מאמר שיטה

פלטפורמה מיקרופלואידית לבחינת תפקידי דחיסה מכנית באינטראקציות בין תאי גידול לתאי מערכת החיסון במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית

26 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/72929

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בפלטפורמה מיקרופלואידית למידול אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון בתוך סביבה תלת-ממדית (3D). התוצאות שלנו גילו שתאי Natural Killer (NK) שמרו על פעילותם נגד הגידול תחת דחיסה מכנית.

תקציר

כוחות מכניים משפיעים באופן משמעותי על יכולתם של תאי מערכת החיסון להרוג תאי גידול בהקשר של אימונותרפיה מבוססת תאים. כדי להרוג תאי גידול, תאי מערכת החיסון חייבים להפעיל כוחות על תא המטרה וליצור סינפסה חיסונית, שדרכה מועברים מולקולות ציטוטוקסיות — כולל granzyme B. למרות חשיבותם, האופן שבו ניתן לנצל רמזים מכניים כדי להגביר הרג המתווך על ידי מערכת החיסון נותר לא מובן דיו. פער ידע זה נובע בחלקו מהיעדר כלים המסוגלים לספק מאץ מכני מבוקר היטב לתרביות תאים בסביבה ריאליסטית מבחינה פיזיולוגית. כאן, אנו מתארים התקן דחיסה מיקרופלואידי שיכול להפעיל דחיסה סטטית או דינמית על ספרואידים של גידול המוטמעים במטריצה חוץ-תאית (ECM), תוך מתן אפשרות לדימוי בזמן אמת של אינטראקציות בין הגידול למערכת החיסון באמצעות מיקרוסקופיה אופטית.

הפלטפורמה המיקרופלואידית מורכבת מ-12 תאים (6 תאי בקרה ו-6 תאים פונקציונליים). כל תא מכיל תא תאים הממוקם ישירות מתחת ליחידת בקרת הלחץ. ספרואידים המוטמעים ב-ECM ממוקמים בתוך תא התאים. באמצעות פלטפורמה זו, חקרנו את יעילות ההריגה של תאי Natural Killer (NK) כנגד ספרואידים של גידול שדי (MCF-7) תחת דחיסה מכנית מוגדרת. התוצאות הראו כי תאי NK נותרו הגורמים המרכזיים למות הספרואידים של הגידול ללא קשר לדחיסה מכנית ב-1.5 mg/mL collagen. מכך עולה כי תאי NK יכולים לשמר את פעילותם האנטי-גידולית תחת עקה דחוסה. ממצאים אלו מדגימים את יעילותה של פלטפורמה זו לחקירת תפקידן של כוחות מכניים באינטראקציות בין גידול למערכת החיסון. מחקרים נמשכים מזהים כעת את המנגנונים המולקולריים המאפשרים לתאי חיסון להסתגל לעקה דחוסה. תובנות שיירכשו ממחקרים אלו עשויות לחשוף נתיב טיפולי מבטיח.

מבוא

אימונותרפיה לסרטן מבוססת תאים היא גישה טיפולית המשתמשת בתאי מערכת החיסון כדי להתמקד בתאי סרטן1. אסטרטגיה זו הוכיחה הצלחה ניכרת בטיפול בסרטני דם2,3,4. עם זאת, רמת ההצלחה שנצפתה בסרטני דם טרם תורגמה במלואה לטיפול בגידולים סולידיים5,6,7. סיבה מרכזית אחת למגבלה זו היא מיקרו-סביבת הגידול (TME) המדכאת את מערכת החיסון, המאפיינת גידולים סולידיים.

ה-TME מאופיין ברמזים מכניים מובחנים שיכולים להסדיר את ההתנהגות התאית. כדי שתהיה השמדה יעילה של תאי גידול על ידי תאי חיסון, על האחרונים להפעיל כוחות על תאי המטרה ולהקים סינפסה חיסונית שדרכה מועברים מולקולות ציטוטוקסיות8. לפיכך, הבנה של האופן שבו כוחות מכניים משפיעים על תפקוד תאי חיסון עשויה לחשוף אסטרטגיות טיפוליות חדשות לשיפור היעילות של אימונותרפיות מבוססות תאים נגד גידולים סולידיים.

מאפיין מכני מגדיר של TME מוצק הוא מאמץ הדחיסה שסביבת המיקרו של הגידול מפעילה על הגידול הצומח9,10. עד כה, מרבית מחקרי הדחיסה התמקדו בהשפעות על התנהגות תאי הגידול10,11. רק לאחרונה עברה תשומת הלב להבנת האופן שבו דחיסה משפיעה על תאי חיסון בתוך ה-TME12. כתוצאה מכך, המנגנונים שבאמצעותם מאמץ דחיסה משפיע על נדידת תאי Natural Killer (NK), עלה היווצרות הסינפסה החיסונית ועל פעילות הציטוטוקסיות נותרו לא מובנים דיו ולא כוונתו באופן מספיק. פער זה מהווה מגבלה קריטית בהבנתנו לגבי האופן שבו ניתן לנצל רמזים מכניים בתוך ה-TME כדי לשפר את התקיפה החיסונית של גידולים מוצקים.

מחסום מרכזי במתן מענה לשאלה זו הוא המחסור בפלטפורמות ניסיוניות המסוגלות להפעיל דחיסה מבוקרת וכמותית בתוך מיקרו-סביבות תלת-ממדיות רלוונטיות פיזיולוגית, תוך שהן מאפשרות בו-זמנית דימות בזמן אמת של אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון. גישות ניסיוניות מוקדמות לבחינת מאמץ דחיסה כללו הטמעה של ספרואידים בג'לי אגרוז13. בעוד ששיטה זו לכדה ביעילות את ההגבלה הפיזית, היא ביטלה אינטראקציות טבעיות בין תאים למטריצה החוץ-תאית (ECM). Dolega et al. השתמשו בלחץ אוסמוטי כדי להשרות מאמץ דחיסה; עם זאת, הספרואידים היו תלויים בתווך תרבית ולכן נותרו חסרי אינטראקציות עם ה-ECM9. Pandey et al. השתמשו במבנה transwell ובמשקולות כדי לדחוס ספרואידים המוטמעים בקולגן, מה ששמר על אינטראקציות בין ה-ECM לתאים אך הגביל את הדימות ברזולוציה גבוהה הדרוש לכימות ניידות של תאי חיסון ופעילות ציטוטוקסית14. יחד, מגבלות אלו מדגישות את הצורך בפלטפורמות ניסיוניות המאפשרות דימות בזמן אמת של התגובות המורפולוגיות של תאים לדחיסה בתוך ה-TME.

כאן אנו מציגים פרוטוקול למכשיר דחיסה מיקרופלואידי15 המאפשר הפעלה מבוקרת של מאמץ דחיסה תוך שימור אינטראקציות רלוונטיות פיזיולוגית בין תאים ל-ECM ותמיכה בדימות תאי חיים ברזולוציה גבוהה של דינמיקה בין תאי חיסון לגידול. הפרוטוקול מורכב מהכנת רכיבי המכשיר (סעיף 1), הרכבת המכשיר (סעיף 2) ודימות של אינטראקציות בין גידול לתאי חיסון (סעיף 3). אנו מדגימים את זרימת העבודה באמצעות בדיקת הרג של תאי NK כנגד ספרואידים של גידול המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). מעבר ליישום זה, ניתן להתאים בקלות את הפלטפורמה לחקר ההשפעות של כוחות מכניים על מגוון רחב של סוגי תאים ואינטראקציות תאיות בסביבות מיקרו 3D.

פרוטוקול

1. הכנת רכיבי המכשיר

  1. הפעלה של פני השטח של תא טעינת הדגימה
    1. הנח מסכה מעל תא טעינת הדגימות (שכבה 1, L1) כך שרק הבארות יהיו חשופות.
    2. חשוף את שכבה 1 הממוסכת לפלזמה של חמצן למשך 15 שניות תוך שימוש בהגדרת ההספק הגבוה (45 W).
    3. הניחו את שכבה 1 בצלחת פטרי, ולאחר מכן המשיכו בביצוע השלבים הבאים בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית.
    4. טפל בכל באר באמצעות 10 µL של 1% פוליאתילן-אימין (PEI) למשך 10 דקות.
    5. הסיר את ה-PEI מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום מארבעת הפינות של כל באר, כדי למנוע שריטות של משטח הזכוכית.
    6. שטפו את הבארים באמצעות 10 µL של תמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS), ולאחר מכן הסר את תמיסת השטיפה באמצעות שאיבה בוואקום מהצד.
    7. טפל בבארות באמצעות 10 µL ב-0.1% גלוטרלדהיד למשך 30 דקות, ולאחר מכן יש להסיר את הגלוטרלדהיד באמצעות שאיבה בוואקום מהפינות.
    8. שטפו את הבארות עם PBS שלוש פעמים, והסירו את נוזל השטיפה מהפינות לאחר כל שטיפה.
    9. עטפו בנייר רגיל (foil) את פטרית הפטרי המכילה את שכבה 1 והשאירו אותה בקבינה לבטיחות ביולוגית למשך הלילה.
  2. עיקור של מסגרת המתכת
    1. טבול את ה-38 מ"מ × מסגרת מתכת של 88 מ"מ ואת שנים-עשר ברגי ראש-צלחת M2.5 באתנול 70% למשך לילה.
  3. הכנה (Priming) של יחידת בקרת הלחץ
    1. חשפו את יחידת בקרת הלחץ לפלזמת חמצן למשך 30 שניות באמצעות הגדרת ההספק הגבוה (45 W).
    2. טבלו את יחידת בקרת הלחץ, כאשר המאפיינים פונים כלפי מטה, במים דה-יוניים (DI) למשך לילה כדי למלא את התעלים ואת התאים של יחידת בקרת הלחץ.
    3. למחרת, הוצא את יחידת בקרת הלחץ מתוך מי ה-DI שבה הייתה טבולה.
    4. מלאו מאגר מיקרופלואידי ב-50 מ"ל של מים מזוקקים (DI water).
      הערה: מאגר המיקרופלואידיות מורכב ממשפער קוני בנפח 50 מ"ל המצויד במכסה מותאם אישית הכולל שני חיבורי צינוריות: קו צינוריות פניאומטי וקו צינוריות להעברת נוזלים.
    5. חבר מזרק מלא באוויר לקו צינור הפניאומטיקה.
    6. לחץ באיטיות על בוכנת המזרק כדי להפעיל לחץ במאגר ולדחוף מים מזוקקים (DI water) דרך צינורת הולכת הנוזלים, עד שהצינורית תהיה מלאה ומים יחלו לטפטף מהקצה.
    7. חברו את צינורות הובלת הנוזלים הממולאים מראש ומטפטפים דרך הסעף (manifold) מפוליקרבונט ואז לכניסה בקוטר 1.5 מ"מ הנמצאת בגב יחידת בקרת הלחץ.
    8. הניחו ליחידת בקרת הלחץ ומכלול הצנרת להתייבש באוויר למשך שעתיים. לאחר ייבוש מלא, יחידת בקרת הלחץ ומכלול הצנרת מוכנים לשלב הבא.

2. הרכבת המכשיר

  1. הכנת קולגן עם תאים מוטמעים
    1. הוצא וייבש את מסגרת המתכת ואת הברגים מהאתנול 70%.
    2. בתוך קבינת בטיחות ביולוגית, הנח שלושה מיקרו-מבחנות של 600 µL על קרח. סמן את המבחנות כדלקמן: "N" (ניטרול), "sp" (ספרואידים של MCF-7), ו-"sp+NK" (ספרואידים של MCF-7 עם תאי NK).
    3. הכן את תערובת הניטרול על ידי הוספת 10× מהנפח הנדרש של Medium 199 (M199) ונתרן הידרוקסיד (NaOH) למבחנה "N".
    4. העבר את הנפח המתאים של תערובת ה-M199:NaOH למבחנות "sp" ו-"sp+NK" כדי להגיע לריכוז סופי של 1×.
    5. אסוף את ספרואידי הגידול וסובב בצנטריפוגה במהירות של 141 × g למשך 3 דקות כדי לאפשר לספרואידים לשקוע בתחתית המבחנה.
      הערה: ספרואידי גידול בקוטר של כ-200 µm הופקו באמצעות פלטפורמת מיקרו-בארים של אגרוז שתוארה בעבר16. בקצרה, 3 × 106 תאי MCF-7 נזרעו במערך מיקרו-בארים של אגרוז בגודל 36 × 36, המורכב מבארים בקוטר 200 µm ובעומק 200 µm, ולאחר מכן תורבדו למשך 7 ימים כדי להפיק את ספרואידי הגידול ששימשו בניסויים.
    6. הסר בזהירות את הנוזל העליון ותלה את הספרואידים ב-200 µL של מצע מלא 50:50 MCF-7/NK (טבלה 1 ו-טבלה 2).
    7. אסוף תאי NK למבחנה קונית של 50 mL, סובב בצנטריפוגה במהירות של 141 × g למשך 4 דקות, וספור את התאים.
      הערה: חיוניות תאי ה-NK צריכה להיות >85% ביום הניסוי.
    8. תלה את המשקע שהתקבל ב-200 µL של מצע NK מלא.
    9. הוסף את הנפח המתאים של תמיסת מלאי הקולגן לכל מבחנה של מיקרו-צנטריפוגה.
    10. הוסף את הנפח המתאים של תלי התאים לכל מבחנה כדי להגיע לנפח סופי של 200 µL המכיל 1.5 mg/mL קולגן.
      הערה: תלי ה-"sp" מכיל ספרואידים של גידול בלבד, בעוד שתלי ה-"sp+NK" מכיל ספרואידים של גידול ו-1.5 × 106 תאי NK.
    11. ערבב בעדינות באמצעות פיפטה כדי להבטיח פיזור אחיד של תאים וקולגן תוך מזעור היווצרות בועות.
  2. הרכבת המכשיר וטעינת תאים
    1. הנח את שכבה 1 בתוך מסגרת המתכת המיובשת.
    2. טען 9 µL מתערובת הקולגן לכל באר.
    3. יישר את יחידת בקרת הלחץ ואת מכלול הצנרת עם תאי התאים בשכבה 1 באמצעות מיקרוסקופ.
    4. הכנס את הברגים המיובשים דרך הצנרת ואל תוך מסגרת המתכת, תוך קיבוע יחידת בקרת הלחץ ושכבה 1 בין הצנרת למסגרת המתכת.
    5. הנח את המכשיר המורכב באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO₂ למשך 45 דקות כדי לאפשר פולימריזציה של הקולגן.
    6. הוסף מצע תרבית תאים מלא 50:50 MCF-7/NK דרך ארבעת פתחי המצע.

3. דימוי של אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון

  1. הנח את המכשיר המורכב בתוך אינקובטור השולחן המותקן על מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה הפוך לצורך דימות תאים חיים.
    הערה: מדגרה הבמה שמרה על טמפרטורה של 37 °C ולחות של כ-50% לאורך משך הדמיה.
  2. הנח קופסת מעטפת משנית מעל המכשיר המורכב כדי לשמור על הסביבה הפנימית ב- 37 °C, 100% לחות, ו-5% CO2₂ לאורך תקופת הדימות.
  3. חבר את המכשיר לבקר הלחץ באמצעות צינור פנאומטי.
  4. יש לרכוש תמונות בשדה בהיר (brightfield) וב-GFP של הספרואידים הגידוליים לפני הפעלת הדחיסה, על מנת לאפשר הערכה של דפורמציית הספרואידים לאחר הדחיסה.
  5. יש להחיל לחץ קבוע של 120 mbar לאורך כל תקופת ההדמיה.
    הערה: תוכנת בקר הלחץ מאפשרת למשתמש להגדיר את פרופיל הלחץ ואת עוצמתו המופעלים במהלך הניסוי. איור משלים 1 מכיל סכימה של מערכת בקרת הלחץ.
  6. התחילו את הדמיית ה-time-lapse על ידי רכישת תמונות בשדה בהיר (brightfield) ותמונות GFP מדי 10 דקות למשך 18 שעות.
    הערה: התמונות נרכשו במישור Z המרכזי של כל ספרואיד גידולי באמצעות 20× עדשה אובייקטיבית במיקרוסקופ פלואורסצנציית-אפי (epi-fluorescence) הפוך. תמונות בשדה בהיר (Brightfield) ובפלואורסצנציית GFP צולמו בזמני חשיפה של 200.1 מילי-שניות ו-298.9 מילי-שניות, בהתאמה.

תוצאות

עבור הניסויים הבאים, נעשה שימוש במכשיר דחיסה מיקרופלואידי15 כדי לדמות אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון בתוך מיקרו-סביבה תלת-ממדית רלוונטית פיזיולוגית, ובמקביל, להפעיל דחיסות סטטיות ודינמיות על ספרואידים של גידולים (איור 1).  רכיבי המכשיר (איור 1A1) וסדר ההרכבה שלהם (איור 1A2) מוצגים ב-איור 1A. מסגרת המתכת משמשת כבסיס של המכשיר, כאשר שכבת תא תאיים (L1) ממוקמת בתוך המסגרת. יחידת בקרת הלחץ, המורכבת מ-L2 ו-L3 המחוברים באמצעות bonding של פלזמה, ממוקמת מעל L1, ולאחריה המניפולד (איור 1A2). יחד, L1 ויחידת בקרת הלחץ מהווים את המכשיר המיקרופלואידי התפקודי והם דחוסים בין מסגרת המתכת למניפולד באמצעות ברגים. המניפולד מכיל פתחי כניסה לצינורות נוזלים לאספקת לחץ למכשיר, וכן מאגרי מדיה המאפשרים ניסויי דימוי תאים חיים לטווח ארוך.

רכיבים וסכימה של התקן מיקרופלואידי; דחיסת תא תאים; תוצאות ניסוי בתאי GFP.
איור 1: התקן דחיסה מיקרופלואידי למחקר אינטראקציות בין תאי מערכת החיסון לספרואידים של גידול תחת דחיסה מכנית. (A1) תצלום של הרכיבים הנדרשים להרכבת ההתקן, מוצגים משמאל לימין: סומן (manifold), יחידת בקרת לחץ (L2 + L3), שכבת תא תאים (L1), ומסגרת מתכת. (A2) סכמה תלת-ממדית של רכיבי ההתקן, מוצגים מלמעלה למטה: סומן, יחידת בקרת לחץ (L2 + L3), שכבת תא תאים (L1), ומסגרת מתכת. שכבות ה-PDMS ‏L2 ו-L3 מחוברות באמצעות פלזמה כדי ליצור את יחידת בקרת הלחץ, הממוקמת מעל תא התאים. הסומן ומסגרת המתכת מקבעים את ההתקן המורכב. (B1) סכימה של חתך רוחב של יחידת דחיסה לפני ואחרי דחיסה. ספרואידים של גידול ו-NK cells המוטמעים ב-ECM ממוקמים בתא התאים. המרחק הראשוני בין החלק התחתון של L1 לחלק התחתון של L2 לפני דחיסה מסומן כ-h. עם הפעלת לחץ על יחידת בקרת הלחץ, L2 נדחף כלפי מטה, מה שגורם לבוכנת ה-PDMS לדחוס את ספרואיד הגידול. ההעתקה כלפי מטה של L2 בעקבות הדחיסה מסומנת כ-Δh. (B2) תמונות מיזוג של שדה בהיר ו-GFP של ספרואיד גידול MCF-7 עם NK cells לפני (שמאל) ואחרי (ימין) דחיסה. תאי MCF-7 מסומנים ב-GFP, בעוד ש-NK cells אינם מסומנים. NK cells מייצגים מסומנים בעיגול כחול, בעוד שקווי מתאר צהובים מסמנים את היקפי ספרואידי הגידול. סרגל קנה מידה = 50 µm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר ההרכבה, ניתן להשתמש במכשיר הדחיסה המיקרופלואידי לדחיסת ספרואידים של גידולים, כפי שמוצג ב-איור 1B. בשלב זה, ספרואידים של גידולים המוטמעים בקולגן עם תאי NK מוכנסים לתא התאים (L1). עם הפעלת לחץ על תא הלחץ (L3), שכבת הממברנה הגמישה (L2) נדחפת כלפי מטה, מה שגורם לבוכנת ה-Polydimethylsiloxane (PDMS) להעביר כוחות דחיסה לספרואיד. תא הלחץ נשלט על ידי מקור לחץ חיצוני. פרטים נוספים בנוגע לתכנון, לייצור ולאפיון של מכשיר הדחיסה המיקרופלואידי פורסמו בעבר במחקר אחר15.

אנו מגדירים את המרחק בין תחתית תא התא (L1) לבין תחתית הממברנה הגמישה (L2) כ-h (איור 1B1, פאנל שמאלי). לפני הדחיסה, מרחק זה הוא 200 µm. עם הפעלת לחץ נוזלים ביחידת בקרת הלחץ, הממברנה הגמישה נדחפת כלפי מטה, מה שמקטין את המרחק h ב- Δh (Δh; איור 1B1, פאנל ימני) ובכך דוחס את הספרואיד הגידולי המוטמע בקולגן. במערכת זו, מאמץ דחיסה מוגדר כ-Δh/h, כאשר h הוא המרחק הראשוני בין L1 ל-L2 לפני הדחיסה, ו-Δh הוא ההעתקה כלפי מטה של L2 לאחר הדחיסה. העתקת הממברנה כוילבה בעבר באמצעות ויזואליזציה של חרוזי פלואורסצנציה הדבוקים לתחתית של L2. תיאור מפורט של הליך הכיול וחישובי מאמץ הדחיסה ניתן למצוא במחקר קודם17. דוגמה לעקומת כיול מוצגת ב- איור משלים 2.

איור 1B2 מציג תמונה מייצגת ממוזגת של שדה בהיר (brightfield) ו-GFP של ספרואיד MCF-7 עם תאי NK המוטמעים ב-1.5 mg/mL קולגן לפני (פאנל שמאלי) ואחרי דחיסה (פאנל ימני). גבולות ספרואיד הגידול סומנו בצהוב. בעקבות הדחיסה, הספרואיד הראה עלייה בשטח המוקרן, דבר המעיד על דפורמציה בתגובה להפעלת עומס מכני מוצלחת. עבור כל הניסויים המוצגים במאמר זה, השתמשנו במאמץ דחיסה של Δh/h = 50%. נציין שקוטר הספרואיד נע בין 140 µm ל-200 µm. משמעות הדבר היא שמאמץ הדחיסה בפועל על הספרואיד קטן מעט מ-50%. סרטון משלים 1 ו-סרטון משלים 2 מציגים z-stacks מייצגים במישור X-Y שנרכשו בערוץ הפלואורסצנציה של GFP של ספרואיד MCF-7 המוטמע ב-1.5 mg/mL קולגן לפני ואחרי הפעלת מאמץ דחיסה של 50%, בהתאמה.

התקן הדחיסה המיקרופלואידי שימש לבחינת ההשפעות של תאי NK, דחיסה, והשילוב ביניהם על מוות של ספרואידים של גידול (איור 2). הדבר מתאפשר הודות לתכנון ההתקן, הכולל 12 בארות תרבית. מתוך בארות אלו, שש יכולות להיות נתונות לדחיסה, בעוד שש הבארות הנותרות משמשות כביקורות ללא דחיסה. תצורה זו מאפשרת ארבעה תנאים ניסיוניים (איור 2A): ספרואידים לבדם ללא דחיסה (sp), ספרואידים עם תאי NK ללא דחיסה (+NK), ספרואידים הנתונים לדחיסה (+comp), וספרואידים החשופים הן לדחיסה והן לתאי NK (+comp+NK).

מיקרוסקופיה של GFP בשיטת Time-lapse; גרף, תרשים פיזור עם ניתוח נתוני GFP מנורמלים.
איור 2: דחיסה מכנית מווסתת את ההריגה של ספרואידים גידוליים המתווכת על ידי תאי NK. (A) תמונות פלואורסצנציה בשיטת Time-lapse של ספרואידים של MCF-7 המוטמעים ב-1.5 mg/mL קולגן תחת ארבעה תנאים: ביקורת של ספרואידים בלבד (sp), ספרואידים עם תאי NK (+NK), ספרואידים עם דחיסה (+comp), וספרואידים עם דחיסה ותאי NK (+comp+NK). פלואורסצנציית GFP מסמנת תאי גידול MCF-7 חיוניים. המסגרת הצהובה מציינת את אזור העניין (ROI), שהוגדר באמצעות התמונה בנקודת זמן של 18 שעות והוחל על כל נקודות הזמן לצורך כימות הפלואורסצנציה. עוצמת פלואורסצנציית ה-GFP הכוללת בתוך ה-ROI נמדדה ושימשה לניתוח המשכי. סרגל קנה מידה = 50 µm. (B) עוצמת פלואורסצנציית GFP כוללת של ספרואיד אחד לאורך זמן תחת 4 תנאים. כל קו צבעוני מייצג את עוצמת הפלואורסצנציה הכוללת של ספרואיד בודד, מנורמלת לעוצמתו הראשונית ב-t = 0. הקו השחור הוא התאמה פולינומיאלית מסדר שני של נתוני עוצמת הפלואורסצנציה שנאספו מ-7 ספרואידים שגודלו תחת תנאי הביקורת, ושימש כרפרנס לחישוב אובדן תאי הגידול ב-(C). (C) אובדן GFP מנורמל עבור התנאים +comp, +NK, ו-+comp+NK חושב על ידי חיסור עוצמת ה-GFP ב-t = 18 h של כל ספרואיד מקו הרפרנס של ספרואידים בלבד (sp). לפיכך, כל נקודת נתונים מייצגת את אובדן ה-GFP המנורמל של ספרואיד בודד. פסי השגיאה מייצגים SEM. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתן להדגים את ההשפעות של תאי NK, דחיסה והשילוב ביניהם על ספרואידים של גידול בתמונות המייצגות של ספרואידים מסוג MCF-7 ב-1.5 mg/mL קולגן (איור 2A). מכיוון שתאי ה-MCF-7 ששימשו ליצירת ספרואידי הגידול סומנו ב-GFP, ניתן היה לנטר את חיוניות הגידול באמצעות שינויים בפלואורסצנציית ה-GFP. תמונות GFP ובתאורה רגילה (brightfield) נרכשו מדי 10 min למשך 18 h באמצעות מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה הפוך. ראוי לציין כי ספרואידים שהוכפפו לדחיסה הראו שטח השלכה גדול יותר מאשר ספרואידים שלא נדחסו, מה שמאשר העברה מוצלחת של עומס מכני מהממברנה הגמישה לספרואיד הגידול. עם הזמן, נצפתה אובדן הדרגתי של פלואורסצנציית GFP בתנאי ה-+NK וה-+comp+NK (איור 2A), מה שמעיד על הרג של תאי הגידול המתווך על ידי תאי NK.

אנו משתמשים באובדן פלואורסצנציית GFP כמדד למות תאי גידול. תאי MCF-7 המסומנים ב-GFP ששימשו במחקר זה הופקו באמצעות טרנסדוקציה לנטיוירילית. בקצרה, נעשה שימוש בווקטור לנטיוירילי כדי להחדיר קסטת ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) המונעת על ידי מקדם elongation factor-1α (EF1α), יחד עם גן עמידות לפומיצין המונע על ידי מקדם Rous sarcoma virus (RSV). לאחר ההדבקה, קסטות הביטוי הלנטיויריליות השתלבו ב-DNA הגנומי של תאי MCF-7, מה שהוביל לביטוי יציב של GFP. לאחר מכן נעשה שימוש בברירה באמצעות פומיצין כדי להסיר תאים שלא עברו טרנסדוקציה. סימון ה-GFP של תאי MCF-7 אפשר לכמת את חיות תאי הגידול על ידי ניטור שינויים בעוצמת פלואורסצנציית ה-GFP לאורך זמן (איור 2B). קשר חזק בין אובדן פלואורסצנציית GFP לבין סמנים מבוססים למות תאים, כולל סמן חי/מת propidium iodide (PI) והסמן לאפופטוזיס annexin-V, הוכח בעבר18, ובכך תוקף אובדן פלואורסצנציית GFP כמדד חלופי למות תאי גידול.

כדי לכמת את ההשפעות של ארבעת התנאים הניסיוניים על חיוניות הגידול, נמדדה עצימות פלואורסצנציית ה-GFP הכוללת של כל ספרואיד גידולי בכל נקודת זמן, הופחתו ממנה ערכי הרקע, והיא נורמלה לערכה הראשוני (איור 2B). פלואורסצנציית הספרואיד הכוללת חושבה בתוך אזור עניין (ROI) שהוגדר מראש. ROI זה התקבל על ידי סימון ידני של גבול הספרואיד הגידולי בתמונה מ-18 שעות (קו מתאר צהוב בלוח של 18 שעות, איור 2A) באמצעות סקריפט MATLAB פנימי. עצימות הפלואורסצנציה הכוללת בתוך ROI זה חושבה לאחר מכן עבור כל נקודת זמן ותוקנה על ידי הפחתת פלואורסצנציית הרקע הממוצעת שנמדדה מ-ROI נפרד שנבחר במקום אחר בתמונה. ערכי הפלואורסצנציה המתוקננים לרקע התקבלו לאחר מכן ונורמלו לעצימות הפלואורסצנציה הראשונית של הספרואיד.

כל עקומה צבעונית מייצגת עוצמת GFP מנורמלת של ספרואיד בודד תחת תנאי ניסוי ספציפי באיור 2B. העקומה התקבלה באמצעות התאמה פולינומיאלית מסדר שני לנתונים הניסויים. העקומות הסגולות מייצגות ספרואידים שהוכפפו לדחיסה בלבד (+comp, איור 2B), העקומות האדומות מייצגות ספרואידים עם תאי NK (+NK, איור 2B), והעקומות הכחולות מייצגות ספרואידים שנחשפו הן לדחיסה והן לתאי NK (+comp+NK, איור 2B). לעומת זאת, העקומה השחורה היא ההתאמה הפולינומיאלית מסדר שני לנתונים של שבעה ספרואידים שגודלו בתנאי של ספרואידים בלבד ששימשו כביקורת (sp, איור 2B). באיור 2B, לצורך בהירות, מוצגים רק הנתונים המותאמים פולינומיאלית, אך לא נקודות הנתונים הניסויים. ראוי לציין כי עוצמת פלואורסצנציית ה-GFP בתנאי של ספרואידים בלבד (sp) וספרואידים + דחיסה (+comp) הראתה מגמה כללית של עלייה לאורך זמן (איור 2B), דבר העולה בקנה אחד עם צמיחה מתמשכת של הגידול או שמירה על חיוניות. לעומת זאת, תנאי ה-+NK וה-+comp+NK הראו ירידה הדרגתית בעוצמת פלואורסצנציית ה-GFP (איור 2B), המעידה על מוות של תאי הגידול.

את אובדן תאי הגידול המצטבר כימתו על ידי חיסור עוצמת פלואורסצנציית ה-GFP הנורמלית והמותאמת של כל ספרואיד תחת תנאי נתון (+comp, +NK, או +comp+NK) מתנאי הביקורת ב-18 h (איור 2C). כתוצאה מכך, כל נקודת נתונים מייצגת את אובדן ה-GFP הנורמלי של ספרואיד בודד ביחס לביקורת של ספרואידים בלבד (איור 2C). בהתאם לכך, תנאי ה-+comp משקף אובדן GFP הנובע מדחיסה בלבד (סגול, איור 2C), תנאי ה-+NK משקף אובדן GFP הנובע מתאי NK בלבד (אדום, איור 2C), ותנאי ה-+comp+NK משקף אובדן GFP הנובע מההשפעות המשולבות של דחיסה ותאי NK (כחול, איור 2C). תנאי ה-+comp הפגין את מידת אובדן ה-GFP הנמוכה ביותר (איור 2C), מה שמרמז כי לדחיסה לבדה הייתה השפעה מינימלית על חיוניות הספרואידים. לעומת זאת, הן תנאי ה-+NK והן תנאי ה-+comp+NK הראו אובדן GFP גבוה משמעותית מאשר תנאי ה-+comp (איור 2C), מה שמעיד על כך שתאי NK הם הגורמים העיקריים למות תאי הגידול. למרות שתנאי ה-+comp+NK הפגין אובדן GFP ממוצע גבוה יותר מאשר תנאי ה-+NK, הבדל זה לא הגיע למשמעות סטטיסטית (איור 2C). ממצאים אלה מרמזים כי דחיסה אינה פוגעת בהריגה של תאי גידול המתווכת על ידי תאי NK. יחד, ממצאים אלו מדגימים כי ניתן להשתמש בהצלחה במכשיר הדחיסה המיקרופלואידי כדי לכמת את ההשפעות העצמאיות והמשולבות של דחיסה ותאי NK על חיוניות ספרואידים של גידול בתוך סביבת 3D רלוונטית פיזיולוגית.

לעומת זאת, תוצאות תת-אופטימליות עלולות להיווצר כאשר (1) הספרואידים נמצאים מחוץ לגבול הבוכנה, (2) הספרואידים ממוקמים קרוב מדי לגבול הבוכנה, ו-(3) מספר ספרואידים נמצאים במרחק של פחות מקוטר ספרואיד אחד זה מזה (איור 3). במקרים אלו, יש להוציא את השדות המתאימים מהניתוח.

אפקט דחיסת תאים; BF, פלואורסצנציית GFP; לפני ואחרי; תוצאות מיקרוסקופיה של צילום רציף (time-lapse) במשך 18 שעות.
איור 3: דוגמה מייצגת לרצף תמונות של ספרואידים שהוצאו מהניתוח. מוצגות תמונות צילום רציף (time-lapse) בשדה בהיר (BF), פלואורסצנציית GFP ותמונות ממוזגות של ספרואידים מסוג MCF-7 עם תאי NK ב-1.5 mg/mL קולגן לפני (עמודה שמאלית) ואחרי דחיסה (שתי העמודות הימניות). תמונות טרום-דחיסה נרכשו 20 min לפני הפעלת הלחץ ו-10 min לפני תחילת צילום ה-time-lapse. לאחר מכן, תמונות נאספו כל 10 min במשך 18 h, כאשר 0 h מתייחס לתמונה הראשונה שנרכשה מיד לאחר הדחיסה ו-18 h מייצג את סיום הניסוי. החץ הכחול מצביע על קצה בוכנת ה-PDMS (L2). שדה צילום זה הוצא מהניתוח מכיוון ששני ספרואידים היו נוכחים באזור הדחיסה ומקומם היה קרוב מדי לגבול הבוכנה. כתוצאה מכך, לא ניתן היה לכמת באופן מהימן את דפורמציית הספרואידים ואת עוצמת פלואורסצנציית ה-GFP במהלך הדחיסה. Scale bar = 50 µm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

(1) ספרואידים הממוקמים מחוץ לגבול הבוכנה אינם חווים דחיסה מכיוון שהלחץ מופעל רק באזור הבוכנה. לכן, יש להוציא ספרואידים אלו הן מתנאי הדחיסה והן מקבוצת הביקורת. (2) יש להוציא ספרואידים הממוקמים על גבול הבוכנה או בקרבתו (איור 3, הספרואיד העליון), שכן ספרואיד זה חווה עומס מכני לא אחיד. (3) יש להוציא ספרואידים הנמצאים במרחק של קוטר ספרואיד אחד מספרואידים שכנים (איור 3). קרבה רבה בין ספרואידים מקשה על כימות עוצמת הפלואורסצנציה של GFP, מכיוון שמרחב העניין (ROI) מוגדר באמצעות נקודת הזמן הסופית. עם הזמן, גבולות הספרואידים עלולים להפוך לבלתי ניתנים להבחנה, מה שמקשה על הגדרת ROI המקיף באופן מדויק ספרואיד בודד בלבד. ניתן לצמצם בעיות אלו על ידי הבטחה כי הספרואידים ממוקמים במרכז אזור הדחיסה במהלך טעינת המכשיר. תשומת לב קפדנית להתפלגות הספרואידים, למיקומם ולסידור המכשיר חיונית להשגת דחיסה אחידה ולהפקת תוצאות ניסיוניות אמינות וניתנות לשחזור.

רכיביםריכוז
מצע α-MEM
סרום עגל עוברי (FBS)10%
פניצילין/סטרפטומייצין1%

טבלה 1: מצע מלא עבור MCF-7.

מרכיביםריכוז
מצע $\alpha$-MEM
מיו-אינוזיטול0.2 mM
2-מרקפטואתנול0.1 mM
סרום עגל עובר (FBS)12.50%
חומצה פולית0.02 mM
סרום סוס (HS)12.50%
פניצילין/סטרפטומייצין1%

טבלה 2: מצע גידול מלא עבור NK.

איור משלים 1: תרשים של מערכת בקרת הלחץ. מדחס אוויר מספק אוויר דחוס (עד 20 psi) לבקר הלחץ. בקר הלחץ מווסת את לחץ האוויר המועבר למכל הלחץ בהתבסס על הגדרות המשתמש. לבקר לחץ עבודה מקסימלי של 200 mbar, יציבות לחץ של 0.005% מסך הסקאלה (FS), רזולוציית לחץ של 0.003% FS, וזמן תגובה של 9 ms, המאפשרים בקרת לחץ מדויקת וניתנת לשחזור. הבקר מחובר למחשב באמצעות universal serial bus (USB), מה שמאפשר למשתמש לתכנת את עוצמתו ואת פרופיל הלחץ המופעל באמצעות התוכנה הנלווית. התוכנה תומכת במספרי גלי דחיסה מרובים, כולל דחיסה קבועה, סינוסואידלית, משולשת ומחזורית. בתרשים זה, הלחץ מוגדר ל-120 mbar, ואוויר דחוס בלחץ זה מועבר למכל המלוחץ דרך צינור פנאומטי. המכל המלוחץ מכיל 50 mL של מים דה-יוניים (DI) ומשמש להמרת לחץ פנאומטי ללחץ הידראולי. לאחר הלחצתו, המכל דוחף נוזל דרך צינורות הולכת נוזלים ליחידת בקרת הלחץ של התקן הדחיסה המיקרופלואידי (ראו איור 1 לפרטים על ההתקן), שם משמש הלחץ ההידראולי להפעלת דחיסה על הספרואיד הגידולי. שים לב כי נעשה שימוש בלחץ נוזלים כדי למנוע בועות אוויר בתוך התקן ה-PDMS. אנא לחץ כאן להורדת הקובץ.

איור משלים 2: עקומת כיול עבור התקן הדחיסה המיקרופלואידי המראה את הקשר בין תזוזת הבוכנה (, µm) לבין הלחץ המופעל על תא בקרת הלחץ (KPa). מדידות ניסיוניות מיוצגות על ידי נקודות, בעוד שהקו הרציף תואם לסימולציית COMSOL. פסי השגיאה מציינים את השגיאה התקנית של הממוצע (SEM) משמונה מדידות ניסיוניות בלתי תלויות, אך הם קטנים מכדי שיהיו נראים. איור זה הועתק מ-Suh et al.15 באישור מה-Royal Society of Chemistry. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

סרטון משלים 1: מערך z-stack במישורי X-Y של ספרואיד MCF-7 המסומן ב-GFP לפני דחיסה. הספרואיד הוטמע ב-1.5 mg/mL קולגן בתוך התקן דחיסה מיקרופלואידי ותמונתו צולמה בערוץ פלואורסצנציית GFP עם גודל צעד z של 1 µm. לאחר מכן, נעשה שימוש ב-ImageJ לשיפור הניגודיות. סרגל קנה מידה = 50 µm. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

סרטון משלים 2: לאחר מכן הופעל מאמץ דחיסה של 50% (Δh/h = 50%) על ספרואיד של תאי MCF-7 המסומנים ב-GFP והמוטמעים ב-1.5 mg/mL קולגן. לאחר הדחיסה, נרכש z-stack במישור X–Y בערוץ פלואורסצנציית GFP באמצעות גודל צעד של 1 µm, והנתונים עובדו ב-ImageJ לשיפור הניגודיות. סרגל קנה מידה = 50 µm. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

דיון

שיטה זו מתארת את השימוש במכשיר דחיסה מיקרופלואידי לבחינת ההשפעות של מאמץ דחיסה על אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון. מערכת זו מסוגלת להפעיל דחיסה מכנית מבוקרת על ספרואידים של גידול המוטמעים בתוך מטריצת קולגן תלת-ממדית. תשתית הזכוכית המהווה את בסיס תא התאים (L1) מאפשרת דימות תאים חיים ברזולוציה גבוהה, מה שהופך את הפלטפורמה למתאימה מאוד למחקרים השואפים לכמת ניידות של תאי חיסון, חדירה ופעילות ציטוטוקסית. באופן חשוב, המערכת משמרת אינטראקציות בין תא לתא ובין תא למטריצה תוך שהיא מאפשרת בקרה מדויקת על הסביבה המכנית. לעומת זאת, גישות ניסיוניות רבות קיימות לבחינת מאמץ דחיסה דורשות פשרה בין אינטראקציות תאיות המתווכות על ידי ה-ECM9,13 לבין דימות ברזולוציה גבוהה14.

במחקר הנוכחי, נעשה שימוש בתאי NK ובספרואידים של גידולי שד מסוג MCF-7 כמערכת מודל. עם זאת, התקן לדחיסה מיקרופלואידית אינו מוגבל לסוגי תאים אלה. נכון להיום, הפלטפורמה יושמה בהצלחה על מודלים מרובים של תאי שד, כולל ספרואידים של גידולי שד מסוג MDA-MB-231 וספרואידים של שד מסוג MCF-10A15,17. ניתן להתאים את הפלטפורמה בקלות לבדיקת אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון במגוון מודלים של גידולים אחרים, כולל ספרואידים של גידולי מוח וריאה. בדומה לכך, הפלטפורמה תואמת למגוון רחב של אוכלוסיות תאי חיסון מעבר לתאי NK, מה שמאפשר חקירה של אינטראקציות מגוונות בין גידול למערכת החיסון תחת דחיסה מכנית. יתרה מכך, ההתקן אינו מוגבל למחקרים המבוססים על ספרואידים וניתן להתאימו לניסויים של תא בודד. יחד, מאפיינים אלו הופכים את הפלטפורמה לכלי רב-שימושי לבחינת האופן שבו כוחות מכניים מווסתים התנהגות תאית במגוון רחב של הקשרים ביולוגיים והמחלות.

יתרון נוסף של מערכת זו הוא השליטה המדויקת בעוצמה ובדפוס הדחיסה המופעלים על הדגימות. במחקר הנוכחי, הופעל מאמץ דחיסה סטטי של 50% למשך כל הניסוי. עם זאת, ניתן לשנות בקלות את רמת המאמץ בהתאם למטרת הניסוי. בנוסף, ניתן להפעיל דחיסה דינמית בצורות גל שונות, כולל גלי ריבוע וגלים סינוסואידליים, על הספרואידים באמצעות מערכת בקרת הלחץ החיצונית. דחיסה בגלי ריבוע כוללת פרקי זמן חלופים של דחיסה ושחרור17, בעוד שדחיסה סינוסואידלית כוללת עליות וירידות הדרגתיות בדחיסה לאורך זמן15. יכולות אלו, בשילוב עם דימיון כמותי ומודלים ניבויים, יכולות לשמש לבדיקת ההשפעה של דחיסה דינמית על יעילות ההריגה החיסונית.

ציינו כי מכשיר דחיסה זה פותח במקור כדי לאפיין תכונות מכניות של גידולים17על ידי שילוב של in situ חיישן כוח, שכבת ג'ל פוליאקרילאמיד (PAA) מתחת לספרואיד הגידול, ניתן לאפיין באופן כמותי את התכונות המכניות של הספרואיד, כגון קשיחות וצמיגות אלסטית15,17שינוי זה מרחיב את יעילות הפלטפורמה מעבר למידול מאמץ דחיסה, כך שהיא כוללת מדידה ישירה של ההתנהגות המכנית של הגידול.

באופן כללי, למכשיר הדחיסה המיקרופלואידי מגוון רחב של יישומים, החל ממדידת תכונות מכניות של ספרואידים ועד לחקירת אינטראקציות בין גידול למערכת החיסון בתוך סביבה בעלת ויסות מכני. עם זאת, ישנם מספר שלבים קריטיים הנדרשים להפעלה מוצלחת של המכשיר. יש למקם את הספרואידים של הגידול קרוב למרכז של כל באר כדי להבטיח דחיסה אחידה. יחידת בקרת הלחץ חייבת להיות מיושרת כראוי עם שכבת תא המבנה (L1) כדי להבטיח העברה מדויקת של הלחץ. בועות אוויר עלולות להיווצר כאשר יחידת בקרת הלחץ מונחת על L1, דבר שעלול להשפיע לרעה על איכות הדימיוג ועל תוצאות הניסוי. כדי למנוע בעיה זו, יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מהחדרת בועות בעת טעינת תערובת הקולגן, ויש להוסיף 8 µL של תערובת קולגן לכל באר כדי למלא מעט יותר את התא לפני הנחת יחידת בקרת הלחץ. פעולה זו מסייעת להבטיח מגע מלא בין השכבות ומפחיתה את הסבירות לכליאת אוויר.

לסיכום, התקן זה מאפשר מידול מבוקר של מאמץ דחיסה בתוך מטריצת קולגן תלת-ממדית בעלת רלוונטיות פיזיולוגית, התומכת באינטראקציות בין תאי גידול לתאי מערכת החיסון. פלטפורמה זו מספקת כלי לחקירת האופן שבו כוחות מכניים סטטיים ודינמיים מווסתים הרג ממסייע למערכת החיסון והתנהגות גידולים בתוך הסביבה המיקרוסקופית של הגידול. כעת, אנו מזהים את המנגנון המולקולרי העומד בבסיס המודולציה המכנית של הרג תאי גידול על ידי מערכת החיסון. מחקרים אלו עשויים להוביל למטרות תרופתיות טיפוליות חדשות.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לסרטן (Grant R01CA221346), מלגת Lance R. Collins מהמכללה להנדסה באוניברסיטת קורנל עבור FM, וקרן ה-Provost של קורנל לחוסן מחקרי עבור FM. עבודה זו בוצעה בחלקה במתקן ה-NanoScale של קורנל, חבר בתשתית הריכוז הלאומית לננוטכנולוגיה (NNCI), הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעים (Grant NNCI-2025233).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 N NaOHSigma-Aldrich797247 µL
10× מדיום M199Sigma-AldrichM0650200 µL
2-מרקפטואתנולThermoFisher313500100
מדחס אווירElveflowמדחס Jun-Air מדגם 3
במה של מיקרוסקופ X-Y אוטומטיתמכשור מדעי יישומיMS-2000
מצלמת CCDHamamatsu PhotonicsORCA-R2
סרום עגל עוברי (FBS)GeminiBioS11150
צינור להגשת נוזליםEleveflowגליל רזרבי של צינור PTFE1/16 אינץ' בקוטר חיצוני
מקור אור פלואורסצנטיExcelitas Technologies יחידת PC מסדרת X-Cite 120
חומצה פוליתסיגמאF7876
גלוטראלדהידמדעי ה-EM 160190.10%
מנקה פלזמה של HarrickHarrick PlasmaPDC-001-HPהגדרת הספק גבוה (45W)
סרום סוס (HS)ThermoFisher16050-122
מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי הפוךOlympusIX81עדשת אובייקטיב 20x (NA = 0.25), המופעלת באמצעות תוכנת Olympus CellSens
מסיכהArtusגיליון דק של אלומיניום במידה 10העובי הוא 0.0125" (0.75 ממ')
קו תאים יציב של MCF-7/GFP (Puromycin)GenTarget IncSC050-G
מסגרת מתכתהכנה בהתאמה אישית הכנה בהתאמה אישית 
מאגר מיקרופלואידיEleveflowמאגר מיקרופלואידי בנפח 50 מ"ל 
מיקרוסקופ OlympusCKX41עדשת אובייקטיב 4x              (NA = 0.1)
מיו-אינוזיטולסיגמאI7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
פניצילין/סטרפטומייציןGibco 15140122
סריש פוספטי מאוזן (PBS) ThermoFisher 10010072
צינור פניאומטיEleveflowכניסת צינור פוליאתר PUR שקוף4" קוטר חיצוני ב-מ"מ
פוליאתילן-אימין (PEI)Sigma-AldrichP31431%
בקר לחץElveflowOB1 NK4מופעל באמצעות תוכנת Elveflow Smart Interface
קולגן מסוג I מזנב חולדה Corning35424931.3 µL מתוך תמיסת מקור של קולגן בריכוז 9.6 mg/mL
ברגיםפיליפסבורג ראש שטוח M2.512 ברגים
דגרה לשולחן המיקרוסקופפלסטיק מדויקמיוצר לפי הזמנה
מזרקBecton Dickinson303134מוצמד למסגרת נעילה אינטגרלית של Luer זכר ל-3/32" OD Barb מבית Eleveflow
αמדיום MEM-ThermoFisher12561056

מקורות

  1. Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.
  2. Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.
  3. Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.
  4. Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.
  5. Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.
  6. Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.
  7. Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.
  8. Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.
  9. Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.
  10. Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.
  11. Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.
  12. Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.
  13. Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.
  14. Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.
  15. Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.
  16. Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.
  17. Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.
  18. Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Immunology and InfectionMicrofluidicsMechanobiologyCancer ImmunologyNatural Killer cellsImmune cellsCompression
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.