מחקר גשמי זה, שנערך בקרב שישה חולים עם מחלת הפרקינסון שעברו השתלת מיקרוביוטה צואית, בחן שינויים זמניים במגוון המיקרוביאלי במעי, בהרכב הטקסונומי ובפרופילים התפקודיים החזויים, לצד שיפורים בתסמינים מוטוריים ולא-מוטוריים. ממצאים אלו מספקים ראיות ראשוניות התומכות בבדיקה מעמיקה יותר של התערבויות מבוססות מיקרוביוטה.
מאמר מחקר
השפעות של השתלת מיקרוביוטה צואית על מאפיינים מיקרוביאליים במעי ועל פנוטיפים קליניים בחולים עם מחלת הפרקינסון
במאמר זה
סיכום
תקציר
שינויים במיקרוביוטה של המעי נקשרו למחלת פרקינסון (PD), אך שינויים מיקרוביאליים לאורכיים לאחר השתקת מיקרוביוטה צואית (FMT) והקשרים הקליניים שלהם עדיין אינם מובנים דיו. מחקר תצפיתי רטרוספקטיבי במרכז יחיד זה כלל 6 חולים עם PD, שסווגו לתתי-קבוצות של חומרה גבוהה ונמוכה על בסיס משך המחלה (>6 שנים לעומת ≤6 שנים). שלושים ושישה דגימות צואה נאספו לפני ה-FMT ובאופן חודשי למשך חמישה חודשים לאחר מכן. גיוון מיקרוביאלי, מבנה הקהילה, הרכב טקסונומי ופרופילים פונקציונליים חזויים הוערכו באמצעות ריצוף גן rRNA ריבוסומלי 16S. הניתוחים כללו גיוון אלפא ובטא, שפע טקסונומי, גודל השפעה של ניתוח מבחן לינארי (LEDA), חיזוי פונקציונלי מבוסס Tax4Fun2, ומתאמי דרג של ספירמן בין מאפיינים מיקרוביאליים למדדים קליניים. ניתוחים תיאוריים הצביעו על הבדלים בעשירות המיקרוביאלית, בגיוון, במבנה הקהילה ובפונקציות החזויות בין תתי-הקבוצות של החומרה ובמהלך נקודות הזמן שלאחר ה-FMT. בקו הבסיס, לתת-הקבוצה בעלת החומרה הנמוכה הייתה עשירות וגיוון מיקרוביאליים גבוהים יותר מאשר לתת-הקבוצה בעלת החומרה הגבוהה, עם שפע גבוה יחסית של טקסה כולל Bifidobacterium ו-Lactobacillus. חודש לאחר ה-FMT, העשירות והגיוון עלו מקו הבסיס בתת-הקבוצה בעלת החומרה הגבוהה, בליווי שינויים בהרכב הטקסונומי. שתי תתי-הקבוצות הראו שונות הקשורה לזמן בגיוון המיקרוביאלי ובהעשרה חזויה של מסלולים מתוך Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes לאחר ה-FMT. הפונקציות החזויות כללו מטבוליזם של פחמימות וחומצות אמינו, ביוסינתזה של מטבוליטים משניים, הובלה ממברנית והעברת אותות. מספר יחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) היו במתאם למדדים של ליקויים מוטוריים, עצירות, איכות שינה, מצב תפקודי ותסמינים נוירופסיכיאטריים. לפיכך, FMT היה קשור לשינויים לאורכיים בגיוון, בהרכב ובפונקציות החזויות של מיקרוביוטת המעי, ומאפיינים מיקרוביאליים ספציפיים היו קשורים למדדים מוטוריים ולא-מוטוריים. בהינתן העובדה שהקוהורט הרטרוספקטיבית הייתה קטנה, ממצאים אלו הם ראשוניים ומצריכים אישור במחקרי בקרה גדולים יותר. מחקרים עתידיים צריכים לקבוע האם שינויים מיקרוביאליים אלו ניתנים לשחזור, נשמרים מעבר לחמישה חודשים, משקפים השתבצות של התורם, ותואמים לשיפור קליני מדיד לאחר השתלה ב-PD.
מבוא
מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה נוירודגנרטיבית פרוגרסיבית שכיחה המתאפיינת בברדיקינזיה, נוקשות, רעד במנוחה וחוסר יציבות תנוחתיות1. בעוד שהפתוגנזה שלה טרם הובהרה במלואה, גורמים מרובים, כולל נוירו-דלקת, חשיפות סביבתיות ונטייה גנטית, קשרו למהלך התחלתו והתקדמותה של המחלה2. ראיות אפידמיולוגיות מצביעות על כך ש-PD היא אחת ההפרעות הנוירולוגיות השכיחות ביותר בקרב מבוגרים והיא קשורה לנטל משמעותי של מוגבלות, כאשר השכיחות עולה עם הגיל3. טיפולים נוכחיים, ובמיוחד טיפול תחליפי דופמין, יכולים להקל על תסמינים מוטוריים במידה מסוימת, אך השפעתם על התקדמות המחלה ועל תסמינים רבים שאינם מוטוריים נותרה מוגבלת, והתגובות לטיפול משתנות בין אנשים4. לפיכך, המשך חקירה של שינויים ביולוגיים הקשורים ל-PD ויעדים טיפוליים פוטנציאליים נותר בעל חשיבות קלינית.
קהילת המיקרוביום במעי ממלאת תפקיד חשוב בשמירת שלמות מחסום המעי, בויסות תגובות חיסוניות ובשמירה על הומאוסטזיס מטבולי5. השתלת מיקרוביוטה צואית (FMT) כוללת העברה של מיקרוביוטה צואית מתורם בריא למקבל במטרה לשקם את המאזן המיקרוביאלי במעי6,7. מחקרי בעלי חיים מרובים הצביעו על כך שהשתלת מיקרוביוטת מעי יכולה להשפיע על פנוטיפים נוירו-התנהגותיים8,9. בהינתן שמיקרוביוטה ממטופלים עם דיכאון או חרדה יכולה להשריץ שינויים התנהגותיים תואמים בעכברים, מיקרוביוטה מתורמים בריאים עשויה לשפר תוצאות התנהגותיות10. בנוסף, תצפיות קליניות ראשוניות דיווחו על שיפור בתסמינים לאחר FMT בחלק מהמטופלים עם PD ואוטיזם, מה שמרמז כי להתערבויות מבוססות מיקרוביוטה עשוי להיות רלוונסיות פוטנציאלית להפרעות נוירולוגיות ונוירו-פסיכיאטריות11,12. עם זאת, המנגנונים העומדים בבסיס השפעות אלו נותרו לא ברורים, ונדרשים מחקרים קליניים כדי לבסס את הבטיחות והיעילות של FMT ב-PD.
למרות שמחקרים קודמים הצביעו על קשר בין מיקרוביוטת המעי לבין PD, השינויים האורכיים בהרכב המיקרוביאלי של המעי בעקבות FMT והקשרים שלהם למאפיינים קליניים נותרו niezוהים במידה רבה. עדיין לא ברור האם חולים עם חומרות קליניות שונות מראים תגובות מיקרוביאליות מובחנות לאחר FMT.
במחקר תצפיתי רטרוספקטיבי זה, שנערך במרכז רפואי אחד, סקרנו חולי PD שעברו FMT במסגרת פרקטיקה קלינית שגרתית. נותחו מדדים קליניים לפני ואחרי ה-FMT, ודגימות צואה זמינות נותחו בהמשך באמצעות רצף גנים של 16S rRNA כדי לבחון את הגיוון המיקרוביאלי במעי, את ההרכב הטקסונומי, פרופילים פונקציונליים חזויים ומתאמים עם מדדים קליניים. מחקר זה נועד לאפיין תוצאות קליניות ופרופילים של מיקרוביוטת המעי לאחר FMT ב-PD, ולספק ראיות ראשוניות למחקרי בקרה פרוספקטיביים עתידיים.
פרוטוקול
המחקר נערך בהתאם להצהרת הלסינקי, והפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים השני המסונף לאוניברסיטת ננג'ינג הרפואית (מספר אישור: 2021-KY-100-01). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים.
מחקר תצפיתי רטרוספקטיבי זה, שנערך במרכז אחד, בוצע במחלקה לנוירולוגיה בבית החולים המשלי שני של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה. מינואר 2022 עד דצמבר 2023, נכללו בסך הכל 32 חולים עם PD ראשוני שעמדו בקריטריונים האבחנתיים למחלת הפרקינסון (מהדורת 2020). בסופו של דבר, שישה חולים שעמדו בקריטריוני בחירה קפדניים והשלימו את כל הליכי המחקר נכללו בניתוח המשך. פרטי הסינון, ההחרגה והמעקב מוצגים ב-איור משלים 1.
איסוף דגימות צואה וניתוח הקהילה המיקרוביאלית
מיקרוביוטה עיתית הושגה ממתנדבים בריאים. תהליך סינון התורמים בוצע בקפידה בהתאם להסכמת המומחים הסינית בנושא יישום קליני של השתלת מיקרוביוטה עיתית. קריטריונים להכללת תורמים: גיל 18–40 שנים, ללא היסטוריה של מחלות כרוניות; ללא היסטוריה של מחלות במערכת העיכול, הפרעות מטבוליות, מחלות אוטואימוניות או הפרעות פסיכיאטריות; ללא שימוש באנטיביוטיקה, פרוביוטיקה, תרופות מדכאות חיסון או מעכבי משאבת פרוטונים ב-3 החודשים האחרונים; ללא נסיעות לאזורי מגפה, ללא עירויי דם או היסטוריה כירורגית ב-6 החודשים האחרונים. סינון דם ועיתים לשלילת מחלות זיהומיות ופתוגנים כולל: נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV), נגיף הדלקת הכבד B (HBV), נגיף הדלקת הכבד C (HCV), Treponema pallidum, Clostridium difficile, סלמונלה (Salmonella), Shigella, קמפילובקטר (Campylobacter), פתוגני Escherichia coli, נגיפי מעי וטפילים. נפחה של דגימת צואה תקפה אחת צריך להיות לפחות 50 גרם. באמצעות מערכת אוטומטית לטיהור מיקרוביוטה של צואה (ראה טבלת חומרים), 500 מ"ל של תמיסל מלח סטרילי הוספו לכל 100 גרם של צואה טרייה, שלושה סבבים של סנטריפוגציה ושטיפה סטנדרטיים (700 × ג', 3 דקות), ומיד לאחר מכן בוצע חיסון לאחר הכנת תרחיף עם תמיסת מלח סטרילית ביחס נפחים של 1:2. הנבדקים קיבלו הזרקה בודדת של 150 מ"ל תרחיף המכיל כ-5 × 10^13 חיידקים חיים13.
כל המקבלים קיבלו FMT באמצעות קולונוסקופיה, כאשר המכשיר הוכנס עד לעיוור (cecum) ולמעי הגס העולה; התמיה הוזרקה לאט ובאופן אחיד דרך תעלת הביופסיה כדי לעודד יישוב מועדף של המעי הגס הימני. לאחר ההזרקה, נשארו המטופלים בתנוחה שכיבה על צדם הימני למשך 2 h לפחות. לפני הפרוצדורה, נשמרה דיאטה דלה בשיירי מזון למשך 3 ימים, ולאחר מכן דיאטה נוזלית מלאה למשך 24 h לפני הפרוצדורה, עם צום ממוצקים למשך 6 h ומנוזלים למשך 2 h לפני ההזרקה. בערב שלפני הש transplantation, בוצע ניקוי סטנדרטי של כל המעי באמצעות תמיסת אלקטרוליטים של polyethylene glycol עד לקבלת הפרשה צלולה ללא צואה. הגבלות תרופתיות כללו הפסקה של אנטיביוטיקה סיסטמית למשך 72 h לפחות לפני ה-FMT והימנעות ממנה למשך שבוע לאחר מכן. מעכבי פומפת פרוטון (PPIs) הופסקו 24–48 h לפני הפרוצדורה, וחומרים משלשליים ופרוביוטיקה הופסקו ביום ה-transplantation.
במהלך הפרוצדורה, בוצע ניטור רציף של קצב הלב, לחץ הדם ורוויית החמצן, ונבחנו תסמינים כגון נפיחות בבטן, כאב או בחילה; העירוי הופסק באופן מיידי במקרה של כאב בטן חריף או תסמונת של hypotension. במהלך 7 הימים הראשונים לאחר ההשתלה, נערך מעקב יומי לתיעוד תדירות יציאות, עקביות הצואה וכל תופעות הלוואי, כולל כאבי בטן, שלשולים, חום והמטוכזיה (hematochezia). המעקב ארוך הטווח נמשך עד 5 חודשים, וכלל דגימות צואה מתוכננות לניתוח מיקרוביוטת המעי והערכות קליניות באמצעות מדד UPDRS (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale) ומדד Wexner Constipation Score, לצד תיעוד של שינויים בתסמינים ושימוש בתרופות נלוות, כדי להעריך באופן מקיף הן את היעילות והן את הבטיחות.
דגימות צואה נאספו בשש נקודות זמן: לפני FMT ובחודשים 1, 2, 3, 4 ו-5 לאחר FMT. כל המשתתפים קיבלו הנחיות סטנדרטיות לאיסוף דגימות צואה. כ-10–20 g של חלק מרכזי מדגימת הצואה נאספו באמצעות פינצטה סטרילית והוכנסו למכלי איסוף סטריליים. הדגימות הועברו למעבדה תוך 2–3 h לאחר האיסוף וחולקו לאליקוטיים בתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה סטריליות של 1.5 mL (ראו טבלת חומרים) על ידי חוקרים מיומנים תחת תנאים אספטיים. כל האליקוטיים הוקפאו מיד בטמפרטורה של −80 °C עד לניתוח נוסף.
לאחר איסוף דגימות הצואה, הובלו כל הדגימות על קרח יבש לספק רצף מסחרי (ראו טבלת החומרים) לצורך רצף של הגן 16S rRNA. הכנת הספרייה, הרצף ובקרת האיכות הראשונית בוצעו בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי של הספק. DNA גנומי הופק מכל דגימת צואה, והאזורים ההיפרו-וריאביליים V3–V4 של הגן הבקטריאלי 16S rRNA הוגברו באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) תוך שימוש בפריימרים 341F ו-805R. הרצף בוצע בפלטפורמת רצף קצר שולחנית (ראו טבלת החומרים) תוך שימוש בכימיה של קצוות זוגיים 2 × 300 bp כדי לאפיין את פרופילי המיקרוביום במעי של המטופלים לפני FMT ובנקודות זמן שונות במעקב לאחר ה-FMT. לאחר הרצף, עובדו הקריאות הגולמיות כדי לקבל רצפים באיכות גבוהה לניתוח מיקרוביאלי המשכי. סיווג טקסונומי בוצע באמצעות חבילת השמה טקסונומית מסחרית של 16S ומסד הנתונים למזהה מיקרוביאלי הנלווה אליה (ראו טבלת החומרים). הפרופילים הטקסונומיים שהתקבלו שימשו לניתוחים עוקבים של גיוון מיקרוביאלי, הרכב קהילה, שפע דיפרנציאלי ותפקוד מיקרוביאלי חזוי.
הערכות קליניות ותוויות אנליטיות
חולים עם PD סווגו לשתי קבוצות חומרה בהתאם למשך המחלה: קבוצת חומרה גבוהה (>6 שנים, סומנה כ-"_H") וקבוצת חומרה נמוכה (≤6 שנים, סומנה כ-"_L"). דגימות צואה שנאספו לפני FMT הוגדרו כדגימות בסיס וסומנו כ-FB_H או FB_L בהתאם לקבוצת החומרה המתאימה. דגימות שנאספו בחודשים 1, 2, 3, 4 ו-5 לאחר ה-FMT סומנו כ-FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H ו-FP5M_H עבור קבוצת החומרה הגבוהה, וכ-FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L ו-FP5M_L עבור קבוצת החומרה הנמוכה. הפרמטרים הקליניים שהוערכו כללו את מדד העצירות של Wexner, מדד תסמינים לא-מוטוריים (NMSS), שאלון תסמינים לא-מוטוריים (NMSQ), סקר נוירופסיכיאטרי (NPI), שלב Hoehn–Yahr, מדד פעילויות היומיום (ADL), מדד איכות השינה של פיטסבורג (PSQI), ה-(UPDRS I–VI) המקורי, וציון UPDRS כולל. שילוב של שיטות סטטיסטיות תיאוריות והסקיות שימש לניתוח השינויים במדדים הקליניים של חולי PD בקבוצת החומרה הגבוהה (קבוצת _H) ובקבוצת החומרה הנמוכה (קבוצת _L) בשש נקודות זמן. כדי לבחון באופן ראשוני הבדלים בין הקבוצות בכל נקודות הזמן, הושוו התפלגויות המדדים בין קבוצות _H ו- _L בכל נקודת זמן באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum, וכן הוחל מודל ליניארי מעורב (LMM) קפדני יותר עם חסימות אקראיות ספציפיות למטופל. בשל גודל המדגם המוגבל, תוצאות המודל עם ההשפעות המעורבות מוצגות כמרחבי רפרונסיים גששיים בלבד. נקודת הקצה הראשית של מחקר גשש זה הייתה השינוי במגוון ובהרכב המיקרוביום במעי מהנקודת הבסיס לנקודות הזמן שלאחר השתלת מיקרוביוטת צואה, כאשר שינויים קליניים הוערכו כנקודות קצה משניות.
הקבצת OTU, ניתוח גיוון ושפע טקסונומי
יחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) שימשו לסיכום הרכב הקהילה המיקרובסית, ורצפים עם דמיון של ≥97% קובצו לאותו OTU. עומק הרצף הוערך באמצעות עקומות ררפיקציה (rarefaction) מבוססות Shannon, כאשר מישורי העקומה העידו על כיסוי מספיק באופן כללי לצורך ניתוחי שונות במורד הזרם.
מדדי גיוון אלפא (Alpha diversity) הוערכו באמצעות מדדי Chao1 ו-abundance-based coverage estimator (ACE) עבור עושר מיקרוביאלי, ומדדי Shannon ו-Simpson עבור גיוון כללי ומידה של אחידות (evenness). גיוון בטא (Beta diversity) הוערך באמצעות מרחקי UniFrac משוקללים ולא משוקללים, ולאחריהם ניתוח רכיבים ראשיים (PCoA) להדמיית הבדלים בהרכב הקהילה המיקרוביאלית בין הקבוצות. הבדלים בין-קבוצתיים בגיוון אלפא ובגיוון בטא נבחנו באמצעות מבחנים לא-פרמטריים וניתוח שונות רב-משתני permutational (PERMANOVA), בהתאמה, כפי שמתואר בסעיף הניתוח הסטטיסטי.
ההרכב הטקסונומי סוכם ברמות המערכה, המחלקה, הסדרה, המשפחה והסוג, בהתבסס על נתוני ריצוף של גן 16S rRNA. באמצעות חבילת ניתוח אקולוגיה של קהילות עבור R (ראו טבלת חומרים), זהה והצג באופן ויזואלי את 10 הטקסונים השכיחים ביותר בכל רמה טקסונומית. פרופילים טקסונומיים הוצגו באמצעות תרשימי עמודות, וטקסונים נבחרים הושוו בהמשך בין קבוצות באמצעות תרשימי קופסה.
ניתוח שפע דיפרנציאלי של טקסים מיקרוביאליים
טקסונים בעלי שפע שונה בין קבוצות שהוגדרו מראש זוהו באמצעות ניתוח גודל אפקט של אפלימננט ליניארי (LEfSe). LEfSe משלב את מבחן Kruskal–Wallis, מבחן Wilcoxon וניתוח אפלימננט ליניארי (LDA) כדי לזהות טקסונים בעלי מובהקות סטטיסטית וערך מבחין. טקסונים עם P < 0.05 וציון LDA (log10) > 3 נחשבו כבעלי שפע שונה. השפע היחסי של הטקסונים המבחינים הוצג ויזואלית באמצעות תרשימי עמודות טקסונומיים.
ניבוי תפקודי וניתוח קורלציה קלינית
פרופילים תפקודיים חזויים של מיקרוביוטת המעי הוסקו מנתוני רצף של גן 16S rRNA באמצעות Tax4Fun2 ואנוטציה בוצעה על פי מאגר הנתונים Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). מסלולים חזויים שהועשרו באופן מבדל זוהו באמצעות LEfSe, כאשר נקבעו ספי ערכים של P < 0.05 וציון LDA (log10) > 3. מכיוון שפרופילים תפקודיים אלו הוסקו ולא נמדדו באופן ישיר בגישות מטגנומיות או מטבולימיות, הם פורשו כהבדלים תפקודיים חזויים. ניתוח מתאם דרג של Spearman בוצע כדי לבחון קשרים בין מאפיינים מיקרוביאליים למדדים קליניים.
ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת R (ראו טבלת חומרים). משתנים קליניים סוכמו כחציונים וטווחים (מינימום–מקסימום). מדדי alpha diversity הושוו בין קבוצות באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum, בעוד ש-beta diversity הוערך באמצעות PERMANOVA עם 999 פרמוטציות. טקסלומיות בעלות שפע דיפרנציאלי ומסלולים פונקציונליים חזויים זוהו באמצעות LEfSe, כאשר P < 0.05 וציון LDA (log10) > 3 שימשו כספי השמעות. עבור ניתוח שפע דיפרנציאלי לרוחב זמן, הופעל מודל אפקטים מעורבים (mixed-effects model) עם חיתוכי מקרי (random intercepts) ספציפיים למטופל, ולאחריו בוצעו השוואות זוגיות post-hoc עם תיקון Benjamini-Hochberg לקצב הגילוי השגוי (false discovery rate). ניתוח מתאם דרוג של Spearman שימש להערכת קשרים בין מאפייני מיקרוביום המעי למדדים קליניים, תוך יישום תיקון Benjamini–Hochberg לקצב הגילוי השגוי עבור ערכי ה-P של המתאם. ערך P דו-זנבי < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית. תיקון להשוואות מרובות הוחל על ניתוחי המתאמים ושפע הטקסלומיות. בהינתן גודל המדגם הקטן ומבנה הדגימה הlongitudinal החוזר, הניתוחים הסטטיסטיים נחשבו כחקרים גישושים, והתוצאות פורשו בזהירות.
תוצאות
בחירת מטופלים ומאפייני בסיס
שישה מטופלים עם PD נכללו בניתוח הסופי, ביניהם שלושה גברים ושלוש נשים. הגיל החציוני היה 69.0 שנים (טווח: 61–75), ומדד מסת הגוף (BMI) החציוני היה 22.6 ק"ג/מ"ר.2הקוהורט כלל שני פנוטיפים קליניים דומיננטיים בנוקשות, שניים דומיננטיים ברעדה ושניים מעורבים. המאפיינים הקליניים הבסיסיים מוצגים ב- טבלה 1.
המאפיינים הקליניים היו שונים בין תתי-הקבוצות של PD עם חומרה גבוהה ונמוכה (Table 1). בקוהורט חקר זה, ציון ה-UPDRS הכולל היה גבוה יותר בקבוצת FB_H מאשר בקבוצת FB_L, בהתאם לסיווג החומרה שהוגדר מראש, מה שמעיד על ליקוי מוטורי כללי חמור יותר. הבדלים נצפו גם במספר פרמטרים קליניים מוטוריים ולא-מוטוריים, כולל סבי-סולמות של UPDRS, PSQI, מדד העצירות של Wexner, סולם ADL ו-NMSS. ממצאים אלו מצביעים על כך שתתי-הקבוצות של החומרה שהוגדרו מראש נבדלו לא רק בשלב המחלה המוטורי, אלא גם במספר מאפיינים לא-מוטוריים ותפקודיים.
מסלולים אינדיבידואליים של מטופלים הוצגו באמצעות תרשימי קו עבור מדדים קליניים מרכזיים (איור 1). כפי שמוצג, נצפתה מגמת ירידה עקבית במדדי NMSQ, NMSS, NPI, PSQI, UPDRS Total ומדדי Wexner בכל ששת המטופלים לאחר FMT, ללא קשר לחומרת המחלה הראשונית. באופן בולט, מטופלים בקבוצת _H הראו שיפור קליני תלול יותר מאשר אלו בקבוצת _L, למרות ציוני בסיס גבוהים יותר. השוואות קליניות הראו הבדלים עקביים בין קבוצות החומרה הגבוהה והנמוכה. רוב ההשוואות בנקודות זמן ספציפיות היו מובהקות, כל המדדים הקליניים המאוגדים היו שונים בין הקבוצות, ומודלים של אפקטים מעורבים (mixed-effects models) אישרו נטל תסמינים נמוך יותר ותפקוד יומיומי טוב יותר בקבוצת החומרה הנמוכה.
אירועים חריגים בחולי PD לאחר FMT
אירועים חריגים שתועדו לאחר FMT סוכמו ב- טבלה 2האירועים שדווחו בתדירות הגבוהה ביותר היו נפיחות, שלשולים, החמרה של עצירות ובחילה/הקאות, שכל אחד מהם הופיע בשני מטופלים. כאב בבטן דווח אצל מטופל אחד. לא נרשם חום, ואף מטופל לא הפסיק את הטיפול ב-FMT עקב אירועים חריגים. ממצאים אלו מצביעים על כך שתסמינים גסטרו-אינטסטינליים היו האירועים החריגים שתועדו בשכיחות הגבוהה ביותר בקוהורט קטן זה; עם זאת, יש לפרש את תוצאות הבטיחות בזהירות לאור גודל המדגם המוגבל.
כיסוי גיוון מספק וזיהוי של OTUs ספציפיים לקבוצה
ניתוח עקומות 희דלול (Rarefaction) הראה כי מדד שאנון התקרב בהדרגה למישור (plateau) ככל שעומק הריצוף גדל, מה שמעיד על כך שעומק הריצוף היה בדרך כלל מספיק להערכת השונות המיקרוביאלית בין הדגימות (איור 2A). בסך הכל זוהו 80 OTUs בכל הדגימות. מספר זה, הנמוך יחסית של OTUs, עולה בקנה אחד עם עומק הריצוף וגודל המדגם המוגבל במחקר מקדימה זה. ניתוח באמצעות דיאגרמת ונ זיהה OTUs משותפים וייחודיים בין 12 הקבוצות (איור 2B). זוהו 80 OTUs בסך הכל, כולל 53 OTUs המשותפים לכל הקבוצות. מספר ה-OTUs הייחודיים בכל קבוצה היה כדלקמן: 2 ב-FB_H, 12 ב-FB_L, 4 ב-FP1M_H, 0 ב-FP1M_L, 1 ב-FP2M_H, 0 ב-FP2M_L, 4 ב-FP3M_H, 0 ב-FP3M_L, 0 ב-FP4M_H, 1 ב-FP4M_L, 1 ב-FP5M_H, ו-2 ב-FP5M_L. מבין קבוצות אלו, ב-FB_L היה מספר ה-OTUs הייחודיים הגבוה ביותר, בעוד שב-FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L ו-FP4M_H לא נצפו OTUs ייחודיים בניתוח זה. ממצאים אלו מצביעים על כך שתתי-הקבוצות של PD חלקו סט ליבה של OTUs, בעוד שחלק מהקבוצות הראו דפוסי OTU מוגבלים הייחודיים לקבוצה.
גיוון מיקרוביאלי ופרופילים פונקציונליים חזויים נבדלים בין תתי-קבוצות של חומרת PD
מגוון האלפא היה גבוה יותר בקבוצת FB_L מאשר בקבוצת FB_H, כפי שמשתקף במדדי Chao1, ACE, Shannon ו-Simpson מוגברים (איור 3A). ניתוח PCoA מבוסס UniFrac הראה הפרדה ברורה בין שתי תתי-קבוצות החומרה, מה שמרמז על הבדלים במבנה קהילת המיקרוביום במעי (איור 3B). ברמת המעמד הפילום (phylum), קבוצת FB_L הראתה שכיחות גבוהה יחסית של Firmicutes ו-Actinobacteria, בעוד שקבוצת FB_H התאפיינה בשכיחות גבוהה יותר של Bacteroidetes ו-Proteobacteria (איור 3C). ברמת הסוג (genus), Bacteroides, Megasphaera ו-Escherichia היו שכיחים יותר ב-FB_H, בעוד ש- Bifidobacterium ו- Lactobacillus היו שכיחים יותר ב-FB_L (איור 3D).
ניתוח LEfSe זיהה טקסונים הקשורים לחומרת המחלה שהיו בשפע שונה. טקסונים הקשורים ל-Bacteroidetes/Bacteroides וטקסונים הקשורים ל-Proteobacteria היו מועשרים ב-FB_H, בעוד שטקסונים הקשורים ל- Bifidobacterium, Actinobacteria, Firmicutes, Clostridia ו- Parabacteroides היו מועשרים ב-FB_L (איור 3E). ניתוח מסלולי KEGG חזוי הראה גם פרופילים פונקציונליים מובחנים בין הקבוצות. FB_H היה מועשר בעיקר במסלולים חזויים הקשורים למטבוליזם גלובלי, מטבוליזם של פחמימות ואנרגיה, העברת אותות, מערכות דו-רכיביות וביוסינתזה של ליפופוליסכריד. לעומת זאת, FB_L היה מועשר במסלולים חזויים הקשורים לביוסינתזה של מטבוליטים משניים, מטבוליזם של חומצות אמינו, מטבוליזם של נוקלאוטידים, רפליקציה ותיקון, חישוש מרבקה (quorum sensing), תובעת ממברנה ונשאי ABC (איור 3F). ממצאים אלו מעידים על כך שתתי-קבוצות של חומרת PD נבדלו במגוון המיקרוביאלי, בהרכב הטקסונומי ובפוטנציאל הפונקציונלי החזוי.
חודש לאחר FMT, תת-הקבוצה FP1M_H הראתה גיוון מיקרוביאלי גבוה יותר ופרופילים פונקציונליים חזויים מובחנים
בהשוואה ל-FB_H, קבוצת FP1M_H הראתה מגוון אלפא גבוה יותר, כפי שמעידים מדדי Chao1, ACE, Shannon ו-Simpson מוגברים (איור 4A). ניתוח PCoA מבוסס UniFrac הראה הפרדה ברורה בין FB_H ל-FP1M_H, מה שמרמז על שינוי במבנה קהילת המיקרוביום במעי חודש לאחר ה-FMT (איור 4B). ברמת המעמד של המערכה (phylum), ב-FP1M_H נצפתה שכיחות יחסית גבוהה יותר של Firmicutes, Actinobacteria ו-Verrucomicrobia, בעוד שב-FB_H נצפתה שכיחות גבוהה יותר של Bacteroidetes ו-Proteobacteria (איור 4C). ברמת הסוג, Bifidobacterium, Akkermansia, Enterococcus ו- Lactobacillus היו שכיחים יותר ב-FP1M_H, בעוד ש- Bacteroides, Megasphaera ו-Escherichia היו שכיחים יותר ב-FB_H (איור 4D).
ניתוח LEfSe זיהה טקסונים בעלי שכיחות דיפרנציאלית הקשורים לקבוצות. טקסונים הקשורים ל-Bacteroidetes/Bacteroides היו מועשרים ב-FB_H, בעוד שטקסונים הקשורים ל-Firmicutes, Actinobacteria, Clostridia, Bifidobacterium ו-Acidaminococcus היו מועשרים ב-FP1M_H (איור 4E). ניתוח נתיבי KEGG חזוי הראה כי FB_H היה מועשר בנתיבים הקשורים להעברת אותות, מערכות דו-רכיביות, מטבוליזם של פחמימות, מטבוליזם של ליפידים, מטבוליזם של אנרגיה ומטבוליזם של קו-פקטורים/ויטמינים. לעומת זאת, FP1M_H היה מועשר בנתיבים חזויים הקשורים למטבוליזם של חומצות אמינו, מטבוליזם של נוקלאוטידים, מטבוליזם של עמילן וסוכרוז, שכפול ותיקון, טרנסלציה, ביוסינתזה של מטבוליטים משניים, חישוש (quorum sensing), נשאי ABC ותעתוע ממברנה (איור 4F). ממצאים אלו מרמזים כי בתת-הקבוצה עם רמת חומרה גבוהה, FMT היה קשור לעלייה במגוון המיקרוביאלי ולשינויים בהרכב הטקסונומי ובפוטנציאל התפקודי החזוי.
עושר מיקרוביאלי, הרכב טקסונומי ופרופילים תפקודיים חזויים היו שונים בין קבוצות FB_L ו-FP1M_L
בהשוואה ל-FB_L, קבוצת FP1M_L הראתה עושר מיקרוביאלי גבוה יותר, כפי שמעידים מדדי Chao1 ו-ACE מוגברים, בעוד שמדדי Shannon ו-Simpson לא נבדלו באופן מובהק בין הקבוצות (איור 5A). ניתוח PCoA המבוסס על UniFrac הראה הפרדה ניכרת בין FB_L ל-FP1M_L, מה שמרמז על הבדלים בהרכב הקהילה המיקרוביאלית לאחר FMT (איור 5B). ברמת המערכה (phylum), ב-FP1M_L נצפתה שכיחות גבוהה יחסית של Actinobacteria, Verrucomicrobia, Synergistetes ו-Euryarchaeota, בעוד ש-Firmicutes ו-Bacteroidetes היו שכיחים יותר ב-FB_L (איור 5C). ברמת הסוג (genus), Bifidobacterium, Akkermansia ו-Parabacteroides היו שכיחים יותר ב-FP1M_L, בעוד ש-Bacteroides ו-Lactobacillus היו שכיחים יותר ב-FB_L (איור 5D).
ניתוח LEfSe הראה העשרה של טקסונום הקשור ל-Firmicutes, Clostridia ו-Ruminococcaceae ב-FB_L, בעוד שטקסונום הקשור ל-Bacteroidetes, Bacteroidales, Parabacteroides, Porphyromonadaceae, Synergistetes, Alistipes ו-Rikenellaceae הועשרו ב-FP1M_L (איור 5E). ניתוח נתיבי KEGG חזוי הצביע על כך ש-FB_L הועשר בנתיבים הקשורים להעברת אותות, מערכות דו-מרכיביות, מטבוליזם של פחמימות, מטבוליזם של ליפידים, מטבוליזם של סוכרי אמינו וסוכרי נוקלאוטיד, מטבוליזם של עמילן וסוכרוז, ומערכת הפוספוטרנספראז. FP1M_L הועשר בנתיבים חזויים הקשורים לנתיבי מטבוליזם גלובליים, מטבוליזם של חומצות אמינו, תרגום, ביוסינתזה של חומצות אמינו, ביוסינתזה של מטבוליטים משניים ועיבוד מידע גנטי (איור 5F). תוצאות אלו מעידות כי בתת-הקבוצה עם רמת חומרה נמוכה, FMT היה קשור בעיקר לעלייה בעושר המיקרוביאלי ולשינויים בהרכב הטקסונומי ובפוטנציאל התפקודי החזוי.
מגוון המיקרוביום במעי, ההרכב הטקסונומי והפרופילים התפקודיים החזויים השתנו בין תתי-קבוצות של PD בחומרה גבוהה בנקודות זמן שונות לאחר FMT
ניתוח גבון אלפא (Alpha diversity) בקרב חמשת תתי-הקבוצות של מחלת פרקינסון (PD) עם חומרה גבוהה (FP1M_H עד FP5M_H) הראה שונות בעושר ובגבון המיקרוביאלי לאורך נקודות הזמן (איור 6A). מבין תתי-קבוצות אלו, FP2M_H הראתה את מדדי ה-Chao1, ACE, Shannon ו-Simpson הנמוכים ביותר, בעוד ש-FP1M_H, FP3M_H, FP4M_H ו-FP5M_H הראו ערכים גבוהים יחסית. ניתוח גבון בטא (Beta diversity) באמצעות מרחקי UniFrac שקלוליות ולא שקלוליות חשף הפרדה בין חמשת תתי-הקבוצות בתרשימי ה-PCoA, מה שמעיד על הבדלים בהרכב קהילת המיקרוביום במעי בנקודות זמן שונות לאחר ה-FMT (איור 6B). ברמת המערכה (phylum), 10 הטקסונים השכיחים ביותר מוצגים ב-איור 6C. Bacteroidetes נראו שכיחים יותר ב-FP3M_H, FP4M_H ו-FP5M_H, בעוד ש-Firmicutes ו-Actinobacteria היו שכיחים יותר ב-FP1M_H. Verrucomicrobia נראו מועשרים יחסית ב-FP2M_H. ברמת הסוג, Bacteroides היה שכיח יחסית יותר ב-FP3M_H, FP4M_H ו-FP5M_H, בעוד ש-Akkermansia ו-Escherichia היו שכיחים יותר ב-FP2M_H. Bifidobacterium היה מועשר יחסית ב-FP1M_H (איור 6D). ניתוח LEfSe זיהה טקסונים בעלי שכיחות שונה באופן מובהק בין מספר תתי-קבוצות עם חומרה גבוהה (איור 6E), כולל טקסונים הקשורים ל-Firmicutes, Actinobacteria, Bifidobacterium ו-Clostridia ב-FP1M_H; טקסונים הקשורים ל-Proteobacteria ו-Enterobacteriaceae ב-FP2M_H; טקסונים הקשורים ל-Bacteroidetes ו-Bacteroides ב-FP3M_H; וטקסונים הקשורים ל-Synergistetes ב-FP4M_H. פרופיל תפקודי חזוי המבוסס על אנוטציית נתיבי KEGG הראה דפוסי העשרה ספציפיים לתתי-הקבוצות (איור 6F). FP1M_H הראתה העשרה חזויה במטבוליזם של עמילן וסוכרוז ובביוסינתזה של מטבוליטים שניים אחרים, FP2M_H הראתה העשרה חזויה במטבוליזם של קופקטורים וויטמינים ובמטבוליזם של אנרגיה, ו-FP5M_H הראתה העשרה חזויה בהעברת אותות ובמערכות דו-רכיביות. ממצאים אלו מצביעים על כך שתתי-הקבוצות של מחלת פרקינסון עם חומרה גבוהה הראו שונות זמנית בגבון המיקרוביאלי, בהרכב הטקסונומי ובפרופילים התפקודיים החזויים לאחר FMT.
גיוון מיקרוביאלי במעי, הרכב טקסונומי ופרופילים תפקודיים חזויים השתנו בין תתי-קבוצות של PD בחומרה נמוכה בנקודות זמן שונות לאחר FMT
ניתוח מגוון אלפא בקרב חמש תתי-הקבוצות של PD בחומרה נמוכה (FP1M_L עד FP5M_L) הראה שונות בעושר ובמגוון המיקרוביאלי לאורך נקודות הזמן (איור 7A). FP2M_L הראתה מדדי Chao1 ו-ACE נמוכים יחסית, בעוד ש-FP4M_L ו-FP5M_L הראו מדדי Shannon ו-Simpson גבוהים יחסית, מה שמעיד על שונות בעושר ובשיוויוניות (evenness) בין תתי-הקבוצות בעלות החומרה הנמוכה. ניתוח מגוון בטא באמצעות מרחקי UniFrac שוקללים ולא שוקללים חשף הפרדה בין חמש תתי-הקבוצות בגרפי ה-PCoA, דבר המצביע על הבדלים בהרכב קהילת המיקרוביום במעי בנקודות הזמן שלאחר ה-FMT (איור 7B). ברמת המערכה (phylum), 10 הטקסונים השכיחים ביותר מוצגים ב-איור 7C. Bacteroidetes ו-Firmicutes היו המערכות הדומיננטיות בכל הקבוצות, בעוד ש-Actinobacteria ו-Verrucomicrobia נראו מועשרים יחסית ב-FP1M_L, ו-Firmicutes נראו שכיחים יותר יחסית ב-FP3M_L. ברמת הסוג, Bifidobacterium ו-Akkermansia היו שכיחים יותר יחסית ב-FP1M_L, בעוד ש-Bacteroides היה שכיח יותר יחסית ב-FP2M_L (איור 7D). ניתוח LEfSe זיהה טקסונים בעלי שכיחות דיפרנציאלית הקשורים לתתי-קבוצות במספר תתי-קבוצות בעלות חומרה נמוכה (איור 7E), כולל טקסונים הקשורים ל-Ruminococcaceae ב-FP1M_L, טקסונים הקשורים ל-Firmicutes ו-Clostridiales ב-FP2M_L, טקסונים הקשורים ל-Synergistetes ב-FP3M_L, וטקסונים הקשורים ל-Bacteroidetes, Parabacteroides, Actinobacteria ו-Bifidobacterium ב-FP4M_L. פרופיל פונקציונלי חזוי המבוסס על אנוטציית נתיבי KEGG הראה דפוסי העשרה ספציפיים לתתי-קבוצות (איור 7F). FP1M_L הראתה העשרה חזויה בביוסינתזה של מטבוליטים משניים, FP2M_L הראתה העשרה חזויה בנתיבים הקשורים להעברת אותות, מערכות דו-רכיביות, עיבוד מידע סביבתי, קהילה תאית-פרוקריוטים ומטבוליזם של פחמימות, FP3M_L הראתה העשרה חזויה בתחבּור ממברנתי, חישוש רב-חברי (quorum sensing), שכפול ותיקון ומערכת הפוספוטרנספראז, FP4M_L הראתה העשרה חזויה בעיבוד מידע גנטי, ו-FP5M_L הראתה העשרה חזויה במטבוליזם ובנתיבים מטבוליים. ממצאים אלו מצביעים על כך שתתי-הקבוצות של PD בחומרה נמוכה הראו שונות זמנית במגוון המיקרוביאלי, בהרכב הטקסונומי ובפרופילים הפונקציונליים החזויים לאחר FMT.
קשרים בין OTUs ספציפיים למדדים קליניים ב-PD
כדי לבחון את הקשרים בין שינויים במיקרוביום המעי לבין מאפיינים קליניים ב-PD, הוצגו חזותית 50 המתאמים המובילים בין OTU לפרמטרים קליניים לאחר יישום תיקון להשוואות מרובות, אשר תאמו ל-23 OTUs ייחודיים (איור 8). מספר OTUs הראו דפוסי מתאם דומים על פני מספר מדדים קליניים. לדוגמה, OTU165, OTU67, OTU230, OTU154, OTU72 ומספר OTUs נוספים הראו מתאמים חיוביים עם מדד Wexner, שלב Hoehn–Yahr, PSQI ומספר מדדים הקשורים ל-UPDRS, בעוד שהראו מתאמים שליליים עם סולם ADL ו-NPI. לעומת זאת, OTU10 (Parabacteroides) ו-OTU45 (Fusobacterium) הראו דפוס מתאם הפוך עבור מספר משתנים קליניים. OTU165, שסווג ברמת המערכה (phylum) כ-Firmicutes, הראה מתאמים חיוביים עם חומרת העצירות, שלב המחלה, הפרעות שינה ומספר מרכיבי UPDRS, בעוד שהראה מתאמים שליליים עם סולם ADL ו-NPI. באופן דומה, גם OTU67 (Porphyromonadaceae) נמצא במתאם עם מספר מדדים קליניים מוטוריים ולא-מוטוריים. באופן כללי, ממצאים אלו מצביעים על כך ש-OTUs ספציפיים היו קשורים למספר מדדים קליניים ב-PD, אם כי יש לפרש מתאמים אלו בזהירות ולהתייחס אליהם כאל מקור להצבת היפותזות ולא כראיה לקשר סיבתי.
זמינות נתונים:
חומרים נלווים למחקר זה זמינים ב-DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.21620775.
איור 1: שינויים ארוכי טווח בציונים קליניים לאחר השתלת מיקרוביוטה צואית בחולים עם PD. גרפי קו מראים שינויים בציוני NMSQ, NMSS, NPI, PSQI, UPDRS total, וציוני עצירות של Wexner מרמת הבסיס לפני FMT (FB) ועד לחודשים 1, 2, 3, 4 ו-5 לאחר FMT (FP1M–FP5M) בקבוצת החומרה הגבוהה (H) ובקבוצת החומרה הנמוכה (L). נקודות הנתונים מייצגות ערכי סיכום ברמת הקבוצה, וסטיות התקן מציינות את השונות/הטווח התואמים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עקומות Rarefaction והשוואת OTU בין הקבוצות. (A) עקומות Rarefaction של Shannon המראות את הקשר בין עומק הריצוף לבין הגיוון המיקרוביאלי. ציר ה-x מייצג את עומק הריצוף, וציר ה-y מייצג את מדד הגיוון של Shannon. ההגעה ההדרגתית של העקומות למישור (plateau) מעידה על כך שעומק הריצוף היה בדרך כלל מספיק להערכת הגיוון. (B) דיאגרמת ון המראה OTUs משותפים וייחודיים בין 12 הקבוצות. המספר במרכז מייצג OTUs המשותפים לכל הקבוצות, בעוד שהמספרים באזורים החיצוניים מייצגים OTUs הייחודיים לכל קבוצה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: גיוון מיקרוביאלי, הרכב טקסונומי והבדלים פונקציונליים חזויים בין קבוצות FB_H ו-FB_L. (A) ניתוח גיוון אלפא המבוסס על מדדי Chao1, ACE, Shannon ו-Simpson. (B) ניתוח רכיבים ראשיים (PCoA) המבוסס על מרחקי UniFrac משוקללים ולא משוקללים. (C,D) שפע יחסי של 10 הטקסונומיות המיקרוביאליות הנפוצות ביותר במעי ברמת המעמדה (C) וברמת הסוג (D), מוצג באמצעות תרשימי עמודות מוערמים ותרשימי קופסה. (E) ניתוח LEfSe המראה טקסונומיות בעלות שפע שונה בין קבוצות FB_H ו-FB_L. (F) ניתוח LEfSe של מסלולים פונקציונליים חזויים ב-KEGG. ציוני LDA חיוביים ושליליים מעידים על מסלולים המועשרים בקבוצות שונות. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. אנא לחץ כאן להצגת גרסה מוגדלת של איור זה.
איור 4: גיוון מיקרוביאלי, הרכב טקסונומי והבדלים פונקציונליים חזויים בין קבוצות FP1M_H ו-FB_H. (A) ניתוח גיוון אלפא המבוסס על מדדי Chao1, ACE, Shannon ו-Simpson. (B) ניתוח רכיבים ראשיים (PCoA) המבוסס על מרחקי UniFrac שקלולים ולא שקלולים. (C,D) שכיחות יחסית של 10 הטקסונים המיקרוביאליים המובילים במעי ברמת המערכה (C) וברמת הסוג (D), המוצגת בתרשימי עמודות מצטברים ובתרשימי קופסה. (E) ניתוח LEfSe המראה טקסונים בעלי שכיחות שונה בין קבוצות FP1M_H ו-FB_H. (F) ניתוח LEfSe של מסלולים פונקציונליים חזויים ב-KEGG. ציוני LDA חיוביים ושליליים מצביעים על מסלולים מועשרים בקבוצות שונות. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הבדלים מיקרוביאליים ופונקציונליים בין קבוצות ה-FB_L וה-FP1M_L. (A) ניתוח גיוון אלפא (Alpha diversity) של קבוצות ה-FB_L וה-FP1M_L. (B) ניתוח גיוון בטא (Beta diversity) של קבוצות ה-FB_L וה-FP1M_L. (C,D) שפע יחסי של טקסונים מיקרוביאליים במעי בקבוצות ה-FB_L וה-FP1M_L ברמות המערכה (C) והסוג (D). (E) ניתוח השוואתי של הבדלים בין מינים בין קבוצות ה-FB_L וה-FP1M_L. (F) פונקציות מיקרוביאליות חזויות בקבוצות ה-FB_L וה-FP1M_L. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: גיוון מיקרוביאלי, הרכב טקסונומי והבדלים תפקודיים חזויים בין הקבוצות FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H, ו-FP5M_H. (A) ניתוח גיוון אלפא המבוסס על מדדי Chao1, ACE, Shannon ו-Simpson. (B) ניתוח רכיבים ראשיים (PCoA) המבוסס על מרחקי UniFrac שוקללים ולא שוקללים. (C,D) שפע יחסי של 10 הטקסונומיות המיקרוביאליות השכיחות ביותר במעי ברמת המערכה (C) וברמת הסוג (D), המוצגים באמצעות גרפי עמודות מצטברות וגרפי קופסא. (E) ניתוח LEfSe המראה טקסונומיות עם שפע Differentially abundant בין חמש תתי-הקבוצות עם חומרה גבוהה לאחר FMT. (F) ניתוח LEfSe של מסלולים תפקודיים חזויים של KEGG. ציוני LDA חיוביים מעידים על מסלולים מועשרים בקבוצות המתאימות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מגוון מיקרוביאלי, הרכב טקסונומי והבדלים פונקציונליים חזויים בין הקבוצות FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L, ו-FP5M_L. (A) ניתוח מגוון אלפא (Alpha diversity) המבוסס על מדדי Chao1, ACE, Shannon ו-Simpson. (B) ניתוח קואורדינטות ראשיות (PCoA) המבוסס על מרחקי UniFrac משוקללים ולא משוקללים. (C,D) שפע יחסי של 10 הטקסונומיות המיקרוביאליות המובילות במעי ברמת המערכה (C) וברמת הסוג (D), המוצגות באמצעות תרשימי עמודות מוערמים ותרשימי קופסה. (E) ניתוח LEfSe המראה טקסונומיות בעלות שפע Differentially abundant בין חמש תתי-הקבוצות עם חומרה נמוכה לאחר FMT. (F) ניתוח LEfSe של מסלולים פונקציונליים חזויים לפי KEGG. ציוני LDA חיוביים מצביעים על מסלולים מועשרים בקבוצות המתאימות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: ניתוח מתאם Spearman בין OTUs למדדים קליניים. השורות מייצגות OTUs והעמודות מייצגות מאפיינים קליניים. כל תא מציג את מקדם מתאם Spearman בין OTU ספציפי למדד קליני. צבע אדום מעיד על מתאם חיובי, וצבע כחול מעיד על מתאם שלילי, כאשר עוצמת הצבע משקפת את חוזק הקשר. ערכים מספריים בתאים מייצגים מקדמי מתאם. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מטופל | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| מגדר (נקבה/זכר) | זכר | נקבה | זכר | נקבה | זכר | נקבה |
| גיל (שנים) | 65 | 72 | 68 | 75 | 61 | 70 |
| BMI | 23.5 | 21.8 | 24.2 | 20.5 | 22.1 | 23 |
| סוג תת-מרכיב של PD | נוקשות | רעד | היברידי | נוקשות | רעד | היברידי |
| משך המחלה | 5 | 8 | 6 | 10 | 3 | 7 |
| מדד וקסנר (Wexner score) | 12 | 15 | 10 | 18 | 8 | 13 |
| סך הכל UPDRS | 45 | 61 | 49 | 72 | 36 | 55 |
| סך הכל NMSS | 45 | 62 | 50 | 70 | 38 | 55 |
| NMSQ | 10 | 14 | 11 | 16 | 8 | 12 |
| PSQI | 8 | 11 | 9 | 13 | 6 | 10 |
| ADL | 90 | 75 | 85 | 70 | 95 | 65 |
| NPI | 5 | 9 | 6 | 12 | 3 | 7 |
| משך העצירות | 4 | 7 | 5 | 9 | 2 | 6 |
| LEDD (mg/d) | 600 | 800 | 700 | 900 | 400 | 750 |
| שימוש בחומרים משלשלים | לא | שימוש לסירוגין | לא | שימוש ארוך טווח | לא | שימוש לסירוגין |
| שימוש בפרוביוטיקה | לא | כן | לא | כן | לא | לא |
| שימוש באנטיביוטיקה | לא | לא | כן | לא | לא | לא |
| שלב Hoehn–Yahr | 2 | 3 | 2.5 | 3.5 | 1.5 | 3 |
| קבוצת חומרה | נמוכה | גבוהה | נמוכה | גבוהה | נמוכה | גבוהה |
טבלה 1: מאפיינים דמוגרפיים וקליניים בסיסיים של חולי פרקינסון, בחלוקה לפי משך המחלה. המטופלים סווגו לקבוצת משך מחלה ארוך (>6 שנים; FB_H) או לקבוצת משך מחלה קצר (≤6 שנים; FB_L). נתונים מוצגים כחציון (טווח) עבור משתנים רציפים ומספר (%) עבור משתנים קטגוריים, במידת הרלוונטיות. קיצורים: ADL, פעולות היומיום; BMI, מדד מסת הגוף; NMSS, סולם תסמינים לא-מוטוריים; NMSQ, שאלון תסמינים לא-מוטוריים; NPI, שאלון נוירו-פסיכיאטרי; PD, מחלת פרקינסון; PSQI, מדד איכות השינה של פיטסבורג; UPDRS, סולם דירוג מאוחד למחלת פרקינסון.
| אירועים חריגים | מטופלים (n, %) |
| נפיחות וגזים | 2 (33.3%) |
| כאבי בטן | 1 (16.7%) |
| שלשול | 2 (33.3%) |
| עצירות מחמירה | 2 (33.3%) |
| חום | 0 |
| בחילה/הקאה | 2 (33.3%) |
| הפסקת השתלת מיקרוביוטה עיתית (FMT) עקב אירועים חריגים | 0 |
טבלה 2: אירועים חריגים בעקבות השתלת מיקרוביוטה צואית במטופלים עם מחלת פרקינסון. הטבלה מציגה את מספר ואחוז המטופלים שחוו כל אירוע חריג במהלך המעקב לאחר השתלת מיקרוביוטה צואית. לא דווח על חום או על הפסקת טיפול עקב אירועים חריגים. קיצורים: FMT, השתלת מיקרוביוטה צואית; PD, מחלת פרקינסון.
איור משלים 1: בחירת משתתפים וזרימת מטופלים. תרשים זרימה של תהליך סינון המדגמים עבור חולי פרקינסון העוברים FMT ומשתתפים בריצוף 16S rRNA. n מייצג את מספר המשתתפים.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
דיון
FMT היא התערבות מבוססת מיקרוביוטה המעבירה מיקרוביוטת צואה מתורם בריא למעי של הרכיב כדי לשחזר את המאזן המיקרוביאלי במעי14. ראיות גוברות מצביעות על כך שמיקרוביוטת המעי ממלאת תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס של מערכת העצבים15. ראיות מציר המעי-מוח הדו-כיווני מעידות כי מיקרוביוטת המעי עשויה להשפיע על דלקת במערכת העצבים המרכזית, על מטבוליזם של מוליכים עצביים ועל תגובות התנהגותיות ב-PD16,17. לפיכך, השתלת מיקרוביוטה עוררה עניין כהתערבות פוטנציאלית, אף שיישומה הקליני במחלות נוירופסיכיאטריות ונוירודגנרטיביות נותר בשלב חקר ראשוני18. מחקר תצפיתי רטרוספקטיבי במרכז בודד זה העריך תוצאות קליניות, בטיחות ופרופילים חקרניים של מיקרוביוטת המעי בחולים עם PD שעברו השתלת מיקרוביוטת צואה (FMT) כחלק מפרקטיקה קלינית שגרתית. צפינו הבדלים בעושר המיקרוביאלי במעי, בגיוון, במבנה הקהילה ובפרופילים פונקציונליים חזויים בין תתי-קבוצות של חומרת PD ובנקודות זמן לאחר ה-FMT. ממצאים אלו מרמזים כי פרופילים מיקרוביאליים במעי עשויים להשתנות בהתאם לחומרת המחלה ועשויים להשתנות באופן דינמי לאחר התערבות FMT. לפיכך, יש להתייחס לתוצאות אלו אך ורק ככאלו המעוררות השערות, והן דורשות תיקוף במחקרים גדולים יותר עם עוצמה סטטיסטית הולמת.
עצירות היא אחד מהתסמינים הבלתי-מוטוריים השכיחים והמעיקים ביותר ב-PD19. עצירות עלולה לפגוע באיכות החיים, להגביר את הצורך בחומרים משלשלים ולהפריע לספיגת תרופות דופמינרגיות. בקוהורט הנוכחי, מדדי העצירות של Wexner ירדו לאחר FMT בשתי תתי-הקבוצות האנליטיות, אם כי מידת השיפור והמשכיותו השתנו לאורך נקודות הזמן של המעקב. תבנית זו מרמזת על קשר זמני בין FMT לבין שיפור בתסמיני המעי.
שמנו גם שינויים במספר מדדים קליניים מוטוריים ולא-מוטוריים, כולל NMSS, PSQI, UPDRS III וציוני UPDRS כוללים. ממצאים אלו ראויים לציון מכיוון ש-PD היא הפרעה רב-מערכתית שבה תפקוד לקוי של מערכת העיכול, הפרעות שינה, תסמינים אוטונומיים, תסמינים נוירו-פסיכיאטריים ופגיעה מוטורית קיימים לעיתים קרובות בו-זמנית. הסבר אפשרי הוא שוויסות של מיקרוביוטת המעי עשוי להשפיע על מוטיליות מערכת העיכול, דלקת סיסטמית, שלמות מחסום המעי, מטבוליטים מיקרוביאליים ואיתות לאורך ציר המיקרוביוטה-מעי-מוח. עם זאת, ציונים מוטוריים ולא-מוטוריים ב-PD מושפעים מגורמים מרובים, כולל שלב המחלה, טיפול דופמינרגי, איכות השינה, מצב רוח, תפקוד אוטונומי לקוי, מצב שיקום ופעילות יומית. לפיכך, יש לפרש את השינויים ב-UPDRS, NMSS, PSQI ומדדים הקשורים ל-ADL כתצפיות קליניות גששיות.
הממצאים שלנו עולים בקנה אחד באופן רחב עם מחקרים קודמים שקישרו בין מיקרוביוטה של המעי לבין ההטרוגניות הקלינית הקשורה ל-PD. מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי השתלה של מיקרוביוטה צואתית מתורמים בריאים עשויה לשפר תסמינים מוטוריים ולא-מוטוריים בחולים עם מחלת פרקינסון, בליווי שינויים בהרכב המיקרוביוטה של המעי ובמסלולים תפקודיים13,20. למרות שהפרעות בשליטה על דחפים לא השפיעו באופן משמעותי על גיוון α ו-β בחולי PD במחקר קודם אחד, טקסוני מיקרוביאליים ספציפיים היו מועשרים בחולים עם הפרעות בשליטה על דחפים והראו הבדלים תפקודיים פוטנציאליים במסלולים כגון פירוק קסנוביוטיקה ומטבוליזם של ניאצין21. מחקר אחר דיווח כי חולי PD עם חרדה הראו הרכב מיקרוביוטה משתנה של המעי וגיוון β, מה שנתן תמיכה נוספת לקשר האפשרי בין הפלורה המעית לבין תסמינים לא-מוטוריים הקשורים ל-PD22. במחקר זה, הגיוון וההרכב המיקרוביאליים היו שונים בין תתי-קבוצות עם חומרה גבוהה ונמוכה, ומספר תתי-קבוצות לאחר-FMT הראו דפוסים מיקרוביאליים מובחנים. תוצאות אלו תומכות באפשרות שהמיקרוביוטה של המעי עשויה להיות מעורבת בביטויים הקליניים הרב-ממדיים של PD, אם כי קשרים סיבתיים טרם אומתו.
מספר טקסונים שזוהו במחקר זה עשויים להיות רלוונטיים ביולוגית לשינויים במיקרוביום של המעי הקשורים ל-PD. חיידקים מסוימים עשויים להשפיע על הפתופיזיולוגיה של PD דרך מסלולים חיסוניים ומטבוליים23. Firmicutes הוא אחד ממשפחות החיידקים המרכזיות בעלות גרם-חיובי במעי האנושי, והוא כולל נציגים המעורבים בייצור חומצות שומן קצרות שרשרת ובשמירה על מחסום המעי24. במחקר זה, OTU165, שסומן ברמת המערכה (phylum) כ-Firmicutes, היה אחד מה-OTUs שהיו קשורים תדירה ביותר למשתנים קליניים. עם זאת, קבוצות טקסונומיות רחבות כגון Firmicutes מכילות נציגים מגוונים מבחינה תפקודית, ויש לגשת לפרשנות הביולוגית שלהם בזהירות. ניתוח מטאגנומי של צואה הראה כי Lactobacillus ואפיטופים מיקרוביאליים קשורים לו ממשפחת ה-Firmicutes מועשרים בחולי PD וקשורים למסמנים דלקתיים ولمסלולים מטבוליים כגון תסבך פרופיונאט25.Bifidobacterium הוא סוג חיידקים בעל תכונות אנטי-דלקתיות פוטנציאליות שעשוי לתרום לוויסות המיקרוביאלי במעי, בעוד ש-Bacteroides הוא סוג קומנסלי חשוב שדיסביוזה שלו נקשרה לפגיעה בתפקוד מחסום המעי ולהגברת תגובות דלקתיות26,27. במחקר הנוכחי, Bacteroides היה שכיח יחסית יותר ב-FP2M_L, בעוד ש-Bifidobacterium היה שכיח יחסית יותר ב-FP1M_L. במודל חולדות של PD, תוסף של Bifidobacterium breve Bif11 שיפר ליקויים מוטוריים וקוגניטיביים, הפחית גורמים דלקתיים ועקה חמצונית במוח האמצעי, והחזיר את תכולת חומצות השומן קצרות השרשרת ואת תפקוד מחסום המעי28. מחקרים קודמים דיווחו גם הם על שכיחות משתנה של Bacteroides בחולי PD, בליווי שינויים במטבוליזם של חומרי מוצא לחומצות שומן קצרות שרשרת וקשרים לחומרת המחלה29. ממצאים אלו מעידים כי לטקסונים שנצפו במחקר זה עשויה להיות משמעות ביולוגית פוטנציאלית, אך נדרשים ניתוח טקסונומי ברזולוציה גבוהה יותר ותיקוף תפקודי.
ניתוח חיזוי תפקודי העלה כי תתי-קבוצות שונות של PD הראו דפוסים שונים של העשרה חזויה במסלולי KEGG. קבוצת FB_H הראתה העשרה חזויה במסלולים כגון מטבוליזם של פחמימות, חמצון פוספורילציה (oxidative phosphorylation), מטבוליזם מיקרובי בסביבות מגוונות ותהליכים הקשורים לליפופוליסכריד, מה שעשוי לשקף פוטנציאל מטבולי מיקרוביאל משונה בקבוצה עם חומרה גבוהה. חמצון פוספורילציה הוא תהליך מרכזי שבאמצעותו מיטוכונדריה מייצרות אנרגיה ושומרות על תפקוד נוירונלי תקין30. הפרעה בחמצון פוספורילציה עלולה להוביל לחסר אנרגיה, לעקה חמצונית ولدלקת נוירונלית, אשר קשרו לדכאון ול-PD31. מחקרים העלו כי מיקרוביום המעי עשוי להשפיע על תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי על ידי ויסות סינתזה של מוליכים עצביים, מיטופגיה והומיאוסטזיס של עקה חמצונית32. גנים הקשורים ל-PD עשויים גם לפגוע בתפקוד קומפלקס I מיטוכונדריאלי, להפחית ייצור ATP ולהחמיר את התקדמות המחלה על ידי שיבוש מסלול Akt33. בנוסף, ליפופוליסכריד (LPS), מרכיב חשוב של חיידקים גרם-שליליים, עשוי לעורר תגובות דלקתיות נוירונליות, ומחקרי בעלי חיים הראו כי חשיפה ל-LPS יכולה להפעיל מיקרוגליה, לעודד שחרור גורמים דלקתיים, לפגוע במבנים עצביים ולהשראות שינויים התנהגותיים דמויי פרקינסון34. במחקר זה, חלק מתתי-הקבוצות עם חומרה נמוכה ואלו שלאחר FMT הראו גם הן העשרה חזויה במסלולים הקשורים למטבוליזם של חומצות אמינו, ביוסינתזה של מטבוליטים משניים, הובלה קרומית, שכוПло ותיקון, ומטבוליזם הקשור לחומצות שומן קצרות-שרשרת. עם זאת, מאחר שתוצאות מסלולים אלו הוסקו מרצף 16S rRNA ולא נמדדו ישירות בגישות מטאגנומיות או מטאבולימיות, יש להתייחס אליהן כתוצאות גששיות.
מחקר זה העריך גם קשרים בין מאפיינים של מיקרוביומה במעי לבין מדדים קליניים המשקפים תסמינים מוטוריים ולא מוטוריים ב-PD. מדד Wexner משקף את תפקוד הפינוי; שלב Hoehn–Yahr ו-UPDRS מעריכים את חומרת הליקוי המוטורי; PSQI ו-ADL מודדים את איכות השינה ואת היכולת התפקודית היומית, בהתאמה; ו-NPI מעריך תסמינים נוירופסיכיאטריים כגון חרדה ודיכאון35,36,37. מספר OTUs נמצאו קשורים לסולמות קליניים הנוגעים לעצירות, הפרעות שינה, ליקוי מוטורי, מצב תפקודי ותסמינים נוירופסיכיאטריים. מחקרים קודמים מבוקרים ואקראים דיווחו כי FMT עשוי לשפר את התפקוד האוטונומי ותסמינים גסטרו-אינטסטינליים בחולי PD ולהגביר את מורכבות המיקרוביומה במעי, מה שמרמז כי FMT עשוי להוות התערבות משלימה הפיזה38. מחקר אחר מצא גם כי הגיוון המיקרוביאלי במעי היה משתנה בחולי PD, כאשר Firmicutes ו-Actinobacteria הראו מתאם חיובי עם ציוני UPDRS III, NMSS, Wexner ושאלון מחלת הפרקינסון בעל 39 סעיפים PDQ-39, בעוד ש-Bacteroidetes הראו מתאמים שליליים עם מדדים אלו39. עם זאת, המתאמים שנצפו במחקר הנוכחי אינם מבססים סיבתיות, ויש לפרש את כיוון הקשרים הללו בזהירות.
בטיחות היא שיקול חיוני בהערכת FMT למחלות נוירודגנרטיביות. בקוהורט זו, האירועים הבלתי רצויים שדווחו היו בעיקר גסטרו-אינטסטינליים, כולל נפיחות, שלשול, החמרה של עצירות, בחילה/הקאות וכאבים בבטן. לא תועב חום, ואף מטופל לא הפסיק את ה-FMT עקב אירועים בלתי רצויים. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-FMT היה בדרך כלל סובל באופן טוב בקוהורט קטנה זו. עם זאת, הערכת הבטיחות התבססה על רשומות קליניות רטרוספקטיביות ועל מספר מוגבל של מטופלים. לא ניתן לשלול סיבוכים נדירים אך בעלי חשיבות קלינית, כולל זיהום, אספירציה, העברת פתוגנים מהתורם, סיבוכים מטבוליים ואירועים בלתי רצויים מאוחרים. מחקרים פרוספקטיביים עתידיים צריכים לכלול הגדרות סטנדרטיות של אירועים בלתי רצויים, ניטור בטיחות פעיל, תיעוד סינון תורמים ומעקב לטווח ארוך.
יש להכיר במספר מגבלות, הכוללות את גודל המדגם הקטן (n = 6), היעדר קבוצת ביקורת, תכנון של מדידות חוזרות עם פוטנציאל לפסאודו-שכפול (pseudoreplication) ונסיגה לממוצע, ותיעוד חלקי של גורמים מבלבלים פוטנציאליים כגון תזונה, טיפולים בעצירות, התאמות תרופתיות ושימוש באנטיביוטיקה או פרוביוטיקה; למרות שהמשתתפים הונחו להימנע מאלו האחרונים, לא ניתן לשלול חשיפות לא מתועדות שייתכן והשפיעו על מיקרוביוטת המעי. בנוסף, היסטוריה משפחתית של מחלת פרקינסון או הפרעות נוירולוגיות אחרות לא תועדה באופן שיטתי, מה שמנע הערכה של תרומות גנטיות או משפחתיות. תחזיות פונקציונליות התבססו על נתוני 16S rRNA ולא על מדידות מטאגנומיות או מטבולימיות ישירות, ומספר OTUs סווגו רק ברמות טקסונומיות רחבות, מה שהגביל את הפרשנות הביולוגית. מגבלות אלו מחייבות פרשנות זהירה של ממצאים אלו.
על אף זאת, מחקר ראשוני זה מצביע על כך ש-FMT היה קשור לשינויים בתסמינים הקשורים לעצירות, במדדים קליניים מוטוריים ולא-מוטוריים נבחרים, באירועים לוואי במערכת העיכול ובפרופילים גששניים של מיקרוביוטת המעי במטופלים עם PD. הממצאים מספקים ראיות ראשוניות מהעולם האמיתי ותומכים בבדיקה מעמיקה יותר של התערבויות המכוונות למיקרוביוטה ב-PD עם עצירות. עם זאת, בהתחשב בגודל המדגם הקטן, בעיצוב הרטרוספקטיבי, במבנה המדידות החוזרות ובהיעדר קבוצת ביקורת, יש לפרש את התוצאות בזהירות. נדרשים מחקרים פרוספקטיביים מבוקרים עם פרוטוקולי FMT סטנדרטיים, נקודות סיום קליניות שנקבעו מראש, ניטור בטיחות קפדני ואנליזות מולטי-אומיקס משולבות כדי להבהיר את הערך הקליני, הבטיחות והמכניזמים הביולוגיים של FMT ב-PD.
גילויים
ניגודי עניינים: המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
תודות
אנו מודים לכל העמיתים שסייעו ותמכו במחקר זה. שיתוף הפעולה והעידוד שלהם היו בעלי ערך רב עבור עבודתנו.
מימון: מחקר זה מומן על ידי Jiangsu Provincial Key Program for Elderly Health (LKZ2022004).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת MiSeq | Illumina, Inc. | SY-410-1003 | פלטפורמת ריצוף קצראסי (short-read) שולחנית המשמשת עבור 16S rRNA V3–ריצוף אמפליקון V4 עם 2 × כימיה של קריאה זוגית (paired-end) באורך 300 bp. |
| Metagenome@KIN | World Fusion Co., Ltd. | v2.2.1; https://www.w-fusion.com/metagenome | תוכנה מסחרית המשמשת לשיוך טקסונומי של 16S rRNA וניתוח קהילות מיקרוביאליות. |
| מאגר נתונים לזיהוי מיקרוביאלי (חיידקי) | TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd. | DB-BA, בסיס נתונים גרסה 10.0; https://www.tecsrg.co.jp/services/enki/ | מאגר נתוני ייחוס של 16S rDNA חיידקי המשמש לזיהוי מיקרוביאלי. |
| פריימר 341F | BGI Genomics Co., Ltd. | אוליגונוקלאיד בהזמנה אישית; ללא מספר קטלוגי | רצף הפריימר הקדמי: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′. |
| פריימר 805R | BGI Genomics Co., Ltd. | אוליגונוקלאיד בהתאמה אישית; ללא מספר קטלוגי | רצף הפריימר ההפוך: 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′. |
| שירות ריצוף גן 16S rRNA | BGI Genomics Co., Ltd. (ווהאן, סין) | https://www.bgi.com/us/sequencing-services/rna-sequencing-solutions/16s18s-its-sequencing/ ריצוף 16S, 18S ו-ITS שירותי ריצוף גנטי של BGI מספקים פתרונות מקיפים לניתוח קהילות מיקרוביאליות באמצעות ריצוף Amplicon של הגנים 16S rRNA, 18S rRNA ו-ITS. שירותים אלו מאפשרים זיהוי מדויק, סיווג טקסונומי ואפיון של גוון המיקרוביום במגוון רחב של דגימות ביולוגיות וסביבתיות. ריצוף 16S rRNA (חיידקים וארכאה) ריצוף 16S rRNA הוא הסטנדרט לניתוח קהילות חיידקים וארכאה. על ידי מיקוד באזורים משמרים (Conserved regions) ובאזורים משתנים (Hypervariable regions) של הגן 16S, ניתן להבדיל בין מינים שונים ולנתח את המבנה והתפקוד של הקהילה המיקרוביאלית. ריצוף 18S rRNA (איקריוטים) ריצוף 18S rRNA משמש לזיהוי וסיווג של אורגניזמים איקריוטיים, כולל פרוטיסטים ופטריות. שיטה זו חיונית לחקר מיקרוביום של בעלי חיים, צמחים ומערכות אקולוגיות מורכבות. ריצוף ITS (פטריות) המרחקים המדוברים (Internal Transcribed Spacer - ITS) הם רצפי ה-DNA שנמצאים בין הגנים 18S, 5.8S ו-28S rRNA. אזור ה-ITS נחשב ל"ברקוד" המקובל לזיהוי פטריות בשל רמת השונות הגבוהה שבו, המאפשרת הפרדה מדויקת בין מינים קרובים. יתרונות השירותים של BGI: - כיסוי רחב של אזורים היפר-וריאביליים: אופטימיזציה של תהליכי הגברה (Amplification) להבטחת ייצוג מדויק של הקהילה. - דיוק גבוה ורגישות: שימוש בטכנולוגיות ריצוף מתקדמות להשגת עומק קריאה גבוה ודיוק רב. - ניתוח ביו-אינפורמטיקה מקיף: עיבוד נתונים הכולל סינון רצפים, השוואה למסדי נתונים עדכניים (כגון SILVA, Greengenes, UNITE) וניתוח מגוון (Alpha and Beta diversity). - התאמה למגוון דגימות: ניסיון רב בטיפול בדגימות קרקע, מים, רקמות אנושיות, דגימות קליניות ומזון. יישומים: - מחקר מיקרוביום (Microbiome Research): הבנת השפעת הקהילה המיקרוביאלית על בריאות המארח ומחלות. - אקולוגיה סביבתית: ניטור שינויים בקהילות המיקרוביאליות בתגובה לתנאי סביבה. - אבחון קליני: זיהוי פתוגנים וניתוח דסביוזיס (Dysbiosis) במצבים רפואיים. - בקרת איכות חקלאית: זיהוי פטריות וחיידקים פתוגניים בגידולים חקלאיים ובקרקע. | ספק רצף מסחרי; ביצע הכנה של ספרייה, רצף ובקרת איכות ראשונית. |
| מבחנות מיקרו-צנטריפוגה Eppendorf Safe-Lock, Biopur, 1.5 מ"ל | Eppendorf SE | '0030121589 | מבחנות פוליפרופילן סטריליות המשמשות לחלוקת דגימות צואה למנות לצורך אחסון ב- −80 °ג. |
| LEfSe | מעבדת סגאטה (Segata Lab)/bioBakery | v1.1.2; https://github.com/SegataLab/lefse | תוכנת Linear discriminant analysis effect size ששימשה לזיהוי טקסונים בעלי שכיחות שונה ומסלולים חזויים. |
| Tax4Fun2 | צוות הפיתוח של Tax4Fun2 | v1.1.5; https://github.com/fjossandon/Tax4Fun2 | חבילת R המשמשת להסקת פרופילים תפקודיים של Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes מנתוני 16S rRNA. |
| חבילת ה-R microeco | צ'י ליו (Chi Liu) ותורמים | v1.15.0; https://cran.r-project.org/package=microeco | חבילת ניתוח והדמיה של אקולוגיית קהילות עבור ניתוחים של שפע ומגוון מיקרוביאלי. |
| תוכנת R | R Foundation for Statistical Computing | גרסה לא דווחה; https://www.r-project.org/ | סביבת חישוב סטטיסטית ששימשה לניתוחים קליניים וניתוחי מיקרוביום; על המחברים לאשר את הגרסה המדויקת. |
| מערכת GenFMTer לאוטומציה של טיהור מיקרוביוטת צואה | Nanjing FMT Medical Co., Ltd. | מודל: GenFMTer; https://en.fmtmed.com/ | מערכת אוטומטית המשמשת לסנטריפוגציה סטנדרטית, שטיפה והכנה של תמיסת מיקרוביוטת הצואה. |
מקורות
- Masuda T, Egawa K, Takeshita Y, Tanaka K. Parkinson's disease bradykinesia, forward posture, and drug-induced Pisa syndrome alleviated with traditional Japanese acupuncture: a case report. Cureus. 2024;16(10):e70860. doi:10.7759/cureus.70860.
- Boyd RJ, Avramopoulos D, Jantzie LL, McCallion AS. Neuroinflammation represents a common theme amongst genetic and environmental risk factors for Alzheimer and Parkinson diseases. J Neuroinflammation. 2022;19(1):223. doi:10.1186/s12974-022-02584-x.
- Zhong QQ, Zhu F. Trends in prevalence cases and disability-adjusted life-years of Parkinson's disease: findings from the Global Burden of Disease Study 2019. Neuroepidemiology. 2022;56(4):261–70.
- Albin RL, Brissenden JA, Lee TG, Leventhal DK. Striatal dopamine actions and movement: inferences from Parkinson disease. J Neurosci. 2025;45(24):e0022252025. doi:10.1523/JNEUROSCI.0022-25.2025.
- Panwar S, Sharma S, Tripathi P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Front Physiol. 2021;12:715611. doi:10.3389/fphys.2021.715611.
- Minkoff NZ, et al. Fecal microbiota transplantation for the treatment of recurrent Clostridioides difficile (Clostridium difficile.). Cochrane Database Syst Rev. 2023;4(4):CD013871. doi:10.1002/14651858.CD013871.pub2.
- Wang M, et al. Influence of the gut microbiota, metabolism and environment on neuropsychiatric disorders. Curr Rev Clin Exp Pharmacol. 2025;20(4):334–48.
- Ojeda J, Ávila A, Vidal PM. Gut microbiota interaction with the central nervous system throughout life. J Clin Med. 2021;10(6):1299. doi:10.3390/jcm10061299.
- Lobo B, et al. The stressed gut: region-specific immune and neuroplasticity changes in response to chronic psychosocial stress. J Neurogastroenterol Motil. 2023;29(1):72–84.
- Jang HM, et al. Transplantation of fecal microbiota from patients with inflammatory bowel disease and depression alters immune response and behavior in recipient mice. Sci Rep. 2021;11(1):20406. doi:10.1038/s41598-021-00088-x.
- Segal A, et al. Fecal microbiota transplant as a potential treatment for Parkinson's disease—a case series. Clin Neurol Neurosurg. 2021;207:106791. doi:10.1016/j.clineuro.2021.106791.
- Scheperjans F, et al. Fecal microbiota transplantation for treatment of Parkinson disease: a randomized clinical trial. JAMA Neurol. 2024;81(9):925–38.
- Zhang H, et al. Pilot clinical trial of fecal microbiota transplantation for constipation in Parkinson's disease. J Microbiol Biotechnol. 2025;35:e2509029. doi:10.4014/jmb.2509.09029.
- Danne C, Rolhion N, Sokol H. Recipient factors in faecal microbiota transplantation: one stool does not fit all. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2021;18(7):503–13.
- Su X, Gao Y, Yang R. Gut microbiota-derived tryptophan metabolites maintain gut and systemic homeostasis. Cells. 2022;11(15):2296. doi:10.3390/cells11152296.
- Góralczyk-Bińkowska A, Szmajda-Krygier D, Kozłowska E. The microbiota–gut–brain axis in psychiatric disorders. Int J Mol Sci. 2022;23(19):11245. doi:10.3390/ijms231911245.
- Chen M, et al. Neurotransmitter and intestinal interactions: focus on the microbiota–gut–brain axis in irritable bowel syndrome. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:817100. doi:10.3389/fendo.2022.817100.
- Zheng L, Ji YY, Wen XL, Duan SL. Fecal microbiota transplantation in metabolic diseases: current status and perspectives. World J Gastroenterol. 2022;28(23):2546–60.
- Yao L, et al. Constipation in Parkinson's disease: a systematic review and meta-analysis. Eur Neurol. 2023;86(1):34–44.
- Figura M, et al. Safety and efficacy of fecal microbiota transplantation in alleviating symptoms of Parkinson's disease: a randomized, placebo-controlled, double-blinded study. Ann Neurol. 2026;100(1):10–21.
- Lin SH, et al. Associations between gut microbiota composition and impulse control disorders in Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 2025;26(13):6146. doi:10.3390/ijms26136146.
- Lin SH, et al. Anxiety-related gut microbiota alterations in Parkinson's disease: distinct associations compared with healthy individuals. Front Cell Infect Microbiol. 2025;15:1594152. doi:10.3389/fcimb.2025.1594152.
- Nie S, et al. Inflammatory microbes and genes as potential biomarkers of Parkinson's disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 2022;8(1):101. doi:10.1038/s41522-022-00367-z.
- Markowiak-Kopeć P, Śliżewska K. The effect of probiotics on the production of short-chain fatty acids by the human intestinal microbiome. Nutrients. 2020;12(4):1107. doi:10.3390/nu12041107.
- Li Z, et al. Altered Actinobacteria- and Firmicutes-phylum-associated epitopes in patients with Parkinson's disease. Front Immunol. 2021;12:632482. doi:10.3389/fimmu.2021.632482.
- Aghamohammad S, et al. The potential role of Bifidobacterium. spp. as preventive and therapeutic agents in controlling inflammation by affecting inflammatory signalling pathways. Lett Appl Microbiol. 2022;75(5):1254–63.
- Chen Y, Cui W, Li X, Yang H. Interaction between commensal bacteria, immune response and the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. Front Immunol. 2021;12:761981. doi:10.3389/fimmu.2021.761981.
- Valvaikar S, et al. Supplementation with the probiotic Bifidobacterium breve. Bif11 reverses neurobehavioural deficits, inflammatory changes and oxidative stress in a Parkinson's disease model. Neurochem Int. 2024;174:105691. doi:10.1016/j.neuint.2024.105691.
- Mao L, et al. Cross-sectional study on the gut microbiome of patients with Parkinson's disease in Central China. Front Microbiol. 2021;12:728479. doi:10.3389/fmicb.2021.728479.
- Trigo D, et al. Mitochondria, energy and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Lett. 2022;596(9):1095–110.
- Masenga SK, Kabwe LS, Chakulya M, Kirabo A. Mechanisms of oxidative stress in metabolic syndrome. Int J Mol Sci. 2023;24(9):7898. doi:10.3390/ijms24097898.
- Zhao H, et al. Multiple pathways through which the gut microbiota regulates neuronal mitochondria constitute another possible direction for depression. Front Microbiol. 2025;16:1578155. doi:10.3389/fmicb.2025.1578155.
- Ali MZ, Dholaniya PS. Oxidative phosphorylation-mediated pathogenesis of Parkinson's disease and its implications via Akt signaling. Neurochem Int. 2022;157:105344. doi:10.1016/j.neuint.2022.105344.
- Zhang J, et al. LPS activates neuroinflammatory pathways to induce depression in a Parkinson's disease-like condition. Front Pharmacol. 2022;13:961817. doi:10.3389/fphar.2022.961817.
- Ota E, et al. Incidence and risk factors of bowel dysfunction after minimally invasive rectal cancer surgery and discrepancies between the Wexner score and the low anterior resection syndrome score. Surg Today. 2024;54(7):763–70.
- Kataoka H, Sugie K. Association between fatigue and Hoehn–Yahr staging in Parkinson's disease: an eight-year follow-up study. Neurol Int. 2021;13(2):224–31.
- Ren XQ, et al. Mediating roles of activities of daily living and depression in the relationship between sleep quality and health-related quality of life. Sci Rep. 2024;14(1):14057. doi:10.1038/s41598-024-65095-0.
- Cheng Y, et al. Efficacy of fecal microbiota transplantation in patients with Parkinson's disease: clinical trial results from a randomized, placebo-controlled design. Gut Microbes. 2023;15(2):2284247. doi:10.1080/19490976.2023.2284247.
- Hu Y, Wang H, Zhong Y, Sun Y. Retrospective analysis of diet, gut microbiota diversity and clinical pharmacology outcomes in patients with parkinsonism syndrome. Heliyon. 2024;10(21):e38645. doi:10.1016/j.heliyon.2024.e38645.