מחקר זה מדגים כי miR-1298 קשור באופן הדוק לפלישה ולנדידה ב-CRC ועשוי לתפקד כמדכא גידול על ידי עיכוב התקדמות ה-CRC, מה שמדגיש את הפוטנציאל שלו כמטרה טיפולית חדשה לטיפול ב-CRC.
מאמר מחקר
תפקידה של ציר ה-miR-1298/Bone Morphogenetic Protein 7 בסרטן המעי הגס והחטול (Colorectal Cancer)
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
השכיחות של סרטן המעי הגס והחלחולת (CRC) נמצאת במגמת עלייה בשנים האחרונות. חקרנו את המשמעות הקלינית והמנגנונים המולקולריים של miR-1298 ב-CRC. בסך הכל גויסו 85 חולי CRC. כל רמות הגנים הוערכו באמצעות RT-qPCR. בתאי CRC, רמות ה-miR-1298 וה-bone morphogenetic protein 7 (BMP7) נוסגרו באמצעות טרנספקציה של תאים. המטרה של miR-1298 נחזתה באמצעות אנליזה ביו-אינפורמטית וזוהתה באמצעות מערכת דואל-לוציפראז רפורטר. תפקוד תאי CRC הוערך באמצעות בדיקת CCK-8, בדיקת Transwell וציטומטריית זרימה. המתאם בין miR-1298 ל-BMP7 ברקמות CRC נחקר באמצעות מתאם פירסון. miR-1298 היה מופחת משמעותית ב-CRC והיה קשור למאפיינים קליני פתולוגיים ממאירים. בתאי CRC, miR-1298 דיכא פרוליפרציה, נדידה ופלישה, והגביר אפופטוזיס. BMP7 היה מטרה במורד הזרם (downstream) של miR-1298 והיה במתאם שלילי עם miR-1298. ביטוי יתר של BMP7 הפך באופן חלקי את ההשפעה המדכאת של miR-1298 על פרוליפרציה, נדידה ופלישה בתאי CRC, וכן את קידומו של האפופטוזיס. miR-1298 היה קשור לפלישה ולנדידה ועשוי לדכא את התקדמות ה-CRC. BMP7 עשוי להיות מתווך תפקודי פוטנציאלי של miR-1298 ב-CRC.
מבוא
סרטן המעי הגס והחלחולת (CRC) מהווה נטל בריאותי משמעותי ברחבי העולם, ומדורג כאחד הגורמים העיקריים למוות מסרטן בעולם1. CRC נובע מהתאים האפיתליאליים של המעי הגס והחלחולת, ומתפתח בדרך כלל בהדרגה דרך תהליך רב-שלבי הידוע כהתקדמות מאדנומה לסרטן, תהליך הנמשך מספר שנים2. להשלכות של CRC יש השפעה מרחיקה ומגוונת. בנוסף לסיכון למוות, ל-CRC עשוי להיות השפעה משמעותית על חיי היום-יום של המטופלים. הטיפול דורש בדרך כלל ניתוח נרחב, שעלול להוביל לסיבוכים כגון קולוסטומיה קבועה, תפקוד לקוי של המעי, או הפרעות בתפקוד המיני והשתן3. בנוסף, הנטל הכלכלי של כימותרפיה, טיפול ממוקד ומעקב ארוך טווח מפעיל עומס משמעותי הן על המטופלים והן על מערכת הבריאות. לכן, חקירת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ה-CRC נותרת בעדיפות מרכזית בתחום בריאות הציבור.
בסרטן המעי הגס והחלק האחורי של המעי הישר (CRC), הפרה של הבקרה על microRNAs (miRNAs) ספציפיים היא מאפיין בולט של התהליך התומוריגני ומשפיעה על תהליכי מפתח4. זיהוי ה-miRNAs הללו, המהווים ביטוי דיפרנציאלי, לא רק מעמיק את הבנתנו לגבי הפתוגנזה של CRC, אלא גם מציע נתיבים פוטנציאליים לסמנים ביולוגיים אבחנאיים חדשים ומטרות טיפוליות. מבין ה-miRNAs הרבים הקשורים לסרטן, miR-1298 הפך למטרה מרכזית למחקר. ראיות קיימות מצביעות על כך ש-miR-1298 פועל לעיתים קרובות כמדכא גידולים בסוגי סרטן שונים. לדוגמה, בסרטן ריאות מסוג שאינו תאי קטנים (NSCLC), הוא מעכב צמיחה ופלישה של תאים על ידי סימון נתיבים אונקוגניים מרכזיים5. באופן דומה, בגידולי מוח, רמות נמוכות שלו (downregulation) קשורות להתפתחות הגידול, בעוד ששחזור רמותיו מעכב את התקדמות הגידול6. לאור תפקידו המבוס כמדכא גידולים בסרטנים אחרים, תפקידו הספציפי של miR-1298 בקרצינוגנזה של המעי הגס והחלק האחורי של המעי הישר — ובמיוחד מטרות ה-downstream שלו וההשלכות התפקודיות ב-CRC — נותר במידה רבה בלתי נחקר. פער ידע זה הוא משמעותי, בהינתן הנוף המולקולרי הייחודי של CRC בהשוואה לממאירות אחרות.
BMP7 הוא ציטוקין מופרש ורב-תכליתי השייך למשפחת העל של transforming growth factor-β (TGF-β)7. ב-CRC, BMP7 ממלא בעיקר תפקיד המעודד גידול. BMP7 נמצא בדרך כלל כבעל ביטוי מוגבר ברקמות ובתאים של CRC8. BMP7 מעלה את יכולות הפלישה, הנדידה והתכונות דמויות תאי הגזע של תאי סרטן, ככל הנראה על ידי הפעלת רצפי אותות פרו-אינבזיביים וויסות של מיקרו-סביבת הגידול כדי לקדם נדידה9. בסוגים שונים של סרטן, miRNAs ספציפיים זוהו כמדכאים פוסט-טרנסקריפציונליים ישירים של BMP7. לדוגמה, miR-137 פועל כמתאם ל-BMP7 ב-NSCLC כדי לעכב את גדילת התאים10. לאור ממצאים אלו, אנו משערים ש-BMP7 עשוי להיות מעורב ב-CRC. עם זאת, השאלה האם miR-1298 פועל כמתאם ישיר ל-BMP7 ב-CRC לא תוקפה ניסיונית. יתרה מכך, אף מחקר לא אפיין באופן מקיף את ציר miR-1298/BMP7 ב-CRC באמצעות שילוב של תיקוף מכניסטי, פנוטיפיקה תפקודית ומתאם קליני.
לפיכך, מטרותינו היו: (1) לבחון את דפוס הבקרה של miR-1298 ב-CRC ואת הקשר שלו למאפיינים קליניקופתולוגיים; (2) לאפיין באופן פונקציונלי את ההשפעות של miR-1298 על פרוליפרציה, אפופטוזיס, פלישה ונדידה של תאי CRC; (3) לתקף ניסיונית את BMP7 כמטרה של miR-1298 ב-CRC; ו-(4) להעריך את הערך האבחנתי והפרוגנוסטי של miR-1298 בחולי CRC. באמצעות שילוב של גישות משלימות אלו, ביקשנו לספק הבנה מקיפה של ציר ה-miR-1298/BMP7 ב-CRC ולגלות ביומרקרים ומטרות טיפוליות חדשות למחלה זו.
פרוטוקול
המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים למוח וuhan (מספר אישור: 20220826). כל המשתתפים סיפקו הסכמה כתובה לאחר ידיעת הנעשה לפני ההירשם. המחקר נערך בהתאם להצהרת הלווסנה. התקבלה הסכמה לפרסום מכולם המשתתפים ש dữים שלהם כלולות. פרטים על הריאגנטים, קומפלטים, נוגדנים, קווי תאים, פלסמידים והציוד שהושמו במחקר זה, לרבות יצרנים ומידע קטלוגי, מופיעים ב- 테בלת חומרים.
חולים ודגימות
מאי 2022 עד אוגוסט 2024, אספנו דוגמיות של רקמות סרטניות ולא סרטניות סמוכות מ-85 מטופלים עם CRC. לא לאחד מהמשתתפים הייתה היסטוריה של סרטן, כימותרפיה או טיפול קרינה. בנוסף, נכללו במחקר זה 71 נבדקים בריאים שעשו בדיקת גוף.
תחזית
ערכי הסף לקבוצות ביטוי גבוה/נמוך של miR-1298 נקבעו על סמך רמת הביטוי הממוצעת בדגימות רקמת CRC. תקופת המעקב הייתה 12 חודשים, והמעקב בוצע באמצעות שיחת טלפון או בדיקה חוזרת. האירוע הסופי היה מוות. מבין 85 החולים, נרשמו 14 מקרי מוות במהלך תקופת המעקב, ולא היו חולים עם נתוני מעקב חסרים.
תרבות תאים והעברת גנים לתאים
השיגו את קו התאים האנושי של המנוקת הרגילה FHC, וכן את קווי תאי ה-CRC האנושיים SW480 ו-HCT-116. התאים גודלו בתווך Dulbecco'תערובת Dulbecco של חומרת Eagle (DMEM) מושרה ב-10% סרום עגל שפיר (FBS). הועברו miR-1298 דמה או מונע לתאי SW480 ו-HCT-116 באמצעות Lipofectamine 3000. לאחר מכן, הועברו באופן משותף miR-1298 דמה ו-pcDNA3.1-BMP7 (OE-BMP7) או הווקטור pcDNA3.1 (OE-NC) לתאי SW480 ו-HCT-116. השלבים הספציפיים היו כדלקמן: התאים גודלו ב-37℃ °C עם 5% CO₂ עד שהם הגיעו ל-70%–80% התלכדות. התאים הוזרקו ב-5 x 104 תאים לכל בורר בצלחת 24 בוררים והונטפו לילה אחד. תערובת טרנספציה שמכילה 250 µל של אופטי-מם, 1.25 µL של Lipofectamine 3000, 1.5 µל- P3000, 50 nM miRNA, ו-1 µג' של פלסמיד הוכנו והתוערו למשך 15 דקות לפני הוספתם לתאים. לאחר 6 שעות, הוחלף התווך בתווך DMEM שלם, והדגימות נאספו לאחר 48 שעות.
ניתוח ביואינפורמטיקה
המטרה של miR-1298 נחזתה באמצעות מסד הנתונים TargetScan 8.0 (https://www.targetscan.org/vert_80/). לאחר מכן זוהה אתר הקישוריות החזוי בין miR-1298 ל-BMP7.
בוחן דו-לוקיפרז
הבריא והמוטנט 3′-רצפי UTR של BMP7 שמכילים את אתר הקישור החזוי של miR-1298 הוכנסו לווקטור הדיווח pmirGLO בעל לומינסצנציה כפולה, כדי ליצור בהתאמה את פלסמידי הדיווח BMP7 Wt ו-BMP7 Mut. לניסוי הלומינסצנציה, תאי SW480 ו-HCT-116 הועברו בתרחיש משותף עם פלסמיד BMP7 Wt או BMP7 Mut יחד עם הדמה (mimic), חסם (inhibitor) של miR-1298 או בקרות שליליות מתאימות. השלבים הספציפיים היו כדלקמן: התאים הוזרקו לצלחות 24-תאים בעומס של 4 x 104 תאים לכל באר. כל באר הועברה באופן שותף עם 0.8 µגרם של פלסמיד דיווח, 50 ננומולר miR-1298 מימיק, איניביטור, או בקרת שלילית מתאימה, ו-Lipofectamine 3000. לאחר 8 שעות, הסרה את תוספת התווך, וקרעו את התאים על ידי הוספת 100 µל. של חומר פירוק פסיבי (PLB) למשך 15 דקות. A 20 µ50 מ"ל של ליזט הועברו לצלחת שיקוף לבנה, µנוסף L של LAR II, ונמדדה פעילות הלוסיפראז של חרק האש. נוסף 50 נוסף µL עצור&התווסף מגיב Glo למדידת Renilla. לבסוף, הושלמה הנורמליזציה של הנתונים.
RT-qPCR
RNA נמשך מתאי תרבית, סרום ורקמות CRC קפואות באמצעות חומר המנתח TRIzol. בקצרה, התאים נמסו ישירות ב-1 מ"ל של TRIzol לכל צלחת 10 ס"מ; פיסות הרקמה הומוגניזו ב-TRIzol על קרח. לאחר הפרדת הפאזות באמצעות כלורופורם והPRECIPITATION באמצעות איזופרופנול, שטפו פלטים של RNA ב-75% אתנול, יבשו באוויר ו растворו במים חסרי RNase. קבעו את טהרת RNA והריכוז שלו באמצעות ספקטרופוטומטר נפח מיקרו (A260/A280 = 1.8–2.1, A260/A230 > 2.0). לצורך ניתוח mRNA, ה-DNA הגנומי הנותר הוסר באמצעות gDNA Eraser, ו-500 ננוגרם של RNA הומרו לאחור באמצעות ערכת PrimeScript RT Reagent Kit עם אוליגו(dT) והקסמרים אקראיים (37 °15 דקות ב- C ו-85 °C למשך 5 שניות). לצורך ניתוח miRNA, 100 ננוגרם של RNA הומר ברטרנסקריפציה הפוכה עם פריימר מסוג stem-loop שספציפי ל-miR-1298-5p או ל-U6 באמצעות קיט Mir-X miRNA First-Strand Synthesis (16 °C למשך 30 דקות, 42 °C למשך 30 דקות, ו-85 °C למשך 5 שניות). כל ריצה כללה ביקורים של שליטה ללא RT ומבלי תבנית. cDNA הופשר בהתאם ומאוחסן ב- −80 °C עד ביצוע qPCR. ריכוזי miR-1298 ו-BMP7 נמדדו באמצעות כימיה של SYBR Green. U6 ו-GAPDH שימשו כבקרים פנימיים לנירמול miRNA ו-mRNA, בהתאמה. הביטוי היחסי חושב באמצעות שיטת 2 השוואתית−ΔΔ.Ct שיטה. רצפי הפריימרים (5'′–3′היו כדלקמן: miR-1298-קדימה: TCGGCAGGTTCATTCGGCTGTC, חזרה: CTCAACTGGTGTCGTGGA; U6-קדימה: CTCGCTTCGGCAGCACA, חזרה: AACGCTTCACGAATTTGCGT; BMP7-קדימה: CAAGAACCAGGAAGCCCTGC, חזרה: TTCTTACAGGCCTGCCTCTGG; ו-GAPDH-קדימה: GACATGCCGCCTGGAGAAAC, חזרה: AGCCCAGGATGCCCTTTAGT. תנאי התגובה ל-qPCR היו כדלקמן: 95 °C ל-2 דקה, 35 מחזורים של 95 °30 מעלות צלזיוס שניות, 60 °30 מעלות צלזיוס שניות, ו-72 °60 C s. תבניות cDNA הוסבו לדילולים עוקבים (5-כפליים) כדי ליצור עקומות תקן. יעילות ההגברה E חושבה באמצעות הנוסחה, E = (10-1/slope-1) × 100%. יעילות ההגברה של ה引נים חושבה באופן הבא: EmiR-1298 = 102.1%, EBMP7 = 96.3%, EGAPDH = 100.3%, EU6 = 99.8%. כל הפורמים עמדו בטווח היעילות המתקבל של 90–110%. כל ניסויי ה-RT-qPCR כללו שלושה חזרות ביולוגיות עצמאיות, כל אחת עם 3 חזרות טכניות. את יציבותם של U6 ו-GAPDH הערכנו באמצעות האלגוריתם geNorm. ערכי ה-M של שני הגנים היו מתחת לסף המומלץ של 1.5, מה שאשר את התאימותם.
בדיקת קיט ספירת תאים-8 (CCK-8)
התאים SW480 ו-HCT-116 הוזרעו בצלחות 96-תאים ב-2 × 103 תאים/באר ב-100 µL של DMEM שלם והתונבכו למשך 24 שעות. 48 שעות לאחר ההעברה, התונבכו הצלחות למשך שעה ב-37 °absorbance ב-450 ננומטר נמדד באמצעות קורא מיקרופלאט. שישה בארות רפליקה שימשו לכל קבוצה, והופחת ערך של ערך בקרה המכיל מדיום בתוספת CCK-8 ללא תאים.
Citometriya be-zri'a
האפופטוזיס נבדקה באמצעות ציטומטריית זרימה בעזרת קיט לגילוי אפופטוזיס Annexin V-FITC/PI. 48 שעות לאחר הטרנספציה, התאים SW480 ו-HCT-116 אוספו באמצעות טריפסיניזציה, שוטפו פעמיים ב-PBS קפוא, ועומסנו מחדש ב-1x binding buffer בריכוז של 1 × 106 תאים/מ"ל. חלקות של 1 x 105 התאים הועברו לצלוחות FACS, נצבעו עם 5 µ5 מ"ל של אנקסין V-FITC ו-5 µL של PI למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחשכה, ומדליכו עם 400 µלטר של חיץ קשירה לפני האיסוף. כללו ביקורות חיוביות לא ממויינות, ממויינות בודדת ומעוררות בסטאורוספורין לצורך קומפנסציה וקביעת השערים. ניתוח הנתונים בוצע באמצעות תוכנת FlowJo (FlowJo 10.2).
נדידת תאים והפרעה
העתקה והחדירה של תאים נבדקו באמצעות מיכלי טרנסוול בני 24 בוררים עם סינר בגודל 8 µמברנות PET בגודל 5 מיקרומטר. לassays של פליטה, הממברנה העליונה הוכנסה מראש עם 50 µל-מטריג'ל ב-37 °C למשך שעתיים, ואז הורעפו בתווך DMEM ללא סרום במשך 30 דקות לפני הזרעה; בבדיקות ניסיון ההגירה הושמט שלב הקריסה. תאי SW480 ו-HCT-116 שעברו העברה גנטית הורעפו בתווך DMEM ללא סרום במשך 12 שעות, ולאחר מכן 2 x 104 תאים ב-100 µלמיכל העליון הוסיפו 0.1% BSA ב-DMEM חסר סרום. למיכל התחתון הוסיפו 600 µL DMEM עם 10% FBS כמוך-משוך. לאחר 24 שעות (נדידה) או 48 שעות (השתלטות) ב-37 °ג', תאי לא מهاגרים על פני השטח העליון הוסרו באמצעות מזרק כותנה. התאים על פני השטח התחתון קובעו ב-4% פורמאלדהיד במשך 15 דקות, נצבעו ב-0.1% קריסטל ויולט במשך 20 דקות, שוטפו ונשמרו לייבוש באוויר. צולמו חמש שטחיות אקראיות לכל ממברנה בהגדלה של 200X באמצעות מיקרוסקופ הפוך וספרו ידנית על ידי שני צופים עצמאיים.
בלוט מערבי
החלבונים התוך-תאיים הכולל נמצאו על ידי שטיפת התאים בתמיסת ריסוס RIPA המשולבת בתערובת של מעכבי פרוטאאז. ריכוזי החלבונים נקבעו באמצעות קיט שיקוף פרוטאין BCA. כמויות שקולות של שברי חלבון (50) µג) הופרדו על ידי SDS-PAGE 10% והועברו לאחר מכן לזכוכית PVDF. לאחר חסימה של אתרי קשירה לא ספציפיים באמצעות BSA 2%, דוגמו הממברנות עם נוגדנים ראשוניים נגד BMP7 (1:1,000) ו-GAPDH (1:2,000) למשך 90 דקות ב-37℃ °C. לאחר שלוש שטיפות עם PBST, הוטמעו הממברנות באנטיגן משני מחובר לפראוקסידאז מתרנגול (HRP). פסי החלבון תוערו באמצעות סוכן כימילומינצנציה ECL.
ניתוח סטטיסטי
הנתונים wurden ואומנו באמצעות SPSS 27.0. כל הערכים דווחו כממוצע ± סטיית תקן ± סטיית תקן (SD), אלא אם כן צוין אחרת. בדיקת Shapiro-Wilk שימשה לבדיקת ההתפלגות הנורמלית. ההבדלים בין הקבוצות נקבעו באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג'מבחן t. ההשוואה של ביטוי miR-1298 בין רקמות גידול של CRC ורקמות לא סרטניות סמוכות נעשתה באמצעות מבחן t של סטודנט מזווג'מבחן t. לפני ביצוע מבחן הפרמטרים, נעשה שימוש במבחן לבן כדי להעריך את הומוגניות השונויות. להשוואות מרובות קבוצות, נתונים פרמטריים ניתחו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA), עם טוקי'המבחן HSD של שיף השתמש להשוואות זוגיות לאחר הממצא. המתאם בין miR-1298 ל-BMP7 ברקמות של סרטן המעי הגס נבדק באמצעות מקדם המתאם של פירסון'ניתוח מתאמי s. p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.
תוצאות
miR-1298 הופחת באופן משמעותי ב-CRC
ברקמות CRC, רמות ה-miR-1298 היו נמוכות יותר מאשר ברקמות סמוכות שאינן סרטניות (איור 1A). ניתוח של גרורות בבלוטות הלימפה גילה כי רמות miR-1298 היו נמוכות יותר אצל חולים עם גרורות בבלוטות הלימפה מאשר אצל חולים ללא גרורות בבלוטות הלימפה (איור 1B). בחולים עם CRC שגודל הגידול שלהם היה > 5 cm, רמות miR-1298 היו נמוכות משמעותית מאשר בחולים שגודל הגידול שלהם היה ≤ 5 cm (p = 0.017; איור 1C). miR-1298 פחת עם התקדמות שלב הגידול, עם הבדלים משמעותיים בין שלב 1 לשלב 3 (p = 0.047) ובין שלב 1 לשלב 4 (p = 0.09; איור 1D). בסרום של חולים עם CRC, miR-1298 הופחת באופן משמעותי (איור 1E), וניתוח עקומת ROC הראה AUC של 0.89, עם רגישות של 78.82% וספציפיות של 83.10% (איור 1F).
על בסיס רמת הביטוי החציונית של miR-1298, חולקו חולי CRC לקבוצות בעלות ביטוי נמוך וגבוה. בחולי CRC, miR-1298 היה קשור באופן הדוק לשלב TNM (p < 0.01), לגודל הגידול (p = 0.03), לגרורות בקשרי לימפה (p = 0.03) ולדיפרנציאציה של הגידול (p = 0.035). עם זאת, miR-1298 לא היה קשור לגיל (p = 0.832) או למגדר (p = 0.165) (טבלה 1). ניתוח Kaplan–Meier הראה כי לחולי CRC עם ביטוי נמוך של miR-1298 הייתה הישרדות כוללת קצרה יותר מאשר לאלו עם ביטוי גבוה של miR-1298 (log-rank p = 0.039; איור 1G). ניתוח רגרסיית Cox הצביע על כך שביטוי מופחת של miR-1298 עשוי להוות מדד פרוגנוסטי פוטנציאלי בחולי CRC (p = 0.035, טבלה 2).
miR-1298 דיכא את השגשוג וקידם אפופטוזיס בתאי CRC
בתאי SW480, טרנספקציה עם mimic או inhibitor של miR-1298 שינתה ביעילות את הביטוי של miR-1298, עם הבדל מובהק בין קבוצת ה-inhibitor NC לקבוצת ה-miR-1298 inhibitor (p = 0.05; איור 2A). ביטוי יתר של miR-1298 הפחית את חיוניות התאים וקידם אפופטוזיס, בעוד שדיכוי של miR-1298 העלה את חיוניות התאים והפחית אפופטוזיס; האפופטוזיס היה שונה באופן מובהק בין קבוצת ה-inhibitor NC לקבוצת ה-miR-1298 inhibitor (p = 0.08; איור 2B,C). בתאי HCT-16, טרנספקציה שינתה באופן דומה את הביטוי של miR-1298 (p = 0.02; איור 2D), ונצפו הבדלים מובהקים בין קבוצת ה-inhibitor NC לקבוצת ה-miR-1298 inhibitor בחיוניות התאים (p = 0.07; איור 2E) ובאפופטוזיס (p = 0.05; איור 2F).
miR-1298 דיכא את הנדידה והפלישה של תאי CRC
ביטוי יתר של miR-1298 הפחית את מספר תאי SW480 ו-HCT-16 שנדדו ופלשו, בעוד שעיכוב של miR-1298 הגביר את נדידת התאים והפלישה שלהם (איור 3A–D). בתאי SW480, מספר התאים הפולשים היה נמוך משמעותית בקבוצת ה-miR-1298 mimic מאשר בקבוצת ה-mimic NC (p = 0.04; איור 3B).
BMP7 היה מטרה של miR-1298 ב-CRC
TargetScan הצביע על כך ש-BMP7 עשוי להיות מטרה של miR-1298 (איור 4A). בדיקות דו-לוסיפרז (Dual-luciferase reporter assays) בתאי SW480 ו-HCT-16 הראו כי ביטוי יתר או עיכוב של miR-1298 שינו את פעילות הלוסיפרז של ה-BMP7 Wt reporter אך לא של ה-BMP7 Mut reporter (איור 4B,C). בתאי HCT-16, פעילות הלוסיפרז של ה-BMP7 Wt reporter הייתה נמוכה באופן משמעותי בקבוצת ה-miR-1298 mimic מאשר בקבוצת ה-mimic NC (p = 0.02; איור 4C). ברקמות CRC, רמות BMP7 היו מוגברות באופן ניכר (איור 4D). בנוסף, BMP7 ו-miR-1298 הראו מתאם שלילי (איור 4E). בתאי SW480 ובתאי HCT-16, ביטוי יתר של miR-1298 עיכב את BMP7 הן ברמת ה-RNA והן ברמת החלבון, בעוד שעיכוב של miR-1298 הוביל לעלייה בביטוי של BMP7 (איור 4F,G).
miR-1298 עשוי להפעיל השפעה מדכאת גידולים ב-CRC באמצעות ויסות של BMP7
בתאי SW480, אוששה מודולציה מוצלחת של ביטוי BMP7 (איור 5A). ביטוי יתר של BMP7 הפך באופן חלקי את הירידה בחיוניות התאים ואת העלייה באפופטוזיס שהושרות על ידי ביטוי יתר של miR-1298, בעוד ששתיקה (knockdown) של BMP7 הפחיתה עוד יותר את חיוניות התאים והגבירה את האפופטוזיס (איור 5B,C). בתאי HCT-16, אוששה גם כן מודולציה מוצלחת של ביטוי BMP7 (איור 5D), עם השפעות תואמות על חיוניות התאים והאפופטוזיס (איור 5E,F). בתאי SW480, ביטוי BMP7 וחיוניות התאים היו נמוכים משמעותית בקבוצת ה-miR-1298 mimic + si-BMP7 מאשר בקבוצת ה-miR-1298 mimic + si-NC (p = 0.02 ו-p = 0.005, בהתאמה; איור 5A,B). האפופטוזיס היה שונה משמעותית בין קבוצות ה-miR-1298 mimic + OE-BMP7 וה-miR-1298 mimic + OE-NC (p = 0.01; איור 5C). בתאי HCT-16, חיוניות התאים הייתה נמוכה משמעותית בקבוצת ה-miR-1298 mimic + si-BMP7 מאשר בקבוצת ה-miR-1298 mimic + si-NC (p = 0.02; איור 5E). ביטוי גבוה של BMP7 הפך באופן חלקי את ההשפעות המדכאות של miR-1298 על נדידה ופלישה של תאי CRC, בעוד ששתיקה של BMP7 הגבירה השפעות מעכבות אלו (איור 6A–D). בתאי SW480, שתיקה של BMP7 הפחיתה משמעותית את מספר התאים שנדדו והפלישנים בהשוואה לקבוצת ה-si-NC (p = 0.03 ו-p = 0.020, בהתאמה; איור 6A,B). בתאי HCT-16, ביטוי יתר של BMP7 שינה משמעותית את מספר התאים שנדדו בהשוואה לקבוצת ה-OE-NC (p = 0.030; איור 6C), בעוד ששתיקה של BMP7 הפחיתה משמעותית את מספר התאים הפלישנים בהשוואה לקבוצת ה-si-NC (p = 0.07; איור 6D).
זמינות נתונים:
הנתונים התומכים בממצאי מחקר זה מסופקים כ- קובץ משלים.
איור 1ביטוי של miR-1298 ברקמות CRC. (Aביטוי יחסי של miR-1298 ברקמות CRC וברקמות לא סרטניות סמוכות.Bביטוי יחסי של miR-1298 ברקמות CRC מחולים עם גרורות בקשרי לימפה (+LNM) ומחולים ללא גרורות בקשרי לימפה (−LNM).Cביטוי יחסי של miR-1298 ברקמות CRC בהתאם לגודל הגידול.ד'ביטוי יחסי של miR-1298 ברקמות CRC בהתאם לשלב הגידול.ה_) ביטוי יחסי של miR-1298 בסרום של חולי CRC ובביקורות בריאות. (ז'( עקומת מאפייני מקלט (ROC) עבור miR-1298 בסרום להבחנה בין חולים ב-CRC לבין ביקורות בריאות. (ג') עקומות הישרדות כללית לפי Kaplan–Meier עבור חולים עם CRC בהתאם לביטוי נמוך וגבוה של miR-1298. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2השפעות של miR-1298 על השגשוג והאפופטוזיס של תאי CRC. (A) ביטוי יחסי של miR-1298 בתאי FHC ו-SW480 לאחר טרנספקציה של miR-1298 mimic, mimic NC, miR-1298 inhibitor או inhibitor NC. (B) חיוניות תאים של תאי SW480 בעקבות ביטוי יתר או עיכוב של miR-1298. (C) אפופטוזיס של תאי SW480 בעקבות ביטוי יתר או עיכוב של miR-1298. (ד'ביטוי יחסי של miR-1298 בתאי FHC ותאי HCT-16 לאחר טרנספקציה עם miR-1298 mimic, mimic NC, מעכב miR-1298 (miR-1298 inhibitor) או inhibitor NC.ה_) חיוניות תאים של תאי HCT-16 לאחר ביטוי יתר או עיכוב של miR-1298. (F) אפופטוזיס של תאי HCT-16 בעקבות ביטוי יתר או עיכוב של miR-1298. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. **p < 0.01; ***p < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 3: השפעות miR-1298 על נדידה ופלישה של סרטן המעי הגס והחלחולת (CRC) תאים. (A) מספר תאים שהיגרו בתאי SW480 בעקבות טרנספקציה של miR-1298 mimic, mimic NC, miR-1298 inhibitor או inhibitor NC. (B) מספר התאים הפולשניים בתאי SW480 לאחר טרנספקציה ב-miR-1298 mimic, mimic NC, miR-1298 inhibitor, או inhibitor NC. (C) מספר התאים שנדדו בתאי HCT-16 לאחר טרנספקציה עם miR-1298 mimic, mimic NC, miR-1298 inhibitor, או inhibitor NC. (ד') מספר תאים פולשניים בתאי HCT-16 לאחר טרנספקציה עם miR-1298 mimic, mimic NC, miR-1298 inhibitor או inhibitor NC. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. **p < 0.01; ***p < 0.001. נא ללחוץ כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.
איור 4: מיקוד הקשר בין miR-1298 ל-BMP7. (Aאתר קישור חזוי בין miR-1298 לבין ה-3' של BMP7′ אזור שאינו מתורגם (UTR).B) פעילות לוקיפראז יחסית של רפורטרים של BMP7 Wt ו-BMP7 Mut בעקבות ביטוי יתר או עיכוב של miR-1298 בתאי SW480. (C) פעילות לוסיפרז יחסית של רפורטרים של BMP7 Wt ו-BMP7 Mut בעקבות ביטוי יתר או עיכוב של miR-1298 בתאי HCT-16. (ד'ביטוי יחסי של BMP7 ברקמות CRC וברקמות לא סרטניות סמוכות.ה) מתאם בין ביטוי miR-1298 לביטוי BMP7 ברקמות CRC. (ז׳) ביטוי יחסי של BMP7 בתאי SW480 ו-HCT-16 לאחר טרנספקציה עם miR-1298 mimic, mimic NC, miR-1298 inhibitor או inhibitor NC. (ג') רמות חלבון BMP7 יחסיות בתאי SW480 ו-HCT-16 בעקבות טרנספקציה עם mimic של miR-1298, mimic NC, מעכב (inhibitor) של miR-1298 או inhibitor NC. **p < 0.01; ***p < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 5ויסות משותף של miR-1298 ו-BMP7 על שגשוג ואפופטוזיס בתאי סרטן המעי הגס (CRC). תאי SW480 ו-HCT-16 עברו טרנספקציה משותפת עם miR-1298 mimic ו-OE-NC, OE-BMP7, si-NC או si-BMP7.Aביטוי יחסי של BMP7 בתאי SW480.B) חיות תאים בתאי SW480. (C) אפופטוזיס בתאי SW480. (ד׳) ביטוי יחסי של BMP7 בתאי HCT-16. (ה( חיות תאים בתאי HCT-16. (F) אפופטוזיס בתאי HCT-16. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. פסי השגיאה מייצגים סטיית תקן. **p < 0.01; ***p < 0.01. קיצורים: OE-NC = ביקורת שלילית לביטוי יתר; OE-BMP7 = ביטוי יתר של BMP7; si-NC = ביקורת שלילית ל-RNA מפריע קצר (small interfering RNA); si-BMP7 = RNA מפריע קצר המכוון ל-BMP7. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 6בקרה משותפת (Co-regulation) של miR-1298 ו-BMP7 על נדידה ופלישה של תאי סרטן המעי הגס (CRC). תאי SW480 ו-HCT-16 עברו טרנספקציה משותפת (co-transfected) עם miR-1298 mimic ו-OE-NC, OE-BMP7, si-NC או si-BMP7.A) מספר תאים שנדדו בתאי SW480. (B(מספר התאים הפולשניים בתאי SW480. (C) מספר התאים שהגירהו בתאי HCT-16. (ד׳) מספר תאים פולשניים בתאי HCT-16. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. פס השגיאה מייצגים סטיית תקן. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.01. קיצורים: OE-NC = ביקורת שלילית לביטוי יתר; OE-BMP7 = ביטוי יתר של BMP7; si-NC = ביקורת שלילית ל-RNA מפריע קטן; si-BMP7 = RNA מפריע קטן המכוון ל-BMP7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| משתנה | סה"כ | miR-1298 | ערך p | |
| (n = 85) | נמוך (n = 46) | גבוה (n = 39) | ||
| גיל (שנים) | ||||
| ≤50 | 49 | 27 | 2 | 0.832 |
| >50 | 36 | 19 | 17 | |
| מין (זכר/נקבה) | ||||
| זכר | 4 | 27 | 17 | 0.165 |
| נקבה | 41 | 19 | 2 | |
| שלב TNM | ||||
| 1–2 | 60 | 41 | 19 | <0.01*** |
| 3–4 | 25 | 5 | 20 | |
| גודל גידול (cm) | ||||
| ≤5 | 72 | 34 | 38 | 0.003** |
| >5 | 13 | 12 | 1 | |
| גרורות בקשרי לימפה | ||||
| כן | 34 | 25 | 9 | 0.03** |
| לא | 51 | 21 | 30 | |
| דיפרנציאציה של הגידול | ||||
| דרגה נמוכה | 53 | 24 | 29 | 0.035* |
| דרגה גבוהה | 32 | 2 | 10 | |
טבלה 1: הקשר בין מאפיינים קליניקו-פתולוגיים לרמות הביטוי של miR-1298 בחולים עם CRC. החולים סווגו לקבוצות של ביטוי נמוך (n = 46) וביטוי גבוה (n = 39) של miR-1298, ונבחנו הקשרים בין הביטוי של miR-1298 למאפיינים קליניקו-פתולוגיים. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.01. קיצורים: CRC = סרטן המעי הגס והחלחולת; TNM = גרורות בבלต่อים וגידול (tumor node metastasis).
| משתנה | יחס סיכונים | רווח בר סמך של 95% | p ערך | |
| נמוך יותר | עליון | |||
| גיל | 0.776 | 0.186 | 3.242 | 0.728 |
| מין | 0.614 | 0.152 | 2.474 | 0.492 |
| שלב TNM | 4.62 | 1.181 | 18.078 | 0.028* |
| גודל הגידול | 8.078 | 1.833 | 35.587 | 0.006** |
| גרורות בקשרי לימפה | 6.584 | 1.134 | 38.245 | 0.036* |
| דיפרנציאציה של גידולים | 6.392 | 1.748 | 23.377 | 0.005** |
| miR-1298 | 0.145 | 0.024 | 0.87 | 0.035* |
טבלה 2: ניתוח רגרסיית Cox של גורמים פרוגנוסטיים בחולים עם CRC. ניתוח רגרסיית Cox בוצע כדי להעריך את הקשר בין מאפיינים קליניקופתולוגיים לבין ביטוי miR-1298 עם הפרוגנוזה בחולים עם CRC. *p < 0.05; **p< 0.01. קיצורים: CI = רווח סמך; CRC = סרטן המעי הגס והחלחולת; TNM = גרורות בבלטות הלימפה ובאיברים רחוקים.
קובץ משלים. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
סרטן המעי הגס והחלחולת (CRC) מטיל נטל כבד על הפרט והחברה בשל שיעורי התחלואה והתמותה הגבוהים שלו. למרות תוכניות סריקה כגון קולונוסקופיה, מספר רב של חולי CRC עדיין מאובחנים בשלב מתקדם, דבר המדגיש את הצורך הדחוף בסמנים ביולוגיים יעילים יותר ובלתי פולשניים לגילוי מוקדם1. יתרה מכך, הפרוגנוזה של CRC גרורתי נותרת גרועה, כאשר עמידות לתרופות וחזרה של המחלה הן תופעות נפוצות יחסית12. לכן, הבנה מעמיקה של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההופעה, ההתקדמות והגרורות של CRC היא חיונית לפיתוח טיפולים ממוקדים חדשים ולהתגברות על עמידות לטיפול. CRC הוא הטרוגני מאוד, כלומר גידולים שנראים דומים עשויים להפגין הבדלים משמעותיים בהתנהגותם13. מחקר מתמשך הוא אפוא חשוב לשיפור הגילוי המוקדם, קידום טיפול מותאם אישית, ובסופו של דבר שיפור שיעורי ההישרדות בקרב חולי CRC.
חריגות ב-miRNA מעורבות בפיתוח, בשביעות השלב (staging) ובפרוגנוזה של CRC14. בשל יציבותם בנוזלי גוף, ל-miRNAs יש גם פוטנציאל רב כסמנים ביולוגיים (biomarkers) לא פולשניים לאבחון ולפרוגנוזה15. במחקר זה, miR-1298 נמצא ברמה מופחתת (downregulated) ברקמות CRC, וביטויו היה קשור לשלב TNM ולגרורות בקשרי הלימפה, מה שמרמז על תפקיד פוטנציאלי בהתקדמות ה-CRC. ראוי לציין כי מחקרנו הוא הראשון לאפיין באופן מקיף את ביטויו של miR-1298 בקוהורט קלינית של CRC ולהדגים את הקשר שלו למדדים קלינ פתולוגיים מרכזיים, כולל שלב TNM, גרורות בקשרי הלימפה ודיפרנציאציה של הגידול.
שיבוש של תהליכים תאיים מרכזיים—כולל פרוליפרציה, אפופטוזיס, נדידה ופלישה—הוא גורם מניע בסי להתפתחות סרטן ולתמותה16. פרוליפרציה בלתי נשלטת מאפשרת לתאי גידול לעבור התרחבות קלונלית ראשונית. במקביל, התחמקות מאפופטוזיס מאפשרת לתאים אלו לשרוד ולהצטבר אל מול נזקים פנימיים או גורמי עקה חיצוניים. שילוב זה מוביל לצמיחתו של הגידול הראשוני17,18. לכן, טיפולים ממוקדים המהלכים את הגורמים המולקולריים למאפיינים אלו הם המפתח לפיתוח טיפולים יעילים עבור CRC. miRNA תורמים להתפתחות הגידול על ידי ויסות הפנוטיפ הממאיר של תאי סרטן19. miR-1298 הוא אחד מ-miRNA אלו. לדוגמה, ביטוי נמוך (downregulation) של miR-1298-5p מקדם את התקדמות סרטן הקיבה20. ביטוי גבוה (upregulation) של miR-1298 מדכא את הפרוליפרציה של תאי סרטן השד, משרה אפופטוזיס וגורם לעצירת מחזור התא21. בנוסף, miR-1298-5p פועל גם כמדכא גידולים בסרטן השלפוחית2. תוצאות מחקר זה הצביעו על כך שביטוי יתר של miR-1298 דכא את הפרוליפרציה, הנדידה והפלישה והגביר את האפופטוזיס, מה שמרמז כי הוא עשוי לדכא את הפנוטיפ הממאיר של CRC. חשוב לציין כי מחקרנו הרחיב את הדיווחים הקודמים על ידי הערכה שיטתית של פנוטיפים ממאירים מרכזיים בתאי CRC, ובכך סיפק אפיון תפקודי מלא יותר של miR-1298 בסוג סרטן ספציפי זה.
בכל הנוגע להשפעותיו המעודדות גידולים, BMP7 יכול לקדם פרוליפרציה של תאי סרטן על ידי ויסות מסלולי אותות כגון PI3K/AKT23. באמצעות ויסות רמותיהם של פקטורים אנטי-אפופטוטיים כגון Bcl‑2, BMP7 מעניק עמידות לאפופטוזיס בתאי סרטן24. בנוסף, BMP7 מגביר בעיקר את נדידתם ופלישתם של תאי סרטן על ידי השראת מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי (EMT)25. מעורבותו של BMP7 בקידום הסרטן עולה בקנה אחד עם הממצא שלנו לפיו רמות BMP7 היו מוגברות ברקמות CRC. ניתוח ביואינפורמטי הצביע על כך ש-BMP7 עשוי להיות מטרה של miR-1298, וזיהה אתר קישור חזוי בין miR-1298 ל-BMP7. יתרה מכך, ניסויי הצלה (rescue experiments) הצביעו על כך ש-BMP7 פעל ככל הנראה כמתווך תפקודי של miR-1298 ב-CRC. בהתחשב במסלולי האות הקשורים ל-BMP7 בסרטן, השבנו היפותזה כי ציר ה-miR-1298/BMP7 מווסת את מסלולי האות במורד הזרם (SMAD, PI3K/AKT, EMT) השולטים בהתנהגות תאי CRC. באופן מכריע, תיקפנו ניבוי זה באופן ניסיוני באמצעות בדיקות לוסיפראז (luciferase reporter assays), שאישרו קישור ישיר של miR-1298 ל-3′ UTR של BMP7. בנוסף, ניסויי הצלה הדגימו כי שחזור של BMP7 הפך באופן חלקי את ההשפעות המדכאות גידולים של ביטוי יתר של miR-1298, מה שסיפק ראיה תפקודית לכך ש-BMP7 הוא מתווך במורד הזרם של miR-1298 ב-CRC. למיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון המבס את ציר הוויסות miR-1298/BMP7 בסרטן המעי הגס והחלחול.
בנוסף לתובנות מכניסטיות, המחקר שלנו סיפק ראיות תרגומיות התומכות בתועלת הקלינית של miR-1298. ניתוח עקומת ROC הדגים כי ל-miR-1298 עשוי להיות ערך אבחנתי ב-CRC. ניתוח הישרדות חשף עוד כי ביטוי נמוך של miR-1298 היה קשור לפרוגנוזה גרועה יותר, וניתוח רגרסיית Cox הצביע על כך שרמה מופחתת של miR-1298 עשויה להוות גורם פרוגנוסטי ל-CRC, מה שתומך בערכו החבוי של miR-1298 כסמן ביולוגי אבחנתי ופרוגנוסטי ל-CRC.
למחקר זה מספר מגבלות. בנוגע לדגימות קליניות, מכיוון שמחקר זה השתמש בעיקר בנתונים ממרכז אחד, נדרשים מחקרי תיקוף רב-מרכזיים בעתיד כדי לאשש באופן חסון יותר את תפקידו של miR-1298 כמדכא גידולים ב-CRC. מחקר זה התמקד בניסויים תאיים in vitro, אשר לא תפסו באופן מלא את המורכבות של מיקרו-סביבת הגידול in vivo. היעדר מודלים של גידולי קסנוגרפט היה אחת מהמגבלות של מחקר זה. מחקרים עתידיים צריכים לכלול תיקוף in vivo כדי להבהיר עוד יותר את תפקידו של ציר miR-1298/BMP7 במיקרו-סביבת הגידול. בנוסף, ניסויים עתידיים יוכלו לאש עוד יותר את המסלולים שמעל ומטה לציר miR-1298/BMP7 באמצעות תחזיות ביואינפורמטיות וניסויי in vitro ו-in vivo. תקופת המעקב הייתה קצרה יחסית, מה שהגביל את רמת הבשלות של הערכת ההישרדות לטווח ארוך. למרות שבוצעו ניתוחי Kaplan–Meier ורגרסיית Cox, ייתכן שהתוצאות הושפעו מתקופת המעקב הקצרה יחסית. מעקב מורחב נמצא כעת בביצוע כדי לאמת את הערך הפרוגנוסטי של miR-1298 ב-CRC. יתרה מכך, מסלולי האיתות במורד הזרם (SMAD, PI3K/AKT, EMT) המווסתים על ידי ציר miR-1298/BMP7 בבקרת התנהגותם של תאי CRC לא אומתו ניסיונית במחקר זה ודורשים חקר נוסף. במחקר זה לא בוצעו ניסויי הצלה הפוכיים (miR-1298 inhibitor + BMP7 siRNA). ניסויים כאלו יספקו ראיות משלימות לשאלה האם השתקה של BMP7 יכולה להפוך את ההשפעות המעודדות גידול של עיכוב miR-1298. היעדר סוג זה של ניסוי הצלה מחליש את המסקנות המכניסטיות שלנו. נדרשים מחקרים עתידיים שישלבו את עיצוב ניסויי ההצלה ההפוכה הזה ותיקוף in vivo כדי לבס באופן מלא את התפקוד של ציר miR-1298/BMP7 ב-CRC.
לסיכום, ייתכן ש-miR-1298 קשור להתקדמות של CRC. מבחינה תפקודית, miR-1298 עשוי לעכב פרוליפרציה, פלישה ומגרציה של תאי CRC. BMP7 עשוי להיות מתווך תפקודי פוטנציאלי של miR-1298 ב-CRC.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים פינסיים או לא-פינסיים רלוונטיים להצהיר עליהם.
תודות
המחברים מצהירים כי לא התקבלו כספים, מענקים או תמיכות אחרות במהלך הכנת כתב יד זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת קריסטל ויולט (crystal violet) בריכוז 0.1% | Sigma-Aldrich | C075 | |
| ערכה ל-SDS-PAGE בריכוז 10% | Epizyme | PG12 | |
| 4% פאראפורמאלדהיד | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| פלטת תרבית תאים בעלת 6 בארות | Corning | 3516 | |
| פלטת תרבית תאים בעלת 96 בארות | Corning | 3599 | |
| ערכה לגילוי אפופטוזיס באמצעות Annexin V-FITC/PI | שונים (למשל, Elabscience, BD Biosciences) | E-CK-A21 (Elabscience) או 56547 (BD) | |
| נוגדן נגד BMP7 | Abcam | ab176707 | |
| Anti-GAPDH | Abcam | ab181602 | |
| ערכה לבדיקת BCA | Sangon | C503021 | |
| BMP7 מוטציה 3‘פלסמיד דגישה (reporter plasmid) של UTR- | בנייה מותאמת אישית (שובטה לתוך pmirGLO) | מותאם אישית | |
| פריימרים ל-BMP7 | Sangon Biotech (שנגחאי, סין) | סינתזה בהתאמה אישית | |
| BMP7 מסוג בר (Wild-type) 3‘פלסמיד דג (reporter plasmid) ל-UTR | בנייה מותאמת אישית (שובטה לתוך pmirGLO) | מותאם אישית | |
| ערכה לספירת תאים-8 (CCK-8) | Dojindo (Japan) | CK04 | |
| בקבוק לתרבית תאים (T-25) | Corning | 430639 | |
| DMEM (Dulbecco‘(מדיום איגל משונו / Modified Eagle Medium) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 11995065 | |
| סרום עגל עוברי (FBS) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 16140071 | |
| שורת התאים FHC (תאי אפיתל נורמליים של מעי הגס האנושי) | ATCC | CRL-1831 | |
| ציטומטר זרימה | BD Biosciences | FACSCanto™ II | |
| תוכנת FlowJo V10 | FlowJo, LLC | — | |
| פריימרים ל-GAPDH (בקרת פנימית ל-mRNA) | Sangon Biotech (שנגחאי, סין) | סינתזה מותאמת אישית | |
| שבט תאי HCT-16 (קרצינומה של המעי הגס והחלחולת באדם) | ATCC | CCL-247 | |
| נוגדן משני מצומד ל-HRP | Beyotime | A0208 | |
| מיקרוסקופ הפוך | Nikon (או מקביל לו) | Eclipse Ts2 | |
| סוכן טרנספקציה Lipofectamin 30 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L30015 | |
| מערכת בדיקת לוסיפראז (Luciferase Assay System) | Promega | E1500 | |
| מטריצת קרום בסיס Matrigel | Corning | 354230 | |
| קורא מיקרופלטה | BioTek (Agilent) | סינרגיה H1 | |
| מעכב miR-1298 | GenePharma (שנגחאי, סין) | הזמנה מותאמת אישית (מסונתז לפי הזמנה) | |
| mimic של miR-1298 | GenePharma (שנגחאי, סין) | מותאם אישית (מסונתז לפי הזמנה) | |
| פריימרים ל-miR-1298 | Sangon Biotech (שנגחאי, סין) | סינתזה בהתאמה אישית | |
| ערכה לסינתזת הגדיל הראשון של miRNA מסוג Mir-X | Takara Bio | 638313 | |
| OE-NC | GenePharma (שנגחאי, סין) | הזמנה מותאמת אישית (מסונתז בהזמנה) | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| בופר ליזיס פסיבי | Promega | E194A | |
| וקטור pcDNA3.1 (ביקורת וקטור ריק) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | V79020 | |
| pcDNA3.1-BMP7 (פלסמיד לביטוי יתר של BMP7 - OE-BMP7) | GenePharma (שנגחאי, סין) | מותאם אישית (מסנתז לפי הזמנה) | |
| וקטור ביטוי למטרות miRNA מסוג pmirGLO Dual-Luciferase | Promega | E130 | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | |
| ערכת ריאגנטים PrimeScript RT (Perfect Real Time) | Takara (Japan) | RR037A | |
| ערכה לריאגנט PrimeScript RT עם gDNA Eraser | Takara Bio | RR047A | |
| תערובת מעכבי פרוטאז (Protease inhibitor cocktail) | Thermo | 78429 | |
| PVDF | אבסין | abs935 | |
| RIPA | Abcam | ab156034 | |
| מבחנות מיקרוצנטריפוגה נקיות מ-RNase (1.5 מ"ל) | Axygen (Corning) | MCT-150-C | |
| טיפים לפיפטה נקיים מ-RNase | Axygen (Corning) | T-300 (10 µL), T-20-Y (200 µL), T-10-B (1000 µL) | |
| si-BMP7 | GenePharma (שנחאי, סין) | מותאם אישית (מסונתז לפי הזמנה) | |
| si-NC | GenePharma (שנגחאי, סין) | מותאם אישית (מסונתז לפי הזמנה) | |
| סטורוסיפורין (ביקרת חיובית לאפופטוזיס) | Sigma-Aldrich | S5921 | |
| קו תאים SW480 (אדנוקרצינומה של המעי הגס והחלחולת בבני אדם) | ATCC | CCL-28 | |
| תערובת מאסטר ל-qPCR עם SYBR Green | Takara (Japan) | RR036A | |
| תא Transwell (24 בארות, 8.0 µm גודל הנקבים) | Corning (Costar) | 3422 | |
| ריאגנט TRIzol | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | |
| פריימרים ל-U6 (בקרה אנדוגנית ל-miRNA) | Sangon Biotech (שנגחאי, סין) | סינתזה בהתאמה אישית |
מקורות
- Ali EAM, Altaie AM, Talaat IM, Hamoudi R. Putative role of Tie2-expressing monocytes/macrophages in colorectal cancer progression through enhancement of angiogenesis and metastasis. Cancers (Basel). 2025;17(17):2856.
- Golfinopoulou R, Hatziagapiou K, Mavrikou S, Kintzios S. Unveiling colorectal cancer biomarkers: harnessing biosensor technology for volatile organic compound detection. Sensors (Basel). 2024;24(14):4712.
- Islind AS, et al. Individualized blended care for patients with colorectal cancer: the patient's view on informational support. Support Care Cancer. 2021;29(6):3061-67.
- Sun Y, et al. IGF2BP3 enhances ferroptosis resistance in colon cancer by stabilizing SLC7A11 and is regulated by miR-98-5p. Front Oncol. 2025;15:1576895.
- Du Z, et al. MicroRNA-1298 is downregulated in non-small cell lung cancer and suppresses tumor progression in tumor cells. Diagn Pathol. 2019;14(1):132.
- Qi Y, et al. The dual role of glioma exosomal microRNAs: glioma eliminates tumor suppressor miR-1298-5p via exosomes to promote immunosuppressive effects of MDSCs. Cell Death Dis. 2022;13(5):426.
- Vasan R, et al. High BMP7 expression is associated with poor prognosis in ovarian cancer. J Cell Mol Med. 2023;27(21):3378-87.
- Motoyama K, et al. Clinical significance of BMP7 in human colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 2008;15(5):1530-37.
- Shi Q, et al. Analysis of the role of the BMP7-Smad4-Id2 signaling pathway in SW480 colorectal carcinoma cells. Mol Med Rep. 2011;4(4):627-31.
- Yang YR, et al. MicroRNA-137 inhibits cell migration and invasion by targeting bone morphogenetic protein-7 (BMP7) in non-small cell lung cancer cells. Int J Clin Exp Pathol. 2015;8(9):10847-53.
- Yan T, et al. Oxidative stress gene expression in ulcerative colitis: implications for colon cancer biomarker discovery. Sci Rep. 2025;15(1):22641.
- Zhou Y, et al. Interleukin-17F suppressed colon cancer by enhancing caspase 4 mediated pyroptosis of endothelial cells. Sci Rep. 2024;14(1):18363.
- Ku X, et al. In-depth characterization of mass spectrometry-based proteomic profiles revealed novel signature proteins associated with liver metastatic colorectal cancers. Anal Cell Pathol (Amst). 2019;2019:7653230.
- Wang Y, et al. Overexpression of microRNA-216a inhibits autophagy by targeting regulated MAP1S in colorectal cancer. Onco Targets Ther. 2019;12:4621-29.
- Correa-Gallego C, et al. Circulating plasma levels of microRNA-21 and microRNA-221 are potential diagnostic markers for primary intrahepatic cholangiocarcinoma. PLoS One. 2016;11(9):e0163699.
- Qin Y, Zhou Y. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K in cancer biology and its therapeutic applications (review). Mol Med Rep. 2026;33(5):144.
- Louis L, Chee BS, McAfee M, Nugent M. Electrospun drug-loaded and gene-loaded nanofibres: the holy grail of glioblastoma therapy? Pharmaceutics. 2023;15(6):1649.
- Termini D, Den Hartogh DJ, Jaglanian A, Tsiani E. Curcumin against prostate cancer: current evidence. Biomolecules. 2020;10(11):1536.
- Wu SR, Wu Q, Shi YQ. Recent advances of miRNAs in the development and clinical application of gastric cancer. Chin Med J (Engl). 2020;133(15):1856-67.
- Li X, et al. MiR-1298-5p level downregulation induced by Helicobacter pylori infection inhibits autophagy and promotes gastric cancer development by targeting MAP2K6. Cell Signal. 2022;93:110286.
- Chen W, et al. microRNA-1298 inhibits the malignant behaviors of breast cancer cells via targeting ADAM9. Biosci Rep. 2020;40(12):BSR20201215.
- Zhang X, et al. Circular RNA TAF4B promotes bladder cancer progression by sponging miR-1298-5p and regulating TGFA expression. Front Oncol. 2021;11:643362.
- Leinhauser I, et al. Oncogenic features of the bone morphogenic protein 7 (BMP7) in pheochromocytoma. Oncotarget. 2015;6(36):39111-26.
- Guan J, et al. Bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) mediates ischemic preconditioning-induced ischemic tolerance via attenuating apoptosis in rat brain. Biochem Biophys Res Commun. 2013;441(3):560-66.
- Lim M, Chuong CM, Roy-Burman P. PI3K, Erk signaling in BMP7-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) of PC-3 prostate cancer cells in 2- and 3-dimensional cultures. Horm Cancer. 2011;2(5):298-309.