הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה מונחית-רשת של $\beta$-sitosterol במודלים של תאי מזנגיום דלקתיים ופרו-פיברוטיים הרלוונטיים לגלומרולוניפריטיס כרונית

107 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73000

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  , 
1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה משלב פרמקולוגיה של רשתות, עגינה מולקולרית (molecular docking) מאושרת וניסויי in vitro כדי להעריך קשרי מועמד בין מרכיבים של Cordyceps sinensis לתהליכים הקשורים לגלומרולונפריטיס כרונית. β-Sitosterol נבחר לאימות ברמת התרכובת ונמצא כי הוא מפחית הפעלה דלקתית ופרו-פיברוטית במודלים של תאי מזנגיום.

תקציר

גלומרולונפריטיס כרוני (CGN) מאופיין בפגיעה דלקתית מתמשכת ובמידול פיברוטי פרוגרסיבי, אך מערכות היחסים בין תרכובות למטרות העומדות בבסיס התערבויות המבוססות על מוצרים טבעיים נותרו לא מוגדרות במלואן. מחקר זה שילב פרמקולוגיית רשת, עיגון מולקולרי (molecular docking) מאומת וניסויי in vitro כדי להעריך רכיבים מועמדים של Cordyceps sinensis (C. sinensis) בתהליכים פתולוגיים הקשורים ל-CGN. רכיבים מועמדים של C. sinensis סרקו, ומטרות הקשורות לתרכובות שהופקו ממאגר המידע ופלטפורמת הניתוח של Systems Pharmacology של הרפואה הסינית המסורתית הוחלפו עם גנים הקשורים ל-CGN. ניתוחי העשרה פונקציונלית ואינטראקציית חלבון-חלבון שימשו לתיעדוף תהליכים ביולוגיים ומטרות מפתח (hub targets). PTGS2 זוהה כמטרת חפיפה מרכזית. עיגון מולקולרי בוצע באמצעות מבנה של COX-2 קשור ל-celecoxib. עיגון מחדש של ליגנד ה-celecoxib שקו-גובש שחזר את התנוחה הקריסטלוגרפית עם RMSD של 0.876 Å, מה שביסס את פרוטוקול העיגון. β-Sitosterol ו-linoleyl acetate הראו תאימות חזויה עם אזור העיגון של COX-2, עם זיקות קישור של −7.2 ו-−7.5 kcal/mol, בהתאמה. β-Sitosterol נבחר לאישוש ברמת התרכובת בתאי מזנגיום גלומרולריים של חולדה מסוג HBZY-1. בריכוזים של 0.5–10 µM, β-sitosterol לא הפחית באופן ניכר את חיוניות התאים. בתאים שעברו גרייה של ליפופוליסכריד (LPS), β-sitosterol הפחית את הביטוי של Tnf, Il6, ו-Ptgs2, הפחית את ייצור הפרוסטגלנדין E2 (PGE2), והפחית את שכיחות חלבון הציקלואקסיגנאז-2 (COX-2). בתאים שטופלו בגורם גדילה טרנספורמטיבי β1 (TGF-β1), β-sitosterol הפחית את הביטוי של Col1a1 ו-Acta2 והפחית את שכיחות חלבון ה-alpha-smooth muscle actin (α-SMA). ממצאים אלו מספקים ראיות להגדרת היפותזה לפיה β-sitosterol מווסת הפעלה דלקתית ופרו-פיברוטית במודלים של תאי מזנגיום, אך הם אינם מבססים עיכוב אנזימטי ישיר של COX-2 או יעילות טיפולית ב-CGN.

מבוא

גלומרולונפריטיס כרוני (CGN) כולל קבוצה הטרוגנית של הפרעות גלומרולריות שעלולות להתפתח למחלה כלית כרונית ולשלב סופי של מחלה כלית1. המחלה מאופיינת בפגיעה גלומרולרית מתמשכת, הפעלה דלקתית וremodeling פיברוטי פרוגרסיבי2,3. למרות שקורטיקוסטרואידים וחומרים אימונוסופרסיביים משמשים בחלק מהמטופלים, שליטה ארוכת טווח במחלה נותרת קשה במקרים רבים, ותופעות לוואי הקשורות לטיפול הן נפוצות1,4,5. ההתקדמות של CGN כוללת תהליכים פתולוגיים המשפיעים זה על זה, כולל הפעלה חיסונית, תפקוד לקוי של האנדותל, סטרס חמצוני והצטברות של המטריקס החוץ-תאי3,6,7. לכן, זיהוי מוקדים מולקולריים המחברים בין תגובות דלקתיות ופרו-פיברוטיות עשוי לסייע ביצירת היפותזות הניתנות לבדיקה עבור אסטרטגיות התערבות הרלוונטיות למחלה.

Cordyceps sinensis (C. sinensis) שימש בהקשרים קליניים וניסיוניים הקשורים לכליות, ודווח כי הוא מפעיל השפעות אנטי-דלקתיות, אנטי-אפופטוטיות וציטופרוטקטיביות במספר מודלים של מחלה8,9,10. עם זאת, הבסיס המולקולרי שדרכו רכיביו המועמדים עשויים לקיים אינטראקציה עם מטרות רלוונטיות לדלקת גלומרולרית (glomerulonephritis) נותר ללא הגדרה מספקית11. בהינתן טבעם הרב-מרכיבי של C. sinensis וההטרוגניות המכניסטית של CGN, פרמקולוגיית רשת מספקת מסגרת שימושית לתיעדוף של קשרים מועמדים בין תרכובת-מטרה-מסלול12,13.

במחקר זה, סריקת תרכובות, איתור מטרות, ניתוח חפיפה בין מחלות לגנים, העשרה פונקציונלית, ניתוח רשת אינטראקציות בין חלבונים, דקינג מולקולרי ו- in vitro שולבו בדיקות תיקוף כדי לבחון קשרים מולקולריים פוטנציאליים בין מרכיבים מועמדים של *C. sinensis* ותהליכים פתולוגיים הרלוונטיים ל-CGN. פרוסטגלנדין-אנדופרוקסיד סינתאז 2 (PTGS2תועדף כמטרה מרכזית (hub target) מתוך רשת התרכובות-מחלות, ונבדק באמצעות סימולציית עגינה מולקולרית (molecular docking) תוך שימוש במבנה של ציקלו-אקסיגנאז-2 (COX-2) קשור לסלקוקסיב (celecoxib), עם תיקוף באמצעות עגינה חוזרת (redocking). בהתבסס על תוצאות הרשת, ניתוח העגינה וראיות קודמות לפעילות אנטי-דלקתית ואנטי-פיברוטית, β-sitosterol נבחר כתרכובת מועמדת מייצגת לצורך תיקוף (validation) בהמשך הדרך14,15,16תאי מזנגיום שעקברו גירוי באמצעות ליפופוליסכריד (LPS) שימשו להערכת שפעול דלקתי והתגובה הקשורה ל-COX-2/פרוסטגלאנדין E2 (PGE2), בעוד שגורם גדילה טרנספורמיבי β1 (TGF-βנכלל מודל המושרה על ידי 1) כדי להעריך את ביטוי סממנים פרו-פיברוטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניתוחי הפארמקולוגיה של הרשת והביואינפורמטיקה התבססו על מאגרי נתונים הזמינים לציבור ולא כללו משתתפים אנושיים או בעלי חיים. ניסויי ה-in vitro בוצעו באמצעות קו תאים מבוסס ולא דרשו אישור אתי בהתאם לדרישות המוסדיות.

סריקת מרכיבים פוטנציאליים ואחזור מטרות

מרכיבים מועמדים והמטרות התואמות להם נשבו מתוך מאגר המידע ופלטפורמת הניתוח של פרמקולוגיית מערכות ברפואה סינית מסורתית (TCMSP) באמצעות מונח החיפוש “dongchongxiacao” ב-13 ביולי 2025. תרכובים עם זמינות ביולוגית פומית חזויה של לפחות 30% ודמיון לתרופה (drug-likeness) של לפחות 0.18 נשמרו. שבעה מרכיבים מועמדים עמדו בשני קריטריוני הסינון. המשקל המולקולרי, הזמינות הביולוגית הפומית, הדמיון לתרופה ומתארי פרמקוקינטיקה זמינים אחרים נרשמו מ-TCMSP לצורך השוואה תיאורית.

המידע על קשרי תרכובת-מטרה הקשור לרכיבים שנשמרו הורד ישירות מ-TCMSP. כניסות כפולות של מטרות הוסרו ידנית בעת בניית סט המטרות הבלתי חופף, בעוד שקשרי התרכובת-מטרה המקוריים נשמרו לצורך בניית הרשת בהמשך. מכיוון ש-TCMSP סיפק שמות מטרות בצורתם המלאה ולא כסמלי גנים סטנדרטיים, כל מטרה נחפשה במאגר UniProt (נגישה ב-14 ביולי 2025). נבחרה הכניסה האנושית המתאימה, ושם המטרה הומר לסמל הגן הרשמי שלה. מערך הנתונים הסטנדרטי של תרכובת-מטרה שימש להצלבת מחלה-מטרה ולניתוח רשת תרכובת-מטרה.

איסוף גנים הקשורים לדלקת גלומרולרית וחפיפת מטרות

גנים הקשורים למחלה נשאפו מ-GeneCards, DisGeNET, PharmGKB וממאגר ה-Therapeutic Target Database באמצעות מונח החיפוש “glomerulonephritis” בתאריך 14 ביולי 2025. עבור GeneCards, נשמרו רשומות עם ציוני רלוונטיות הגבוהים מהציון החציוני של 10. רשומות מתאימות מהמאגרים האחרים נכללו בהתאם להערות המחלה-מטרה (disease-target annotations) המאושרות שלהם. שמות הגנים הותקנו לסמלי גנים רשמיים של בני אדם, ורשומות כפולות הוסרו. הליך זה הניב 1,134 גנים ייחודיים הקשורים לגלומרולוניפריטיס. מכיוון שהחיפוש השתמש במונח הרחב “glomerulonephritis”, מערך הנתונים שהתקבל נחשב לרלוונטי לתהליכים מולקולריים הקשורים לגלומרולוניפריטיס כרונית, ולא ספציפי לסוג היסטופתולוגי בודד.

מטרות הקשורות לתרכובות שהופקו מ-TCMSP הוחלפו עם קבוצת הגנים הקשורה למחלה באמצעות R. זוהו עשרים ושלוש מטרות חופפות. דיאגרמות ון הופקו באמצעות חבילת ה-R בשם venn, ורשת המטרות החופפות של התרכובות נבנתה והוצגה באופן חזותי באמצעות Cytoscape. הקשרים בין מרכיבי המועמדות למטרות החופפות מסוכמים ב- טבלה 1.

ניתוחי העשרה תפקודית ואינטראקציות בין חלבונים

ניתוחי העשרה של Gene Ontology (GO) ושל Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) בוצעו ב-R באמצעות clusterProfiler ו-org.Hs.eg.db. מונחי Gene Ontology נותחו בקטגוריות של תהליך ביולוגי, רכיב תאי ותפקוד מולקולרי. ערכי P הותאמו עבור בדיקות מרובות בשיטת Benjamini-Hochberg, ומונחים או מסלולים עם ערכי P מתוקננים הנמוכים מ-0.05 נשמרו. מונחים ומסלולים מועשירים הוצגו באמצעות תרשימי עמודות ותרשימי נקודות שנוצרו באופן עצמאי.

23 המטרות החופפות הוגשו ל-STRING, כאשר נבחר Homo sapiens כארגון ונקבע ציון אינטראקציה מינימלי הגבוה מ-0.4. רשת האינטראקציה בין חלבונים שהתקבלה יובאה ל-Cytoscape. טופולוגיית הרשת הוערכה באמצעות CytoNCA על בסיס דרגה (degree), מרכזיות בינתיות (betweenness), מרכזיות קרבה (closeness), מרכזיות וקטור עצמי (eigenvector centrality), קישוריות ממוצעת מקומית ומרכזיות הרשת. מטרות צומת (Hub targets) הוגדרו כצמתים שערכיהם של הדרגה, מרכזיות הבינתיות, מרכזיות הקרבה, מרכזיות וקטור העצמי, הקישוריות הממוצעת המקומית ומרכזיות הרשת היו כולם גבוהים מערכי החציונים המתאימים של הרשת. ניתוח זה תיעדן תשע מטרות צומת לצורך פרשנות המשך.

עגינה מולקולרית ותיקוף באמצעות עגינה חוזרת (redocking)

ביצוע עגינה מולקולרית (Molecular docking) בוצע באמצעות מבנה של cyclooxygenase-2 קשור ל-celecoxib, מזהה PDB ID 3LN1. שרשרת A וקבוצת ה-heme המשויכת אליה נשמרו כקולטן, בעוד שמולקולות מים קריסטלוגרפיות והליגנד celecoxib שסו-קריסטלו הוסרו במהלך הכנת הקולטן. הקונפורמציה הטבעית של ה-celecoxib חולצה בנפרד משרשרת A לצורך תיקוף של עגינה מחדש (redocking). אטומי מימן פולריים ומטעני Gasteiger נוספו באמצעות AutoDockTools, והקולטן נשמר בפורמט PDBQT. PDB ID 3LN1 הוא מבנה ברזולוציה של 2.40 Å של COX-2 עכברי הקשור ל-celecoxib. המבנים של β-sitosterol ושל linoleyl acetate ה obtained מ-PubChem והוכנו באמצעות Open Babel. אטומי מימן ומטעים חלקיים של Gasteiger נוספו, קשרים סיבוביים הוגדרו, וכל ליגנד הומר לפורמט PDBQT. Celecoxib, β-sitosterol ו-linoleyl acetate עוגנו באמצעות AutoDock Vina עם אותו קולטן ואותם פרמטרי חיפוש.

תיבת העגינה (docking box) מורכזה על אזור קישור ה-celecoxib הטבעי באמצעות הקואורדינאטות הבאות: center_x = 30.9886 center_y = -22.2836 center_z = -16.5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. ערך השקיפות (exhaustiveness) נקבע ל-16, מספר מצבי הפלט (output modes) ל-10, וטווח האנרגיה ל-3 kcal/mol. התנוחה (pose) המדורגת בראש הרשימה, על סמך אנרגיית הקישור הנמוכה ביותר שנחזתה, נשמרה לצורך ויזואליזציה. לצורך תיקוף הפרוטוקול, בוצע עיגון חוזר (redocking) של celecoxib טבעי תחת אותם תנאים, וחושב באמצעות PyMOL הסטייה הריבועית הממוצעת (RMSD) של האטומים הכבדים בין התנוחה הקריסטלוגרפית לתנוחה שעוגנה מחדש. סטייה ריבועית ממוצעת הפחותה מ-2 Å נחשבה לשחזור מקובל של תנוחת הייחוס. שאריות הממוקמות בטווח של 4 Å מכל ליגנד שעוגן זוהו ב-PyMOL. ציוני העגינה והתנוחות פורשו כהערכות של תאימות מבנית ולא כראיה ישירה לקישור למטרה או לעכבון אנזימטי.

תרבית תאים והכנת תרכובות

תאי מזנגיום גלומרולריים של חולדה מסוג HBZY-1 תורגדו במצע Dulbecco’s modified Eagle בתוספת גלוקוז גבוה, 10% fetal bovine serum ו-1% penicillin-streptomycin בטמפרטורה של 37 °C בתנאים לחים עם 5% CO₂. עבור כל הניסויים נעשה שימוש בתאים במעברים 2–7, ומצבם כנקיים ממיקופלסמה אומת לפני השימוש. β-Sitosterol ו-celecoxib שימשו כתרכובות מוגדרות כימית. β-Sitosterol הומס באתנול מוחלט כדי להכין תמיסת מלאי בריכוז 10 mM (בקירוב 4.15 mg/mL). במידת הצורך, בוצעה סונקציה קצרה וחימום ל-50–60 °C כדי להגיע לתמיסה צלולה באופן ויזואלי. Celecoxib הומס ב-dimethyl sulfoxide להכנת תמיסת מלאי בריכוז 10 mM (בקירוב 3.81 mg/mL). תמיסות המלאי חולקו למנות ואוחסנו בטמפרטורה של −20 °C. לפני הטיפול, תמיסות המלאי דוללו ישירות לתוך מצע תרבית שחומם מראש ועורבבו באופן מיידי.

ריכוזי חומרי הנושא הותאמו בתוך כל ניסוי. במבחן חיוניות התאים, ריכוז האתנול הסופי הותאם ל-0.2% v/v בכל הקבוצות, מכיוון שריכוז ה-β-sitosterol הגבוה ביותר שנבדק היה 20 µM. בניסוי הדלקת המופעל על ידי LPS, ריכוזי האתנול וה-dimethyl sulfoxide הסופיים הותאמו ל-0.1% ו-0.01% v/v, בהתאמה, בכל הקבוצות. בניסוי הפרו-פיברוטי המופעל על ידי TGF-β1, ריכוז האתנול הסופי הותאם ל-0.1% v/v בכל הקבוצות. נפחים שקולים של חומרי הנושא המתאימים התווספו לקבוצות הביקורת (Control), LPS ו-TGF-β1.

בדיקת חיוניות תאים

תאים נזרעו בפלטות בעלות 96 בארות בצפיפות של 5 × 103 תאים לבערה ב-100 µL של מצע מלא, והושארו להיצמד למשך 24 h. כדי להעריך את טווח הריכוזים של β-sitosterol, תאים הודגרו עם 0.5, 1, 5, 10 או 20 µM של β-sitosterol למשך 24 h. עבור בדיקת חיוניות תאים הקשורה ל-LPS, התאים טופלו מראש ב-β-sitosterol בריכוזים של 1, 5 או 10 µM למשך 2 h, ולאחר מכן נחשפו ל-1 µg/mL של lipopolysaccharide למשך 24 h נוספות.

קבוצות הטיפול היו ביקורת, β-sitosterol בריכוז 0.5 µM, β-sitosterol בריכוז 1 µM, β-sitosterol בריכוז 5 µM, β-sitosterol בריכוז 10 µM, β-sitosterol בריכוז 20 µM, LPS, LPS בתוספת β-sitosterol בריכוז 1 µM, LPS בתוספת β-sitosterol בריכוז 5 µM, ו-LPS בתוספת β-sitosterol בריכוז 10 µM. ריאגנט Cell Counting Kit-8 הוסף בכמות של 10 µL לכל באר, והפלטות דגרו למשך 2 h. לאחר מכן נמדדה הבליעה באורך גל של 450 nm. חיוניות התאים נקבעה לאחר הפחתת ערך הבלנק (ללא תאים) והובעה ביחס לקבוצת הביקורת. כל תנאי כלל שש בארות טכניות בכל אחד משישה ניסויים ביולוגיים עצמאיים. הערכים מהבארות הטכניות מכל ניסוי חושבו כממוצע כדי ליצור ערך שחזור ביולוגי אחד לצורך ניתוח סטטיסטי.

הפעלה דלקתית המושרית על ידי LPS

עבור ניסויי הפעלה דלקתית, תאי HBZY-1 נזרעו בפלטות בעלות 6 בארות בצפיפות של 2 × 105 תאים לבארה, וטופלו לאחר הגעה לכ-70%–80% התמזגות (confluence). התאים הוחזקו במצע המועשר ב-1% סרום בקר עוברי למשך 12 h לפני הטיפול. β-Sitosterol או celecoxib ניתן 2 h לפני גירוי ב-LPS. לאחר מכן, התאים נחשפו ל-1 µg/mL LPS למשך 24 h.

הקבוצות הניסיוניות היו בקרה, β-sitosterol בריכוז 10 µM, LPS, LPS בתוספת β-sitosterol בריכוז 1 µM, LPS בתוספת β-sitosterol בריכוז 5 µM, LPS בתוספת β-sitosterol בריכוז 10 µM, ו-LPS בתוספת celecoxib בריכוז 1 µM. Celecoxib נכלל כביקורת חיובית תפקודית לעיכוב של ייצור פרוסטגלנדינים התלוי ב-COX-2. בסיום הטיפול, נאספו על-נוזלי תרבית למדידת PGE2. תאים נאספו בנפרד לצורך אנליזת quantitative real-time PCR של Tnf, Il6, ו-Ptgs2 ולצורך אנליזת western blot של COX-2.

הפעלה פרו-פיברוטית המושרית על ידי TGF-β1

מודל נפרד המושרה על ידי TGF-β1 שימש להערכת הפעלה פרופיברוטית. תאי HBZY-1 נזרעו בפלטות בעלות 6 באריים בצפיפות של 2 × 105 תאים לבאר ונשמרו במצע המועשר ב-1% fetal bovine serum למשך 12 h לפני הטיפול. התאים טופלו מראש ב-β-sitosterol למשך 2 h, ולאחר מכן עוברוהם בגירוי של 10 ng/mL recombinant TGF-β1 למשך 48 h.

קבוצות הטיפול כללו ביקורת, β-sitosterol (10 µM), TGF-β1, TGF-β1 + β-sitosterol (5 µM), ו-TGF-β1 + β-sitosterol (10 µM). בסיום תקופת הטיפול, התאים נאספו לצורך ניתוח quantitative real-time PCR של Col1a1 ו-Acta2 ולצורך ניתוח western blot של alpha-smooth muscle actin (α-SMA).

PCR כמותי בזמן אמת (Quantitative real-time PCR)

RNA כולל בודד מהתאים המטופלים באמצעות ריאגנט להוצאת RNA מבוסס פנול-גואנידיניום, בהתאם לפרוטוקול היצרן. ריכוז ה-RNA והטוהר שלו נקבעו באמצעות ספקטרופוטומטר. רק דגימות עם יחס A260/A280 של 1.8–2.0 שימשו לשעתוק הפוך. עבור כל דגימה, 1 µg של RNA כולל שעתקה באופן הפוך ל-DNA משלים בנפח תגובה סופי של 20 µL. ה-DNA המשלים שהתקבל דולל פי חמישה במים נקיים מנוקלאז לפני ביצוע qPCR. ה-qPCR בוצע בנפח כולל של 20 µL המכיל 10 µL של 2× SYBR Green master mix, 0.4 µL של פריימרים קדמיים ואחוריים בריכוז 10 µM כל אחד, 2 µL של DNA משלים מדולל, ו-7.2 µL של מים נקיים מנוקלאז. תנאי ההגברה כללו שלב דה-נטורציה ראשוני ב-95 °C למשך 30 s, ולאחריו 40 מחזורים של דה-נטורציה ב-95 °C למשך 5 s והתאמה-הארכה (annealing-extension) ב-60 °C למשך 30 s. לאחר מכן בוצע ניתוח עקומת המסה (melting-curve analysis) מ-65 °C עד 95 °C כדי לאמת את ספציפיות ההגברה.

הגנים שנמדדו היו Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2ו- Gapdh. Gapdh שימש כגן הייחוס הפנימי. ביטוי גנים יחסי נקבע באמצעות שיטת ה-2−ΔΔCt שיטה, כאשר קבוצת הביקורת שימשה ככיול. רצפי הפריימרים מופיעים ב- טבלה נלווית 1כל דגימה נותחה בשלוש חזרות טכניות, ובוצעו שישה ניסויים ביולוגיים עצמאיים. הערכים שהתקבלו מהחזרות הטכניות חושבו כממוצע לפני ביצוע הניתוח הסטטיסטי.

מדידת PGE2 באמצעות תגובת ספיחה חיסונית קשורה לאנזים (ELISA)

על־נוזלי תרבית נאספו לאחר 24 h של גירוי ב-LPS וסובבו בcentrifuge במהירות של 1,000 × g למשך 10 min בטמפרטורה של 4 °C להסרת שיירי תאים. ריכוזי PGE2 נקבעו באמצעות ערכה מסחרית של סריקה חיסונית קשורה לאנזים (ELISA) בהתאם להוראות היצרן.

תקנים ודגימות הועמסו על פלטת הבדיקה בשכפולים. לאחר השלמת שלבי קישור הנוגדנים ופיתוח הצבע, נמדדה הבליעה באורך גל של 450 nm באמצעות קורא מיקרו-פלטות. ריכוזי PGE2 נקבעו על סמך עקומת סטנדרט לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים והובעו כ-pg/mL. נותחו על-נוזלים מששה ניסויי תאים בלתי תלויים. מדידות שכפול עבור כל דגימה ביולוגית חושבו כממוצע לפני ביצוע הניתוח הסטטיסטי.

Western blotting

תאי שהטופלו עברו ליזיס בבופר למסיי radioimmunoprecipitation assay בתוספת תערובת מעכבי פרוטאז. הליזאטים דגרו על קרח למשך 30 min וסנטריפוגו ב-12,000 × g למשך 15 min בטמפרטורה של 4 °C. ריכוזי החלבונים בעיקרי השכבה (supernatants) נקבעו באמצעות בדיקת חלבון bicinchoninic acid. כמויות שוות של חלבון (30 µg לכל נתיב) עורבבו עם בופר טעינה (loading buffer) ועברו דנטורציה ב-95 °C למשך 5 min. חלבונים מניסויי LPS הופרדו על ג'לים של sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide בריכוז 10%, בעוד שחלבונים מניסויי TGF-β1 הופרדו על ג'לים בריכוז 12%. החלבונים המופרדים הועברו לאחר מכן לממברנות polyvinylidene fluoride.

את הממברנות חסמו עם 5% חלב דל שומן ב-Tris-buffered saline המכיל 0.1% Tween 20 למשך 1 h בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגרו אותן למשך לילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) ו-GAPDH (1:5000). את COX-2 ניתוחו בדגימות מהניסוי עם LPS, בעוד שאת α-SMA ניתוחו בדגימות מהניסוי עם TGF-β1. לאחר שטיפה, דגרו את הממברנות עם נוגדנים משניים המשולבים עם horseradish peroxidase (1:5000) למשך 1 h בטמפרטורת החדר. את פסי החלבון הדמיאו באמצעות substrate לכימילומינצנציה משופרת וצולמו במערכת דימות כימילומינצנטית. זמני החשיפה היו בערך 10 s עבור COX-2, 10 s עבור α-SMA ו-2 s עבור GAPDH.

עוצמות הפסים כוונתו באמצעות ImageJ. אותות של COX-2 ו-α-SMA נורמלו לאות GAPDH התואם. Western blotting בוצע באמצעות דגימות חלבון שהתקבלו משישה ניסויים עצמאיים של תרביות תאים וטיפולים.

ניתוח סטטיסטי

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות GraphPad Prism. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. שישה ניסויי תרבית תאים וטיפולים בלתי תלויים בוצעו עבור כל ניתוח כמותי, כאשר כל ניסוי בלתי תלוי ייצג שכפול ביולוגי אחד. מדידות של שכפולים טכניים שהתקבלו מאותו ניסוי ביולוגי מופעו כממוצע לפני הניתוח הסטטיסטי ולא נחשבו לתצפיות בלתי תלויות.

עבור בדיקת חיוניות התאים, כל ניסוי ביולוגי כלל שש בארות טכניות לכל תנאי. תגובות qPCR בוצעו בשלוש חזרות טכניות עבור כל דגימה ביולוגית, ומדידות של PGE2 בוצעו בשתי חזרות. הכימות של ה-Western blot התבססה על שש דגימות חלבון שהוכנו באופן עצמאי. לפיכך, כל עמודה כמותית כוללת שישה ערכים של חזרות ביולוגיות בודדות.

הבדלים בין קבוצות מרובות נותחו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way analysis of variance), ולאחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey. ערך P דו-צדדי < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית. ערכים של חזרות ביולוגיות פרטניות הוצגו יחד עם הממוצע וסטיית התקן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סריקת מרכיבים פוטנציאליים, אחזור מטרות וחיתוך מטרות

תהליך העבודה לזיהוי מטרות חופפות פוטנציאליות בין תרכובות למחלות מסוכם ב- איור 1Aשבעה תרכובות מועמדות של *C. sinensis* עמדו בקריטריוני הסינון שהוגדרו מראש של OB ≥30% ו-DL ≥0.18, כולל חומצה ארכידונית, לינואלשיל אצטט, βסיטוסטרול, פרוקסיארגוסטרול, צרוויסטרול, כולסטריל פלמיטט ו-CLR (טבלה 2במקביל, 1,134 גנים הקשורים לדלקת גלומרולו (glomerulonephritis) נשלופו מ-GeneCards, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה שילב פרמקולוגיה של רשתות, דוקינג מולקולרי המתוקף באמצעות ליגנד-ייחוס וניסויים ברמת התרכובת כדי לבחון היפותזה הקשורה ל-PTGS2, שנגזרה מרכיבים מועמדים של C. sinensis. שבעה רכיבים עמדו בקריטריוני הסינון שהוגדרו מראש של TCMSP, ו-23 מטרות חפפו לקבוצת הגנים הקשורה לגלומרולונפריטיס. ניתוח אינטראקציות בין חלבונים תיעד תשע מטרות מרכזיות, שביניהן נבחר PTGS2 לצורך דוקינג והערכה ניסויית. דוקינג חוזר של celecoxib שחזר את תצורת הגביש שלו, בעוד ש-β-sitosterol ו-linoleyl acetate הראו תאימות חזויה בינוני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי利益. כלים מבוססי בינה מלאכותית (ChatGPT, OpenAI) שימשו לסיוע בעריכה לשונית ובתכנון ראשוני של איורים סכמתיים. בינה מלאכותית גנרטיבית שימשה לסיוע בהכנת טיוטות גרפיות ראשוניות של איורים 1A ו-7, אשר נסקרו לאחר מכן ותוקנו על ידי המחברים כדי להבטיח עקביות עם השיטות והתוצאות המדווחות. כל התוצרים שסייעה להם בינה מלאכותית הוערכו באופן ביקורתי ואושרו על ידי המחברים. המחברים אישרו את תוכן האיורים הסופי ונשאו באחריות מלאה ליושרה ולדיוק של כתב היד.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי התמחות מיוחדת למאפייני נפריפת ברפואה סינית ומערבית משולבת (ZYTSZK2-3) והמחקר על אסטרטגיית התערבות של TCM במחלת כליות כרונית מנקודת מבט של ניהול מחלות כרוניות (202240169).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנול מוחלטSigma-Aldrich/MerckE7023אתנול בדרגת ביולוגיה מולקולרית, 200 proof, לא דנטורי; ממס עבור βמלאי $\beta$-sitosterol.
AutoDock VinaScripps Researchגרסה 1.1.2סימולציית עגינה מולקולרית
מCבט בטיחות ביולוגיתThermo Fisher Scientificסדרה 1300 A2פעולות תרביות תאים סטריליות
סלקוקסיבMedChemExpressHY-14398מעכב COX-2 סלקטיבי המשמש כביקורת חיובית; תמיסת מקור בריכוז 10 mM ב-DMSO. 
ערכה לספירת תאים 8 (Cell Counting Kit-8)Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04בדיקה קולורימטרית של WST-8 להערכת חיוניות תאים; מדידת בליעה באורך גל של 450 ננומטר.
מערכת לדימיון כימילומינצנציהBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPרכישת דימויים של Western blot
חבילת ה-R ‏clusterProfilerBioconductorגרסה 4.10.0ניתוח העשרה של GO ו-KEGG
CO2 אינקובטור לתרבית תאיםThermo Fisher ScientificForma Series II 3111דגירה של תרביות תאים ב- 37 °C ו-5% CO22
נוגדן מונוקלונלי לארנב ל-COX-2 (D5H5)טכנולוגיית איתות תאי12282Western blot שהוכח עבור COX-2 של בן אדם, עכבר וחולדה; בשימוש בדילול של 1:1,000.
תוסף CytoNCAחנות האפליקציות של Cytoscapeגרסה 2.1.6ניתוח טופולוגי של מטרות רכז (Hub target topological analysis)
תוכנת Cytoscapeקונסורציום Cytoscapeגרסה 3.8.0ויזואליזציה ואנליזה של רשתות
דימתיל סולפוקסידSigma-Aldrich/MerckD2650BioReagent שעבר סינון סטרילי, ≥99.7%; ממס עבור תמיסת מלאי של celecoxib.
מאגר הנתונים DisGeNETקבוצת האינפורמטיקה הביו-רפואית אינטגרטיביתלא רלוונטישליפת גנים הקשורים למחלה עבור גלומרולוניפריטיס
מדיום איגל משופר של דולבקו (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTמצע בסיסי לתרבית תאי HBZY-1
מצע לכימילומינצנציה מוגברתBeyotime BiotechnologyP0018Sויזואליזציה של פסי Western blot
סרום עגל עוברGibco/Thermo Fisher Scientific10099-141Cתוסף סרום לתרבית תאים
נוגדן חד-שבטי משפחת הארנב ל-GAPDH (D16H11)טכנולוגיית העברת אותים תאיים5174בקרת העמסה ל-Western blot; בעל תגובתיות ל-GAPDH של בן אדם, עכבר וחולדה; נעשה בו שימוש בדילול של 1:5,000 לאחר אופטימיזציה פנימית.
מאגר הנתונים GeneCardsמכון ויצמן למדעלא רלוונטישליפת גנים הקשורים לדלקת גלומרולולרית
GraphPad Prismתוכנת GraphPadגרסה 9.0.0.121ניתוח סטטיסטי של נתוני ניסויים in vitro
נוגדן עיזים אנטי-rabbit IgG המשורשב ל-HRPProteintech GroupSA00001-2נוגדן משני לנוגדנים ראשוניים מארנב
תוכנת ImageJהמכונים הלאומיים לבריאותגרסה 1.54ניתוח דנסיטומטרי של Western blot
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוךOlympusCKX53תצפית על מורפולוגיית תאים
חבילת ה-R ‏org.Hs.eg.dbBioconductorגרסה 3.18.0אנוטציה של גנים אנושיים לצורך ניתוח העשרה
תמיסת פניצילין-סטרפטומייציןGibco/Thermo Fisher Scientific15140122תוסף אנטיביוטי לתרבית תאים
פרוסטגלנדין E2 ערכת בדיקה למדדי פרמטריםR&D Systems, מותג של Bio-TechneKGE004BELISA תחרותי רב-מינים עבור על-נוזלי תרביות תאים; טווח בדיקה 39–2,500 pg/mL; גילוי קולורימטרי ב-450 ננומטר.
מאגר הנתונים PharmGKBמאגר ידע של פרמקו-גנומיקהלא זמיןאחזור מטרות הקשורות למחלה
מאגר המידע PubChemהמרכז הלאומי למידע על ביוטכנולוגיהלא ניתן לספק תרגום מכיוון שלא הוזן טקסט מקור. נא לספק את הטקסט לאנגלית שברצונך לתרגם לעברית.שחזור מבני ליגנדים
ממברנת PVDFMillipore/MerckIPVH00010ממברנת העברה של חלבונים עבור Western blotting
מערכת הגרפיקה המולקולרית PyMOLשלוה (Schr)ödinger, LLCגרסה 2.6.2ויזואליזציה של תנוחת העגן (Docking pose)
תוכנת RR Foundation for Statistical Computingגרסה 4.3.2ניתוח חפיפת מטרות והעשרה
קו תאי מזנגיום גלומרולריים של חולדה (HBZY-1)Procell Life Science & חברה בע"מ לטכנולוגיהCL-0117מודל תיקוף של תאי מזנגיום in vitro
בנק נתוני החלבונים RCSBמעבדה שיתופית למחקר בביואינפורמטיקה מבניתמזהה PDB: 3LN1שליפת מבנה הגביש של PTGS2/COX2
TGF- אנושי רקומביננטיβחלבון 1PeproTech, מותג של Thermo Fisher Scientific100-21-10UGTGF- אנושי רקומביננטי המופק מתאי HEK293β1; גרייה פרופיברוטית בריכוז של 10 ng/mL. 
מערכת אלקטרופורזה מסוג SDS-PAGEBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN Tetraהפרדת חלבונים באמצעות SDS-PAGE
מאגר המידע STRINGקונסורציום ELIXIR/STRINGגרסה 12.0בניית רשת אינטראקציות בין חלבונים
מאגר המידע TCMSPמאגר נתונים של פרמקולוגיית מערכות ברפואה סינית מסורתיתלא זמיןסריקת תרכובות מועמדות מ-*Cordyceps sinensis*
מאגר מטרות טיפוליותקבוצת מחקר תרופות חדשניות וביואינפורמטיקהלא רלוונטישליפת מטרות טיפוליות
α-נוגדן ראשוני ל-SMAProteintech Group14395-1-APזיהוי של α-ביטוי חלבון SMA
β-סיטוסטרוול (דרגת טוהר >98%)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5; תרכובת מוגדרת המשמשת לטיפול בתאים; תמיסת מלאי 10 mM באתנול מוחלט. 

מקורות

  1. Kidney Disease: Improving Global Outcomes Glomerular Diseases Work G. KDIGO 2021 Clinical Practice Guideline for the Management of Glomerular Diseases. Kidney Int. 2021;100(4S):S1–S276.
  2. Roccatello D. et al. From inflammation to renal fibrosis: A one-way road in autoimmunity? Autoimmun Rev. 2024;23(4):103466.
  3. Reiss AB. et al. Fibrosis in Chronic Kidney Disease: Pathophysiology and Therapeutic Targets. J Clin Med. 2024;13(7).
  4. Kant S, Kronbichler A, Geetha D. Principles of Immunosuppression in the Management of Kidney Disease: Core Curriculum 2022. Am J Kidney Dis. 2022;80(3):393–405.
  5. El Karoui K, Fervenza FC, De Vriese AS. Treatment of IgA Nephropathy: A Rapidly Evolving Field. J Am Soc Nephrol. 2024;35(1):103–16.
  6. Stenvinkel P. et al. Chronic Inflammation in Chronic Kidney Disease Progression: Role of Nrf2. Kidney Int Rep. 2021;6(7):1775–87.
  7. Tanaka S, Portilla D, Okusa MD. Role of perivascular cells in kidney homeostasis, inflammation, repair and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2023;19(11):721–32.
  8. Liu W. et al. Mechanism of Cordyceps sinensis and its Extracts in the Treatment of Diabetic Kidney Disease: A Review. Front Pharmacol. 2022;13:881835.
  9. Yan G. et al. The effects of Ophiocordyceps sinensis combined with ACEI/ARB on diabetic kidney disease: A systematic review and meta-analysis. Phytomedicine. 2023;108:154531.
  10. Li S, Pang W, Wang Y, Zhang Y. Cordyceps sinensis extract protects against acute kidney injury by inhibiting perforin expression in NK cells via the STING/IRF3 pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(7):5887–904.
  11. Zhang Y, Li K, Zhang C, Liao H, Li R. Research Progress of Cordyceps sinensis and Its Fermented Mycelium Products on Ameliorating Renal Fibrosis by Reducing Epithelial-to-Mesenchymal Transition. J Inflamm Res. 2023;16:2817–30.
  12. Zhao L. et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  13. Ru J. et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 2014;6:13.
  14. Bi Y. et al. beta-Sitosterol Suppresses LPS-Induced Cytokine Production in Human Umbilical Vein Endothelial Cells via MAPKs and NF-kappaB Signaling Pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2023;2023:9241090.
  15. Sun Y, Gao L, Hou W, Wu J. beta-Sitosterol Alleviates Inflammatory Response via Inhibiting the Activation of ERK/p38 and NF-kappaB Pathways in LPS-Exposed BV2 Cells. Biomed Res Int. 2020;2020:7532306.
  16. Park YJ. et al. Effects of beta-Sitosterol from Corn Silk on TGF-beta1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Lung Alveolar Epithelial Cells. J Agric Food Chem. 2019;67(35):9789–95.
  17. Li DD. et al. RTEC-intrinsic IL-17-driven inflammatory circuit amplifies antibody-induced glomerulonephritis and is constrained by Regnase-1. JCI Insight. 2021;6(13).
  18. Martin-Carro B. et al. Role of Klotho and AGE/RAGE-Wnt/beta-Catenin Signalling Pathway on the Development of Cardiac and Renal Fibrosis in Diabetes. Int J Mol Sci. 2023;24(6).
  19. Naas S, Schiffer M, Schodel J. Hypoxia and renal fibrosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2023;325(4):C999–C1016.
  20. Harris RC, Breyer MD. Physiological regulation of cyclooxygenase-2 in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281(1):F1–11.
  21. Calder PC. Eicosanoids. Essays Biochem. 2020;64(3):423–41.
  22. Waldner C, Heise G, Schror K, Heering P. COX-2 inhibition and prostaglandin receptors in experimental nephritis. Eur J Clin Invest. 2003;33(11):969–75.
  23. Pan Y. et al. Myeloid cyclooxygenase-2/prostaglandin E2/E-type prostanoid receptor 4 promotes transcription factor MafB-dependent inflammatory resolution in acute kidney injury. Kidney Int. 2022;101(1):79–91.
  24. Volzke A, Koch A, Meyer Zu Heringdorf D, Huwiler A, Pfeilschifter J. Sphingosine 1-phosphate (S1P) induces COX-2 expression and PGE2 formation via S1P receptor 2 in renal mesangial cells. Biochim Biophys Acta. 2014;1841(1):11–21.
  25. Sawano H. et al. 15-Deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 inhibits IL-1beta-induced cyclooxygenase-2 expression in mesangial cells. Kidney Int. 2002;61(6):1957–67.
  26. Guo B. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligands inhibit TGF-beta 1-induced fibronectin expression in glomerular mesangial cells. Diabetes. 2004;53(1):200–8.
  27. Zou R. et al. PPARgamma agonists inhibit TGF-beta-PKA signaling in glomerulosclerosis. Acta Pharmacol Sin. 2010;31(1):43–50.
  28. Wei J. et al. PP2 Ameliorates Renal Fibrosis by Regulating the NF-kappaB/COX-2 and PPARgamma/UCP2 Pathway in Diabetic Mice. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:7394344.
  29. Yang C, Chen EA, Zhang Y. Protein-Ligand Docking in the Machine-Learning Era. Molecules. 2022;27(14).
  30. Quiroga R, Villarreal MA. Developing Generalizable Scoring Functions for Molecular Docking: Challenges and Perspectives. Curr Med Chem. 2025;32(28):5960–72.
  31. Li J. et al. TGF-beta/Smad signaling in chronic kidney disease: Exploring post-translational regulatory perspectives (Review). Mol Med Rep. 2024;30(2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בטא-סיטוסטרולפרמקולוגיה רשתיתדוקינג מולקולריעיכוב COX-2מסלולים דלקתייםהפעלה פרו-פיברוטיתCordyceps sinensisניתוח אינטראקציה בין חלבונים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.