הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטת QuEChERS משופרת לניתוח חשריים אורגנו-זרחתיים בקרקעות חקלאיות באמצעות כרומטוגרפיית גז ומספקטרומטריית מסות טנדם

117 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72745

⸱

18 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ingeniería, Universidad EAN

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה שונה של Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) הכוללת ניקוי באמצעות מיצוי פאזה מוצקה מפוזרת (dSPE) המבוסס על סופח מגנזיום סיליקט, לצורך קביעה של שאריות מרובות של חומרי הדברה אורגנו-זרחניים בקרקעות חקלאיות באמצעות כרומטוגרפיה גזית-ספקטרומטריית מסות טנדם, לשיפור הסרת חומרים שנמשכים יחד עם התמצית, מזעור הפרעות אנליטיות הקשורות למטריצה ותמיכה בכימות אמין של רמות עקבה.

תקציר

קביעה מדויקת של שאריות חשפך אורגנו-פוספט (OPP) בקרקעות חקלאיות באמצעות כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסות טנדם (GC-MS/MS) מואכת לעיתים קרובות על ידי השפעות אות הנגרמות מהמטריצה כתוצאה מחומר אורגני שנחלץ במקביל, חומרים הומיים ומפריעים הקשורים למינרלים. אסטרטגיות ניקוי קונבנציונליות של Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) עשויות שלא להסיר ביעילות רכיבי מטריצה מחילוצי קרקע מורכבים, ובכך לפגוע בביצועים האנליטיים. מחקר זה מציג פרוטוקול QuEChERS משופר המשלב את הסופח בניקוי של מיצוי מוצק פזור (dSPE) עם סופחים מעורבים, לקביעה סימולטנית של 12 OPPs בקרקעות חקלאיות באמצעות GC-MS/MS. שבעה שילובי סופחי dSPE הוערכו בשישה סוגי קרקעות חקלאיות בעלות תכונות קרקע משתנות. הסרת חומרים שנחלצו במקביל נמדדה באופן גרווימטרי, והשילוב של אמין ראשוני-שניוני, octadecylsilane וסופח מגנזיום סיליקט (50 mg כל אחד, עם 150 mg מגנזיום סולפט ללא מים) השיג את ממוצע הסרת החומרים הנחלצים במקביל הגבוה ביותר (88%). חומרי הגנה על האנאליט המורכבים מ-ethylglycerol, L-gulonic acid γ-lactone, D-sorbitol וחומצה שיקימית שולבו בחילוצים הסופיים כדי למזער את השפעות המטריצה, בעוד שכיול מותאם למטריצה פיצה על וריאציות באות הספציפיות לקרקע. Chlorpyrifos-methyl-d10 וטריפניל פוספט שימשו כסטנדרטים פנימיים לתהליך ולהזרקה, בהתאמה. עקומות כיול מותאמות למטריצה (5–600 µg/kg) הראו ליניאריות מצוינת, עם מקדמי דטרמינציה ≥0.9933 עבור רוב השילובים של אנאליט-קרקע. גבול הגילוי (5 µg/kg) שימש להערכת הליניאריות, בעוד שגבול הכמותיות של השיטה נקבע ב-50 µg/kg כרמה הנמוכה ביותר שעברה תיקוף. דיוק ודיוק חזרתי (precision) שנבחנו בשלוש רמות התאוששות (50, 200 ו-400 µg/kg, n = 5 לכל רמה) הראו התאוששות בין 70% ל-120% עם סטיות תקן יחסיות ≤20% עבור רוב השילובים של אנאליט-קרקע, ובכך עמדו בקריטריוני הביצועים של SANTE/2020/12830 (Rev.2). התאוששויות נמוכות יותר נצפו רק עבור fenamiphos, pirimiphos-ethyl ו-ethion במטריקות קרקע נבחרות. התוצאות מדגימות כי סופח המגנזיום סיליקט משפר את ניקוי ה-dSPE על ידי הפחתת חומרים שנחלצו במקביל, וכי שילובו עם חומרי הגנה על האנאליט וכיול מותאם למטריצה מספק קביעה אמינה של רב-שאריות של OPPs במטריקות קרקע מורכבות באמצעות GC-MS/MS.

מבוא

חומרי הדברה אורגנו-פוספומיים (OPPs) נותרים בין מחלקות הכימיקלים החקלאיים הנפוצות ביותר בעולם, בשל היעילות הרחבה והורסטיליות של מחלקה זו בהגנה על גידולים1. אף על פי שחומרי OPPs רבים עוברים פירוק סביבתי מהיר יותר מאשר חומרי הדברה אורגנו-כלוריים, יישום נרחב וחוזר של תרכובות אלה מוביל לנוכחות מתמשכת שלהן בקרקעות חקלאיות2. הקרקע משמשת כמדור הסביבתי העיקרי הקולט את חומרי ההדברה, ויכולה לשמש כמאגר זמני ממנו עלולים לעבור שאריות אל הגידולים, למים עיליים, למי תהום ולמערכות אקולוגיות סמוכות3. נוכחותן של שאריות OPPs מעוררת דאגה מכיוון שתרכובות אלה נקשרו להשפעות נוירוטוקסיות בבני אדם באמצעות עיכוב של פעילות האצטילכוליןסטראז, וכן להשפעות שליליות על אורגניזמים שאינםו יעד, על קהילות מיקרוביאליות בקרקע ועל התפקוד המערכתי של הסביבה2. לפיכך, הופעתן של שאריות OPPs בקרקעות חקלאיות עשויה לתרום לאובדן מגוון ביולוגי, לחוסר איזון אקולוגי ולחשיפה סביבתית דרך שרשראות מזון ונתיבים המועברים במים3. קביעה מהימנה של שאריות OPPs חיונית אפוא ליצירת נתוני שכיחות באיכות גבוהה, לתמיכה בהערכות חשיפה סביבתית ולשיפור ההבנה של הגורל הסביבתי של OPPs תחת תנאים חקלאיים שונים. יתרה מכך, שיטות אנליטיות שפותחו ועברו אופטימיזציה באמצעות סוג קרקע בודד לא בהכרח יספקו ביצועים שוויים כאשר ייושמו על קרקעות בעלות מאפיינים פיזיקו-כימיים מנוגדים4,5, דבר המדגיש את חשיבות הערכת התשומשיות של השיטה בסביבות חקלאיות מגוונות. עם זאת, כימות ברמות עקביות נותר מאתגר מכיוון שקרקעות חקלאיות מראות שונות פיזיקו-כימית ניכרת, המשפיעה על יעילות המיצוי, על אפקטים של מטריצה (MEs) ועל הביצועים האנליטיים הכוללים6.

כרומטוגרפיה גזית-ספקטרומטריית מסות בטור (GC-MS/MS) מוכרת רחבות כטכניקה אנליטית של ייחוס לקביעת שאריות מרובות של OPPs ברמות עקבה במטריצות מורכבות7,8. עם זאת, כימות מדויק תלוי לא רק בביצועי המכשיר אלא גם ביעילות הכנת הדגימה. תמציות קרקע מכילות בדרך כלל רכיבי מטריצה שנחולצו במקביל, המגיעים למערכת הכרומטוגרפית יחד עם האנליטים המיועדים ועשויים לשנות את תגובת האנליט באמצעות דיכוי או הגברה של האות4,5,6. מידת ההשפעות הללו משתנה במידה ניכרת בין קרקעות ומושפעת מגורמים כגון תכולת חומר אורגני, פראקציית חימר, הרכב מינרלי ו-pH. כתוצאה מכך, MEs נותרים אחד המקורות העיקריים לאי-ודאות אנליטית בקביעת חומרי הדברה מבוססת GC-MS/MS ומדגישים את הצורך באסטרטגיות ניקוי המסוגלות להפחית את עומס הרכיבים שנחולצו במקביל תוך שימור התשואה של האנליט5,9,10. יתרה מכך, יצירת נתוני שאריות מהימנים דורשת עמידה בקריטריונים לביצועים אנליטיים המקובלים בינלאומית כדי להבטיח את דיוק השיטה, השוואתיות בין מחקרים והתאמה ליישומי ניטור סביבתי11.

שיטת ה-Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) הפכה לגישת הכנת הדגימות הנפוצה ביותר לניתוח שאריות רב-חומרים של חומרי הדברה, וזאת בשל פשטותה, צריכת ממס נמוכה וישימות רחבה במטריצות חקלאיות שונות4,12,13. עיצובה המודולרי והגמיש אפשרו התאמה נרחבת לסוגי דגימות ויישומים אנליטיים מגוונים, דבר שתרם לאימוצא הנרחב שלה בניתוחי שאריות רב-חומרים עכשוויים ולקשרה התכופה לכימיה אנליטית בת-קיימא בשל צריכת הממס המופחתת והכנת הדגימות המפשטת. סתגלנות זו מאפשרת גם להתאים את השיטה על ידי בחירת תנאי מיצוי וניקוי המבוססים על מאפייני מטריצה ספציפיים. בניתוח קרקע, יעילות שלב הניקוי באמצעות מיצוי מוצק פאזה מפוזר (dSPE) היא קריטית, שכן הסרה לא מספקת של רכיבי מטריצה שנמצאו יחד עם המיצוי עלולה להשפיע לרעה על הביצועים האנליטיים של קביעת GC-MS/MS עוקבת4,14. שילובי סופחים קונבנציונליים המבוססים על אמין ראשוני-שניוני (PSA) ואוקטדצילסילאן (C18) מספקים לעיתים קרובות הסרה מוגבלת של רכיבי הומואיקה פולריים, המהווים את אחד הגורמים העיקריים לאפקטים של אותות מושרי-מטריצה בתמציות קרקע חקלאית14. Florisil, סופח מגנזיום סיליקט בעל זיקה לתרכובות בטווח רחב של פולריות, הדגים ביצועי ניקוי מבטיחים במטריצות של מזון וצמחים15,16. עם זאת, תרומתו לאסטרטגיות ניקוי dSPE עם סופחים מעורבים עבור קרקעות חקלאיות נותרה ללא אפיון מספיק, במיוחד בקרקעות המציגות תכונות פיזיקו-כימיות מגוונות17,18,19,20,21.

מחקר זה מציג פרוטוקול QuEChERS משופר שבו נבחנו שבעה שילובי סופחים של dSPE בשישה סוגי קרקעות חקלאיות בעלי pH, תכולת חומר אורגני ומרקם שונים. המחקר התבסס על ההנחה ששילוב סופח מגנזיום סיליקט בניקוי dSPE של סופחים מעורבים ישפר את הסרת רכיבי מטריצה שנשלפו יחד עם האנליטים מתמצי קרקע חקלאית. בחירת הסופח התבססה על הערכה גרבימטרית של הסרת רכיבים שנשלפו יחד, והשילוב שהניב את יעילות הניקוי הממוצעת הגבוהה ביותר הועמד לאחר מכן לוולידציה אנליטית מלאה. הפרוcedure המותאמת בוצעה לוולידציה לקביעה סימולטנית של 12 OPPs באמצעות סטנדרטיזציה פנימית, כיול תואם-מטריצה ו-GC-MS/MS. בנוסף, חומרי הגנה על האנליט (ethylglycerol, L-gulonic acid γ-lactone, D-sorbitol ו-shikimic acid) שולבו בפרוטוקול הסופי כאסטרטגיה משלימה לצמצום השפעות אות שאריות הנגרמות מהמטריצה. באמצעות שילוב של אופטימיזציית ניקוי שיטתית עם וולידציה אנליטית מקיפה על קרקעות בעלות תכונות פיזיקו-כימיות מנוגדות, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה חסונה וניתנת לשחזור שעשויה להקל על קביעת שאריות חומרי הדברה בקרקעות חקלאיות הטרוגניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

נתוני המקור העומדים בבסיס האופטימיזציה הניסויית של הליך הניקוי בשיטת dSPE, מערך הנתונים של אפקט המטריצה והאפיון הפיזיקו-כימי של ששת קרקעות החקלאות הופקדו ב-Zenodo והם זמינים לציבור בכתובת DOI: 10.5281/zenodo.2164870. פרטי הריאגנטים והציוד שבהם נעשה שימוש מפורטים ב- טבלת חומרים.

1. דגימת קרקע והכנתה

הערה: כדי להבטיח את הבטיחות האישית, מומלץ ללבוש חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות ניטריל לאורך כל הפרוטוקול.

  1. אסוף דגימת קרקע מרוכבת מסיבית מהשכבה העליונה (0–10 cm) בכל מיקום חקלאי נבחר על ידי שילוב של 8 תת-דגימות בודדות שנאספו באמצעות תכנון דגימה סיסטמטי של רשת ריבועית22.
    הערה: תכנון הרשת הריבועית של 8 הנקודות תואם להמלצות של רשות הגנת הסביבה של ניו סאות' ויילס (NSW EPA) עבור אתרים בשטח של כ-10 m2 (0.1 ha)2.
  2. שלב וערב היטב תת-דגימות אלו בשטח כדי לקבל דגימה מסיבית מייצגת אחת (≥50 g) לכל מיקום, ובכך הגדר קו בסיס של מטריצה הומוגנית להערכת ביצועי השיטה.
    הערה: דגימה מרוכבת משמשת כאן אך ורק כדי לבקרה של השפעות רקע המטריצה לצורך אופטימיזציה ותיקוף של השיטה. תחת מסגרות רגולטוריות להערכות של קרקעות מזוהמות לא ידועות או מהעולם האמיתי, דגימה מרוכבת מוגבלת באופן קפדני על ידי ה-NSW EPA בשל סיכוני דילול כימי2. לצורך אפיון אתר בפועל או זיהוי מוקדי זיהום (hotspots), יש לשמור את הדגימות מצמתים ברשת כדגימות נפרדות ולנתח אותן באופן אינדיבידואלי כדי למנוע תוצאות שליליות שגויות ולשמר נתוני שונות מרחבית.
  3. העבר את דגימות הקרקע למעבדה במכלי זכוכית ענבריים אטומים בתנאי חושך.
    הערה: מכלי זכוכית מועדפים על פני שקיות פוליאתילן כדי למזער הפסדים עקב ספיחה של OPPs הידרופוביים או חצי-נדיפים על פני שטח פלסטיק, ולהפחית את הסיכון לנדידה של מזהמים או אינטראקציות בין פולימר לאנליט. תנאי חושך ממזערים פוטו-דגרדציה של תרכובות רגישות לאור במהלך ההובלה.
  4. ייבש את הדגימות באוויר בטמפרטורת הסביבה בהיעדר אור ישיר עד להשגת משקל קבוע.
    הערה: ייבוש באוויר מיושם כדי לבקר את תכולת הלחות בקרקע ולהבטיח שהתוצאות ידווחו על בסיס משקל יבש, מה שמשפר את היכולת להשוות בין דגימות עם תכני מים טבעיים שונים. ייבוש מאולץ בתנור נמנע כדי למנוע הפסדים פוטנציאליים של OPPs לא יציבים תרמית או חצי-נדיפים ושינויים במבנה החומר האורגני בקרקע ובמאפייני הספיחה.
  5. פרק ידנית אגרגטים של קרקע ונפה דרך רשת פלדת אל-חלד של 2 mm. אחסן קרקעות הומוגניות במכלי זכוכית ענבריים אטומים בתנאי חושך וקירור ב-4 °C עד למיצוי.
    הערה: המאפיינים הפיזיקו-כימיים של שש הקרקעות ששימשו במחקר זה היו זמינים מניתוחי קרקע שגרתיים קודמים. נתונים אלו שימשו אך ורק לבחירת קרקעות חקלאיות המכסות טווח רחב של pH (קרקע:H2O, 1:2)23, תכולת חומר אורגני (שיטת Walkey Black)24, ומרקם (שיטת Bouyoucos)25 לצורך הערכת השיטה.

2. הכנת ריאגנטים, תמיסות סטנדרט ותמיסות סטנדרט פנימי

הערה: אלא אם צוין אחרת, תמיסות סטוק של חומרי הדברה בודדים, תמיסות סטנדרט עבודה מעורבות, תמיסות סטנדרט פנימי פרוצדוראלי (P-IS) וסטנדרט פנימי להזרקה (I-IS), תמיסות התאוששות ותמיסות סטנדרט כיול מוכנות בבקבוקי מדידה של 10 mL, מועברות לבקבוקוני זכוכית ענבריים ונשמרות בטמפרטורה של −20 °C עד לשימוש. כיול מותאם למטריצה, חומרי הגנה על האנליט, ה-P-IS וה-I-IS שולבו מכיוון שכל אחד מהם מטפל במקור שונה של שונות אנליטית, ובכך משפרים את החסון של הניתוח הכמותי במטריצות קרקע מורכבות.

  1. הכינו תמיסות מלאי נפרדות עבור כל אחד מ-12 התקנים המסחריים של OPP (ראו טבלת חומרים) בריכוז של 10 mg/L בטולואן (toluene).
  2. שלבו נפחים מתאימים של תמיסות המלאי הבודדות כדי להכין תמיסת סטנדרט עבודה מעורבת באצטוניטריל (ACN) בריכוז של 40 מ"ג/ליטר.
    הערה: תמיסת סטנדרט עבודה מעורבת זו משמשת לאחר מכן להכנת תמיסות כיול ותמיסות בחינת התאוששות.
  3. הכן chlorpyrifos-methyl-d10 כסטנדרט פנימי מסומן (P-IS) ב-ACN בריכוז של 750 מ"ג/ליטר. הוסף במהלך שלב המיצוי (שלב 3.2) כדי לנטר ולתקן שונות פרוצדורלית.
    הערה: Chlorpyrifos-methyl-d10 נבחר כסטנדרט פנימי פסימי (P-IS) מכיוון שכ-OPP המסומן איזוטופית, הוא מציג התנהגות פיזיקו-כימית דומה לזו של האנליטים המטרה, בעודו נותר ניתן להבחנה בקלות באמצעות MS/MS.
  4. הכינו טריפניל פוספט (triphenyl phosphate) כתקן פנימי (I-IS) ב-ACN בריכוז של 1050 מג'/ליטר. הוסיפו מיד לפני הניתוח המכשירי (שלב 4.2.4) כדי לתקן עבור שונות בהזרקה.
  5. הכינו תמיסות שחזור ריכוז (stock recovery solutions) ב-ACN המוחמץ ב-0.05% (נפח/נפח) של חומצה פורמית, כדי לספק ריכוזים סופיים שווי-קרקע של 50 µg/kg, 200 µg/kgו- 400 µg/kg עבור ה-OPPs כאשר 300 µL נוסף ל-5 גרם של קרח שחורה לפני המיצוי. הכין תמיסת P-IS נפרדת התואמת ל- 200 µg/kg דגימה שקולה
    הערה: החמצה באמצעות חומצה פורמית משפרת את היציבות של OPPs במהלך האחסון.
  6. הכינו תמיסות כיול המכילות את 12 ה-OPPs ואת chlorpyrifos-methyl-d10 ב-ACN עם 0.05% (נפח/נפח) חומצה פורמית, המתאימות לריכוזים סופיים שווי-קרקע של 5, 10, 25, 75, 200, 40 ו- 600 µg/kg עבור האנליטים ו- 200 µg/kg עבור ה-P-IS.
    הערה: תמיסות אלו משמשות לאחר מכן להכנת עקומות כיול תואמות-מטריצה (matrix-matched calibration curves) עבור כל מטריצת קרקע, אשר הותאמו באמצעות רגרסיה ליניארית לא משוקללת. גבול הגילוי (LOD) וגבול הכימות (LOQ) הוגדרו בהתאם למסמך ההנחיות SANTE/2020/12830 (Rev.2). ה-LOD נחשב לרמת הכיול הנמוכה ביותר במטריצה, בעוד שה-LOQ התקיים ברמת הריכוז המהודקת (validated) הנמוכה ביותר, שהראתה התאוששות ודיוק מקובלים.
  7. הכינו תערובת להגנה על האנליט המורכבת מ-ethylglycerol (בריכוז 10 גרם/ליטר), L-gulonic acid γ-lactone (בריכוז 10 גרם/ליטר), D-sorbitol (בריכוז 10 גרם/ליטר) ו-shikimic acid (בריכוז 5 גרם/ליטר) ב-ACN:מים (1:1, נפח/נפח) המחמיצים ב-0.1% חומצה פורמית. אחסנו ב-−20 °Cיש להוסיף מיד לפני הניתוח המכשירי (שלב 4.2.4) לצורך הפחתת אפקט מטריצה (ME).

3. מיצוי QuEChERS

  1. שקלו 5.0 g ± 0.01 g של קרקע מיובשת באוויר ומסוננת לתוך מבחנה לצנטריפוגה מפּוליפרופילן בנפח 50 mL.
  2. עבור ניסויי בקרת התאוששות, הוסיפו את תמיסת ה-P-IS (שהוכנה בשלב 2.3) ואת תמיסת ההתאוששות המתאימה (שהוכנה בשלב 2.5) כדי להגיע לריכוזים סופיים של 20 µg/kg עבור chlorpyrifos-methyl-d10 ו-50, 20, או 400 µg/kg עבור ה-OPPs המיועדים (n = 5 לכל רמת התאוששות עבור כל סוג קרקע).
    הערה: בניסויי התאוששות, הן תמיסת ה-P-IS והן תמיסות התאוששות של הפסטיצידים מתווספות לפני המיצוי, כפי שמתואר בשלב 3.2. בניתוח שגרתי של דגימות קרקע, רק ה-P-IS מתווסף לפני המיצוי כדי לפצות על שונות פרוצדורלית במהלך הכנת הדגימה והניתוח. להכנת תמציות כיול תואמות מטריצה (matrix-matched), לא מוסיפים את ה-P-IS ולא סטנדרטים של פסטיצידים במהלך המיצוי; מכינים תמציות קרקע ריקות (blank), וסטנדרטים של כיול המכילים הן את האנליטים והן את ה-P-IS (שהוכנו בשלב 2.6) מתווספים לאחר הניקוי (ראו שלב 4.2.4).
  3. ערבבו בורטקס למשך 30 s ואפשרו לדגימות המועשרות להגיע לשיווי משקל למשך 10 min בטמפרטורת החדר.
    הערה: תקופת שיווי המשקל מעודדת אינטראקציה בין האנליטים המועשרים לבין מטריצת הקרקע לפני המיצוי, מה שמשפר את הייצוגיות של ניסויי ההתאוששות.
  4. הוסיפו 10 mL של מים דה-יוניים ונערה ידנית למשך 30 s כדי להבטיח הרטבה מלאה של מטריצת הקרקע.
    הערה: הידרציה משפרת את דסורפציית האנליטים מחלקיקי הקרקע ומקלה על חלוקה (partitioning) יעילה במהלך המיצוי.
  5. הוסיפו 10 mL של ACN המכיל 1% (v/v) חומצה אצטית. סגרו מיד את המבחנה עם פק ונערה בעוצמה למשך 2 min.
  6. הוסיפו 6.0 g של מגנזיום סולפט (MgSO4) אנहाइडרי ו-1.5 g של נתרן אצטט, ונערה מיד את המבחנה בעוצמה למשך 1 min.
    הערה: ערבוב מהיר לאחר הוספת המלחים חיוני כדי להבטיח חלוקת פאזות יעילה ולמנוע היווצרות של אגרגטי מלח.
  7. סובבו בצנטריפוגה במהירות 180 × g למשך 5 min.
  8. העבירו את פאזת ה-ACN העליונה למבחנה נקייה לצורך ניקוי dSPE בהמשך.

4. ניקוי באמצעות מיצוי פאזה מוצקה דיספרסיבית (dSPE)

הערה: סעיף זה מורכב משתי גישות. ראשית, נבחנו שבעה שילובי סופחים של dSPE כדי לזהות את הרכב הניקוי המספק את הסרת החומרים הנלווים (co-extractive removal) הממוצעת הגבוהה ביותר בשישה סוגי קרקעות חקלאיות. לאחר מכן, שילוב הסופחים שנבחר יושם כהליך ניקוי אופטימלי לצורך תיקוף השיטה בהתאם למסמך ההנחיות SANTE/2020/12830 (Rev.2) של המנהלת הכללית לבריאות ובטיחות מזון של הנציבות האירופית (DG SANTE)11.

  1. Optimization of dSPE sorbent combinations
    ​NOTE: Gravimetric co-extractive removal was selected as the optimization criterion because it provides an analyte-independent measure of cleanup efficiency. The sorbent amounts evaluated correspond to the conventional proportions widely employed in QuEChERS-based dSPE procedures, thereby facilitating adoption of the proposed protocol in routine analytical laboratories.
    1. Prepare 2 mL microcentrifuge tubes containing the following sorbent combinations: (i) 150 mg anhydrous MgSO4 + 50 mg PSA; (ii) 150 mg anhydrous MgSO4 + 50 mg C18; (iii) 150 mg anhydrous MgSO4 + 50 mg magnesium silicate adsorbent; (iv) 150 mg anhydrous MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18; (v) 150 mg anhydrous MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg magnesium silicate adsorbent; (vi) 150 mg anhydrous MgSO4 + 50 mg C18 + 50 mg magnesium silicate adsorbent; (vii) 150 mg anhydrous MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18 + 50 mg magnesium silicate adsorbent.
    2. Transfer 1.0 mL aliquots of the extract obtained in step 3.8 into each dSPE tube.
      NOTE: Perform all sorbent evaluations in triplicate for each soil. Aliquots used for comparison should originate from the same extract to ensure that differences in co-extractive removal are attributable exclusively to the cleanup composition.
    3. Vortex for 1 min and centrifuge at 1800 × g for 5 min.
    4. Transfer 1.0 mL of each cleaned extract into a previously dried and weighed glass test tube. Evaporate the solvent to dryness under a gentle nitrogen stream at 40 °C.
    5. Allow the test tube to cool in a desiccator to room temperature and determine the mass of the remaining residue. Calculate the mass of co-extractives by subtracting the initial weight of the empty test tube from the final weight after solvent evaporation.
    6. Determine the amount of co-extractives present in extracts without dSPE cleanup by evaporating equivalent aliquots of untreated extract under identical conditions.
    7. Calculate co-extractive removal according to Equation 126:
      Static equilibrium formula for coextractive removal percentage; chemistry equation diagram.
    8. Calculate the mean co-extractive removal from triplicate determinations for each sorbent combination and soil. Then, calculate the average removal across the six agricultural soils for each sorbent combination.
    9. Evaluate differences among sorbent combinations using analysis of variance (ANOVA) under a randomized complete block design (RCBD), considering sorbent combination as the treatment factor and soil matrix as the blocking factor. Prior to ANOVA, assess residual normality and homogeneity of variances using the Shapiro-Wilk and Levene tests, respectively. Perform pairwise comparisons using Tukey´s HSD test at a significance level of α = 0.05.
    10. Select the cleanup composition based on the combined evaluation of the statistical analysis and the overall mean co-extractive removal.
      NOTE: Reducing the co-extractive load minimizes the introduction of matrix components into the chromatographic system, thereby improving chromatographic performance, reducing contamination of the GC-MS/MS system, and lowering instrument maintenance requirements.
      NOTE: The combination containing PSA, C18, and the magnesium silicate adsorbent (50 mg each, with anhydrous 150 mg MgSO4) achieved the highest average co-extractive removal and was therefore selected as the optimized cleanup procedure for all subsequent analyses.
  2. Application of the optimized dSPE cleanup procedure
    1. Transfer 1.0 mL of the extract obtained in step 3.8 into a 2 mL microcentrifuge tube containing 150 mg anhydrous MgSO4, 50 mg PSA, 50 mg C18, and 50 mg magnesium silicate adsorbent.
    2. Vortex for 1 min to ensure complete interaction between the extract and sorbents.
    3. Centrifuge at 1800 × g for 5 min.
    4. Transfer 200 µL of the cleaned supernatant to an autosampler vial and add 20 µL of the analyte protectant mixture prepared in step 2.7 and 50 µL of the triphenyl phosphate solution prepared in step 2.4. Mix thoroughly before instrumental analysis.
      NOTE: For matrix-matched calibration, prepare blank extracts from each soil following the extraction and cleanup procedures described in steps 3 and 4.2, without addition of pesticides or the P-IS. After cleanup, transfer 200 µL of the cleaned blank extract to seven separate autosampler vials and add the calibration solutions prepared in step 2.6 to obtain final concentrations of 5, 10, 25, 75, 200, 400, and 600 µg/kg for the analytes and 200 µg/kg for the P-IS. Add 20 µL of the analyte protectant mixture and 50 µL of the triphenyl phosphate to each vial as described in step 4.2.4, resulting in a final vial volume of 270 µL. Construct independent matrix-matched calibration curves for each soil matrix. Soil-equivalent concentrations are based on the 200 µL aliquot of cleaned extract, which represents the extract obtained from the original 5 g soil sample. The subsequent addition of analyte protectants and the I-IS increases the final vial volume but does not modify the amount of soil represented by the extract aliquot. For solvent-based calibration, replace the 200 µL aliquot of cleaned soil extract with 200 µL of ACN and prepare calibration vials using the same analyte concentrations, P-IS concentration, I-IS concentration, and analyte protectant mixture employed for matrix-matched calibration. These solvent-based calibration curves are subsequently used for ME evaluation.
    5. Perform instrumental analysis using a GC-MS/MS system.

5. אנליזת GC-MS/MS ורכישת נתונים

הערה: תיאורים מפורטים של תצורת ה-GC-MS/MS ונהלי רכישת הנתונים זמינים במאמר של Varela-Martínez et al.27. הפרמטרים הכרומטוגרפיים והספקטרומטריים העיקריים מסוכמים להלן.

  1. השתמש במערכת GC-MS/MS המצוידת בספקטרומטר מסות בעל משולש קוואדרופול (triple quadrupole), מקור יינון אלקטרוני (EI) הפועל ב-70- eV, ודגימה אוטומטית (autosampler).
  2. התקן עמודת נימיים מסיליקה מותכת בעלת קוטביות נמוכה (30 מ' × 0.25 מ"מ קוטר פנימי × 0.25 µm עובי השכבה) והשתמש בהליום כגז נשא בקצב זרימה קבוע של 1.2 מ"ל/דקה.
  3. לפני הניתוח, יש לוודא את מוכנות המכשיר, כולל אספקת גז נשא, ביצועי מערכת הוואקום, מצב המזרק ומפלס ממס השטיפה באוטוסמפלר. בצע כיוונון (tuning) למכשיר בהתאם להמלצות היצרן.
    הערה: יש לוודא כי ואקום העבודה עומד במפרטים המומלצים על ידי יצרן המכשיר לפני תחילת כל רצף אנליטי.
  4. הגדירו את תוכנית הטמפרטורה של תנור ה-GC באופן הבא: טמפרטורה התחלתית של 50 °C במשך דקה אחת; העלה ל- 180 °C ב- 25 °C/דקה; לאחר מכן ל- 230 °C ב- 5 °C/דקה; ולבסוף ל- 290 °C ב- 25 °C/דקה. שמרו על הטמפרטורה הסופית למשך 6 דקות. זמן ההרצה הכולל הוא 24.6 דקות.
  5. הגדירו את טמפרטורת פתח ההזרקה ל- 250 °C ובצעו 1 µL הזרקות במצב splitless. פתח את שסתום ה-split דקה אחת לאחר ההזרקה.
    הערה: כדי למזער שאריות (carryover), יש לשטוף את מזרק הדוגם האוטומטי (autosampler syringe) באופן רצופי במתנול, אתיל אצט ו-ACN בין ההזרקות.
  6. הגדירו את טמפרטורת קו ההעברה של ה-MS ל- 250 °C ואת טמפרטורת מקור היונים ל- 300 °C.
  7. רכוש נתונים במצב ניטור תגובות מרובה (MRM) באמצעות מעברי יוני מוצא-תוצר המפורטים ב- טבלה 1.
  8. כמת את האנליטים באמצעות עקומות כיול תואמות-מטריצה (matrix-matched) שהוכנו עבור כל מטריצת קרקע. חשב את ריכוזי האנליטים על סמך היחס בין שטח הפסגה של האנליט לבין שטח הפסגה של chlorpyrifos-methyl-d10.
  9. השתמש בטריפניל פוספט (triphenyl phosphate) כבתקן פנימי (I-IS) כדי לאמת את עקביות ההזרקה לאורך רצף הניתוח.
  10. חשב את ה-MEs בהתאם ל- משוואה 228:
    נוסחה לאפקט מטריצה, ME(%)=[Slope_matrix/Slope_solvent-1]x10, נוסחה בכימיה אנליטית.
    כאשר ערכים שליליים מעידים על דיכוי אות וערכים חיוביים מעידים על הגברת אות.
    הערה: סקירה סכמטית של תהליך העבודה האנליטי המלא מוצגת ב- איור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ששת הקרקעות החקלאיות שנבחרו להערכת השיטה ייצגו טווח רחב של תכונות קרקע (ראו טבלה 2), כולל ערכי pH (קרקע:H2O, 1:2) הנעים בין 4.67 ל-7.31, תכני חומר אורגני מ-0.18% עד 6.46%, וחלקי חרס מ-2.9% עד 48.5%. חמש קרקעות הגיעו מאזורים חקלאיים בקולומביה ואחת מספרד. גיוון זה נכלל במכוון כדי להעריך את החוסן של הליך הניקוי המוצע במטריצות קרקע מנוגדות, בהינתן שתכונות קרקע כגון pH, תכן חומר אורגני ומרקם ידועים כמשפיעים על מיצוי משותף, השפעות מטריצה (MEs) והשבה של אנליטים במהלך ניתוח שאריות חומרי הדברה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קביעת שאריות חומרי הדברה בקרקעות נותרת מאתגרת מבחינה אנליטית בשל השונות הגבוהה בתכונות הפיזיקליות-כימיות של הקרקע וההבדלים הנובעים מכך בהרכב הרכיבים הנחלצים במקביל4,5,6,14,17,18,19,20,21. למרות ששיטות המבוססות על QuEChERS ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

במהלך הכנת עבודה זו, השתמשו המחברים בגרסה החינמית של Claude (Anthropic) כדי לסייע בתכנון הפריסה הגרפית של איור 3 ובגרסה החינמית של ChatGPT (GPT-5.5, OpenAI) כדי לסייע בדקדוק ובאיות. לאחר השימוש בכלים אלו, סקרו ועריכו המחברים בקפידה את כל התכנים לפי הצורך. כל התוכן המדעי, הנתונים, הניתוחים והמסקנות הופקו, אומתו ואושרו על ידי המחברים, הנושאים באחריות מלאה לדיוק וליושרה של המאמר המפורסם.

תודות

המחברים מודים באריכות לאוניברסיטת EAN ולמשרד ניהול המחקר וההעברה שלה על התמיכה במחקר זה. המחברים מודים גם למעבדות של אוניברסיטת EAN על אספקת המתקנים האנליטיים והמשאבים הטכניים הדרושים לביצוע עבודה זו, כולל הגישה למכשור ה-GC-MS/MS ששימש לאורך המחקר. עבודה זו נתמכה על ידי הניהול של מחקר והעברה, Universidad EAN, Bogotá D.C., קולומביה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-אתוקסי-1,2-פרופאנדיאול (אתילגליצרול)Sigma Aldrich260428-1G
חומצה אצטיתSigma Aldrich695092
אצטוניטרילMerck1006652500
דגימן אוטומטי AOAC 20i/sShimadzu221-723115-58
מאזןOHAUSPA224
C18Sigma Aldrich52600-U
מבחנות צנטריפוגה, 2 מ"לEppendorf4610-1815
מבחנות צנטריפוגה, 50 מ"לקן602002
צנטריפוגה Z206AMERMLE6019500118
עמודת SH-Rxi-5sil MS, 30 מ' x 0.25 מ"מ, 0.25 µmShimadzu221-75954-30
מכל, עם פקק, זכוכית עגולה (amber), 1000 מ"לSigma AldrichZ674176
מייבש (Desiccator)Simax415262302
Dispensette 5-50 מ"למותג4600361
D-סורביטולSigma Aldrich240850-5G
אתיל אצטטמרק1313181212
Florisil &נפה <200 mesh, אבקה דקהSigma Aldrich288705-50G
חומצה פורמיתMerck1002641000
GCMS-TQ8040Shimadzu211552
מזרק הזרקהShimadzuLC2213461800
חומצה L-גולונית γ-לקטוןSigma Aldrich310301-5G
ליינר ללא פיצול (splitless liner)Shimadzu221-4887-02
מגנזיום סולפט (אנहाइडרס)Sigma AldrichM7506-2KG
מתנולPanreac131091.12.12
מים מזוקקים בדרגה גבוהה מאוד (טיפוס 1) מסוג Milli-QMilliporeF4H4783518
טיפים לפיפט 10- 100 µLBiologix200010
טיפי פפית 100- 1000 µLמותג541287
טיפים לפיפט 20- 200 µLמותג732028
פיפטות פסטורNORMAX5426023
פיפט Transferpette S עם נפח משתנה 10 - 100 µLמותג704774
פיפט Transferpette S משתנה 100 - 1000 µLמותג704780
פיפט Transferpette S עם נפח משתנה 20 - 200 µLSCILOGEX712111099999
אמין ראשוני-שניוני (PSA)Sigma Aldrich52738-U
מקרר/מקפיאנראה שהטקסט שהזנת ("Haceb") אינו באנגלית ואינו מכיל תוכן מדעי לתרגום. אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם לעברית.NEV ALC 404
חומצה שיקימיתSigma AldrichS5375-1G
נתרן אצטטSigma Aldrich241245-1KG
תוכנת GCMSsolutionShimadzu223-18472-92
רשת פלדת אל-חלד בגודל 2 מ"מפינזואר (Pinzuar)PS33N10
מבחנה, זכוכית, 10 מ"לSigma AldrichBR114508
טולואןMerck1083252500
טריפניל פוספט (I-IS)Sigma Aldrich241288-50G
מבחנות עם רכיב פנימי מודבק (fused-in insert), 0.3 מ"לSigma Aldrich29398-U
מבחנות, עם פקק הברגה, זכוכית ענברית, 15 מ"לSigma Aldrich27088-U
בקבוק מדידה, 10 מ"לSigma AldrichDWK28017-10
ערבוב במערבל VortexScilogex82120004
חומרי הדברה
כלורפיריפוסSigma Aldrich45395-100MG2921-88-2
כלורפיריפוס-מתילSigma Aldrich45396-250MG5598-13-0
כלורפיריפוס-מתיל-d10 (P-IS)Sigma Aldrich90047-5MG285138-81-0
אתיון (Ethion)Sigma Aldrich45477-250MG563-12-2
פנמיפוס (Fenamiphos)Sigma Aldrich45483-250MG22224-92-6
פניטרותיוןSigma Aldrich45487-250MG122-14-5
פנתיון (Fenthion)Sigma Aldrich36552-250MG55-38-9
מאלתיוֹןSigma Aldrich36143-100MG121-75-5
מתידתיוןSigma Aldrich36158-100MG950-37-8
פרתיון-מתילSigma Aldrich36187-100MG298-00-0
פירימיפוס-אתיל (Pirimiphos-ethyl)Sigma Aldrich45628-250MG23505-41-1
פירימיפוס-מתילSigma Aldrich32058-250MG29232-93-7
טולקלופוס-מתילSigma Aldrich31209-250MG5701804-9

מקורות

  1. Saad H, Elfeky SA, El-Gamel NE, Dena ASA. Organophosphate pesticides: a review on classification, synthesis, toxicity, remediation and analysis. RSC Adv. 2025;15(48):40802-40822.
  2. Mali H, et al. Organophosphate pesticides an emerging environmental contaminant: Pollution, toxicity, bioremediation progress, and remaining challenges. J Environ Sci. 2023;127:234-250.
  3. Dhuldhaj UP, Singh R, Singh VK. Pesticide contamination in agro-ecosystems: toxicity, impacts, and bio-based management strategies. Environ Sci Pollut Res. 2023;30:9243-9270.
  4. González-Curbelo MÁ, Varela-Martínez DA, Riaño-Herrera DA. Pesticide-residue analysis in soils by the QuEChERS method: A review. Molecules. 2022;27(13):4323.
  5. Wang J, et al. Multiresidue analysis method for the determination of 477 pesticides in soil based on thorough method validation. J Agric Food Chem. 2025;73(27):17269-17286.
  6. Mohamed AH, et al. Sampling and sample preparation techniques for the analysis of organophosphorus pesticides in soil matrices. Crit Rev Anal Chem. 2023;53(4):906-927.
  7. Bhattu M, Kathuria D, Billing BK, Verma M. Chromatographic techniques for the analysis of organophosphate pesticides with their extraction approach: a review (2015–2020). Anal Methods. 2022;14(4):322-358.
  8. Wondimu KT, Geletu AK, Kedir WM. Recent developments in monitoring of organophosphorus pesticides in food samples. J Agric Food Res. 2025;19:101709.
  9. Bulaić Nevistić M, Kovač Tomas M. Matrix effect evaluation in GC/MS-MS analysis of multiple pesticide residues in selected food matrices. Foods. 2023;12(21):3991.
  10. Damale RD, et al. Multiresidue analysis of pesticides in four different pomegranate cultivars: Investigating matrix effect variability by GC-MS/MS and LC-MS/MS. Food Chem. 2023;407:135179.
  11. European Commission. Guidance document on pesticide analytical methods for risk assessment and post-approval control and monitoring purposes (SANTE/2020/12830, Rev. 2). 2023. Available from: https://food.ec.europa.eu/system/files/2021-03/pesticides_ppp_app-proc_guide_res_mrl-guidelines-2020-12830.pdf
  12. González-Curbelo MÁ, et al. Evolution and applications of the QuEChERS method. Trends Anal Chem. 2015;71:169-185.
  13. Varela-Martinez DA, Gonzalez-Salamo J, Gonzalez-Curbelo MÁ, Hernandez-Borges J. Quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) extraction. In: Liquid-phase Extraction. Elsevier; 2020. p. 399-437.
  14. González-Curbelo MÁ. Analysis of organochlorine pesticides in a soil sample by a modified QuEChERS approach using ammonium formate. J Vis Exp. 2023;191:e64901.
  15. Jin Q, et al. Simultaneous determination of six acidic herbicides and metabolites in plant origin matrices by QuEChERS-UPLC-MS/MS. Molecules. 2025;30(4):852.
  16. Zhu L, et al. Establishment and validation of anticoagulant rodenticides in animal samples by HPLC-MS/MS, focusing on evaluating the effect of modified QuEChERS protocol on matrix effect reduction. ACS Omega. 2022;7(21):18146-18158.
  17. do Amaral B, Peralta-Zamora P, Nagata N. Simultaneous multi-residue pesticide analysis in southern Brazilian soil based on chemometric tools and QuEChERS-LC-DAD/FLD method. Environ Sci Pollut Res. 2022;29:39102-39115.
  18. Łozowicka B, et al. The fate of spirotetramat and dissipation metabolites in Apiaceae and Brassicaceae leaf-root and soil system under greenhouse conditions estimated by modified QuEChERS/LC-MS/MS. Sci Total Environ. 2017;603:178-184.
  19. Dong B, Shao X, Lin H, Hu J. Dissipation, residues and risk assessment of metaldehyde and niclosamide ethanolamine in pakchoi after field application. Food Chem. 2017;229:604-609.
  20. Guan J, Li D, Guo Y, Shi S, Yan F. Simultaneous determination of seven pesticide residues in soil samples using ultrasound-assisted dispersive solid-phase extraction combined with UHPLC-MS/MS. Sep Sci Plus. 2018;1(4):296-305.
  21. Kaczyński P, Łozowicka B, Jankowska M, Hrynko I. Rapid determination of acid herbicides in soil by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection based on dispersive solid phase extraction. Talanta. 2016;152:127-136.
  22. NSW Environment Protection Authority. Sampling design part 1 - application: Contaminated land guidelines (EPA 2022P3915). 2022. Available from: https://hdp-au-prod-app-nswepa-yoursay-files.s3.ap-southeast-2.amazonaws.com/9116/6027/3560/22p3915-sampling-design-guidelines-part1.pdf
  23. Eckert D, Sims JT. Recommended soil pH and lime requirement tests. In: Recommended Soil Test Procedures for the Northeastern United States. Cooperative Bulletin No. 493; 2009. p. 19-26.
  24. Schulte EE, Hoskins B. Recommended soil organic matter tests. In: Recommended Soil Test Procedures for the Northeastern United States. 2011. p. 52-60.
  25. Ashworth J, Keyes D, Kirk R, Lessard R. Standard procedure in the hydrometer method for particle size analysis. Commun Soil Sci Plant Anal. 2001;32(5-6):633-642.
  26. González-Curbelo MÁ, Hernández-Borges J, Borges-Miquel TM, Rodríguez-Delgado MÁ. Determination of pesticides and their metabolites in processed cereal samples. Food Addit Contam A. 2012;29(1):104-116.
  27. Varela-Martínez DA, González-Curbelo MÁ, González-Sálamo J, Hernández-Borges J. Determination of 45 pesticides in avocado varieties by the QuEChERS method and gas chromatography-tandem mass spectrometry. J Vis Exp. 2023;202:e66082.
  28. Varela-Martínez DA, González-Curbelo MÁ, González-Sálamo J, Hernández-Borges J. High-throughput analysis of pesticides in minor tropical fruits from Colombia. Food Chem. 2019;280:221-230.
  29. Varela-Martínez DA, González-Curbelo MÁ, González-Sálamo J, Hernández-Borges J. Analysis of pesticides in cherimoya and gulupa minor tropical fruits using AOAC 2007.1 and ammonium formate QuEChERS versions: A comparative study. Microchem J. 2020;157:104950.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

חומרי הדברה אורגנו-זרחתייםמיצוי QuEChERSמיצוי מוצק על פאזה מפוזרת (dSPE)השפעות מטריצההסרה של חומרים נלווים למיצוימגני אנליטיםכיול תואם מטריצה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.