מאמר מחקר

השתקה של LINC00707 מקלה על דלקת ומסנכרנת עקה חמצונית במיקרוגליה מסוג BV2 שעבר גירוי על ידי LPS באמצעות ציר ה-miR-145-5p/TRAF6 בפגיעה בחוט השדרה

111 צפיות

⸱

11 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nursing, Zhangjiakou First Hospital, 2Department of Orthopedics, Zhangjiakou First Hospital, 3Department of Pediatrics, Zhangjiakou First Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ביטוי של Plasma LINC00707 מוגבר בפגיעות בחוט השדרה ומקדם דלקת ותסמיכי חמצון המתווכות על ידי מיקרוגליה דרך ציר הסיגנלינג miR-145-5p/TRAF6. השתקה של LINC00707 מחלישה תגובות פתולוגיות אלו, ובכך מדגישה את פוטנציאל ה-LINC00707 כמטרה טיפולית.

תקציר

פגיעה בחבל השדרה (SCI) גורמת למוגבלות לכל החיים, מפחיתה באופן משמעותי את איכות החיים ומטילה נטל סוציו-כלכלי כבד. מחקר זה בחן את תפקידו של LINC00707 ב-SCI באמצעות ויסות של ציר השליחה miR-145-5p/TRAF6. דגימות פלזמה מ-30 נבדקים בריאים ו-75 חולים עם SCI נותחו לבדיקת ביטוי של LINC00707, miR-145-5p ו-TRAF6 באמצעות RT-qPCR. קשרים בין רמות LINC00707 בפלזמה לבין גורמים פרו-דלקתיים הוערכו בחולים עם SCI. תאי מיקרוגליה מסוג BV2 נחשפו ל-100 ng/mL LPS, ונמדדו גורמים הקשורים לדלקת ולעקה חמצונית. אינטראקציות מולקולריות הוערכו באמצעות בדיקת דו-לוסיפראז (dual-luciferase reporter assay). ניתוח רגרסיה לוגיסטית שימש לזיהוי גורמים הקשורים לביטוי של LINC00707. רמות LINC00707 ו-TRAF6 בפלזמה היו מוגברות בחולים עם SCI, בעוד שרמות miR-145-5p היו מופחתות. רמות LINC00707 בפלזמה נמצאו במתאם חיובי עם רמות גורמים דלקתיים בפלזמה. LINC00707 פעל כספוג מולקולרית עבור miR-145-5p, ו-TRAF6 היה גן מטרה של miR-145-5p. עיכוב של LINC00707 הפחית גורמים דלקתיים, חומרים מעודדי עקה חמצונית ורמות mRNA של TRAF6 בתאי BV2. עיכוב של miR-145-5p הפיק השפעות הפוכות. ממצאים אלה מרמזים כי ביטוי מוגבר של LINC00707 קשור לחומרת ה-SCI, וכי השתקה (knockdown) של LINC00707 עשויה להקל על דלקת ועקה חמצונית המתווכות על ידי מיקרוגליה באמצעות ויסות של ציר השליחה miR-145-5p/TRAF6.

מבוא

פגיעה בחבל השדרה (SCI) היא מצב טראומטי הגורם לנזק לחבל השדרה, רכיב קריטי במערכת העצבים המרכזית. SCI קוטעת באופן ישיר את נתיבי ההולכה העצבית בין חבל השדרה למוח, דבר הגורם לליקויים משמעותיים בתפקודי המוטוריקה, החושים והמערכות האוטונומיות1,2. מחקרים אפידמיולוגיים דיווחו על שכיחות שנתית של כ-5 מקרים ל-100,000 אנשים, כאשר שיעור התמותה הקשור למחלה מגיע עד ל-16.7%3,4. סקר קנדי העריך כי עלות השיקום לאורך החיים עבור כל חולה עם SCI עשויה להגיע עד ל-US$336,0005. השכיחות הגבוהה, שיעור התמותה והעלויות המשמעותיות הקשורות לאבחון, טיפול ושיקום הופכים את SCI לאתגר קליני מרכזי הדורש אסטרטגיות טיפוליות משופרות.

ההתקדמות הפתולוגית של SCI מורכבת משני שלבים: פגיעה ראשונית ופגיעה משנית. פגיעה ראשונית נובעת מדחיסה מכנית טראומטית או מקריעה של רקמת חוט השדרה, בעוד שפגיעה משנית מתווכת על ידי תהליכים פתולוגיים, כולל דלקת ועקה חמצונית6,7. בתנאים פיזיולוגיים, נוירו-דלקת המתווכת על ידי מיקרוגליה תורמת להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית8,9,10. עם זאת, בעקבות SCI, המיקרוגליה הופכת למפועלת באופן מוגזם ומשחררת כמויות גדולות של מתווכי דלקת (pro-inflammatory mediators)11,12. מתווכים אלו גורמים לייצור מופרז של מיני חמצן רדיקליים (ROS), מה שגורם לנזק ולמוות של נוירונים ומחמיר את הפגיעה המשנית בחוט השדרה13,14. לפיכך, דיכוי של הפעלה מוגזמת של מיקרוגליה והקטעת רצף הדלקת מהוויים אסטרטגיות טיפוליות מבטיחות לקידום התאוששות נוירולוגית ולשיפור התוצאות בעקבות SCI.

RNA לא מקודדים ארוכים (lncRNAs) הם סוג של RNA לא מקודדים, שאורכם עולה על 200 נוקלאוטידים ואין להם פוטנציאל לקידוד חלבונים15בתחילה נחשב כטרנסקריפציוני "רעש," lncRNAs מוכרים כיום כווסתים חשובים של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים מגוונים16מחקרים אחרונים הראו כי ל-lncRNAs יש תפקידים קריטיים בפגיעות עצביות. Long intergenic non-protein-coding RNA 707 (LINC00707) התגלה כווסת חשוב של הפרעות במערכת העצבים. מחקרים קודמים דיווחו כי LINC00707 מחמיר פגיעות מוחית טראומטית על ידי הגברת דלקת המתווכת על ידי מיקרוגליה.17בנוסף, Zhu ואחרים. הוכיח כי השתקה של LINC00707 הפחיתה באופן משמעותי דלקת ואפופטוזיס בתאי PC12 שגורמו על ידי ליפופוליסכריד (LPS)18ממצאים אלו מספקים בסיס תיאורטי ראשוני לבחינת המעורבות של LINC00707 בפגיעה בחוט השדרה (SCI). עם זאת, נותר לבסס אם LINC00707 מווסת דלקת המתווכת על ידי מיקרוגליה במהלך SCI.

LncRNAs פועלים כספוגים מולקולריים באמצעות מנגנון ה-competitive endogenous RNA (ceRNA), כאשר הם מבודדים microRNAs (miRNAs) ומסדירים את ביטוי הגנים של מטרות במורד המסלול19. דפוס רגולטורי זה מעורב באופן נרחב בפתוגנזה של מחלות שונות. בפרט, miR-145-5p מופחת משמעותית ברקמות של SCI20 ובמהלך פגיעה המושרית על ידי LPS21, וביטויו יתר מחליש ביעילות את תגובות העקה החמצונית והדלקת של המיקרוגליה22. לגורם Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6) יש אף הוא תפקיד מרכזי בפתולוגיה של SCI23,24,25. עם זאת, השאלה האם LINC00707, miR-145-5p ו-TRAF6 מפעילים פונקציות רגולטוריות מתואמות ב-SCI נותרה לבירור.

במחקר הנוכחי, ביטוי LINC00707 היה מוגבר באופן משמעותי בתאי מיקרוגליה שעברוהסטימולציה על ידי LPS. לפיכך, השערנו כי LINC00707 עשוי לפעול כווסת פרו-דלקתי במיקרוגליה, וכי השתקתו עשויה להפחית את התגובה הנוירו-דלקתית, ובכך לשפר את ההתקדמות הפתולוגית של SCI. מחקר זה בחן האם LINC00707 מווסת תגובות דלקתיות של מיקרוגליה ותורם לפתוגנזה של SCI.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הראשון בז'אנגג'יקו (מספר אישור 2024-KY-18). כל המשתתפים עודכנו במטרות המחקר ובסיכונים הפוטנציאליים וחתמו על טופס הסכמה מדעת לפני הגיוס. דגימות דם ורידיות נאספו מקבוצות ביקורת בריאות במהלך בדיקות גופניות שגרתיות, ומחולים עם פגיעה בחוט השדרה (SCI) מיד לאחר הקבלתו לבית החולים. המדידות המעבדתיות בוצעו על ידי המעבדה הקלינית של בית החולים. כלי המחקר שנעשה בהם שימוש בפרוטוקול זה מפורטים ב- טבלת חומרים.

1. נבדקים
סך הכל 75 חולים עם SCI גויסו מבית החולים הראשון בז'אנגג'יקו (Zhangjiakou First Hospital) בין ינואר 2023 לינואר 2025. קריטריוני ההכללה היו SCI שאושר באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת (CT) או דימות תהודה מגנטית (MRI), וזמן של ≤ 12 h מהפגיעה ועד להשכבה בבית החולים. קריטריוני ההחרגה היו היסטוריה של טראומה או ניתוח בחוט השדרה או במוח במהלך 6 החודשים האחרונים; מחלה קרדיווסקולרית קשה, כולל אוטם בשריר הלב או הפרעות קצב; היריון או הנקה; וגידולים ממאירים, ליקוי בתפקוד הכבד או הכליות, מחלה צרברו-וסקולרית קשה או מחלות זיהומיות.

על פי תקני הסיווג הנוירולוגי של איגוד פגיעות העמודשדרה האמריקאי (ASIA)26, 75 חולים עם SCI סווגו לקבוצות של תפקוד נוירולוגי תקין (n = 21), SCI חלקית (n = 36) ו-SCI מלאה (n = 18). התפלגות אתרי הפגיעה הייתה כדלקמן: צווארית, 36.0%; חזית, 30.7%; ומותנית, 33.3%. 30 אנשים בריאים שהותאמו לאוכלוסיית המחקר גויסו באופן אקראי כדי לשמש כקבוצת ביקורת. מידע קליני בסיסי נאסף עבור כל המשתתפים. קריטריוני ההכללה עבור אנשים בריאים היו: ללא היסטוריה של טראומה של חוט השדרה או המוח, ניתוח, או הפרעות נוירולוגיות; ללא היסטוריה של מחלות דלקתיות כרוניות, הפרעות אוטואימוניות או גידולים ממאירים; ללא מחלה קרדיווסקולרית, כבדית או כלייתית חמורה; ללא זיהום חריף או כרוני ב-4 השבועות האחרונים; ללא היריון או הנקה; והתאמה בגיל ובמין לקבוצת ה-SCI.

מדד העצמאות התפקודית (FIM) שימש להערכת העצמאות התפקודית בפעילויות היומיום. הניקוד המקסימלי ב-FIM הוא 126. תחושה מגעית, acmesthesia וניקוד מוטורי שימשו להערכת התפקוד החושי והמוטורי. הניקוד המקסימלי לתחושה מגעית ול-acmesthesia היה 112, והניקוד המוטורי המקסימלי היה 100. ניקוד נמוך יותר מעיד על ליקוי נוירולוגי חמור יותר.

2. תרבית תאים, בניית מודל והטרנספקציה
תאי מיקרוגליה BV2 של עכבר המוקטנים (Immortalized) התקבלו ממרכז משאבי התאים של מכון הביוטכנולוגיה של שנגחאי. התאים תורבדו במצע DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) עם רמת גלוקוז גבוהה, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין (100 U/mL) וסטרהפტომיצין (100 U/mL). התאים הוחזקו בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח הכיל 5% CO₂.

לבניית המודל, תאי BV2 עוררו באמצעות 0, 10, 20, 50, 100, 150, או 200 ng/mL של lipopolysaccharide (LPS) למשך 24 h. ריכוז ה-LPS האופטימלי נבחר על סמך התוצאות הניסיוניות.

עבור טרנספקציה, תאי BV2 נזרעו בלוחיות בעלות 6 בארות ועברו טרנספקציה ברגע שהגיעו לצפיפות (confluence) המתאימה. נעשה שימוש ברכיב טרנספקציה בריכוז של 1.5 µL/well בהתאם להוראות היצרן. לאחר 6 h, מצע התרבית הוחלף במצע טרי, והתאים תורבדו למשך 24 h נוספות. עבור המבנה להשקת LINC00707, הביקורת השלילית התואמת, אוליגנוקלאיד miR-145-5p ואוליגנוקלאיד הביקורת התואם, נעשה שימוש בריכוז של 50 nM לכל בארה. כל ניסויי הטרנספקציה חזרו באופן בלתי תלוי לפחות 5 פעמים, עם 3 חזרות מקבילות לכל ניסוי בלתי תלוי. הנתונים נותחו סטטיסטית באמצעות תוצאות של לפחות 5 ניסויים בלתי תלויים.

3. ELISA
את עליוני תרבית התאים (supernatants) של תאי BV2 שעברו טרנספקציה ועירור באמצעות LPS אספו על ידי צנטריפוגציה במהירות של 12,000 × g למשך 10 דקות, ורמות של interleukin-1β (IL-1β), IL-6 ו-tumor necrosis factor-α (TNF-α) נמדדו באמצעות ערכות ELISA המתאימות. בקצרה, הבדיקה בוצעה על ידי אינקובציה רצופית עם נוגדן מסומן בביוטין, קונג'וגט של HRP-streptavidin ותסבסב TMB, בהתאם להוראות היצרן. הבליעה נמדדה באורך גל של 450 nm באמצעות קורא מיקרו-פלייטים. רמות הציטוקינים נקבעו על פי עקומות סטנדרט. כל דגימה נמדדה בשלוש חזרות, ובוצעו 6 ניסויים עצמאיים.

4. מדידת ROS
רמות ה-ROS התוך-תאיים בתאי BV2 שעברו סטימולציה באמצעות LPS נמדדו באמצעות ערכה לבדיקת מיני חמצן ראקטיביים (reactive oxygen species assay kit). בקצרה, התאים דגרו עם 10 µmol/L DCFH-DA בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, הוסר הנוזל שמעל התאים והתאים נשטפו 3 פעמים בתמיסת PBS כדי להסיר שאריות של הגשוש (probe) החוץ-תאי. עוצמת הפלואורסצנציה נמדדה באמצעות קורא לוחות (microplate reader) באורכי גל של עירור ופליטה של 488 nm ו-525 nm, בהתאמה. רמות ROS יחסיות חושבו על בסיס עוצמת הפלואורסצנציה. כל הדגימות נותחו בשלוש חזרות, והניסוי כולו חזר באופן עצמאי לפחות 5 פעמים.

5. זיהוי של מלונדיאלדהיד, סופראוקסיד דיסמוטאז וגלוטתיון
תאי BV2 שעברו טיפול נאספו, והוכנו הומוגנאטים של התאים. דגימות סנטריפוגו במהירות של 12,000 × g למשך 10 דקות ב-4 °C כדי לקבל את העילאי. ערכות זיהוי מסחריות למלונדיאלדהיד (MDA), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) וגלוטתיון (GSH) שימשו לקביעת רמותיהם בעילאי התאים, בהתאם להוראות היצרן. כל הדגימות נותחו בשלוש חזרות, והניסוי כולו חזר באופן עצמאי לפחות 5 פעמים.

6. בדיקת דואל-לוציפראז (Dual-luciferase reporter assay)
מקטעים של האזור הבלתי מתורגם 3' (3' UTR) של LINC00707 ו-TRAF6 המכילים את אתרי הקשירה החזויים של miR-145-5p, יחד עם הרצפים המוטנטיים התואמים, שוכפלו לתוך וקטור הדוח לוציפראז pmirGLO כדי ליצור קונסטרוקטים של דוח מסוג פראי (WT-LINC00707 ו-WT-TRAF6) ומסוג מוטנטי (MUT-LINC00707 ו-MUT-TRAF6). תאי BV2 עברו טרנספקציה משולבת של קונסטרוקטי הדוח ואוליגונוקלאידים של miR-145-5p וגודלו במשך 24 h. לאחר מכן התאים נאספו, ופעילות לוציפראז של firefly ו-Renilla נמדדה באמצעות קורא מיקרו-פלטה.

7. RT-qPCR
RNA כולל הוצאה באמצעות ריאגנט להוצאת RNA. איכות ה-RNA הוערכה באמצעות יחס OD₂₆₀/OD₂₈₀, כאשר ערכים שבין 1.8 ל-2.0 נחשבו למקובלים. כ-1 µg של RNA כולל הועבר ל-cDNA באמצעות ערכה לשעתוק הפוך. ביטוי גנים נכמת באמצעות RT-qPCR באמצעות SYBR Green PCR master mix. שעתוק הפוך בוצע ב-42 °C למשך 15 min, ולאחריו ביטול פעילות של reverse transcriptase ב-95 °C למשך 3 min. ה-cDNA המסנתזאשמר במאוזן ב-−20 °C עד לניתוח. PCR כמותי בזמן אמת בוצע באמצעות דנטורציה מוקדמת ב-95 °C למשך 1 min, ולאחריה 40 מחזורים של דנטורציה ב-95 °C למשך 5 s והיכרות (annealing) והארכה ב-60 °C למשך 15 s. אותות פלואורסצנציה נאספו בסוף כל שלב של היכרות והארכה. ניתוח עקומת התכה בוצע ב-95 °C למשך 15 s, ולאחריו ב-60 °C למשך 1 min. רמות ביטוי יחסיות חושבו באמצעות שיטת 2⁻ΔΔCt. GAPDH או 5S שימשו כרפרנס פנימי לנורמליזציה של ביטוי הגנים. רצפי הפריימרים היו כדלקמן: LINC00707, forward 5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3' ו-reverse 5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'; miR-145-5p, forward 5'-GCCGAGGTCCAGTTTTCCCA-3' ו-reverse 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'; TRAF6, forward 5'-ATTACAACTGAGGTGCTTCT-3' ו-reverse 5'-GCATCTGGTTCTGTTATAGGA-3'; GAPDH, forward 5'-ATCCCATCACCATCTTCCAGG-3' ו-reverse 5'-CGCCCCACTTGATTTTGG-3'; ו-5S, forward 5'-TCGTCTGATCTCGGAAGCTAA-3' ו-reverse 5'-AAGCCTACAGCACCCGGTAT-3'.

8. ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנה סטטיסטית. נורמליות התפלגות הנתונים הוערכה באמצעות מבחן Shapiro-Wilk, כאשר P > 0.05 העיד על התפלגות נורמלית. נתונים בעלי התפלגות נורמלית הוצגו כממוצע ± SD, בעוד שנתונים שאינם בעלי התפלגות נורמלית הוצגו כחציון (P25, P75). עבור משתנים רציפים בעלי התפלגות נורמלית, השוואות בין 2 קבוצות בוצעו באמצעות מבחן t של Student, והשוואות בין קבוצות מרובות בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני ולאחריו מבחן post hoc של Tukey. עבור נתונים שאינם בעלי התפלגות נורמלית, נעשה שימוש במבחן Mann-Whitney U להשוואות בין 2 קבוצות, ובמבחן Kruskal-Wallis להשוואות בין קבוצות מרובות. מבחן chi-square שימש לניתוח משתנים קטגוריאליים בין קבוצות. ניתוחי רגרסיה לוגיסטית חד-משתנית ורב-משתנית שימשו להערכת גורמים קליניים הקשורים לביטוי של LINC00707. משתנים רציפים חולקו לשתי קבוצות לפי חציון העמות (קבוצת ערך גבוה = 1; קבוצת ערך נמוך = 0). משתנים עם P < 0.05 בניתוח רגרסיה לוגיסטית חד-משתנית הוכנסו לניתוח רגרסיה לוגיסטית רב-משתנית. התוצאות הוצגו כיחסי סיכויים (ORs) עם רווחי סמך (CIs) של 95%, כאשר OR > 1 העיד על קשר חיובי ו-OR < 1 העיד על קשר שלילי. כל ניסויי הפנוטיפ של התאים כללו לפחות 4 חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, עם 3 חזרות טכניות לכל חזרה ביولوجית. P < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

תוצאות

רמות LINC00707 בפלזמה היו גבוהות בחולים עם SCI
נותחו המאפיינים הקליניים הבסיסיים של 30 נבדקים בריאים ו-75 חולים עם SCI. בהשוואה לנבדקים בריאים, לחולים עם SCI היו ציונים נמוכים באופן ניכר בתחושת מגע, acmesthesia, תפקוד מוטורי ומדד עצמאות תפקודית (FIM), מה שמעיד על פגיעה בתפקוד החושי והמוטורי. בנוסף, רמות של ציטוקינים פרו-דלקתיים בסרום היו גבוהות באופן משמעותי בחולים עם SCI מאשר בביקורות בריאות (טבלה 1, P < 0.001), מה שמרמז על תגובה דלקתית מוגברת.

פריטיםHSSCIP-value
(n=30)(n=75)
גיל (שנים)45.83±10.0646.17±9.920.786
BMI (kg/m2)22.82±1.5723.94±1.290.69
מגדר (גבר, n)18410.619
עישון (n)11280.949
שתייה (n)14330.804
סיווג ASIA של SCI (n)/
SCI מלא/18
SCI חלקי/36
תפקוד עצבי תקין/21
רמת פגיעת ה-SCI (n, %)/
חוליה צווארית/27 (36.0%)
חוליה חזית/23 (30.7%)
חוליה מותנית/25 (33.3%)
ציון תחושה מישית/53.42±22.12
ציון אקמסטזיה/53.39±24.68
ציון תרגול/49.07±18.74
ציון מדד עצמאות תפקודית/71.33±19.41
IL-1β (pg/mL)1.47±0.5252.21±11.32<0.001
IL-6 (pg/mL)2.14±0.9788.47±23.52<0.001
TNF-α (pg/mL)2.84±1.1361.09±18.24<0.001
CRP (mg/L)1.42±0.6362.67±21.85<0.001
קיצורים: HS, נבדק בריא; SCI, פגיעה בחוט השדרה; BMI, מדד מסת הגוף; ASIA, איגוד הפגיעות בעמוד השדרה האמריקאי; FIM, מדד עצמאות תפקודית; IL, אינטרלוקין; TNF, גורם נמק גידולים; CRP, חלבון C-ריאקטיבי.

טבלה 1: השוואה של מאפיינים קליניים בבסיס בין נסיינים בריאים לבין חולי פגיעה בחוט השדרה. טבלה זו משווה מאפיינים דמוגרפיים, ציוני תפקוד נוירולוגי, משתנים הקשורים לפגיעה ורמות של סמני דלקת בין נסיינים בריאים לבין חולי פגיעה בחוט השדרה. קיצורים: HS, נסיינים בריאים; SCI, פגיעה בחוט השדרה; ASIA, איגוד הפגיעות בעמוד השדרה האמריקאי; FIM, מדד העצמאות התפקודית; IL, אינטרלוקין; TNF, גורם נמק גידולי; CRP, חלבון C רגיב.

הביטוי של LINC00707 בפלזמה נמדד באמצעות RT-qPCR. בהשוואה לנבדקים בריאים, חולים עם SCI הראו ביטוי מוגבר משמעותית של LINC00707 בפלזמה (איור 1A, P < 0.001). ניתוח עקומי מאפייני תגובה (ROC) סיפק ראיות ראשוניות לכך שלביטוי LINC00707 עשוי להיות ערך מבחין בהפרדה בין חולים עם SCI לנבדקים בריאים (איור 1B). יתרה מכך, הביטוי של LINC00707 בפלזמה עלה ככל שהחמירה החומרה הקלינית של ה-SCI (איור 1C, P < 0.001). ניתוח קורלציה הראה כי הביטוי של LINC00707 בפלזמה קשור באופן חיובי לרמות של IL-1β (r = 0.635, P < 0.001), IL-6 (r = 0.612, P < 0.001), TNF-α (r = 0.675, P < 0.001) ו-C-reactive protein (CRP; r = 0.611, P < 0.001) (איור 1D–G). ממצאים אלו מרמזים כי ביטוי מוגבר של LINC00707 קשור לתגובות דלקתיות בחולים עם SCI.

תרשימי עמודות של ניתוח ביטוי A, C; עקומת ROC B; תרשימי פיזור של מתאם D-G; השוואת נתונים מדעיים.
איור 1ביטוי LINC00707 בפלזמה והמתאמים שלו עם גורמים דלקתיים בפלזמה. (Aהביטוי של LINC00707 בפלזמה היה גבוה יותר בחולים עם פגיעה בחוט השדרה (SCI) מאשר בנבדקים בריאים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t למדגמים בלתי תלויים.Bניתוח עקומת מאפייני תגובה של מקלט (ROC) סיפק אינדיקציה ראשונית לכך שביטוי LINC00707 עשוי להועיל להבחנה בין חולים עם SCI לנבדקים בריאים.Cביטוי ה-LINC00707 בפלזמה עלה עם העלייה בחומרת הפגיעה בחוט השדרה (SCI), בהתאם לסיווג של איגוד הפגיעות בעמוד השדרה האמריקאי (ASIA). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA חד-כיווני, ולאחריו מבחן post hoc מסוג Tukey’s HSD.ד–גהביטוי של LINC00707 בפלסמה נמצא במתאם חיובי עם רמות של גורמי דלקת. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח מתאם פירסון. *P < 0.01 ו-**P < 0.001. נבדקים בריאים, n = 30; חולים עם פגיעה בחוט השדרה (SCI), n = 75. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

גורמים הקשורים לביטוי LINC00707 נותחו באמצעות רגרסיה לוגיסטית חד-משתנית ורב-משתנית
ניתוחי רגרסיה לוגיסטית חד-משתנית ורב-משתנית בוצעו כדי לזהות גורמים הקשורים לביטוי LINC00707. ניתוח חד-משתני הראה כי סיווג ה-ASIA של SCI (OR = 3.912, 95% CI: 1.792–8.537, P < 0.001), מדד ה-FIM (OR = 0.281, 95% CI: 0.108–0.729, P = 0.009), ורמת ה-CRP (OR = 4.600, 95% CI: 1.724–12.271, P = 0.002) היו קשורים לביטוי LINC00707. לאחר התאמה למשתנים מתערבים פוטנציאליים, רגרסיה לוגיסטית רב-משתנית הראתה כי סיווג ה-ASIA של SCI (OR = 2.598, 95% CI: 1.088–6.203, P = 0.032), מדד ה-FIM (OR = 0.303, 95% CI: 0.102–0.902, P = 0.032), ורמת ה-CRP (OR = 3.202, 95% CI: 1.024–10.015, P = 0.045) היו גורמים בלתי תלויים הקשורים לביטוי LINC00707 (Table 2). סיווג ASIA חמור יותר ורמות CRP מוגברות היו קשורים לביטוי גבוה יותר של LINC00707, בעוד שמדד FIM גבוה יותר היה קשור לביטוי נמוך יותר של LINC00707. קשרים אלו תומכים עוד יותר באפשרות ש-LINC00707 מעורב בתהליך הפתולוגי של SCI.

פריטיםניתוח רגרסיה חד-משתניניתוח רגרסיה רב-משתני
או95% CI (רווח ברחשה של 95%)Pערך-pאורווח בר-סמך של 95%Pערך-p
גיל 1.1760.475-2.9140.725
מגדר1.3030.524-3.2400.57
סיווג ASIA לפגיעות בחוט השדרה (SCI) 3.9121.792-8.537<0.0012.5981.088-6.2030.032
סיווג ASIA של פגיעות רכבתיות (SCI)0.5880.497-1.4800.582
מדד תחושה מגעית0.850.343-2.1050.725
מדד אקמתזיה (Acmesthesia score)0.8540.345-2.1190.734
ציון פעילות גופנית0.3920.153-1.0060.051
מדד FIM0.2810.108-0.7290.0090.3030.102-0.9020.032
IL-1β1.1810.475-2.9350.72
IL-6 1.4530.585-3.6080.42
TNF-α1.3040.526-3.2330.567
חלבון מגיב C (CRP) 4.61.724-12.2710.0023.2021.024-10.0150.045
קיצורים: OR, יחס סיכויים; CI, רווח בר-סמך; ASIA, איגוד הפגיעות בעמוד השדרה האמריקאי; FIM, מדד עצמאות תפקודי; IL, אינטרלוקין; TNF, גורם נמק גידולים; CRP, חלבון C-ריאקטיבי.

טבלה 2: ניתוח רגרסיה לוגיסטית של גורמים הקשורים לביטוי של LINC00707. טבלה זו מציגה את ניתוחי הרגרסיה הלוגיסטית החד-משתנית והרב-משתנית ששימשו לזיהוי גורמים קליניים הקשורים לביטוי LINC00707 בחולים עם פגיעה בחוט השדרה. התוצאות מוצגות כיחסי סיכויים עם רווחי סמך של 95% וערכי P תואמים. קיצורים: OR, יחס סיכויים; CI, רווח סמך; ASIA, איגוד הפגיעות בעמוד השדרה האמריקאי; FIM, מדד עצמאות תפקודית; IL, אינטרלוקין; TNF, גורם נמק גידולים; CRP, חלבון C-reactive.

השקת LINC00707 הפחיתה דלקת ועקה חמצונית בתאי BV2 שעברו סטימולציה על ידי LPS
תאי BV2 טופלו בריכוזים עולים של LPS (0, 10, 20, 50, 100, 150, או 200 ng/mL). ניתוח RT-qPCR הראה כי הביטוי של LINC00707 עלה באופן משמעותי לאחר טיפול ב-100, 150 ו-200 ng/mL LPS (איור 2A, P < 0.001, n = 6). בהתבסס על ממצאים אלו ודיווחים קודמים27˒28, נבחר ריכוז של 100 ng/mL LPS להקמת מודל SCI in vitro. בהשוואה לקבוצת הביקורת, הביטוי של LINC00707 היה גבוה באופן משמעותי בתאי BV2 שעברו סטימולציה על ידי LPS. טרנספקציה של si-LINC00707 דיכאה ביעילות את הביטוי של LINC00707 (איור 2B, P < 0.001, n = 6).

לאחר מכן נבחנו ההשפעות של השתקת LINC00707 על דלקת ועקה חמצונית. גירוי באמצעות LPS העלה באופן משמעותי את הפרשת IL-1β (איור 2C, P < 0.001, n = 5), IL-6 (איור 2D, P < 0.001, n = 5), ו-TNF-α (איור 2E, P < 0.001, n = 5), כמו גם את רמות ה-ROS התוך-תאיים (איור 2F, P < 0.001, n = 6) ואת תכולת ה-MDA (איור 2G, P < 0.001, n = 5). בניגוד לכך, גירוי LPS הפחית באופן משמעותי את רמות הסממנים לנוגדי חמצון SOD (איור 2H, P < 0.001, n = 6) ו-GSH (איור 2I, P < 0.001, n = 5). השתקת LINC00707 הפחיתה באופן משמעותי את הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים ואת רמות הסממנים לעקה חמצונית, תוך השבת רמות נוגדי החמצון בתאי BV2 שגורו ב-LPS. ממצאים אלו מעידים כי השתקת LINC00707 ממתנת את התגובות הדלקתיות ואת העקה החמצונית המושרות על ידי LPS בתאי BV2.

סדרת תרשימי עמודות המנתחים ביטוי ציטוקינים ופרמטרים ביוכימיים בניסוי המושרה על ידי LPS.
איור 2: השפעות של knockdown ל-LINC00707 על דלקת ועקה חמצונית בתאי BV2 שעברו גרייה ב-LPS. תאי BV2 גורו באמצעות 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS). (A) ביטוי LINC00707 נמדד באמצעות RT-qPCR בתאי BV2 שטופלו בריכוזים שונים של LPS. (B) ביטוי LINC00707 עלה בקבוצת ה-LPS וירד לאחר טרנספקציה של si-LINC00707. (C–E) בדיקת ELISA הראתה כי הפרשת גורמים פרו-דלקתיים עלתה בקבוצת ה-LPS וירדה בעקבות knockdown ל-LINC00707. (F–G) רמות מיני חמצן רהיטים (ROS) ותוכן malondialdehyde (MDA) עלו בקבוצת ה-LPS וירדו בעקבות knockdown ל-LINC00707. (H–I) פעילות superoxide dismutase (SOD) ורמות glutathione (GSH) מופחת עלו בקבוצת ה-LPS וגברו בעקבות knockdown ל-LINC00707. **P < 0.001; ns, לא מובהק. n ≥ 5. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן Tukey’s HSD post hoc. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

LINC00707 מתפקד כספוג מולקולרי עבור miR-145-5p
כדי לחקור את המנגנון המולקולרי העומד בבסיס התפקוד הביולוגי של LINC00707, נעשה שימוש במסד הנתונים ENCORI כדי לחזות miRNAs מטרה פוטנציאליים. ניתוח ביואינפורמטי זיהה רצפי קישור משלימים בין LINC00707 לבין miR-145-5p (איור 3A). בדיקות דואל-לוציפרז (Dual-luciferase reporter assays) הראו כי פעילות הלוציפרז בבניות ה-WT-LINC00707 פחתה באופן משמעותי על ידי miR-145-5p mimic ועלתה על ידי miR-145-5p inhibitor. לעומת זאת, אף אחד מהטיפולים לא השפיע על פעילות הלוציפרז בבניות ה-MUT-LINC00707 (איור 3B, P < 0.001, n = 4), מה שמאשש את האינטראקציה הישירה בין LINC00707 ל-miR-145-5p.

ניתוח RT-qPCR הראה כי ביטוי miR-145-5p בפלזמה פחת באופן משמעותי בחולים עם SCI בהשוואה לנבדקים בריאים (איור 3C, P < 0.001). בנוסף, ביטוי LINC00707 נמצא במתאם שלילי עם ביטוי miR-145-5p (איור 3D, P < 0.001), ורמות miR-145-5p בפלזמה פחתו בהדרגה עם העלייה בחומרת ה-SCI (איור 3E, P < 0.001). In vitro, ביטוי miR-145-5p פחת באופן משמעותי בתאי BV2 שעוברו סטימולציה של LPS בהשוואה לתאי בקרה, בעוד שהשחת (knockdown) של LINC00707 השחזירה את ביטוי miR-145-5p (איור 3F, P < 0.001, n = 6). ממצאים אלו מרמזים כי LINC00707 מתפקד כ-competing endogenous RNA (ceRNA) על ידי ספיחת miR-145-5p ובכך מווסת את ביטויו במהלך ההתקדמות הפתולוגית של SCI.

ניתוח ביטוי גנים; miR-145-5p, בדיקת לוסיפראז, גרף מתאם; תרשימי עמודות, יישור רצפים.
איור 3LINC00707 מתפקד כספוג מולקולרי עבור miR-145-5p. (A) מסד הנתונים ENCORI חזה רצפי קישור משלימים בין LINC00707 לבין miR-145-5p. (ב) בדיקת דו-לוסיפראז (dual-luciferase reporter assay) איששה את האינטראקציה בין LINC00707 לבין miR-145-5p. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA דו-כיווני, ולאחריו מבחן פוסט-הוק מסוג Tukey’s HSD. (ג) בדיקת RT-qPCR הראתה כי ביטוי miR-145-5p בפלסמה היה מופחת בחולים עם SCI. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t למדגמים בלתי תלויים. (ד) ביטוי LINC00707 נמצא במתאם שלילי עם ביטוי miR-145-5p בחולים עם פגיעה בחוט השדרה (SCI). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח מתאם פירסון (Pearson correlation analysis). (E) ביטוי miR-145-5p בפלזמה פחת עם העלייה בחומרת הפגיעה בחוט השדרה (SCI) בהתאם לסיווג ASIA. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני, ולאחריו מבחן פוסט-הוק מסוג Tukey’s HSD. (F) הביטוי של miR-145-5p פחת בקבוצת ה-LPS, עלה בעקבות טרנספקציה של si-LINC00707, וירד בעקבות טרנספקציה של מעכב miR-145-5p. ניתוח סטטיסטי בוצע בוצע באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way ANOVA), ולאחריו מבחן פוסט-הוק מסוג Tukey’s HSD. P < 0.05, *P < 0.01, ו-**P < 0.001; ns, לא מובהק. נבדקים בריאים, n = 30; חולים עם SCI, n = 75; ניסויי תאים, n ≥ 4. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עיכוב של miR-145-5p הגביר את הדלקת ואת העקה החמצונית בתאי BV2 שעברו גרייה באמצעות LPS
כדי לחקור את תפקידו של miR-145-5p, תאי BV2 עברו טרנספקציה עם מעכב miR-145-5p או עם ביקורת שלילית תואמת. לאחר מכן הוערכו הרמות של ציטוקינים דלקתיים ומסמני עקה חמצונית. בהשוואה לקבוצת הביקורת השלילית למעכב, עיכוב של miR-145-5p העלה באופן מובהק את הפרשתו של IL-1β (איור 4A, P < 0.001, n = 5), IL-6 (איור 4B, P < 0.001, n = 5), ו-TNF-α (איור 4C, P < 0.001, n = 5). בנוסף, רמות ה-ROS התוך-תאיות (איור 4D, P < 0.001, n = 6) ותכולת ה-MDA (איור 4E, P < 0.001, n = 5) עלו באופן מובהק, בעוד שרמות ה-SOD (איור 4F, P < 0.001, n = 6) וה-GSH (איור 4G, P < 0.001, n = 5) ירדו באופן מובהק. ממצאים אלו מעידים כי עיכוב של miR-145-5p הופך את ההשפעות המגנות של knockdown של LINC00707 על דלקת ועקה חמצונית המושרות על ידי LPS בתאי BV2.

תרשימי עמודים המשווים רמות ביטוי חלבון עם טיפול ב-LPS במחקר עיכוב גנים.
איור 4: השפעות עיכוב miR-145-5p על דלקת ועקה חמצונית בתאי BV2. (A–C) בדיקת ELISA הראתה כי הפרשתם של גורמים פרו-דלקתיים עלתה באופן משמעותי לאחר טרנספקציה עם המעכב של miR-145-5p. (D–E) רמות רדיקלי חמצן חופשיים (ROS) ותכולת malondialdehyde (MDA) עלו באופן משמעותי לאחר טרנספקציה עם המעכב של miR-145-5p. (F–G) פעילות superoxide dismutase (SOD) ורמות glutathione (GSH) פחתו באופן משמעותי לאחר טרנספקציה עם המעכב של miR-145-5p. **P < 0.001. n ≥ 5. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן Tukey’s HSD post hoc. נתונים מוצגים כממוצע ± SD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

זיהוי TRAF6 כגן מטרה של miR-145-5p
בסיס הנתונים miRDB חזה את TRAF6 כמטרה פוטנציאלית של miR-145-5p. רצפי קישור משלימים בין ה-3′ UTR של TRAF6 לבין miR-145-5p זוהו (איור 5A). בדיקות דואל-לוציפראז (Dual-luciferase reporter assays) הראו כי פעילות הלוציפראז במבנה WT-TRAF6 פחתה באופן משמעותי על ידי ה-mimic של miR-145-5p ועלתה על ידי המעכב (inhibitor) של miR-145-5p. לעומת זאת, אף אחד מהטיפולים לא השפיע על פעילות הלוציפראז במבנה MUT-TRAF6 (איור 5B, P < 0.001, n = 4), מה שמאשר כי TRAF6 הוא מטרה ישירה של miR-145-5p.

ניתוח RT-qPCR הראה כי ביטוי mRNA של TRAF6 בפלזמה היה מוגבר באופן משמעותי בחולים עם SCI (איור 5C, P < 0.001). ביטוי TRAF6 נמצא במתאם שלילי עם ביטוי של miR-145-5p (איור 5D, P < 0.001), ורמות mRNA של TRAF6 בפלזמה עלו עם חומרת ה-SCI (איור 5E, P < 0.001). In vitro, ביטוי TRAF6 היה מוגבר באופן משמעותי בתאי BV2 שעברו גירוי באמצעות LPS בהשוואה לקבוצת הביקורת, אך הופחת באופן משמעותי לאחר knockdown של LINC00707 (איור 5F, P < 0.001, n = 6). לעומת זאת, עיכוב של miR-145-5p השחזר את ביטוי TRAF6 (איור 5G, P < 0.001, n = 6). ממצאים אלו מעידים כי LINC00707 מווסת את ביטוי TRAF6 באמצעות מסלול השיגנל של miR-145-5p.

דיאגרמת בקרה של ביטוי גנים עם אינטראקציית miR-145-5p; כוללת משוואות, תרשימים ונתונים.
איור 5: TRAF6 הוא גן מטרה של miR-145-5p. (A) מסד הנתונים miRDB חזה רצפי קישור משלימים בין TRAF6 ל-miR-145-5p. (B) בדיקת reporter של dual-luciferase אישרה את קשר המטרה בין TRAF6 ל-miR-145-5p. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות two-way ANOVA ולאחריו מבחן Tukey’s HSD post hoc. (C) RT-qPCR הראה כי ביטוי TRAF6 בפלזמה היה מוגבר בחולים עם SCI. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות independent-samples t-test. (D) ביטוי TRAF6 נמצא במתאם שלילי עם ביטוי miR-145-5p בפלזמה בחולים עם SCI. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח מתאם פירסון (Pearson correlation analysis). (E) ביטוי TRAF6 בפלזמה עלה עם העלייה בחומרת ה-SCI על פי סיווג ASIA. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן Tukey’s HSD post hoc. (F) ביטוי TRAF6 היה מוגבר בתאי BV2 שעברו גרייה ב-LPS ופחת לאחר knockdown של LINC00707. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן Tukey’s HSD post hoc. (G) ביטוי TRAF6 עלה בעקבות עיכוב של miR-145-5p. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן Tukey’s HSD post hoc. P < 0.05, *P < 0.01, ו-**P < 0.001; ns, לא מובהק. נבדקים בריאים, n = 30; חולים עם SCI, n = 75; ניסויי תאים, n ≥ 4. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

זמינות נתונים:
המאגרי נתונים שהופקו ו/או נותחו במחקר הנוכחי זמינים במאגר Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.21470454.

דיון

פגיעה בחבל השדרה (SCI) היא הפרעה טראומטית חמורה של מערכת העצבים המרכזית הגורמת לפגיעה או לאובדן מלא של ההולכה העצבית דרך חבל השדרה, דבר המוביל לליקויים מוטוריים, תחושתיים ואוטונומיים לכל החיים, וכן להשלכות פיזיולוגיות ופסיכולוגיות עמוקות29˒30. חומרת ליקויים אלו עולה בדרך כלל עם היקף הפגיעה בחבל השדרה. במחקר הנוכחי, ביטוי LINC00707 בפלזמה היה מוגבר בחולים עם SCI והיה במתאם חיובי עם רמות של ציטוקינים פרו-דלקתיים במחזור הדם, מה שמרמז על תפקיד פוטנציאלי של LINC00707 בדלקת ובעקה חמצונית הקשורות ל-SCI. בהתבסס על ממצאים קליניים אלו, חקרנו להלביה את התפקיד הרגולטורי של LINC00707 בדלקת ובעקה חמצונית בתאי BV2 שעברו טיפול ב-LPS, בהקשר של פתוגנזה של SCI.

LINC00707 מעורב במגוון תהליכים ביולוגיים באמצעות ויסות של מסלולי איתות מרובים31. בנוסף לוויסות של שגשוג תאים, אפופטוזיס, נדידה ופלישה, נמצא כי LINC00707 משתתף בתגובות דלקתיות ובעקה חמצונית18˒32˒33. מחקרים קודמים דיווחו על ביטוי מוגבר של LINC00707 בסרטני ריאות34, שד35, צוואר הרחם36 וכבד37, שם הוא מקדם את התקדמות המחלה על ידי ויסות של מטרות מולקולריות במורד המסלול. בנוסף, השתקה של LINC00707 מקדמת את ההבדלה האוסטאוגנית של תאי גזע מזנכימליים ממח העצם באמצעות ויסות של miR-103a-3p38. Zou et al. הדגימו עוד כי LINC00707 מקדם תגובות דלקתיות המושרות על ידי LPS בתאי MRC-5, ובכך תמכו בתפקידו הפרו-דלקתי33. בהתאם לממצאים אלו, המחקר הנוכחי הראה כי ביטויו של LINC00707 עלה באופן משמעותי בתאי BV2 שעברו גירוי LPS, בעוד שהשקתה של LINC00707 הפחיתה את ייצורם של ציטוקינים פרו-דלקתיים ומסמני עקה חמצונית. ממצאים אלו תומכים עוד יותר במעורבותו של LINC00707 בתגובות דלקתיות ובתגובות לעקה חמצונית.

דיווחים קודמים הצביעו על כך ש-LINC00707 פועל כ-RNA אנדוגני מתחרה (ceRNA) על ידי ויסות של miR-145-5p במספר מצבים פתולוגיים, כולל מחלת לב רומטית39, סרטן של השלפוחית40, ודיפרנציאציה אוסטאוגנית41. מחקרים קודמים הראו כי miR-145-5p מפעיל השפעות מגינות ב-SCI על ידי דיכוי דלקת ועקה חמצונית42˒43, ועל ידי קידום אנגיוגנזה ותיקון עצבי44˒45. בהתאמה לתצפיות אלה, המחקר הנוכחי הראה כי ביטוי של miR-145-5p בפלזמה היה נמוך בחולים עם SCI ובתאי BV2 שעברוהסטימולציה על ידי LPS. לעומת זאת, אושש כי LINC00707 מקייים אינטראקציה ישירה עם miR-145-5p, והשתקת LINC00707 החזירה את ביטוי ה-miR-145-5p. יתרה מכך, עיכוב של miR-145-5p ביטל את ההשפעות המגינות של השתקת LINC00707 על תגובות דלקתיות ועקה חמצונית. ממצאים אלו מרמזים כי LINC00707 עשוי לתרום להתקדמות ה-SCI על ידי ויסות תגובות דלקתיות ותגובות עקה חמצונית המתווכות על ידי miR-145-5p.

מחקרים קודמים הדגימו כי TRAF6 ממלא תפקיד חשוב במחלות של מערכת העצבים המרכזית46. ראיות מצביעות גם על כך שעיכוב של TRAF6 יכול לשפר באופן משמעותי SCI47˒48. המחקר הנוכחי זיהה באופן נוסף את TRAF6 כמטרה ישירה של miR-145-5p. ביטוי TRAF6 עלה באופן משמעותי בחולים עם SCI ובתאי BV2 שעברו סטימולציה של LPS. בנוסף, knockdown של LINC00707 הפחית את ביטוי TRAF6, בעוד שעיכוב של miR-145-5p החזיר את ביטוי TRAF6. ממצאים אלו מרמזים כי LINC00707 עשוי לווסת את ביטוי TRAF6 באמצעות miR-145-5p במהלך SCI.

מחקר זה מרמז כי LINC00707 עשוי להשפיע על תגובות דלקתיות המתווכות על ידי מיקרוגליה ועל פגיעה כתוצאה מעקה חמצוני במהלך SCI, על ידי ויסות ציר הסיגנלינג miR-145-5p/TRAF6. ממצא זה עולה בקנה אחד עם דיווח קודם של Zhu et al., אשר הדגימו כי השתקת LINC00707 הפחיתה דלקת ואפופטוזיס המושרים על ידי LPS בתאי PC-12; עם זאת, המנגנון הבסיסי במחקרם כלל את ציר miR-30a-5p/Neurod118. יחד, ממצאים אלו מצביעים על כך ש-LINC00707 עשוי שלא לפעול דרך מטרה אחת של miRNA, אלא דרך רשתות miRNA נפרדות באופן התלוי בסוג התא, ובכך לתרום לתהליכים הפתולוגיים של SCI.

למחקר זה מספר מגבלות. ראשית, הוערך ביטוי ה-mRNA של TRAF6 בלבד, בעוד שביטוי החלבון לא נבדק. מחקרים עתידיים צריכים לכלול אישוש ברמת החלבון, כגון אנליזת Western blot, כדי לאפיין יותר את מערכת היחסים הרגולטורית בין LINC00707, miR-145-5p ו-TRAF6. שנית, מחקר זה נערך באופן בלעדי ברמה התאית תוך שימוש במודל מיקרוגליא של BV2 שעברההסטימולציה על ידי LPS, ללא אישוש in vivo. בהתחשב במורכבות של מיקרו-הסביבה ב-SCI, ייתכן שהממצאים הנוכחיים אינם משחזרים במלואם את התנאים הפתופיזיולוגיים in vivo. השאלה האם LINC00707 מפעיל השפעות פרו-דלקתיות דומות במודלים של בעלי חיים ל-SCI נותרה להוכחה. מחקרים עתידיים יקימו מודלים של בעלי חיים ל-SCI כדי לאשש את התפקיד הרגולטורי של LINC00707 ואת המכניזמים המולקולריים העומדים בבסיסו. שלישית, למרות שתוצאותינו מצביעות על כך ש-LINC00707 פועל דרך מסלול השיגנלינג של miR-145-5p/TRAF6 כדי להשפיע על הדלקת, עדיין לא ידוע האם LINC00707 מתפקד אך ורק כספוג עבור miRNAs ספציפיים או שמא הוא נקשר ישירות לחלבונים מסוימים. נדרשים מחקרים נוספים כדי להבהיר פרטים מכניסטיים אלו. רבעית, אנליזת עקומת ה-ROC התבססה על נתונים ממרכז רפואי יחיד וממספר קטן יחסית של מטופלים. דבר זה עלול היה להוביל להטיה, ובכך להפוך את הממצאים לראשוניים. נדרשים מחקרים רב-מרכזיים רחבים יותר עם מספר רב יותר של מטופלים כדי לאשש את הפוטנציאל האבחנתי של הביו-מרקרים שזוהו.

ממצאי מחקר זה מצביעים על כך ש-LINC00707 עשוי להוות סמן ביולוגי פוטנציאלי בבדיקת פלסמה ומטרה טיפולית עבור SCI. עם זאת, תרגום ממצאים אלה ליישומים קליניים ידרוש מספר שלבים נוספים. ראשית, יש להעריך את ערך ההבחנה הפוטנציאלי של LINC00707 בפלסמה בקוהורטות רחבות יותר ממספר מרכזים, בקוהורטות תיקוף עצמאיות ובקבוצות ביקורת רלוונטיות של טראומה או דלקת. הערכה קלינית ובדיקה רדיולוגית נותרות הגישות העיקריות לאבחון SCI. שנית, יש להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של התמקדות ב-LINC00707 במודלים של בעלי חיים כדי לבחון את יעילותו ובטיחותו. בסופו של דבר, מודולציה של מסלול השליח LINC00707/miR-145-5p/TRAF6 עשויה להציע גישה חדשנית להפחתת דלקת עצבית ועקה חמצונית בחולים עם SCI, אם כי נדרשת עבודה משמעותית כדי לגשר על הפער בין המחקר במעבדה ליישום הקליני.

באופן כללי, הביטוי של LINC00707 ו-TRAF6 בפלזמה עלה, בעוד שהביטוי של miR-145-5p ירד, בחולים עם SCI ובתאי BV2 שעברו גרייה באמצעות LPS. השתקה (knockdown) של LINC00707 הפחיתה תגובות דלקתיות ועקה חמצונית באמצעות ציר השליח miR-145-5p/TRAF6, מה שמרמז כי נתיב בקרה זה עשוי להוות מטרה טיפולית פוטנציאלית עבור SCI.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מחקר במדעי הרפואה של Hebei (מענק מס' 20251479).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"לKIRGENKG2211מבחנה מפוליפרופילן עם מכסה בלחץ (snap-cap), נקייה מ-DNase/RNase, לא פירוגנית, כוח צנטריפוגלי מרבי 20,000 × g, לאחסון דגימות RNA/חלבון ולצנטריפוגה.
צלחת תרבית תאים בעלת 6 בארותCorning3516פלטת פוליסטירן שטופה TC עם תחתית שטוחה, סטרילית ועטופה בנפרד; נפח הבאר הוא 16.8 מ"ל עם שטח גידול של 9.5 סמ"ר
מחט לאיסוף דםBecton, Dickinson and Company367283מחט לאיסוף דם לשימוש חד-פעמי של BD Vacutainer. עיצוב מחט דו-צדדי, כאשר קצה אחד מיועד לדקירה ורידית והקצה השני מתחבר למחזיק ולשפופרת הוואקום לצורך איסוף למספר שפופרות. מצופה בסיליקון כדי לצמצם את אי-הנוחות של המטופל בזמן ההחדרה.
מבחנות לאיסוף דםBecton, Dickinson and Company367605מבחנות BD Vacutainer לאיסוף דם בוואקום. פקקים בצבעים שונים מצביעים על תוספים שונים, התואמים לבדיקות מעבדה ספציפיות.
קו תאי מיקרוגליה של עכבר המונחלים BV2מרכז משאבי התאים של מכון הביוטכנולוגיה של שנגחאיRRID: CVCL_0182שורת תאי מיקרוגליה עכבריים מאומתים המבטאים באופן יציב סמנים ספציפיים למיקרוגליה (Iba1, CD11b, F4/80). בעקבות גרייה ב-LPS, תאי BV2 מפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1β, IL-6, TNF-α) ומצבירים ROS ותוצרי MDA תוך-תאיים, כדי לדמות במערכת חוץ-גופית (in vivo) הפעלה דלקתית של מיקרוגליה לאחר פגיעה בחוט השדרה. התאים גודלים במצע DMEM עם ריכוז גלוקוז גבוה, בתוספת 10% FBS ו-1× פניצילין-סטRepartitionפטומייצין, שנשמר ב- 37 °C עם 5% CO2 אינקובטור עם לחות; מעבר (passaging) כאשר מגיעים ל-70%–80% התמזגות (confluence) כדי למנוע הפעלה יתרה.
ערכה לבדיקת מלונדיאלדהיד (MDA) בתאיםNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-4-2ערכה קולורימטרית מבוססת מיקרופלט לזיהוי כמותי של מלונדיאלדהיד תאי, סמן של פראוקסידציה של ליפידים. MDA מגיב עם חומצה תיוברוביטורית (TBA) תחת חימום ליצירת תוצרי תגובה (adducts) אדומים; הבליעה נמדדת באורך גל של 532 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר למיקרופלט. הערכה עברה אופטימיזציה לדגימות של ליזט תאי, תפעול בקיבולת גבוהה במיקרופלט של 96 בארות, וטווח כימות ליניארי המכסה רמות נמוכות עד בינוניות של חמצון ליפידים במיקרוגליה.
CO2 אינקובטורThermo Scientific3111מים מלחחים במעטפת מים CO22 אינקובטור עם נפח פנימי של 184 L, IR CO22 חיישן, מערכת סינון אוויר HEPA למיזעור זיהום מיקרוביאלי. שומרת על סביבת תרבית יציבה ב- 37 °C, 5% CO22 ולחות רוויה עבור תרבית תאים נצמדים לטווח ארוך.
ערכת בדיקה לגן דוחה של לוסיפראז כפול (Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit)Beyotime BiotechnologyRG028ערכה דו-לוסיפראזית זו מאפשרת גילוי כמותי עוקב של לוסיפראז מרשש (firefly luciferase) ולוסיפראז רנילה (Renilla luciferase) בליזאטים של תאים. תחילה נמדד אות לוסיפראז מרשש באמצעות סובסטרט לוסיפרין; רכיב הגילוי של רנילה שבא לאחר מכן מכיל מעכב (quencher) חזק המבטל את >99.9% שארית לומנסנציה של גחלילית (firefly), המבטיחה קריאה נקייה של אות Renilla עם סובסטרט קואלנטראזין (coelenterazine). הערכה כוללת בופר ייעודי לליזיס תאים עבור ליזיס של תאים נצמדים, התואם ללוח מיקרופלטה בעל 96 בארות עבור לומינומטר. ריאגנט הגחלילית הוא נוזל מעורב מראש לשימוש ישיר; ערכי הלומנסנציה של הגחלילית ושל ה-Renilla נרשמים באופן רצופי כדי לחשב פעילות לוסיפראז יחסית מנורמלת (יחס גחלילית/Renilla) לצורך תיקוף של מטרה מסוג ceRNA.
מצע דאלבקו המשופר (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco11995065DMEM הוא מצע בסיסי הנמצא בשימוש נרחב לתמיכה בצמיחה של סוגים רבים ושונים של תאי יונקים. פורמולציה זו מכילה גלוקוז בריכוז גבוה, L-glutamine, פנול אדום וסודיום פירובט. המצע דורש תוספים, בדרך כלל 10% סרום עוברי בקר (FBS), ו-5–10% CO2 סביבה לשמירה על pH פיזיולוגי.
סרום עוברי של בקרכל הירוק13011-8611FBS בדרגת פרימיום, רמה נמוכה של אנדוטוקסינים ומייקופלסמה & שלילי לבקטריופאג'ים, הוסף ל-DMEM בריכוז של 10% נפח/נפח כדי לתמוך בצמיחת התאים.
GraphPad Prism גרסה 9GraphPad Software, סן דייגו, קליפורניה, ארה"בלא ניתן לתרגם טקסט ריק. אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם.תוכנה לגרפים מדעיים ולניתוח סטטיסטי המתמחה בנתונים מניסויי תאים in vitro. כל ערכי הבליעה הגולמיים של qPCR, ELISA, עקה חמצונית ולומניסנציית dual-luciferase יוובאו ל-Prism 9 לצורך ביצוע אימות נורמליות, השוואות קבוצות פרמטריות/לא-פרמטריות, יצירת כל הדמויות הכמותיות וחישוב הממוצע ± סטיית תקן (SD), ערכי P מדויקים ורווחי סמך (CIs) של 95%, וייצוא איורים ברזולוציה גבוהה (300 dpi) העומדים בתקני פרסום של כתבי עת. קבצי מקור מקוריים של פרויקטי .prism עבור כל הגרפים הופקדו במאגר הנתונים הציבורי כנדרש.
IBM SPSS Statistics גרסה 26.0IBM Corporation, Armonk, NY, USAלא רלוונטיחבילת תוכנה סטטיסטית מקיפה המשמשת למיון נתוני בסיס של דגימות קליניות, בדיקת נורמליות (מבחן שפירו-וילק), מבחן t למדגמנים בלתי תלויים/לא מזווגים, וניתוח שונות (ANOVA) חד-כיווני עם מבחן Tukey’תיקון השוואות מרובות, מבחן Mann-Whitney U לא-פרמטרי, וחישוב ערכי P מדויקים ומרווחי סמך של 95% עבור כל מערכי הנתונים הכמותיים האנושיים והתאיים. כל הנתונים הדמוגרפיים והמעבדתיים של המטופלים הקליניים עובדו ונאחרו בפלטפורמה זו.
IL-1β ערכה ל-ELISA מסוג SimpleStepAbcamab255730ערכה זו של ELISA קולורימטרי מסוג סנדוויץ' עם שטיפה אחת מאמצת את טכנולוגיית SimpleStep הקניינית, המשלימה את כל הליך הזיהוי בתוך 90 דקות. היא מודדת באופן כמותי אינטרלוקין-1 של חולדה.β בסבסב (supernatant) של תרבית תאים, בסרום, ובדגימות פלזמה עם EDTA/ציטראט/הפרין. רגישות הגילוי מגיעה ל-26.58 pg/mL, עם טווח כימות ליניארי של 54.69–3500 pg/mL. ערכה כוללת מיקרו-פלטה של רצועות בעלות 8 בארות שניתן להפרידן, המצופה מראש. אותי בליעה מזוהים באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות לצורך חישוב IL-1β ריכוז.
ערכת SimpleStep ELISA ל-IL-6Abcamab234570ערכה לביצוע בדיקת SimpleStep ELISA קולורימטרית מסוג סנדוויץ', המותאמת לזיהוי כמותי של אינטרלוקין-6 (IL-6) של חולדה בדגימות של על-נוזל תרבית תאים, סרום ופלזמה עם ציטראט/EDTA/הפרין. הערכה מאמצת תהליך עבודה הכולל אינקובציה בשלב אחד ושטיפה אחת כדי לקצר את זמן הבדיקה הכולל ל-90 דקות, עם רגישות זיהוי של 43 pg/mL וטווח כימות ליניארי שבין 125 pg/mL ל-8000 pg/mL. הערכה כוללת מיקרופלטה עם פסים של 8 בארות הניתנים להפרדה ומצופה מראש; ערכי הבליעה נקראים באורך גל של 450 nm באמצעות ספקטרופוטומטר למיקרופלטות לצורך חישוב ריכוז ה-IL-6 הסופי.
פלטת LightCycler Multiwell 96, לבנהRoche LifeScience, שוויץ4729692001פלטות תגובה לבנות מ 폴ipropylene בעלות 96 בארות עם שוליים חלקיים (half-skirted), שעברו אופטימיזציה מיוחדת עבור מכשיר ה-LightCycler 96 ל-PCR בזמן אמת. דפנות הבארות הלבנות מפחיתות הפרעות של פלואורסצנציה ברקע ומשפרות את השתקפות האות על מנת להגביר את רגישות הגילוי עבור תמלילים בריכוז נמוך. תכנון אחיד של דפנות דקות מבטיח מוליכות תרמית עקבית בכל הבארות, ותואם לנפחי תגובה הנעים בין 10 ל- 50 μLנקי מ-DNase/RNase ומפירוגנים עבור בדיקות הגברה של cDNA המופק מ-RNA.
סוכן טרנספקציה LipofectamineTM 3000Thermo Fisher ScientificL3000015ריאגנט טרנספקציה של ננו-חלקיקי ליפידים, המשולב עם P3000 Enhancer, מאפשר טרנספקציה יעילה של siRNA/פלסמיד בתאי מיקרוגליה מסוג BV2 עם רעילות תאית נמוכה.
ערכה לסנתזה של cDNA גדיל ראשון מ-lnRcute lncRNATIANGENKR202-02ערכה זו עברה אופטימיזציה מיוחדת עבור תעתוקה הפוכה של RNA לא מקודד ארוך (lncRNAs) בעל שכיחות נמוכה, תכולת GC משתנה ומבנים שניוניים מורכבים. היא מכילה בופר נפרד להסרת gDNA כדי לבטל זיהום של DNA גנומי לפני התעתוקה ההפוכה, ותערובת פריימרים ייעודית ל-lnR-RT להעשרת תבניות lncRNA באורכן המלא. רב-התעתק ההפוך (reverse transcriptase) המודגמ תאפשר סינתזה יעילה של cDNA בעל גדיל ארוך מכמות RNA כוללת הנעה בין 10 ng ל-2 ng.
ערכה לגילוי lncRNA באמצעות qPCR מסדרת lnRcute (SYBR Green)TIANGENFP402תערובת מוכנה (premix) ייעודית ל-qPCR כמותי המבוסס על SYBR Green, המשמשת לכמותיות של lncRNA. פולימרז DNA מסוג hot-start המתווך על ידי נוגדן מבטיח סגוליות הגברה גבוהה; רכיבי H-competitor מקטינים הַפרעות של מבנים שניוניים בתבניות lncRNA עשירות ב-GC. התערובת תואמת ל-cDNA שהופק באמצעות ערכת שעתוק הפוך של lncRNA מסדרת lnRcute, ומתאימה לכימות ביטוי יחסי של lncRNA בריכוזים נמוכים.
אוליגנוקליאוטידים של miR-145-5pGeneralbiol (ווחאן, סין)לא רלוונטימימוס (mimic), מעכב (inhibitor) ואוליגונוקלאוטידי ביקורת שלילית תואמים סינתטיים של miR-145-5p, ששימשו לוויסות פעילות miR-145-5p בתאי BV2. נעשה בהם שימוש בניסויי ביטוי, דלקת, עקה חמצונית ובבדיקות דוּ-לוסיפראז (dual-luciferase reporter assays).
ערכה לסנתזה של גדיל cDNA ראשון של miRNA מסוג miRcute PlusTIANGENKR211-02עושה שימוש בתגובה של מבחנה אחת המשלבת זנב poly (A) ושעתוק הפוך כדי לפשט את זרימת העבודה הניסויית. תערובת האנזימים מכילה poly (A) polymerase מ-E. coli, reverse transcriptase חסר RNase H ומעכב RNase, המכוונים באופן ספציפי ל-miRNA בוגר חד-גדילי ומונעים הפרעה להגברה מצד pre-miRNA בעל מבני לולאה (hairpin). מתאים ל-miRNA שהופק מליזט של תאים, פלסמה ודגימות רקמה.
ערכה לזיהוי miRNA באמצעות qPCR miRcute Plus (SYBR Green)TIANGENFP411תערובת מוכנה (premix) של SYBR Green המותאמת לכימות של miRNA בוגר, תואמת באופן מלא למוצרי שעתוק הפוך של miRcute. מערכת הבאפר משפרת את יעילות ההישבטות (annealing) של הפריימרים עבור אמפליקונים קצרים של miRNA, ומספקת אותות פלואורסצנציה יציבים ורגישות גבוהה לזיהוי של miRNA בעל ביטוי חלש. U6 snRNA משמש בדרך כלל כייחוס פנימי לנורמליזציה.
תמיסת פניצילין-סטרפטומייצין (100×)Beyotime BiotechnologyC0222תערובת מסוננת סטרילית המכילה 10,000 U/mL פניצילין ו-10 mg/mL סטריפטומייסין; דילול עבודה של 1:100 במצע תרבית למניעת זיהום חיידקי.
ערכה לבדיקת מיני חמצן ראקטיביים עם מדללBeyotime BiotechnologyS0034Mערכה זו משתמשת בחסון הפלואורסצנטי DCFH-DA לצורך כימות של מיני חמצן רהאקטיביים (ROS) תוך-תאיים. DCFH-DA חודר את ממבנה התא ועובר הידרוליזה על ידי אסטראזה תוך-תאית ל-DCFH, אשר מחומצן על ידי ROS ליצירת DCF פלואורסצנטי. הערכה תואמת למיקרו-פלטה בעלת 96 בארות ולקורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי לצורך זיהוי בסביקת תפוקה גבוהה (Ex = 488 nm, Em = 525 nm). הערכה מצוידת במדלל חסון ייעודי ובריאגנט בקרת חיוביות Rosup לייצוב אותות הצביעה, והיא מתאימה לזיהוי עקה חמצונית בתאי מיקרוגליה BV2 דבקים ללא ליזיס של התאים.
ערכה לבדיקה של גלוטתיון רדוקציוני (GSH)המכון להנדסה ביו-טכנולוגית ג'יאנצ'נג בננג'ינג (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute)A006-1-2ערכה קולורימטרית למיקרו-פלטה לזיהוי גלוטתיון רדוקטז (GSH), נוגד החימצון התאי המרכזי. GSH מגיב עם חומצה דיתיאו-דיניטרובנזואית (DTNB) כדי להפיק תוצר כרומוגני צהוב, שספיגתו נמדדת באורך גל של 405 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. הערכה מתאימה פרוטוקול סטנדרטי במבחנות לזיהוי בתפוקה גבוהה במיקרו-פלטה בעלת 96 בארות, לצורך ניתוח נוגדי חימצון בליזאט של תאים.
si-LINC00707GenePharma (שנגחאי, סין)לא ניתן להציג תוכן לתרגום.RNA מספרי קטן (small interfering RNA) שנועד להפחית את ביטוי LINC00707 בתאי BV2. משמש לניסויי אובדן תפקוד (loss-of-function) כדי להעריך את ההשפעות של השתקת LINC00707 על תגובות דלקתיות, עקה חמצונית, ביטוי miR-145-5p וביטוי TRAF6.
si-LINC00707 NCGenePharma (שנגחאי, סין)לא ניתן לספק תרגום מכיוון שלא הוזן טקסט מקור. נא לספק את הטקסט באנגלית לתרגום.RNA פריערה קטן (siRNA) שאינו מכוון, המשמש כביקורת שלילית עבור טרנספקציה של si-LINC00707. משמש לשליטה על השפעות לא ספציפיות של הליך הטרנספקציה והחשיפה ל-siRNA.
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)TIANGEN4992777תערובת מוכנה (premix) אוניברסלית ל-qPCR כמותי עם SYBR Green עבור כימות יחסי של mRNA, המכילה Taq polymerase עם התנעה חמה (hot-start), dNTPs, SYBR Green I וצבע ייחוס ROX לנרמול פלואורסצנציה. הגברה לא ספציפית נמוכה, יעילות הגברה יציבה, ושימוש נרחב לכימות גנים מטרת mRNA (כגון TRAF6, GAPDH וכו').
צנטריפוגה קטנה לשולחן Thermo ScientificTM SorvallTM ST 8Thermo Scientific75200709הבחירה הקלאסית עבור מעבדות קליניות, המסוגלת לטיפול בעד 24 × 5/7 מ"ל של מבחנות לאיסוף דם בבת אחת. סדרת R היא גרסה מקוררת, היכולה להגן טוב יותר על דגימות הדורשות סרטיפוגציה בטמפרטורה נמוכה.
ערכה לסינתזה של cDNA גדיל ראשון TIANScript IITIANGENGKR107-02תוכנן עבור שעתוק הפוך כללי של mRNA ליצירת cDNA באורך רב של עד 12 kb. מצויד גם בפריימרים מסוג Oligo (dT) 15 וגם בפריימרים של הקסמרים אקראיים (random hexamers) לאסטרטגיות פרימינג גמישות. ה-reverse transcriptase של M-MLV המ модиפייד קורא ביעילות דרך תכנים בעלי אחוז GC גבוה ומבנים משניים מורכבים של mRNA, עם תאימות רחבה להגברה של mRNA ב-qPCR בהמשך התהליך.
TNF-α ערכה ל-ELISA מסוג SimpleStepAbcamab236712ערכה ל-ELISA מסוג סנדוויץ' (sandwich ELISA) מהירה בשטיפה אחת (SimpleStep), המותאמת לזיהוי כמותי של גורם נמק גידולי (tumor necrosis factor) של חולדהα (TNF-α) בתעלי supernatant של תרביות תאים, בסרום ובדגימות פלזמה שונות. משך הבדיקה הכולל הוא 90 דקות, עם רגישות גבוהה במיוחד של 1.04 pg/mL וטווח גילוי לינארי מ-15.63 pg/mL ועד 1000 pg/mL. מצויד ב-8 נתיבים נתיקים×פלטה בעלת 12 בארות עם ציפוי מוקדם; ערכי OD ב-450 ננומטר נרשמים עבור TNF- סופי-α חישוב כמותי.
ערכה למדידת סך superoxide dismutase (T-SOD)המכון להנדסה ביו-טכנולוגית נאנג'ינג ג'יאנצ'נג (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute)A001-3-2ערכה של מיקרופלטה כרומוגנית WST-1 לגילוי פעילות אנזימטית כוללת של SOD. SOD מסלק רדיקלי אניון סופראוקסיד ומעכב את תגובת החזרת ה-WST-1. בליעה נמדדת באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלטות לצורך חישוב הפעילות. מתאימה לדגימות של הומוגנאט תאים, סרום ורקמות, עם התפתחות צבע יציבה וחזרתיות גבוהה להערכת קיבולת נוגדי חמצון.
ריאגנט TRIzolThermo Fisher Scientific15596018ריאגנט פנול-גואנידין איזו-תיocyanate חד-פאזי לבידוד שלב אחד של RNA כולל מתאי מיקרוגליה בתרבית; מחלץ בו-זמנית DNA וחלבון מדגימות זהות.

מקורות

  1. Trueblood CT, Singh A, Cusimano MA, Hou S. Autonomic dysreflexia in spinal cord injury: mechanisms and prospective therapeutic targets. Neuroscientist. 2024;30(5):597-611.
  2. Anderson MA, Squair JW, Gautier M, Hutson TH, Kathe C, Barraud Q, et al. Natural and targeted circuit reorganization after spinal cord injury. Nat Neurosci. 2022;25(12):1584-96.
  3. Liu Y, Yang X, He Z, Li J, Li Y, Wu Y, et al. Spinal cord injury: global burden from 1990 to 2019 and projections up to 2030 using Bayesian age-period-cohort analysis. Front Neurol. 2023;14:1304153. doi:10.3389/fneur.2023.1304153.
  4. Sekhon LH, Fehlings MG. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 2001;26(24 Suppl):S2-12.
  5. Chan BC, Cadarette SM, Wodchis WP, Krahn MD, Mittmann N. The lifetime cost of spinal cord injury in Ontario, Canada: a population-based study from the perspective of the public health care payer. J Spinal Cord Med. 2019;42(2):184-93.
  6. Van Broeckhoven J, Sommer D, Dooley D, Hendrix S, Franssen A. Macrophage phagocytosis after spinal cord injury: when friends become foes. Brain. 2021;144(10):2933-45.
  7. Xiao S, Zhong N, Yang Q, Li A, Tong W, Zhang Y, et al. Aucubin promoted neuron functional recovery by suppressing inflammation and neuronal apoptosis in a spinal cord injury model. Int Immunopharmacol. 2022;111:109163. doi:10.1016/j.intimp.2022.109163.
  8. Li F, Wang Y, Zheng K. Microglial mitophagy integrates the microbiota-gut-brain axis to restrain neuroinflammation during neurotropic herpesvirus infection. Autophagy. 2023;19(2):734-6.
  9. Beattie MS. Inflammation and apoptosis: linked therapeutic targets in spinal cord injury. Trends Mol Med. 2004;10(12):580-3.
  10. Brennan FH, Li Y, Wang C, Ma A, Guo Q, Li Y, et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 2022;13(1):4096. doi:10.1038/s41467-022-31797-0.
  11. Kwon HS, Koh SH. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Transl Neurodegener. 2020;9(1):42. doi:10.1186/s40035-020-00221-2.
  12. Zhong J, Qiu X, Yu Q, Chen H, Yan C. A novel polysaccharide from Acorus tatarinowii protects against LPS-induced neuroinflammation and neurotoxicity by inhibiting TLR4-mediated MyD88/NF-κB and PI3K/Akt signaling pathways. Int J Biol Macromol. 2020;163:464-75.
  13. Han X, Xu T, Fang Q, Zhang H, Yue L, Hu G, et al. Quercetin hinders microglial activation to alleviate neurotoxicity via .the interplay between NLRP3 inflammasome and mitophagy. Redox Biol. 2021;44:102010. doi:10.1016/j.redox.2021.102010.
  14. Simpson DSA, Oliver PL. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants (Basel). 2020;9(8):743. doi:10.3390/antiox9080743.
  15. Onoguchi-Mizutani R, Akimitsu N. Long noncoding RNA and phase separation in cellular stress response. J Biochem. 2022;171(3):269-76.
  16. Zhang Y. LncRNA-encoded peptides in cancer. J Hematol Oncol. 2024;17(1):66. doi:10.1186/s13045-024-01591-0.
  17. Hu W, Zhou J, Jiang Y, Bao Z, Hu X. Silencing of LINC00707 alleviates brain injury by targeting miR-30a-5p to regulate microglia inflammation and apoptosis. Neurochem Res. 2024;49(1):222-33.
  18. Zhu S, Zhou Z, Li Z, Shao J, Jiao G, Huang YE, et al. Suppression of LINC00707 alleviates lipopolysaccharide-induced inflammation and apoptosis in PC-12 cells by regulating miR-30a-5p/Neurod1. Biosci Biotechnol Biochem. 2019;83(11):2049-56.
  19. Long J, Lan W, Shen B, Liao F, Cai H, Li J, et al. LncRNA-miRNA-mRNA network in schizophrenia. J Mol Neurosci. 2025;75(3):104.
  20. De Gasperi R, Graham ZA, Harlow LM, Bauman WA, Qin W, Cardozo CP. The signature of microRNA dysregulation in muscle paralyzed by spinal cord injury includes downregulation of microRNAs that target myostatin signaling. PLoS One. 2016;11(12):e0166189.
  21. Lin Y, Liu L, Lin Y, Yang R, Liao S, Xu M, et al. MiR-145 alleviates sepsis-induced inflammatory responses and organ injury by targeting ADAM17. Front Biosci (Landmark Ed). 2024;29(1):44. doi:10.31083/j.fbl2901044.
  22. Wang C, Gu L, Yang Z, Su J, Wen X. Mume Fructus total flavonoids modulate miR-145-3p expression to inhibit lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine production in BV2 cells. Comb Chem High Throughput Screen. 2026;29. doi:http://dx.doi.org/10.2174/0113862073447531260414195911
  23. Chen S, Wei J, Huang L, Feng B, Guo W. MiRNA-194-5p inhibits inflammatory response after spinal cord injury via .regulating TRAF6. Minerva Med. 2020;111(6):603-6.
  24. Lu Y, Jiang BC, Cao DL, Zhang ZJ, Zhang X, Ji RR, et al. TRAF6 upregulation in spinal astrocytes maintains neuropathic pain by integrating TNF-α and IL-1β signaling. Pain. 2014;155(12):2618-29.
  25. Zhao Y, Li T, Zhang L, Yang J, Zhao F, Wang Y, et al. TRAF6 promotes spinal microglial M1 polarization to aggravate neuropathic pain by activating the c-JUN/NF-κB signaling pathway. Cell Biol Toxicol. 2024;40(1):54. doi:10.1007/s10565-024-09900-6.
  26. Kirshblum SC, Memmo P, Kim N, Campagnolo D, Millis S, American Spinal Injury Association. Comparison of the revised 2000 American Spinal Injury Association classification standards with the 1996 guidelines. Am J Phys Med Rehabil. 2002;81(7):502-5.
  27. Xue MT, Sheng WJ, Song X, Shi YJ, Geng ZJ, Shen L, et al. Atractylenolide III ameliorates spinal cord injury in rats by modulating microglial/macrophage polarization. CNS Neurosci Ther. 2022;28(7):1059-71.
  28. Zhang H, Xiang L, Yuan H, Yu H. PTPRO inhibition ameliorates spinal cord injury through shifting microglial M1/M2 polarization via .the NF-κB/STAT6 signaling pathway. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2024;1870(5):167141. doi:10.1016/j.bbadis.2024.167141.
  29. Eli I, Lerner DP, Ghogawala Z. Acute traumatic spinal cord injury. Neurol Clin. 2021;39(2):471-88.
  30. Brouwers E, van der Meent H, Curt A, Maier DD, Abel RF, Weidner N, et al. Recovery after traumatic thoracic and lumbar spinal cord injury: the neurological level of injury matters. Spinal Cord. 2020;58(9):980-7.
  31. Yao Q, Li Z, Chen D. Review of LINC00707: a novel lncRNA and promising biomarker for human diseases. Front Cell Dev Biol. 2022;10:813963. doi:10.3389/fcell.2022.813963.
  32. Chen L, Chen Y, Huang J, Zhang J. LncRNA LINC00707 serves as a sponge of miR-382-5p to alleviate lipopolysaccharide-induced WI-38 cell injury through upregulating NKAP in infantile pneumonia. Autoimmunity. 2022;55(5):328-38.
  33. Zou X, Gao C, Shang R, Chen H, Wang B. Knockdown of lncRNA LINC00707 alleviates LPS-induced injury in MRC-5 cells by acting as a ceRNA of miR-223-5p. Biosci Biotechnol Biochem. 2021;85(2):315-23.
  34. Ma T, Ma H, Zou Z, He X, Liu Y, Shuai Y, et al. The long intergenic noncoding RNA 00707 promotes lung adenocarcinoma cell proliferation and migration by regulating Cdc42. Cell Physiol Biochem. 2018;45(4):1566-80.
  35. Li H, Liu Q, Hu Y, Yin C, Zhang Y, Gao P. LINC00707 regulates autophagy and promotes the progression of triple-negative breast cancer by activation of the PI3K/AKT/mTOR pathway. Cell Death Discov. 2024;10(1):138. doi:10.1038/s41420-024-01906-7.
  36. Fang F, Guo C, Zheng W, Li Q. LINC00707 promotes cell proliferation in cervical cancer via .the miR-374c-5p/SDC4 axis. Biomed Res Int. 2022;2022:5793912. doi:10.1155/2022/5793912.
  37. Wei M, Lu L, Ma J, Luo Z, Tan X, Wang J. LINC00707 impairs natural killer cell antitumor activity in hepatocellular carcinoma by decreasing YTHDF2 stability. J Cell Mol Med. 2024;28(5):e18106.
  38. Liu J, Wu M, Feng G, Li R, Wang Y, Jiao J. Downregulation of LINC00707 promotes osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by regulating DKK1 via .targeting miR-103a-3p. Int J Mol Med. 2020;46(3):1029-38.
  39. Zhao W, Huang G, Ye J. LINC00707 inhibits myocardial fibrosis and immune disorder in rheumatic heart disease by regulating miR-145-5p/S1PR1. Biotechnol Genet Eng Rev. 2024;40(4):3073-86.
  40. Gao T, Ji Y. Long noncoding RNA LINC00707 accelerates tumorigenesis and progression of bladder cancer via .targeting the miR-145/CDCA3 regulatory loop. Urol Int. 2021;105(9–10):891-905.
  41. Cai WL, Zeng W, Liu HH, Zhu BY, Liu JL, Liu Y. LncRNA LINC00707 promotes osteogenic differentiation of hBMSCs through the Wnt/β-catenin pathway activated by the LINC00707/miR-145/LRP5 axis. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(1):18-28.
  42. Jiang L, Wei ZC, Xu LL, Yu SY, Li C. Inhibition of miR-145-5p reduces spinal cord injury-induced inflammatory and oxidative stress responses via .affecting the Nurr1-TNF-α signaling axis. Cell Biochem Biophys. 2021;79(4):791-9.
  43. Jiang Z, Zhang J. Mesenchymal stem cell-derived exosomes containing miR-145-5p reduce inflammation in spinal cord injury by regulating the TLR4/NF-κB signaling pathway. Cell Cycle. 2021;20(10):993-1009.
  44. Park AJ, Fandl HK, Garcia VP, Coombs GB, DeSouza NM, Greiner JJ, et al. Differential expression of vascular-related microRNA in circulating endothelial microvesicles in adults with spinal cord injury: a pilot study. Top Spinal Cord Inj Rehabil. 2023;29(2):34-42. doi:10.46292/sci22-00032.
  45. Gao C, Yin F, Li R, Ruan Q, Meng C, Zhao K, et al. MicroRNA-145-mediated KDM6A downregulation enhances neural repair after spinal cord injury via .the NOTCH2/Abcb1a axis. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:2580619. doi:10.1155/2021/2580619.
  46. Dou Y, Tian X, Zhang J, Wang Z, Chen G. Roles of TRAF6 in the central nervous system. Curr Neuropharmacol. 2018;16(9):1306-13.
  47. Huang T, Jia Z, Fang L, Cheng Z, Qian J, Xiong F, et al. Extracellular vesicle-derived miR-511-3p from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells ameliorates spinal cord injury through the TRAF6/S1P axis. Brain Res Bull. 2022;180:73-85.
  48. Wei J, Wang J, Zhou Y, Yan S, Li K, Lin H. MicroRNA-146a contributes to SCI recovery via .regulating TRAF6 and IRAK1 expression. Biomed Res Int. 2016;2016:4013487.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ויסות דלקתRT-qPCRבדיקת דואל-לוציפרזאקטיבציה של מיקרוגליה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.