מחקר זה מבצע אופטימיזציה של בדיקת הגברה איזותרמית מתווכת לולאה (LAMP) באמצעות פחם פעיל ובנטוניט לזיהוי מינים פתוגניים של Vibrio במאכלי ים. טיפול מקדימה זה מסיר ביעילות מעכבי תגובה, ומניב אבחון מהיר, רגיש וכלכלי יותר באופן משמעותי בהשוואה לשיטות קונבנציונליות.
מאמר מחקר
הגברת הרגישות באמצעות הגברה בלולאה (Loop-Amplification) תוך שימוש בפחם פעיל ובבנטוניט לזיהוי של Vibrio spp. במוצרי דגה
במאמר זה
סיכום
תקציר
בסוג Vibrio קיימים יותר מ-100 מינים, מתוכם 12 נחשבים פתוגניים לבני אדם; המינים המבודדים השכיחים ביותר במזון הם V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, ו-V. alginolyticus. הבעיה העיקרית בזיהוי מינים אלו באמצעות שיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונליות היא העלויות הגבוהות ומשך הזמן הממושך של האבחנה. amplification isothermal loop-mediated (LAMP) שימשה לזיהוי של V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, ו-V. alginolyticus. פחם פעיל עם בנטוניט (ACB) שימש להסרת מעכבים, דבר ששיפר את רגישות הבדיקה; נבחנו ערכי pH 6, 7 ו-9, וכן זמני מגע שונים בין הדגימה ל-ACB. רגישות שיטת ה-LAMP השתפרה כאשר נעשה שימוש בפחם פעיל ובבנטוניט להסרת מעכבי תגובה בדגימות של שרימפס, דגים וצדפות. רגישות ה-LAMP, הערך הניבוי השלילי, הערך הניבוי החיובי והסגוליות של ה-LAMP היו שווים או גבוהים מ-90% עבור כל הדגימות שנבדקו. שיטת ה-LAMP עשויה להוות חלופה לזיהוי V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, ו-V. alginolyticus במוצרי דגהיות, הודות ליישום מהיר יותר, רגישות גבוהה יותר ועלויות נמוכות יותר מהשיטה הסטנדרטית.
מבוא
מינים של הסוג Vibrio נפוצים בסביבות ימיות ועשויים להיות קשורים לדגים, רכיכות או סרטנים באופן שיכול להיות פתוגני או קומנסלי. דווח כי 12 מינים יכולים להיות פתוגניים לבני אדם, כאשר Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ו-V. alginolyticus מראים שכיחות בידוד גבוהה יותר במוצרי דגים. בארצות הברית, רשויות הבריאות מעריכות כי .Vibrio spp גורמים ליותר מ-80,000 זיהומים בשנה1,2,3,4,5. בידוד של .Vibrio spp משיגים באמצעות שיטות קונבנציונליות הכוללות העשרה ראשונית, גידול במצעים סלקטיביים ואישור באמצעות בדיקות ביוכימיות וסרולוגיות6,7. שיטות קונבנציונליות אלו מוגבלות בשל הזמן הממושך הנדרש לבידוד הפתוגן (עד 5 ימים) ובשל חוסר ביכולת ההבחנה שלהן, אשר לעיתים קרובות אינה מצליחה להבדיל במדויק בין מינים קרובים בתוך הסוג Vibrio בשל פרופילים פנוטיפיים וביוכימיים דומים6,7,8.
לחלופין, הגברה איזותרמית מתווכת לולאות (LAMP) דווחה כטכניקה מולקולרית מהירה, מדויקת וזולה לזיהוי פתוגנים9,10. שיטה זו יעילה מאוד מבחינה כלכלית ומהירה יותר מ-PCR קונבנציונלי, כיוון שאינה דורשת ציוד מורכב כגון תרמוסייקלרים9. שיטת ה-LAMP מאפשרת, בשלב אחד, גילוי של הגן המטרה על ידי תצפית בעכירות בתוך מבחנת התגובה שנגרמת מהשקעה של מגנזיום פירופוספט, היות שהוא תוצר תגובה יציב בטמפרטורה של 65 °C, הטמפרטורה המשמשת בטכניקת ה-LAMP, כך שהעלייה בעכירות נמצאת במתאם עם כמות ה-DNA שסונתזה, ובכך נמנע השימוש בג'לי אגרוז ובטרנס-אילומינטורים11,12,13,14,15.
ניתן לשפר את רגישות הגילוי של פתוגנים אלו על ידי סילוק מעכבי תגובה כגון פרוטאזות, יוני סידן, גליקוגן וליפידים, העלולים לעכב את ה- Bst polymerase או להיקשר למטרה ה-DNA, ובכך למנוע הגברה13,16,17,18,19,20. דווח כי שילוב של פחם פעיל עם בנטוניט (ACB) יעיל מאוד בסילוק מעכבי הגברה, ובכך מעלה את רגישות הגילוי של Escherichia coli בדגימות צדפות, תוך הפחתת עלויות מכיוון ש-ACB זול יותר משימוש בערכות מסחריות21.
בעבודה זו, אנו מציעים לייעל את שיטת ה-LAMP באמצעות שימוש בפחם פעיל ובבנטוניט כדי להגביר את הרגישות בזיהוי של V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus ו-V. alginolyticus ישירות ממוצרי דגה. שיטה מיועלת זו מספקת הנחיה מעשית לניטור שגרתי ובקרת איכות בתעשיית המזון, והיא ישימה מאוד לאבחון מהיר של פתוגנים, תוך הימנעות משלבי העשרה מוקדמים ממושכים. באשר לביצועיה הצפויים, השיטה מראה רגישות מצוינת (מעל 98%) וסגוליות (100%) במטריצות כגון דגים ושרימפס. עם זאת, מגבלה מרכזית שיש לקחת בחשבון היא שבמדגמים מזוהמים מאוד במקור, כגון צדפות, מערכת ה-ACB אינה יכולה לסלק לחלוטין את כל החומר האורגני המפריע, דבר העלול להוריד מעט את רגישות הבדיקה (94%–98%).
פרוטוקול
מחקר זה לא כלל נבדקים בני אדם או בעלי חוליות; לפיכך, לא נדרש אישור אתי מוסדי. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים ב- טבלת חומרים.
1. זני חיידקים ששימשו בניסוי ומיצוי DNA
זני Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037, ו-V. alginolyticus ATCC 17749 גודלו במצע BHI (brain heart infusion) עם 2% NaCl בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 h. זני Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, ו-Salmonella Typhimurium ATCC 14028 תורבדו במצע BHI ללא נתרן כלוריד בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 h כדי לשמש כביקורות שליליות בבדיקות. לצורך הפקת DNA, תרבית ללילה הוכנסה לצנטריפוגה במהירות של 16,000 x g למשך 6 min בטמפרטורה של 25 °C. הנוזל העליון נשפך בזהירות כדי למנוע הפרעה למשקע התאים, והמשקע הוחזר לתליה באופן יסודי על ידי פיפטינג ב-500 μL של תמיסת בופר TAE (Tris-acetic acid-EDTA, pH 8). התליה הורתחה למשך 6 min כדי לבצע ליזיס לתאים, ולאחר מכן קוללה מיד על קרח למשך 5 min. צנטריפוגה סופית בוצעה כדי להשקיע את השאריות התאיות, ובכך התקבל נוזל עליון צלול המכיל את ה-DNA המופק, אשר שימש לאחר מכן כתבנית להגברה בשיטת LAMP22,23.
2. פרוצדורת LAMP
הפריימרים ששימשו ב-LAMP (Table 1) נבחנו כדי לאשש את הספציפיות בזיהוי של V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, ו-V. alginolyticus. זיהוי של כל מין Vibrio באמצעות LAMP בוצע באנבוبي תגובה על ידי הכנת נפח סופי של 25 μL של תערובת המכילה: 1.6 μM מכל אחד מהפריימרים, 1.4 mM של תערובת dNTP, 6 mM MgSO4, 800 mM של betaine, 8 U של Bst DNA polymerase, ו-5 μL של template DNA. תערובת התגובה ערבבה בעדינות ודגרה במקלח מים ב-65 °C למשך 60 min. לאחר זמן הדגירה, תוצרי ההגברה הופרדו על ג'ל agarose בריכוז 1.5%. לאחר מכן, תוצרי ההגברה נצבעו באמצעות 1 μL של צבע DNA פלואורסצנטי המדולל ביחס של 1:100 ונחשפו באמצעות transilluminator של אור כחול. טכניקה נוספת לקביעה אם הבדיקה הייתה חיובית בזיהוי הפתוגן כללה הוספה של 4 μL של hydroxynaphthol blue (HNB, 125 μM) לאנבובי התגובה ותצפית על שינוי הצבע בעין בלתי מזוינת. בדיקה חיובית התאפיינה בהיווצרות צבע כחול, ובדיקה שלילית בצבע סגול24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, ו-Salmonella Typhimurium ATCC 14028 שימשו כביקורות שליליות לשיטת ה-LAMP. תוצרי ההגברה שהתקבלו ב-LAMP הופרדו על ג'ל agarose ונצפו באמצעות transilluminator. התמונות שהתקבלו נרכשו וסורקו דיגיטלית באמצעות תוכנת MS 1D Analysis Software.
3. טיפול בדגימות של צדפות, שרימפס ודגים לצורך סילוק של Vibrio spp. הנמצאים בדגימות באופן טבעי
נרכשו עשרה דגימות של צדפות, 10 דגימות של שרימפס ו-10 דגימות של דגים, במשקל מקורב של 200 g כל אחת. להסרה של תאי Vibrio המופיעים באופן טבעי, נעשה שימוש במתודולוגיה שפורסמה בעבר21. נשקלו חמישים גרם (50 g) מכל דגימה והם עברו הומוגניזציה מכנית בבלנדר עם פדלים (paddle blender) במהירות של 260 rpm למשך 1 min, דבר שיצר תרחיף רקמה אחיד, אשר אוחסן לאחר מכן בטמפרטורה של -70 °C למשך 72 h. לאחר מכן, הדגימות הופשרו לחלוטין באמצעות אמבט מים בטמפרטורה של 40 °C, והדגימות נשטפו עם 300 mL של תמיסת בופר פוספ senhorית מלוחה (0.85% NaCl, pH 9). כדי לוודא שהפרוצדורה הקודמת הצליחה לסלק את ה-Vibrio מהדגימות, בוצעה מתודולוגיית העשרה ראשונית (pre-enrichment) כפי שמופיע בפרק 9 של ה-Bacteriological Analytical Manual של ה-Food and Drug Administration7. התמיסה המלוחה שהכילה את הדגימה הוחלפה ב-450 mL של מי פפטון בסיסיים (APW, pH 9). לאחר מכן הוכנו בקפידה דילולים סדרתיים ב-APW עד לדילול של 10⁻3 והם הודגרו למשך 24 h. לבסוף, נלקחה מנה (aliquot) מכל מבחנה ונזרעה על מצע סלקטיבי של אגר thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS), והודגרה למשך 24 h בטמפרטורה של 37 °C כדי לאשר חזותית את היעדרו של מושבות Vibrio אופייניות. כל הבדיקות בוצעו בשחזור של שלוש פעמים.
4. הכנת פחם פעיל עם בנטוניט (ACB) והערכת התאוששות תאית
כדי לקבוע את התנאים שבהם ACB יעיל ביותר בספיחת מעכבים הנמצאים בדגימות של מוצרי דגה, תוך שמירה על ספיחה מינימלית של תאי המטרה, נעשה שימוש במתודולוגיה שפורסמה21 כדי לקבוע את ה-pH האופטימלי ואת זמן המגע בין ה-ACB לדגימות המזון. פחם פעיל נשטף ביסודיות במים מזוקקים וחויב בייבוש בטמפרטורה של 55 °C. לאחר מכן, 32.6 g של פחם פעיל ערבובו עם 3.04 g של בנטוניט, תוך ערבוב רציף במהירות של 150 rpm למשך 24 h כדי להבטיח פיזור אחיד, חויב בייבוש בטמפרטורה של 55 °C ועקר, מה שהוביל לקבלת אבקת ACB יבשה, הומוגנית ועדינה. כדי להעריך את השחזור התאי לאחר ערבוב תאי Vibrio עם תערובת הפחם הפעיל-בנטוניט (ACB), גודלו זנים בנפרד במצע BHI עם 2% NaCl עד להגעה לצפיפות תאים של 1.5 x 104 CFU/mL. לאחר מכן, 1 mL מכל זן Vibrio הוחדר בנפרד לתוך 100 mL של בופר פוספט (PBS, 0.85% NaCl, שהותאם ל-pH 4, 6 ו-9). התרחף הבקטריאלי שולב לאחר מכן עם 4.6 g של ACB שהוכן מראש והושאר בערבוב במהירות של 150 rpm למשך 15, 30 ו-60 min כדי לאפשר מגע. לאחר כל זמן מגע שהגדירו, הופרד בזהירות אליקווט של 0.1 mL, הוא נזרע בשיטת הפריסה על גבי אגר TCBS, והודגרה בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 h לפני ביצוע ספירת המושבות.
5. הערכת גבול הגילוי של V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, ו-V. alginolyticus בדגימות של צדפות, שרימפס ודגים שטופלו בפחם פעיל ובבנטוניט
כל אחד מה- Vibrio המינים ששימשו במחקר זה גודלו במצע BHI broth, וצפיפות התאים שלהם כווננה במדויק ל-1.5 x 104, 7.5 x 103, 3.8 x 103, 1.5 x 103, 7.5 x 102, 3 x 102, 1.5 x 102, ו-76 CFU/mL (A600 nm ~0.25) כפי שנמדד באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, 1 מ"ל מכל אחד Vibrio התרבית שימשה להדבקה של 50 גרם מכל דגימה (צדפות, דגים, שרימפס) שטופלו בעבר כדי להסיר כל Vibrio נוכחות. הדגימות המוחדרות עוברו להומוגניזציה בבלנדר עם פלתו (paddle blender) במהירות של 360 סטורים לדקה (rpm) למשך 30 שניות, ודוללו עם 450 מ"ל של APW (pH 6). לאחר מכן, התערובת הוכנסה לצנטריפוגה במהירות של 260 x ג למשך 5 דקות ב- 4 °C להפרדת שאריות גדולות. את הנוזל העליון שהתקבל העבירו לדריכה לבקבוקים המכילים 23 גרם של ACB, ערבבו במהירות של 150 סל"ד למשך 15 דקות לספיחת מעכבים, וסיננו באמצעות נייר סינון, כך שהתקבל תמיסת אלוציה צלולה נטולת חלקיקים גדולים. תמיסה זו הועברה לאחר מכן לצנטריפוגה במהירות של 16,000 x גמר במשך 10 דקות ב- 4 °C, מה שהוביל להיווצרות משקע תאים (cell pellet) גלוי בתחתית המבחנה, אשר שימש לאחר מכן להפקת DNA. כל Vibrio המין זוהה באמצעות שיטת LAMP. הבקרות השליליות כללו דגימות שמוחדרות עם זנים של Escherichia קולי (coli) ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, ו- Salmonella Typhimurium ATCC 14028. תערובת התגובה דגרה באמבט מים ב- 65 °C למשך 60 דקות. לאחר זמן האינקובציה, תוצרי ההגברה הופרדו בג'ל אגרוז בריכוז של 1.5% ונצבעו בצבע DNA פלואורסצנטי. הג'לים נחשפו במכשיר להארה אחורית באור כחול (blue light transilluminator). לבסוף, 4 μL של הידרוקסינפתול כחול (125 μMנוסף לכל מבחנה לצורך זיהוי בעין בלתי מזוינת24.
6. קביעת הערך הניבוי החיובי, הערך הניבוי השלילי, הסגוליות והרגישות של שיטת ה-LAMP
הרגישות, הסגוליות והערכים הניבויים של שיטת ה-LAMP נקבעו באמצעות 30 דגימות (10 של שרימפס, 10 של צדפות ו-10 של דגים). כל דגימה הוחדרה בריכוז המינימלי שניתן לזיהוי שנקבע עבור כל מין של Vibrio. כדי לקבוע את אחוזי הרגישות והסגוליות, וכן את ערך הניבוי השלילי (NPV) וערך הניבוי החיובי25, נעשה שימוש בטבלת התאמה לסיכום החיוביים האמיתיים (TP), השליליים האמיתיים (TN), החיוביים השגויים (FP) והשליליים השגויים (FN) שהתקבלו במהלך הניסויים. (טבלה 2). על בסיס נתונים אלו, יושמו הנוסחאות הבאות:
תוצאות
זני חיידקים ששימשו במחקר והפקת DNA
DNA הופק בהצלחה מכל הזנים הפתוגניים ומזני הביקורת השלילית כדי לשמש כתבניות עבור בדיקות ה-LAMP בהמשך הניסוי.
פרוטוקול LAMP
הפריימרים ששימשו בעבודה זו היו ספציפיים להגברה של המטרה המולקולרית בכל מין של Vibrio. תוצרי ההגברה שהתקבלו בשיטת LAMP כאשר נעשה שימוש בזני Vibrio הוכיחו כי כל פריימר היה ספציפי להגברת הגן מטרה של כל מין של Vibrio (איור 1).
טיפול בדגימות של צדפות, שרימפס ודגים לצורך ביטול Vibrio spp. הנמצאים באופן טבעי בדגימות
הטיפול לביטול Vibrio spp. הנמצאים באופן טבעי בדגימות היה יעיל, ואפשר הפחתה של 100% של Vibrio spp. לא נצפתה צמיחה של Vibrio spp. כאשר פעלנו לפי שיטת ה-BAM7.
הכנה של פחם פעיל עם בנטוניט (ACB) והערכה של השחזור התאי
סילוק מעכבי התגובה באמצעות פחם פעיל-בנטוניט אפשר העלאה של הרגישות בזיהוי הפתוגן בשיטת LAMP. הדבר נובע מהיכולת של הפחם הפעיל-בנטוניט לספוח חומרים מעכבים העשויים להשפיע על הפולימראזה במהלך הליך ההגברה, בנוסף לשימור מוגבל של תאי חיידקים (איור 2). אחוז השחזור של Vibrio בשימוש בערכי pH וזמני מגע שונים הראה שחזור תאי גבוה יותר (93.4% ± 2.9%) כאשר ה-pH היה 6 וזמן המגע היה 15 דקות. כאשר נעשה שימוש ב-pH 4, לא נרשמה צמיחה של Vibrio, וב-pH 7 ו-9 השחזור היה 33.4% ± 7.6% ו-67.2% ± 5.8%, בהתאמה. עבודה זו מציעה להשתמש ב-pH 6 כדי לשפר את רגישות הזיהוי של השיטה.
הערכה של גבול הגילוי של V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, ו-V. alginolyticus בדגימות של צדפות, שרימפס ודגים שטופלו בפחם פעיל ובבנטוניט
בדגימות צדפות, גבול הגילוי עבור V. cholerae היה 150 CFU/g, ועבור V. alginolyticus, V. vulnificus, ו-V. parahaemolyticus היה 3 x 102 CFU/g; בדגימות שרימפס ודגים, V. cholerae גולה בריכוז מינימלי של 150 CFU/g, בעוד שעבור V. alginolyticus, V. vulnificus, ו-V. parahaemolyticus גבול הגילוי היה 76 CFU/g. התוצאות שהתקבלו בשיטת ה-LAMP גילו כי השימוש ב-hydroxinaphthol blue בהשוואה לרגישות ה-LAMP הסיר מעכבי תגובה בדגימות שלא טופלו ב-ACB (איור 3). הבחנו כי רגישות ה-LAMP הייתה גבוהה יותר כאשר הדגימות טופלו ב-ACB.
קביעת ערך ניבוי חיובי, ערך ניבוי שלילי, סגוליות ורגישות של שיטת ה-LAMP
ביצועי האבחון של שיטת ההגברה איזותרמית מתווכת לולאה (LAMP) המותאמת, עם ובלי טיפול מקדים של פחם פעיל-בנטוניט (ACB), הוערכו באופן שיטתי ב-150 ניסויים כדי לבחון את חסונו של התהליך (טבלה 3). הסרת מעכבים טבעיים ממזון באמצעות מערכת ה-ACB שיפרה משמעותית את כל פרמטרי האבחון (רגישות, סגוליות, ערך ניבוי חיובי (PPV) וערך ניבוי שלילי (NPV)) לערכים השווים ל-90% או גבוהים ממנו בכל המטריצות, בהשוואה לדגימות שלא עברו טיפול.
בדגימות של דגים ושרימפס שטופלו ב-ACB, הבדיקה הראתה ביצועים אבחנאיים מקסימליים, עם רגישות, סגוליות, PPV ו-NPV של 100% (איור 4). לעומת זאת, בדגימות של דגים ושרימפס שלא טופלו, נוכחותם של מעכבים שמקורם במטריצה פגעה קשות בבדיקה, והפחיתה את רגישות הגילוי ל-62.5% ו-52.5%, בהתאמה. עבור מטריצת צדפות מורכבת מאוד, טיפול ה-ACB הצליח למתן הפרעות מרכזיות, והביא לרגישות כוללת גבוהה של 95.0% ו-NPV של 71.4% (איור 5). בניגוד לכך, דגימות צדפות שלא טופלו הראו ירידה קריטית ברגישות הגילוי ל-32.5% ו-NPV של 15.6% עקב נוכחות מאסיבית של תרכובות אורגניות כגון גליקוגן וליפידים המעכבים את הפולימראז.
הספציפיות האבחנתית של שיטת ה-LAMP נותרה ב-100% לאורך כל 150 הניסויים, ללא קשר לסוג המטריצה או לטיפול המקדים, כאשר לא נרשמו תוצאות חיוביות שגויות. ספציפיות מוחלטת זו מיוחסת לתכנון הסלקטיבי מאוד של סטי הפריימרים המכוונים לגנים ספציפיים למין (gyrB עבור V. alginolyticus, ompW עבור V. cholerae, tlh עבור V. parahaemolyticus, ו-vvhA עבור V. vulnificus). ממצאים סטטיסטיים אלו מוכיחים כי שיטת ה-ACB-LAMP המותאמת היא כלי אמין ועמיד ביותר לזיהוי מהיר, ללא צורך בתרבית, של מיני Vibrio פתוגניים במוצרי דגה מגוונים.
לבסוף, אנו סבורים כי שימוש בשיטת ה-LAMP בשילוב עם טיפול מקדים להסרת מעכבי תגובה יכול להגביר את רגישות הגילוי של פתוגנים במזון באמצעות שיטת ה-LAMP. לפיכך, טכניקה זו, המיושמת לחיפוש אחר V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus ו-V. vulnificus, צפויה להיות מועילה בניטור למניעת זיהומים הנגרמים על ידי מיקרואורגניזמים אלו.
זמינות נתונים:
כל הנתונים הגולמיים התומכים בממצאי מחקר זה, כולל ספירות המושבות החיידקיות המספריות (CFU/g) בערכי pH ובזמני מגע שונים, וכן תוצאות הביצועים האבחנתיים המלאות עבור כל 150 ניסויי התיקוף, זמינים לציבור במאגר Zenodo בכתובת https://doi.org/10.5281/zenodo.21799272. מערך הנתונים הנלווה מכיל את קובץ גיליון הנתונים המלא (קובץ נספח 1).
איור 1: ניתוח ספציפיות של תוצרי הגברה בשיטת LAMP על ג'ל אגרוז 1.5%. נתיב M, מרקר גודל מולקולרי 100 bp; נתיב 1, ביקורת שלילית (Escherichia coli ATCC 25922); נתיב 2, ביקורת שלילית (Listeria monocytogenes ATCC 49594); נתיב 3, V. alginolyticus ATCC 17749; נתיב 4, V. cholerae no O1 CECT 557; נתיב 5, V. parahaemolyticus ATCC 7802; נתיב 6, V. vulnificus ATCC 29037. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אחוז ההתאוששות של זני Vibrio תחת תנאי pH וזמני מגע שונים עם תערובת פחם פעיל-בנטוניט (ACB). התאוששות תאית (%) נקבעה לאחר ה接種ה של זני Vibrio בריכוז של 1.5 × 104 CFU/mL ב-PBS שהותאם ל-pH 4.0, 6.0, 7.0 ו-9.0, וטיפול עם 4.6 g של ACB למשך 15 min, 30 min ו-60 min. נקודת הנתונים ב-pH 6.0 ו-15 min של מגע מדגימה התאוששות תאית אופטימלית (93.4% ± 2.9%), מה שמעיד על כך שזמן מגע קצר מספיק כדי להשיב את תאי המטרה תוך שמירה על יעילות גבוהה של הסרת מעכבים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 3: גבול גילוי של תוצרי הגברה בשיטת LAMP בדגימות פירותי ים שהושלמו באופן מלאכותי. תוצאות הגברה ב (A) צדפות, (B) שרימפס, ו (C) דגימות דגים שהושלמו עם דילוליות סדרתיות של מיני Vibrio ועברו טיפול מקדים ב-ACB. נבובות: (1) בקרה שלילית; (2) V. alginolyticus; (3) V. parahaemolyticus; (4) V. vulnificus; (5) V. cholerae לא O1; ו-(6) V. mimicus (שימש כבקרת מטרה). פאנל עליון: גילוי קולורימטרי חזותי באמצעות 4 μL של Hydroxynaphthol Blue (HNB, 125 μM) תחת בדיקה בעין, כאשר תגובות חיוביות מופיעות בצבע כחול ותגובות שליליות נותרות בצבע סגול. פאנל תחתון: גילוי מבוסס פלואורסנציה באמצעות צבע Midori Green Advanced (MGA) שחזותי תחת מאיר אור כחול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פרמטרים השוואתיים של ביצועים דיאגנוסטיים של שיטת ה-LAMP עם ובלי הסרה של מעכבים. השוואה של רגישות כללית, סגוליות, ערך ניבוי חיובי (PPV) וערך ניבוי שלילי (NPV) בדגימות של דגים, שרימפס וצדפות שהושרה בערכים המינימליים שניתן לזיהוי (n = 10 ניסיונות לכל שילוב של מין/מטריצה, ובסך הכל 150 ניסיונות). העמודות משוות דגימות שעברו טיפול מקדים בתערובת אבנית-בנטוניט (ACB) אופטימלית מול ביקורות ללא טיפול (ללא הסרת מעכבים). רמות ההשראה נקבעו על 150 CFU/g עבור V. cholerae בכל המטריצות; 300 CFU/g עבור V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, ו-V. vulnificus בצדפות; ו-76 CFU/g בדגים ובשרימפס. טיפול מקדים ב-ACB השחזר בהצלחה את כל הפרמטרים הדיאגנוסטיים ל-≥90% בכל המטריצות. אנא לחצו כאן כדי להצות גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: רגישות וסגוליות ספציפיות למטרה של שיטת ה-ACB-LAMP האופטימלית במטריצות שונות של פירות ים. ביצועים אבחנתיים פרטניים עבור V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus, ו-V. vulnificus בדגימות דגים, שרימפס וצדפות (n = 10 בדיקות לכל שילוב של מטרה/מזון) שעברו טיפול מקדים ב-ACB. הסגוליות הגיעה ל-100% עבור כל המטרות הודות לתכנון פריימרים ספציפיים למינים המתבססים על הגנים gyrB, ompW, tlh, ו-vvhA. הרגישות הגיעה ל-100% במטריצות של דגים ושרימפס, כאשר נצפתה ירידה קלה ל-90% בצדפות בשל המורכבות הבסיסית הגבוהה של המטריצה האורגנית המפריעה לתגובה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: פריימרים ששימשו בבדיקות הגברה איזותרמית מתווכת לולאה (LAMP). תיאור של פריימרים פנימיים קדמיים ואחוריים (FIP, BIP), פריימרים חיצוניים (F3, B3), ופריימרים של לולאה (LF, LB) שתוכננו לטרגוט ספציפי למינים V. alginolyticus (gyrB), V. parahaemolyticus (tlh), V. vulnificus (vvhA), ו-V. cholerae (ompW). אנא לחצו כאן להורדת טבלה זו.
טבלה 2: טבלת התנייה להערכת פרמטרי ביצועים אבחנאיים של שיטת ה-LAMP. הגדרה סטנדרטית של מטריצה 2x2 המשמשת לסיווג וסיכום של תוצאות חיוביות אמיתיות (TP), תוצאות שליליות אמיתיות (TN), תוצאות חיוביות שגויות (FP) ותוצאות שליליות שגויות (FN) לצורך חישוב רגישות, סגוליות, ערך ניבוי חיובי (PPV) וערך ניבוי שלילי (NPV) בדגימות מאכלי ים מועשרות ובדגימות שאינן מועשרות. אנא לחצו כאן להורדת טבלה זו.
קובץ משלים 1: מערכי נתונים גולמיים התומכים בממצאי מחקר זה. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
מחקר זה קובע תנאים אופטימליים לשיפור הרגישות של הגברה איזותרמית מתווכת-לולאה (LAMP) לזיהוי של V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, ו-V. vulnificus בדגימות מזון ימי מזוהמות. על ידי עקיפת שלב ההעשרה המקדימה המסורתי, זמן האבחון מתקצר משמעותית, מה שמציע גישה יעילה ומהירה מאוד לזיהוי ישיר של פתוגנים מתוצרי דגה.
שיפור מתודולוגי מרכזי במחקר זה הוא האופטימיזציה של שלב הסרת המעכבים. מתודולוגיות קודמות השתמשו ב-pH של 4 לפני ההגברה21; עם זאת, הדבר הוביל לאפס התאוששות של זני Vibrio, בעיקר מכיוון שמיני Vibrio רגישים מאוד לסביבות חומציות26. כדי לטפל בכך, התנאים שונו באופן שיטתי כדי לשפר בו-זמנית את ההתאוששות התאית ולסלק מעכבי תגובה המופיעים באופן טבעי. השעייה מחדש של פחם פעיל עם בנטוניט (ACB) בתמיסת בופר ב-pH 6, ולאחריה ערבוב במשך 15 דקות עם הדגימה, התגלתה כתנאי האופטימלי. שינוי זה ממקסם את הדחייה האלקטרוסטטית בין החיידקים ל-ACB על ידי התקרבות לנקודה האיזואלקטרית של ממברנת החיידק21,27,28, ובכך מצמצם את אובדן תאי המטרה. כתוצאה מכך, שיפור מתודולוגי זה הניב רגישות גילוי הגבוהה פי 2–50 מזו של דגימות שעובדו ללא טיפול ב-ACB.
בניגוד לשיפורים מתודולוגיים אלה, יישום מוצלח של פרוטוקול זה עשוי לדרוש פתרון בעיות מפורש במקרה של הופעת בעיות נפוצות. בעיה שכיחה שנתקלים בה במהלך היישום היא הסרה חלקית של חומר אורגני, שעלולה להפריע לפולימראז ולהפחית את רגישות ה-LAMP, במיוחד במטריצות מזוהמות מאוד. אם ההגברה נכשלת או שהרגישות יורדת, פתרון הבעיות צריך להתחיל באימות ה-pH של תערובת ה-ACB והדגימה; סטיות מ-pH 6 עלולות להוביל למות תאים (אם התערובת חומצית מדי) או לספיגה לא מספקת של מעכבים. בנוסף, אם מופיעים תוצאות שגויים שליליים למרות טיפול נכון ב-ACB, על החוקרים לוודא שזמן המגע אינו עולה על 15 min, שכן חשיפה ממושכת עלולה להוביל לשימור בלתי מכוון של תאי המטרה על ידי המטריצה. עבור זיהוי בעין, ניתן לפתור שינויי צבע מעורפלים על ידי הבטחת הסרה מלאה של יוני סידן מהמטריצה, שעלולים אחרת להפריע לשקיעת מגנזיום פירופוספט בבדיקת ה-LAMP.
עבודה זו מדווחת, לראשונה, על זיהוי של Vibrio spp. בדגימות דגים באמצעות שיטת LAMP בשילוב עם קדם-טיפול ב-ACB. מחקר זה מקדם את התחום המדעי על ידי ביסוס שיטת זיהוי מהירה, אמינה וחסכונית למוצרי דגים13,19,23,29. בעוד ש-PCR קונבנציונלי מהווה גישה חלופית לבדיקת השערה זו, הספציפיות הגבוהה והערכים הניבויים שהתקבלו כאן מוכיחים כי בדיקת ACB-LAMP היא אפשרות עדיפה. יתרון מתודולוגי קריטי של טכניקה זו הוא אי-תלות בציוד מתוחכם ויקר, כגון תרמוסייקלרים, תאי אלקטרופורזה ומכשירי תאורה אחורית (transilluminators)9,30. יתרה מכך, הגילוי הוויזואלי של התוצאות באמצעות hydroxynaphthol blue מפשט משמעותית את פרשנות הנתונים.
על אף הרגישות והסגוליות הגבוהות שהושגו, נצפתה מגבלה בולטת של המחקר במטריצות עם זיהום בסיסי גבוה, כגון דגימות צדפות. במקרים אלו, מערכת ה-ACB אינה יכולה לסלק לחלוטין את כל החומר האורגני המפריע, דבר המפחית מעט את רגישות הבדיקה בהשוואה לדגימות דגים או שרימפס. לבסוף, היישומים הפוטנציאליים של שיטה זו מדגישים את תועלתה לניטור שגרתי בעוצמה גבוהה בתעשיית המזון למניעת זיהומים הקשורים ל-Vibrio. כיוונים עתידיים צריכים לתת עדיפות לאוטומציה של שלבי מיצוי ה-DNA והסרת המעכבים באמצעות ACB. אוטומציה של מאפיינים מתודולוגיים מרכזיים אלו היא יתרון מכריע שיפחית באופן משמעותי את זמן העבודה הישירה, ימזער טעויות אנוש ויסדיר משתני פתרון בעיות, ובכך יקל על היישום בקנה מידה רחב של טכניקה זו במעבדות בקרת איכות תעשייתיות.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגודי ברים.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פחם פעיל | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| בנטוניט | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| בטאין | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| טרנס-אילומינטור של מערכות Bio-Image | מערכות דימות ביולוגית | MBE-CP-01 | |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0374 | |
| צנטריפוגה (דגם J2-HS) | Beckman Coulter | <קישור ל-"https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri">https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| תערובת dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| הידרוקסינפתול כחול (Hydroxynaphthol blue) | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| תוכנה לניתוח MS 1D | מדעים מרכזיים | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| ספקטרופוטומטר (דגם 6300) | Jenway | 630531 | |
| מערכת סירקולטור לערבול דגימות (Stomacher Circulator), דגם 400 | סוורד | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae שאינו O1 | CT עם חומר ניגוד (CECT) | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| נייר Whatman | Whatman | 1001-055 |
מקורות
- Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
- Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
- CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
- Robert-Pillot A et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2014;189:75-81.
- Brands DA et al. Prevalence of Salmonella spp. in oysters in the United States. Appl Environ Microbiol. 2005;71(2):893-897.
- Gxalo O et al. Virulence and antibiotic resistance characteristics of Vibrio isolates from rustic environmental freshwaters. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:732001.
- De Paola A, Kaysner CA. Bacteriological Analytical Manual, Vibrio. Food and Drug ENTER
- Chahorm K, Prakitchaiwattana C. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods. Int J Food Microbiol. 2018;264:46-52.
- Anupama KP et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichment. Mol Biol Rep. 2021;48(1):1009-1016.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Sridapan T et al. Rapid detection of Clostridium perfringens in food by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow biosensor. PLoS One. 2021;16(1):e0245144.
- Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
- Yamazaki W, Ishibashi M, Kawahara R, Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008;8:163.
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229.
- Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(1):150-154.
- Yamazaki W et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species. Appl Environ Microbiol. 2010;76(3):820-828.
- Di H et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with enrichment culture for rapid detection of very low numbers of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples. Biol Pharm Bull. 2015;38(1):82-87.
- Cai SH et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish. Lett Appl Microbiol. 2010;50(5):480-485.
- Han F, Ge B. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis. 2008;5(3):311-320.
- Zhang L et al. Rapid, specific and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification targeted to vvhA gene. Hai Yang Xue Bao. 2018;37(4):83-88.
- Luan C, Levin RE. Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of PCR detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue. J Microbiol Methods. 2008;72(1):67-72.
- Ren C-H, Hu C-Q, Luo P, Wang Q-B. Sensitive and rapid identification of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Res. 2009;164(5):514–21.
- Srisuk C et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW: Detection of Vibrio cholerae by LAMP. Lett Appl Microbiol. 2010;50(1):36-42.
- Goto M et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009;46(3):167-172.
- Parikh R et al. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45-50.
- Yung CM et al. Insensitivity of diverse and temporally variable particle-associated microbial communities to bulk seawater environmental parameters. Appl Environ Microbiol. 2016;82(11):3431-3437.
- Abolmaaty A, Gu W, Witkowsky R, Levin RE. The use of activated charcoal for the removal of PCR inhibitors from oyster samples. J Microbiol Methods. 2007;68(2):349-352.
- Lee JL, Levin RE. Detection of 5 CFU/g of Escherichia coli O157:H7 on lettuce using activated charcoal and real-time PCR without enrichment. Food Microbiol. 2011;28(3):562-567.
- Tian CD et al. Study on detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of loop-mediated isothermal amplification method: V. Parahaemolyticus in shellfish. J Food Saf. 2011;31(3):371-378.
- Niessen L, Luo J, Denschlag C, Vogel RF. The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Microbiol. 2013;36(2):191-206.