הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השפעות נפרופרוטקטיביות של טיפול ב-N-Acetylcysteine וב-Montelukast לאחר מתן חומר ניגוד במודל חולדות של פגיעה כלייתית חריפה מושרית חומר ניגוד

108 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73087

⸱

3 בספטמבר 2026

 ,  , 
1Department of Emergency Medicine, Kırşehir Ahi Evran University Faculty of Medicine, 2Department of Histology and Embryology, Kırşehir Ahi Evran University Faculty of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג מודל של חולדה לפגיעה חריפה בכליות המושרית על ידי חומר ניגוד, ומעריך מתן של N-acetylcysteine ושל montelukast לאחר החשפתם לחומר הניגוד, בנפרד ובשילוב. משטרי הטיפול היו קשורים לתפקוד כלייתי פגוע פחות, להפחתה בעקה חמצונית, בדלקת ובנזק היסטופתולוגי, אם כי הטיפול המשולב לא הראה עליונות עקבית על פני טיפול בודד.

תקציר

פגיעה כלייתית חריפה מושרית ניגודיות (CI-AKI) היא סיבוך משמעותי של חשיפה לחומרי ניגודיות יודים, שבהם תהליכי דלקת ועקה חמצונית תורמים לנזק כלייתי. מחקר זה ביסס מודל ניסויי של CI-AKI בחולדות ובחן את ההשפעות של טיפול ב-N-acetylcysteine (NAC), מונטelukast, או שילוב של שניהם, שהחל לאחר מתן חומר הניגודיות. חולדות זכר בוגרות מסוג Wistar עברו מניעת מים, ולאחריה מתן תוורידי רצופי של Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), אינדומטצין ויוהקסול. הטיפול הוחל שעה אחת לאחר השלמת מתן היוהקסול, כ-1.5 שעות לאחר מתן ה-L-NAME, ונמשך פעם ביום למשך 3 ימים רצופים. נבחנו מדדי תפקוד כלייתי, פרמטרים של עקה חמצונית, ציטוקינים דלקתיים, סמנים ביולוגיים לפגיעה כלייתית והיסטופתולוגיה של הכליות. קבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה הראתה תפקוד כלייתי לקוי באופן בולט, פרופיל דלקתי ועקה חמצונית לא נוחים, ונזק היסטופתולוגי משמעותי. בהשוואה לקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה, בעלי חיים שקיבלו NAC, מונטelukast או את משטר השילוב הראו בדרך כלל שיפור בממצאים הביוכימיים וההיסטופתולוגיים. רמות הגלוטתיון (GSH) היו הגבוהות ביותר, וציוני הנזק ההיסטופתולוגי הממוצעים היו הנמוכים ביותר מבחינה מספרית בקבוצת השילוב; עם זאת, הטיפול המשולב לא עלה בעקביות על המונותרפיה בכל התוצאים שנבחנו. פרוטוקול זה מספק מסגרת פרה-קלינית מבוקרת להערכת התערבויות לאחר מתן חומר ניגודיות ב-CI-AKI, והממצאים מצדיקים חקירה ניסויית נוספת של NAC ומונטelukast, מבלי לקבוע יעילות קלינית או יתרון ספציפי לשילוב.

מבוא

פגיעה כלייתית חריפה (AKI) מסבכת לעיתים קרובות את מהלכהם של מטופלים המאושפזים בבית החולים ותורמת לעלייה בתחלואה, בתמותה ובשימוש במשאבי בריאות. מכיוון שחומרי ניגוד יודים משמשים באופן שגרתי בדימות אבחנתי ובפרוצדורות פולשניות, הידרדרות בתפקוד הכליות בעקבות חשיפה לחומר ניגוד הפכה לדאגה קלינית חשובה. הנומנקלטורה הנוכחית מבדילה בין פגיעה כלייתית חריפה הקשורה לחומר ניגוד (CA-AKI), הכוללת כל אירוע של AKI המתרחש לאחר מתן חומר ניגוד, לבין פגיעה כלייתית חריפה המושרית על ידי חומר ניגוד (CI-AKI), שבה הפגיעה הכלית מיוחסת סיבתית לחומר הניגוד. במודלים ניסיוניים מבוקרים, שבהם ניתן לקשור ישירות את החשיפה לחומר הניגוד לנזק כלייתי, המונח CI-AKI נותר נפוץ בשימוש1,2.

מטופלים עם מחלה כלית כרונית, סוכרת, גיל מתקדם, אי-ספיקת לב או תחלואה לבבית-כלי דם נלווית אחרת הם רגישים במיוחד ל-CI-AKI. תפקוד הכליות משתפר אצל מטופלים רבים שנפגעו; עם זאת, במקרים חמורים יותר עלולים להתרחש ליקויים כלייתיים מתמשכים, צורך בטיפול חליפי לכליות וסיכון מוגבר למוות. CI-AKI קשורה גם לאשפוזים ממושכים יותר ולשימוש רב יותר במשאבי בריאות. השלכות שליליות אלה מדגישות את הצורך המתמשך בפיתוח גישות מנע וטיפול יעילות עבור פגיעה כלית הקשורה לחומר ניגוד1,3,4,5.

התפתחות של CI-AKI כוללת מספר תהליכים הקשורים זה בזה, הכוללים פגיעה בפרפוזיה של הכליות, חוסר איזון בחמצן במוך הכליה (medulla), עקה חמצונית, דלקת ורעילות טובולרית ישירה. חשיפה לחומר ניגוד משנה את טון כלי הדם התוך-כלייתיים לכיוון של כיווץ כלי דם (vasoconstriction) תוך החלשת התגובות להרחבת כלי דם (vasodilation), ובכך מפחיתה את זרימת הדם לכליות. המוך החיצוני רגיש במיוחד מכיוון שזמינות החמצן באזור זה מוגבלת כבר בתנאים פיזיולוגיים. לכן, ירידה נוספת באספקת החמצן לאחר מתן חומר ניגוד עלולה להוביל לפגיעה טובולרית היפוקסית2,6,7.

היפוקסיה כלייתית בעקבות חשיפה לחומר ניגוד מלווה ביצירה מוגברת של רדיקלים חופשיים (ROS), התורמת באופן משמעותי לפגיעה בכליות. כאשר ייצור ה-ROS עולה על קיבולת נוגדי החמצון האנדוגנית, עלול להתפתח נזק חמצוני בליפידים תאיים, בחלבונים וב-DNA, בעוד שסיגנל דלקתי מועצם בו-זמנית. הן בהקשרים ניסיוניים והן בהקשרים קליניים, מתן חומר ניגוד נקשר לעלייה במדדי עקה חמצונית ולפגיעה במנגנוני הגנה של נוגדי חמצון. מסלולים מולקולריים המעורבים בתגובה זו כוללים יצירת רדיקלים התלויה ב-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase והפעלה של nuclear factor kappa-B (NF-κB)1,6,8,9.

תרומת הדלקת מעידה כי לא ניתן להסביר את ה-CI-AKI באמצעות הפרעה המודינמית בלבד. ראיות מהעת האחרונה קשרו גם את הפרופטוזיס, סטרס ניטרוזטיבי ומלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים לפגיעה כלייתית בעקבות חשיפה לחומר ניגוד. הזיהוי של מנגנונים נוספים אלה הרחיב את מגוון המטרות המולקולריות הנחקרות למניעה ולטיפול ב-CI-AKI1.

רמות קריאטינין בנסיוב ותפוקת שתן משמשים בדרך כלל לזיהוי CI-AKI, אך שניהם עשויים להשתנות רק לאחר שפגיעה כלייתית כבר התפתחה. מגבלה זו עודדה הערכה של סמנים מוקדמים יותר, כולל kidney injury molecule-1 (KIM-1), המשקף נזק טובולי, ו-cystatin C, הקשור לשינויים בסינון הגלומרולרי. ראיות ממחקרים ניסיוניים וקליניים מצביעות על כך ששינויים בביומרקרים אלו עשויים להפוך לגילויים במהלך השלב המוקדם של CI-AKI, ולכן הם תומכים בהערכה מוקדמת יותר של פגיעה כלייתית9,10,11.

התקדמות בהבנת הפתופיזיולוגיה של CI-AKI עודדה הערכה של התערבויות פרמקולוגיות המכוונות למסלולים חמצוניים ודלקתיים. הידרציה נאותה נותרת אמצעי המניעה העיקרי, בעוד שהיתרונות המדווחים של גישות מבוססות תרופות השתנו בין מחקרים שונים. כתוצאה מכך, שום טיפול פרמקולוגי טרם הדגים יעילות עקבית מספיקה כדי שא יאומץ כהתערבות קלינית סטנדרטית עבור CI-AKI1,4,12,13.

N-acetylcysteine (NAC) נבחן באופן נרחב כגישה פרמקולוגית להגבלה של CI-AKI. ההשפעות הרנו-פרוטקטיביות (מגנות הכליות) המוצעות שלו קשורות לספיחה של מינים ריאקטיביים ולשיקום מאגרי הגלוטתיון. תמיכה קלינית ראשונית הגיעה ממחקר מכונן בקרב חולים עם מחלת כליות כרונית, שבו NAC הפחית את השכיחות של תפקוד כליות לקוי הקשור לחומר ניגוד14. עם זאת, ניסויים קליניים מאוחרים יותר וסינתזות של ראיות הניבו ממצאים לא עקביים, כאשר חלק מהמחקרים דיווחו על תועלת ואחרים לא הראו השפעה קלינית משמעותית. לפיכך, יעילותו של NAC עבור CI-AKI נותרת לא ודאית12,15,16,17.

מונטלוקסט (Montelukast) חוסם באופן סלקטיבי את קולטן לוקוטריאני ציסטאנייל-1 (cysteinyl leukotriene receptor-1) ומשמש מזה זמן רב לטיפול באסמה ובהפרעות אלרגיות. ראיות ניסיוניות מצביעות על כך שסוכן זה מפעיל השפעות נוגדות דלקת, נוגדות חמצון ומעכבות אפופטוזה. במודלים שונים של פגיעה כלייתית, מתן מונטלוקסט נקשר להפחתה בפרוקסידציה של ליפידים, לחיזוק הגנות נוגדות חמצון אנדוגניות, לנזק היסטופתולוגי פחות חמור ולהחלשה של הפגיעה בכליות18,19,20,21,22.

הראיות הבוחנות באופן ספציפי את השימוש ב-montelukast ב-CI-AKI נותרו מוגבלות. ממצאים ניסיוניים זמינים מצביעים על כך שהשפעותיו הכליתיות עשויות לכלול מודולציה של אותות חמצוניים ודלקתיים. ביטוי מופחת של NADPH oxidase 4 (NOX4), p22phox, ו-NF-κB הוצע כמנגנון אחד שדרכו montelukast עשוי להפחית פגיעה כליתית הקשורה לחומר ניגוד9.

NAC ו-montelukast משפיעים על מסלולים נפרדים חלקית אך חופפים המעורבים בפגיעה כלייתית. NAC תומך בעיקר בהגנה אנטי-אוקסידנטית, בעוד של-montelukast ישנן פעולות אנטי-דלקתיות ואנטי-אוקסידנטיות כאחד. לכן, מתן סימולטני של חומרים אלו עשוי להשפיע על מרכיבים מרובים של הפתופיזיולוגיה של CI-AKI; עם זאת, השאלה האם האינטראקציה ביניהם יוצרת תועלת אדיטיבית או סינרגית לא הוכחה במודלים ניסיוניים18,19,20,21,22.

מחקרים קודמים העריכו בעיקר התערבויות שניתנו לפני החשיפה לחומר ניגוד, בעוד שהראיות בנוגע לטיפולים שהחלו לאחר החשיפה נותרו דלילות. בפרט, מתן מונטelukast יחד עם NAC לאחר החשיפה לחומר ניגוד נחקר באופן מוגבל במודלים ניסיוניים של CI-AKI. לפיכך, המחקר הנוכחי העריך את השפעתם של montelukast ו-NAC, שניתנו לאחר החשיפה לחומר ניגוד בנפרד או בשילוב, ביחס לתפקוד הכליות, מדדי עקה חמצונית ומנגנוני הגנה אנטי-אוקסידנטיים, סממנים ביולוגיים של פגיעה כלייתית ודלקת, ושינויים היסטופתולוגיים במודל של חולדות עם CI-AKI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסויים שכללו בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המקובלות בינלאומית לטיפול בבעלי חיים למעבדה ושימוש בהם, ועמדו בדרישות ה-Animal Research: Reporting of בתוך הגוף (In Vivo) הנחיות לניסויים (ARRIVE). הפרוטוקול הניסויי אושר על ידי הוועדה המקומית לאתיקה של ניסויי בעלי חיים באוניברסיטת Ahi Evran, קרשאהיר (Kırşehir), טורקיה (החלטה מס' 2, ישיבה מס' 12, תאריך: 12 ביוני 2025). נעשה כל מאמץ למזער את סבל בעלי החיים ולהפחית את מספר בעלי החיים ששימשו לאורך המחקר. פרטיהם של כל הריאגנטים והציוד ששימשו רשומים ב- טבלת חומרים.

הכנת כימיקלים

במחקר זה נעשה שימוש ב-Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), indomethacin, iohexol, montelukast sodium ו-NAC. תמיסת L-NAME בריכוז 10 mg/mL הוכנה בתמיסת סליין (normal saline) סטרילית 0.9% באמצעות 1 g של L-NAME ל-100 mL. התמיסה הוכנה באופן טרי ביום המתן והושתמשה ללא אחסון מעבר לאותו יום. להשראת מודל ה-CI-AKI הניסויי, L-NAME ניתן בווריד (IV) במינון של 10 mg/kg. עבור חולדה השוקלת כ-220 g, הכמות המחושבת הייתה כ-2.2 mg, המקבילה לנפח מתן של כ-0.22 mL. Indomethacin הוכנה בתמיסת sodium bicarbonate 5% בריכוז של 10 mg/mL על ידי המסה של 100 mg בנפח סופי של 10 mL. התמיסה עברה ערבוב ב-vortex עד להומוגניות ויזואלית. ה-pH הסופי של תמיסת ה-indomethacin שהוכנה לא נמדד במהלך הניסוי ולכן לא ניתן היה לקבוע אותו רטרוספקטיבית. הליך סטריליזציה או סינון ספציפי עבור תמיסת ה-indomethacin שהוכנה לא תועד ברשומות הניסוייות ולכן לא ניתן היה לדווח עליו רטרוספקטיבית. לא נקבע או הוערך טווח יציבות רשמי; התמיסה הוכנה באופן טרי והושתמשה באותו היום. להשראת מודל ה-CI-AKI הניסויי, indomethacin ניתן בווריד במינון של 10 mg/kg. עבור חולדה השוקלת כ-220 g, הכמות המחושבת הייתה כ-2.2 mg, המקבילה לנפח מתן של כ-0.22 mL.

הפורמולציה המסחרית של iohexol, המכילה 647 mg iohexol/mL וריכוז יוד שווה ערך של 300 mg/mL, הנתנה ללא דילול נוסף. הטמפרטורה המדויקת של ה-iohexol בזמן ההזרקה לא תועדה. לא ניתן היה לאמת באופן מהימן ערך אוסמולליות ספציפי לפורמולציה מתוך הרשומות הניסוייות הזמינות, ולכן הוא אינו מדווח. להשראת מודל ה-CI-AKI הניסויי, iohexol ניתן בווריד במינון של 3 g יוד/kg. בחולדה השוקלת כ-220 g, מינון זה סיפק כ-0.66 g של יוד והתאים לנפח הזרקה של כ-2.2 mL.

הוכנה תרחיף של montelukast sodium ב-0.5% carboxymethyl cellulose (CMC). התרחיף הוכן טרי בכל יום של מתן התרופה ועבר ערבול ב-vortex מיד לפני המנה כדי להבטיח פיזור אחיד של החלקיקים התלויים. מינון ה-montelukast הנדרש עבור כל חיה חושב בנפרד על בסיס משקל הגוף שנמדד בתחילת המחקר, באמצעות הנוסחה הבאה: מינון נדרש (mg) = משקל גוף (kg) × 10 mg/kg. עבור חיה השוקלת כ-220 g, המינון המחושב היה כ-2.2 mg והועבר באמצעות הזנה פומית (oral gavage). התרחיף נבדק חזותית לפני כל מתן, וכל תכשיר שהראה שקיעה עבר ערבול חוזר ב-vortex לפני השימוש.

NAC ניתן לקבוצות הטיפול מהפורמולציה המסחרית שלו ללא דילול נוסף במינון תוך-peritonei של 100 mg/kg. עבור כל בעל חיים, חושב המינון הנדרש באופן פרטני על סמך משקל הגוף שנרשם בתחילת המחקר. בבעל חיים ששקלו כ-220 g, הדבר תאם לכ-22 mg של NAC ולנפח מתן של כ-0.15 mL. לפני מתן המינון, התמיסה נבדקה ויזואלית, ורק תכשירי שהיו צלולים וללא חלקיקים נראים לעין שימשו לניסוי.

כל תמיסה עברה בדיקה חזותית לפני המתן. התמיסות של L-NAME, indomethacin, iohexol ו-NAC נבדקו לאיתור שינויי צבע וחלקיקים נראים לעין. מיד לפני המתן, תרחיף ה-montelukast עבר ערבוב ב-vortex ובדיקה חזותית כדי לאשר אחידות. כל תמיסה שלא עמדה בקריטריוני קבלה אלו לא הייתה בשימוש. במהלך הכנתם והמתנתם של כל הכימיקלים נלבשו חלוקי מעבדה, כפפות מגן והגנה לעיניים. כל ההליכים בוצעו בהתאם לדרישות בטיחות המעבדה והבטיחות הביולוגית המוסדיות.

בחירת בעלי חיים, דיור, קבוצות ניסוי והקצאה רנדומלית

שלושים חולדות ויסטאר לבנות זכרים בוגרות (בגיל 8–12 שבועות; משקל גוף, 200–220 g) הושגו ממעבדת המחקר לבעלי חיים ניסיינים של אוניברסיטת אהי אווראן, קירשהיר, טורקיה. נבחרו חולדות זכרים כדי לשמור על עקביות מתודולוגית עם מודלים של CI-AKI ניסיינים שפורסמו בעבר, וכדי למנוע את הכנסת שלב מחזור הייחמה כמשתנה ביולוגי נוסף. המין לא נבחן כמשתנה ניסייני במחקר הנוכחי. מתקן בעלי החיים החזיק ברישיון גידול/ייצור מספר 184, והחולדות גודלו ונשמרו שם בתנאי מעבדה סטנדרטיים. בעת הגיוס, לבעלי החיים לא היה סטטוס מתועד של נקיים מפתוגנים ספציפיים (SPF) או סיווג בריאותי מיקרוביולוגי רשמי אחר. כל חולדה שכנה בנפרד בכלוב פוליקרבונט במידות של 40 cm × 25 cm × 20 cm, כאשר נסורת אורן קצוצה גס שימשה כמצע. תנאי החדר נשמרו על 24 °C ± 2 °C ולחות יחסית של 35% ± 10% באמצעות מערכת אוטומטית לבקרת סביבה ואוורור. הוחל לוח זמנים של 12 שעות אור/12 שעות חושך, עם תאורה מהשעה 07:00 עד 19:00. לא סופקה העשרה סביבתית ייעודית במהלך שלב ההסתגלות בן 7 הימים או בתקופה הניסיינית שבאה בעקבותיה. מזון כופתיות סטנדרטי למכרסמים ומי ברז היו זמינים ad libitum, למעט תקופה מוגדרת של 16 h של מניעת מים לפני השראת ה-CI-AKI. הרכב המזון היה 24% חלבון גולמי, 3.94% תאית גולמית, 5.08% שומן גולמי, 8.8% אפר גולמי, 1.44% ליזין, 0.61% מתיונין, 1.14% סידן, 0.89% זרחן ו-0.28% נתרן. כל בעלי החיים עברו הסתגלות במשך 7 ימים לפני תחילת ההליכים הניסייניים. תצפיות יומיות נערכו הן במהלך תקופת ההסתגלות והן במהלך התקופה הניסיינית כדי להעריך את המצב הכללי, צריכת מזון ומים, ניידות, יציבה, מראה הפרווה וכל סימן למצוקה. כדי למזער הטיות בבחירה, בעלי החיים חולקו לחמש הקבוצות הניסייניות באמצעות רצף הקצאה אקראית שהופק במחשב, כאשר שש חולדות הוקצו לכל קבוצה. גודל המדגם נקבע על ידי ניתוח עוצמה a priori באמצעות G*Power גרסה 3.1.9.6.

גודל המדגם נקבע באמצעות ניתוח עוצמה (power analysis) מוקדם עבור ניתוח שונות חד-כיווני עם השפעות קבועות (fixed-effects one-way ANOVA) הכולל חמש קבוצות ניסוייות. בהנחה של גודל אפקט (f) של 0.65, שיעור שגיאה מסוג I (α) של 0.05 ועוצמה סטטיסטית של 80%, חושב גודל המדגם הכולל הנדרש כ-30 בעלי חיים, המקבילים לשישה בעלי חיים לכל קבוצה. גודל האפקט (f = 0.65) הונח מראש כייצוג של אפקט בין-קבוצתי כולל גדול עבור ההשוואה בין חמש הקבוצות. החישוב נועד לקבוע את גודל המדגם הנדרש לזיהוי אפקט כולל שכזה, ולא תוכנן באופן ספציפי לזיהוי הבדלים זוגיים קטנים יותר בין קבוצות הטיפול הפעילות. בעל החיים הבודד נחשב ליחידה הניסויית עבור כל הניתוחים.

מלבד טיפול שגרתי, ניטור בריאות יומי והליכים סופיים, בעלי החיים בקבוצת הביקורת לא עברו טיפול או ריסון הקשורים לפרוטוקול, מניעת מים, הזרקות תוורידיות או תוצלומיות, הזנה דרך גרב (oral gavage), או מתן חומר נשאי (vehicle). קבוצת ה-CI-AKI כללה בעלי חיים שבהם הוקם מודל CI-AKI ביום 8 ושלא קיבלו טיפול. קבוצת ה-CI-AKI + Montelukast כללה בעלי חיים שבהם הוקם מודל CI-AKI ובהמשך טופלו ב-montelukast. קבוצת ה-CI-AKI + NAC כללה בעלי חיים שבהם הוקם מודל CI-AKI ובהמשך טופלו ב-NAC. קבוצת ה-CI-AKI + Montelukast + NAC כללה בעלי חיים שבהם הוקם מודל CI-AKI ובהמשך טופלו בשילוב של montelukast ו-NAC. לא קבוצת הביקורת ולא קבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה עברו הליכי דמה (sham) תואמים לטיפול. באופן ספציפי, לא בוצעו בקבוצות אלו טיפול דמה, הזנה דרך גרב דמה, הזרקות טיפול דמה, או מתן חומר נשאי תואם לטיפול. החומרים הנשאיים ששימשו להכנת L-NAME, indomethacin ו-montelukast היו תמיסת סליין נורמלית 0.9%, תמיסת סודיום ביקרבונט 5% ו-0.5% CMC, בהתאמה, כפי שמתואר בהכנת הכימיקלים. NAC ניתן מהפורמולציה המסחרית שלו ללא דילול נוסף, ולא הוכנה עבורו תמיסה נשאית נפרדת. ביום 8, כל בעלי החיים למעט אלו שבקבוצת הביקורת עברו 16 h של מניעת מים, ולאחריהם מתן תוורידי רצוף של L-NAME (10 mg/kg), indomethacin (10 mg/kg), ו-iohexol (3 g iodine/kg) כדי להשרות פגיעה כלייתית חריפה מושרית ניגודיות (contrast-induced acute kidney injury). בקבוצות הטיפול הייעודיות, montelukast (10 mg/kg, הזנה דרך גרב) ו/או NAC (100 mg/kg, הזרקה תוצלומית) ניתןו תחילה שעה אחת לאחר השלמת מתן ה-iohexol ביום 8, מה שמתבגר לכ-1.5 h לאחר מתן ה-L-NAME, ובהמשך ניתןו פעם ביום באותה השעה בימים 9 ו-10.

פרוטוקול למתן תרופה

CI-AKI הוקם בהתאם לפרוטוקול ניסויי שפורסם, המורכב מ-16 h של מניעת מים, ולאחריהן מתן תוורידי רצף של L-NAME, indomethacin ו-iohexol23,24,25. L-NAME ו-indomethacin ניתנו במינון של 10 mg/kg כל אחד, בעוד ש-iohexol ניתן במינון של 3 g iodine/kg. מינוני הטיפול היו 10 mg/kg עבור montelukast sodium ו-100 mg/kg עבור NAC. בחירת המינונים להשראת המודל ולטיפול הונחתה על ידי מחקרים ניסוייים שפורסמו בעבר22,26,27. לא בוצע מחקר מקדימה לקביעת טווח מינונים או אופטימיזציה של המינון. מינוני ה-NAC וה-montelukast נבחרו באופן עצמאי בהתבסס על מחקרים ניסוייים שפורסמו בעבר על כל אחד מהחומרים בנפרד, ולא נגזרו ממחקר למציאת מינון ספציפי לשילוב ביניהם. המינונים שנבחרו לא נועדו לייצג חשיפות שוות מבחינה פרמקולוגית, ולא בוצע ניתוח של תגובה למינון או ניתוח רשמי של אינטראקציה בין תרופות. לא נעשה שימוש בסף מספרי או מעבדתי שנקבע מראש כדי להגדיר השראה מוצלחת של המודל ברמת החיה הבודדת. בנקודת הסיום של המחקר, הקמה מוצלחת של פגיעה כלייתית נתמכה על ידי השינויים ההיסטופתולוגים האופייניים שנצפו בקבוצת ה-CI-AKI שלא טופלה בהשוואה לקבוצת הביקורת (Control). ביום 8, כל בעלי החיים למעט אלו שבקבוצת הביקורת עברו תקופה אחת של 16 h של מניעת מים מיד לפני השראת פגיעה כלייתית חריפה מושרית ניגוד (contrast-induced acute kidney injury). מניעת המים לא חזרה על עצמה במהלך שאר התקופה הניסוית. מזון כופתי סטנדרטי נותר זמין ad libitum לאורך כל תקופת מניעת המים. עם השלמת תקופת מניעת המים הבודדת של 16 h, הגישה למי ברז הוחזרה בו-זמנית ו-ad libitum בכל קבוצות הניסוי שסבלו ממניעת מים, לפני מתן החומר הראשון להשראת המודל, L-NAME, ונשמרה למשך שאר התקופה הניסוית. תזמון ותנאי החזרת המים היו זהים בכל הקבוצות שסבלו ממניעת מים. צריכת המים לאחר ההחזרה לא הוגבלה לנפח שהוגדר מראש ולא נמדדה כמותית. לא נמדדו משקלי גוף זוגיים מיד לפני ואחרי תקופת מניעת המים של 16 h; לכן, לא ניתן היה לחשב את אחוז ירידת משקל הגוף הקשורה להתייבשות. תפוקת השתן לא נוטרה כמותית. לאחר החזרת הגישה למים, הוחלה השראת ה-CI-AKI. כל מתן התוורידי הרצף של L-NAME, indomethacin ו-iohexol בוצע דרך וריד זנב צדי באמצעות מחט 26 G המחוברת למזרק סטרילי של 5 mL. לפני המתן התוורידי, הזנב חומם במים למשך מספר דקות כדי להקל על הוויזואליזציה וההתרחבות של ורידי הזנב הצדיים. לאחר כל מתן תוורידי, הוזרם לווריד 0.5 mL של תמיסת סליין סטרילית 0.9%, בנוסף  לנפח המתן המחושב של החומר הרלוונטי להשראת המודל. אתר ההזרקה נוטר ויזואלית לאורך כל תהליך המתן וההזרמה כדי לבדוק נפיחות, דליפה או עדות לדליפה חוץ-ורידית (extravasation). L-NAME (במינון 10 mg/kg) ניתן ראשון. חמש עשרה דקות לאחר מתן L-NAME, ניתן indomethacin (במינון 10 mg/kg) תוורידית דרך אותו וריד זנב צדי. חמש עשרה דקות לאחר מתן indomethacin, ניתן iohexol תוורידית דרך אותו וריד זנב צדי במינון של 3 g iodine/kg. עבור כל בעל חיים, מינון ה-iohexol ונפח ההזרקה התואם חושבו באופן אינדיבידואלי בהתבסס על משקל הגוף שנרשם בתחילת המחקר ועל ריכוז יוד מסחרי של 300 mg iodine/mL. הדבר תאם לנפח מתן של 10 mL/kg ולכן, בערך 2.0–2.2 mL עבור חולדות השוקלות 200–220 g. לא נקבע מראש נפח תוורידי מקסימלי מותר המוגדר בפרוטוקול; המתן התוורידי הגדול ביותר של חומר בודד שנעשה במחקר זה היה iohexol במינון 10 mL/kg. Iohexol ניתן לאט לאורך כ-1–2 min. מתן תוורידי מוצלח אומת על ידי היעדר נפיחות נראית, דליפה או דליפה חוץ-ורידית באתר ההזרקה. לא נצפתה דליפה חוץ-ורידית חלקית, ושום הזרקה לא דרשה ניסיון חוזר או מתן מינון חוזר עקב חשד לדליפה חוץ-ורידית. שעה לאחר השלמת מתן ה-iohexol, ניתן לראשונה הטיפול הייעודי לקבוצות הטיפול. מכיוון שמתן ה-iohexol הוחל 30 min לאחר מתן L-NAME והושלם לאורך כ-1–2 min, תחילת הטיפול התרחשה כ-91–92 min (כ-1.5 h) לאחר מתן L-NAME. Montelukast sodium (במינון 10 mg/kg) ניתן באמצעות הזנה דרך פה (oral gavage), בעוד ש-NAC (במינון 100 mg/kg) ניתן תוך-צפקית (intraperitoneally).

הזנה פומית (Oral gavage) בוצעה באמצעות קנולה להזנה מפלדת אל-חלד במידה 22 G. כל חיה נשמרה במצב זקוף, והקנולה להזנה הוכנסה בעדינות דרך הוושט אל תוך הקיבה. במקרים של התנגדות מוגברת, הקנולה נשלפה ומוקמה מחדש לפני המתן. החיה נבחנה לאיתור רפלקס הקאה (regurgitation) במהלך ההזנה ומיד אחריה. לא נצפה רפלקס הקאה או כל עדות אחרת למינון פומית חלקי במהלך ההזנה או מיד אחריה באף אחת מהחיות, ואף חיה לא הוצאה מהמחקר על בסיס חשד למתן פומית לא מוצלח. הזרקות תוך-פעטוניות (Intraperitoneal) בוצעו לרביע הימני התחתון של הבטן. המחט הוכנסה בזווית של כ-30°–45°, ובוצעה שאיבה (aspiration) לפני ההזרקה כדי לוודא שלא חלה כניסה שגויה לכלי דם. אתר ההזרקה נוטר visually במהלך המתן ומיד אחריו כדי לבדוק דליפה, דימום או סיבוכים נראים אחרים. הטיפולים שנקבעו ניתנו פעם ביום באותה שעה בימים 8, 9 ו-10. בהתאם לכך, חיות בקבוצת CI-AKI + Montelukast קיבלו montelukast פעם ביום למשך שלושה ימים רצופים, חיות בקבוצת CI-AKI + NAC קיבלו NAC פעם ביום למשך שלושה ימים רצופים, וחיות בקבוצת CI-AKI + Montelukast + NAC קיבלו הן montelukast והן NAC פעם ביום בהתאם לאותו לוח זמנים של טיפול למשך 3 ימים. כל פעולות השראת המודל והמתן הטיפולים בוצעו על ידי אותו חוקר. משקל הגוף נמדד פעם אחת עבור כל חיה בתחילת המחקר ולא נמדד שוב במהלך תקופת הניסוי. עבור כל חיה, המינון ונפח המתן התואם של כל חומרי השראת המודל והטיפולים במחקר חושבו באופן פרטני באמצעות משקל הגוף שנרשם בתחילת המחקר. כל פרוצדורות ההזרקה הוורידית, התוך-פעטונית וההזנה הפומית בוצעו באמצעות אותה טכניקה סטנדרטית כדי למזער שונות הקשורה למתן החומרים.

הליך ההמתה, נקודות סיום הומניות ואיסוף דגימות

בעלי החיים נבחנו פעם ביום לאורך כל הניסוי כדי לזהות שינויים במצב הכללי, בצריכת מזון ומים, בניידות, בתנוחה, במראה הפרווה ובסימני מצוקה. נקודות הסיום ההומניות שהוגדרו מראש כללו רפיון בולט, חוסר יכולת להגיע למזון או למים הזמינים או לצרוך אותם, תנוחה לא תקינה, ירידה בניידות, פילוארקציה (זקיפת שיער) מתמשכת וכל ביטוי גלוי אחר של מצוקה. בעלי חיים שעמדו באחד מקריטריונים אלו היו אמורים לעבור הרגאנימי מיידי; עם זאת, אף בעל חיים לא עמד בקריטריונים לנקודות הסיום ההומניות במהלך המחקר. ביום ה-11, 24 h לאחר הטיפול האחרון, הושרה הרדמה עמוקה באמצעות מתן תוך-פריטוני של ketamine (80 mg/kg) יחד עם xylazine (10 mg/kg). היעדר תגובת נסיגה של הכף (pedal withdrawal response) שימש לאימות של מישור הרדמה הולם. לאחר שאישרו עומק הרדמה מספיק, נדגמו כ-3–5 mL דם מכל בעל חיים באמצעות דקירה תוך-לבבית. ההרגאנימי הושלם לאחר מכן על ידי דימום עד מוות בעוד בעל החיים נשאר תחת הרדמה עמוקה. היעדר פעילות לבבית ונשימה ספונטנית שימשו לאישור המוות.

דם שנאסף למדידות ביוכימיות של סרום הוכנס למבחנות ללא נוגדי קרישה והושאר עד להשלמת קרישת הדם. לאחר מכן, המבחנות סובבו בצנטריפוגה במהירות של 3,000 × g למשך 10–15 min בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן הופרד פלג הסרום ואוחסן בטמפרטורה של −80 °C עד לניתוח. דגימות המיועדות למדידת גלוטתיון נאספו בנפרד במבחנות המכילות ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). מכיוון שדגימות אלו עברו אנטי-קוואגולציה, הן עובדו ללא שלב קרישה בהתאם לנוהל בדיקת הגלוטתיון המתאים. הפרדת הסרום נחשבה לקבילה כאשר הסרום שהופק היה צלול ולא הראה עדות נראית לעין להמוליזה.

לאחר אישור המוות, בוצעה לפרוטומיה חצצית והכליות משני הצדדים הוסרו בזהירות מכל בעל חיים. רקמות שומן ורקמות חיבור מסביב ננקו מהדגימות. הכליה הימנית נשמרה אך ורק לצורך בדיקה היסטופתולוגית, בעוד הכליה השמאלית הוקצתה לניתוח ביוכימי. רקמה מעורבת מהכליה השמאלית נותחה ללא דיסקציה נפרדת של קליפת הכליה (renal cortex) והמוח (medulla). שתי הכליות טופלו באופן עצמאי, ודגימות מבעלי חיים שונים נשמרו בנפרד לאורך כל תהליך העיבוד ללא איחוד דגימות. הכליה הימנית כולה הוכנסה ל-10% neutral buffered formaldehyde ועובדה לצורך הערכה היסטופתולוגית. נחתכים הכוללים את קליפת הכליה והמוח החיצוני הוכנו ונבחנו בהתאם לנהלים המתוארים בעיבוד ובדירוג ההיסטופתולוגי. כל כליה שמאלית סומנה באופן אינדיבידואלי ונשמרה ב-80 °C- עד להומוגניזציה ובדיקה ביוכימית. לאחר הכריתה, נבדקה שלמות הרקמה באופן מקרוסקופי, וכמות מספקת של רקמה נשמרה לצורך ההערכות ההיסטופתולוגיות והביוכימיות המתוכננות.

החוקר האחראי על השראת המודל ומתן הטיפול לא יכול היה להיות מסווג, כיוון שהקבוצות הניסוייות עברו פרוצדורות שונות. עם זאת, זהות הקבוצות נסתרה מהחוקרים שביצעו את הניתוחים הביוכימיים והסטטיסטיים ומהפתולוג שביצע את ההערכות ההיסטופתולוגיות. כל בעלי החיים שהוכנסו למחקר נשמרו בו ונכללו בניתוחים העוקבים. דגימות ביולוגיות, רקמות מבעלי חיים, מקבעים מבוססי פורמאלדהיד וחומרים כימיים פסולתיים אחרים טופלו תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים. סילוק כל הפסולת הביולוגית והכימית בוצע בהתאם לדרישות המוסדיות לבטיחות ביולוגית וניהול פסולת מסוכנת.

ניתוחים ביוכימיים

מדידות ביוכימיות בוצעו באמצעות סרום, דם עם נוגד קרישה EDTA, והומוגנאטים של רקמת הכליה השמאלית שנאספו מכל חיה. ההליכים מוצגים להלן בהתאם למטריצה הביולוגית ששימשה עבור כל פרמטר. הסרום נסרק עבור urea, חנקן Urea בדם (BUN), creatinine, superoxide dismutase (SOD), ו-malondialdehyde (MDA). Urea, BUN ו-creatinine שימשו כמדדים לתפקוד הכליות, בעוד שפעילות SOD וריכוז MDA הוערכו כפרמטרים של עקה חמצונית. ערכי Urea ו-BUN בסרום התקבלו באמצעות אותה בדיקת enzymatic urease–glutamate dehydrogenase. בשיטה זו, urea עברה הידרוליזה על ידי urease לייצור אמוניה, אשר הגיבה לאחר מכן עם 2-oxoglutarate ו-reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) בנוכחות glutamate dehydrogenase. השיטה האנליטית ששימשה הייתה בדיקת קינטיקה מסוג enzymatic urease–glutamate dehydrogenase. הירידה בבליעה (absorbance) כתוצאה מצריכת NADH נמדדה באופן קינטי באמצעות ספקטרופוטומטר. ריכוז creatinine בסרום נמדד קולורימטרית באמצעות אנלייזר ביוכימי אוטומטי. פעילות SOD בסרום נמדדה קולורימטרית באמצעות ערכה מסחרית על אותו אנלייזר ביוכימי אוטומטי. בדיקת ה-SOD התבססה על ייצור רדיקלים של superoxide על ידי מערכת xanthine–xanthine oxidase ותגובתם עם 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride ליצירת תוצר formazan צבעוני. הבליעה בנקודת הסיום נמדדה ב-505 nm, ופעילות ה-SOD בויתאה כ-U/mL. ריכוז MDA בסרום נקבע קולורימטרית באמצעות תגובת thiobarbituric acid. דגימות סרום עורבבו עם trichloroacetic acid קר להשקעת חלבונים, והמשקב שהתקבל הופרד על ידי סנטריפוגציה. שלב סנטריפוגציה זה בוצע ב-7,500 × g למשך 5 min ב-4 °C. התסמין (supernatant) הגיב עם thiobarbituric acid ב-90 °C למשך 60 min, קורר ונמדד ב-532 nm. ריכוזי MDA חושבו מעקומת הכיול המתאימה ובויתאו כ-nmol/mL. ניתוח Glutathione (GSH) בוצע באמצעות דם עם נוגד קרישה EDTA. חלבונים הושקעו עם trichloroacetic acid, והדגימות לאחר הסרת החלבונים נותחו קולורימטרית בשיטת Ellman משופרת. הדגימות שולבו עם 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) בבופר Tris בריכוז 500 mM ב-pH 8.2. תגובה של קבוצות התיול של GSH עם DTNB ייצרה תוצר צבעוני, והבליעה נרשמה ב-412 nm. פעילות Catalase (CAT) נקבעה באמצעות הליך קולורימטרי דו-שלבי. הדגימות עברו תחילה אינקובציה עם כמות ידועה של hydrogen peroxide, ש-catalase המירה למים וחמצן מולקולרי. לאחר סיום התגובה האנזימטית, נמדד hydrogen peroxide שיורי באמצעות ריאגנט כרומוגני. הבליעה נרשמה ב-405 nm, ופעילות ה-CAT דווחה כ-U/mL. עבור מדידות רקמת כליה, הכליה השמאלית מכל חיה שימשה כרקמה מעורבת ללא הפרדה בין הקורטקס למדולה. כפי שצוין בהליך, הכליה הימנית נשמרה אך ורק לצורך הערכה היסטופתולוגית. דגימות השייכות לחיות בודדות עובדו באופן עצמאי ולא נערבבו בשום שלב. כל דגימת כליה שמאלית עברה הומוגניזציה על קרח בבופר פוספט 50 mM ב-pH 7.4 ביחס רקמה-לבופר של 1:10 (w/v). הומוגנאט רקמת כליה ספציפי לחיה אחת נוצר עבור כל חולדה. אליקוטים נפרדים של הומוגנאט זה שימשו למדידות השונות של רקמת הכליה, כדי להבטיח שכל הפרמטרים נגזרו מאותה חיה בודדת. ההומוגנאטים של רקמת הכליה שהתקבלו עברו סנטריפוגציה ב-14,000 × g למשך 10 min ב-4 °C. לאחר הסנטריפוגציה, התסמין שהתקבל מכל חיה נאסף בנפרד וחולק לאליקוטים עבור ניתוחי רקמת הכליה המתוכננים. ריכוזי Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-1 beta (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), cystatin C, ו-KIM-1 בתסמיני רקמת הכליה נמדדו באמצעות ערכות enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ספציפיות לחולדות. הבדיקות בוצעו בהתאם לפרוטוקולי היצרן. תנאי האינקובציה היו זהים עבור בדיקות ה-ELISA של TNF-α, IL-1β, IL-6, cystatin C, ו-KIM-1. עבור כל בדיקה, הדגימות וריאגנטי ה-ELISA עברו אינקובציה למשך 1 h ב-37 °C; לאחר חמישה מחזורי שטיפה, נוספו תמיסות סובסטרט A ו-B והן עברו אינקובציה למשך 10 min ב-37 °C. בקצרה, סטנדרטים ותסמיני רקמת כליה נוספו לבארים המצופים מראש בנוגדנים, ולאחריהם הנוגדן הגלאי הביוטינילי Corresponding וקומפלקס streptavidin–horseradish peroxidase. לאחר שלבי האינקובציה המפורטים, רכיבים לא קשורים הוסרו באמצעות שוטפת מיקרו-פלט אוטומטית. לאחר מכן נוספה תמיסת הסובסטרט, ותגובת הצבע הופסקה באמצעות תמיסת עצירה חומצית. הבליעה נמדדה ב-450 nm באמצעות קורא מיקרו-פלט, וריכוזי האנליטים חושבו מעקומות הסטנדרט המתאימות. מדידות ELISA של רקמת כליה בוצעו בשכפולים (duplicate). עבור כל אנליט, חושב הממוצע של שתי בארות השכפולים הטכניים כדי לקבל ערך בודד ברמת החיה. בארות שכפולים טכניים ואליקוטים נפרדים שהתקבלו מאותו הומוגנאט ספציפי לחיה לא נחשבו לתצפיות עצמאיות. כל המדידות הביוכימיות בוצעו תחת תנאים סטנדרטיים ספציפיים לבדיקה. דגימות סרום, דם עם נוגד קרישה EDTA ודגימות רקמת כליה עובדו בנפרד בהתאם לדרישות השיטות האנליטיות המתאימות. החוקרים שביצעו את הניתוחים הביוכימיים היו עיוורים להקצאת הקבוצות. החיה הבודדת, ולא כל דגימת סרום, דגימת דם, דגימת כליה, אליקוט הומוגנאט או באר שכפול טכני, נחשבה ליחידה הניסויית. בהתאם לכך, שש תצפיות עצמאיות ברמת החיה נכללו בניתוח הסטטיסטי עבור כל קבוצה ניסויית.

עיבוד ודירוג היסטופתולוגיים

דגימות מהכליה הימנית הוכנו להערכה מיקרוסקופית באמצעות עיבוד היסטולוגי שגרתי. הכליה הימנית השלמה מכל בעל חיים הוטבלה בפורמלדה 10% בבफर ניטרלי למשך 72 h בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, בוצע ייבוש של הרקמה באופן רציף באתנול בריכוזים של 50%, 70%, 80%, 96%, ו-100%, כאשר כל ריכוז הוחל למשך 1 h. לאחר מכן, הדגימות נחשפו לשני מקבצי קסילן למשך 30 min לכל מקבץ לפני הטמעה בפרפין. באמצעות מיקרוטום סיבובי, הוסרו מהבלוקים של הפרפין חתכים בעובי 5 µm שכללו הן את קליפת הכליה (renal cortex) והן את המדולה החיצונית (outer medulla).

עבור צביעה בהמטוקסילין ואאוזין (HE), נטולו מהחתכים את הפרפין והורטבו מחדש, נחשפו להמטוקסילין למשך 5 min, ונשטפו תחת מי ברז זורמים למשך 5 min נוספים. אלכוהול חומצי שימש לבידול, ולאחריו עברו החתכים תהליך כחול (bluing) במי אמוניה למשך 1 min ונצבעו בצביעה נגדית באאוזין למשך 2 min. החתכים הצבועים הובשרו לאחר מכן בריכוזי אלכוהול עולים, הבהירו באמצעות xylene, ונקבעו לצמיתות תחת כיסוי זכוכית.

חתכים שיועדו לצביעת Masson’s trichrome עברו באופן דומה דה-פראפיניזציה ורי-הידרציה. טיפול במורדנט בוצע במשך 60 min ב-56 °C, ולאחריו שטיפה תחת מי ברז זורמים במשך 10 min. לאחר מכן, החתכים טופלו ברצף ב-Weigert’s iron hematoxylin למשך 10 min, תמיסת Biebrich scarlet–acid fuchsin למשך 15 min, תמיסת phosphotungstic acid למשך 10 min, ותמיסת aniline blue למשך 10 min. לאחר טבילה ב-1% acetic acid למשך 5 min, החתכים עברו דהידרציה, הבהרה ב-xylene והרטבה עם זכוכית כיסוי.

לפני ההערכה המיקרוסקופית, נבדקה נאותות הצביעה בנפרד עבור כל שיטה. חתכים שנצבעו ב-HE נחשבו למתאימים כאשר פרטי הגרעין והניגודיות הציטופלזמית היו ניתנים להבחנה בבירור, בעוד שחתכים שנצבעו ב-Masson’s trichrome התקבלו כאשר ניתן היה להדמות בבירור מבני רקמה חיבורית. עבור כל בעל חיים, נבחנו שלושה חתכים שנצבעו ב-HE ושלושה חתכים שנצבעו ב-Masson’s trichrome. חמישה שדות מיקרוסקופיים שנבחרו באופן אקראי הוערכו בכל חתך באמצעות עדשה של 40×. בהתאם לכך, נבחנו 15 שדות מיקרוסקופיים לכל שיטת צביעה עבור כל בעל חיים. כל הבדיקות המיקרוסקופיות בוצעו באמצעות אותה עדשה ובתנאי הערכה סטנדרטיים בכל בעלי החיים ובכל הקבוצות הניסוייות. חתכים שנצבעו ב-Masson’s trichrome הוערכו באופן איכותני עבור התפלגות והשקעה של קולגן אינטרסטיציאלי, הצטברות מטריקס חוץ-תאי ומבנה טובולו-אינטרסטיציאלי. חתכים אלו לא שימשו ליצירת ציוני הפגיעה ההיסטופתולוגית החצי-כמותיים 0–3. פוטומיקרוגרפים נבחרים שנצבעו ב-HE וב-Masson’s trichrome הושגו באמצעות עדשה של 40×, וסרגל קנה מידה של 100 µm נכלל בכל תמונה נבחרת. פוטומיקרוגרפים אלו הושגו למטרות הדגמה ולא נחשבו לתצפיות עצמאיות בדירוג ההיסטופתולוגי או בניתוחים הסטטיסטיים. כל ההערכות ההיסטופתולוגיות בוצעו על ידי פתולוג מנוסה אחד שנשאר עיוור לזהות הקבוצות הניסוייות. השימוש בבודק עיוור יחיד נועד להגביל את הטיית ההערכה והשונות המיוחסת להבדלים בין בודקים. נמק טובולרי, התרחבות טובולרית, דגנרציה תאית וגודש וסקולרי דורגו באופן חצי-כמותי בחתכי כליה שנצבעו ב-HE, בהתאם למערכת שעובדה ממודלים של פגיעה כלייתית שפורסמו בעבר28,29. עבור כל פרמטר, הציונים נעו בין 0 ל-3, בהתאמה לנזק היסטופתולוגי חסר, קל, בינוני וחמור. עבור כל בעל חיים, הממצאים מחמשת השדות המיקרוסקופיים שנבחנו בכל אחד משלושת החתכים שנצבעו ב-HE, המהווים 15 שדות בסך הכל, נשקלו יחד כדי להקצות ציון בודד של 0–3 עבור כל פרמטר היסטופתולוגי. כך, כל בעל חיים תרם ציון אחד עבור נמק טובולרי, התרחבות טובולרית, דגנרציה תאית וגודש וסקולרי. חתכים היסטולוגיים ושדות מיקרוסקופיים נחשבו כדגימות-משנה בתוך בעל החיים ולא נחשבו לתצפיות עצמאיות. בתוך כל חתך, שדות מיקרוסקופיים נבחרו באופן אקראי מאזורי קורטקס כלייתי ומדולה חיצונית דומים כדי להסדיר את הדגימה האנטומית בין בעלי החיים והקבוצות הניסוייות. בעל החיים הבודד, ולא כל כליה, חתך היסטולוגי או שדה מיקרוסקופי, נחשב ליחידה הניסויית. בהתאם לכך, שש תצפיות עצמאיות ברמת בעל החיים נכללו בניתוח הסטטיסטי עבור כל קבוצה ניסויית. הערכים המוצגים ב-Table 3 מייצגים את ממוצעי הקבוצה שחושבו מהציונים האישיים ברמת בעל החיים של ששת בעלי החיים בכל קבוצה ניסויית.

ניתוח סטטיסטי

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי. החיה הבודדת נחשבה ליחידה הניסויית עבור כל הניתוחים הסטטיסטיים. כל קבוצה ניסויית כללה שש חיות בלתי תלויות (n = 6 לקבוצה). חזרות טכניות, בארי בדיקה, חתכי רקמה ושדות מיקרוסקופיים לא נחשבו לתצפיות בלתי תלויות ולא שימשו להגדלת גודל המדגם הסטטיסטי. משתנים רציפים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). נורמליות הוערכה בנפרד בתוך כל קבוצה ניסויית באמצעות מבחן Shapiro–Wilk, והומוגניות של השונויות נבחנה באמצעות מבחן Levene. בהינתן מערך ניסויי מאוזן לחלוטין עם גדלי מדגם שווים בין הקבוצות, נעשה שימוש בניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) להשוואה בין הקבוצות. השוואות זוגיות בוצעו באמצעות מבחן השוואות מרובות post hoc של Duncan. חריגים פוטנציאליים הוערכו באמצעות בחינה גרפית של תרשימי קופסה ובדיקה של תצפיות בודדות. אף תצפית לא נחשבה כמייצגת שגיאת מדידה או תוצאה ניסויית לא תקפה, ואף נקודת נתונים לא הוצאה מסיבות סטטיסטיות. ערך p-value < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סמנים לתפקוד כליות בנסיוב (urea, blood urea nitrogen ו-creatinine)

עיצוב הניסוי, חלוקת בעלי החיים לקבוצות, לוח הזמנים של הטיפול ולוח הזמנים של איסוף הדגימות במחקר הנוכחי מסוכמים ב איור 1. נצפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין הקבוצות ברמות השתן בנורם (urea), BUN וקריאטינין בסרום (p = 0.003, p = 0.003, ו-p = 0.002, בהתאמה). רמת השתן בנורם הממוצעת בסרום הייתה 67.43 mg/dL ± 53.11 mg/dL בקבוצת הביקורת ועלתה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר ניסויי זה על CI-AKI העריך טיפול לאחר חשיפה לחומר ניגוד באמצעות montelukast, NAC, או שילוב שלהם, תוך בדיקת תפקוד הכליות, פרמטרים של עקה חמצונית, תגובות דלקתיות, סמנים ביולוגיים לפגיעה כלייתית ותוצאות היסטופתולוגיות. חשיפה לחומר ניגוד גרמה לעליות משמעותיות ברמות השתן בנסיוב (urea), BUN וקריאטינין בנסיוב, ולוותה בשינויים שליליים בפרמטרים של עקה חמצונית ובסמנים ביולוגיים דלקתיים. רמות מוגברות של KIM-1 ו-cystatin C סיפקו ראיות נוספות לפגיעה כלייתית.

טיפול לאחר חשיפה לחומר ניגוד ב-montelukast, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים. במהלך הכנת כתב יד זה, נעשה שימוש בכלים מסייעים מבוססי בינה מלאכותית (AI) אך ורק לצורך עריכה לשונית ותיקון דקדוקי. לא נעשה שימוש בכלי בינה מלאכותית לצורך יצירה, ניתוח או פרשנות של נתונים, וכן לא ליצירת איורים, טבלאות או אלמנטים גרפיים כלשהם. המחברים נושאים באחראיות מלאה לתוכן כתב היד.

תרומות המחברים:

YS, CS ו-OK תרמו לתכנון ולהגייה של המחקר. YS ביצע את ההליכים הניסיוניים ואת איסוף הנתונים. OK ביצע את הבדיקות ההיסטופתולוגיות. YS ו-CS ביצעו את הניתוחים הסטטיסטיים ופירשו את הנתונים. YS כתב את טיוטת כתב היד. כל המחברים ביצעו עריכה ביקורתית של כתב היד ואישרו את הגרסה הסופית.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי היחידה לתיאום פרויקטים של מחקר מדעי של אוניברסיטת Kırşehir Ahi Evran (מספר פרויקט: TIP.A3.26.006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
 שוטפת פלטות אוטומטית (Auto Strip Washer)Bio-Tek Instruments, USAELx50שטיפה אוטומטית של פלטות ELISA.
 קורא מיקרופלטותBio-Tek Instruments, USAELx800מדידות בליעה ב-ELISA.
RRID:SCR_028651
פורמלין ניטרלי בבפר (10% Neutral Buffered Formalin)Merckלא רשוםקיבוע רקמות להיסטופתולוגיה.
צנטריפוגת שולחניתNüveNF048הכנת דגימות וצנטריפוגציה.
קרבוקסימתילצלולוז (CMC)Sigma-Aldrich, USAC5678חומר נשאי לתמיסת מונטelukast.
ערכה אוניברסלית ל-CATOtto ScientificOtto3051מדידה קולורימטרית של פעילות CAT בסרום באמצעות אנלייזר כימי Mindray BS-400.
הומוגנייזר דיגיטליDaihan ScientificHG-15Dהומוגניזציה של רקמות.
אאוזין Y (צהבהב)Merck1.15935.0025צביעת HE.
תמיסת המטוקסילין של האריסBSLABBS-002צביעת HE.
אינדומטציןSigma-Aldrich, USAI7378משמש להשראת CI-AKI.
יוהקסול (Omnipaque 300)GE HealthCareלא רשוםחומר ניגוד המשמש להשראת CI-AKI.
קטמין הידרוכלוריד (Ketalar)Pfizer, USAלא רשוםהרדמה כללית לפני איסוף דגימות.
מיקרוסקופ אור (Nikon Eclipse)NikonNi-Uבדיקה והדמיה היסטופתולוגית.
RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)Sigma-Aldrich, USAN5751משמש להשראת CI-AKI.
ערכת צביעת טריכרום של מסוןMOSLAB, TürkiyeBKMTO001צביעת טריכרום של מסון.
אנלייזר כימי MindrayMindrayBS-400ניתוחים ביוכימיים.
מונטelukast נתרןSigma-Aldrich, USASML0101ניתן דרך הפה באמצעות זריקה (gavage) כטיפול.
N-אצטילציסטאין (ASIST 300 mg/2 mL)MAC figure-materials-1laç, Türkiyeלא רשוםניתן תוך-פריטוניאלית כטיפול.
ערכת ELISA ל-Cystatin C בחולדהBT Lab, ChinaE0145Raמדידת ELISA של cystatin C בעיקרי רקמה כלייתית.
ערכת ELISA ל-IL-1β בחולדהBT Lab, ChinaE0119Raמדידת ELISA של IL-1β בעיקרי רקמה כלייתית.
ערכת ELISA ל-IL-6 בחולדהBT Lab, ChinaE0135Raמדידת ELISA של IL-6 בעיקרי רקמה כלייתית.
ערכת ELISA ל-KIM-1 בחולדהBT Lab, ChinaE0549Raמדידת ELISA של KIM-1 בעיקרי רקמה כלייתית.
ערכת ELISA ל-TNF-α בחולדהBT Lab, ChinaE0764Raמדידת ELISA של TNF-α בעיקרי רקמה כלייתית.
מחט האכלה מפלדת אל-חלד (קנולה להזנה פומית 22 G)Instech Laboratories, USAלא רשוםמתן תרופה דרך הזנה פומית (gavage).
מזון גרגירים סטנדרטי למכרסמים (Optima)Optima, Türkiyeלא רשוםמספר אצווה 58931. הרכב תזונתי: 24% חלבון גולמי, 3.94% תאית גולמית, 5.08% שומן גולמי, 8.8% אפר גולמי, 1.44% ליזין, 0.61% מתיונין, 1.14% סידן, 0.89% זרחן ו-0.28% נתרן.
ערכה אוניברסלית לקריאטיניןOtto ScientificOttoBC139מדידה קולורימטרית של קריאטינין בסרום.
ערכה אוניברסלית ל-GSHOtto ScientificOtto3053מדידה קולורימטרית של GSH בדם עם נוגד קרישה EDTA באמצעות שיטת Ellman שונויה.
ערכה אוניברסלית ל-MDAOtto ScientificOtto1001מדידה קולורימטרית של MDA בסרום באמצעות קורא מיקרופלטות ELx800.
ערכה אוניברסלית ל-SODOtto ScientificOtto3047מדידה קולורימטרית של פעילות SOD בסרום באמצעות אנלייזר כימי Mindray BS-400.
ערכה אוניברסלית לאוריאהOtto ScientificOttoBC157מדידה קולורימטרית של אוריאה ו-BUN בסרום.
קסילאזין הידרוכלוריד (Rompun)Bayer, Germanyלא רשוםהרדמה כללית לפני איסוף דגימות.

מקורות

  1. Wang Z, Wang Q, Gong X. Unveiling the mysteries of contrast-induced acute kidney injury: new horizons in pathogenesis and prevention. Toxics. 2024;12(8):620.
  2. Cho E, Ko GJ. Pathophysiology and management of radiocontrast-induced nephropathy. Diagnostics. 2022;12(1):180.
  3. Shuka N, et al. Contrast-induced nephropathy in interventional cardiology: incidence, risk factors, and identification of high-risk patients. Cureus. 2023;15(12):e51283.
  4. Shams E, Mayrovitz HN. Contrast-induced nephropathy: a review of mechanisms and risks. Cureus. 2021;13(5):e14842.
  5. Mehran R, et al. A simple risk score for prediction of contrast-induced nephropathy after percutaneous coronary intervention: development and initial validation. J Am Coll Cardiol. 2004;44(7):1393-1399.
  6. Heyman SN, Reichman J, Brezis M. Pathophysiology of radiocontrast nephropathy: a role for medullary hypoxia. Invest Radiol. 1999;34(11):685-691.
  7. Geenen RWF, Kingma HJ, van der Molen AJ. Contrast-induced nephropathy: pharmacology, pathophysiology and prevention. Insights Imaging. 2013;4:811-820.
  8. Manisaligil YA, et al. Assessment of Rac1 and β-PAK expressions in a mouse model for contrast-induced nephropathy. J Basic Clin Health Sci. 2020;4(3):230-236.
  9. Simsek O, et al. Preventative effect of montelukast in mild to moderate contrast-induced acute kidney injury in rats via NADPH oxidase 4, p22phox and nuclear factor kappa-B expressions. Int Urol Nephrol. 2025;57(7):2313-2325.
  10. Banda J, et al. Biomarkers for diagnosis and prediction of outcomes in contrast-induced nephropathy. Int J Nephrol. 2020;2020:8568139.
  11. Zisis IE, et al. Renoprotective effect of vardenafil and avanafil in contrast-induced nephropathy: emerging evidence from an animal model. J Pers Med. 2022;12(5):670.
  12. Walker H, et al. Systematic review and meta-analysis of prophylaxis use with intravenous contrast exposure to prevent contrast-induced nephropathy. Eur J Radiol. 2022;153:110368.
  13. Hossain MA, et al. Contrast-induced nephropathy: pathophysiology, risk factors, and prevention. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2018;29(1):1-9.
  14. Tepel M, et al. Prevention of radiographic-contrast-agent-induced reductions in renal function by acetylcysteine. N Engl J Med. 2000;343(3):180-184.
  15. Liu R, et al. N-acetylcysteine for the prevention of contrast-induced nephropathy: a systematic review and meta-analysis. J Gen Intern Med. 2005;20(2):193-200.
  16. Zhu R, et al. Association of N-acetylcysteine use with contrast-induced nephropathy: an umbrella review of meta-analyses of randomized clinical trials. Front Med (Lausanne). 2023;10:1235023.
  17. Sandilands EA, et al. Acetylcysteine has no mechanistic effect in patients at risk of contrast-induced nephropathy: a failure of academic clinical science. Clin Pharmacol Ther. 2022;111(6):1222-1238.
  18. Sarmadian R, et al. The renoprotective potential of montelukast: a scoping review. Ann Med Surg (Lond). 2024;86(6):3568-3576.
  19. Kokate D, Marathe P. Evaluation of effect of montelukast in the model of streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats. Indian J Endocrinol Metab. 2024;28(1):47-54.
  20. Mojtahedi SY, Ghodsi M, Pourpashang P. Renoprotective efficacy of montelukast: an overview on recent advancements. J Nephropharmacol. 2025;14(1):e12759.
  21. Sener G, et al. Chronic renal failure-induced multiple-organ injury in rats is alleviated by the selective CysLT1 receptor antagonist montelukast. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2007;83(4):257-267.
  22. Sener G, et al. Montelukast protects against renal ischemia/reperfusion injury in rats. Pharmacol Res. 2006;54(1):65-71.
  23. Li LP, et al. Intrarenal oxygenation by blood oxygenation level-dependent MRI in contrast nephropathy model: effect of the viscosity and dose. J Magn Reson Imaging. 2012;36(5):1162-1167.
  24. Liu K, et al. A novel rat model of contrast-induced nephropathy based on dehydration. J Pharmacol Sci. 2019;141(1):49-55.
  25. Alshogran OY, Al Tahrawi AY, Nusair SD. Exploring the effects of edaravone in rats with contrast-induced acute kidney injury. Life Sci. 2022;309:121006.
  26. Suddek GM. Montelukast ameliorates kidney function and urinary bladder sensitivity in experimentally induced renal dysfunction in rats. Fundam Clin Pharmacol. 2013;27(2):186-191.
  27. Aydin A, et al. The examination of the nephroprotective effect of montelukast sodium and N-acetylcysteine in renal ischemia with dimercaptosuccinic acid imaging in a placebo-controlled rat model. Acta Cir Bras. 2020;35(9):e202000905.
  28. Kara O, Kilitci A, Daglioglu G. Protective effect of resveratrol on cisplatin-induced damage in rat kidney. Cukurova Med J. 2022;47(3):990-995.
  29. Pandir D, Kara O. Cisplatin-induced kidney damage and the protective effect of bilberry (Vaccinium myrtillus L.): an experimental study. Turk J Med Sci. 2013;43(6):951-956.
  30. Iordache AM, et al. Phosphodiesterase-5 inhibitors ameliorate structural kidney damage in a rat model of contrast-induced nephropathy. Food Chem Toxicol. 2020;143:111535.
  31. Morcos SK, Thomsen HS, Webb JA. Contrast-media-induced nephrotoxicity: a consensus report. Eur Radiol. 1999;9:1602-1613.
  32. Rudnick MR, et al. Nephrotoxicity of ionic and nonionic contrast media in 1196 patients: a randomized trial. Kidney Int. 1995;47(1):254-261.
  33. Modi K, Padala SA, Gupta M. Contrast-induced nephropathy. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2025 Jan–. Updated 2025 May 5. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK448066/

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

פגיעה כלייתית מושרית חומר ניגודטיפול ב-N-acetylcysteineפגיעה כלייתית בחולדהעקה חמצוניתציטוקינים דלקתייםמדדי תפקוד כלייתיהיסטופתולוגיה של הכליהסמנים ביולוגיים לפגיעה כלייתיתמודל חולדה פרה-קליני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.