כדורי צמר גפןGenesee Scientific51-101לגידול סטנדרטי של Drosophila
אינקובטור מקורר בפלטייר ל-Drosophilaמעבדת של (Shel Lab)SRI6PFלגידול סטנדרטי של Drosophila
מבטי דרוזופילה (Drosophila stock): y[1] w[1]בלומינגטון דרוסופיליה  מרכז מאגריםRRID:BDSC 1495
מלאי Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} מעבדת LaRocqueלא רלוונטינוצר על ידי מעבדת LaRocque באמצעות רקומבינציה סטנדרטית של זן המקור RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) ממרכז זני הדרוזופילה של Bloomington; זמין לבקשה מהמחבר המקשר
מטבלת זבובים של Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]מעבדת LaRocqueלא רלוונטיבדיקת DR-white המשולבת במאגר RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); זמין לפי בקשה מהמחבר המקשר
מערך זבובים (Drosophila stock): y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]מעבדת LaRocqueלא רלוונטיבדיקת DR-white.mu ששולבה במאגר RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); זמין לבקשה מהמחבר המקשר
מבטי דרוסופילה (Drosophila stock): y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]מעבדת LaRocqueלא רלוונטילבןΔ9 תורמים שולבו במאגר RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); זמין לפי בקשה מהמחבר המקשר
פקקי בקבוקי דרוסופילה של FlugsGenesee Scientific49-100לגידול סטנדרטי של Drosophila
סטראומיקרוסקופ פלואורסצנטי (RFP)TriTech ResearchSMT1-FLעבור Drosophila סטנדרטית "דחיפת זבובים" ומיון על בסיס פלואורסצנציה
משטח גידול לזבובים Drosophila של FlyStuffGenesee Scientific59-172עבור Drosophila סטנדרטית "דחיפת זבובים"
KimwipesKimberly-Clarke06-666A
אמבט מים MyBath 4LMidwest ScientificMB-2000-4עבור  הלם תרמי
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYלכימות DNA
מצע גידול Nutri-fly BloomingtonGenesee Scientific66-121לגידול סטנדרטי של Drosophila
הומוגנייזר מנועי אלחוטי עם עלי ופסטל (Pellet Pestle)DWK Life SciencesK749540-0000להומוגניזציה של דגימות לצורך מיצוי gDNA
בקבוקי פוליפרופילןGenesee Scientific32-130לגידול סטנדרטי של Drosophila
מבחנות פוליסטירןGenesee Scientific32-116לגידול סטנדרטי של Drosophila, כולל הלם תרמי
פריימר/אוליגונוקלאוטיד DR-white_8fלא רלוונטי; כל שירות סינתזה של אוליגונוקלאוטידים יהיה מספיקלא רלוונטי5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
פריימר/אוליגונוקלאוטיד DR-white_8aלא רלוונטי; כל שירות לסנתזה של אוליגוניוקלאוטידים הוא מספיקלא רלוונטי5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
פריימר/אוליגונוקלאוטיד DR-white_9fלא רלוונטי; כל שירות סינתזה של אוליגנוקלאוטידים הוא מספקלא רלוונטי5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R Studioהנחגרסה 2023.06.1+524גרסה להורדה חינם; כל גרסה של R Studio היא מקובלת, אם כי הנתונים המוצגים נותחו באמצעות  גרסה 2023.06.1+524
חבילות R Studio: BiostringsBioconductor.org (גרסה 3.24)גרסה 2.76.0סקריפט R יבקש מהמשתמש להתקין חבילה זו
חבילות R Studio: sangerseqRBioconductor.org (גרסה 3.24)גרסה 1.44.0סקריפט ה-R יבקש מהמשתמש להתקין חבילה זו
SapphireAMP Fast PCRTakaraRR350B
מיקרוסקופ סטריאוLeicaM60עבור Drosophila סטנדרטית "דחיפת זבובים"
ניקוי ג'ל ו-PCR באמצעות Wizard SV PromegaA9281

מקורות

  1. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.
  2. Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.
  3. Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.
  4. Figueroa-González G, Pérez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.
  5. Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.
  6. Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.
  7. Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.
  8. Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.
  9. Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.
  10. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.
  11. Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.
  12. Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.
  13. Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.
  14. Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.
  15. Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.
  16. Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.
  17. Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.
  18. Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.
  19. McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.
  20. Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.
  21. Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.
  22. Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.
  23. Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.
  24. Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.
  25. Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.
  26. Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.
  27. Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.
  28. Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.
  29. Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNADSBI SceIPCRTIDE
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.