פרוטוקול זה מתאר כימות ממוקד באמצעות HPLC של רוטין (rutin) וקוורצטין (quercetin) בתמצית ניאב של Styphnolobium japonicum, ומעריך את התמצית במודלים של מיקרוגליה, תרבית משותפת של מיקרוגליה-נוירונים, ויתר לחץ דם הנובע מחסור בתחמוצת החנקן (nitric oxide). זרימת העבודה מקשרת בין הכנת התמצית לבין נקודות קצה של דלקת נוירונית, עקה נוירונלית, לחץ דם והגרעין פארוונטריקולרי (paraventricular nucleus).
מאמר מחקר
תמצית Styphnolobium japonicum המכביתה דלקת של מיקרוגליה ויתר לחץ דם בחולדות שטופלו ב-L-NAME, כפי שכוונתה על ידי HPLC
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
נוירו-דלקת בגרעין הפארא-בנטריקולרי של ההיפותלמוס (PVN) עשויה לתרום לעירור סימפתטי ולהיתר לחץ דם. הערכנו תמצית ניצנים של Styphnolobium japonicum (SJBE; היסטורית Sophora japonica) שכוונתה עבור rutin ו-quercetin באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC) ממוקדת. התמצית נבדקה בתאי מיקרוגליה BV-2 שעוררו באמצעות אנגיוטנסין II (Ang II), בתרביות משותפות (co-cultures) של גורמים מסיסים של BV-2/mHypoA-2/10, בתנאי עקה נוירונלית של נתרן גבוה in vitro, ובחולדות עם יתר לחץ דם עקב חסר בתחמוצת חנקן שרושש באמצעות Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME). בריכוזים עובדים שאינם ציטוטוקסיים, SJBE הפחיתה מדדי דלקת ועקה חמצונית בתאי BV-2 והייתה קשורה לרמות גבוהות יותר של סממנים של אנגיוטנסין-המרה אנזים 2 (ACE2), קולטן Mas (MasR), ואנגיוטנסין-(1-7) [Ang-(1-7)]. בתרבית משותפת, SJBE הפחיתה את ההעברה הדלקתית ואת העקה הנוירונלית. מתן SJBE דרך הפה הפחית מדידות לחץ דם בשיטת tail-cuff והיה קשור לרמות גבוהות יותר של ACE2/MasR ו-Ang-(1-7) ב-PVN, לצביעה נמוכה יותר של Iba-1 ו-c-Fos, ולרמות נמוכות יותר של נוראפינפרין וציטוקינים במחזור הדם. MLN-4760 סיפק תמיכה תפקודית in vitro למעורבות של ACE2, אך לא בוצעו חסימות של מסלולים in vivo או בדיקות פרמקוקינטיקה של חדירה למוח. לפיכך, התוצאות תומכות בקשר בין טיפול ב-SJBE, הפחתה של איתות נוירו-דלקתי ולחץ דם נמוך יותר, מבלי לבסס סיבתיות של מסלול מרכזי.
מבוא
תמציות בוטניות נחקרות יותר ויותר כמודולטורים רב-מרכיביים של מחלות כלי דם ומחלות נוירו-אימוניות. הפרשנות שלהן תלויה בזיהוי ברור של המקור, בהיקף האנליטי ובעקביות כימית. Styphnolobium japonicum (L.) Schott, המוכר היסטורית כ-Sophora japonica L., מניב את חומר ניצני הפרחים המיובשים Flos Sophorae Immaturus או Huai Mi1,2. רוטין (Rutin) הוא סמן איכות מרכזי של חומר זה, המכיל גם פלבנואידים ביו-אקטיביים אחרים3. מחקרי מיצוי העריכו גישות קונבנציונליות וגישות מועצמות להשבת רוטין ופלבנואידים קשורים4,5,6. מחקר עדכני מתאר גם תהליך עבודה ירוק יותר למיצוי רוטין מ-S. japonicum7. HPLC ממוקד מספק כימות יעיל של סמנים שהוגדרו מראש, בעוד שטביעת אצבע כרומטוגרפית או פרופיל רב-מרכיבי נדרשים כדי להעריך עקביות כימית רחבה יותר ועקביות בין מנות; לפיכך, אין לפרש את מדידות הרוטין והקוורצטין הנוכחיות כפרופיל פיטוכימי מלא.
רוטין (Rutin) וקוורצטין (Quercetin) מספקים בסיס פרמקולוגי סביר לבחינת תמציות המופקות מ-S. japonicum בדלקת נוירו-וסקולרית. תכשירי פרחי S. japonicum ורוטין נקשרו להפחתה באיתות דלקתי, כולל תגובות הקשורות ל-NF-kappaB ודלקת עצבית (neuroinflammation)8. מודלים ניסויים מקשרים עוד את הרוטין להפחתה בדלקת עצבית ובפגיעה רקמתית הקשורה ל-NF-kappaB9. קוורצטין נקשר אף הוא לפעילות ביולוגית קרדיווסקולרית ולשיפור במאזן הדלקת-חמצון (inflammatory-redox balance)10,11. במודלים של מיקרוגליה, קוורצטין יכול להגביל את ההפעלה, את הסטרס החמצוני ואת האיתות הדלקתי הקשור לקולטן Toll-like receptor 4 (TLR4)12,13.
יתר לחץ דם אינו רק הפרעה וסקולרית. מעגלים דלקתיים מרכזיים יכולים גם הם לתחזק את הדחף הסימפתטי. הגרעין הפראוונטריקולרי (PVN) משלב אותות נוירואנדוקריניים ואוטונומיים המווסתים את הטון הקרדיווסקולרי. ציטוקינים של מיקרוגליה במוח וב-PVN נקשרו ליתר לחץ דם נוירוגני14, ומיקרוגליה ב-PVN יכולה לזהות הפרעות המודינמיות ולקדם עירור סימפתטי15. תצפיות אלו מציבות את התקשורת בין מיקרוגליה לנוירונים בתוך ה-PVN כמטרה רלוונטית להתערבויות השואפות להפחית עלייה נוירוגנית בלחץ הדם16.
זרוע הקולטן ACE2/Ang-(1-7)/Mas (MasR) של מערכת הרנין-אנגיוטנסין מספקת נתיב הגנה אחד בתוך רשת מרכזית זו17,18. ביטוי יתר של ACE2 ב-PVN מחליש יתר לחץ דם המושרה על ידי אנגיוטנסין II וקושר להפחתה של דלקת עצבית (neuroinflammation)19. סיגנלינג אנדוגני של Ang-(1-7) ב-PVN מווסת גם הוא את הזרימה הסימפתטית20. Ang II יכול להפעיל נתיבי חמצון-חיזור (redox) הקשורים לקולטן אנגיוטנסין II מסוג 1 (AT1)/TLR4 במיקרוגליה של ה-PVN, ובכך לקשר בין סטרס של מערכת הרנין-אנגיוטנסין לבין דלקת עצבית21. תנאי התאים עם רמות נתרן גבוהות שימשו רק כאתגר סטרס in vitro, ולא כ תחליף למודל החיות L-NAME. השאלה האם תמצית ניאב של S. japonicum (SJBE), שמינוי של רוטין וקוורצטין בה נקבע באמצעות HPLC ממוקד, יכולה לרסן דלקת מיקרוגליאלית בממשק מיקרוגליה-נוירון, נותרה לא פתורה. זרימת העבודה הנוכחית משלבת כימות סמנים ממוקד עם מודלים של שיתוף-תרבית של מיקרוגליה וגורמים ממיסים, ומודלים של יתר לחץ דם עקב חסר בחמצן חנקני המושרה על ידי L-NAME. היא מיועדת להשוואה מונחית-היפותזה של תכשיר SJBE מוגדר, ולא לאפיון פיטוכימי מקיף או להדגמת חשיפה של המוח; ניסוי ה-L-NAME אינו מדמה באופן ספציפי יתר לחץ דם נוירוגני המונחה על ידי ה-PVN. כאן, בדקנו האם SJBE מדכא דלקת מיקרוגליאלית המונעת על ידי Ang II, מגביל סיגנלינג דלקתי בנוירונים היפותלמיים, ומפחית את לחץ הדם בחולדות שטופלו ב-L-NAME, והאם תוצאות אלו קשורות לסמני ACE2/Ang-(1-7)/MasR.
פרוטוקול
כל הפעולות בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת ביקורת אתיקה למחקר ביו-רפואי של אוניברסיטת Shanxi Datong (מספר אישור 2021029; תקופת האישור, אוגוסט 2021 עד פברואר 2024) ובוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים למעבדה ושימוש בהם. הרכיבים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים ב- טבלת חומרים.
חומרים וריאגנטים
ניצני פרחים מיובשים ולא פתוחים של Styphnolobium japonicum (L.) Schott (מערך שמות נרדפים. Sophora japonica נעשה שימוש ב- (.L.; Fabaceae; Flos Sophorae Immaturus/Huai Mi). החומר הבוטני אומת באמצעות השוואה לחומר ייחוס מאושר של Sophorae Flos מהמכונים הלאומיים לבקרת מזון ותרופות (NIFDC), בבייג'ינג, סין (מס' קטלוג 121270; מס' אצווה 121270-201403), לפני המיצוי. Rutin (98%, HPLC) ו-quercetin (98%, HPLC) שימשו כתקני ייחוס. Ang II, MLN-4760, L-NAME ו-valsartan שימשו כפי שצוין. ריאגנטים וציוד נוספים מפורטים ב- טבלת חומרים.
הכנה ובקרת איכות של תמצית ניצנים של S. japonicum
את ניצני הפרחים ייבשו בתנור בטמפרטורה של 80 °C עד למשקל קבוע, גרסו והעבירו דרך נפה של 85-mesh. את האבקה העבירו לשני סבבים של מיצוי ברפלקס עם אתנול 85% ביחס של חומר לממס של 1:20 (w/v) בטמפרטורה של 80 °C למשך 1.5 h לכל מיצוי. את התסנינים איחדו וריכזו תחת לחץ מופחת בטמפרטורה של 60 °C עד לקבלת תמצית סמיכה, אותה הקפיאו מראש בטמפרטורה של −80 °C וליופיליזו למשך 48–72 h. את ניצולת המיצוי חישבו כמשקל התמצית היבשה חלקי משקל הסם הגולמי היבש, ואת אבקת ה-SJBE שחולקה למנות אחסנו בתנאים המונעים מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים או חשיפה ללחות.
כרומטוגרפיה נוזלית בעתקת ביצועים (HPLC) בוצעה באמצעות ציוד המצויד בגלאי מערך פוטודיודות UV-visible. האנליטים הופרדו בעמודה פאזה הפוכה C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) עם מيثנול-מים (65:35, v/v) שסופקו באופן איזוקראטי בקצב של 1.0 mL/min. טמפרטורת העמודה נשמרה על 35 °C, הגילוי הוגדר ל-360 nm, נפח ההזרקה היה 20 µL, וזמן הרכישה היה 20 min. SJBE הוכנ בריכוז של 1.0 mg/mL במيثנול. שבע רמות כיול של rutin הוכנו בריכוזים של 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 300 µg/mL ו-400 µg/mL, ושבע רמות כיול של quercetin הוכנו בריכוזים של 0.5 µg/mL, 1 µg/mL, 2.5 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL ו-50 µg/mL. התקנים והדגימות הועברו דרך מסנני ממברנה מפוליטטרהפלואורואתילן של 0.22 µm, 0.5 mL הראשונים של התסנן נזרקו, והשאר הועברו לבקבוקוני HPLC. כל רמת כיול הוזרקה בשכפול, וכל הכנה של SJBE הוזרקה בשלישייה. rutin ו-quercetin זוהו על ידי התאמת זמן השהייה לתקנים אותנטיים בטווח של ±2% ועל ידי ספקטרום מערך פוטודיודות תואם. כל סמן כומת באמצעות כיול תקן חיצוני, ודגימות מדוללות נותחו מחדש כאשר תגובת הגלאי חרגה מטווח הכיול הרלוונטי.
ביצועים אנליטיים, התאמת מערכת והערכת סדרת ייצור
הליניאריות הוערכה באמצעות רגרסיה של ריבועים פחותים של שטח הפיק מול הריכוז בשבעה מפלסים מוגדרים. כיול התקבל כאשר R2 היה לפחות 0.999, וגרף השאריות לא הראה מגמה סיסטמטית. גבול הגילוי וגבול הכימות נקבעו ביחסי אות לרעש של כ-3 ו-10, בהתאמה. ספציפיות הוכח באמצעות בלאנק של מתנול, תמיסת סטנדרטים מעורבת ודגימה של SJBE; אושרו היעדר הפרעות של קואלוציה (coelution) והתאמה של ספקטרום האנליט לסטנדרטים הייחוס.
דיוק ההזרקה הוערך באמצעות שש הזרקות רצופות של סטנדרט מעורב. דיוק תוך-יומי הוערך באמצעות שש קריאות שבוצעו באותו יום, ודיוק בין-יומי הוערך לאורך שלושה ימים רצופים. הדירות הוערכה באמצעות שש תמיסות SJBE שהוכנו באופן עצמאי, ויציבות הדגימה במדגם האוטומטי (autosampler) הוערכה ב-0 h, 4 h, 8 h, 12 h ו-24 h. הבחזור הוערך ב-80%, 100% ו-120% מרמת הסמן הטבעית באמצעות שלוש הכנות שהועשרו באופן עצמאי בכל רמה. דיוק ההזרקה נחשב לקביל כאשר RSD של שטח הפסגה ≤2.0%; הדיוק, הדירות והיציבות נחשבו לקבילים כאשר RSD ≤3.0%; והבחזור הממוצע נחשב לקביל בטווח של 95.0%–105.0% עם RSD של הבחזור ≤3.0%.
לפני כל רצף אנליטי, הוזרק התקן המעורב שש פעמים. התאמת המערכת נחשבה למקובלת כאשר ה-RSD של זמן השהייה היה ≤1.0%, ה-RSD של שטח הפסגה היה ≤2.0%, הרזולוציה הייתה ≥1.5, מקדם הזנב היה ≤2.0, ומספר הפלטות התיאורטיות עבור פסגת ה-rutin היה לפחות 5,000. העמודה הועמדה שוב בשיווי משקל, ובדיקת התאמת המערכת חזרה על עצמה בכל פעם שקריטריון כלשהו לא התקיים.
הוכנו ונותחו שלוש סדרות נפרדות של מיצוי SJBE. עבור כל סדרה נרשם הכרומטוגרם המלא ב-360 nm, כאשר rutin הוגדר כפיס הפסגות של הייחוס, בוצעו יישור של פסגות משותפות הניתנות לשחזור, וחושבו זמן השהייה יחסי, שטח פסגה יחסי ודמיון של הפרופיל כולו. עקביות טביעת האצבע ברמת הסדרה התקבלה כאשר הדמיון היה ≥0.90, ה-RSD של זמן השהייה יחסי של פסגות משותפות ≤2.0%, וה-RSD של שטח פסגה יחסי ≤5.0%. תכני rutin ו-quercetin דווחו עבור כל סדרה יחד עם הממוצע הכללי, סטיית התקן ומקדם השונות.
תרבית תאים וטיפולים
קו תאי המיקרוגליה BV-2 של עכבר וקו תאי העצבים ההיפותלמיים mHypoA-2/10 של עכבר נרכשו ממקורות מסחריים. התאים הופשרו ממלאים מאושרים על ידי הספק, הורחבו למשך שני מעברים, זהותם המינית אומתה באמצעות שיטת PCR ספציפית למין, ואומת כי הם נטולי מיקופלסמה לפני הניסויים ולאחר הפשרה של כל בקבוקון חדש. נעשה שימוש בתאים שבין מעברים 3 ל-20.
תאי BV-2 ו-mHypoA-2/10 תורגדו ב-DMEM עם ריכוז גלוקוז גבוה, בתוספת 10% fetal bovine serum ו-1% penicillin-streptomycin בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO₂. המצע הוחלף מדי 2 d, והתאים הועברו למצע חדש (passaged) כאשר הגיעו ל-70%–80% confluence באמצעות 0.25% trypsin-EDTA. התאים נזרעו 24 h לפני הטיפול, והניסויים התחילו כאשר התאים הגיעו ל-70%–80% confluence.
לבדיקת חיוניות, תאי BV-2 נחשפו ל-SJBE בריכוזים של 0 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, או 400 µg/mL למשך 24 h. עבור ניסויי דלקת, התאים עברו דגירה מקדימה עם SJBE בריכוז המצוין באיור או עם rutin (50 µmol/L) למשך 1 h, ולאחר מכן הוסף Ang II (100 nmol/L) ללא החלפת מצע למשך 24 h נוספות. עבור ניסויי עיכוב של ACE2, הוסף MLN-4760 (10 µmol/L) כ-30 min לפני ה-SJBE, ולאחריו הוסף Ang II כ-1 h אחרי ה-SJBE, כאשר כל החומרים נשמרו לאורך תקופת הגירוי של 24 h. SJBE בריכוז 100 µg/mL שימש עבור ניסויי מנגנון המשכיים. Ang II ו-SJBE הוכנו במצע תרבית סטרילי, בעוד ש-MLN-4760 ו-rutin הוכנו כמלאים ב-dimethyl sulfoxide. ריכוז ה-dimethyl sulfoxide הסופי נשמר ברמה של 0.1% (v/v) בכל קבוצה רלוונטית, כולל בביקורת ה-vehicle. בוצעו שלושה ניסויי תרביות עצמאיים, ותוצאות הבארים הטכניות בתוך כל ניסוי חושבו כממוצע.
בדיקת חיוניות תאים
תאי BV-2 נזרעו בלוחיות בעלות 96 בארות בריכוז של 5 × 103 תאים לבאר ותשביליו למשך 24 שעות. המצע הוחלף במצע טרי המכיל 0 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mLאו, או 400 µg/mL SJBE. לאחר 24 שעות, 10 µL הוסיפו ריאגנט CCK-8, והתאים הודגרו ב- 37 °C במשך שעה אחת. הבליעה נמדדה באורך גל של 450 ננומטר, וחיוניות התאים בוטאה ביחס לבארות ביקורת שלא טופלו. הכנות תרביות עצמאיות שימשו כשכפולים ביולוגיים, ובארות טכניות שימשו למטרת מיצוע בתוך הניסוי בלבד.
זיהוי רמות ROS
לאחר הטיפול, תאי BV-2 הודגרו במצע נטול סרום המכיל 10 µmol/L DCFH-DA בטמפרטורה של 37 °C בחשיכה למשך 30 דקות. התאים נשטפו פעמיים ב-PBS, הופרדו, הועברו דרך מסנן תאים של 40 µm והושעו מחדש ב-PBS קר. לפחות 10,000 אירועי סינגלט (singlet) לדוגמה נרכשו באמצעות ציטומטר זרימה, עם עירור של 488 nm וערוץ פליטה של FITC/530 ± 15 nm. אוכלוסיית התאים העיקרית הוגדרה (gated) על בסיס שטח הפיזור הקדמי והצדי (forward- and side-scatter area), דובלטים הוצאו באמצעות השוואה בין שטח הפיזור הקדמי לגובהו, וגבול הפלואורסצנציה נקבע באמצעות בקרת ביקורת לא צבועה. פיצוי ספקטרלי לא היה נדרש עבור בדיקה בעלת צבע יחיד זו. תבנית הגדרה זהה הוחלה על כל הדגימות המקודדות, ודווחה עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת.
צביעת TUNEL
לאחר תרבית משותפת (co-culture), תאעי עצב בתא התחתון קובעו עם 4% paraformaldehyde למשך 30 min, נשטפו שלוש פעמים ב-PBS, ועברו פרמיליזציה עם 0.3% Triton X-100 ב-PBS למשך 5 min. סך של 50 µL של תערובת תגובת TUNEL הוספה לכל באר, והתאים דגרו ב-37 °C בחשיכה למשך 60 min. הדגימות נשטפו שלוש פעמים, הגרעינים צבעו בצביעה נגדית עם 1 µg/mL DAPI למשך 10 min, והדגימות הועלו לזכוכית (mounted). עבור כל אחת מחמש תרביות משותפות שהוכנו באופן עצמאי לכל קבוצה, נדגמו שלושה שדות נבחרים מראש שאינם חופפים בהגדלה של 200× תוך שימוש בהגדרות חשיפה זהות. גרעינים חיוביים ל-TUNEL נספרו כאחוז מהגרעינים החיוביים ל-DAPI באמצעות סף קבוע ב-ImageJ. שלושת השדות שולבו לממוצע כדי לקבל ערך אחד ברמת התרבית לפני הניתוח הסטטיסטי.
ניסוי של תרבית משותפת של נוירונים ומיקרוגליה
השתמשו במבני Transwell בעלי 24 בארות עם ממברנות פוליקרבונט של 0.4 µm ושטח גידול של כ-0.33 cm2 כדי לדגמן תקשורת ללא מגע המתווכת על ידי גורמים ממיסים. תאי mHypoA-2/10 נזרעו בבארות התחתונות בריכוז של 1 × 105 תאים ב-600 µL מצע, ותאי BV-2 נזרעו במבני ה-Transwell בריכוז של 2 × 105 תאים ב-100 µL מצע. התאים תורבעו למשך לילה לפני ההרכבה. Ang II, SJBE, MLN-4760, rutin והביקורות התואמות להם הוספו לתא BV-2 העליון בהתאם לרצף הטיפולים שתואר לעיל. עבור קבוצות העקה הנוספות של נתרן גבוה, הוסף NaCl לתא הנוירונלי התחתון כדי להעלות את הריכוז הסופי ב-30 mmol/L. תרביות השיתוף המורכבות נשמרו למשך 24 h.
המצע מהתא העליון ותאי BV-2 נאספו לצורך ניתוחים של ציטוקינים ואיתות מיקרוגליאליים, בעוד שהמצע מהתא התחתון ותאי עצבים נאספו בנפרד לצורך ניתוחים של Ang-(1-7), qPCR, אימונובלוטינג ו-TUNEL. זוג אחד של רכיב המערכת (insert) והבאר התחתונה נחשב ליחידה ניסיונית אחת, ובוצעו שלושה ניסויי תרבית משותפת (co-culture) בלתי תלויים. תצורה זו העריכה חילוף של גורמים מסיסים, אך לא יכלה לקבוע כי המיקרוגליה היא המטרה הישירה הבלעדית של SJBE. מאחר שלא נכללה בקרת איזו-אוסמוטית, תנאי ה-NaCl לא יכול היה להבחין בין השפעות ספציפיות של נתרן להשפעות אוסמוטיות.
מודל חיות ליתר לחץ דם
חוללי ויסטאר (Wistar) זכרים, נקיים מפתוגנים ספציפיים (SPF), בני 6–8 שבועות ושוקלים 180–220 g, נרכשו ממקורות מסחריים. שלושה חוללים שוכנו בכל כלוב בטמפרטורה של 22 °C ± 2 °C ובלחות יחסית של 50%–60% תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית למזון ומים. מצע הכלוב הוחלף פעמיים בשבוע, והבעליים עברו אקלימטציה למשך 7 d. בעלי החיים נבחנו מדי יום, ומשקל הגוף נרשם פעמיים בשבוע. יתר לחץ דם המושרה על ידי מחסור בחנקן חמצני הוקם באמצעות מתן L-NAME בזריקה דרך הפה (gavage) במינון של 40 mg/kg/day ב-0.5% CMC-Na; 10 mL/kg) למשך 3 שבועות. התאמתו של המודל נקבעה לפני הרנדומיזציה כלחץ דם סיסטולי ≥140 mmHg בשתי מדידות רצופות. מודל זה שחזר יתר לחץ דם המושרה על ידי מחסור בחנקן חמצני ולא היה ספציפי ליתר לחץ דם נוירוגני.
חלוקה לקבוצות, מתן טיפול ואיסוף דגימות
חולקים חולקו לקבוצת ביקורת נורמלית ולקבוצת מידול של L-NAME. לאחר שנקבעה התאמתם למידול, חולקים היפרטנסיביים מתאימים שובצו לקבוצות של vehicle למודל, SJBE במינון 100 mg/kg/day, 200 mg/kg/day, או 400 mg/kg/day, או קבוצת valsartan במינון 10 mg/kg/day. כל תכשירים למתן ב-gavage הוגשו פעם ביום בנפח של 10 mL/kg, וקבוצות הביקורת קיבלו את אותו נפח של 0.5% CMC-Na. שישה חולקים לכל קבוצה (36 חולקים בסך הכל) הרכיבו את המדגם הסופי שנותח. גיוס ראשוני, מקרי מוות והחרגות דווחו לפי קבוצה וסיבה. ה-gavage היומי נמשך במשך 6 שבועות, בעוד שהקבוצות הנגזרות מהמודל נותרו תחת פרוטוקול L-NAME.
בנקודת הסיום, החולדות הורדמו באמצעות פנטוברביטל נתרן (50 mg/kg, בהזרקה תוך-פעטונית), ואומת אובדן של רפלקס נסיגת כף הרגל. דם (4–6 mL) נאסף מהאאורטה הבטנית לשפופרות EDTA. החולדות הומתו על ידי דימום תחת הרדמה עמוקה ועברו פרפוזיה טרנס-קרדיאלית עם כ-200 mL של סליין 0.9% קר מאוד. דגימות הדם סובבו בצנטריפוגה במהירות של 2,000 × g למשך 15 min בטמפרטורה של 4 °C, והפלזמה נשמרה בטמפרטורה של −80 °C. המוחות הוצאו באופן מיידי. באמצעות אטלס של מוח חולדה, הוכנה חיתוך קורונלי בטווח של כ-1.3− mm עד 2.1− mm מהברגמה, והגרעינים הפרא-ונטריקולריים (PVN) הדו-צדדיים בוצעו במיקרו-דיסקציה בטווח של כ-0.3–0.6 mm לטרלית לקו האמצע ו-7.4–8.2 mm ונטרלית לפני השטח של הגולגולת. הרקמה הוקפאה בהקפאה מהירה (snap-frozen) לצורך אנליזות של RNA וחלבונים, או נטמנה לצורך הכנת חתכים קפואים בעובי 20 µm.
הקצאה אקראית, הסתרת הקצאה, סמיות וקריטריוני החרגה
חולקים של חולדות עם יתר לחץ דם שעמדו בקריטריונים הכלולים במחקר סווגו לפי משקל גוף ולחץ דם סיסטולי בקו הבסיס, והוקצו באמצעות רשימת רנדומיזציה בבלוקים שהופקה במחשב, בבלוקים של שישה. חוקר שלא ביצע את מתן המינונים או את הערכת התוצאים הוא זה שהפיק את הרצף, הכין את קודי הקבוצות הרצופים, ושמר את רשימת ההקצאה בסודיות עד שכל בעלי החיים עמדו בקריטריוני ההכללה. בעל החיים נחשב ליחידה הניסויית עבור נקודות קצה של לחץ דם, מדדים מולקולריים, ביוכימיים והיסטולוגיים.
תכניות הגavage, מבחנות דגימה, מנות רקמה, חתכים, תמונות ולוחיות בדיקה סומנו בקודים אקראיים בני שלוש ספרות עבור החיות. החוקרים שביצעו את מדידות לחץ הדם, הדנסיתומטריה, ELISA, רכישת התמונות ואנליזת התמונות היו מסוכים להקצאת הטיפול. הקוד נחשף רק לאחר השלמת בדיקות האיכות והאנליזה הראשונית שנקבעו מראש. חיות הוצאו מהמחקר רק עקב מוות שאינו קשור לטיפול, מחלה או פציעה קשה, איבוד משקל גוף של >20%, כישלון בגavage, כישלון בהשראת המודל, רישומי tail-cuff לא מספקים לאחר חזרה על הפרוצדורה, אובדן דגימה או כישלון מתועד בבדיקה. כל המקרים של הוצאה מהמחקר דווחו לפי קבוצה וסיבה. מכיוון שלא היה זמין חישוב עוצמה (power calculation) מראש, n = 6 לקבוצה נחשב כמדגם מכניסטי חקיר.
מדידת לחץ דם באמצעות שרוול זנב
לחץ הדם נמדד באמצעות מערכת שרוול זנב (tail-cuff) לא פולשנית בחדר שקט בין השעות 09:00 ל-12:00. חולבים עברו הרגלה במשך 5 ימים רצופים על ידי הנחה במכשיר הריסון למשך 15 min/day. בכל יום מדידה, בעלי החיים חוממו בטמפרטורה של 33 °C ± 1 °C למשך 10 min, ולאחר מכן שהו 5 min נוספים במכשיר הריסון. חמשת מחזורי הניפוח והריקון הראשונים נפסלו, ו-10–15 מחזורים נוספים תועדו. סשן נחשב קביל כאשר לפחות חמש קריאות תקניות מבחינה טכנית הראו מקדם וריאציה של ≤10%. ערך לחץ הדם ברמת בעל החיים חושב כממוצע של הקריאות התקניות. כאשר קריטריון זה לא התממש, בעל החיים נח למשך 10 min, וסט אחד של מחזורים חזר על עצמו. אם הקריטריון עדיין לא התממש, הסשן חזר על עצמו ביום למחרת, והסשן המקורי תועד כנתון חסר במקום להסיר קריאות בודדות באופן סלקטיבי. מדידות שרוול זנב סיפקו הערכות לסירוגין של לחץ הדם ולא סיפקו טלמטריה רציפה.
ELISA
על-נוזלי תרבית תאים, על-נוזלי הומוגנאט של PVN ופלזמה עובדו באמצעות ערכות בדיקה תואמות לאנליט ולמין: TNF-α של עכבר, IL-1β של עכבר, IL-6 של עכבר, TNF-α של חולדה, IL-1β של חולדה, Ang-(1-7) ונוראפינפרין. על-נוזלי התאים הובהרו ב-1,000 × g למשך 10 דקות ב-4 °C. רקמת PVN הומוגניזה ביחס של 1:9 (משקל/נפח) ב-PBS קר בקרח המכיל מעכבי פרוטאז, ועברה סבוב בצנטריפוגה ב-12,000 × g למשך 15 דקות ב-4 °C. הפלזמה הופשרה פעם אחת בלבד על קרח. ריאגנטים הובאו לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. נפח של 100 µL של סטנדרטים ודגימות הוסף בכפילות טכנית ועבר אינקובציה למשך 2 שעות ב-37 °C, ולאחריה חמישה שטיפות עם 300 µL של בופר שטיפה. לאחר מכן, הוספו 100 µL של נוגדן זיהוי ביוטינילי ובוצעו אינקובציה למשך שעה אחת ב-37 °C. הפלטות נשטפו חמש פעמים, ולאחריהן הוספו 100 µL של קונג'וגט horseradish-peroxidase ובוצעה אינקובציה למשך 30 דקות ב-37 °C. לאחר שלב שטיפה נוסף, הוספו 90 µL של מצע TMB, והפלטות פותחו למשך 15 דקות בחושך. לאחר מכן הוסף נפח של 50 µL של תמיסת עצירה, והבליעה נמדדה ב-450 nm תוך 5 דקות באמצעות קורא מיקרופלטות. הריכוזים חושבו באמצעות עקומת סטנדרט לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים. מדידות כפולות התקבלו כאשר מקדם השונות היה ≤15%; דגימות מחוץ לטווח המכויל דוללו ונבדקו שוב.
PCR כמותי בזמן אמת
RNA כולל הוצא מהתאים או מרקמת ה-PVN באמצעות ריאגנט TRIzol. טוהר ה-RNA הוערך באמצעות יחס A260/A280, ו-1 µg RNA שימשו לסנתזת cDNA עם Evo M-MLV reverse-transcription premix. כל תגובת qPCR בנפח של 20 µL הכילה 10 µL של 2× SYBR Green master mix, 0.4 µL של פריימרים קדמיים ואחוריים בריכוז 10 µmol/L כל אחד, 2 µL של cDNA מדולל, ו-7.2 µL של מים נקיים מנוקלאז. התגובות בוצעו בשלוש חזרות טכניות במערכת לגילוי PCR בזמן אמת. תנאי המחזור היו 95 °C למשך 30 s, ולאחריהם 40 מחזורים של 95 °C למשך 5 s ו-60 °C למשך 30 s. לאחר מכן נוצרה עקומת המסה מ-65 °C עד 95 °C במרווחים של 0.5 °C. נכללו ביקורות ללא תבנית (No-template) וללא שעתוק הפוך (no-reverse-transcription). בדיקה התקבלה רק כאשר נצפה שיאו של המסה בודד ונצפעה יעילות של עקומת סטנדרט בטווח של 90%–110%. ביטוי גנים יחסי חושב באמצעות שיטת 2⁻ΔΔCt כאשר Gapdh שימש כגון הייחוס. רצפי הפריימרים ששימשו במחקר מפורטים ב-Table 1.
וסטן בלוט (Western blot)
חלבון כולל הוצא מהתאים או מרקמת ה-PVN באמצעות באפר RIPA קר (בקרח) המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז. הליסאטים הובהרו ב-12,000 × g למשך 15 דקות ב-4 °C, וריכוז החלבון נקבע באמצעות בדיקת BCA. כמות כוללת של 30 µg חלבון לכל נתיב הועמסה על ג'ל SDS-polyacrylamide בריכוז של 8%–12%, שנבחר בהתאם למשקל המולקולרי של חלבון המטרה, והועברה לממברנת PVDF בעלת נקבים של 0.45 µm בזרם של 300 mA למשך 90 דקות על קרח. הממברנות נחסמו למשך שעה בטמפרטורת החדר ב-5% bovine serum albumin עבור פוספו-חלבונים או ב-5% חלב דל שומן עבור יעדים אחרים. נוגדנים ראשוניים הודגרו למשך לילה ב-4 °C בדילולים המפורטים ב-טבלת החומרים, כולל נוגדן ל-CREB כולל. הממברנות נשטפו שלוש פעמים למשך 10 דקות עם TBST והודגרו עם הנוגדן המשני המתאים המצומד ל-horseradish-peroxidase (בדילול 1:5,000) למשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחריהן שטיפה נוספת. הפסים הזוהו בשיטת chemiluminescence משופרת באמצעות חשיפות לא רוויות. צפיפות הפסים נמדדה באמצעות ImageJ. פוספו-חלבונים נורמלו לחלבון הכולל המתאים, בעוד שחלבוני מטרה אחרים נורמלו ל-GAPDH.
צביעה אימונופלואורסצנטית
הוכנו חתכים קפואים קורונליים (20 µm) דרך ה-PVN בטווח של בערך −1.3 עד −2.1 mm ביחס ל-bregma. נבחרו שלושה חתכים תואמים אנטומית לכל חולדה במרווחים של 120 µm. החתכים הגיעו לשיווי משקל במשך 20 min בטמפרטורת החדר, נשטפו שלוש פעמים ב-PBS, ועברו חסימה וחדירות באמצעות 0.3% Triton X-100 ו-5% goat serum למשך 1 h. החתכים דגרו עם נוגדן ראשוני ל-Iba-1 או ל-c-Fos למשך לילה ב-4 °C, נשטפו, ודגרו עם נוגדן משני פלואורסצנטי מתאים למשך 1 h בטמפרטורת החדר בחשכה. הגרעינים נצבעו בצביעה נגדית ב-DAPI למשך 10 min. תמונות בילטרליות של ה-PVN נרכשו בהגדלה של 200× באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך, תוך שמירה על הגדרות חשיפה והגבר זהות עבור כל סמן. סף (threshold) שהוגדר מראש ב-ImageJ הוחל על התמונות המקודדות, ואזור ה-Iba-1-positive או גרעיני ה-c-Fos-positive נכמרו. המדידות משלושת החתכים שורשרו כדי לקבל ערך אחד ברמת החיה.
בטיחות ופינוי פסולת
מטנול, אתנול, פאראפורמאלדהיד, DCFH-DA, ריאגנטים לאלקטרופורזה ורקמות בעלי חיים טופלו בהתאם לנהלי הבטיחות הכימית והביולוגית של המוסד. ממסים נדיפים ופאראפורמאלדהיד טופלו במנדף כימי מאושר, ונלבש ציוד מגן אישי מתאים. פסולת ממסים אורגניים נטולת הלוגנים ופסולת המכילה פורמאלדהיד הופרדו, פסולת ביולוגית עברה דה-קונטמינציה, וחדים ופגרי בעלי חיים פונו דרך המסלולים המוסדיים המאושרים. קטגוריות הפסולת המקומיות ונהלי החירום אושרו לפני השימוש.
ניתוח סטטיסטי
הנתונים הוצגו כממוצע ± סטיית תקן ונאלחו באמצעות תוכנה סטטיסטית ותוכנה לגרפים. הכנת התרבית העצמאית או בעל החיים שימשו כיחידה הניסויית הביולוגית, ובבארות טכניות, שדות או מדידות חוזרות בוצע ממוצע בתוך כל יחידה לפני הסקת מסקנות סטטיסטית. הנחות ההתפלגות ודפוסי השונות נבחנו לפני ביצוע ניתוחים פראמטריים. מערכי נתונים של נקודת סיום עם מספר קבוצות נותחו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way ANOVA), ולאחריו השוואות של Tukey המתואמות לריבוי. לחץ דם סיסטולי לאורך זמן הוצג באופן תיאורי כממוצע ± סטיית תקן, ותוצאות לחץ הדם בנקודת הסיום נותחו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני עם תיקון של Tukey. דווחו ערכי p מתוקננים, הפרשי ממוצעים ומרווחי סמך של 95%. ערך p דו-צדדי של < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית, וכל ההחרגות והערכים החסרים דווחו.
תוצאות
SJBE בכמות שנקבעה באמצעות HPLC ממוקדת מעכבת דלקת מיקרוגליאלית המושראת על ידי Ang II
מיצוי באמצעות רפלוקס של אתנול הניב אבקת SJBE בשיעור של 25.5 ± 0.7% מהחומר ההתחלתי (איור 1A). ניתוח HPLC ממוקד כימת את ה-rutin וה-quercetin בריכוזים של 276.1 mg/g ± 9.2 mg/g ו-12.5 mg/g ± 0.9 mg/g, בהתאמה (איור 1B), ובכך סיפק אפיון כמותי של המדדים עבור תכשיר ה-SJBE ששימש לאורך כל הניסויים הביולוגיים.
SJBE לא הראה השפעה גלית על חיוניות תאי BV-2 בריכוזים של עד 200 µg/mL, בעוד שבתאי 400 µg/mL נצפתה ירידה משמעותית בחיוניות (איור 1C). בהתבסס על ממצאים אלו, נבחר ריכוז של 100 µg/mL לניסויים מכניסטיים המשכיים. Ang II הגביר באופן ניכר את שחרור TNF-α ו-IL-1β מתאי BV-2, בעוד ש-SJBE הפחית את שניB הציטוקינים הדלקתיים לאורך טווח הריכוזים הבלתי-ציטוטוקסיים שנבדקו (איור 1D,E), מה שמעיד על השפעה אנטי-דלקתית תלוית-ריכוז תחת גרייה של Ang II.
SJBE קשורה לסמנים גבוהים יותר של ACE2/MasR ולסיגנלינג נמוך יותר של NF-κB ולעקה חמצונית
גירוי באמצעות Ang II הפחית את ביטוי ה-ACE2 וה-MasR הן ברמת החלבון והן ברמת ה-mRNA, ולווה בעליה של הפספורילציה של NF-κB p65. טיפול ב-SJBE הפך שינויים אלה, על ידי הגברת ביטוי ACE2 ו-MasR תוך הפחתת הפספורילציה של p65 (איור 2A–E).
בהתאם לשינויים מולקולריים אלו, SJBE הפחית את ריכוזי TNF-α מ-135 pg/mL ± 12 pg/mL ל-55 pg/mL ± 6 pg/mL ואת ריכוזי IL-1β מ-102 pg/mL ± 10 pg/mL ל-42 pg/mL ± 5 pg/mL בעיקרי תרביות שעברו גרייה ב-Ang II. הוספה של מעכב ACE2, MLN-4760, החלישה באופן משמעותי השפעות אלו, כאשר TNF-α ו-IL-1β עלו ל-125 pg/mL ± 11 pg/mL ו-95 pg/mL ± 9 pg/mL, בהתאמה. טיפול ב-Rutin שחזר חלק מהתגובה האנטי-דלקתית שנצפתה עם התמצית המלאה (איור 2F).
SJBE הפחית באופן משמעותי גם את פלואורסצנציית ה-DCFH-DA התוך-תאית לאחר גירוי ב-Ang II, מה שמעיד על הצטברות נמוכה יותר של מיני חמצן רבטיביליים תוך-תאיים. הפחיתה זו נחלשה על ידי MLN-4760 (איור 2G,H). יחד, ממצאים אלו מצביעים על כך שההשפעות נוגדות הדלקת ונוגדות החמצון של SJBE בתאי BV-2 שעברו גירוי ב-Ang II מלוות בשיקום של שרטוט הסיגנלינג של ACE2/MasR ורגישות לעקיבה פרמקולוגית של ACE2.
SJBE מגביל העברה דלקתית ממיקרוגליה לנוירונים היפותלמיים
כדי לבחון האם ההשפעות נוגדות הדלקת של SJBE משפיעות על התקשורת בין מיקרוגליה לנוירונים, תאי BV-2 ונוירונים היפותלמיים mHypoA-2/10 תורבדו במערכת Transwell ללא מגע. גרייה באמצעות Ang II העלתה את ריכוזי ה-TNF-α וה-IL-1β במערכת התרבית המשולבת (co-culture), בעוד ש-SJBE הפחית את ה-TNF-α מ-150 ± 15 pg/mL ל-65 ± 8 pg/mL ואת ה-IL-1β מ-110 ± 12 pg/mL ל-48 ± 6 pg/mL (איור 3A). Ang II הפחית גם את הביטוי של Ace2 ו-Mas1, ושניהם חזרו לרמות קרובות לאלו של הביקורת לאחר טיפול ב-SJBE (איור 3B).
שינויים תואמים נצפו בנוירונים היפותלמיים שגודלו בתא התחתון. חשיפה לסביבת שיתוף-תרבית שעברההסטימולציה של Ang II הגבירה את הביטוי של c-Fos ו-COX-2 ושינתה את הביטוי של Avp ו-Oxtr, בעוד ש-SJBE החליש תגובות אלו (איור 3C–G). התבנית ההגנתית הוחלשה על ידי MLN-4760, מה שקושר עוד יותר את פעילות ACE2 להשפעות שנצפו במערכת שיתוף-התרבית.
ממצאים אלו מדגימים כי SJBE מדכא את הסביבה הדלקתית הנוצרת תחת גרייה של Ang II, וכי הדבר מלווה בהפחתה של הפעלת תגובות עצביות היפותלמימיות במורד המסלול במודל ה-Transwell.
SJBE קשור לאיתות של Ang-(1-7) ולפגיעה עצבית מופחתת תחת עקה משולבת של נתרן גבוה ו-Ang II
חשיפה ל-Ang II הפחיתה את ריכוזי Ang-(1-7) בעיליון של תרבית השיתוף והגבירה את היחס בין phospho-CREB/CREB העצבי. טיפול ב-SJBE הגביר את Ang-(1-7) והפחית את הפספורילציה של CREB לעבר רמות הביקורת (איור 4A–C), באופן העקבי עם השחזור של פרופיל השליחה הקשור ל-ACE2/Ang-(1-7)/MasR שנצפה בניסויים הקודמים.
תחת גירוי משולב של 30 mmol/L NaCl ו-Ang II, תאי עצב היפותלמיים הראו ביטוי מוגבר של Avp ושיעור גבוה יותר של תאים חיוביים ל-TUNEL. SJBE נטען באופן משמעותי את שתי התגובות (איור 4D–F), מה שמעיד על הפחתה במצוקה ובפגיעה העצבית תחת האתגר המשולב. עבור ניתוח ה-TUNEL, כל ערך מייצג תרבית משותפת שהוכנה באופן עצמאי, כאשר ממוצע של שלושה שדות מיקרוסקופיים חושב עבור כל חזרה ביולוגית לפני הניתוח הסטטיסטי (n = 5 לכל קבוצה).
SJBE מפחית את לחץ הדם במדידת זנב-שרוול (tail-cuff) ומקושר לסממנים גבוהים יותר של ACE2/Ang-(1-7)/MasR ב-PVN בחולדות שטופלו ב-L-NAME
מתן יומי של L-NAME גרם לעלייה הדרגתית בלחץ הדם הסיסטולי במהלך השראת המודל. לאחר ביסוסיתןיתר לחץ הדם, טיפול ב-SJBE הפחית את לחץ הדם השבועי שנמדד באמצעות שרוול זנב (tail-cuff) במהלך תקופת ההתערבות של 6 השבועות הבאים, כאשר התגובה הבולטת ביותר נצפתה בקבוצת המינון הגבוה (איור 5A).
בסיום המחקר, לחץ הדם הסיסטולי היה 165 ± 8 mmHg בקבוצת מודל ה-L-NAME בהשוואה ל-115 mmHg ± 5 mmHg בחולדות הביקורת. מינון גבוה של SJBE הפחית את לחץ הדם הסיסטולי ל-130 mmHg ± 6 mmHg. לחץ הדם הדיאסטולי ירד מ-110 mmHg ± 6 mmHg ל-85 mmHg ± 4 mmHg, בעוד שלחץ הדם העורקי הממוצע ירד מ-128 mmHg ± 7 mmHg ל-100 mmHg ± 5 mmHg לאחר טיפול במינון גבוה של SJBE (כל ה-p המתוקננים < 0.0001 לעומת קבוצת המודל; איור 5B). ממצאים אלו מדגימים תגובה להורדת לחץ דם ממושכת ל-SJBE במהלך תקופת ההתערבות.
ניתוח של רקמת ה-PVN חשף שינויים מולקולריים מקבילים. טיפול ב-L-NAME הפחית את הביטוי של חלבוני ACE2 ו-MasR וכן את ריכוזי Ang-(1-7), בעוד ש-SJBE השחזר את שלושת הסמנים בדפוס התלוי במינון. בקבוצת המינון הגבוה, ACE2 עלה מביטוי יחסי של 0.40 ± 0.07 ל-1.50 ± 0.18-fold, MasR עלה מ-0.45 ± 0.08 ל-1.35 ± 0.16-fold, ו-Ang-(1-7) עלה מ-9 pg/mg ± 2 pg/mg ל-32 pg/mg ± 5 pg/mg חלבון בהשוואה לקבוצת המודל (איור 5C–E). לפיכך, ההשפעה של SJBE להורדת לחץ הדם לתהה בשחזור של הפרופיל המולקולרי הקשור ל-ACE2/Ang-(1-7)/MasR בתוך ה-PVN.
SJBE קשור לרמות נמוכות יותר של סממני הפעלה דלקתית ב-PVN וסממני פלט סימפתטי מערכתי
יתר לחץ דם המושרה על ידי L-NAME לווה בהפעלה דלקתית בולטת בתוך ה-PVN. רמות mRNA של Tnf ו-Il1b היו מוגברות בחולדות המודל, בעוד שמינון גבוה של SJBE הפחית את ביטוי Tnf מ-4.5 ± 0.5 ל-1.8 ± 0.2-fold ואת ביטוי Il1b מ-3.8 ± 0.4 ל-1.6 ± 0.18-fold (איור 6A).
ניתוח אימונופלואורסצנציה הראה שינויים תאיים תואמים. צביעת Iba-1, המעידה על הפעלה של מיקרוגליה, הייתה מוגברת ב-PVN של חולדות שטופלו ב-L-NAME ופחתה לאחר מתן SJBE. צביעת c-Fos הראתה דפוס דומה, עם הפעלה עצבית נמוכה יותר לאחר טיפול ב-SJBE מאשר בקבוצת המודל שלא טופלה (איור 6B–D).
שינויים דלקתיים מרכזיים אלו לוו בשיפורים במדדי דלקת ומדדים סימפתטיים במחזור הדם. ריכוזי TNF-α ו-IL-1β בפלזמה היו מוגברים בחולדות המודל ופחתו באופן משמעותי בעקבות טיפול ב-SJBE. בקבוצת המינון הגבוה, TNF-α ירד מ-45 pg/mL ± 6 pg/mL ל-20 pg/mL ± 3 pg/mL ו-IL-1β מ-35 pg/mL ± 5 pg/mL ל-15 pg/mL ± 3 pg/mL (איור 6E). באופן דומה, רמות norepinephrine בפלזמה ירדו מ-400 pg/mL ± 45 pg/mL ל-180 pg/mL ± 25 pg/mL (איור 6F).
בסיכום, ממצאים אלו in vivo מראים כי טיפול ב-SJBE מפחית את לחץ הדם בחולדות שטופלו ב-L-NAME, במקביל לשחזור של סמנים הקשורים ל-PVN ACE2/Ang-(1-7)/MasR, להפחתה של הפעלת דלקת ב-PVN, ולירידה ברמות של ציטוקינים דלקתיים ונוראפינפרין במחזור הדם.
זמינות נתונים:
נתוני המקור המספריים העומדים בבסיס האיורים והפלטים הסטטיסטיים הנלווים מסופקים ב- קובץ משלים 1.
איור 1: כימות באמצעות HPLC מכוון וניסויים ראשוניים בתאי BV-2. (A) תשואת המיצוי. (B) תכני Rutin ו-quercetin ב-SJBE שכומו ב-HPLC מכוון. (C) חיות תאי BV-2 לאחר חשיפה ל-SJBE למשך 24 h. (D,E) רמות TNF-α ו-IL-1β בתעלילים של תאי BV-2 שעברו גרייה באמצעות Ang II. הנתונים הם ממוצע ± SD; n = 3 ניסויים עצמאיים עבור הפאנלים הכמותיים הזמינים. נעשה שימוש ב-One-way ANOVA עם השוואות מתוקננות של Tukey. קיצורים: ns, לא מובהק; *p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 2: SJBE קשורה לסממנים גבוהים יותר של ACE2/MasR ולסיגנלינג NF-κB ועקה חמצונית נמוכים יותר בתאי BV-2. (A–D) אימונובלוטים וכמות של ACE2, MasR, phospho-p65, ו-total p65. (E) mRNA של Ace2 ו-Mas1. (F) TNF-α, IL-1β, ו-IL-6. (G,H) פלט ציטומטריה של זרימה עבור ROS וכמות פלואורסצנציה. הנתונים הם ממוצע ± SD; n = 3 ניסויים עצמאיים. נעשה שימוש ב-One-way ANOVA עם השוואות מתוקננות לפי Tukey. ns, לא מובהק; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: SJBE מגביל סיגנלינג דלקתי במודל של תרבית משותפת של גורמים מסיסים של BV-2/mHypoA-2/10. (A) ציטוקינים בעילי תרבית משותפת. (B) mRNA של Ace2 ו-Mas1. (C–F) אימונובלוטים וכמותיות של ACE2, MasR, c-Fos ו-COX-2. (G) ביטוי של Avp ו-Oxtr בנוירונים בתא התחתון. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD; n = 3 ניסויים עצמאיים. נעשה שימוש ב-One-way ANOVA עם השוואות מותאמות לפי Tukey. ns, לא מובהק; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001, ****p < 0.0001. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: SJBE קשור לאיתות של Ang-(1-7) ולפגיעה עצבית נמוכה יותר הקשורה למצבי דחק. (A) Ang-(1-7) בתעלומה של תרבית משולבת. (B,C) Phospho-CREB ו-CREB כולל בנוירונים בתא התחתון. (D) Avp תחת תנאי דחק משולבים של NaCl/Ang II. (E,F) תמונות TUNEL מייצגות וכימות; סרגל קנה מידה, 50 µm. הנתונים הם ממוצע ± SD; n = 3 ניסויים עצמאיים עבור פאנלים A, C, ו-D; n = 5 הכנות עצמאיות של תרבית משולבת עבור פאנל F, עם ממוצע של שלושה שדות לכל הכנה. בוצע מבחן One-way ANOVA עם השוואות מותאמות לפי Tukey. ns, לא מובהק; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: SJBE מוריד את לחץ הדם במדידת זנב-שרוול ומקושר לרמות גבוהות יותר של סממני ACE2/Ang-(1-7)/MasR ב-PVN בחולדות שטופלו ב-L-NAME. (A) לחץ דם סיסטולי לאורך זמן. (B) לחץ דם סיסטולי, דיאסטולי ולחץ עורקי ממוצע בנקודת הסיום. (C,D) אימונובלוטים וכמות ACE2 ו-MasR ברקמת PVN. (E) Ang-(1-7) בהומוגנאטים של PVN. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD; n = 6 חולדות לקבוצה. SBP לאורך זמן מוצג באופן תיאורי; תוצאות נקודת הסיום נבדקו באמצעות one-way ANOVA עם השוואות מתוקננות לפי Tukey. ns, לא מובהק; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: SJBE קשור לרמות נמוכות יותר של סממני הפעלה דלקתית ב-PVN וסממני פלט סימפתטי סיסטמי בחולדות שטופלו ב-L-NAME. (A) mRNA של Tnf ו-Il1b ברקמת PVN. (B–D) אימונופלואורסצנציה וכמות של Iba-1 ו-c-Fos; פסי קנה מידה, 50 µm. (E) TNF-α ו-IL-1β בפלזמה. (F) נוראפינפרין בפלזמה. הנתונים הם ממוצע ± SD; n = 6 חולדות לקבוצה. נעשה שימוש ב-One-way ANOVA עם השוואות מותאמות לפי Tukey. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. אנא לחץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
| Gene | Forward primer (5'-3') | Reverse primer (5'-3') |
| Gapdh | CACCCACTCCTCCACCTTTGAC | GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG |
| Tnf | CCTGCTGCACTTTGGAGTGA | GCTTGAGGGTTTGCTACAACA |
| Il1b | CAGTGAGGAGAATGACCTGTTC | CGAGATGCTGCTGTGAGATT |
| Ace2 | TCCATTGGTCTTCTGCCATCCG | AGACCATCCACCTCCACTTCTC |
| Mas1 | TCCACCATCAATAGCAGCG | AAGCCACCCACATTCAGGC |
| Avp | TCGCCATGATGCTCAACACTACGC | ACACTGTCTCAGCTCCATGTCGGATG |
| Oxtr | GTGTCGAGTTGGACCTCGGG | CCAGGAACAGAATGAGGCACAG |
טבלה 1: רצפי הפריימרים ששימשו במחקר.
קובץ משלים 1: נתוני המקור המספריים העומדים בבסיס הדמויות והפלט הסטטיסטי הנלווה. אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.
דיון
מחקר זה קושר בין תמצית ניצנים של S. japonicum, שמינונה נקבע באמצעות HPLC ממוקד, לבין אותות דלקתיים נמוכים יותר במודלים של תרבית משותפת של מיקרוגליה וגורמים מסיסים, ולבין לחץ דם נמוך יותר במדידת זנב (tail-cuff) בחולדות שטופלו ב-L-NAME. במערכות הניסוייות השונות, טיפול ב-SJBE לווה בסממנים גבוהים יותר של ACE2/Ang-(1-7)/MasR, הפעלה נמוכה יותר של NF-κB ומתח חמצוני נמוך יותר, וסממנים נמוכים יותר של הפעלת דלקת ב-PVN. תצפיות מתכנסות אלו תומכות בהיפותזה נוירו-אימונית, אך אינן קובעות כי הנתיב המרכזי הוא זה שמתווך את ההשפעה הנוגדתית-יתרוֹן (antihypertensive).
התוצאות עקביות עם דיווחים לפיהם רכיבים של פרחי S. japonicum ורוטין מפחיתים אותי דלקת ונוירו-דלקת8,9,22, ועם ראיות לכך שקוורצטין מווסת את הטון הדלקתי הקרדיווסקולרי ואת אותי החמצון-חיזור של מיקרוגליה12,13. המחקר הנוכחי מרחיב תצפיות אלו למודלים נוירו-אימונולוגיים היפותלמיים באמצעות תמצית בוטנית מלאה. מכיוון ש-MLN-4760 החליש את התגובה המגנה רק in vitro, יש לפרש את ACE2 כתושם תפקודי לתגובה התאית נוגדת הדלקת, ולא כמתווך מבוסס של השפעת לחץ הדם in vivo.
הממצאים ב-PVN ממקמים את התצפיות התאיות בתוך אזור של בקרה קרדיווסקולרית. מחקרים קודמים מראים כי מיקרוגליה וציטוקינים דלקתיים תורמיםיתר לחץ דם נוירוגני ועירור סימפתטי23,24. סיגנלינג של Ang-(1-7) בתוך ה-PVN יכול לווסת את הזרימה הסימפתטית, בעוד ש-Ang II יכול להוביל לעקה חמצונית של מיקרוגליה התלויה ב-AT1/TLR420,21. בהתאם לכך, הירידה ב-Iba-1, c-Fos, בציטוקינים דלקתיים ובנוראפינפרין בפלזמה לאחר טיפול ב-SJBE עולה בקנה אחד עם הפעלה דלקתית נמוכה יותר ב-PVN, אך הנתונים אינם קובעים האם שינויים אלו גרמו לירידה בלחץ הדם או שהיו תוצאה של שיפור מערכתי.
מדגמי Ang II ו-L-NAME מספקים הקשרי עקה משלימים ולא מנגנוני מחלה זהים. גרייה של Ang II משרה דלקת מיקרוגליאלית המונעת על ידי מערכת הרנין-אנגיוטנסין, בעוד ש-L-NAME מדמה יתר לחץ דם הנובע מחסור בתחמוצת חנקן, המלווה בתפקוד לקוי של כלי דם ובעקה חמצונית25,26. מדגמים אחרים מעידים אף הם על מעורבות של הפעלה מיקרוגליאלית ב-PVN בבקרת מערכת הסימפתטית14,27, אך מחקר ה-L-NAME הנוכחי אינו ספציפי ליתר לחץ דם נוירוגני המונע על ידי ה-PVN. תנאי השיתוף-תרביתי של נתרן גבוה היווה אתגר למעקה עצבית in vitro ללא בקרה איזו-אוסמוטית, ואין לפרשו כמדגם in vivo של יתר לחץ דם המונע ממלח.
לצורך יישום הדיר, השלבים הקריטיים ביותר הם תיעוד המקור הבוטני, מיצוי ואחסון עקביים, צפיפות תאים ותזמון טיפול סטנדרטיים, הקצאה נכונה של תאי ה-Transwell, הרגלה וחימום של ה-tail-cuff, דגימה מדויקת של ה-PVN, וכמותיות קצה עיוורות. תנודות ביבול המיצוי צריכות להוביל לבדיקה של לחות החומר, יחס הממס, תנאי רפלקס, סינון וליופיליזציה; שינויים בזמני השהייה ב-HPLC צריכים להוביל לבדיקה של הכנת התמיסות הסטנדרטיות, הפאזה הניידת, קצב הזרימה, הטמפרטורה, שיווי המשקל של העמודה והתאמת המערכת. תוצאות לא עקביות של שילוב תרבויות (co-culture) או של ה-tail-cuff צריכות להיפתר באמצעות בדיקת שלמות המאש ב-insert ומיקום הטיפול, או על ידי חזרה על תהליך ההרגלה הסטנדרטי, במקום להשמיט מדידות באופן סלקטיבי. טביעת אצבע כרומטוגרפית או LC-MS/MS, תכנוני שילוב תרבויות ראשוניים או סלקטיביים לתאים, טלמטריה, פרמקוקינטיקה של מוח/פלסמה, וניסויי אובדן תפקוד (loss-of-function) של ACE2/MasR מרכזיים הם חלופות מתאימות לשאלות החורגות מפרוטוקול זה. עבודות בינ-תחומיות מתפתחות על עיצוב מחדש של הנוירון והסביבה המיקרוסקופית שלו ושילוב של דימות ובינה מלאכותית ממחישות כיוונים מתודולוגיים רחבים יותר לחקירת מערכות ביולוגיות מורכבות28,29.
מספר מגבלות מגדירות את טווח היישום. MLN-4760 סיפק ראיות פונקציונליות in vitro בלבד; לא בוצעה חסימת ACE2/MasR in vivo ולא נמדדה חשיפה בפלזמה, במוח או ב-PVN. לפיכך, ריכוז של 100 µg/mL הוא ריכוז עבודה in vitro שאינו ציטוטוקסי, ולא חשיפה שוות ערך ל-in vivo. תכנון ה-Transwell אינו יכול להוכיח פעולה ספציפית למיקרוגליה, ומדגם בעלי החיים הקטן, שלא הוגדר מראש מבחינת עוצמה סטטיסטית, מגביל את הדיוק. מדידות באמצעות שרוול זנב (Tail-cuff) הן לסירוגין ורגישות למגבלה פיזית. לבסוף, כימות ממוקד של rutin/quercetin אינו מבסס טביעת אצבע כימית, תיקוף אנליטי מלא, שיוך מרכיבים או עקביות בין סדרות שונות. במסגרת גבולות אלו, הפרוטוקול תומך ביצירת השערות בנוגע ל-SJBE, סיגנלינג נוירו-דלקתי וויסות לחץ דם, ולא מהווה טענה סיבתית או תרגומית חד-משמעית.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים.
תודות
המחברים מודים על התמיכה המוסדית והטכנית שניתנה על ידי המעבדות המשתתפות.
מימון:
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82600861); פרויקט הנוער של תוכנית המחקר הבסיסית של מחוז שאנשי (מס' 202203021212491, 202303021222205); הפרויקט הכללי של תוכנית המחקר הבסיסית של מחוז שאנשי (מס' 202203021221210); ופרויקט התחלת מחקר לדוקטורט של אוניברסיטת שאנשי דטונג (מס' 2018-B-36).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| inserts Transwell בגודל 0.4 µm | Corning Incorporated | 3413 | insert מממברנת פוליקרבונט ב-24 בארות לתרבית משותפת ללא מגע של BV-2/mHypoA-2/10 |
| נוגדן ACE2 | Cell Signaling Technology | 92485; RRID: AB_3741093 | ACE2 (E5O6J) rabbit mAb; WB 1:1,000; IHC/IF 1:100–1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 4412; RRID: AB_1904025 | נוגדן שני לאימונופלואורסצנציה; 1:500 |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 8889; RRID: AB_2716249 | נוגדן שני לאימונופלואורסצנציה; 1:500 |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | פפטיד Ang II סינתטי; לגירוי מיקרוגליאלי |
| ערכה לבדיקת Angiotensin-(1-7) | Cloud-Clone Corp. | CES085Mi | כימות של Ang-(1-7) |
| ערכה לבדיקת חלבון BCA | Beyotime Biotechnology | P0012 | כימות חלבון |
| תאי BV-2 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0493; RRID: CVCL_0182 | שבט תאי מיקרוגליה של עכבר; מעברים 3–20 |
| עמודת C18 HPLC | Shimadzu Corporation | Shim-pack GIST C18; P/N 227-30017-08 | 250 × 4.6 mm, 5 µm; methanol–water (65:35, v/v), 1.0 mL/min, 35 °C |
| ריאגנט CCK-8 | Beyotime Biotechnology | C0038 | בדיקת חיוניות תאים |
| נוגדן c-Fos | Cell Signaling Technology | 2250; RRID: AB_2247211 | c-Fos (9F6) rabbit mAb; WB 1:1,000; IF 1:200 |
| נוגדן COX-2 | Cell Signaling Technology | 12282; RRID: AB_2571729 | COX-2 (D5H5) rabbit mAb; WB 1:1,000; IHC/IF 1:200 |
| גשושית DCFH-DA | Beyotime Biotechnology | S0033S | זיהוי ROS באמצעות ציטומטריה של זרימה |
| DMEM, גלוקוז גבוה | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11965092 | תווך גידול תאים |
| ערכת Evo M-MLV Reverse Transcription Premix | Accurate Biotechnology | AG11706 | סינתזת cDNA עבור qPCR |
| סרום עגל עוברי (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10099141 | תוסף לגידול תאים |
| ציטומטר של זרימה | BD Biosciences | BD Accuri C6 Plus | רכישת פלואורסצנציית ROS |
| מיקרוסקופ פלואורסצנציה | Olympus/Evident Scientific | IX73 | מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך לדמיון TUNEL ו-PVN |
| נוגדן GAPDH | Cell Signaling Technology | 5174; RRID: AB_10622025 | GAPDH (D16H11) rabbit mAb; WB 1:1,000–1:5,000 |
| סרום עיזים | Beyotime Biotechnology | C0265 | ריאגנט חסימה לאימונופלואורסצנציה |
| מערכת HPLC | Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan | Prominence LC-20A | בדיקת בקרת איכות ממוקדת לרוטין/קוורצטין |
| anti-mouse IgG המקושר ל-HRP | Cell Signaling Technology | 7076; RRID: AB_330924 | נוגדן שני לווסטרן בלוט; 1:3,000–1:5,000 |
| anti-rabbit IgG המקושר ל-HRP | Cell Signaling Technology | 7074; RRID: AB_2099233 | נוגדן שני לווסטרן בלוט; 1:3,000–1:5,000 |
| נוגדן Iba-1/AIF-1 | Cell Signaling Technology | 17198; RRID: AB_2820254 | Iba-1/AIF-1 (E4O4W) rabbit mAb; WB 1:1,000; IHC/IF 1:200 |
| ערכת ELISA ל-IL-6 | Beyotime Biotechnology | PY2782 | כימות IL-6 מעכבר |
| L-NAME | Beyotime Biotechnology | S0006 | מעכב NOS להיפליטנסה עקב חסר בחמצן ניטריקי |
| חולדות Wistar זכרים | Beijing HFK Bioscience Co., Ltd. | Wistar; SCXK (Jing) 2019-0008 | זכרים נקיים מפתוגנים ספציפיים, בני 6–8 שבועות, 180–220 g |
| נוגדן MasR | Alomone Labs | AAR-013; RRID: AB_2039972 | נוגדן נגד קולטן Mas; WB 1:200; IHC/IF 1:100 |
| תאי mHypoA-2/10 | Cedarlane Laboratories Ltd. | CLU176; RRID: CVCL_D384 | שבט תאי עצביים היפותלמיים של עכבר; מעברים 3–20 |
| קורא מיקרופלטה | Thermo Scientific | Multiskan FC; Cat. No. 51119000 | מדידות בליעה עבור CCK-8 ו-ELISA |
| MLN-4760 | Beyotime Biotechnology | SF1197 | מעכב ACE2; 10 µmol/L בניסויי תאים |
| ערכת ELISA ל-Mouse IL-1β | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific | 88-7013A-88 | כימות IL-1β מעכבר |
| ערכת ELISA ל-Mouse TNF-α | Beyotime Biotechnology | PT512 | כימות TNF-α מעכבר |
| נוגדן NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242; RRID: AB_10859369 | NF-κB p65 (D14E12) XP rabbit mAb; WB 1:1,000 |
| מערכת tail-cuff לא פולשנית | Visitech Systems | BP-2000-R-4 | מערכת חימום ואיסוף נתוני לחץ דם ב-tail-cuff של חולדה |
| ערכה לבדיקת Norepinephrine | Cloud-Clone Corp. | HEA907Ge | כימות Norepinephrine |
| נוגדן p-CREB | Cell Signaling Technology | 9198; RRID: AB_2561044 | Phospho-CREB (Ser133) (87G3) rabbit mAb; WB 1:1,000 |
| Penicillin–streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140122 | תוסף אנטיביוטי לגידול תאים |
| גלאי Photodiode-array | Shimadzu Corporation | SPD-M20A | גילוי HPLC UV–visible/PDA ב-360 nm |
| נוגדן p-NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 3031; RRID: AB_330559 | נוגדן Phospho-NF-κB p65 (Ser536); WB 1:1,000 |
| ממברנת PVDF | Beyotime Biotechnology | FFP77 | ממברנת ווסטרן בלוט בגודל 0.45 µm |
| סטנדרט קוורצטין | Beyotime Biotechnology | SM2147 | סטנדרט ייחוס לקוורצטין; 98% טוהר ב-HPLC |
| ערכת ELISA ל-Rat IL-1β | Elabscience Biotechnology Inc. | E-HSEL-R0002 | כימות IL-1β מחולדה |
| ערכת ELISA ל-Rat TNF-α | Elabscience Biotechnology Inc. | E-HSEL-R0001 | כימות TNF-α מחולדה |
| מערכת Real-time PCR | Bio-Rad Laboratories, Inc. | CFX96 Touch; Cat. No. 1855195 | הגברה של qPCR בזמן אמת וניתוח עקומת התכה |
| בופר ליזיס RIPA | Beyotime Biotechnology | P0013B | מיצוי חלבון |
| סטנדרט רוטין | Beyotime Biotechnology | SM2159 | סטנדרט ייחוס לרוטין; 98% טוהר ב-HPLC |
| חומר ייחוס Sophorae Flos | National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC), Beijing, China | 121270; Batch No. 121270-201403 | חומר ייחוס בוטני מאושר לאימות ניצני פרח של S. japonicum |
| ניצני פרחי Styphnolobium japonicum | Study botanical material | Not applicable | ניצני פרחים מיובשים שלא נפתחו, שאומתו מול חומר הייחוס Sophorae Flos של NIFDC |
| נוגדן Total CREB | Proteintech Group, Inc. | 12208-1-AP; RRID: AB_2245417 | נוגדן פוליקלונלי לארנב ל-Total CREB לצורך נורמליזציה של phospho-CREB |
| ריאגנט TRIzol | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific | 15596026 | בידוד RNA |
| ערכה לזיהוי אפופטוזיס TUNEL | Beyotime Biotechnology | C1086 | זיהוי אפופטוזיס עצבית |
| Valsartan | Sigma-Aldrich | SML0142 | אנטגוניסט לקולטן AT1; בקרת חיובית להורדת לחץ דם |
מקורות
- He X, et al. Local and traditional uses, phytochemistry, and pharmacology of Sophora japonica L.: a review. J Ethnopharmacol. 2016;187:160-182.
- Madden E, McLachlan C, Oketch-Rabah H, Calderon AI. United States Pharmacopeia comprehensive safety review of Styphnolobium japonicum flower and flower bud. Phytother Res. 2022;36(5):2061-2071.
- Shi W, et al. Bioactive flavonoids from Flos Sophorae. J Nat Med. 2017;71(3):513-22.
- Paniwnyk L, Beaufoy E, Lorimer JP, Mason TJ. The extraction of rutin from flower buds of Sophora japonica. Ultrason Sonochem. 2001;8(3):299-301.
- Xie Z, et al. Extraction and isolation of flavonoid glycosides from Flos Sophorae Immaturus using ultrasonic-assisted extraction followed by high-speed countercurrent chromatography. J Sep Sci. 2014;37(8):957-965.
- Wang G, et al. Efficient extraction of flavonoids from Flos Sophorae Immaturus by tailored and sustainable deep eutectic solvent as green extraction media. J Pharm Biomed Anal. 2019;170:285-294.
- Le NT, Nguyen TPD, Ho DV, Phung HT, Nguyen HT. A green method to extract rutin from Sophora japonica L. MethodsX. 2023;11:102479.
- Liu Y, et al. Sophora japonica flowers and their main phytochemical, rutin, regulate chemically induced murine colitis in association with targeting the NF-kappaB signaling pathway and gut microbiota. Food Chem. 2022;393:133395.
- Hao G, et al. Rutin inhibits neuroinflammation and provides neuroprotection in an experimental rat model of subarachnoid hemorrhage, possibly through suppressing the RAGE-NF-kappaB inflammatory signaling pathway. Neurochem Res. 2016;41(6):1496-1504.
- Dabeek WM, Marra MV. Dietary quercetin and kaempferol: bioavailability and potential cardiovascular-related bioactivity in humans. Nutrients. 2019;11(10):2288.
- Patel RV, et al. Therapeutic potential of quercetin as a cardiovascular agent. Eur J Med Chem. 2018;155:889-904.
- Han X, et al. Quercetin hinders microglial activation to alleviate neurotoxicity via the interplay between NLRP3 inflammasome and mitophagy. Redox Biol. 2021;44:102010.
- Le K, et al. Quercetin alleviates neonatal hypoxic-ischemic brain injury by inhibiting microglia-derived oxidative stress and TLR4-mediated inflammation. Inflamm Res. 2020;69(12):1201-1213.
- Mi Y, Wu Q, Yuan W, Chen F, Du D. Role of microglia M1/M2 polarisation in the paraventricular nucleus: new insight into the development of stress-induced hypertension in rats. Auton Neurosci. 2018;213:71-80.
- Wei B, et al. Microglia in the hypothalamic paraventricular nucleus sense hemodynamic disturbance and promote sympathetic excitation in hypertension. Immunity. 2024;57(9):2030-42.e8.
- Wang M, et al. Microglia-mediated neuroinflammation: a potential target for the treatment of cardiovascular diseases. J Inflamm Res. 2022;15:3083-3094.
- Xu P, Sriramula S, Lazartigues E. ACE2/ANG-(1-7)/Mas pathway in the brain: the axis of good. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011;300(4):R804-817.
- Bader M. ACE2, angiotensin-(1-7), and Mas: the other side of the coin. Pflugers Arch. 2013;465(1):79-85.
- Sriramula S, Cardinale JP, Lazartigues E, Francis J. ACE2 overexpression in the paraventricular nucleus attenuates angiotensin II-induced hypertension. Cardiovasc Res. 2011;92(3):401-408.
- Silva AQ, Santos RA, Fontes MA. Blockade of endogenous angiotensin-(1-7) in the hypothalamic paraventricular nucleus reduces renal sympathetic tone. Hypertension. 2005;46(2):341-348.
- Biancardi VC, Stranahan AM, Krause EG, de Kloet AD, Stern JE. Cross talk between AT1 receptors and Toll-like receptor 4 in microglia contributes to angiotensin II-derived ROS production in the hypothalamic paraventricular nucleus. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2016;310(3):H404-115.
- Sun XY, et al. Rutin prevents tau pathology and neuroinflammation in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Neuroinflammation. 2021;18(1):131.
- Shi P, et al. Brain microglial cytokines in neurogenic hypertension. Hypertension. 2010;56(2):297-303.
- Shen XZ, et al. Microglia participate in neurogenic regulation of hypertension. Hypertension. 2015;66(2):309-316.
- Simko F, et al. Effect of melatonin on the renin-angiotensin-aldosterone system in L-NAME-induced hypertension. Molecules. 2018;23(2):265.
- Selamoglu Talas Z. Propolis reduces oxidative stress in L-NAME-induced hypertension rats. Cell Biochem Funct. 2014;32(2):150-154.
- Moreira JD, et al. Inhibition of microglial activation in rats attenuates paraventricular nucleus inflammation in Gαi2 protein-dependent, salt-sensitive hypertension. Exp Physiol. 2019;104(12):1892-910.
- Wu Y, Sun R, Ren S, Zengin G, Li M. Neuronal reshaping of the tumor microenvironment in tumorigenesis and metastasis: bench to clinic. Medicine Advances. 2025;3(4):364-371.
- Xu J et al. Advancements in imaging technologies and AI integration for neurodegenerative disease management: a narrative review. Mol Imaging. 2025;24:15353508251393056.