מחקר זה משווה את ההשפעות הנפרו-פרוטקטיביות (מגנות הכליות) של אתנול ופומופיזול במודל חולדה של הרעלת מתנול שקיבל טיפול מקדים במתותריקסאט, שנועד להפחית את פינוי הפורמט התלוי פולאט. תוצאות כלייתיות הוערכו באמצעות מדדי תפקוד כליות, סמנים ביולוגיים לפגיעה בכליות, סמנים דלקתיים, סמנים ביולוגיים הקשורים לחמצון-חיזור וממצאים היסטופתולוגיים.
מאמר מחקר
השפעות נפרופרוטקטיביות של אתנול ופומפיזול במודל חולדות של הרעלת מתנול שעוברו טיפול מקדיים במתותרקסאט
במאמר זה
סיכום
תקציר
הרעלה במתנול גורמת לחמצת מטבולית, לפגיעה באיברים ולמוות; פגיעה כלייתית מנבאת תוצאות שליליות. אתנול ופומפיזול הושוו במודל של חולדות שהוכן מראש באמצעות מתותרקסאט להרעלת מתנול. שלושים חולדות Wistar זכרים חולקו לחמש קבוצות: ביקורת, מתותרקסאט (MTX), MTX + מתנול, MTX + מתנול + פומפיזול, ו-MTX + מתנול + אתנול (n = 6 לכל קבוצה). MTX ניתן באמצעות זריקה לקיבה (oral gavage) במינון של 0.3 mg/kg/day בימים 1–7. שלוש הקבוצות שנחשפו למתנול קיבלו 3 g/kg מתנול באמצעות זריקה לקיבה ביום 8. פומפיזול ניתן באופן תוך-peritoneal במינון של 15 mg/kg כ-4 שעות לאחר מתן המתנול, ולאחר מכן 10 mg/kg בשעות 12, 24 ו-36. אתנול ניתן פעם אחת באמצעות זריקה לקיבה במינון של 0.5 g/kg כ-4 שעות לאחר מתן המתנול. דגימות נאספו ביום 10. לא הוגדר מראש שום מדד תוצאה ראשוני. נבחנו תפקוד כלייתי, פגיעה בהומוגנאט של הכליה, סמנים ביולוגיים דלקתיים, סמנים ביולוגיים הקשורים לחמצון-חיזור (redox) מהדם וממצאים היסטופתולוגיים. ניתוח שונות (ANOVA) העלה הבדלים משמעותיים בין הקבוצות ברמות של cystatin C בהומוגנאט של הכליה (p = 0.003), אינטרלוקין-6 (IL-6; p = 0.013), Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1; p = 0.017), Urea בסרום (p = 0.017), וCreatinine בסרום (p < 0.001). בדיקת Duncan post hoc הראתה ערכים נמוכים יותר עבור פרמטרים אלו בשתי קבוצות הנוגัด (antidote) בהשוואה לקבוצת ה-MTX + מתנול. לא זוהו הבדלים ביוכימיים משמעותיים בין שתי קבוצות הנוגัด. הציונים ההיסטופתולוגיים היו נמוכים יותר בקבוצות הנוגัด. למרות שפומפיזול הראה דפוס תיאורי חיובי יותר, הממצאים אינם מבססים את עליונותו על פני אתנול. שונות לא אחידה (variance heterogeneity), בדיקות מרובות, משטרי נוגัด לא שווים, היעדר מדידות של טוקסיקו-קינטיקה ומאזן חומצה-בסיס ותקופת מעקב קצרה מגבילים את הפרשנות. מחקרים עתידיים צריכים לכלול מדידות ישירות של מתנול ופורמט, פעילות של alcohol dehydrogenase בצитоזול של הכליה, מתאמים עם תוצאות ביוכימיות כלייתיות, תקופות מעקב ארוכות יותר ומשטרי נוגัด דומים.
מבוא
הרעלה ממתיל אלכוהול (מתנול) היא מקרה חירום רעיל משמעותי הקשור לתחלואה ותמותה ניכרות ברחבי העולם, במיוחד בעקבות צריכה של משקאות אלכוהוליים לא חוקיים או כאלו שיוצרו באופן בלתי חוקי. למרות שלמתנול עצמו יש רעילות נמוכה יחסית, הוא עובר מטבוליזם בעיקר בכבד על ידי אלכוהול דהידרוגנאז (ADH) לפורמלהיד ולאחר מכן לחומצה פורמית; הצטברות הפורמט הנובעת מכך עלולה לגרום לחמצת מטבולית עם פער אניונים גבוה, לנוירופתיה אופטית ולפגיעה בריב-איברים1,2. פורמלהיד הוא תוצר ביניים קצר שרירות, בעוד שהצטברות פורמט נחשבת לגורם העיקרי לרעילות באמצעות עיכוב של ציטוכרום אוקסידאז מיטוכונדריאלי, היפוקסיה תאית ועקה חמצונית 3. אבחון מוקדם, תיקון של חמצת מטבולית, טיפול בנוגדי רעל והמודיאליזה הן הגישות הטיפוליות העיקריות להפחתת התמותה2.
בהרעלה ממנול, הביטויים הקליניים הופכים בדרך כלל לנראים לאחר תקופת דגירה. בחילות, הקאות, כאבים בבטן ודיכוי קל של מערכת העצבים המרכזית עשויים להוביל להופעת חמضיות מטבולית עם פער אניוני גבוה (high-anion-gap metabolic acidosis), קוצר נשימה, שינוי במצב ההכרה ותסמינים חזותיים1,2. טשטוש ראייה, פוטופוביה, מילדריאזיס (הרחבת אישונים), בצקת של דיסקוס אופטיקה, ובמקרים חמורים, עיוורון קבוע, הם בין ההשפעות הרעילות האופייניות ביותר הקשורות לעכבה של ציטוכרום אוקסידאז מיטוכונדריאלי המתווכת על ידי חומצה פורמית1,2. אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות כוללות טיפול תומך; תיקון של חמضיות מטבולית באמצעות סודיום ביקרבונט; תוספי חומצה פולינית או פולית; עכבה של אלכוהול דהידרוגנאז באמצעות אתנול או פומפיזול (fomepizole); ובמקרים חמורים נבחרים, המודיאליזה להגברת קצב סילוק המנול והפורמט3,4. פומפיזול נחשב יותר ויותר כנוגד רעל מהקו הראשון בשל פרמקוקינטיקה צפויה יותר, מינון פשוט יותר וסיכון נמוך יותר לתופעות לוואי; עם זאת, אתנול נותר חלופה חשובה בשל זמינותו ועלותו הנמוכה4,5,6,7.
אף שפגיעה בעצב האופטי ובמערכת העצבים המרכזית נחשבה באופן מסורתי לביטויים השולטים של רעילות ממטנול, הכליה מזוהה יותר ויותר כאיבר מטרה רלוונטי מבחינה קלינית8,9,10. בקוהורטות ספציפיות להרעלת מטנול, פגיעה כלייתית חריפה (AKI) נקשרה לחמצת מטבולית חמורה יותר, כשל נשימתי, כשל רב-איברי, הנשמה מכנית, טיפול חוץ-גופי, אשפוז ממושך יותר ושיעורי תמותה גבוהים יותר בבית החולים; החסור בנפח נוזלים, אלח דם (ספסיס), רבדומיוליזיס ופנקראטיטיס חריפה זוהו גם הם כגורמים הקשורים להתפתחות AKI8,10. בקוהורט שדווחה על ידי Chang et al., נמצא כי AKI נותר קשור באופן בלתי תלוי לתמותה בבית החולים בניתוח רב-משתני; עם זאת, העיצוב התצפיתי רטרוספקטיבי אינו קובע כי ה-AKI כשלעצמו גרם לתמותה8. בהתאם לכך, יש לפרש AKI כסמן לחומרת מחלה גדולה יותר ולפרוגנוזה גרועה יותר בהרעלת מטנול. לעומת זאת, הסקירה הסיסטמטית של Wang et al. העריכה תוצאים כלייתיים לאחר הרעלה באלכוהול רעיל באופן רחב יותר, בעיקר מטנול ואתילן גליקול; לפיכך, מסקנותיה אינן ספציפיות למטנול בלבד9. סקירה זו זיהתה תמותה משמעותית בטווח הקצר ופערים חשובים במידע בנוגע להתאוששות כלייתית לטווח ארוך, דיאליזה מתמשכת ודיווח סטנדרטי על תוצאים כלייתיים9.
הקשר בין רעילות למתנול לבין AKI הוא ככל הנראה רב-גורמי. הצטברות של מטבוליטים רעילים עשויה לתרום לכך באמצעות עיכוב מיטוכונדריאלי, היפוקסיה תאית, חמצת מטבולית חמורה וחוסר איזון רדוקס, בעוד שגורמים מערכתיים שתועדו בקוהורטות קליניות — כולל התרוקנות נפחית, פגיעה המודינמית, רבדומיוליזה, אלח דם (ספסיס), אי-ספיקה נשימתית וכשל רב-מערכתי — עשויים לגרום לפגיעות כלייתיות נוספות1,2,3,8,10. נתיבים אלו מספקים קשרים פלוגיים וקליניים סבירים בין הרעלה במתנול לבין פגיעה כלייתית. הפרעות מטבוליות כלייתיות עשויות לנבוע מחשיפה לפורמט במחזור הדם, עיכוב מיטוכונדריאלי, חמצת מטבולית ומעקה המודינמי מערכתי. עם זאת, התרומה הספציפית של חילוף חומרים של אלכוהול ואלדהיד בתוך הרקמה הכלייתית נותרה לא ידועה, מאחר שריכוזי מתנול, פורמלהיד ופורמט, פעילות ADH כלייתית ותפקוד מיטוכונדריאלי לא נמדדו באופן ישיר במחקר הנוכחי.
אתגר מתודולוגי מרכזי במחקרים ניסויים של רעילות למתנול הוא שחולדות מטבוליזן חומצה פורמית במהירות רבה יותר מבני אדם. למרות שהצטברות של חומצה פורמית היא גורם קובע מרכזי לרעילות למתנול בבני אדם, קשה יותר להשיג הצטברות דומה ופגיעה תואמת באיברים בחולדות בשל מטבוליזם יעיל מאוד של פורמט התלוי פולאט. לכן, חומרים המדכאים את מטבוליזם הפולאט נמצאים בשימוש תדיר במודלים ניסויים של רעילות למתנול11,12. טיפול מקדים במתותרקס (MTX) שימש להפחתת פינוי הפורמט התלוי פולאט בחולדות, ובכך הגביר את הרגישות לרעילות למתנול11,12. מתותרקס כשלעצמו אינו גורם לרעילות למתנול, והמודל שנוצר אינו משחזר את כל ההיבטים של הרעלת מתנול בבני אדם. מכיוון שמתותרקס עשוי להשפיע באופן עצמאי על תוצאות כלייתיות, חמצוניות ודלקתיות, נכללה קבוצת MTX בלבד כדי לאפיין שינויים הקשורים לטיפול המקדים. בתוך מגבלות אלו, המודל מספק פלטפורמה פרה-קלינית מבוקרת להשוואת דפוסי תוצאות כלייתיות בין קבוצות ניסוי המקבלות את אותו פרוטוקול של טיפול מקדים במתותרקס וחשיפה למתנול, ולהערכת תוצאות אלו ברמות ביוכימיות, דלקתיות, חמצוניות והיסטופתולוגיות.
עיכוב של אלכוהול דהידרוגנאז מהווה את אבן היסוד של הטיפול בנוגדן (antidotal treatment) להרעלת מתנול. שני החומרים הנפוצים ביותר למטרה זו בפרקטיקה הקלינית הם אתנול ופומהפיזול (4-methylpyrazole). אתנול מדכא באופן תחרותי את היווצרות המטבוליטים הרעילים בשל זיקה גבוהה יותר ל-ADH מאשר למתנול, בעוד שפומהפיזול, מעכב ADH חזק וסלקטיבי, מונע באופן ישיר את המרת המתנול לפורמלהיד וחומצה פורמית5,6. עם זאת, אין קונצנזוס מלא לגבי היעילות הקלינית ההשוואית, הבטיחות, קלות המתן וההשפעות להגנת איברים של שני נוגדי הרעל הללו. פומהפיזול נחשב לבעל יתרון במרכזים רבים בשל משטר מינונים סטנדרטי, היעדר צורך בניטור רמות בנסירי הדם, היעדר דיכוי של מערכת העצבים המרכזית ותכונות פרמקוקינטיות צפויות יותר, בעוד שטיפול באתנול קשור לחסרונות פוטנציאליים, הכוללים היפוגליקמיה, רעילות כבדית, שינוי במצב ההכרה והצורך בניטור אינטנסיבי6,7. לעומת זאת, השוואות קליניות רחבות היקף העלו כי ההשפעות של שני נוגדי הרעל על התמותה והתוצאים הקליניים עשויות להיות דומות. במחקר של .Zakharov et al, שהעריך מקרי הרעלה המונית, לא נצפה הבדל משמעותי בהישרדות בין פומהפיזול לאתנול5.
על אף החשיבות הפרוגנוסטית של AKI בהרעלת מתנול8,9,10, פגיעה כלייתית זכתה לתשומת לב פחותה משמעותית מאשר רעילות עינית ונוירולוגית, וההשפעות הכלייתיות השוואתיות של אתנול ופומפיזול נותרו ללא אפיון מספיק. לכן, נדרשת הערכה ממוקדת כליות המשלבת בדיקות תפקוד כלייתי קונבנציונליות, סממנים מוקדמים של פגיעה תובולרית, ציטוקינים דלקתיים, פרמטרים הקשורים לרדוקס והיסטופתולוגיה, כדי לקבוע האם שתי האסטרטגיות האנטידוטיות קשורות לדפוסי תוצאים כלייתיים שונים. בנוסף, מודל חולדות זה, שעבר טיפול מקדים במתותרקס באופן מבוקר, עשוי להקל על הערכה פרה-קלינית של מועמדים לאנטידוטים, התערבויות המכוונות לכליות והתערבויות תומכות תחת תנאים ניסיוניים מוגדרים. הערך המחקרי של מודל זה טמון בהערכה השוואתית בתוך מסגרת ניסויית חריפה, ולא בשחזור ישיר של המורכבות הקלינית והמטבולית של הרעלת מתנול בבני אדם.
הבדלים במטבוליזם של מתנול בין מכרסמים לבני אדם, יחד עם השימוש בטיפול תרופתי מקדים להפחתת סילוק פורמט התלוי בחומצה פולית, נותרים מגבלות מתודולוגיות חשובות. יתרה מכך, רעילות אקוטית המושרה בתנאים ניסיוניים עשויה שלא לשקף באופן מלא את משכי החשיפה המשתנים ומצבים תחלואתיים נלווים הנפגשים בפרקטיקה הקלינית. בהתאם לכך, ממצאים ממודל חיות זה צריכים להיחשב כראיות פרה-קליניות ראשוניות ואין להשתמש בהם ישירות לתמיכה בהחלטות טיפוליות בבני אדם. נדרש אישור במחקרים קליניים המעוצבים כראוי לפני שניתן יהיה להסיק מסקנות קליניות. על רקע זה, פער הידע המרכזי הוא האם אתנול ופומפיזול (fomepizole) קשורים לדפוסי תוצאות כלייתיות שונים במדדי תפקוד כליות קונבנציונליים, סממנים ביולוגיים לפגיעה ש appealsבציטות (tubular injury), ציטוקינים דלקתיים, פרמטרים הקשורים לחמצון-חיזור (redox) והיסטופתולוגיה במודל של חולדות שטופלו מראש במתותריקסאט (methotrexate). השערת המחקר הייתה שעכבה של אלכוהול דהידרוגנאז באמצעות אתנול או פומפיזול תהיה קשורה להפחתה של הפגיעה הכלייתית, עם הבדלים פוטנציאליים בין הטיפולים בתחומי התוצאים שנבחנו. הגנה כלייתית (Nephroprotection) הוגדרה מבצעית כדפוס חיובי יותר של תוצאות כלייתיות מאשר בקבוצת ה-MTX + Methanol. דפוס זה כלל ריכוזי Urea ו-Creatinine נמוכים יותר בסרום; רמות נמוכות יותר של kidney injury molecule-1 (KIM-1), cystatin C, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), ו-interleukin-1 beta (IL-1β) בכליות; ריכוזי malondialdehyde (MDA) נמוכים יותר בסרום; פעילות superoxide dismutase (SOD) גבוהה יותר בסרום, רמות blood reduced glutathione (GSH) גבוהות יותר, ופעילות blood catalase (CAT) גבוהה יותר; וציונים היסטופתולוגיים נמוכים יותר עבור דגנרציה ש appealsבציטות, נמק ש appealsבציטות, פגיעה גלומרולרית, גודש וסקולרי, דלקת אינטרסטיציאלית ופיברוזיס. הגנה כלייתית לא חושבה כציון משולב יחיד; תחת זאת, תוצאות בודדות הוערכו באופן קולקטיבי על פני תחומים משלימים אלו. בהתאם לכך, המחקר נועד להשוות את ההשפעות של אתנול ופומפיזול על תפקוד כלייתי, פגיעה ש appealsבציטות, דלקת, מצב חמצון-חיזור והיסטופתולוגיה של הכליות במודל זה.
פרוטוקול
כל ההליכים הניסוייים אושרו על ידי הוועדה המקומית לאתיקה של ניסויי בעלי חיים באוניברסיטת Kırşehir Ahi Evran (החלטת אישור מס' 1, ישיבה מס' 12, תאריך אישור: 12 ביוני 2025) ובוצעו בהתאם להנחיות הלאומיות והבינלאומיות לטיפול ובשימוש בבעלי חיים למעבדה. לאורך כל המחקר ננקטו אמצעים להפחתת כאב ומצוקה ולשימוש במספר המינימלי של בעלי חיים הדרוש.
הכנת כימיקלים
Methotrexate שימש כחומר טיפול מקדים כדי להקל על ביסוס המודל הניסיוני לרעילות למתנול. מכיוון שחמצון פורמט התלוי פולאט היה יעיל יותר בחולדות מאשר בבני אדם, נעשה שימוש בטיפול מקדים ב-methotrexate כדי להפחית את פינוי הפורמט ולהגביר את הרגישות לרעילות למתנול; הוא שימש כהתערבות להגברת הרגישות של המודל ולא כתחליף לחשיפה למתנול11,12. ה-Methotrexate סופק כפורמולציה של 500 mg/5 mL, המתאימה לריכוז מלאי של 100 mg/mL. הפורמולציה דוללה עם תמיסת נתרן כלורי סטרילית בריכוז 0.9% כדי להגיע לריכוז עבודה סופי של 0.06 mg/mL. תמיסת העבודה ה diberikan באמצעות זריקה פומית (oral gavage) בנפח של 5 mL/kg, המתאים למינון MTX של 0.3 mg/kg. עבור חולדות שמשקלן היה 200–220 g בתחילת המחקר, נפח המתן היומי נע בין 1.00 ל-1.10 mL לבעל חיים, וחושב באופן פרטני על סמך משקל הגוף שנרשם בתחילת המחקר. משקל הגוף לא נמדד שוב במהלך תקופת הטיפול המקדים ב-MTX שנמשכה 7 ימים. Methotrexate ניתן פעם ביום למשך 7 ימים רצופים (ימי מחקר 1–7), ומתנול ניתן ביום המחקר ה-8 לאחר השלמת פרוטוקול הטיפול המקדים ב-MTX. משטר זה היה עקבי עם מודלים קודמים שפורסמו של טיפול מקדים ב-MTX באמצעות זריקה פומית13.
מתנול (בדרגת טוהר של ≥99.8%) הוכן באופן טרי ביום המתן כתמיסה עבודה מימית בריכוז של 20% (v/v) על ידי דילול במים מזוקקים סטריליים. תמיסת העבודה הוכנה מערבוב של נפח אחד של מתנול עם 4 נפחים של מים מזוקקים סטריליים. בהתאם למודלים של חולדות עם הרעלת מתנול שטופלו מראש במתותטרקס שתוארו בעבר, ניתן מנה בודדת של מתנול לקבוצות 3–5 ביום ה-8 למחקר במינון של 3 g/kg באמצעות הזנה פומפית (oral gavage). לא הוטלו הגבלות על מזון או מים לפני מתן המתנול. נפח המתן הנדרש חושב באופן פרטני על סמך משקל הגוף של כל חיה, ועמד על כ-18.9 mL/kg עבור תמיסת מתנול בריכוז 20%. עבור חולדה השוקלת כ-220 g, מינון זה תאם ל-0.66 g של מתנול ולנפח הזנה סופי של כ-4.2 mL. משטר חשיפה זה למתנול נבחר כדי לשמור על השוואתיות עם מודלים של חולדות עם רעילות חריפה למתנול שטופלו מראש במתותטרקס שפורסמו בעבר13,14,15.
תמיסת העבודה של fomepizole הוכנה בתמיסת sodium chloride סטרילית בריכוז 0.9% בריכוז סופי של 10 mg/mL. מנת טעינה תוך-peritoneale של 15 mg/kg ה diberikan 4 שעות לאחר מתן methanol, ולאחריה מנות תחזוקה תוך-peritoneale של 10 mg/kg בשעות 12, 24 ו-36. בריכוז עבודה של 10 mg/mL, נפחי המתן היו 1.5 mL/kg עבור מנת הטעינה ו-1.0 mL/kg עבור כל מנת תחזוקה. עבור חולדה עם משקל גוף של כ-220 g בתחילת המחקר, מינונים אלו תאמו לכ-0.33 mL עבור מנת הטעינה ו-0.22 mL עבור כל מנת תחזוקה. כל נפחי המתן חושבו באמצעות משקל הגוף שנרשם בתחילת המחקר. מנות הטעינה והתחזוקה של fomepizole נבחרו בהתבסס על המלצות מקובלות לטיפול בהרעלת methanol1,6.
אתנול שימש כטיפול השוואתי נוגד-רעל. אתנול מוחלט (בטוהר של ≥99.8%) דולל במים מזוקקים סטריליים על ידי ערבוב של נפח אחד של אתנול מוחלט עם 4 נפחים של מים מזוקקים סטריליים, כדי לקבל תמיסת עבודה מימית בריכוז סופי של 20% (v/v). מנה בודדת של אתנול הוענקה באמצעות הזנה דרך הפה (oral gavage) במינון של 0.5 g/kg, כ-4 שעות לאחר מתן המתנול; לא ניתנו מנות תחזוקה של אתנול. נפח המתן היה בערך 3.2 mL/kg. עבור חולדה שמשקל גופה בתחילת המחקר היה כ-220 g, נתון זה תאם לנפח הזנה סופי של כ-0.70 mL. נפח המתן חושב על בסיס משקל הגוף שנרשם בתחילת המחקר. ריכוז האתנול, המינון, נתיב המתן ותזמון המתן נבחרו על בסיס מודלים של חולדות שעברו טיפול מקדים במתותריקסאט ובהם שימש אתנול כטיפול השוואתי נוגד-רעל13,14.
כל התמיסות הוכנו באופן טרי ביום המתן ונבדקו לוודא מראה הומוגני והיעדר חלקיקים נראים לעין. מתן התמיסות בדרך הפה בוצע באמצעות קנולה לזריקה (gavage) מפלדת אל-חלד. במהלך הזריקה, הקנולה הועברה בזהירות מחלל הפה אל הוושט, תוך הקפדה למנוע רפלקס הקאה, דליפה מהפה, אספירציה ומצוקה נשימתית. הזרקות תוך-peritoneum בוצעו בתנאים אספטיים באמצעות מזרקים ומחטים סטריליים חד-פעמיים. כל ההליכים הקשורים להכנה ולמתן כימיקלים בוצעו בהתאם לתקנות בטיחות המעבדה המוסדיות.
בעלי חיים ניסייים, תנאי דיור והקצאה אקראית
סך הכל 30 חולדות לבנות זכרים בוגרות מסוג Wistar, בגיל 8–12 שבועות ובמשקל 220 ± 20 g, הושגו ממעבדה למחקר בעלי חיים ניסייים של אוניברסיטת Ahi Evran, Kırşehir, טורקיה. חולדות Wistar נבחרו מכיוון שהן נמצאים בשימוש נרחב במחקרי רעילות והגנה על הכליות (nephroprotection) ומאפשרות השוואה למחקרים שפורסמו בעבר. בעלי החיים שוכנו בטמפרטורה של 24 ± 2 °C תחת מחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך. מזון כופתיות סטנדרטי ומים מהברז סופקו ad libitum לאורך תקופת הניסוי בת 10 הימים. לפני הפרוצדורות הניסייות, כל בעלי החיים עברו תקופת אקלימטציה של 7 ימים.
שלושים חולדות חולקו לחמש קבוצות ניסוי באמצעות הליך הקצאה אקראית מ komputer, עם יעד של שש חיות לכל קבוצה. עבור כל חולדה, הוגרל מספר שלם אקראי בין 1 ל-5, והחיה שויכה לקבוצת הניסוי המתאימה. ברגע שקבוצה כללה שש חיות, כל הגרלה מאוחרת יותר שזיהתה קבוצה זו נפסלה, ומספר אקראי חדש הוגרל עד שנבחרה קבוצה עם מקום פנוי. הליך זה נמשך עד שכל 30 החולדות הוקצו, מה שהביא ל-6 חיות לכל קבוצה. אותו חוקר ביצע את ההגרלות האקראיות והוציא לפועל את ההקצאה; לא נעשה שימוש במפעיל הקצאה נפרד. קבוצה 1 (ביקורת) לא קיבלה טיפול תרופתי ניסויי, והחיות עברו את אותה דגימת נקודת סיום מתוכננת כמו שאר הקבוצות. קבוצה 2 (MTX) קיבלה methotrexate באמצעות הזנה פומית (oral gavage) במינון של 0.3 mg/kg למשך 7 ימים. קבוצה 3 (MTX + Methanol) קיבלה methotrexate למשך 7 ימים, ולאחריה methanol במינון של 3 g/kg ביום ה-8 של המחקר. קבוצה 4 (MTX + Methanol + Fomepizole) קיבלה טיפול מקדים ב-methotrexate ולאחריו methanol, כאשר הטיפול ב-4-methylpyrazole התחיל 4 h מאוחר יותר. קבוצה 5 (MTX + Methanol + Ethanol) קיבלה טיפול מקדים ב-methotrexate ולאחריו methanol, כאשר ethanol ניתן 4 h מאוחר יותר.
כל שלוש הקבוצות שנחשפו למתנול קיבלו את אותו פרוטוקול טיפול מקדים ב-MTX ומתן מתנול, והשליש ביניהן היה אך ורק בטיפול ה-antidote לאחר החשיפה. הקצאת הקבוצות הניסיוניות, פרוטוקול המתן, תזמון הטיפול ב-antidote ותהליך איסוף הדגימות מסוכמים ב-איור 1. בוצע ניתוח עוצמה (power analysis) מוקדם עבור ANOVA חד-כיווני עם השפעות קבועות (fixed-effects) עבור חמש קבוצות בלתי תלויות. בהנחה של גודל אפקט סטנדרטי גדול (Cohen’s f = 0.70), רמת מובהקות של 0.05 ועוצמה סטטיסטית של 80%, גודל המדגם הכולל המינימלי הנדרש חושב כ-30 בעלי חיים, המקביל לשישה בעלי חיים לכל קבוצה. העוצמה המחושבת עבור גודל מדגם כולל של 30 הייתה בערך 80.9%. גודל האפקט ההנ hypothesized (Cohen’s f = 0.70) נקבע לפני הניסוי בהתבסס על ציפיית החוקרים לאפקט כולל גדול בין הקבוצות במודל רעילות חריף זה. הנחה זו התבססה על שיקול דעתם של החוקרים ולא על הערכה שנגזרה מנתוני פיילוט או ממחקר קודם ספציפי. לא הוגדר מראש תוצאה ראשונית (primary outcome) אחת למחקר זה; חישוב גודל המדגם התבסס על הנחה של אפקט כולל גדול בהשוואה כוללת (omnibus comparison) בין חמש הקבוצות הניסיוניות. לא ניתן להגדיר תוצאה ראשונית באופן רטרוספקטיבי כנקודת סיום שהוגדרה מראש. בהתאם לכך, חישוב גודל המדגם אינו מספק עוצמה מספקת עבור כל תוצאה בודדת או עבור השוואות זוגיות.
פרוטוקול להרעלה במתנול וטיפול בנוגדי רעלים
לאחר תקופת ההסתגלות, בעלי החיים בקבוצות 2–5 קיבלו methotrexate פעם ביום למשך 7 ימים רצופים (ימי מחקר 1–7). ביום מחקר 8, בעלי החיים בקבוצות 3–5 קיבלו מנה בודדת של תמיסת מתנול 20% במינון של 3 g/kg באמצעות הזנה במזון דרך גרגרת (oral gavage). לא הוטלו הגבלות של צום או הגבלות אחרות על מזון או מים לפני מתן המתנול.
בקבוצת ה-MTX + Methanol + Fomepizole, ניתן מינון טעינה תוך-peritoneal של 15 mg/kg כ-4 שעות לאחר מתן המתנול, ואחריו מינוני תחזוקה תוך-peritoneal של 10 mg/kg בשעות 12, 24 ו-36 לאחר מתן המתנול. בקבוצת ה-MTX + Methanol + Ethanol, ניתן מינון בודד של אתנול באמצעות הזנה בבליעה (oral gavage) במינון של 0.5 g/kg כ-4 שעות לאחר מתן המתנול; לא ניתןו מינוני תחזוקה של אתנול. שני משטרי הטיפול נבחרו כדי לשקף המלצות מינון מקובלות ל-fomepizole ופרוטוקולי השוואה של אתנול שפורסמו בעבר1,6,13,14. המשטרים לא תוכננו לספק טיפול תואם מבחינת מינון, נתיב מתן או חשיפה. לפיכך, משטר ה-fomepizole החזרתי תוך-peritoneal ומינון האתנול הבודד דרך הפה היוו השוואה פרמקולוגית לא שוויונית. מתן מוצלח באמצעות gavage אושר על ידי היעדר רפלקס הקאה, דליפה מהפה או מצוקה נשימתית במהלך הפעולה. מתן תוך-peritoneal מוצלח אושר על ידי היעדר דליפה, דימום או נפיחות ניכרת באתר ההזרקה.
לאחר המתן, בעלי החיים נוטרו באופן קבוע מבחינת מצב בריאותי כללי, ניידות, צריכת מזון, יציבה, מראה הפרווה וסימני רעילות. לוח הזמנים של הטיפול תוכנן כך שיאפשר תחילת היווצרות של מטאבוליטים רעילים ממטנול, תוך מתן אפשרות להערכת ההשפעות המגנות והטיפוליות של חומרי הניתוק (antidotal agents).
המתת חסד, נקודות סיום הומניאליות ואיסוף דגימות
במהלך הניסוי, כל בעלי החיים נבחנו מדי יום עבור מצב בריאותי כללי, צריכת מזון ומים, ניידות ושינויים התנהגותיים. קריטריונים לנקודות סיום הומניאליות הוגדרו מראש כחולשה בולטת (lethargy), חוסר יכולת לצרוך מזון או מים, ירידה חמורה במשקל, ניידות מוגבלת, תנוחה לא תקינה, זקיפת שיער (piloerection) מתמשכת, או סימנים ברורים למצוקה. בעלי חיים שימלאו את אחד מקריטריונים אלו היו מועמדים להמתת חסד. עם זאת, אף בעל חיים לא הגיע לקריטריונים שהוגדרו מראש כנקודות סיום הומניאליות במהלך המחקר.
כל בעלי החיים בחמש הקבוצות הניסיוניות הומתו ביום ה-10 למחקר. עבור הקבוצות MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, ו-MTX + Methanol + Ethanol, נקודת סיום זו תאמה ל-48 h לאחר מתן methanol בודד ביום ה-8 למחקר. קבוצת הביקורת נותרה ללא טיפול עד ליום ה-10 למחקר, בעוד שקבוצת ה-MTX בלבד נוטרה עד ליום ה-10 למחקר לאחר השלמת פרוטוקול מתן MTX של 7 ימים. לפיכך, לחמש הקבוצות היה אותו משך מחקר כולל, והן עברו הרדמה ואיסוף דגימות באותו יום למחקר.
השתמשו בקטמין ובקסילזין כדי להשרות הרדמה עמוקה. את עומק ההרדמה אישרו באמצעות אובדן רפלקס נסיגת הכף. לאחר השגת הרדמה עמוקה, נאספו דגימות דם באמצעות ניקור תוך-לביבי (intracardiac puncture). הושגו כ-3–5 mL של דם באמצעות מזרק ומחט מתאימים. דם שנאסף למדידת ריכוזי urea ו-creatinine בסרום, פעילות SOD בסרום וריכוז MDA בסרום הועבר למבחנות ללא נוגדי קרישה והושאר להיקרש באופן מלא. דם שיועד למדידת רמת GSH ופעילות CAT נאסף בנפרד למבחנות המכילות ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ועובד ללא שלב קרישה. לאחר היווצרות קריש מלאה, דגימות הסרום סובבו בצנטריפוגה במהירות של 3,000 × g למשך 10–15 min בטמפרטורה של 4 °C. הסרום המופרד נשמר בטמפרטורה של −80 °C עד לניתוח. הפרדה מוצלחת של הסרום אוששה על ידי מראה צלול וללא המוליזה. לאחר איסוף הדם, הושלמה ההמתה על ידי דימום תחת הרדמה עמוקה. לאחר מכן בוצעה לפרוטומיה חצייתית (median laparotomy), ושתי הכליות הוסרו בזהירות. לאחר הסרת השומן והרקמות החיבוריות שמסביב, נשטפו הכליות במי מלח פיזיולוגיים קרים. דגימות הרקמה חולקו לצורך ניתוחים היסטופתולוגיים וביוכימיים. דגימות שהוקצו לבדיקה היסטופתולוגית הונחו בפורמאלדהיד 10% בניטרול באפר. דגימות שהוקצו לניתוחים ביוכימיים סומנו כראוי ונשמרו בטמפרטורה של −80 °C.
איסוף הדגימות, הניתוחים הביוכימיים והערכות התוצאות בוצעו על ידי חוקרים שלא היו מודעים לקבוצות הניסוי. לא הוחרגו בעלי חיים מהניתוחים.
ניתוחים ביוכימיים
ריכוז Urea בסרום נמדד באמצעות בדיקה קינטית אנזימטית של urease–glutamate dehydrogenase באנלייזר ביוכימי אוטומטי. Urea עברה הידרוליזה על ידי urease כדי לייצר אמוניה, אשר הגיבה לאחר מכן עם 2-oxoglutarate ו-nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) רדוכתי בנוכחות glutamate dehydrogenase. הירידה בבליעה (absorbance) כתוצאה מצריכת NADH נמדדה באופן קינטי. ריכוז creatinine בסרום נמדד כולורימטרית באמצעות אותו אנלייזר ביוכימי אוטומטי.
פעילות superoxide dismutase (SOD) בסרום נקבעה באמצעות בדיקה קולורימטרית המבוססת על ייצור רדיקלי superoxide על ידי מערכת xanthine–xanthine oxidase ותגובתם עם 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride ליצירת תוצר formazan צבעוני. ספיגה (absorbance) בסוף התגובה נמדדה ב-505 nm. ריכוז malondialdehyde (MDA) בסרום נקבע באמצעות תגובת חומצה תיוברביטורית (thiobarbituric acid). דגימות סרום ערבבו עם חומצה טריכלוראצטית קרה להשקעת חלבונים ועברו צנטריפוגציה במהירות של 7,500 × g למשך 5 min ב-4 °C. העליון (supernatant) שהתקבל ערבב עם נפח שווה של חומצה תיוברביטורית ודגר ב-90 °C למשך 60 min. לאחר מכן, מבחנות התגובה קוררו באמבט מים קרים למשך 10 min, והספיגה נמדדה ב-532 nm. ריכוזי MDA חושבו על סמך עקומת הכיול המתאימה. רמות glutathione מרוחבס (GSH) נמדדו בדם עם נוגדם קרישה EDTA באמצעות שיטת Ellman משופרת. לאחר השקעת חלבונים בחומצה טריכלוראצטית, הדגימות ללא החלבונים הגיבו עם 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) בבופר Tris בריכוז 500 mM ב-pH 8.2, והספיגה נמדדה ב-412 nm. פעילות catalase (CAT) נמדדה בדם עם נוגדם קרישה EDTA באמצעות בדיקה קולורימטרית בשני שלבים. דגימות דגרו עם כמות ידועה של מי חמצן, ולאחר הפסקת התגובה האנזימטית, נמדד מי חמצן שיורי באמצעות ריאגנט כרומוגני ב-405 nm.
מכיוון שפעילות SOD וריכוז MDA נמדדו בסרום, ורמת GSH ופעילות CAT נמדדו בדם שעבר אנטי-קוואגולציה באמצעות EDTA ולא בהומוגנאטים של רקמת כליה, נורמליזציה של פרמטרים אלה הקשורים לרדוקס לריכוז החלבון הכולל ברקמה לא הייתה ישימה. לצורך פרשנות של פרופיל הביומארקרים הקשורים לרדוקס, ריכוזי MDA גבוהים יותר בסרום נחשבו כעקביים עם פריקסדציה ליפידית מוגברת, בעוד שפעילות SOD נמוכה יותר בסרום, רמות GSH נמוכות בדם ופעילות CAT נמוכה בדם נחשבו כמעידות על קיבולת נוגדת חמצון מופחתת; שינויים בכיוון ההפוך פורשו כפרופיל רדוקס חיובי יותר.
עבור מדידות של סמיכה חיסונית תלוית אנזים (ELISA) ברקמת כליה, כ-50 mg של רקמת כליה שנשמרה ב-80 °C- הומוגניזה על קרח ב-500 µL של בופר הומוגניזציה המכיל תערובת מעכבי פרוטאז, בהתאם ליחס קבוע של רקמה לבופר של 1:10 (משקל/נפח). עבור כל חולדה הוכנה דוגמית הומוגנאט אחת של רקמת כליה ספציפית לבעל החיים. דגימות מבעלי חיים שונים עובדו באופן עצמאי ולא אוחדו בשום שלב. ההומוגנאטים סובבו בצנטריפוגה במהירות של 14,000 × g למשך 10 דקות ב-4 °C, והעלייה שיתקבלו מכל בעל חיים נאספו בנפרד וחולקו לאליקוויטים עבור ניתוחי רקמת הכליה המתוכננים. ריכוז החלבון הכולל לא נמדד בנפרד; לפיכך, תוצאות ה-ELISA של הרקמה לא נורמלו אליו. ריכוזים סופיים שחושבו מעקומות סטנדרט ספציפיות לבדיקה בוטאו כ-ng/L עבור TNF-α ו-IL-6 וכ-ng/mL עבור IL-1β, KIM-1 ו-cystatin C.
מולקולת פגיעה בכליות-1 (KIM-1) וציסטטין C נבחנו כסמני ביולוגים לפגיעה כלייתית, בעוד שגורם נמק גידולי-α (TNF-α), אינטרלוקין-6 (IL-6) ואינטרלוקין-1β (IL-1β) נבחנו כסמנים לדלקת כלייתית. חמשת האנליטים נמדדו בהומוגנאטים של רקמת כליות באמצעות ערכות ELISA ספציפיות לחולדה, בה accordance עם פרוטוקולי היצרן. עבור הבדיקות הרלוונטיות, הרגישויות האנליטיות וטוואחי המדידה היו 2.51 ng/L ו-5–1,000 ng/L עבור TNF-α, 0.052 ng/L ו-0.1–40 ng/L עבור IL-6, 0.08 ng/mL ו-0.2–60 ng/mL עבור IL-1β, 0.01 ng/mL ו-0.05–10 ng/mL עבור KIM-1, ו-0.25 ng/mL ו-0.5–100 ng/mL עבור ציסטטין C, בהתאמה. לפני האנליזה, כל הריאגנטים, התקנים והעל-נוזלים (supernatants) של רקמת הכליות הובאו לטמפרטורת החדר. עקומות סטנדרט נוצרו בנפרד עבור כל הרצה של הבדיקה בהתאם להמלצות היצרן. תקנים ועל-נוזלים של רקמת כליות הוספו לבארים מצופות מראש בנוגדנים, ולאחריהם הוסף הנוגדן הגלאי הביוטינילי tương ứng וצמיד streptavidin-horseradish peroxidase. הדגימות וריאגנטי ה-ELISA דגרו במשך 1 h ב-37 °C. לאחר חמישה מחזורי שטיפה באמצעות שוטף מיקרו-פלטה אוטומטי, הוספו תמיסות סובסטרט A ו-B ודגרו במשך 10 min ב-37 °C. התגובה הצבעונית הופסקה באמצעות תמיסת עצירה חומצית, והבליעה (absorbance) נמדדה ב-450 nm. עבור כל אנליט, ערכי בליעה מתוקננים לבלנק הומרו לריכוזים באמצעות עקומת הסטנדרט הספציפית לבדיקה הרלוונטית.
כל הבדיקות הביוכימיות בוצעו תחת תנאים סטנדרטיים, וכל הדגימות עובדו באמצעות אותם נהלים. מדידות ELISA ברקמת כליה בוצעו בשכפולים. עבור כל אנליט, חושב הממוצע של שני בארי השכפולים הטכניים כדי לקבל ערך יחיד ברמת החיה. בארי שכפולים טכניים ואליקוואוטים נפרדים שהתקבלו מאותו הומוגנאט ספציפי לחיה לא נחשבו לתצפיות עצמאיות. החיה הבודדת נחשבה ליחידה הניסויית, ותוצאה אחת ברמת החיה עבור כל פרמטר נכללה בניתוח הסטטיסטי.
עיבוד היסטופתולוגי ודירוג פגיעה כלייתית
דגימות רקמה עובדו להערכה מיקרוסקופית באמצעות פרוצדורות היסטופתולוגיות סטנדרטיות. רקמות כליה קובעו בפורמלהיד 10% בעל בופר ניטרלי בטמפרטורת החדר למשך 72 h. לאחר הקיבוע, הרקמות עברו דהידרציה בריכוזי אתנול מדורגים של 50%, 70%, 80%, 96% ו-100%, כאשר כל ריכוז נשמר למשך 1 h. לאחר מכן, הרקמות עברו הבהרה באמצעות פרוצדורת קסילן דו-שלבית וטמיעה בבלוקי פאראפין. חתכים בעובי 5 µm הופקו מבלוקי הפאראפין באמצעות מיקרוטום סיבובי.
עבור צביעת hematoxylin and eosin, נבצעו הסרת פראפין והידרציה מחדש של החתכים, צביעה ב-hematoxylin למשך 5 min, ושטיפה תחת מי ברז זורמים למשך 5 min. בידול בוצע באמצעות אלכוהול חומצי, ולאחר מכן הושארו החתכים במי אמוניה למשך 1 min. לאחר מכן, בוצעה צביעת נגד של החתכים ב-eosin למשך 2 min. לאחר מכן, החתכים עברו דהידרציה באמצעות סדרה עולה של אלכוהול, הבהרה ב-xylene, וסגירה עם חומר קיבוע מתאים.
עבור צביעת Masson’s trichrome, נתחים עברו דפראפיניזציה ורי-הידרציה, ולאחר מכן דגרו בתמיסת מורדנט בטמפרטורה של 56 °C למשך 60 min ונשטפו תחת זרימת מים למשך 10 min. לאחר מכן, הנתחים טופלו באופן רצופי ב-Weigert’s iron hematoxylin למשך 10 min, ב-Biebrich scarlet-acid fuchsin למשך 15 min, בחומצה פוספו-טונגסטית למשך 10 min, וב-aniline blue למשך 10 min. לבסוף, הנתחים הושרו ב-1% acetic acid למשך 5 min, עברו דהידרטציה, הבהרה ב-xylene וסגירה.
הצלחת הצביעה אוששה על ידי צביעה גרעינית ברורה, ניגודיות ציטופלזמית שנשמרה, שימור המבנה הכליתי וויזואליזציה ברורה של מבני רקמה חיבורית. כל השקופיות הצבועות נבחנו בתנאים סטנדרטיים באמצעות מיקרוסקופ אור שצורף לו מערכת דימוי דיגיטלית.
הערכות היסטופתולוגיות בוצעו על ידי פתולוג מנוסה אחד שהיה מסוך לקבוצות הניסוי. הדירוג ההיסטופתולוגי בוצע בהגדלה של 200×. עבור כל חיה ועבור כל פרמטר היסטופתולוגי, נבחנו 10 שדות מיקרוסקופיים שנבחרו באופן אקראי. השדה שהראה את השינוי החמור ביותר עבור הפרמטר הנבדק שימש לקביעת הציון השלם הבודד של החיה בסולם של 0–4. פגיעה טובולרית הוערכה על פי התרחבות טובולרית, הצטברות של חומר חלבוני בתוך הלומן הטובולרי, דגנרציה של האפיתל הטובולרי ונמק טובולרי. פגיעה גלומרולרית הוערכה על פי דגנרציה או אטרופיה גלומרולרית, הרחבה של חלל בומן (Bowman’s space) וגודש וסקולרי. פגיעה אינטרסטיציאלית הוערכה על בסיס דלקת אינטרסטיציאלית ופיברוזיס. לצורך ההערכה ההיסטופתולוגית נעשה שימוש בחתכים של כליה בעובי חמישה מיקרומטרים, שנצבעו בהמטוקסילין ואאוזין ובצביעת Masson’s trichrome, מכל חיה. פוטומיקרוגרפיות מייצגות התקבלו בהגדלה של 200×, כאשר סרגלי קנה מידה מייצגים 100 µm. מספר החתכים ההיסטולוגיים הנפרדים שנבחנו לכל חיה לא ניתן לשחזור מרישומי המחקר ולכן לא ניתן לדווח עליו.
הממצאים בצביעת Masson’s trichrome פוענכו היסטומורפולוגית, תוך התחשבות במיקום ובדפוס המורפולוגי של השקיעת הקולגן, ולא רק בעוצמת הצביעה הכחולה. הניסוי הכמותי של מדד הפיברוזיס האינטרסטיציאלית התבסס על הערכה היסטומורפולוגית זו, ולא בוצעה כימות של אחוז השטח החיובי לקולגן. הדירוג ההיסטופתולוגי בוצע באופן חצי-כמותי באמצעות קריטריונים להערכת פגיעה כלייתית שתוארו בעבר16,17. לכל בעל חיים הוקצה ציון מספר שלם עבור כל פרמטר היסטופתולוגי בסולם של 0–4, כאשר 0 = היעדר, 1 = מינימלי, 2 = קל, 3 = בינוני, ו-4 = חמור. קטגוריות הדירוג ייצגו את ההערכה הכוללת של הפתולוג (בבדיקה עיוורת) לגבי החומרה המורפולוגית של כל נגע, ולא מדד מורפומטרי רציף.
אמצעי בטיחות וניהול פסולת
נעשה שימוש בציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול במתנול, פורמלהיד, זילן, דגימות ביולוגיות ורקמות בעלי חיים. נלבשו חלוקי מעבדה, כפפות והגנה על העיניים. בשל הרעילות הסיסטמית והנדיפות של המתנול, כל הפרוצדורות בוצעו בזהירות. פרוצדורות הכוללות פורמלהיד וזילן בוצעו תחת מapay כימיים במידת האפשר. חפצים חדים נאספו במיכלים מתאימים לפינוי חפצים חדים. פסולת כימית וחומרים ביולוגיים פונו בהתאם לנהלי הבטיחות הביולוגית וניהול הפסולת המסוכנת של המוסד.
ניתוח סטטיסטי
משתנים ביוכימיים רציפים, סמני פגיעה כלייתית, משתנים דלקתיים, משתני תפקוד כלייתי ומשתנים הקשורים לרדוקס בוטאו כממוצע ± סטיית תקן (mean ± SD). נורמליות התפלגות הנתונים הוערכה באמצעות מבחן Shapiro–Wilk, והומוגניות השונויות נבדקה באמצעות מבחן Levene. השוואות בין-קבוצתיות לתוצאות ביוכימיות בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA). בדיקות הנחות זיהו חריגות מהנורמליות בקבוצה אחת עבור קריאטינין בנסיוב, והטרוגניות של השונויות עבור מספר תוצאות ביוכימיות. גישת ה-ANOVA המקורית נשמרה; עם זאת, חריגות אלו עשויות היו להשפיע על מהימנות ערכי ה- p- שהתקבלו, ולכן הממצאים פורשו בזהירות.
כאשר זוהה הבדל מובהק סטטיסטית באמצעות ANOVA, בוצעו השוואות זוגיות בין הקבוצות באמצעות מבחן ההשוואות המרובות post hoc של Duncan. ערכים החולקים את אותה אות באותית עלית בתוך כל שורה לא היו שונים באופן מובהק לפי מבחן ה-post hoc של Duncan. לא הוחל תיקון ריבוי נוסף על התוצאות הביוכימיות. פרוצדורת Duncan לא סיפקה בקרה חזקה על שיעור שגיאות מסוג I ברמת המשפחה (family-wise type I error rate), ובדיקה של תוצאות מרובות הגבירה עוד יותר את הסיכון לממצאים של חיוביים שגויים (false-positive). לפיכך, השוואות מובהקות בודדות פוירשו בזהירות.
גודלי אפקט כוללים לתוצאות ביוכימיות נאמדו באמצעות eta-squared (η2), שחושב כ-(F × df_between)/(F × df_between + df_error), כאשר df_between = 4 ו-df_error = 25. רווחי סמך דו-צדדיים של 95% חושבו על ידי היפוך של התפלגות F לא-מרכזית והמרה של גבולות הלא-מרכזיות (λ) באמצעות λ/(λ + N), כאשר N = 30. חישובים משלימים אלו בוצעו באמצעות סביבת מחשוב מדעית. האומדנים נגזרו מסטטיסטיקות F מעוגלות שהתקבלו מהניתוח הסטטיסטי הראשוני ולכן היו מקורבים. רווחי הסמך התבססו על הנחות הנורמליות ושיווי השוני של מודל ה-ANOVA ולא הותאמו עבור מספר תוצאות.
ציונים היסטופתולוגיים היו תצפיות חצי-כמותיות סדרתיות, שסוכמו באופן תיאורי כממוצע ± SD כדי להראות את עומס הנגעים הממוצע ברמת הקבוצה ואת השונות בין החיות. לא בוצעו בדיקות השערה הסקות או השוואות זוגיות post hoc עבור הציונים ההיסטופתולוגיים. לפיכך, ANOVA, מבחן post hoc של Duncan ודיווח על ערכי p הוחלו רק על תוצאות ביוכימיות, סממנים לפגיעה כלייתית, תוצאות דלקתיות, תפקודי כליות ותוצאות הקשורות לרדוקס. ערך p < 0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית.
תוצאות
All 30 animals were included in the analyses, with six animals in each of the five experimental groups. All animals in the five groups were euthanized and sampled on study day 10. For the three methanol-exposed groups, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Therefore, the total study duration and sample collection time were consistent across all experimental groups. Renal injury and inflammatory biomarkers, renal function and redox-related parameters, and histopathological findings were evaluated as described below.
Biochemical findings: renal injury and inflammatory biomarkers
The findings for renal injury and inflammatory biomarkers measured in kidney tissue homogenates are presented in Table 1. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in cystatin C [F(4,25) = 5.329, p = 0.003], IL-6 [F(4,25) = 3.907, p = 0.013], KIM-1 [F(4,25) = 3.673, p = 0.017], TNF-α [F(4,25) = 7.660, p < 0.001], and IL-1β [F(4,25) = 11.584, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 1. Kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, and KIM-1 were highest in the MTX + Methanol group, whereas no significant differences were observed among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups for these variables. Kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β were also highest in the MTX + Methanol group. The MTX-only group showed higher levels of TNF-α and IL-1β in kidney tissue homogenates than the Control group, whereas the antidote-treated groups showed intermediate values (Table 1).
Renal function and redox-related parameters
Serum renal function indices and blood-derived redox-related parameters were presented in Table 2. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in serum urea [F(4,25) = 3.694, p = 0.017], serum creatinine [F(4,25) = 12.988, p < 0.001], serum SOD activity [F(4,25) = 11.621, p < 0.001], blood GSH level [F(4,25) = 10.164, p < 0.001], blood CAT activity [F(4,25) = 10.631, p < 0.001], and serum MDA concentration [F(4,25) = 8.814, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 2.
Serum urea, serum creatinine, and serum MDA concentrations were highest in the MTX + Methanol group. Serum urea and serum MDA concentrations did not differ significantly among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups, whereas serum creatinine was lowest in the Control group (Table 2).
The MTX + Methanol group also showed the lowest serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity. Compared with the MTX + Methanol group, the fomepizole-treated group showed significantly higher serum SOD and blood CAT activities, whereas the corresponding increases in the ethanol-treated group were not statistically significant. Blood GSH levels did not differ significantly among the MTX-only, MTX + Methanol, and two antidote-treated groups (Table 2).
Compared with the Control group, the MTX-only group showed higher kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β and lower serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity but did not differ significantly in kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, or KIM-1 or in serum urea, serum creatinine, or serum MDA concentration.
Histopathological findings and renal injury scores
The results of the histopathological evaluation of renal tissues were presented in Table 3. Descriptive variation among the groups was observed in tubular dilatation, accumulation of proteinaceous material, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.
In the Control group, renal tissue preserved normal histological architecture, with no evident pathological alterations in the glomerular or tubular structures. In the MTX group, mild tubular degeneration, vascular congestion, and interstitial inflammation were observed.
The MTX + Methanol group showed the highest observed injury scores across the evaluated tubular, glomerular, vascular, and interstitial parameters. Both antidote-treated groups showed descriptively lower observed scores than the MTX + Methanol group. In descriptive comparisons, the fomepizole-treated group showed lower observed scores than the ethanol-treated group for most parameters, particularly tubular dilatation, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, and interstitial fibrosis (Table 3). These comparisons were descriptive, and no inferential statistical tests were performed on the histopathological scores. Representative renal histopathological images obtained using hematoxylin and eosin and Masson’s trichrome staining are shown in Figure 2.
Overall, the MTX + Methanol group showed the highest renal injury and inflammatory biomarker values, the least favorable renal function and redox profiles, and the highest histopathological injury scores. Both antidote-treated groups showed more favorable renal outcome patterns than the MTX + Methanol group, with the fomepizole-treated group showing a more consistently favorable pattern across the evaluated domains. The MTX-only group also showed changes in selected inflammatory and redox-related parameters relative to the Control group.
DATA AVAILABILITY:
The animal-level raw data supporting the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, renal function, and redox-related analyses are provided in Supplementary File 1.
Figure 1: Experimental design and treatment timeline. Schematic representation of the experimental rat model of methanol intoxication. Adult male Wistar albino rats were assigned to five groups: Control, methotrexate (MTX) only, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol (n = 6/group). Standard pellet chow and tap water were available ad libitum throughout the 10-day study, and no fasting or other food or water restrictions were imposed before or after methanol administration. The Control group received no experimental treatment. Animals in Groups 2–5 received MTX by oral gavage at 0.3 mg/kg once daily for seven consecutive days (study days 1–7). Animals in Groups 3–5 received a single dose of methanol at 3 g/kg by oral gavage on study day 8. In the MTX + Methanol + Fomepizole group, an intraperitoneal loading dose of fomepizole at 15 mg/kg was administered 4 h after methanol administration, followed by maintenance doses of 10 mg/kg at 12, 24, and 36 h. In the MTX + Methanol + Ethanol group, ethanol was administered as a single dose of 0.5 g/kg by oral gavage 4 h after methanol administration. All animals were euthanized on study day 10. For Groups 3–5, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Blood and kidney samples were collected for analyses of renal function, renal injury biomarkers, inflammatory cytokines, redox-related biomarkers, and renal histopathology. Abbreviations: MTX = methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.
Figure 2: Representative histopathological findings in renal tissue from experimental groups. Representative kidney sections from the Control, MTX, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups are shown. The upper row presents hematoxylin and eosin (H&E) staining, whereas the lower row presents Masson’s trichrome staining. The Control group exhibited preserved renal architecture with normal glomerular and tubular morphology. The blue-stained collagen observed in the glomerular and tubular basement membranes, vascular walls, and interstitial connective tissue of the Control group was considered physiological collagen rather than evidence of pathological fibrosis. The MTX group showed mild tubular degeneration, vascular congestion, and inflammatory changes. The MTX + Methanol group exhibited more pronounced renal injury, characterized by tubular degeneration (*), vascular congestion (+), widening of Bowman’s space (x), tubular necrosis (↑), interstitial inflammation (↕), and periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change (‡), as observed in the Masson’s trichrome-stained section. The Fomepizole-treated group showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group, with relatively preserved tubular and glomerular structures and less extensive necrosis, inflammation, vascular congestion, and collagen-associated changes. The Ethanol-treated group also showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group; however, residual tubular, glomerular, and vascular alterations were more apparent than in the Fomepizole-treated group. Photomicrographs were obtained at 200× magnification, and scale bars represent 100 µm. Masson’s trichrome staining was evaluated as supportive histomorphological evidence; differences in the intensity of blue staining among the panels were not used as a quantitative measure for intergroup comparison of fibrosis. Symbols: * tubular degeneration; + vascular congestion; x widening of Bowman’s space; ↑ tubular necrosis; ↕ interstitial inflammation; ‡ periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change. MTX, methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.
| Variable | Control (n = 6) | MTX (n = 6) | MTX + Methanol (n = 6) | MTX + Methanol + Fomepizole (n = 6) | MTX + Methanol + Ethanol (n = 6) | p | η² (95% CI) |
| Cystatin C (ng/mL) | 26.07 ± 12.05a | 32.01 ± 1.86a | 45.23 ± 10.51b | 32.49 ± 1.60a | 31.27 ± 4.60a | 0.003 | 0.460 (0.084 – 0.597) |
| IL-6 (ng/L) | 7.66 ± 1.38a | 8.72 ± 2.45a | 11.02 ± 0.83b | 7.96 ± 1.54a | 8.12 ± 1.77a | 0.013 | 0.385 (0.023 – 0.535) |
| KIM-1 (ng/mL) | 2.21 ± 1.00a | 2.47 ± 0.24a | 3.45 ± 0.81b | 2.28 ± 0.58a | 2.32 ± 0.37a | 0.017 | 0.370 (0.013 – 0.522) |
| TNF-α (ng/L) | 118.66 ± 22.95a | 190.51 ± 5.84b | 238.29 ± 34.68c | 147.10 ± 24.31ab | 168.41 ± 75.41ab | <0.001 | 0.551 (0.181 – 0.668) |
| IL-1β (ng/mL) | 8.43 ± 0.59a | 12.53 ± 1.05c | 15.26 ± 1.46d | 10.05 ± 2.86ab | 11.17 ± 2.37bc | <0.001 | 0.650 (0.316 – 0.743) |
Table 1: Renal injury and inflammatory biomarkers in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. All biomarkers were measured in kidney tissue homogenates. Cystatin C, KIM-1, and IL-1β concentrations are expressed in ng/mL; IL-6 and TNF-α concentrations are expressed in ng/L. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified among some biomarkers; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted with caution. Abbreviations: MTX = methotrexate; KIM-1 = kidney injury molecule-1; IL-6 = interleukin-6; TNF-α = tumor necrosis factor-alpha; IL-1β = interleukin-1 beta; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval. η2 represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated.
| Variable | Control | MTX | MTX + Methanol | MTX + Methanol + Fomepizole | MTX + Methanol + Ethanol | p | η² (95% CI) |
| Serum urea (mg/dL) | 39.64 ± 13.69a | 46.88 ± 9.49a | 98.75 ± 59.24b | 48.03 ± 19.64a | 60.44 ± 18.53a | 0.017 | 0.371 (0.014–0.523) |
| Serum creatinine (mg/dL) | 0.50 ± 0.10a | 0.54 ± 0.05ab | 0.72 ± 0.03c | 0.54 ± 0.03ab | 0.60 ± 0.05b | <0.001 | 0.675 (0.356–0.762) |
| Serum SOD activity (U/mL) | 470.40 ± 40.49d | 371.16 ± 17.64c | 219.29 ± 85.06a | 319.38 ± 107.20bc | 256.22 ± 67.89ab | <0.001 | 0.650 (0.317–0.743) |
| Blood GSH (mmol/L) | 58.74 ± 31.90b | 26.36 ± 5.92a | 11.10 ± 3.73a | 19.56 ± 1.66a | 13.66 ± 5.32a | <0.001 | 0.619 (0.272–0.720) |
| Blood CAT activity (U/mL) | 220.82 ± 74.08c | 160.88 ± 55.18b | 68.90 ± 13.41a | 129.45 ± 7.49b | 110.14 ± 20.18ab | <0.001 | 0.630 (0.287–0.728) |
| Serum MDA (nmol/mL) | 13.17 ± 2.03a | 17.29 ± 6.36a | 31.83 ± 9.94b | 17.93 ± 2.04a | 19.34 ± 4.65a | <0.001 | 0.585 (0.225–0.694) |
Table 2: Renal function and redox-related parameters in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Serum urea, serum creatinine, superoxide dismutase (SOD) activity, and malondialdehyde (MDA) concentration were measured in serum, whereas reduced glutathione (GSH) level and catalase (CAT) activity were measured in blood anticoagulated with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Serum urea and creatinine concentrations are expressed in mg/dL, SOD and CAT activities in U/mL, GSH levels in mmol/L, and MDA concentrations in nmol/mL. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified for some outcomes; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted cautiously. The redox-related biomarkers are indirect indicators and do not constitute direct measurements of mitochondrial function or molecular mechanisms of injury. η2 represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated. Abbreviations: MTX = methotrexate; SOD = superoxide dismutase; GSH = reduced glutathione; CAT = catalase; MDA = malondialdehyde; EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval.
| Variable | Control | MTX | MTX + Methanol | MTX + Methanol + Fomepizole | MTX + Methanol + Ethanol |
| Tubular dilatation | 0.16 ± 0.40 | 1.50 ± 0.54 | 3.50 ± 0.54 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| Proteinaceous material accumulation | 0.00 ± 0.00 | 1.33 ± 0.51 | 3.16 ± 0.40 | 0.66 ± 0.51 | 1.33 ± 0.51 |
| Tubular epithelial degeneration | 0.16 ± 0.40 | 1.83 ± 0.40 | 3.83 ± 0.40 | 1.00 ± 0.00 | 2.00 ± 0.00 |
| Tubular necrosis | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 3.33 ± 0.51 | 0.83 ± 0.40 | 1.33 ± 0.51 |
| Glomerular degeneration | 0.16 ± 0.40 | 1.33 ± 0.51 | 3.33 ± 0.51 | 1.00 ± 0.00 | 1.66 ± 0.51 |
| Bowman's space enlargement | 0.00 ± 0.00 | 1.16 ± 0.40 | 3.00 ± 0.00 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| Vascular congestion | 0.00 ± 0.00 | 1.33 ± 0.51 | 3.16 ± 0.40 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| Interstitial inflammation | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 3.00 ± 0.63 | 0.83 ± 0.40 | 1.16 ± 0.40 |
| Interstitial fibrosis | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 2.83 ± 0.40 | 0.66 ± 0.51 | 1.16 ± 0.40 |
Table 3: Descriptive histopathological scores in experimental groups. Data are presented descriptively as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Histopathological scores were obtained from kidney sections stained with hematoxylin and eosin (H&E) and Masson’s trichrome; the scores are dimensionless. Each animal was assigned one integer score for each histopathological parameter on a scale of 0–4, where 0 = absent, 1 = minimal, 2 = mild, 3 = moderate, and 4 = severe. The decimal values presented in the table represent the arithmetic means of the individual integer scores obtained from the six animals in each experimental group and do not represent scores assigned to individual animals or a continuous scoring system. The standard deviations represent between-animal variability within each group. No inferential statistical testing or post hoc pairwise comparisons were performed on the histopathological scores; therefore, the observed between-group patterns should be interpreted descriptively rather than as statistically significant differences. Histopathological evaluation included tubular dilatation, proteinaceous material accumulation, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.
Supplementary File 1: Raw data supporting the biochemical analyses. This spreadsheet contains the animal-level raw values used for the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, and redox-related analyses reported in the manuscript. Please click here to download this file.
דיון
הממצא העיקרי של מחקר זה היה שקבוצת ה-MTX + Methanol הראתה את פרופיל הפגיעה הכלית החמור ביותר בכל הנוגע לתוצאות תפקודיות, דלקתיות, קשורות לחמצון (redox) והיסטופתולוגיות. בקבוצה זו נמדדו הערכים הגבוהים ביותר של urea בנסיוב, creatinine בנסיוב, cystatin C כלי, KIM-1, TNF-α, IL-6, IL-1β ו-MDA, והפעילות הנמוכה ביותר של SOD, רמות GSH ופעילות CAT, יחד עם ציוני הפגיעה ההיסטופתולוגית הגבוהים ביותר שנצפו. שתי הקבוצות שטופלו בתרופות נגד (antidotes) הראו דפוסי תוצאות כליות חיוביים יותר מאשר קבוצת ה-MTX + Methanol, כאשר הקבוצה שטופלה ב-fomepizole הראתה דפוס חיובי עקבי יותר במדדים שנבחנו. עם זאת, ממצאים אלו התקבלו במודל של חולדות שטופלו מראש ב-MTX במצב חריף תוך שימוש במשטרי תרופות נגד שאינם שווים: מתן fomepizole חוזר תוך-peritoneal לעומת מנה אחת של ethanol דרך הפה. הבדלים אלו בדרך המתן ובתדירות המינון מגבילים את ההשוואה הישירה של היעילות הנפרו-פרוטקטיבית, ודפוסי התוצאות שנצפו אינם מבססים את עליונות ה-fomepizole על פני ethanol. קבוצת ה-MTX בלבד הראתה רמות TNF-α ו-IL-1β גבוהות יותר ופעילות SOD, רמות GSH ופעילות CAT נמוכות יותר מקבוצת הביקורת, בעוד שרמות ה-cystatin C הכלי, IL-6, KIM-1, urea בנסיוב, creatinine בנסיוב ו-MDA נותרו דומות סטטיסטית בין הקבוצות. דפוס זה העיד על כך שטיפול מוקדם ב-MTX תרם לפרופיל הדלקתי ולקשור לחמצון ברקע. בהתאם לכך, השינויים הנוספים שנצפו בקבוצת ה-MTX + Methanol התרחשו על רקע של טיפול מוקדם ב-MTX ולא ניתן היה לייחס אותם למתנול בלבד. מכיוון שלא נכללה קבוצת methanol בלבד, לא ניתן היה להפריד באופן מלא את התרומה העצמאית של המתנול ואת האינטראקציות הפוטנציאליות בין MTX למתנול.
על בסיס רעילות המטנול המוכרת, הצטברות של מטבוליטים רעילים ייצגה גורם אפשרי לפגיעה כלייתית. מטנול עובר מטבוליזם בעיקר בכבד על ידי ADH לפורמאלדהיד ולאחר מכן לחומצה פורמית1,3,18,19,20. לכן, ייתכן שהכליות הושפעו בעיקר מהפורמט במחזור הדם וממהפרעות המטבוליות הסיסטמיות הנובעות מכך, ולא ממטבוליזם מקומי נרחב של מטנול. עם זאת, לא ניתן היה לשלול תרומה של מטבוליזם של אלכוהול או אלדהיד ברקמה הכלייתית, שכן ריכוזי המטנול, הפורמאלדהיד והפורמט, כמו גם פעילות ADH כלייתית, לא נמדדו. חומצה פורמית מעכבת את mitochondrial cytochrome c oxidase, ובכך פוגעת בזרחון חמצוני, מפחיתה את ייצור ה-ATP ומשרה היפוקסיה היסטוטוקסית; תהליך זה עלול להסתיים בחמצת לקטית, עלייה בייצור רדיקלים חופשיים (ROS) ונזק לממברנות1,2,3,19,20. בהשוואה לכבד, המהווה את האתר העיקרי למטבוליזם של מטנול, הכליות עשויות להיות רגישות במיוחד להשפעות המשניות של פורמט ולהפרעות מטבוליות סיסטמיות. לתאי אפיתל של הצינור הפרוקסימלי יש דרישות אנרגיה גבוהות והם פגיעים במיוחד לתפקוד מיטוכונדריאלי לקוי, לעקה חמצונית ולפגיעה במיקרו-סירקולציה. כתוצאה מכך, היפוקסיה המתווכת על ידי פורמט, חמצת מטבולית ודלקת עשויות לתרום לפגיעה כלייתית2,8,9,21,22,23. מחקרים קליניים שהראו קשר בין פגיעה כלייתית חריפה לבין חמצת מטבולית, כשל נשימתי, רבדומיוליזה, אלח דם ותפקוד לקוי של איברים מרובים, העלו כי הפגיעה הכלייתית עשויה לשקף את העומס הרעיל הסיסטמי8,9,10,21. חמצון מהיר יותר של פורמט התלוי בפולאט בחולדות לעומת בני אדם היווה מגבלה חשובה של המודלים הניסיוניים1,11,12. בהתאם לכך, נעשה שימוש בטיפול מקדים ב-methotrexate כדי להפחית את פינוי הפורמט ולהגביר את הרגישות לרעילות של מטנול, ולא כדי לשחזר את התמונה הקלינית והמטבולית המלאה של הרעלת מטנול בבני אדם.
ליקוי בתפקוד הכליות הודגם באמצעות הערכה משולבת של פרמטרים ביוכימיים קונבנציונליים וסמנים ביולוגיים של פגיעה כלייתית. ריכוזים מוגברים של urea ו-creatinine בנסיב במיג'ג'ו בקבוצת MTX + Methanol תמכו בפגיעה בסינון הכלייתי וביכולת ההפרשה. רמות מוגברות של cystatin C ו-KIM-1 בכליות העלו כי פגיעה טובולרית ליוותה את הליקוי התפקודי. בהינתן הקשר של KIM-1 לפגיעה בטובולות הפרוקסימליות, עלייה זו תאמה דגנרציה, התרחבות ונמק של תאי האפיתל הטובולרית24,25. רמות מוגברות של cystatin C תמכו אף הן בקיומה של פגיעה בתפקוד הכליות26,27. רמות נמוכות יותר של סמנים ביולוגיים אלו בקבוצות שטופלו ב-fomepizole וב-ethanol העידו על הפחתה של הפגיעה הכלייתית, כאשר דפוס עקבי יותר נצפה בקבוצה שטופלה ב-fomepizole. דפוס הסמנים הביולוגיים הקשורים לרדוקס תאם מצב של עקה חמצונית כגורם אפשרי לפגיעה כלייתית, ולא כראיה למנגנון מאושר. MDA משמש בדרך כלל כמדד לפרוקסדציה של ליפידים, בעוד ש-GSH תורם לשמירה על הומיאוסטזיס רדוקס תאי28,29. במודלים ניסיוניים של הרעלה במתנול ושל נוירופתיה אופטית הקשורה למתנול, עקה חמצונית, פרוקסדציה של ליפידים וירידה בקיבולת הנוגדת חמצון נקשרו אף הן לפגיעה ברקמית10,15,20. פעילות SOD נמוכה יותר בנסיב, ריכוזי MDA גבוהים יותר בנסיב ורמות GSH נמוכות יותר בדם ופעילות CAT נמוכה יותר בקבוצת MTX + Methanol תאמו קיבולת נגדת חמצון מופחתת ופרוקסדציה מוגברת של ליפידים; עם זאת, מדידות אלו לא ביססו מנגנון מיטוכונדריאלי או מולקולרי בבסיס התהליך. ריכוזי MDA נמוכים יותר בנסיב והתאוששות חלקית של פעילות SOD בנסיב ופעילות CAT בדם בקבוצות שטופלו בנוגדן היו תואמות לפרופיל סמנים ביולוגיים רדוקסיבי מיטבי יותר, כאשר דפוס חיובי ועקבי יותר נצפה בקבוצה שטופלה ב-fomepizole.
ערכים גבוהים יותר של TNF-α, IL-6 ו-IL-1β בקבוצת ה-MTX + Methanol היו עקביים עם פרופיל כלייתי פרו-דלקתי. מכיוון שציטוקינים אלו לא היו ספציפיים למסלול אחד ו-MTX כשלעצמו היה קשור לשינויים במדדי דלקת נבחרים, הממצאים תמכו בדלקת כגורם תורם אפשרי ולא כמנגנון מאומת של פגיעה כלייתית. תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי המתווך על ידי חומצה פורמית, היפוקסיה תאית ועקה חמצונית עשויים להוות בסיס להפעלה של מסלולי דלקת; לפיכך, עקה חמצונית ודלקת עשויות להתקדם כתהליכים המחזקים זה את זה ברעילות למתנול1,2,3,15. מודלים ניסיוניים של הרעלת מתנול דיווחו על קשרים בין חשיפה למתנול לבין חדירה של תאי דלקת, נזק היסטופתולוגי ורמות מוגברות של מדדים פרו-דלקתיים כגון IL-1β ו-TNF-α13,15. ממצאים אלו היו עקביים עם הרמות המוגברות של ציטוקינים פרו-דלקתיים וציונים גבוהים יותר לדלקת אינטרסטיציאלית, דגנרציה טובולרית ונמק טובולרי שנצפו בקבוצת ה-MTX + Methanol. באופן כולל, הממצאים היו תואמים לתהליך רב-גורמי הכולל השפעות של מטבוליטים רעילים, עקה חמצונית, דלקת, פגיעה במיקרו-סירקולציה ועומס רעיל סיסטמי; עם זאת, מסלולים אלו לא נבחנו באופן ישיר. רמות נמוכות יותר של TNF-α, IL-6 ו-IL-1β בקבוצות שטופלו בתרופת נוגד-רעל העלו כי עיכוב של יצירת מטבוליטים רעילים עשוי היה גם להגביל את התגובה הדלקתית. ממצאים היסטופתולוגיים סיפקו מתאמים ברמת הרקמה לפגיעה כלייתית, כאשר קבוצת ה-MTX + Methanol הראתה את ציוני הפגיעה הגבוהים ביותר שנצפו במדדים טובולריים, גלומרוולריים, וסקולריים ואינטרסטיציאליים. שתי הקבוצות שטופלו בנוגד-רעל הראו ציוני פגיעה היסטופתולוגית נמוכים יותר באופן תיאורי, והקבוצה שטופלה ב-fomepizole הראתה ציונים נמוכים יותר באופן תיאורי מאשר הקבוצה שטופלה ב-ethanol ברוב המדדים. עם זאת, מכיוון שלא בוצעו בדיקות סטטיסטיות הסקתית על הציונים ההיסטופתולוגיים, תצפיות אלו לא ביססו הגנה היסטופתולוגית מובהקת סטטיסטית או עליונות של אחד מנוגדי הרעל16,17.
השפעותיהם כנוגדים של אתנול ופומפיזול (fomepizole) בהרעלת מתנול מבוססות על דיכוי המטבוליזם המתווך על ידי אלכוהול דהידרוגנאז, ובכך הן מפחיתות את היווצרות הפורמלהיד and חומצה פורמית. אתנול פועל כסובסטרט תחרותי, בעוד פומפיזול פועל כמעכב ישיר וחזק של אלכוהול דהידרוגנאז1,3,4,6,7,30,31,32. דפוסי התוצאות הכליתיות חיוביים יותר שנצפו בשתי הקבוצות שטופלו בנוגדים תואמים את ההשפעות הצפויות של עיכוב אלכוהול דהידרוגנאז. עם זאת, הספרות הנוכחית אינה מדגימה עליונות קלינית מוחלטת של פומפיזול על פני אתנול. למרות שפומפיזול מועדף לעיתים קרובות בשל מינון קל יותר, פרמקוקינטיקה צפויה ופרופיל תופעות לוואי נמוך יותר, אתנול נותר חלופה יעילה1,3,4,6,7,30,32. בנתוני הרעלת מתנול המסיבית שדווחו על ידי Zakharov et al., לא נצפה הבדל ברור בין שני הנוגדים בשיעורי התמותה, משך השהייה בטיפול נמרץ או הצורך בדיאליזה; לפיכך, יש לגלות זהירות בפרשנויות הנוגעות לעליונות קלינית5. לא זוהו הבדלים ישירים משמעותיים סטטיסטית בין הקבוצות שטופלו בפומפיזול ובאתנול עבור התוצאות הביוכימיות באמצעות מבחן post hoc של דנקן (Duncan). יתרה מכך, פומפיזול ניתן במינונים חוזרים, בעוד אתנול ניתן כמינון בודד. משטרי הטיפול לא הותאמו מבחינת נתיב מתן, תדירות המינון או חשיפה סיסטמית. כתוצאה מכך, הדפוס החיובי יותר באופן תיאורי הקשור לפומפיזול יכול היה לשקף הבדלים בלוח הזמנים של המינון, בנתיב המתן או בחשיפה לתרופה, בנוסף להבדלים בין סוכני הנוגדים, ולא ביסס יעילות ביוכימית גבוהה יותר, עליונות קלינית או העדפה לטיפול קליני5,6,30,32. נקודת חוזק מרכזית של המחקר הייתה ההערכה המשולבת של Urea ו-creatinine בסרום, cystatin C, KIM-1, ציטוקינים פרו-דלקתיים, ביומרקרים הקשורים ל-redox וציונים היסטופתולוגיים על פני תחומים פונקציונליים, טובולריים, דלקתיים, redox-related ומבניים משלימים. מודל זה, המתמקד בפגיעה כלית, עשוי לספק מסגרת פרה-קלינית שימושית להערכת משטרי נתיב נוגדים, התערבויות נלוות להגנה על הכליות וביומרקרים לפגיעה כליתית בתנאים של פינוי פורמט מופחת התלוי בחומצה פולית8,9,10,21.
מספר מגבלות השפיעו על הפרשנות. היכולת להכליל את התוצאות באופן ישיר להרעלת מתנול קלינית הייתה מוגבלת בשל המודל החייתי הניסויי וההבדלים מטבוליים בין מינים. למתותרקס עשויות להיות השפעות עצמאיות על תוצאות כלייתיות, דלקתיות וחמצוניות33, והיעדרן של קבוצת ביקורת שקיבלה מתנול בלבד מנע הפרדה מלאה בין השפעות המתנול לבין אינטראקציות פוטנציאליות בין MTX למתנול. ריכוזי סרום או רקמה של מתנול, פורמאלדהיד, פורמט, אתנול ופומפיזול לא נמדדו, ופעילות ADH בפרקציית הציטזול הכלייתית הגולמית לא הוערכה; לפיכך, לא ניתן היה לאמת באופן ישיר רגישות מטבולית, היווצרות מטבוליטים רעילים, חשיפה לתרופה נוגדת רעל (antidote) ועיכוב של מטבוליזם של מתנול, ולא ניתן היה לבצע ניתוחי מתאם עם תוצאות ביוכימיות כלייתיות. משתני חומצה-בסיס, כולל pH, ביקרבונט, עודף בסיס (base excess) ופער אניונים (anion gap), לא נמדדו. המעקב של 48 h אפשר הערכה של תוצאות כלייתיות חריפות בלבד ולא קבע התאוששות כלייתית, התמדה או הפיכות של הפגיעה, או שינויים מבניים כרוניים. צביעת Masson’s trichrome הוערכה היסטומורפולוגית ללא מדידה כמותית של שטח חיובי לקולגן, וסממני פיברוזיס מולקולריים או ביוכימיים, כולל ביטוי של α-smooth muscle actin, תכולת קולגן וריכוז 4-hydroxyproline, לא הוערכו. הערכה היסטופתולוגית על ידי פתולוג בודד בשיטת סמיות (blinded) מנעה הערכה של הסכמה בין בוחנים (interobserver agreement), ודירוג פגיעות חצי-כמותי נותר פוטנציאלית כפוף לסיווג תלוי-בוחן. משטרי הטיפול בנוגדי הרעל לא היו שווים מבחינה פרמקולוגית; ריכוזי ELISA ברקמת הכליה לא נורמלו לריכוז חלבון כולל; לא בוצעו ניתוחים מולקולריים של תפקוד מיטוכונדריאלי ומסלולי מוות תאי; גודל המדגם היה מוגבל; ורק חולדות זכרים נכללו במחקר. מחקרי עתיד צריכים לכלול קבוצות של מתנול בלבד ו-MTX בלבד, משטרי טיפול תואמים בנוגדי רעל, מדידות סדרתיות של ריכוזי מתנול, פורמט ונוגדי רעל, פעילות ADH כלייתית, מדידות חומצה-בסיס, הערכה כמותית של פיברוזיס, מעקב ארוך יותר ותיקוף קליני שתוכנן כראוי. לסיכום, חשיפה למתנול במודל חולדות זה שטופל מראש במתותרקס הייתה קשורה לפגיעה בתפקוד הכלייתי, עלייה בסממנים ביולוגיים של פגיעה כלייתית ודלקת, פרופיל redox לא רצוי ופגיעה היסטופתולוגית. שתי הקבוצות שטופלו בנוגדי רעל הראו דפוסי תוצאות כלייתיות חיוביים יותר מאשר קבוצת ה-MTX + Methanol. פומפיזול הראה דפוס תיאורי חיובי עקבי יותר לאורך התחומים שהוערכו; עם זאת, היעדר הבדלים ביוכימיים ישירים מובהקים בין קבוצות נוגדי הרעל, האופי התיאורי של ההשוואות ההיסטופתולוגיות, משטרי טיפול לא שווים בנוגדי רעל והיעדר מדידות טוקסיקו-קינטיות מנעו מסקנות לגבי עליונותו על פני אתנול. ממצאים אלו מוגבלים למודל חולדות שטופל מראש במתותרקס ואינם קובעים את ההשפעות הכלייתיות של אף אחד מנוגדי הרעל בעקבות חשיפה למתנול ללא טיפול מקדם במתותרקס או בהרעלת מתנול בבני אדם. נדרשים מחקרים נוספים הכוללים מדידות טוקסיקו-קינטיות ישירות, הערכות מכניסטיות, משטרי מינון תואמים של נוגדי רעל ומעקב ארוך יותר כדי להעריך את השחזוריות והישימות הרחבה יותר של ממצאים אלו.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים. במהלך הכנת כתב יד זה, נעשה שימוש בכלים מבוססי בינה מלאכותית (AI) אך ורק לצורך עריכה לשונית ותיקון דקדוקי. לא נעשה שימוש בכלי בינה מלאכותית ליצירה, ניתוח או פרשנות של נתונים, ואף לא ליצירת איורים, טבלאות או אלמנטים גרפיים. המחברים נושאים באחריות מלאה לתוכן כתב היד.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי היחידה לתיאום פרויקטים של מחקר מדעי של אוניברסיטת Kırşehir Ahi Evran (מספר פרויקט: TIP.A3.26.011). לגוף המממן לא היה תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף הנתונים, בניתוח הנתונים, בפרשנות הנתונים או בכתיבת כתב היד.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פורמלין ניטרלי ומנוטרל 10% | Merck | לא תועד | קיבוע רקמות לעיבוד היסטופתולוגי. |
| אתנול מוחלט (≥99.8%) | Sigma-Aldrich, USA | לא הוקלט | דלל במים מזוקקים סטריליים לקבלת תמיסה סופית בריכוז 20% (נפח/נפח); ניתן כמנה בודדת באמצעות הזנה דרך הפה (oral-gavage) במינון של 0.5 גרם/ק"ג, 4 שעות לאחר מתן המתנול. |
| צנטריפוגה לשולחן מעבדה | Nüve | NF048 | הכנת דגימות וצנטריפוגה. |
| נוגדן מצומד לביוטין | רכיבי ערכת ELISA של BT Lab | כלול בערכה | נוגדן זיהוי |
| ערכה לבדיקת CAT (קטלאז) | Otto Scientific | Otto3051 | מדידה קולורימטרית של פעילות קטלאז (CAT) בדם עם נוגד קרישה EDTA. |
| תערובת מעכבי פרוטאז מלאה במינוי מינימלי ללא EDTA (cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail) | Roche / Sigma-Aldrich | 11836170001 | נוסף למסיי של הומוגניזציה במהלך הכנת הומוגנאטים של רקמת כליה לצורך אנליזות ELISA. |
| ערכה לבדיקת קריאטינין | Otto Scientific | OttoBC139 | הערכת רמות קריאטינין בנסיוב. |
| הומוגנייזר דיגיטלי | Daihan Scientific | HG-15D | הומוגניזציית רקמות |
| שוטף רצועות אוטומטי ELx50 | Bio-Tek Instruments, USA | ELx50 | שטיפת ELISA |
| קורא פלטות מיקרו ELx800 | Bio-Tek Instruments, ארה"ב | ELx800 | מדידת בליעה עבור בדיקות ELISA ובדיקות קולורימטריות; בליעת ה-ELISA נקראה באורך גל של 450 ננומטר. |
| אוסין Y (צהבהב) | Merck | 1.15935.0025 | צביעה היסטופתולוגית |
| פומפיזול (4-מתיאל-פירזול) | ה_üלא סופק טקסט לתרגום. נא לספק את הטקסט באנגלית המיועד לתרגום לעברית.ü ארסן <טקסט חלופי לתמונה="משוואה 1" אנא ספק את הטקסט למקור שברצונך לתרגם."/files/ftp_upload/73284/73284eq1.jpg" סגנון="שוליים: אוטומטי;"/> א'.<טקסט חלופי לתמונה="משוואה 2" בשל העדר טקסט במקור (src=), לא ניתן לבצע תרגום. נא לספק את הטקסט המיועד לתרגום."/files/ftp_upload/73284/73284eq2.jpg" סגנון="שוליים: אוטומטי;"/>., אנקרה, טורקיהüטורקיה | לא הוקלט | הוכן בתמיסת נתרן כלוריד סטרילית בריכוז 0.9%, בריכוז סופי של 10 מג/מ"ל; ניתן בזרקה תוך-peritoneal כמינון טעינה של 15 מג/ק"ג 4 שעות לאחר מתן המתנול, ולאחריו מינוני תחזוקה של 10 מג/ק"ג בפרקי זמן של 12, 24 ו-36 שעות לאחר מתן המתנול. |
| ערכה ל-GSH (גלוטתיון) | Otto Scientific | Otto3053 | מדידה קולורימטרית של רמות גלוטתיון רדוקציית (GSH) בדם עם נוגד קרישה EDTA. |
| תמיסת המטוקסילין של האריס | מעבדה לרמה ביולוגית 2 | BS-002 | צביעה היסטופתולוגית |
| חומצה כלורית (HCl) | Merck | 7647-01-0 | כוונון pH |
| IBM SPSS Statistics | IBM Corp. | IBM SPSS Statistics גרסה 29.0 | ניתוח סטטיסטי; RRID:SCR_016479. |
| קטאמין הידרוכלוריד (Ketalar) | Pfizer, ארה"ב | לא תועד | הרדמה כללית לפני איסוף דם ורקמת כליה. |
| מיקרוסקופ אור | Nikon Eclipse | Ni-U | בדיקה היסטופתולוגית |
| ערכה לצביעת מסון טריקרומי (Masson's Trichrome) | MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. <טקסט חלופי לתמונה="משוואה 2" בדיקת רגישות של תאי סרטן לרעלים באמצעות בדיקת Viability של תאי סרטן ב-2D"/files/ftp_upload/73284/73284eq2.jpg" סגנון="שוליים: אוטומטי;"/>כותרת, Tüטורקיה) | BKMTO001 | צביעה היסטופתולוגית |
| ערכה לבדיקת MDA (מאלונדיאלדהיד) | Otto Scientific | Otto1001 | מדידה קולורימטרית של רמות מלונדיאלדהיד (MDA) בסרום כמדד לפרוקסידציה של ליפידים. |
| מתנול (≥99.8%) | Sigma-Aldrich, USA | 322415 | ניתן במתן פומי (3 גרם/ק"ג) כדי להשרות הרעלה ניסויית במתנול. |
| מתות trexat (Emthexate 500 mg/5 mL) | Teva Pharma Belgium | לא הוקלט | פורמולציה מסחרית בריכוז 100 מ"ג/מ"ל שדוללה בתמיסת נתרן כלורי 0.9% סטרילית כדי להגיע לריכוז עבודה סופי של 0.06 מ"ג/מ"ל; הועברה באמצעות זריקה פומית (oral gavage) במינון של 5 מ"ל/ק"ג, המקבילים ל-0.3 מ"ג/ק"ג, פעם ביום למשך 7 ימים רצופים. |
| מנתח כימיה של Mindray | Mindray | BS-400 | מדידת Urea ו-creatinine בסרום. |
| שעוות פראפין, בדרגה היסטולוגית | לא הוקלט | לא הוקלט | הטמעה של רקמות. |
| סליין במאזן פוספטים (PBS) | Merck | P4417 | שטיפת רקמה |
| ערכה לביצוע ELISA של Cystatin-C בחולדות | מעבדת BT, סין | E0145Ra | כימות רמות של cystatin C בהומוגנאטים של רקמת כליה; רגישות אנליטית, 0.25 ng/mL; טווח זיהוי, 0.5–100 ננוגרם/מ"ל. |
| IL-1 של חולדהβ ערכה ל-ELISA | BT Lab, סין | E0119Ra | כימות של IL-1β רמות בהומוגנאטים של רקמת כליה; רגישות אנליטית, 0.08 ng/mL; טווח זיהוי, 0.2–60 ng/mL. |
| ערכת ELISA ל-IL-6 בחולדה | BT Lab, סין | E0135Ra | כימות רמות IL-6 בהומוגנאטים של רקמת כליה; רגישות אנליטית, 0.052 ng/L; טווח גילוי, 0.1–40 ng/L. |
| ערכת ELISA ל-KIM-1 בחולדה | מעבדת BT, סין | E0549Ra | כימות רמות KIM-1 בהומוגנאטים של רקמת כליה; רגישות אנליטית, 0.01 ng/mL; טווח גילוי, 0.05–10 ng/mL. |
| TNF- של חולדהα ערכה ל-ELISA | מעבדות BT, סין | E0764Ra | כימות של TNF-αα רמות בהומוגנאטים של רקמת כליה; רגישות אנליטית, 2.51 ng/L; טווח גילוי, 5–1,000 ננוגרם לליטר. |
| בופר ליזיס והפקה RIPA | Thermo Scientific | 89900 | הומגניזציה וליזיס של רקמת כליה לצורך אנליזות ELISA. |
| ערכה לבדיקת SOD (סופראוקסיד דיסמוטאז) | Otto Scientific | אוטו3047 | מדידה קולורימטרית של פעילות סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) בסרום. |
| נתרן ציטראט | Merck | 03-04-6132 | הכנת תמיסות בופר |
| נתרן הידרוקסיד (NaOH) | Merck | 1310-73-2 | כיוון pH |
| מחט הזנה מפלדת אל-חלד (קנולה להזנה פומית 22 G) | Instech Laboratories, USA | לא הוקלט | קניולה רב-פעמית מפלדת אל-חלד המשמשת למתן חומרים בדרך של גavage אוראלי בחולדות. |
| תמיסת עצירה | רכיבי ערכת ELISA של BT Lab | כלול בערכה | סיום תגובת ELISA |
| סטרפטאווידין פראוקסידאז | Thermo Scientific | SHRP248-B | מערכת גילוי ELISA |
| תמיסת סובסטרט TMB | רכיבי ערכת ELISA של BT Lab | כלול בערכה | מצע כרומוגני |
| Tris-HCl | Thermo Scientific | 1185-53-1 | הכנת תמיסת באפר |
| ערכה למדידת Urea | Otto Scientific | OttoBC157 | מדידה של רמות Urea בנסיוב. |
| תרכיז בופר שטיפה | מרכיבי ערכת ELISA של BT Lab | כלול בערכה | שטיפת פלטה |
| חולדות ויסטאר לבנות (Wistar albino rats) | מעבדת מחקר בבעלי חיים ניסיינים של אוניברסיטת אהי אווראן, <טקסט חלופי לתמונה="משוואה 3" אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם."/files/ftp_upload/73284/73284eq3.jpg" סגנון="שוליים: אוטומטי;"/>, Tüטורקיה | מספר רישיון גידול/הפקה 184 | זכר; 8–בן 12 שבועות; משקל גוף, 220 ± 20 גרם |
| קסילזין הידרוכלוריד (Rompun) | Bayer, גרמניה | לא הוקלט | הרדמה כללית לפני איסוף דם ורקמת כליה. |
| קסילן, בדרגה היסטולוגית | לא הוקלט | לא הוקלט | עיבוד והבהרה של רקמה היסטולוגית. |
מקורות
- Barceloux DG et al. American Academy of Clinical Toxicology practice guidelines on the treatment of methanol poisoning. J Toxicol Clin Toxicol. 2002;40(4):415-446.
- Nekoukar Z et al. Methanol poisoning as a new world challenge: a review. Ann Med Surg (Lond). 2021;66:102445.
- Mégarbane B, Borron SW, Baud FJ. Current recommendations for treatment of severe toxic alcohol poisonings. Intensive Care Med. 2005;31(2):189-195.
- McMartin K, Jacobsen D, Hovda KE. Antidotes for poisoning by alcohols that form toxic metabolites. Br J Clin Pharmacol. 2025;91(3):662-671.
- Zakharov S et al. Fomepizole versus ethanol in the treatment of acute methanol poisoning: comparison of clinical effectiveness in a mass poisoning outbreak. Clin Toxicol (Phila). 2015;53(8):797-806.
- Rietjens SJ, de Lange DW, Meulenbelt J. Ethylene glycol or methanol intoxication: which antidote should be used, fomepizole or ethanol? Neth J Med. 2014;72(2):73-79.
- Brent J. Fomepizole for ethylene glycol and methanol poisoning. N Engl J Med. 2009;360(21):2216-2223.
- Chang ST et al. Acute kidney injury and the risk of mortality in patients with methanol intoxication. BMC Nephrol. 2019;20(1):205.
- Wang C et al. Kidney outcomes after methanol and ethylene glycol poisoning: a systematic review and meta-analysis. Clin Toxicol (Phila). 2023;61(5):326-335.
- Thongprayoon C et al. Acute kidney injury in hospitalized patients with methanol intoxication: National Inpatient Sample 2003-2014. Hosp Pract (1995). 2021;49(3):203-208.
- Johlin FC, Fortman CS, Nghiem DD, Tephly TR. Studies on the role of folic acid and folate-dependent enzymes in human methanol poisoning. Mol Pharmacol. 1987;31(5):557-561.
- Noker PE, Tephly TR. The role of folates in methanol toxicity. Adv Exp Med Biol. 1980;132:305-315.
- Taşlı NG et al. Protective effects of rutin against methanol-induced acute toxic optic neuropathy: an experimental study. Int J Ophthalmol. 2018;11(5):780-785.
- Konuk ŞG et al. Evaluation of the protective role of melatonin in methanol-induced optic neuropathy. Int Ophthalmol. 2025;45(1):182.
- Gursul C et al. Amelioration of oxidative damage parameters by carvacrol on methanol-induced liver injury in rats. Exp Anim. 2022;71(2):224-230.
- Kara Ö, Kilitci A, Dağlıoğlu G. Protective effect of resveratrol on cisplatin induced damage in rat kidney. Cukurova Med J. 2022;47(3):990-995.
- Pandir D, Kara Ö. Cisplatin-induced kidney damage and the protective effect of bilberry (Vaccinium myrtillus L.): an experimental study. Turk J Med Sci. 2013;43(6):951-956.
- Jacobsen D, McMartin KE. Methanol and ethylene glycol poisonings. Mechanism of toxicity, clinical course, diagnosis and treatment. Med Toxicol. 1986;1(5):309-334.
- Alrashed M et al. The perils of methanol exposure: insights into toxicity and clinical management. Toxics. 2024;12(12):924.
- Yazgan ÜC et al. Effect of caffeic acid phenethyl ester on oxidant and anti-oxidant status of liver and serum in a rat model with acute methanol intoxication. Ir J Med Sci. 2017;186(2):519-523.
- Gharaeikhezri MH et al. Prevalence and predicting factors of acute kidney injury due to methanol intoxication; a systematic review. J Renal Inj Prev. 2024;13(2):e32195.
- Allata Y et al. The role of nephrologists in the management of methanol poisoning. Cureus. 2023;15(4):e37471.
- Mullins ME, Kraut JA. The Role of the Nephrologist in Management of Poisoning and Intoxication: Core Curriculum 2022. Am J Kidney Dis. 2022;79(6):877-889.
- Ichimura T et al. Kidney injury molecule-1 (KIM-1), a putative epithelial cell adhesion molecule containing a novel immunoglobulin domain, is up-regulated in renal cells after injury. J Biol Chem. 1998;273(7):4135-4142.
- Han WK et al. Kidney injury molecule-1 (KIM-1): A novel biomarker for human renal proximal tubule injury. Kidney Int. 2002;62(1):237-244.
- Dharnidharka VR, Kwon C, Stevens G. Serum cystatin C is superior to serum creatinine as a marker of kidney function: a meta-analysis. Am J Kidney Dis. 2002;40(2):221-226.
- Herget-Rosenthal S et al. Early detection of acute renal failure by serum cystatin C. Kidney Int. 2004;66(3):1115-1122.
- Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem. 1979;95(2):351-358.
- Sedlak J, Lindsay RH. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent. Anal Biochem. 1968;25:192-205.
- Mégarbane B. Treatment of patients with ethylene glycol or methanol poisoning: focus on fomepizole. Open Access Emerg Med. 2010;2:67-75.
- Brent J et al. Fomepizole for the treatment of methanol poisoning. N Engl J Med. 2001;344(6):424-429.
- Najari F, Baradaran I, Najari D. Methanol poisoning and its treatment. Int J Med Toxicol Forensic Med. 2020;10(1):26639.
- Rajamani R, Muthuvel A, Senthilvelan M, Sheeladevi R. Oxidative stress induced by methotrexate alone and in the presence of methanol in discrete regions of the rodent brain, retina and optic nerve. Toxicol Lett. 2006;165(3):265-273.