פרוטוקול זה מציג מודל של חולדה לפגיעה חריפה בכליות המושרית על ידי חומר ניגוד, ומעריך מתן של N-acetylcysteine ושל montelukast לאחר החשפתם לחומר הניגוד, בנפרד ובשילוב. משטרי הטיפול היו קשורים לתפקוד כלייתי פגוע פחות, להפחתה בעקה חמצונית, בדלקת ובנזק היסטופתולוגי, אם כי הטיפול המשולב לא הראה עליונות עקבית על פני טיפול בודד.
מאמר שיטה
השפעות נפרופרוטקטיביות של טיפול ב-N-Acetylcysteine וב-Montelukast לאחר מתן חומר ניגוד במודל חולדות של פגיעה כלייתית חריפה מושרית חומר ניגוד
במאמר זה
סיכום
תקציר
פגיעה כלייתית חריפה מושרית ניגודיות (CI-AKI) היא סיבוך משמעותי של חשיפה לחומרי ניגודיות יודים, שבהם תהליכי דלקת ועקה חמצונית תורמים לנזק כלייתי. מחקר זה ביסס מודל ניסויי של CI-AKI בחולדות ובחן את ההשפעות של טיפול ב-N-acetylcysteine (NAC), מונטelukast, או שילוב של שניהם, שהחל לאחר מתן חומר הניגודיות. חולדות זכר בוגרות מסוג Wistar עברו מניעת מים, ולאחריה מתן תוורידי רצופי של Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), אינדומטצין ויוהקסול. הטיפול הוחל שעה אחת לאחר השלמת מתן היוהקסול, כ-1.5 שעות לאחר מתן ה-L-NAME, ונמשך פעם ביום למשך 3 ימים רצופים. נבחנו מדדי תפקוד כלייתי, פרמטרים של עקה חמצונית, ציטוקינים דלקתיים, סמנים ביולוגיים לפגיעה כלייתית והיסטופתולוגיה של הכליות. קבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה הראתה תפקוד כלייתי לקוי באופן בולט, פרופיל דלקתי ועקה חמצונית לא נוחים, ונזק היסטופתולוגי משמעותי. בהשוואה לקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, בעלי חיים שקיבלו NAC, מונטelukast או את משטר השילוב הראו בדרך כלל שיפור בממצאים הביוכימיים וההיסטופתולוגיים. רמות הגלוטתיון (GSH) היו הגבוהות ביותר, וציוני הנזק ההיסטופתולוגי הממוצעים היו הנמוכים ביותר מבחינה מספרית בקבוצת השילוב; עם זאת, הטיפול המשולב לא עלה בעקביות על המונותרפיה בכל התוצאים שנבחנו. פרוטוקול זה מספק מסגרת פרה-קלינית מבוקרת להערכת התערבויות לאחר מתן חומר ניגודיות ב-CI-AKI, והממצאים מצדיקים חקירה ניסויית נוספת של NAC ומונטelukast, מבלי לקבוע יעילות קלינית או יתרון ספציפי לשילוב.
מבוא
פגיעה כלייתית חריפה (AKI) מסבכת לעיתים קרובות את מהלכהם של מטופלים המאושפזים בבית החולים ותורמת לעלייה בתחלואה, בתמותה ובשימוש במשאבי בריאות. מכיוון שחומרי ניגוד יודים משמשים באופן שגרתי בדימות אבחנתי ובפרוצדורות פולשניות, הידרדרות בתפקוד הכליות בעקבות חשיפה לחומר ניגוד הפכה לדאגה קלינית חשובה. הנומנקלטורה הנוכחית מבדילה בין פגיעה כלייתית חריפה הקשורה לחומר ניגוד (CA-AKI), הכוללת כל אירוע של AKI המתרחש לאחר מתן חומר ניגוד, לבין פגיעה כלייתית חריפה המושרית על ידי חומר ניגוד (CI-AKI), שבה הפגיעה הכלית מיוחסת סיבתית לחומר הניגוד. במודלים ניסיוניים מבוקרים, שבהם ניתן לקשור ישירות את החשיפה לחומר הניגוד לנזק כלייתי, המונח CI-AKI נותר נפוץ בשימוש1,2.
מטופלים עם מחלה כלית כרונית, סוכרת, גיל מתקדם, אי-ספיקת לב או תחלואה לבבית-כלי דם נלווית אחרת הם רגישים במיוחד ל-CI-AKI. תפקוד הכליות משתפר אצל מטופלים רבים שנפגעו; עם זאת, במקרים חמורים יותר עלולים להתרחש ליקויים כלייתיים מתמשכים, צורך בטיפול חליפי לכליות וסיכון מוגבר למוות. CI-AKI קשורה גם לאשפוזים ממושכים יותר ולשימוש רב יותר במשאבי בריאות. השלכות שליליות אלה מדגישות את הצורך המתמשך בפיתוח גישות מנע וטיפול יעילות עבור פגיעה כלית הקשורה לחומר ניגוד1,3,4,5.
התפתחות של CI-AKI כוללת מספר תהליכים הקשורים זה בזה, הכוללים פגיעה בפרפוזיה של הכליות, חוסר איזון בחמצן במוך הכליה (medulla), עקה חמצונית, דלקת ורעילות טובולרית ישירה. חשיפה לחומר ניגוד משנה את טון כלי הדם התוך-כלייתיים לכיוון של כיווץ כלי דם (vasoconstriction) תוך החלשת התגובות להרחבת כלי דם (vasodilation), ובכך מפחיתה את זרימת הדם לכליות. המוך החיצוני רגיש במיוחד מכיוון שזמינות החמצן באזור זה מוגבלת כבר בתנאים פיזיולוגיים. לכן, ירידה נוספת באספקת החמצן לאחר מתן חומר ניגוד עלולה להוביל לפגיעה טובולרית היפוקסית2,6,7.
היפוקסיה כלייתית בעקבות חשיפה לחומר ניגוד מלווה ביצירה מוגברת של רדיקלים חופשיים (ROS), התורמת באופן משמעותי לפגיעה בכליות. כאשר ייצור ה-ROS עולה על קיבולת נוגדי החמצון האנדוגנית, עלול להתפתח נזק חמצוני בליפידים תאיים, בחלבונים וב-DNA, בעוד שסיגנל דלקתי מועצם בו-זמנית. הן בהקשרים ניסיוניים והן בהקשרים קליניים, מתן חומר ניגוד נקשר לעלייה במדדי עקה חמצונית ולפגיעה במנגנוני הגנה של נוגדי חמצון. מסלולים מולקולריים המעורבים בתגובה זו כוללים יצירת רדיקלים התלויה ב-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase והפעלה של nuclear factor kappa-B (NF-κB)1,6,8,9.
תרומת הדלקת מעידה כי לא ניתן להסביר את ה-CI-AKI באמצעות הפרעה המודינמית בלבד. ראיות מהעת האחרונה קשרו גם את הפרופטוזיס, סטרס ניטרוזטיבי ומלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים לפגיעה כלייתית בעקבות חשיפה לחומר ניגוד. הזיהוי של מנגנונים נוספים אלה הרחיב את מגוון המטרות המולקולריות הנחקרות למניעה ולטיפול ב-CI-AKI1.
רמות קריאטינין בנסיוב ותפוקת שתן משמשים בדרך כלל לזיהוי CI-AKI, אך שניהם עשויים להשתנות רק לאחר שפגיעה כלייתית כבר התפתחה. מגבלה זו עודדה הערכה של סמנים מוקדמים יותר, כולל kidney injury molecule-1 (KIM-1), המשקף נזק טובולי, ו-cystatin C, הקשור לשינויים בסינון הגלומרולרי. ראיות ממחקרים ניסיוניים וקליניים מצביעות על כך ששינויים בביומרקרים אלו עשויים להפוך לגילויים במהלך השלב המוקדם של CI-AKI, ולכן הם תומכים בהערכה מוקדמת יותר של פגיעה כלייתית9,10,11.
התקדמות בהבנת הפתופיזיולוגיה של CI-AKI עודדה הערכה של התערבויות פרמקולוגיות המכוונות למסלולים חמצוניים ודלקתיים. הידרציה נאותה נותרת אמצעי המניעה העיקרי, בעוד שהיתרונות המדווחים של גישות מבוססות תרופות השתנו בין מחקרים שונים. כתוצאה מכך, שום טיפול פרמקולוגי טרם הדגים יעילות עקבית מספיקה כדי שא יאומץ כהתערבות קלינית סטנדרטית עבור CI-AKI1,4,12,13.
N-acetylcysteine (NAC) נבחן באופן נרחב כגישה פרמקולוגית להגבלה של CI-AKI. ההשפעות הרנו-פרוטקטיביות (מגנות הכליות) המוצעות שלו קשורות לספיחה של מינים ריאקטיביים ולשיקום מאגרי הגלוטתיון. תמיכה קלינית ראשונית הגיעה ממחקר מכונן בקרב חולים עם מחלת כליות כרונית, שבו NAC הפחית את השכיחות של תפקוד כליות לקוי הקשור לחומר ניגוד14. עם זאת, ניסויים קליניים מאוחרים יותר וסינתזות של ראיות הניבו ממצאים לא עקביים, כאשר חלק מהמחקרים דיווחו על תועלת ואחרים לא הראו השפעה קלינית משמעותית. לפיכך, יעילותו של NAC עבור CI-AKI נותרת לא ודאית12,15,16,17.
מונטלוקסט (Montelukast) חוסם באופן סלקטיבי את קולטן לוקוטריאני ציסטאנייל-1 (cysteinyl leukotriene receptor-1) ומשמש מזה זמן רב לטיפול באסמה ובהפרעות אלרגיות. ראיות ניסיוניות מצביעות על כך שסוכן זה מפעיל השפעות נוגדות דלקת, נוגדות חמצון ומעכבות אפופטוזה. במודלים שונים של פגיעה כלייתית, מתן מונטלוקסט נקשר להפחתה בפרוקסידציה של ליפידים, לחיזוק הגנות נוגדות חמצון אנדוגניות, לנזק היסטופתולוגי פחות חמור ולהחלשה של הפגיעה בכליות18,19,20,21,22.
הראיות הבוחנות באופן ספציפי את השימוש ב-montelukast ב-CI-AKI נותרו מוגבלות. ממצאים ניסיוניים זמינים מצביעים על כך שהשפעותיו הכליתיות עשויות לכלול מודולציה של אותות חמצוניים ודלקתיים. ביטוי מופחת של NADPH oxidase 4 (NOX4), p22phox, ו-NF-κB הוצע כמנגנון אחד שדרכו montelukast עשוי להפחית פגיעה כליתית הקשורה לחומר ניגוד9.
NAC ו-montelukast משפיעים על מסלולים נפרדים חלקית אך חופפים המעורבים בפגיעה כלייתית. NAC תומך בעיקר בהגנה אנטי-אוקסידנטית, בעוד של-montelukast ישנן פעולות אנטי-דלקתיות ואנטי-אוקסידנטיות כאחד. לכן, מתן סימולטני של חומרים אלו עשוי להשפיע על מרכיבים מרובים של הפתופיזיולוגיה של CI-AKI; עם זאת, השאלה האם האינטראקציה ביניהם יוצרת תועלת אדיטיבית או סינרגית לא הוכחה במודלים ניסיוניים18,19,20,21,22.
מחקרים קודמים העריכו בעיקר התערבויות שניתנו לפני החשיפה לחומר ניגוד, בעוד שהראיות בנוגע לטיפולים שהחלו לאחר החשיפה נותרו דלילות. בפרט, מתן מונטelukast יחד עם NAC לאחר החשיפה לחומר ניגוד נחקר באופן מוגבל במודלים ניסיוניים של CI-AKI. לפיכך, המחקר הנוכחי העריך את השפעתם של montelukast ו-NAC, שניתנו לאחר החשיפה לחומר ניגוד בנפרד או בשילוב, ביחס לתפקוד הכליות, מדדי עקה חמצונית ומנגנוני הגנה אנטי-אוקסידנטיים, סממנים ביולוגיים של פגיעה כלייתית ודלקת, ושינויים היסטופתולוגיים במודל של חולדות עם CI-AKI.
פרוטוקול
כל ההליכים הניסויים שכללו בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המקובלות בינלאומית לטיפול בבעלי חיים למעבדה ושימוש בהם, ועמדו בדרישות ה-Animal Research: Reporting of בתוך הגוף (In Vivo) הנחיות לניסויים (ARRIVE). הפרוטוקול הניסויי אושר על ידי הוועדה המקומית לאתיקה של ניסויי בעלי חיים באוניברסיטת Ahi Evran, קרשאהיר (Kırşehir), טורקיה (החלטה מס' 2, ישיבה מס' 12, תאריך: 12 ביוני 2025). נעשה כל מאמץ למזער את סבל בעלי החיים ולהפחית את מספר בעלי החיים ששימשו לאורך המחקר. פרטיהם של כל הריאגנטים והציוד ששימשו רשומים ב- טבלת חומרים.
הכנת כימיקלים
במחקר זה נעשה שימוש ב-Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), indomethacin, iohexol, montelukast sodium ו-NAC. תמיסת L-NAME בריכוז 10 mg/mL הוכנה בתמיסת סליין (normal saline) סטרילית 0.9% באמצעות 1 g של L-NAME ל-100 mL. התמיסה הוכנה באופן טרי ביום המתן והושתמשה ללא אחסון מעבר לאותו יום. להשראת מודל ה-CI-AKI הניסויי, L-NAME ניתן בווריד (IV) במינון של 10 mg/kg. עבור חולדה השוקלת כ-220 g, הכמות המחושבת הייתה כ-2.2 mg, המקבילה לנפח מתן של כ-0.22 mL. Indomethacin הוכנה בתמיסת sodium bicarbonate 5% בריכוז של 10 mg/mL על ידי המסה של 100 mg בנפח סופי של 10 mL. התמיסה עברה ערבוב ב-vortex עד להומוגניות ויזואלית. ה-pH הסופי של תמיסת ה-indomethacin שהוכנה לא נמדד במהלך הניסוי ולכן לא ניתן היה לקבוע אותו רטרוספקטיבית. הליך סטריליזציה או סינון ספציפי עבור תמיסת ה-indomethacin שהוכנה לא תועד ברשומות הניסוייות ולכן לא ניתן היה לדווח עליו רטרוספקטיבית. לא נקבע או הוערך טווח יציבות רשמי; התמיסה הוכנה באופן טרי והושתמשה באותו היום. להשראת מודל ה-CI-AKI הניסויי, indomethacin ניתן בווריד במינון של 10 mg/kg. עבור חולדה השוקלת כ-220 g, הכמות המחושבת הייתה כ-2.2 mg, המקבילה לנפח מתן של כ-0.22 mL.
הפורמולציה המסחרית של iohexol, המכילה 647 mg iohexol/mL וריכוז יוד שווה ערך של 300 mg/mL, הנתנה ללא דילול נוסף. הטמפרטורה המדויקת של ה-iohexol בזמן ההזרקה לא תועדה. לא ניתן היה לאמת באופן מהימן ערך אוסמולליות ספציפי לפורמולציה מתוך הרשומות הניסוייות הזמינות, ולכן הוא אינו מדווח. להשראת מודל ה-CI-AKI הניסויי, iohexol ניתן בווריד במינון של 3 g יוד/kg. בחולדה השוקלת כ-220 g, מינון זה סיפק כ-0.66 g של יוד והתאים לנפח הזרקה של כ-2.2 mL.
הוכנה תרחיף של montelukast sodium ב-0.5% carboxymethyl cellulose (CMC). התרחיף הוכן טרי בכל יום של מתן התרופה ועבר ערבול ב-vortex מיד לפני המנה כדי להבטיח פיזור אחיד של החלקיקים התלויים. מינון ה-montelukast הנדרש עבור כל חיה חושב בנפרד על בסיס משקל הגוף שנמדד בתחילת המחקר, באמצעות הנוסחה הבאה: מינון נדרש (mg) = משקל גוף (kg) × 10 mg/kg. עבור חיה השוקלת כ-220 g, המינון המחושב היה כ-2.2 mg והועבר באמצעות הזנה פומית (oral gavage). התרחיף נבדק חזותית לפני כל מתן, וכל תכשיר שהראה שקיעה עבר ערבול חוזר ב-vortex לפני השימוש.
NAC ניתן לקבוצות הטיפול מהפורמולציה המסחרית שלו ללא דילול נוסף במינון תוך-peritonei של 100 mg/kg. עבור כל בעל חיים, חושב המינון הנדרש באופן פרטני על סמך משקל הגוף שנרשם בתחילת המחקר. בבעל חיים ששקלו כ-220 g, הדבר תאם לכ-22 mg של NAC ולנפח מתן של כ-0.15 mL. לפני מתן המינון, התמיסה נבדקה ויזואלית, ורק תכשירי שהיו צלולים וללא חלקיקים נראים לעין שימשו לניסוי.
כל תמיסה עברה בדיקה חזותית לפני המתן. התמיסות של L-NAME, indomethacin, iohexol ו-NAC נבדקו לאיתור שינויי צבע וחלקיקים נראים לעין. מיד לפני המתן, תרחיף ה-montelukast עבר ערבוב ב-vortex ובדיקה חזותית כדי לאשר אחידות. כל תמיסה שלא עמדה בקריטריוני קבלה אלו לא הייתה בשימוש. במהלך הכנתם והמתנתם של כל הכימיקלים נלבשו חלוקי מעבדה, כפפות מגן והגנה לעיניים. כל ההליכים בוצעו בהתאם לדרישות בטיחות המעבדה והבטיחות הביולוגית המוסדיות.
בחירת בעלי חיים, דיור, קבוצות ניסוי והקצאה רנדומלית
שלושים חולדות ויסטאר לבנות זכרים בוגרות (בגיל 8–12 שבועות; משקל גוף, 200–220 g) הושגו ממעבדת המחקר לבעלי חיים ניסיינים של אוניברסיטת אהי אווראן, קירשהיר, טורקיה. נבחרו חולדות זכרים כדי לשמור על עקביות מתודולוגית עם מודלים של CI-AKI ניסיינים שפורסמו בעבר, וכדי למנוע את הכנסת שלב מחזור הייחמה כמשתנה ביולוגי נוסף. המין לא נבחן כמשתנה ניסייני במחקר הנוכחי. מתקן בעלי החיים החזיק ברישיון גידול/ייצור מספר 184, והחולדות גודלו ונשמרו שם בתנאי מעבדה סטנדרטיים. בעת הגיוס, לבעלי החיים לא היה סטטוס מתועד של נקיים מפתוגנים ספציפיים (SPF) או סיווג בריאותי מיקרוביולוגי רשמי אחר. כל חולדה שכנה בנפרד בכלוב פוליקרבונט במידות של 40 cm × 25 cm × 20 cm, כאשר נסורת אורן קצוצה גס שימשה כמצע. תנאי החדר נשמרו על 24 °C ± 2 °C ולחות יחסית של 35% ± 10% באמצעות מערכת אוטומטית לבקרת סביבה ואוורור. הוחל לוח זמנים של 12 שעות אור/12 שעות חושך, עם תאורה מהשעה 07:00 עד 19:00. לא סופקה העשרה סביבתית ייעודית במהלך שלב ההסתגלות בן 7 הימים או בתקופה הניסיינית שבאה בעקבותיה. מזון כופתיות סטנדרטי למכרסמים ומי ברז היו זמינים ad libitum, למעט תקופה מוגדרת של 16 h של מניעת מים לפני השראת ה-CI-AKI. הרכב המזון היה 24% חלבון גולמי, 3.94% תאית גולמית, 5.08% שומן גולמי, 8.8% אפר גולמי, 1.44% ליזין, 0.61% מתיונין, 1.14% סידן, 0.89% זרחן ו-0.28% נתרן. כל בעלי החיים עברו הסתגלות במשך 7 ימים לפני תחילת ההליכים הניסייניים. תצפיות יומיות נערכו הן במהלך תקופת ההסתגלות והן במהלך התקופה הניסיינית כדי להעריך את המצב הכללי, צריכת מזון ומים, ניידות, יציבה, מראה הפרווה וכל סימן למצוקה. כדי למזער הטיות בבחירה, בעלי החיים חולקו לחמש הקבוצות הניסייניות באמצעות רצף הקצאה אקראית שהופק במחשב, כאשר שש חולדות הוקצו לכל קבוצה. גודל המדגם נקבע על ידי ניתוח עוצמה a priori באמצעות G*Power גרסה 3.1.9.6.
גודל המדגם נקבע באמצעות ניתוח עוצמה (power analysis) מוקדם עבור ניתוח שונות חד-כיווני עם השפעות קבועות (fixed-effects one-way ANOVA) הכולל חמש קבוצות ניסוייות. בהנחה של גודל אפקט (f) של 0.65, שיעור שגיאה מסוג I (α) של 0.05 ועוצמה סטטיסטית של 80%, חושב גודל המדגם הכולל הנדרש כ-30 בעלי חיים, המקבילים לשישה בעלי חיים לכל קבוצה. גודל האפקט (f = 0.65) הונח מראש כייצוג של אפקט בין-קבוצתי כולל גדול עבור ההשוואה בין חמש הקבוצות. החישוב נועד לקבוע את גודל המדגם הנדרש לזיהוי אפקט כולל שכזה, ולא תוכנן באופן ספציפי לזיהוי הבדלים זוגיים קטנים יותר בין קבוצות הטיפול הפעילות. בעל החיים הבודד נחשב ליחידה הניסויית עבור כל הניתוחים.
מלבד טיפול שגרתי, ניטור בריאות יומי והליכים סופיים, בעלי החיים בקבוצת הביקורת לא עברו טיפול או ריסון הקשורים לפרוטוקול, מניעת מים, הזרקות תוורידיות או תוצלומיות, הזנה דרך גרב (oral gavage), או מתן חומר נשאי (vehicle). קבוצת ה-CI-AKI כללה בעלי חיים שבהם הוקם מודל CI-AKI ביום 8 ושלא קיבלו טיפול. קבוצת ה-CI-AKI + Montelukast כללה בעלי חיים שבהם הוקם מודל CI-AKI ובהמשך טופלו ב-montelukast. קבוצת ה-CI-AKI + NAC כללה בעלי חיים שבהם הוקם מודל CI-AKI ובהמשך טופלו ב-NAC. קבוצת ה-CI-AKI + Montelukast + NAC כללה בעלי חיים שבהם הוקם מודל CI-AKI ובהמשך טופלו בשילוב של montelukast ו-NAC. לא קבוצת הביקורת ולא קבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה עברו הליכי דמה (sham) תואמים לטיפול. באופן ספציפי, לא בוצעו בקבוצות אלו טיפול דמה, הזנה דרך גרב דמה, הזרקות טיפול דמה, או מתן חומר נשאי תואם לטיפול. החומרים הנשאיים ששימשו להכנת L-NAME, indomethacin ו-montelukast היו תמיסת סליין נורמלית 0.9%, תמיסת סודיום ביקרבונט 5% ו-0.5% CMC, בהתאמה, כפי שמתואר בהכנת הכימיקלים. NAC ניתן מהפורמולציה המסחרית שלו ללא דילול נוסף, ולא הוכנה עבורו תמיסה נשאית נפרדת. ביום 8, כל בעלי החיים למעט אלו שבקבוצת הביקורת עברו 16 h של מניעת מים, ולאחריהם מתן תוורידי רצוף של L-NAME (10 mg/kg), indomethacin (10 mg/kg), ו-iohexol (3 g iodine/kg) כדי להשרות פגיעה כלייתית חריפה מושרית ניגודיות (contrast-induced acute kidney injury). בקבוצות הטיפול הייעודיות, montelukast (10 mg/kg, הזנה דרך גרב) ו/או NAC (100 mg/kg, הזרקה תוצלומית) ניתןו תחילה שעה אחת לאחר השלמת מתן ה-iohexol ביום 8, מה שמתבגר לכ-1.5 h לאחר מתן ה-L-NAME, ובהמשך ניתןו פעם ביום באותה השעה בימים 9 ו-10.
פרוטוקול למתן תרופה
CI-AKI הוקם בהתאם לפרוטוקול ניסויי שפורסם, המורכב מ-16 h של מניעת מים, ולאחריהן מתן תוורידי רצף של L-NAME, indomethacin ו-iohexol23,24,25. L-NAME ו-indomethacin ניתנו במינון של 10 mg/kg כל אחד, בעוד ש-iohexol ניתן במינון של 3 g iodine/kg. מינוני הטיפול היו 10 mg/kg עבור montelukast sodium ו-100 mg/kg עבור NAC. בחירת המינונים להשראת המודל ולטיפול הונחתה על ידי מחקרים ניסוייים שפורסמו בעבר22,26,27. לא בוצע מחקר מקדימה לקביעת טווח מינונים או אופטימיזציה של המינון. מינוני ה-NAC וה-montelukast נבחרו באופן עצמאי בהתבסס על מחקרים ניסוייים שפורסמו בעבר על כל אחד מהחומרים בנפרד, ולא נגזרו ממחקר למציאת מינון ספציפי לשילוב ביניהם. המינונים שנבחרו לא נועדו לייצג חשיפות שוות מבחינה פרמקולוגית, ולא בוצע ניתוח של תגובה למינון או ניתוח רשמי של אינטראקציה בין תרופות. לא נעשה שימוש בסף מספרי או מעבדתי שנקבע מראש כדי להגדיר השראה מוצלחת של המודל ברמת החיה הבודדת. בנקודת הסיום של המחקר, הקמה מוצלחת של פגיעה כלייתית נתמכה על ידי השינויים ההיסטופתולוגים האופייניים שנצפו בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה בהשוואה לקבוצת הביקורת (Control). ביום 8, כל בעלי החיים למעט אלו שבקבוצת הביקורת עברו תקופה אחת של 16 h של מניעת מים מיד לפני השראת פגיעה כלייתית חריפה מושרית ניגוד (contrast-induced acute kidney injury). מניעת המים לא חזרה על עצמה במהלך שאר התקופה הניסוית. מזון כופתי סטנדרטי נותר זמין ad libitum לאורך כל תקופת מניעת המים. עם השלמת תקופת מניעת המים הבודדת של 16 h, הגישה למי ברז הוחזרה בו-זמנית ו-ad libitum בכל קבוצות הניסוי שסבלו ממניעת מים, לפני מתן החומר הראשון להשראת המודל, L-NAME, ונשמרה למשך שאר התקופה הניסוית. תזמון ותנאי החזרת המים היו זהים בכל הקבוצות שסבלו ממניעת מים. צריכת המים לאחר ההחזרה לא הוגבלה לנפח שהוגדר מראש ולא נמדדה כמותית. לא נמדדו משקלי גוף זוגיים מיד לפני ואחרי תקופת מניעת המים של 16 h; לכן, לא ניתן היה לחשב את אחוז ירידת משקל הגוף הקשורה להתייבשות. תפוקת השתן לא נוטרה כמותית. לאחר החזרת הגישה למים, הוחלה השראת ה-CI-AKI. כל מתן התוורידי הרצף של L-NAME, indomethacin ו-iohexol בוצע דרך וריד זנב צדי באמצעות מחט 26 G המחוברת למזרק סטרילי של 5 mL. לפני המתן התוורידי, הזנב חומם במים למשך מספר דקות כדי להקל על הוויזואליזציה וההתרחבות של ורידי הזנב הצדיים. לאחר כל מתן תוורידי, הוזרם לווריד 0.5 mL של תמיסת סליין סטרילית 0.9%, בנוסף לנפח המתן המחושב של החומר הרלוונטי להשראת המודל. אתר ההזרקה נוטר ויזואלית לאורך כל תהליך המתן וההזרמה כדי לבדוק נפיחות, דליפה או עדות לדליפה חוץ-ורידית (extravasation). L-NAME (במינון 10 mg/kg) ניתן ראשון. חמש עשרה דקות לאחר מתן L-NAME, ניתן indomethacin (במינון 10 mg/kg) תוורידית דרך אותו וריד זנב צדי. חמש עשרה דקות לאחר מתן indomethacin, ניתן iohexol תוורידית דרך אותו וריד זנב צדי במינון של 3 g iodine/kg. עבור כל בעל חיים, מינון ה-iohexol ונפח ההזרקה התואם חושבו באופן אינדיבידואלי בהתבסס על משקל הגוף שנרשם בתחילת המחקר ועל ריכוז יוד מסחרי של 300 mg iodine/mL. הדבר תאם לנפח מתן של 10 mL/kg ולכן, בערך 2.0–2.2 mL עבור חולדות השוקלות 200–220 g. לא נקבע מראש נפח תוורידי מקסימלי מותר המוגדר בפרוטוקול; המתן התוורידי הגדול ביותר של חומר בודד שנעשה במחקר זה היה iohexol במינון 10 mL/kg. Iohexol ניתן לאט לאורך כ-1–2 min. מתן תוורידי מוצלח אומת על ידי היעדר נפיחות נראית, דליפה או דליפה חוץ-ורידית באתר ההזרקה. לא נצפתה דליפה חוץ-ורידית חלקית, ושום הזרקה לא דרשה ניסיון חוזר או מתן מינון חוזר עקב חשד לדליפה חוץ-ורידית. שעה לאחר השלמת מתן ה-iohexol, ניתן לראשונה הטיפול הייעודי לקבוצות הטיפול. מכיוון שמתן ה-iohexol הוחל 30 min לאחר מתן L-NAME והושלם לאורך כ-1–2 min, תחילת הטיפול התרחשה כ-91–92 min (כ-1.5 h) לאחר מתן L-NAME. Montelukast sodium (במינון 10 mg/kg) ניתן באמצעות הזנה דרך פה (oral gavage), בעוד ש-NAC (במינון 100 mg/kg) ניתן תוך-צפקית (intraperitoneally).
הזנה פומית (Oral gavage) בוצעה באמצעות קנולה להזנה מפלדת אל-חלד במידה 22 G. כל חיה נשמרה במצב זקוף, והקנולה להזנה הוכנסה בעדינות דרך הוושט אל תוך הקיבה. במקרים של התנגדות מוגברת, הקנולה נשלפה ומוקמה מחדש לפני המתן. החיה נבחנה לאיתור רפלקס הקאה (regurgitation) במהלך ההזנה ומיד אחריה. לא נצפה רפלקס הקאה או כל עדות אחרת למינון פומית חלקי במהלך ההזנה או מיד אחריה באף אחת מהחיות, ואף חיה לא הוצאה מהמחקר על בסיס חשד למתן פומית לא מוצלח. הזרקות תוך-פעטוניות (Intraperitoneal) בוצעו לרביע הימני התחתון של הבטן. המחט הוכנסה בזווית של כ-30°–45°, ובוצעה שאיבה (aspiration) לפני ההזרקה כדי לוודא שלא חלה כניסה שגויה לכלי דם. אתר ההזרקה נוטר visually במהלך המתן ומיד אחריו כדי לבדוק דליפה, דימום או סיבוכים נראים אחרים. הטיפולים שנקבעו ניתנו פעם ביום באותה שעה בימים 8, 9 ו-10. בהתאם לכך, חיות בקבוצת CI-AKI + Montelukast קיבלו montelukast פעם ביום למשך שלושה ימים רצופים, חיות בקבוצת CI-AKI + NAC קיבלו NAC פעם ביום למשך שלושה ימים רצופים, וחיות בקבוצת CI-AKI + Montelukast + NAC קיבלו הן montelukast והן NAC פעם ביום בהתאם לאותו לוח זמנים של טיפול למשך 3 ימים. כל פעולות השראת המודל והמתן הטיפולים בוצעו על ידי אותו חוקר. משקל הגוף נמדד פעם אחת עבור כל חיה בתחילת המחקר ולא נמדד שוב במהלך תקופת הניסוי. עבור כל חיה, המינון ונפח המתן התואם של כל חומרי השראת המודל והטיפולים במחקר חושבו באופן פרטני באמצעות משקל הגוף שנרשם בתחילת המחקר. כל פרוצדורות ההזרקה הוורידית, התוך-פעטונית וההזנה הפומית בוצעו באמצעות אותה טכניקה סטנדרטית כדי למזער שונות הקשורה למתן החומרים.
הליך ההמתה, נקודות סיום הומניות ואיסוף דגימות
בעלי החיים נבחנו פעם ביום לאורך כל הניסוי כדי לזהות שינויים במצב הכללי, בצריכת מזון ומים, בניידות, בתנוחה, במראה הפרווה ובסימני מצוקה. נקודות הסיום ההומניות שהוגדרו מראש כללו רפיון בולט, חוסר יכולת להגיע למזון או למים הזמינים או לצרוך אותם, תנוחה לא תקינה, ירידה בניידות, פילוארקציה (זקיפת שיער) מתמשכת וכל ביטוי גלוי אחר של מצוקה. בעלי חיים שעמדו באחד מקריטריונים אלו היו אמורים לעבור הרגאנימי מיידי; עם זאת, אף בעל חיים לא עמד בקריטריונים לנקודות הסיום ההומניות במהלך המחקר. ביום ה-11, 24 h לאחר הטיפול האחרון, הושרה הרדמה עמוקה באמצעות מתן תוך-פריטוני של ketamine (80 mg/kg) יחד עם xylazine (10 mg/kg). היעדר תגובת נסיגה של הכף (pedal withdrawal response) שימש לאימות של מישור הרדמה הולם. לאחר שאישרו עומק הרדמה מספיק, נדגמו כ-3–5 mL דם מכל בעל חיים באמצעות דקירה תוך-לבבית. ההרגאנימי הושלם לאחר מכן על ידי דימום עד מוות בעוד בעל החיים נשאר תחת הרדמה עמוקה. היעדר פעילות לבבית ונשימה ספונטנית שימשו לאישור המוות.
דם שנאסף למדידות ביוכימיות של סרום הוכנס למבחנות ללא נוגדי קרישה והושאר עד להשלמת קרישת הדם. לאחר מכן, המבחנות סובבו בצנטריפוגה במהירות של 3,000 × g למשך 10–15 min בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן הופרד פלג הסרום ואוחסן בטמפרטורה של −80 °C עד לניתוח. דגימות המיועדות למדידת גלוטתיון נאספו בנפרד במבחנות המכילות ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). מכיוון שדגימות אלו עברו אנטי-קוואגולציה, הן עובדו ללא שלב קרישה בהתאם לנוהל בדיקת הגלוטתיון המתאים. הפרדת הסרום נחשבה לקבילה כאשר הסרום שהופק היה צלול ולא הראה עדות נראית לעין להמוליזה.
לאחר אישור המוות, בוצעה לפרוטומיה חצצית והכליות משני הצדדים הוסרו בזהירות מכל בעל חיים. רקמות שומן ורקמות חיבור מסביב ננקו מהדגימות. הכליה הימנית נשמרה אך ורק לצורך בדיקה היסטופתולוגית, בעוד הכליה השמאלית הוקצתה לניתוח ביוכימי. רקמה מעורבת מהכליה השמאלית נותחה ללא דיסקציה נפרדת של קליפת הכליה (renal cortex) והמוח (medulla). שתי הכליות טופלו באופן עצמאי, ודגימות מבעלי חיים שונים נשמרו בנפרד לאורך כל תהליך העיבוד ללא איחוד דגימות. הכליה הימנית כולה הוכנסה ל-10% neutral buffered formaldehyde ועובדה לצורך הערכה היסטופתולוגית. נחתכים הכוללים את קליפת הכליה והמוח החיצוני הוכנו ונבחנו בהתאם לנהלים המתוארים בעיבוד ובדירוג ההיסטופתולוגי. כל כליה שמאלית סומנה באופן אינדיבידואלי ונשמרה ב-80 °C- עד להומוגניזציה ובדיקה ביוכימית. לאחר הכריתה, נבדקה שלמות הרקמה באופן מקרוסקופי, וכמות מספקת של רקמה נשמרה לצורך ההערכות ההיסטופתולוגיות והביוכימיות המתוכננות.
החוקר האחראי על השראת המודל ומתן הטיפול לא יכול היה להיות מסווג, כיוון שהקבוצות הניסוייות עברו פרוצדורות שונות. עם זאת, זהות הקבוצות נסתרה מהחוקרים שביצעו את הניתוחים הביוכימיים והסטטיסטיים ומהפתולוג שביצע את ההערכות ההיסטופתולוגיות. כל בעלי החיים שהוכנסו למחקר נשמרו בו ונכללו בניתוחים העוקבים. דגימות ביולוגיות, רקמות מבעלי חיים, מקבעים מבוססי פורמאלדהיד וחומרים כימיים פסולתיים אחרים טופלו תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים. סילוק כל הפסולת הביולוגית והכימית בוצע בהתאם לדרישות המוסדיות לבטיחות ביולוגית וניהול פסולת מסוכנת.
ניתוחים ביוכימיים
מדידות ביוכימיות בוצעו באמצעות סרום, דם עם נוגד קרישה EDTA, והומוגנאטים של רקמת הכליה השמאלית שנאספו מכל חיה. ההליכים מוצגים להלן בהתאם למטריצה הביולוגית ששימשה עבור כל פרמטר. הסרום נסרק עבור urea, חנקן Urea בדם (BUN), creatinine, superoxide dismutase (SOD), ו-malondialdehyde (MDA). Urea, BUN ו-creatinine שימשו כמדדים לתפקוד הכליות, בעוד שפעילות SOD וריכוז MDA הוערכו כפרמטרים של עקה חמצונית. ערכי Urea ו-BUN בסרום התקבלו באמצעות אותה בדיקת enzymatic urease–glutamate dehydrogenase. בשיטה זו, urea עברה הידרוליזה על ידי urease לייצור אמוניה, אשר הגיבה לאחר מכן עם 2-oxoglutarate ו-reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) בנוכחות glutamate dehydrogenase. השיטה האנליטית ששימשה הייתה בדיקת קינטיקה מסוג enzymatic urease–glutamate dehydrogenase. הירידה בבליעה (absorbance) כתוצאה מצריכת NADH נמדדה באופן קינטי באמצעות ספקטרופוטומטר. ריכוז creatinine בסרום נמדד קולורימטרית באמצעות אנלייזר ביוכימי אוטומטי. פעילות SOD בסרום נמדדה קולורימטרית באמצעות ערכה מסחרית על אותו אנלייזר ביוכימי אוטומטי. בדיקת ה-SOD התבססה על ייצור רדיקלים של superoxide על ידי מערכת xanthine–xanthine oxidase ותגובתם עם 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride ליצירת תוצר formazan צבעוני. הבליעה בנקודת הסיום נמדדה ב-505 nm, ופעילות ה-SOD בויתאה כ-U/mL. ריכוז MDA בסרום נקבע קולורימטרית באמצעות תגובת thiobarbituric acid. דגימות סרום עורבבו עם trichloroacetic acid קר להשקעת חלבונים, והמשקב שהתקבל הופרד על ידי סנטריפוגציה. שלב סנטריפוגציה זה בוצע ב-7,500 × g למשך 5 min ב-4 °C. התסמין (supernatant) הגיב עם thiobarbituric acid ב-90 °C למשך 60 min, קורר ונמדד ב-532 nm. ריכוזי MDA חושבו מעקומת הכיול המתאימה ובויתאו כ-nmol/mL. ניתוח Glutathione (GSH) בוצע באמצעות דם עם נוגד קרישה EDTA. חלבונים הושקעו עם trichloroacetic acid, והדגימות לאחר הסרת החלבונים נותחו קולורימטרית בשיטת Ellman משופרת. הדגימות שולבו עם 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) בבופר Tris בריכוז 500 mM ב-pH 8.2. תגובה של קבוצות התיול של GSH עם DTNB ייצרה תוצר צבעוני, והבליעה נרשמה ב-412 nm. פעילות Catalase (CAT) נקבעה באמצעות הליך קולורימטרי דו-שלבי. הדגימות עברו תחילה אינקובציה עם כמות ידועה של hydrogen peroxide, ש-catalase המירה למים וחמצן מולקולרי. לאחר סיום התגובה האנזימטית, נמדד hydrogen peroxide שיורי באמצעות ריאגנט כרומוגני. הבליעה נרשמה ב-405 nm, ופעילות ה-CAT דווחה כ-U/mL. עבור מדידות רקמת כליה, הכליה השמאלית מכל חיה שימשה כרקמה מעורבת ללא הפרדה בין הקורטקס למדולה. כפי שצוין בהליך, הכליה הימנית נשמרה אך ורק לצורך הערכה היסטופתולוגית. דגימות השייכות לחיות בודדות עובדו באופן עצמאי ולא נערבבו בשום שלב. כל דגימת כליה שמאלית עברה הומוגניזציה על קרח בבופר פוספט 50 mM ב-pH 7.4 ביחס רקמה-לבופר של 1:10 (w/v). הומוגנאט רקמת כליה ספציפי לחיה אחת נוצר עבור כל חולדה. אליקוטים נפרדים של הומוגנאט זה שימשו למדידות השונות של רקמת הכליה, כדי להבטיח שכל הפרמטרים נגזרו מאותה חיה בודדת. ההומוגנאטים של רקמת הכליה שהתקבלו עברו סנטריפוגציה ב-14,000 × g למשך 10 min ב-4 °C. לאחר הסנטריפוגציה, התסמין שהתקבל מכל חיה נאסף בנפרד וחולק לאליקוטים עבור ניתוחי רקמת הכליה המתוכננים. ריכוזי Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-1 beta (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), cystatin C, ו-KIM-1 בתסמיני רקמת הכליה נמדדו באמצעות ערכות enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ספציפיות לחולדות. הבדיקות בוצעו בהתאם לפרוטוקולי היצרן. תנאי האינקובציה היו זהים עבור בדיקות ה-ELISA של TNF-α, IL-1β, IL-6, cystatin C, ו-KIM-1. עבור כל בדיקה, הדגימות וריאגנטי ה-ELISA עברו אינקובציה למשך 1 h ב-37 °C; לאחר חמישה מחזורי שטיפה, נוספו תמיסות סובסטרט A ו-B והן עברו אינקובציה למשך 10 min ב-37 °C. בקצרה, סטנדרטים ותסמיני רקמת כליה נוספו לבארים המצופים מראש בנוגדנים, ולאחריהם הנוגדן הגלאי הביוטינילי Corresponding וקומפלקס streptavidin–horseradish peroxidase. לאחר שלבי האינקובציה המפורטים, רכיבים לא קשורים הוסרו באמצעות שוטפת מיקרו-פלט אוטומטית. לאחר מכן נוספה תמיסת הסובסטרט, ותגובת הצבע הופסקה באמצעות תמיסת עצירה חומצית. הבליעה נמדדה ב-450 nm באמצעות קורא מיקרו-פלט, וריכוזי האנליטים חושבו מעקומות הסטנדרט המתאימות. מדידות ELISA של רקמת כליה בוצעו בשכפולים (duplicate). עבור כל אנליט, חושב הממוצע של שתי בארות השכפולים הטכניים כדי לקבל ערך בודד ברמת החיה. בארות שכפולים טכניים ואליקוטים נפרדים שהתקבלו מאותו הומוגנאט ספציפי לחיה לא נחשבו לתצפיות עצמאיות. כל המדידות הביוכימיות בוצעו תחת תנאים סטנדרטיים ספציפיים לבדיקה. דגימות סרום, דם עם נוגד קרישה EDTA ודגימות רקמת כליה עובדו בנפרד בהתאם לדרישות השיטות האנליטיות המתאימות. החוקרים שביצעו את הניתוחים הביוכימיים היו עיוורים להקצאת הקבוצות. החיה הבודדת, ולא כל דגימת סרום, דגימת דם, דגימת כליה, אליקוט הומוגנאט או באר שכפול טכני, נחשבה ליחידה הניסויית. בהתאם לכך, שש תצפיות עצמאיות ברמת החיה נכללו בניתוח הסטטיסטי עבור כל קבוצה ניסויית.
עיבוד ודירוג היסטופתולוגיים
דגימות מהכליה הימנית הוכנו להערכה מיקרוסקופית באמצעות עיבוד היסטולוגי שגרתי. הכליה הימנית השלמה מכל בעל חיים הוטבלה בפורמלדה 10% בבफर ניטרלי למשך 72 h בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, בוצע ייבוש של הרקמה באופן רציף באתנול בריכוזים של 50%, 70%, 80%, 96%, ו-100%, כאשר כל ריכוז הוחל למשך 1 h. לאחר מכן, הדגימות נחשפו לשני מקבצי קסילן למשך 30 min לכל מקבץ לפני הטמעה בפרפין. באמצעות מיקרוטום סיבובי, הוסרו מהבלוקים של הפרפין חתכים בעובי 5 µm שכללו הן את קליפת הכליה (renal cortex) והן את המדולה החיצונית (outer medulla).
עבור צביעה בהמטוקסילין ואאוזין (HE), נטולו מהחתכים את הפרפין והורטבו מחדש, נחשפו להמטוקסילין למשך 5 min, ונשטפו תחת מי ברז זורמים למשך 5 min נוספים. אלכוהול חומצי שימש לבידול, ולאחריו עברו החתכים תהליך כחול (bluing) במי אמוניה למשך 1 min ונצבעו בצביעה נגדית באאוזין למשך 2 min. החתכים הצבועים הובשרו לאחר מכן בריכוזי אלכוהול עולים, הבהירו באמצעות xylene, ונקבעו לצמיתות תחת כיסוי זכוכית.
חתכים שיועדו לצביעת Masson’s trichrome עברו באופן דומה דה-פראפיניזציה ורי-הידרציה. טיפול במורדנט בוצע במשך 60 min ב-56 °C, ולאחריו שטיפה תחת מי ברז זורמים במשך 10 min. לאחר מכן, החתכים טופלו ברצף ב-Weigert’s iron hematoxylin למשך 10 min, תמיסת Biebrich scarlet–acid fuchsin למשך 15 min, תמיסת phosphotungstic acid למשך 10 min, ותמיסת aniline blue למשך 10 min. לאחר טבילה ב-1% acetic acid למשך 5 min, החתכים עברו דהידרציה, הבהרה ב-xylene והרטבה עם זכוכית כיסוי.
לפני ההערכה המיקרוסקופית, נבדקה נאותות הצביעה בנפרד עבור כל שיטה. חתכים שנצבעו ב-HE נחשבו למתאימים כאשר פרטי הגרעין והניגודיות הציטופלזמית היו ניתנים להבחנה בבירור, בעוד שחתכים שנצבעו ב-Masson’s trichrome התקבלו כאשר ניתן היה להדמות בבירור מבני רקמה חיבורית. עבור כל בעל חיים, נבחנו שלושה חתכים שנצבעו ב-HE ושלושה חתכים שנצבעו ב-Masson’s trichrome. חמישה שדות מיקרוסקופיים שנבחרו באופן אקראי הוערכו בכל חתך באמצעות עדשה של 40×. בהתאם לכך, נבחנו 15 שדות מיקרוסקופיים לכל שיטת צביעה עבור כל בעל חיים. כל הבדיקות המיקרוסקופיות בוצעו באמצעות אותה עדשה ובתנאי הערכה סטנדרטיים בכל בעלי החיים ובכל הקבוצות הניסוייות. חתכים שנצבעו ב-Masson’s trichrome הוערכו באופן איכותני עבור התפלגות והשקעה של קולגן אינטרסטיציאלי, הצטברות מטריקס חוץ-תאי ומבנה טובולו-אינטרסטיציאלי. חתכים אלו לא שימשו ליצירת ציוני הפגיעה ההיסטופתולוגית החצי-כמותיים 0–3. פוטומיקרוגרפים נבחרים שנצבעו ב-HE וב-Masson’s trichrome הושגו באמצעות עדשה של 40×, וסרגל קנה מידה של 100 µm נכלל בכל תמונה נבחרת. פוטומיקרוגרפים אלו הושגו למטרות הדגמה ולא נחשבו לתצפיות עצמאיות בדירוג ההיסטופתולוגי או בניתוחים הסטטיסטיים. כל ההערכות ההיסטופתולוגיות בוצעו על ידי פתולוג מנוסה אחד שנשאר עיוור לזהות הקבוצות הניסוייות. השימוש בבודק עיוור יחיד נועד להגביל את הטיית ההערכה והשונות המיוחסת להבדלים בין בודקים. נמק טובולרי, התרחבות טובולרית, דגנרציה תאית וגודש וסקולרי דורגו באופן חצי-כמותי בחתכי כליה שנצבעו ב-HE, בהתאם למערכת שעובדה ממודלים של פגיעה כלייתית שפורסמו בעבר28,29. עבור כל פרמטר, הציונים נעו בין 0 ל-3, בהתאמה לנזק היסטופתולוגי חסר, קל, בינוני וחמור. עבור כל בעל חיים, הממצאים מחמשת השדות המיקרוסקופיים שנבחנו בכל אחד משלושת החתכים שנצבעו ב-HE, המהווים 15 שדות בסך הכל, נשקלו יחד כדי להקצות ציון בודד של 0–3 עבור כל פרמטר היסטופתולוגי. כך, כל בעל חיים תרם ציון אחד עבור נמק טובולרי, התרחבות טובולרית, דגנרציה תאית וגודש וסקולרי. חתכים היסטולוגיים ושדות מיקרוסקופיים נחשבו כדגימות-משנה בתוך בעל החיים ולא נחשבו לתצפיות עצמאיות. בתוך כל חתך, שדות מיקרוסקופיים נבחרו באופן אקראי מאזורי קורטקס כלייתי ומדולה חיצונית דומים כדי להסדיר את הדגימה האנטומית בין בעלי החיים והקבוצות הניסוייות. בעל החיים הבודד, ולא כל כליה, חתך היסטולוגי או שדה מיקרוסקופי, נחשב ליחידה הניסויית. בהתאם לכך, שש תצפיות עצמאיות ברמת בעל החיים נכללו בניתוח הסטטיסטי עבור כל קבוצה ניסויית. הערכים המוצגים ב-Table 3 מייצגים את ממוצעי הקבוצה שחושבו מהציונים האישיים ברמת בעל החיים של ששת בעלי החיים בכל קבוצה ניסויית.
ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי. החיה הבודדת נחשבה ליחידה הניסויית עבור כל הניתוחים הסטטיסטיים. כל קבוצה ניסויית כללה שש חיות בלתי תלויות (n = 6 לקבוצה). חזרות טכניות, בארי בדיקה, חתכי רקמה ושדות מיקרוסקופיים לא נחשבו לתצפיות בלתי תלויות ולא שימשו להגדלת גודל המדגם הסטטיסטי. משתנים רציפים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). נורמליות הוערכה בנפרד בתוך כל קבוצה ניסויית באמצעות מבחן Shapiro–Wilk, והומוגניות של השונויות נבחנה באמצעות מבחן Levene. בהינתן מערך ניסויי מאוזן לחלוטין עם גדלי מדגם שווים בין הקבוצות, נעשה שימוש בניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) להשוואה בין הקבוצות. השוואות זוגיות בוצעו באמצעות מבחן השוואות מרובות post hoc של Duncan. חריגים פוטנציאליים הוערכו באמצעות בחינה גרפית של תרשימי קופסה ובדיקה של תצפיות בודדות. אף תצפית לא נחשבה כמייצגת שגיאת מדידה או תוצאה ניסויית לא תקפה, ואף נקודת נתונים לא הוצאה מסיבות סטטיסטיות. ערך p-value < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.
תוצאות
סמנים לתפקוד כליות בנסיוב (urea, blood urea nitrogen ו-creatinine)
עיצוב הניסוי, חלוקת בעלי החיים לקבוצות, לוח הזמנים של הטיפול ולוח הזמנים של איסוף הדגימות במחקר הנוכחי מסוכמים ב איור 1. נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הקבוצות ברמות השתן בנורם (urea), BUN וקריאטינין בסרום (p = 0.003, p = 0.003, ו-p = 0.002, בהתאמה). רמת השתן בנורם הממוצעת בסרום הייתה 67.43 mg/dL ± 53.11 mg/dL בקבוצת הביקורת ועלתה ל-606.71 mg/dL ± 429.42 mg/dL בקבוצת ה-CI-AKI. באופן דומה, רמת ה-BUN הממוצעת עלתה מ-31.51 mg/dL ± 24.82 mg/dL בקבוצת הביקורת ל-268.63 mg/dL ± 190.84 mg/dL בקבוצת ה-CI-AKI. רמות הקריאטינין בסרום עלו גם הן באופן ניכר, מ-0.60 mg/dL ± 0.05 mg/dL בקבוצת הביקורת ל-3.27 mg/dL ± 2.14 mg/dL בקבוצת ה-CI-AKI. השוואות post hoc של Duncan הדגימו כי רמות השתן בנורם, ה-BUN והקריאטינין בסרום היו נמוכות באופן מובהק בכל אחת מקבוצות הטיפול – קבוצות ה-CI-AKI + Montelukast, CI-AKI + NAC, ו-CI-AKI + Montelukast + NAC – מאשר בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה (כל ה- p < 0.05). נתונים עבור סממני תפקוד כליות בסרום מוצגים בטבלה 1.
מדדי עקה חמצונית ופעילות אנזימי נוגדי חמצון
נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הקבוצות ברמות ה-SOD, GSH, CAT ו-MDA (p = 0.044, p = 0.001, p = 0.003, ו-p = 0.001, בהתאמה; Table 1). ניתוח post hoc של דנקן (Duncan) הראה כי רמות ה-GSH היו גבוהות באופן מובהק בקבוצות ה-montelukast, ה-NAC והטיפול המשולב מאשר בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה (כולם p < 0.05). לקבוצת השילוב הייתה גם רמת GSH גבוהה באופן מובהק מקבוצת הביקורת (Control) (p < 0.05). עם זאת, לא נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין קבוצת השילוב לבין אחת מקבוצות המונותרפיה או בין שתי קבוצות המונותרפיה (כולם p > 0.05). רמת ה-SOD הנמוכה ביותר נצפתה בקבוצת ה-CI-AKI (92.23 U/mL ± 16.37 U/mL), בעוד שקבוצת הביקורת הראתה 147.81 U/mL ± 33.27 U/mL. רמות ה-GSH היו הנמוכות ביותר בקבוצת ה-CI-AKI (66.05 mmol/L ± 24.72 mmol/L) והגבוהות ביותר בקבוצת ה-CI-AKI + Montelukast + NAC (172.44 mmol/L ± 60.48 mmol/L). פעילות ה-CAT הייתה הגבוהה ביותר בקבוצת הביקורת (93.35 U/mL ± 18.75 U/mL) והנמוכה ביותר בקבוצת ה-CI-AKI (33.22 U/mL ± 17.07 U/mL). לגבי רמות ה-MDA, הערך הגבוה ביותר נצפה בקבוצת ה-CI-AKI (54.13 nmol/mL ± 19.37 nmol/mL), בעוד שהערך הנמוך ביותר נרשם בקבוצת ה-CI-AKI + NAC (21.53 nmol/mL ± 5.07 nmol/mL). נתונים הנוגעים למדדי עקה חמצונית ולפעילויות של אנזימי נוגדי חמצון מוצגים ב-Table 1.
סמני ביולוגיים לפגיעה כלייתית ודלקת (KIM-1, Cystatin C, TNF-α, IL-1β, ו-IL-6)
נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הקבוצות ביחס לרמות של cystatin C כלייתי, IL-6, KIM-1, TNF-α ו-IL-1β (p < 0.001, p = 0.008, p = 0.027, p = 0.006, ו-p < 0.001, בהתאמה; Table 2). השוואות post hoc של Duncan הראו שרמות ה-cystatin C, IL-6, KIM-1, TNF-α ו-IL-1β היו נמוכות באופן מובהק בכל אחת מקבוצות הטיפול, קבוצות ה-CI-AKI + Montelukast, ה-CI-AKI + NAC וה-CI-AKI + Montelukast + NAC, מאשר בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה (כל ה-p < 0.05). עבור IL-1β, נצפה הבדל מובהק סטטיסטית גם בין קבוצות ה-CI-AKI + Montelukast וה-CI-AKI + NAC (p < 0.05). רמות ה-cystatin C הכלייתי היו הגבוהות ביותר בקבוצת ה-CI-AKI (18.43 ng/mL ± 1.06 ng/mL), בעוד שקבוצת הביקורת הראתה ערך של 10.30 ng/mL ± 0.78 ng/mL. באופן דומה, רמות ה-IL-6 היו הגבוהות ביותר בקבוצת ה-CI-AKI (13.41 ng/L ± 2.14 ng/L) והנמוכות ביותר בקבוצת הביקורת (9.29 ng/L ± 2.70 ng/L). רמות ה-KIM-1 היו הגבוהות ביותר בקבוצת ה-CI-AKI (3.07 ng/mL ± 0.36 ng/mL), בהשוואה ל-2.25 ng/mL ± 0.54 ng/mL בקבוצת הביקורת. באופן דומה, רמות ה-TNF-α היו הגבוהות ביותר בקבוצת ה-CI-AKI (161.69 ng/L ± 26.14 ng/L), בעוד שהנמוכות ביותר נצפו בקבוצת הביקורת (95.49 ng/L ± 16.98 ng/L). רמות ה-IL-1β היו הגבוהות ביותר בקבוצת ה-CI-AKI (9.28 ng/mL ± 0.68 ng/mL), בעוד שהערך הנמוך ביותר נצפה בקבוצת ה-CI-AKI + Montelukast (7.34 ng/mL ± 0.57 ng/mL). נתונים הנוגעים לסממנים ביולוגיים של פגיעה כלייתית ודלקת מוצגים ב-Table 2. חשוב לציין כי למרות שחלק מערכי הסממנים הביוכימיים בקבוצת ה-CI-AKI + Montelukast + NAC היו גבוהים יותר מבחינה מספרית מאלו של קבוצת ה-CI-AKI + Montelukast, השוואות post hoc של Duncan לא הראו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין שתי קבוצות טיפול אלו עבור אף אחד מהמשתנים הביוכימיים שנבחנו, כולל פרמטרים של עקה חמצונית, סממנים ביולוגיים של פגיעה כלייתית וסממנים ביולוגיים של דלקת (p > 0.05).
הערכה היסטופתולוגית
ממצאים היסטופתולוגיים
חתכי כליה שנצבעו ב-HE הראו מבנה כלייתי שנשמר בקבוצת הביקורת (Control), עם מורפולוגיה תקינה של הגלומרולוֹמי והשפופרתוֹת. לעומת זאת, קבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה הראתה שינויים היסטופתולוגיים בולטים, כולל פגיעה באפיתל השפופרתות, דגנרציה תאית נרחבת, התרחבות שפופרתית, שיירי תאים בתוך חללי השפופרות וגודש וסקולרי. שינויים נמקריים היו ניכרים במיוחד במקטעי השפופרות הפרוקסימליים. בקבוצת ה-CI-AKI + Montelukast, חומרת הפגיעה השפופרתית פחתה בהשוואה לקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, אם כי שינויים דגנרטיביים מוקדיים נותרו ניכרים. באופן דומה, קבוצת ה-CI-AKI + NAC הראתה שימור טוב יותר של שלמות האפיתל השפופרתי ואזורי נמק מעטים יותר. בבדיקה היסטופתולוגית איכותית, המבנה הכלייתי נראה שמור בקבוצת ה-CI-AKI + Montelukast + NAC, עם מבנים קורטיקליים ומדולריים שנשמרו במידה רבה, ונמק שפופרתי, התרחבות שפופרתית, דגנרציה תאית וגודש וסקולרי מוגבלים יחסית. חתכים שנצבעו ב-Masson’s trichrome חשפו התפלגות תקינה של קולגן אינטרסטיציאלי בקבוצת הביקורת. בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, נצפו השבחה של שקיעת קולגן אינטרסטיציאלי, חוסר ארגון במבנה הטוובולו-אינטרסטיציאלי והצטברות של מטריקס חוץ-תאי. שינויים אלו נראו פחות בולטים בקבוצות הטיפול, כולל קבוצת הטיפול המשולב, בהשוואה לקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה. חתכי כליה נבחרים שנצבעו ב-HE וב-Masson’s trichrome הממחישים ממצאים אלו מוצגים ב-איור 2.
דירוג היסטופתולוגי חצי-כמותי
הערכה היסטופתולוגית חצי-כמותית הראתה כי הציונים עבור נמק של הצינוריות (tubular necrosis), התרחבות צינוריות (tubular dilatation), דגנרציה תאית וגודש כלי דם היו הגבוהים ביותר בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה. הציונים הממוצעים בקבוצה זו היו 2.67, 2.83, 2.67 ו-2.50, בהתאמה. הציונים הממוצעים הגבוהים יחסית, שהתקרבו לגבול העליון של סולם ה-0–3, היו עקביים עם השינויים הצינוריים והכליים הנרחבים והחמורים שנצפו בבדיקה היסטופתולוגית איכותית באותה קבוצה. לעומת זאת, כל הפרמטרים היו חסרים בקבוצת הביקורת (Control). ציוני פגיעה נמוכים יותר נצפו בכל קבוצות הטיפול בהשוואה לקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה. קבוצת ה-CI-AKI + Montelukast הראתה ציונים ממוצעים של 1.33 עבור נמק של הצינוריות, 1.50 עבור התרחבות צינוריות, 1.17 עבור דגנרציה תאית ו-1.00 עבור גודש כלי דם. הערכים המקבילים בקבוצת ה-CI-AKI + NAC היו 1.17, 1.17, 0.83 ו-0.83, בהתאמה. מבחינה מספרית, ציוני הפגיעה ההיסטופתולוגית הממוצעים הנמוכים ביותר נצפו בקבוצת ה-CI-AKI + Montelukast + NAC, עם ערכים ממוצעים של 0.50, 0.67, 0.50 ו-0.17 עבור נמק של הצינוריות, התרחבות צינוריות, דגנרציה תאית וגודש כלי דם, בהתאמה. נתוני הדירוג ההיסטופתולוגי המפורטים מוצגים ב-Table 3.
הנתונים הגולמיים העומדים בבסיס כל הניתוחים הביוכימיים וההיסטופתולוגיים, ותמונות ההיסטולוגיה המקוריות ללא חיתוך בצביעות HE ו-Masson’s trichrome, מסופקים כ- קובץ משלים 1.
איור 1: עיצוב ניסויי ולוח זמנים של המחקר. ייצוג סכמטי של זרימת העבודה הניסוית. שלושים חולדות זכר בוגרות מסוג Wistar חולקו אקראית לחמש קבוצות (n = 6 לכל קבוצה) לאחר תקופת אקלמיזציה של 7 ימים. קבוצת הביקורת לא עברה הרעבה ממים, השראה של CI-AKI או טיפול. שאר הקבוצות עברו תקופה בודדת של הרעבה ממים למשך 16 h, ולאחריה מתן תוורידי רצוף של L-NAME (10 mg/kg), indomethacin (10 mg/kg) ו-iohexol (3 g iodine/kg) כדי להשרות CI-AKI. שעה לאחר מתן ה-iohexol, קבוצות הטיפול הייעודיות קיבלו montelukast (10 mg/kg, דרך הגavage), NAC (100 mg/kg, הזרקה תוך-peritoneal), או את שניהם פעם ביום בימים 8–10, בעוד שקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה לא קיבלה טיפול תרפויטי. כל הקבוצות עברו הליכים סופיים ואיסוף דגימות ביום 11. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: חתכים מייצגים של כליה צבועים ב-HE וב-Masson’s trichrome מקבוצות הניסוי. חתכים מייצגים של כליה צבועים ב-HE וב-Masson’s trichrome שהתקבלו מקבוצות ה- (A) ביקורת, (B) CI-AKI, (C) CI-AKI + Montelukast, (D) CI-AKI + NAC, ו-(E) CI-AKI + Montelukast + NAC. חתכים צבועים ב-HE (שורה עליונה) מדגימים מבנה כלייתי שמור בקבוצת הביקורת, בעוד שקבוצת ה-CI-AKI מראה נמק טובולרי בולט (*), התרחבות טובולרית (+), דגנרציה תאית (×) וגודש וסקולרי (↑). שינויים היסטופתולוגיים אלו נראים מומתנים בחתכים מייצגים מקבוצות הטיפול בהשוואה לאלו של קבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה. חתכים צבועים ב-Masson’s trichrome (שורה תחתונה) מראים הצטברות מוגברת של קולגן אינטרסטיציאלי וחוסר ארגון טובולו-אינטרסטיציאלי בקבוצת ה-CI-AKI, בעוד ששינויים אלו נראים פחות בולטים בחתכים המייצגים מקבוצות הטיפול. סרגל קנה מידה = 100 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| משתנה | ביקורת | פגיעה חריפה בכליות לאחר חומר ניגוד (CI-AKI) | פגיעה חריפה בכליות לאחר חומר ניגוד עם מורבידיות (CI-AKI+M) | CI-AKI+NAC | CI-AKI+NAC+M | p |
| urea (מג/דצילליטר) | 67.43±53.11a | 606.71±429.42b | 105.89±28.63a | 243.14±135.99a | 293.61±212.05a | 0.003 |
| BUN (מ"ג/ד"ל) | 31.51±24.82a | 268.63±190.84b | 51.53±14.69a | 129.54±73.54a | 108.38±87.36a | 0.003 |
| קריאטינין (מ"ג/דצילטר) | 0.60±0.05a | 3.27±2.14b | 0.61±0.12a | 1.53±1.17a | 1.28±0.55a | 0.002 |
| SOD (U/mL) | 147.81±33.27a | 92.23±16.37b | 130.96±42.19a | 137.87±31.95a | 141.71±30.27a | 0.044 |
| GSH (ממול/ליטר) | 124.29±21.24b | 66.05±24.72a | 133.87±26.95סרטן השלפוחית | 139.31±30.10סרטן השריד (bc) | 172.44±60.48גב | 0.001 |
| CAT (U/mL) | 93.35±18.75כ | 33.22±17.07a | 58.67±32.95אב | 52.64±19.97ab | 75.46±26.85bc | 0.003 |
| MDA (נמול/מ"ל) | 23.42±13.48a | 54.13±19.37b | 22.40±14.81a | 21.53±5.07a | 37.01±9.29a | 0.001 |
| בכל שורה, קבוצות החולקות לפחות אות אחת בתוספת עילית לא היו שונות באופן מובהק, בעוד שקבוצות ללא אות משותפת בתוספת עילית היו שונות באופן מובהק על פי מבחן פוסט-הוק של דנקן (p < 0.05). | ||||||
טבלה 1: פרמטרים ביוכימיים ושל עקה חמצונית בקבוצות הניסוי. הבדלים זוגיים מובהקים: Urea, BUN, Creatinine (CREA), SOD, ו-MDA, בין CI-AKI לבין Control, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC, ו-CI-AKI+M+NAC; GSH, בין CI-AKI לכל שאר הקבוצות ובין Control ל-CI-AKI+M+NAC; CAT, בין Control לבין CI-AKI, CI-AKI+M, ו-CI-AKI+NAC, ובין CI-AKI ל-CI-AKI+M+NAC. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 6) ונותחו באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן post hoc של Duncan. ערכים ללא אות עלית משותפת נבדלים באופן מובהק (p < 0.05).
| משתנה | בקרה | CI-AKI | CI-AKI+M | CI-AKI+NAC | CI-AKI+NAC+M | p |
| Cystatin C (ng/mL) | 10.30±0.78a | 18.43±1.06b | 10.90±1.13a | 11.00±0.59a | 11.13±0.84a | <0.001 |
| IL-6 (ng/L) | 9.29±2.70a | 13.41±2.14b | 10.24±0.86a | 10.66±0.83a | 10.85±1.63a | 0.008 |
| KIM-1 (ng/mL) | 2.25±0.54a | 3.07±0.36b | 2.39±0.60a | 2.45±0.33a | 2.45±0.17a | 0.027 |
| TNF-α (ng/L) | 95.49±16.98a | 161.69±26.14b | 110.26±38.12a | 119.42±35.35a | 127.76±15.13a | 0.006 |
| IL-1β (ng/mL) | 7.65±0.53ab | 9.28±0.68c | 7.34±0.57a | 8.24±0.73b | 8.11±0.72ab | <0.001 |
| בכל שורה, קבוצות בעלות אות עילית אחת לפחות משותפת לא היו שונות באופן מובהק, בעוד שקבוצות ללא אות עילית משותפת היו שונות באופן מובהק על פי מבחן post hoc של Duncan (p < 0.05). | ||||||
טבלה 2: רמות של סממנים ביולוגיים לפגיעה כלייתית ולדלקת בקבוצות הניסוי. הבדלים זוגיים מובהקים: cystatin C, IL-6, KIM-1 ו-TNF-α, בין CI-AKI לבין Control, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC ו-CI-AKI+M+NAC; IL-1β, בין CI-AKI לכל שאר הקבוצות ובין CI-AKI+M ל-CI-AKI+NAC. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 6) ונותחו באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן post hoc של Duncan. ערכים ללא אות עלית משותפת שונים באופן מובהק (p < 0.05).
| קבוצות | נמק טובולי | התרחבות טובולרית | דגנרציה תאית | גודש וסקולרי |
| ביקורת | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CI-AKI | 2.67 | 2.83 | 2.67 | 2.5 |
| CI-AKI+M | 1.33 | 1.5 | 1.17 | 1 |
| CI-AKI+NAC | 1.17 | 1.17 | 0.83 | 0.83 |
| CI-AKI+NAC+M | 0.5 | 0.67 | 0.5 | 0.17 |
טבלה 3: השוואה של פרמטרי נזק היסטופתולוגי ברקמת כליה בקבוצות הניסוי. ציוני פגיעה היסטופתולוגית חצי-כמותיים המבוססים על צביעת HE מוצגים כממוצעי קבוצה (n = 6 בעלי חיים/קבוצה). הציונים דורגו כ-0 (ללא נזק), 1 (קל), 2 (בינוני), ו-3 (נזק חמור), כאשר ציונים גבוהים יותר מעידים על פגיעה היסטופתולוגית רבה יותר.
קובץ משלים 1: נתונים התומכים בממצאי מחקר זה.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.
דיון
מחקר ניסויי זה על CI-AKI העריך טיפול לאחר חשיפה לחומר ניגוד באמצעות montelukast, NAC, או שילוב שלהם, תוך בדיקת תפקוד הכליות, פרמטרים של עקה חמצונית, תגובות דלקתיות, סמנים ביולוגיים לפגיעה כלייתית ותוצאות היסטופתולוגיות. חשיפה לחומר ניגוד גרמה לעליות משמעותיות ברמות השתן בנסיוב (urea), BUN וקריאטינין בנסיוב, ולוותה בשינויים שליליים בפרמטרים של עקה חמצונית ובסמנים ביולוגיים דלקתיים. רמות מוגברות של KIM-1 ו-cystatin C סיפקו ראיות נוספות לפגיעה כלייתית.
טיפול לאחר חשיפה לחומר ניגוד ב-montelukast, NAC, או בשילוב ביניהם, היה קשור לשינויים חיוביים במספר פרמטרים שנבחנו. עם זאת, השילוב לא הראה עליונות עקבית על טיפול במונותרפיה של montelukast בתוצאות הביוכימיות. יחד, תצפיות אלו עולות בקנה אחד עם מעורבות של עקה חמצונית ודלקת ב-CI-AKI, ומצביעות על כך שהתערבויות הפועלות על תהליכים אלו עשויות להפחית את הפגיעה הכlyתית, אם כי מסלולי האיתות הבסיסיים לא נבחנו ישירות במחקר הנוכחי1,30.
העלייה הבולטת ברמות השתן (urea) בנסיוב, ב-BUN ובקריאטינין לאחר מתן חומר הניגוד תומכת בהשראה מוצלחת של תפקוד כלייתי לקוי במודל ניסויי זה של CI-AKI. חשיפה לחומר ניגוד עלולה לפגוע בתפקוד הכליות באמצעות תהליכים שזורים הכוללים כיווץ כלי דם תוך-כלייתי, היפוקסיה במוך הכליה (medullary hypoxia), פגיעה חמצונית ונזק לתאי הרנולות. הירידה הנובעת מכך בפרפוזיה הכלייתית ובסינון הגלומרולרי עשויה להגביל את סילוק תוצרי פסולת חנקניים, ובכך להעלות את ריכוזיהם במחזור הדם. השינויים בתפקוד הכליות שנצפו בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה עקביים עם אלו שדווחו במחקרים ניסוייים קודמים1,30,31,32.
שונות תוך-קבוצתית ניכרת נצפתה עבור urea בנסיוב ו-BUN בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, כפי שבא לידי ביטוי בסטיות התקן הגדולות יחסית. פיזור זה עשוי לשקף הבדלים ביולוגיים בין-אינדיבידואליים ברגישות לפרוטוקול השראת ה-CI-AKI הרגיש, כולל שונות בתגובה הכלית למחסור במים, עיכוב של נתיבי nitric oxide ופרוסטגלאנדינים, וחשיפה לחומר ניגוד. ייתכן שגם הבדלים מינוריים ברזרבה התפקודית הכלית ובתגובות הפיזיולוגיות בין בעלי החיים תרמו לחומרת הפגיעה הכלית ההטרוגנית. לכן, יש לפרש את סטיות התקן הגדולות כראיה לשונות ביולוגית משמעותית בתוך מודל ניסויי זה ולא כשגיאת מדידה. עם זאת, בהתחשב במספר הקטן של בעלי החיים בכל קבוצה, יש לפרש את מאפייני ההתפלגות ואת גודל ההבדלים הקשורים לטיפול בזהירות.
במחקר הנוכחי, רמות urea בסרום, BUN ו-creatinine היו נמוכות יותר באופן מספרי בקבוצה שטופלה ב-NAC מאשר בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, דפוס העולה בקנה אחד עם הפחתה אפשרית של התפקוד הכליתי לקוי. NAC נחקר רבות ב-CI-AKI, אך ההשפעות שדווחו על התפקוד הכליתי השתנו בין מחקרים שונים14,15,16,17. המנגנונים המוצעים כוללים ניקוי של מינים רבטיביים, תמיכה בסנתזת glutathione והגבלה של פגיעה חמצונית ברקמת הכליה1. לפיכך, פרופיל התפקוד הכליתי שנצפה בעקבות טיפול ב-NAC עשוי להיות קשור לתכונותיו כנוגד חמצון, אם כי מנגנון זה לא נבדק ישירות במחקר הנוכחי.
במחקר הנוכחי, רמות urea, BUN ו-creatinine בסרום היו נמוכות יותר באופן מספרי בקבוצה שטופלה ב-montelukast מאשר בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, מה שמרמז על הפחתה אפשרית של התפקוד הכליתי הפגום. מחקרים ניסויים קודמים, כולל חקירות של CI-AKI, דיווחו באופן דומה על רמות נמוכות יותר של creatinine ו-urea בסרום לאחר מתן montelukast9,18,19. קבוצת השילוב הראתה אף היא סמנים של תפקוד כליתי נמוכים יותר באופן מספרי מאשר קבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה. עם זאת, urea, BUN ו-creatinine היו נמוכים יותר באופן מספרי בטיפול ב-montelukast כמרפא יחיד (monotherapy) מאשר בטיפול המשולב, והשוואות post hoc של Duncan לא הראו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין שתי קבוצות אלו (p > 0.05). לפיכך, טיפול משולב לא הפגין עליונות על טיפול ב-montelukast כמרפא יחיד עבור סמנים אלו של תפקוד כליתי.
נזק חמצוני נחשב לגורם תורם חשוב לפתופיזיולוגיה של CI-AKI. היפוקסיה במוך הכליה (Medullary hypoxia) המושרה על ידי חשיפה לחומר ניגוד מעודדת ייצור מופרש של ROS, אשר עלול לפגוע בליפידים תאיים ובמיטוכונדריה, לגרום לנזק לתאי אפיתל תובוליים ולהגביר סיגנל דלקתי1,12,30.
קבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה הפגינה את ריכוז ה-MDA הגבוה ביותר, יחד עם הפעילויות הנמוכות ביותר של SOD ו-CAT והרמה הנמוכה ביותר של GSH, מה שמעיד על חוסר איזון בין העומס החמצוני למנגנוני ההגנה הנוגדי החמצון בעקבות החשיפה לחומר הניגוד. פרופילים דומים, המאופיינים בעלייה ב-MDA יחד עם ירידה ביכולת נוגדת החמצון, דווחו במודלים ניסיוניים אחרים של CI-AKI18,19. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם התפיסה לפיה עקה חמצונית תורמת להתפתחות ולהחמרה של הפגיעה הכלית, ולא מתרחשת אך ורק כתוצאה משנית1,30.
בהשוואה לקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, הקבוצות שטופלו ב-NAC ובמונטלוקסט הראו בדרך כלל ערכי MDA נמוכים יותר יחד עם ערכי SOD, GSH ו-CAT גבוהים יותר, דפוס התואם להפחתה של פגיעה חמצונית. הפעולות האנטי-חמצוניות המוצעות של NAC כוללות נטרול של מינים רב-פעילים ושמירה על זמינות הגלוטתיון התוך-תאית1,14. מונטלוקסט עשוי להגביל פגיעה חמצונית כלייתית באמצעות מנגנונים החורגים מחסימת קולטני לוקוטריאני ציסטאניל, כולל דיכוי תגובות חמצוניות בתוך רקמת הכליה18,33. מחקרים קודמים על פגיעה כלייתית, כולל מודלים של CI-AKI, דיווחו באופן דומה על הפחתה בפרוקסידציה של ליפידים ושיפור במנגנוני ההגנה האנטי-חמצוניים בעקבות טיפול במונטלוקסט9,19,27. למרות שפרמטרים חיוביים של סטרס חמצוני נצפו גם בקבוצת השילוב, הטיפול המשולב לא עלה באופן עקבי בביצועיו על אף אחד מהטיפולים הבודדים. בהתאם לכך, ממצאים אלו אינם מבססים אפקט אנטי-חמצוני אדיטיבי או סינרגי של מתן NAC ומונטלוקסט יחד.
הממצאים של KIM-1 ו-cystatin C סיפקו ראיות משלימות לפגיעה כלייתית בעקבות חשיפה לחומר ניגוד. KIM-1 קשור בעיקר לנזק באפיתל התובולי, בעוד ש-cystatin C משמש כאינדיקטור לשינויים הקשורים לסינון ולפגיעה כלייתית; שניהם הוערכו כסממנים ביולוגיים מוקדמים במודלים ניסויים של CI-AKI1,10. בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, הרמות הגבוהות ביותר של שני הסממנים הביולוגיים לוו בהידרדרות ניכרת במדדי התפקוד הכלייתי הקונבנציונליים. תבנית זו עקבית עם מחקרים ניסויים קודמים שדיווחו על עלייה ב-KIM-1 וב-cystatin C לאחר פגיעה כלייתית מושרית חומר ניגוד1,10.
בהשוואה לקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, קבוצות הטיפול הראו ערכי KIM-1 ו-cystatin C נמוכים יותר, דפוס התואם להפחתה של הפגיעה הכלית. פרופיל ביומרקרים זה היה מקביל לריכוזי urea ו-creatinine בנסיוב שהיו נמוכים יותר באופן מספרי לאחר הטיפול. מחקרים ניסיוניים קודמים קישרו מתן montelukast להפחתה בביטוי של KIM-1, לפגיעה טובולרית פחות חמורה ולשימור התפקוד הכלי במודלים של CI-AKI ומודלים אחרים של פגיעה כלית9,18,19. באופן דומה, NAC נקשר לפרופילים חיוביים יותר של ביומרקרים לפגיעה כלית חריפה, פוטנציאלית באמצעות הגבלת נזק תאי הקשור לעקה חמצונית14,15,16,17. עם זאת, לא זוהו הבדלים מובהקים סטטיסטית ב-KIM-1 או ב-cystatin C בין קבוצת הטיפול המשולב לקבוצת המונו-תראפיה של montelukast (p > 0.05). בהתאם לכך, הממצאים הנוכחיים אינם מדגימים תועלת נוספת בביומרקרים כתוצאה מהטיפול המשולב.
תגובות חמצוניות ודלקתיות עשויות לחזק אחת את השנייה במהלך CI-AKI. עודף של ROS עשוי לעורר סיגנלינג פרו-דלקתי, כאשר עליות עוקבות ב-TNF-α, IL-1β ו-IL-6 עשויות להגביר את הפגיעה ברקמת הכליות1,12,13,30.
קבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה הראתה את הריכוזים הגבוהים ביותר של TNF-α, IL-1β ו-IL-6, מה שתומך בנוכחות של תגובה דלקתית בעקבות חשיפה לחומר ניגוד. במודלים ניסיוניים של CI-AKI, עלייה בציטוקינים אלו נקשרה לפגיעה טובולרית, חדירה של תאי דלקת ולירידה בתפקוד הכליות10,12,13. פרופיל הציטוקינים הדלקתיים שנצפה במחקר הנוכחי עולה בקנה אחד עם ממצאים ניסיוניים קודמים שדווחו לאחר מתן חומר ניגוד1.
הקבוצות שטופלו ב-NAC ובמונטלוקסט הראו ערכים נמוכים יותר של TNF-α, IL-1β ו-IL-6 בהשוואה לקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, דפוס התואם להפחתה של התגובה הדלקתית. הפעילות נוגדת-הדלקת המיוחסת ל-NAC עשויה לנבוע חלקית מעומס חמצוני מופחת ומהגבלה הנובעת מכך של ייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים1,14,15,16,17. מונטלוקסט עשוי להשפיע על ביטוי ציטוקינים באמצעות חסמה של קולטני ציסטייניל-לוקוטריאנים וכן באמצעות ויסות של תהליכי איתות דלקתיים אחרים18,33. מחקרי פגיעה כלייתית ניסיוניים קישרו גם הם טיפול במונטלוקסט להפחתה באיתות הקשור ל-NF-κB ובפעילות פרו-דלקתית9,19,27. בהתאם לכך, פרופיל הציטוקינים שנצפה במחקר זה תואם לוויסות של תהליכים דלקתיים המערבים מסלולים כגון NF-κB ואינפלאסום NLRP3 (NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3). עם זאת, NF-κB, NLRP3 ו-NOX4 לא נמדדו באופן ישיר; לכן, ממצאי הביומארקרים מספקים ראיות תומכות עקיפות בלבד ואינם יכולים לקבוע הפעלה או עיכוב ספציפיים למסלול.
ערכי ציטוקינים דלקתיים היו נמוכים יותר בקבוצת הטיפול המשולב מאשר בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, אך הטיפול המשולב לא הניב באופן עקבי ערכים נמוכים יותר מאשר טיפול במונטelukast לבדו. לא נמצאו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הקבוצות של CI-AKI + Montelukast ו-CI-AKI + Montelukast + NAC עבור TNF-α, IL-1β או IL-6 (p > 0.05). לפיכך, התוצאות הנוכחיות אינן מספקות ראיות לכך שהוספת NAC למונטelukast מעניקה תועלת אנטי-דלקתית נוספת.
הערכות היסטופתולוגיות הדגימו עוד כי מתן חומרי ניגוד הוביל לפגיעה מבנית משמעותית בכליות. הממצאים של נמק Tubular, הרחבה Tubular, דגנרציה תאית וגודש וסקולרי שנצפו בקבוצת ה-CI-AKI מייצגים מאפיינים היסטופתולוגיים אופייניים ל-CI-AKI ונקשרו לליקוי בפרפוזיה הכלית, סטרס חמצוני ופגיעה בתאי ה-Tubule1,12,18,19. יחד עם הממצאים הביוכימיים, שינויים היסטופתולוגיים אלו מאשרים כי מתן חומרי ניגוד הוביל לפגיעה משמעותית ברקמת הכליה. מידת הפגיעה ההיסטופתולוגית הנמוכה יותר שנצפתה בקבוצות שטופלו ב-montelukast וב-NAC מרמזת כי חומרים אלו עשויים להפעיל השפעות מגנות על רקמת הכליה. ראוי לציין כי קבוצת הטיפול המשולב הציגה את ציוני הפגיעה ההיסטופתולוגית הנמוכים ביותר מבחינה מספרית מבין קבוצות הטיפול. יתרה מכך, הערכה איכותית של חתכים שנצבעו ב-Masson’s trichrome הראתה שקיעה פחות בולטת של קולגן אינטרסטיציאלי ושימור טוב יותר של הארכיטקטורה ה-tubulointerstitial בקבוצות הטיפול בהשוואה לקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה. בהתחשב בתקופת התצפית החדה ובאופייה האיכותי של הערכת ה-Masson’s trichrome, יש לפרש ממצאים אלו כעדות לשימור מבני טוב יותר בנקודת הזמן שנבדקה, ולא כעVIDENCE לשינוי בעיצוב מחדש ארוך טווח של המטריצה החוץ-תאית.
הערכה היסטופתולוגית חצי-כמותית הייתה עקבית עם התצפיות האיכותיות, והראתה ציוני פגיעה נמוכים יותר בכל קבוצות הטיפול בהשוואה לקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה. למרות שבקבוצת השילוב נרשמו ציוני הפגיעה ההיסטופתולוגית הנמוכים ביותר מבחינה מספרית, ממצא זה לא לווה בעליונות עקבית בתוצאות הביוכימיות. לפיכך, אין לפרש את הממצאים ההיסטופתולוגיים החיוביים שנצפו בטיפול המשולב כראיה לאפקט אדיטיבי או סינרגטי על בסיס עיצוב המחקר הנוכחי. באופן דומה, מחקרים קודמים במודלים ניסיוניים של CI-AKI וצורות אחרות של פגיעה כלייתית חריפה דיווחו כי דיכוי של עקה חמצונית ודלקת מפחית את הנזק ההיסטופתולוגי ותורם לשימור השלמות התווארית9,18,19,27.
נצפתה סטייה לכאורה בין הממצאים הביוכימיים להיסטופתולוגיים. למרות ש מספר משתנים ביוכימיים היו גבוהים יותר באופן מספרי בקבוצת המונטelukast כמונותרפיה מאשר בקבוצת השילוב, הבדלים אלו לא היו מובהקים סטטיסטית. בניגוד לכך, קבוצת השילוב הראתה את ציוני הפגיעה ההיסטופתולוגית הנמוכים ביותר מבחינה מספרית. נתק חלקי זה עשוי לשקף הבדלים בתהליכים הביולוגיים ובפרופילים הזמניים שנמדדו על ידי שתי גישות ההערכה. בדיקה היסטופתולוגית מעריכה ישירות פגיעה תאית ומבנית מקומית ברקמת הכליה, ולכן עשויה לחשוף שימור ברמת הרקמה בנקודת הזמן שנבדקה, גם כאשר סמני תפקוד כליתי בסרום ומדדים ביוכימיים אחרים אינם משתפרים באותה מידה. לעומת זאת, תוצאות ביוכימיות מספקות קריאות תפקודיות או מולקולריות עקיפות ועשויות להיות מושפעות מרזרבה תפקודית של הכליה, מנגנוני פיצוי, שונות ביולוגית בין בעלי חיים וממועד איסוף הדגימות. מכיוון שכל נקודות הקצה נמדדו בנקודת זמן סופית אחת, ייתכן שהשימור המבני וההחלמה הביוכימית לא היו מסונכרנים. בהתאם לכך, יש לפרש את המראה ההיסטופתולוגי המיטיב יותר בקבוצת השילוב כהבדל בין שיטות ההערכה ולא כעדות ליעילות כוללת עליונה. עם זאת, למרות שהערכות היסטופתולוגיות בוצעו בתנאי סמיות כדי למזער הטיות של הבוחן, כל חתכי הרקמה הוערכו על ידי פתולוג אחד, דבר שמונע הערכה של שונות בין בוחנים. מחקרים עתידיים שישלבו מספר מעריכים עצמאיים עשויים לשפר עוד יותר את המהימנות והשחזוריות של הממצאים ההיסטופתולוגיים.
יישום הדירות של מודל זה תלוי בביצוע עקבי של מספר שלבים פרוצדורליים. יש להפוך לסטנדרטיים בכל החיות את משך הזמן של מניעת השקיה, המרווחים שהוגדרו מראש המפרידים בין מתן ה-L-NAME, האינדומטאצין וה-iohexol, ואת קצב ההזרקה האיטי לווריד של ה-iohexol. דליפה חוץ-ורידית (extravasation) מווריד הזנב עלולה להפחית את מינון הניגודיות האפקטיבי ולהגביר את השונות בחומרת הפגיעה הכלית; לכן, יש לנטר את אתר ההזרקה בקפידה לאורך כל תהליך המתן. כאשר מתרחשת דליפה, extravasation או התנגדות משמעותית במהלך ההזרקה, יש לשקול את האפשרות של מתן חומר ניגודיות לא מלא בעת פירוש הממצאים התואמים. עקביות המינון עלולה להיפגע גם כתוצאה מרפלקס הקאה (regurgitation) במהלך הזנה פומית (oral gavage) או רסוזפנסיה לא מספקת של תכשיר ה-montelukast. החלת אותם נהלים סטנדרטיים על כל החיות ושיוך פעולות המתן לאותו חוקר במידת האפשר עשויים להפחית שונות פרוצדורלית שניתן למנוע.
פרוטוקול זה מאפשר להקים CI-AKI בתוך תקופה ניסויית קצרה יחסית, תוך מתן אפשרות לבחינת תוצאות ביוכימיות והיסטופתולוגיות באותו מודל חיה1,2,9.
נקודת חוזק של המחקר הנוכחי היא שפגיעה כלייתית אופיינה באמצעות תוצאים תפקודיים, ביוכימיים, דלקתיים והיסטופתולוגיים משלימים. הערכה של מדדי תפקוד כלייתי יחד עם פרמטרים של עקה חמצונית, ציטוקינים דלקתיים, KIM-1, cystatin C ומורפולוגיה של רקמת הכליה אפשרה לבחון מספר מרכיבים של CI-AKI במסגרת אותו ניסוי. הכללה של KIM-1 ו-cystatin C הרחיבה את ההערכה מעבר למדידות קונבנציונליות של קריאטינין בנסיוב. בדיקה של montelukast ו-NAC הן בנפרד והן יחד אפשרה השוואה ישירה של אסטרטגיות הטיפול; עם זאת, הממצאים לא הראו עליונות עקבית של השילוב על פני טיפול בודד (monotherapy) לאורך התוצאים שנבחנו. יתרה מכך, בניגוד לגישות השראה המבוססות על חשיפה לחומר ניגוד בלבד, המודל הנוכחי משלב כיווץ כלי דם כלייתי והיפוקסיה מדולרית, ובכך יוצר מצב של פגיעה כלייתית בולטת שבו ניתן להעריך שינויים ביולוגיים הקשורים לטיפול.
מרווח הזמן של 1 h בין החשיפה לחומר הניגוד לתחילת הטיפול מייצג את נקודת הזמן שנבדקה בפרוטוקול ניסויי זה בלבד, ואין לפרשו כחלון טיפולי המהווה תיקוף קליני. אף על פי שטיפול מיד לאחר חשיפה ידועה לחומר ניגוד עשוי להיות רלוונטי למחקרים תרגומיים עתידיים, מחקר בעלי החיים הנוכחי אינו יכול לקבוע את ההיתכנות או היעילות שלו במסגרות קליניות. בפרט, זמן התחלת הטיפול האופטימלי, המינון, נתיב המתן, משך הטיפול ואוכלוסיית המטופלים נותרים לא ידועים. גורמים אלו חייבים להיבדק במחקרים תרגומיים וקליניים ייעודיים לפני שניתן יהיה לשקול מתן NAC או montelukast לאחר חשיפה לחומר ניגוד לשימוש קליני.
יש להכיר במספר מגבלות של המחקר הנוכחי. הממצאים התקבלו ממודל חיות פרה-קליני ולכן לא ניתן להכלילם באופן ישיר על הפרקטיקה הקלינית. מכיוון שהפרוטוקול שילב מניעת שתיית מים עם עיכוב של נתיבי החנקית (nitric oxide) והפרוסטגלאנדין, הפגיעה הכלית שנוצרה עשויה להיות חמורה יותר מהפגיעה הנפוצה לאחר חשיפה לחומר ניגוד בחולים. כ consequently, יש לפרש את התוצאות בהקשר של הגדרה ניסויית רגישה זו. למרות שהמודל מאפשר הערכה מבוקרת של תגובות ביולוגיות לטיפולים מועמדים להגנה על הכליות (renoprotective), הוא אינו משחזר את מלוא ההטרוגניות או את טווח החומרה של CI-AKI קליני. לכן, שינויים הקשורים לטיפול שנצפו במחקר זה עשויים להיות שונים בחולים בעלי פרופילי סיכון קלים או מגוונים יותר. נדרשת שחזור במודלים פחות אינטנסיביים המקרבים יותר את התנאים הקליניים הנפוצים, ולאחריהם מחקרים קליניים שתוכננו כראוי, בטרם ניתן יהיה לקבוע את עוצמתם או את הרלוונטיות הקלינית של השפעות אלו. מגבלה נוספת היא שרק חולדות זכרים נכללו במחקר. לפיכך, הבדלים פוטנציאליים הקשורים למין ברגישות ל-CI-AKI ובתגובות ל-NAC ולמונטelukast לא נבחנו, ולא следует להניח כי הממצאים הנוכחיים תקפים גם לחיות נקבה. נדרשים מחקרים עתידיים שיכללו את שני המינים כדי לקבוע האם המין משפיע על חומרת הפגיעה הכלית או על התגובה לטיפול.
מגבלה נוספת היא היעדרה של קבוצת דמי (sham) פרוצדורלית התואמת את הקבוצות הניסיוניות מבחינת טיפול הקשור לפרוטוקול, ריסון, מניעת מים, הזרקות, הזנה דרך פה (oral gavage) ומתן חומר נשאי (vehicle). מכיוון שקבוצת הביקורת לא עברה הליכים אלו, לא ניתן לשלול לחלוטין כי מתח פרוצדורלי לא שוויוני והשפעות לא ספציפיות הקשורות לריסון, טיפול חוזר, הזרקות, הזנה דרך פה וחשיפה לחומר נשאי תרמו כגורמים פוטנציאליים לכמה מההבדלים שנצפו בין קבוצת הביקורת לקבוצות הניסיוניות. הכללת קבוצות דמי פרוצדורליות וקבוצות ביקורת לנשאי התואמות באופן הולם במחקרים עתידיים תסייע להבחין בין השפעות לא ספציפיות אלו הקשורות להליך, לבין השפעות המיוחסות ספציפית להשראת וטיפול ב-CI-AKI.
על אף שגודל המדגם שנקבע מראש חושב כדי לספק עוצמה של 80% לגילוי השפעה כוללת גדולה כפי שהונחה בין חמש הקבוצות הניסוייות, המחקר לא תוכנן עם עוצמה ספציפית לגילוי הבדלים זוגיים קטנים יותר בין קבוצות המונו-תמיכה וקבוצות הטיפול המשולב. לפיכך, ייתכן שלמחקר הייתה עוצמה מוגבלת לגילוי הבדלים כאלה בין הטיפולים, ומגמות מספריות שאינן מובהקות לא צריכות להתפרש כראיה לשקילות. יידרשו מחקרים עם גדלי מדגם גדולים יותר כדי לקבוע אם מגמות אלו מייצגות הבדלי טיפול הניתנים לשחזור.
מאחר שבוחן מינון בודד בלבד של כל סוכן, המחקר הנוכחי אינו יכול לקבוע שילוב מינונים אופטימלי של NAC–montelukast, לאפיין אינטראקציות סינרגיסטיות או אנטגוניסטיות תלויות-מינון, או לכמת את התרומה היחסית של כל סוכן להשפעות שנצפו בטיפול המשולב. לפיכך, ייתכן שסוכן אחד תרם באופן חזק יותר לתוצאות ספציפיות, אך לא ניתן לקבוע זאת ממערך המחקר הנוכחי. מחקרים עתידיים שישלבו רמות מינון מרובות וניתוחים פורמליים של אינטראקציות בין תרופות יהיו נחוצים כדי לאפיין את קשרי המינון-תגובה ולזהות משטר שילוב אופטימלי.
המחקר העריך מדדים ביוכימיים של עקה חמצונית ודלקת, אך לא בחן באופן ישיר את מסלולי השליחאות התוך-תאיים הקשורים אליהם. לפיכך, פרופילי הסמנים הביולוגיים שנצפו אינם יכולים להוכיח האם מסלולי שליחאות הקשורים ל-NF-κB, NLRP3 או NOX4 הופעלו או עוכבו על ידי הטיפול. מחקרים עתידיים המשתמשים בגישות מולקולריות, כולל Western blotting ו-quantitative polymerase chain reaction (qPCR), נדרשים כדי לקבוע כיצד מסלולים אלו תורמים להשפעות הכליתיות של montelukast ו-NAC.
מאחר שההערכות הוגבלו לשלב החריף, המחקר הנוכחי אינו מספק מידע לגבי התאוששות כלייתית עוקבת או עיצוב מחדש של הרקמה בטווח הארוך. לפיכך, יש לראות בהשקעת הקולגן המוגבלת יחסית שנצפתה בקבוצות הטיפול בנקודת הסיום שנבדקה ממצא מבני מוקדם, ולא כראיה לכך שנמנעה פיברוזיס כלייתית כרונית. ממצא זה עשוי במקום זאת לשקף הנחתה של הפגיעה הכלייתית הראשונית. נדרשים מחקרי אורך הכוללים נקודות הערכה מאוחרות יותר כדי לקבוע אם שינויים מוקדמים אלו נשמרים והאם הם משפיעים על התפקוד הכלייתי לטווח ארוך או על עיצוב מחדש של הרקמה.
באופן כללי, מתן של montelukast ו-NAC לאחר הזרקת חומר ניגוד, לבד או בשילוב, היה קשור להחלשה של תפקוד כליות לקוי, עקה חמצונית, תגובות דלקתיות ופגיעה היסטופתולוגית במודל ניסויי זה של CI-AKI. עם זאת, הטיפול המשולב לא הדגים עליונות עקבית על פני טיפול במונו-תרפיה לאורך התוצאים שנבחנו. ממצאים אלו מוגבלים למודל הפרה-קליני הנוכחי ותומכים במחקר ניסויי נוסף ולא בהשלכה ישירה על הפרקטיקה הקלינית.
לסיכום, טיפול לאחר חשיפה לחומר ניגוד ב-montelukast, NAC, או בשילוב ביניהם, היה קשור לממצאים ביוכימיים והיסטופתולוגיים חיוביים יותר במודל ניסיוני זה של CI-AKI. עם זאת, המשטר המשולב לא עלה באופן עקבי על המונותרפיה במדדי התוצאה שנבחנו. מכיוון שתצפיות אלו התקבלו במחקר פרה-קליני בבעלי חיים, יש להתייחס אליהן כבסיס לתיקוף ניסיוני נוסף ולא כראיה ליעילות או ישימות קלינית. נדרש מחקר נוסף כדי לקבוע את הרלוונטיות הפוטנציאלית של גישות טיפול אלו לאחר חשיפה לחומר ניגוד עבור CI-AKI קליני.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים. במהלך הכנת כתב יד זה, נעשה שימוש בכלים מסייעים מבוססי בינה מלאכותית (AI) אך ורק לצורך עריכה לשונית ותיקון דקדוקי. לא נעשה שימוש בכלי בינה מלאכותית לצורך יצירה, ניתוח או פרשנות של נתונים, וכן לא ליצירת איורים, טבלאות או אלמנטים גרפיים כלשהם. המחברים נושאים באחראיות מלאה לתוכן כתב היד.
תרומות המחברים:
YS, CS ו-OK תרמו לתכנון ולהגייה של המחקר. YS ביצע את ההליכים הניסיוניים ואת איסוף הנתונים. OK ביצע את הבדיקות ההיסטופתולוגיות. YS ו-CS ביצעו את הניתוחים הסטטיסטיים ופירשו את הנתונים. YS כתב את טיוטת כתב היד. כל המחברים ביצעו עריכה ביקורתית של כתב היד ואישרו את הגרסה הסופית.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי היחידה לתיאום פרויקטים של מחקר מדעי של אוניברסיטת Kırşehir Ahi Evran (מספר פרויקט: TIP.A3.26.006).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שוטפת פלטות אוטומטית (Auto Strip Washer) | Bio-Tek Instruments, USA | ELx50 | שטיפה אוטומטית של פלטות ELISA. |
| קורא מיקרופלטות | Bio-Tek Instruments, USA | ELx800 | מדידות בליעה ב-ELISA. RRID:SCR_028651 |
| פורמלין ניטרלי בבפר (10% Neutral Buffered Formalin) | Merck | לא רשום | קיבוע רקמות להיסטופתולוגיה. |
| צנטריפוגת שולחנית | Nüve | NF048 | הכנת דגימות וצנטריפוגציה. |
| קרבוקסימתילצלולוז (CMC) | Sigma-Aldrich, USA | C5678 | חומר נשאי לתמיסת מונטelukast. |
| ערכה אוניברסלית ל-CAT | Otto Scientific | Otto3051 | מדידה קולורימטרית של פעילות CAT בסרום באמצעות אנלייזר כימי Mindray BS-400. |
| הומוגנייזר דיגיטלי | Daihan Scientific | HG-15D | הומוגניזציה של רקמות. |
| אאוזין Y (צהבהב) | Merck | 1.15935.0025 | צביעת HE. |
| תמיסת המטוקסילין של האריס | BSLAB | BS-002 | צביעת HE. |
| אינדומטצין | Sigma-Aldrich, USA | I7378 | משמש להשראת CI-AKI. |
| יוהקסול (Omnipaque 300) | GE HealthCare | לא רשום | חומר ניגוד המשמש להשראת CI-AKI. |
| קטמין הידרוכלוריד (Ketalar) | Pfizer, USA | לא רשום | הרדמה כללית לפני איסוף דגימות. |
| מיקרוסקופ אור (Nikon Eclipse) | Nikon | Ni-U | בדיקה והדמיה היסטופתולוגית. RRID:SCR_024835 |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) | Sigma-Aldrich, USA | N5751 | משמש להשראת CI-AKI. |
| ערכת צביעת טריכרום של מסון | MOSLAB, Türkiye | BKMTO001 | צביעת טריכרום של מסון. |
| אנלייזר כימי Mindray | Mindray | BS-400 | ניתוחים ביוכימיים. |
| מונטelukast נתרן | Sigma-Aldrich, USA | SML0101 | ניתן דרך הפה באמצעות זריקה (gavage) כטיפול. |
| N-אצטילציסטאין (ASIST 300 mg/2 mL) | MAC  laç, Türkiye | לא רשום | ניתן תוך-פריטוניאלית כטיפול. |
| ערכת ELISA ל-Cystatin C בחולדה | BT Lab, China | E0145Ra | מדידת ELISA של cystatin C בעיקרי רקמה כלייתית. |
| ערכת ELISA ל-IL-1β בחולדה | BT Lab, China | E0119Ra | מדידת ELISA של IL-1β בעיקרי רקמה כלייתית. |
| ערכת ELISA ל-IL-6 בחולדה | BT Lab, China | E0135Ra | מדידת ELISA של IL-6 בעיקרי רקמה כלייתית. |
| ערכת ELISA ל-KIM-1 בחולדה | BT Lab, China | E0549Ra | מדידת ELISA של KIM-1 בעיקרי רקמה כלייתית. |
| ערכת ELISA ל-TNF-α בחולדה | BT Lab, China | E0764Ra | מדידת ELISA של TNF-α בעיקרי רקמה כלייתית. |
| מחט האכלה מפלדת אל-חלד (קנולה להזנה פומית 22 G) | Instech Laboratories, USA | לא רשום | מתן תרופה דרך הזנה פומית (gavage). |
| מזון גרגירים סטנדרטי למכרסמים (Optima) | Optima, Türkiye | לא רשום | מספר אצווה 58931. הרכב תזונתי: 24% חלבון גולמי, 3.94% תאית גולמית, 5.08% שומן גולמי, 8.8% אפר גולמי, 1.44% ליזין, 0.61% מתיונין, 1.14% סידן, 0.89% זרחן ו-0.28% נתרן. |
| ערכה אוניברסלית לקריאטינין | Otto Scientific | OttoBC139 | מדידה קולורימטרית של קריאטינין בסרום. |
| ערכה אוניברסלית ל-GSH | Otto Scientific | Otto3053 | מדידה קולורימטרית של GSH בדם עם נוגד קרישה EDTA באמצעות שיטת Ellman שונויה. |
| ערכה אוניברסלית ל-MDA | Otto Scientific | Otto1001 | מדידה קולורימטרית של MDA בסרום באמצעות קורא מיקרופלטות ELx800. |
| ערכה אוניברסלית ל-SOD | Otto Scientific | Otto3047 | מדידה קולורימטרית של פעילות SOD בסרום באמצעות אנלייזר כימי Mindray BS-400. |
| ערכה אוניברסלית לאוריאה | Otto Scientific | OttoBC157 | מדידה קולורימטרית של אוריאה ו-BUN בסרום. |
| קסילאזין הידרוכלוריד (Rompun) | Bayer, Germany | לא רשום | הרדמה כללית לפני איסוף דגימות. |
מקורות
- Wang Z, Wang Q, Gong X. Unveiling the mysteries of contrast-induced acute kidney injury: new horizons in pathogenesis and prevention. Toxics. 2024;12(8):620.
- Cho E, Ko GJ. Pathophysiology and management of radiocontrast-induced nephropathy. Diagnostics. 2022;12(1):180.
- Shuka N, et al. Contrast-induced nephropathy in interventional cardiology: incidence, risk factors, and identification of high-risk patients. Cureus. 2023;15(12):e51283.
- Shams E, Mayrovitz HN. Contrast-induced nephropathy: a review of mechanisms and risks. Cureus. 2021;13(5):e14842.
- Mehran R, et al. A simple risk score for prediction of contrast-induced nephropathy after percutaneous coronary intervention: development and initial validation. J Am Coll Cardiol. 2004;44(7):1393-1399.
- Heyman SN, Reichman J, Brezis M. Pathophysiology of radiocontrast nephropathy: a role for medullary hypoxia. Invest Radiol. 1999;34(11):685-691.
- Geenen RWF, Kingma HJ, van der Molen AJ. Contrast-induced nephropathy: pharmacology, pathophysiology and prevention. Insights Imaging. 2013;4:811-820.
- Manisaligil YA, et al. Assessment of Rac1 and β-PAK expressions in a mouse model for contrast-induced nephropathy. J Basic Clin Health Sci. 2020;4(3):230-236.
- Simsek O, et al. Preventative effect of montelukast in mild to moderate contrast-induced acute kidney injury in rats via NADPH oxidase 4, p22phox and nuclear factor kappa-B expressions. Int Urol Nephrol. 2025;57(7):2313-2325.
- Banda J, et al. Biomarkers for diagnosis and prediction of outcomes in contrast-induced nephropathy. Int J Nephrol. 2020;2020:8568139.
- Zisis IE, et al. Renoprotective effect of vardenafil and avanafil in contrast-induced nephropathy: emerging evidence from an animal model. J Pers Med. 2022;12(5):670.
- Walker H, et al. Systematic review and meta-analysis of prophylaxis use with intravenous contrast exposure to prevent contrast-induced nephropathy. Eur J Radiol. 2022;153:110368.
- Hossain MA, et al. Contrast-induced nephropathy: pathophysiology, risk factors, and prevention. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2018;29(1):1-9.
- Tepel M, et al. Prevention of radiographic-contrast-agent-induced reductions in renal function by acetylcysteine. N Engl J Med. 2000;343(3):180-184.
- Liu R, et al. N-acetylcysteine for the prevention of contrast-induced nephropathy: a systematic review and meta-analysis. J Gen Intern Med. 2005;20(2):193-200.
- Zhu R, et al. Association of N-acetylcysteine use with contrast-induced nephropathy: an umbrella review of meta-analyses of randomized clinical trials. Front Med (Lausanne). 2023;10:1235023.
- Sandilands EA, et al. Acetylcysteine has no mechanistic effect in patients at risk of contrast-induced nephropathy: a failure of academic clinical science. Clin Pharmacol Ther. 2022;111(6):1222-1238.
- Sarmadian R, et al. The renoprotective potential of montelukast: a scoping review. Ann Med Surg (Lond). 2024;86(6):3568-3576.
- Kokate D, Marathe P. Evaluation of effect of montelukast in the model of streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats. Indian J Endocrinol Metab. 2024;28(1):47-54.
- Mojtahedi SY, Ghodsi M, Pourpashang P. Renoprotective efficacy of montelukast: an overview on recent advancements. J Nephropharmacol. 2025;14(1):e12759.
- Sener G, et al. Chronic renal failure-induced multiple-organ injury in rats is alleviated by the selective CysLT1 receptor antagonist montelukast. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2007;83(4):257-267.
- Sener G, et al. Montelukast protects against renal ischemia/reperfusion injury in rats. Pharmacol Res. 2006;54(1):65-71.
- Li LP, et al. Intrarenal oxygenation by blood oxygenation level-dependent MRI in contrast nephropathy model: effect of the viscosity and dose. J Magn Reson Imaging. 2012;36(5):1162-1167.
- Liu K, et al. A novel rat model of contrast-induced nephropathy based on dehydration. J Pharmacol Sci. 2019;141(1):49-55.
- Alshogran OY, Al Tahrawi AY, Nusair SD. Exploring the effects of edaravone in rats with contrast-induced acute kidney injury. Life Sci. 2022;309:121006.
- Suddek GM. Montelukast ameliorates kidney function and urinary bladder sensitivity in experimentally induced renal dysfunction in rats. Fundam Clin Pharmacol. 2013;27(2):186-191.
- Aydin A, et al. The examination of the nephroprotective effect of montelukast sodium and N-acetylcysteine in renal ischemia with dimercaptosuccinic acid imaging in a placebo-controlled rat model. Acta Cir Bras. 2020;35(9):e202000905.
- Kara O, Kilitci A, Daglioglu G. Protective effect of resveratrol on cisplatin-induced damage in rat kidney. Cukurova Med J. 2022;47(3):990-995.
- Pandir D, Kara O. Cisplatin-induced kidney damage and the protective effect of bilberry (Vaccinium myrtillus L.): an experimental study. Turk J Med Sci. 2013;43(6):951-956.
- Iordache AM, et al. Phosphodiesterase-5 inhibitors ameliorate structural kidney damage in a rat model of contrast-induced nephropathy. Food Chem Toxicol. 2020;143:111535.
- Morcos SK, Thomsen HS, Webb JA. Contrast-media-induced nephrotoxicity: a consensus report. Eur Radiol. 1999;9:1602-1613.
- Rudnick MR, et al. Nephrotoxicity of ionic and nonionic contrast media in 1196 patients: a randomized trial. Kidney Int. 1995;47(1):254-261.
- Modi K, Padala SA, Gupta M. Contrast-induced nephropathy. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2025 Jan–. Updated 2025 May 5. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK448066/