הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

השוואה ביצועית מודעת-מדורים של טרנסקריפטומים של נגיפי נשימה עבור מודולים של תגובת מאכסן באף ובדם: מחקר חישובי

85 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73334

⸱

18 בספטמבר 2026

 , 
1Comprehensive Rehabilitation Department, Beidahuang Industry Group General Hospital, 2Department of Pathology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University

במאמר זה

סיכום

מחקר חישובי זה מציג זרימת עבודה המודעת-מדורה (compartment-aware) להשוואת ביצועים (benchmarking) של טרנסקריפטומים ציבוריים של נגיפי נשימה, ומראה כי תגובות המאכסן באף ובדם מציגות התאמה מוגבלת ברמת הגן, אך מניבות מודולים ספציפיים למדורה, הניתנים לשחזור ובעלי פרשנות ביולוגית, על פני מערכי נתונים עצמאיים, השוואות קליניות, התאוששות לאורך זמן ובדיקות חוסן.

תקציר

טרנסקריפטומים ציבוריים של נגיפי נשימה הם בעלי ערך לחקר תגובות המארח, אך הבדלים במקור הרקמה, בהגדרת הביקורות ובמבנה המחקר עלולים להטעות ניתוחים מאוחדים. פיתחנו זרימת עבודה חישובית המודעת למדורים (compartment-aware) כדי לקבוע אם ניתן לזהות פעילות עקבית של תגובת המארח תוך שימור ההקשר הביולוגי של האף והדם. קבוצת ילדים מצומדת מ-GSE117827 שימשה כסט נתונים עוגן, והכללה של טרנסקריפטומים ממטיילי אף ומדם מלא מזיהום סימפטומטי ב-picornavirus, זיהום סימפטומטי ב-respiratory syncytial virus, זיהוי אסימפטומטי של picornavirus וביקורות שליליות לנגיפים. לאחר סינון לפי ועדת שמות הגנים של HUGO (HGNC), נותחו 27,685 גנים. מודולים נפרדים של 50 גנים מקודדי חלבון לאף ולדם הוגדרו מהתגובות החיוביות המובילות וננעלו לפני הערכה חיצונית. השפעות ברמת הגן באף ובדם היו כמעט בלתי תלויות (Pearson r = 0.015), והמודולים חלקו שישה גנים עם חפיפת דירוג חקירתית (Jaccard index = 0.064). עם זאת, המודול של האף הפריד בין זיהום לביקורות בקבוצות עצמאיות של דרכי נשימה עליונות, עם שטחים תחת עקומת מאפיין תגובה (AUROCs) של 0.749, 0.693 ו-0.609, בעוד שהמודול של הדם השיג AUROCs של 0.832, 0.924 ו-0.870 בקבוצות דם חיצוניות. בנתוני זיהומים טבעיים לאורכיים, ציונים תואמים ירדו משלב המחלה החריפה ועד השחרור, עם דלתות מצומדות של 0.436 לדגימות אף ו-0.330 לדם. שלושה סטים של נתוני ייחוס נוספים הכוללים 666 דגימות חיצוניות, יחד עם ביקורות של גנים אקראיים, סריקות גודל מודול, יציבות ב-bootstrap, מתאמי תוכנית-סמן וחלוקת שונות, הגדירו את החוסן והמגבלות של זרימת העבודה. סט 33 ה-messenger ribonucleic acid (mRNA) של Pandya נותר חזק יותר להבחנה בין נגיפי לטרבליירי, בעוד שהמודול של הדם עלה גם בדלקת ריאות חיידקית. ממצאים אלו תומכים במודולים ספציפיים למדורים כציוני פעילות של תגובת מארח הניתנים לשימוש חוזר לצורך השוואת קבוצות ומעקב אחר התאוששות, ולא כסמנים ביולוגיים אוניברסליים לכל הרקמות או כמסווגי פתוגנים עצמאיים.

מבוא

חתימות טרנסקריפטומיות של המאכסן משמשות באופן נרחב לסיווג תסמונות זיהומיות ולהשוואת תגובות חיסוניות בין פתוגנים שונים1,2,3,4,5. נגיפי נשימה מפעילים לעיתים קרובות גנים מושפעי-אינטרפרון (ISGs), מתווכי דלקת ומסלולי הצגת אנטיגן חופפים6,7,8,9,10. מחקרים זוגיים ואורכיים מהעת האחרונה מראים גם כי תגובות מקומיות בדרכי הנשימה ותגובות סיסטמיות עשויות להיבדל בתזמון, בהרכב התאי ובעוצמה11. סוגיה זו חורגת מעבר לשפעת, נגיף הסינציטיום הנשימתי (RSV), רינווירוס ו-SARS-CoV-2. מטפנומווירוס אנושי נותר גורם חשוב למחלות נשימה, אך הספרות העוסקת בתגובת המאכסן ובהתערבויות טיפוליות עדיין נמצאת בשלבי פיתוח12,13. תצפיות אלו על זיהומי נגיפי נשימה מדגישות עוד יותר את ההבדלים בין תגובות מאכסן מקומיות בדרכי הנשימה לבין תגובות סיסטמיות14. עבור מחקרים חישוביים של יחסי מאכסן-נגיף, השאלה המעשית היא לפיכך לא רק אם קיימת תגובה, אלא האם ניתן להשתמש מחדש בנתונים ציבוריים באמצעות זרימת עבודה שקופה השומרת על ההקשר הרקמתי ומניבה ציוני תגובת-מאכסן הניתנים לשחזור.

רוב מאגרי הנתונים הציבוריים של טרנסקריפטום נגיפי נשימה לא תוכננו לצורך הסקה נקייה בין נגיפים שונים או בין רקמות שונות. מקור הרקמה, העיתוי, החומרה, הגיל, הגדרת הביקורת והפלטפורמה משתנים לעיתים קרובות במקביל. מאגרי נתונים של ביטוי ברזולוציה גבוהה רגישים גם הם לווריאציות טכניות ולווריאציות ברמת המחקר שאינן רצויות15,16. לכן, ניתוח מאוחד (pooled analysis) עלול לחשוף חתימה חזקה של אינטרפרון או תגובה דלקתית תוך טשטוש מקורה. דגימות מאף לוכדות ביולוגיה חיסונית של אפיתל וריריות, בעוד שדם שלם משקף תגובות לוקוציטיות סיסטמיות. התייחסות למדגמים ממדורים אלו כניתנים להחלפה הופכת את חישוב הניקוד לפשוט, אך את פרשנותו לקשה.

בנינו את הניתוח סביב GSE117827, קוהורט מצומד של נזלת-דם מאותו מחקר, במקום אוסף הגילוי הגדול ביותר שזמין17. הקוהורט קטן, אך הוא מפחית משתנים מתערבים בין מחקרים כאשר משווים את גדלי האפקט של הנזלת והדם. הוא כולל זיהום סימפטומטי בפיקורנאווירוס, זיהום סימפטומטי ב-RSV, זיהוי א-סימפטומטי של פיקורנאווירוס ובקרות שליליות לווירוס. לכן השתמשנו בו רק כעוגן עבור מודולים נפרדים הספציפיים למדורים. השיוך למודול נקבע לפני הבדיקה החיצונית. יציבות הבחירה של הקוהורט הקטן נבחנה באמצעות דגימה חוזרת של בוטסטראפ מרובד, ערכי אפס של גנים אקראיים ואנליזות רגישות לגודל המודול.

הוספנו שכבת ביסוס (benchmarking) עם משוואים חיידקיים ולא-זיהומיים. GSE63990 מכיל דגימות של דם מלא ממחלה נשימתית חריפה המסומנות כויראליות, חיידקיות או לא-זיהומיות18. GSE40012 מכיל דגימות של דלקת ריאות קהילתית חמורה, תסמונת תגובה דלקתית סיסטמית (SIRS) וביקורות בריאות19. קוהורטות אלו בוחנות האם מודול מסוים משקף פעילות כללית של תגובת המארח או ספציפיות לסוג הפתוגן. GSE53543 נותח בנפרד כביסוס להפרעה של ריינווירוס בתאי דם לבנים מונונוקלאיים (PBMC) ex vivo. הוא מודד את התגובתיות של הלוקוציטים תחת גירוי מבוקר, אך אינו שקול לזיהום טבעי.

הנחת היסוד שלנו היא שמרנית במכוון. איננו מנסים להוכיח חתימה אנטי-ויראלית אוניברסלית מנתונים ציבוריים הטרוגניים. במקום זאת, אנו בוחנים האם תהליך עבודה מודע למדור (compartment-aware workflow) יכול להפיק ציוני מודול שנותרים שימושיים לאחר בדיקה חיצונית. השימוש המיועד הוא משלים למסווגים אבחנתיים כגון Pandya 33-mRNA. מודולים אלו מדרגים את פעילות התגובה של המארח באף ובדם על פני קהלי מחקר, התאוששות ומדרגי תסמינים. הם אינם נועדו לקבוע את סוג הפתוגן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה ניתח מחדש נתונים מזוהים במידע כללי שזמינים לציבור, ולא כלל גיוס חדש, התערבות או איסוף דגימות. לפיכך, לא נדרשו אישור אתי מוסדי או הסכמה מודעת חדשה עבור ניתוח משני זה. אישור אתי והסכמה מודעת למחקרים המקוריים דווחו על ידי מחוללי הנתונים הרלוונטיים.

מבנה המחקר ולוגיקת זרימת העבודה
ביצענו מחקר ביו-אינפורמטיקה רטרוספקטיבי המבוסס על נתונים ציבוריים, תוך שימוש במאגרי נתונים שהופקדו ב-Gene Expression Omnibus20,21. לא הופקו דגימות חולים חדשות, ניסויי תרביות תאים, מודלים של בעלי חיים או תיקוף במעבדה (wet-lab). זרימת העבודה התבססה על עיצוב של "עוגן תחילה" (anchor-first). GSE117827 שימש להערכת גודל האפקט, בניית מודולים, בדיקת הלימה בין מדורים (cross-compartment concordance) וניתוח גרדיאנט התסמינים. מאגרי נתונים עצמאיים הוכנסו למחקר רק לאחר שנקבעה החברות במודול. זרימת העבודה כללה עיגון של מדורים זוגיים, מיפוי ל-HGNC וסינון של גנים מקודדי חלבון, בנייה נפרדת של מודולים לאף ולדם, תיקוף לרוחב הזמן ותיקוף תואם-רקמה, השוואה לבנצ'מרקים קליניים וניתוחי חסינות (robustness analyses). ניתוחים מאששים כללו את הבדיקות הנעולות התואמות-רקמה והבדיקות הלונגיטודיות. ניתוחי חפיפת הגנים, גרדיאנט התסמינים, תוכנית הסמנים וניתוחי השונות היו גששיים או תיאוריים.

עוגן קוהורט וניגוד ראשוני
GSE117827 מכיל פרופילים של ביטוי מתוך מטשבי אף ודם מלא של 26 ילדים: 9 מקרי picornavirus סימפטומטיים, 5 זיהויי picornavirus א-סימפטומטיים, 6 מקרי RSV סימפטומטיים, ו-6 ביקורות א-סימפטומטיות שליליות לנגיף17. בשני מקרי RSV היו דגימות דם חסרות. לכן, תכנון העוגן המלא הכיל 50 דגימות, והניגוד הראשוני של נגועים מול ביקורות הכיל 40 דגימות לאחר החרגת זיהויי picornavirus א-סימפטומטיים מבניית המודולים. עבור הניגוד הראשוני, דגימות של picornavirus סימפטומטי ו-RSV סימפטומטי סומנו כנגועות, ודגימות א-סימפטומטיות שליליות לנגיף סומנו כביקורות. זיהויי picornavirus א-סימפטומטיים לא טופלו כביקורות מכיוון שזיהוי נגיפי ללא תסמינים הוא נבדל ביולוגית מבריאות שלילית לנגיף. דגימות אלו הופרשו מבניית המודולים ושימשו מאוחר יותר לניתוח מדרג תסמינים.

מיפוי גששים ועיבוד מקדים
מדגם GSE117827 פירפיל על GPL23126. מזהי אשכולות תמלילים מופו לסמלי גנים באמצעות קובץ האנוטציה Clariom D Human na36, hg38 שהופץ דרך פלטפורמת GEO GPL24539. רק סמלים מאושרים על ידי HGNC נשמרו22. גששי בקרה, גששי ERCC, אשכולות תמלילים שלא מופו וסמלים שאינם מאושרים הוסרו. מספר אשכולות תמלילים המופים לאותו סמל מאושר אוחדו באמצעות חציון הביטוי. לאחר הסינון והאיחוד, 27,685 גנים היו זמינים לניתוח העוגן. טרנספורמציית log₂(x + 1) הוחלה רק כאשר האחוזון ה-95 של מטריצת הביטוי עלה על 50, מה שמעיד על סולם עוצמה שאינו לוגריתמי. גנים עם יותר מ-20% ערכים חסרים הוסרו; ערכים חסרים שנותרו הוחלפו בחציון הפנימי של הגן. לאחר מכן, כל גן נסטנדר על פני כל הדגימות באותו סט נתונים כ- z = (x − mean)/sample standard deviation (ddof = 1). לגנים עם שונות אפס הוקצה ערך סטנדרטי של 0. בניית המודולים הוגבלה לרשומות המסווגות כגנים מקודדי חלבון בסט המלא של HGNC.

ניתוח גודל אפקט ובניית מודולים
מדגמי תאי אפ and דם נותחו בנפרד. מדגמי נגיף סימפטומטיים הושוו לקבוצות ביקורת שליליות לנגיף באמצעות הפרשי ממוצעים סטנדרטיים של Hedges g ומבחני Welch דו-זנביים23. Hedges g חושב כהפרש הממוצעים בין הקבוצה המודבקת לקבוצת הביקורת, חלקי סטיית התקן המאוחדת, ובכפל בתיקון למדגמים קטנים 1 − 3/(4df − 1), כאשר df = ninfected + ncontrol − 2. מבחני Welch בוצעו עם שונויות לא שוות. שיעורי גילוי שגוי (FDR) לפי Benjamini–Hochberg חושבו עבור כל הגנים שנבחנו בכל מדגם24. מכיוון ששום גן מקודד לחלבון לא עמד בשילוב הקשיח שנקבע מראש של FDR < 0.05 ו-Hedges g > 0.8 בעקבת העוגן (anchor cohort) הקטנה, גנים בעלי אפקט חיובי דורגו ראשית לפי ערך P עולה של מבחן Welch דו-זנבי, ולאחר מכן לפי Hedges g יורד, כאשר סמל הגן שימש כקובע סופי במקרה של תיקו. 50 הגנים המובילים הרכיבו כל מודול ראשוני. חמישים גנים נבחרו מראש כגודל מודול בינוני השומר על רוחב ביולוגי תוך הגבלת אובדן של גנים חסרים בין פלטפורמות שונות. גודל מודול זה לא הותאם ל-AUROC חיצוני. ניתוחי רגישות באמצעות 10, 25, 50, 100 ו-200 גנים הניבו את אותה תוצאה איכותנית של הפרדת עוגן. המטרה הייתה הדירות ברמת המודול, ולא גילוי של גן בודד.

הלימה בין מדגמים (Cross-compartment concordance)
הערכות Hedges g של דגימות אף ודם הותאמו לפי גן והושוו באמצעות מתאמי פירסון וספירמן. החפיפה בין 50 המודולים המובילים באף לבין 50 המודולים המובילים בדם סוכמה על ידי מספר החפיפה ומדד ג'קארד (Jaccard index). גנים חופפים פ ursprüngלשו כמועמדים ניסיוניים לחפיפת דרגות בין מדגמים, ולא כסמנים ביולוגיים (biomarkers) שמורים ומאומתים.

תיקוף חיצוני תואם-רקמה
תיקוף של ציון המודול בוצע באמצעות מאגרי נתונים ציבוריים עצמאיים עם קבוצות מקור ניתנות לפירוש. תיקוף של דרכי הנשימה העליונות כלל דגימות של שטיפת אף של RSV מ-GSE41374 ואת מאגרי הנתונים של SARS-CoV-2 GSE152075 ו-GSE156063. תיקוף של דם כלל את GSE171110 ושתי יחידות GSE38900 שנורמלו בנפרד: GPL10558 (36 דגימות; 28 RSV ו-8 ביקורות) ו-GPL6884 (138 דגימות; 107 RSV ו-31 ביקורות). עבור כל מאגר נתונים חיצוני, גששים (probes) מופו לסמלי HGNC, וסמלים כפולים אוחדו לפי חציון הביטוי. אותם כללי טרנספורמציה, סינון ערכים חסרים, השלמת חציון וסטנדרטיזציית z לכל גן ששימשו עבור מאגר העוגן הוחלו בתוך כל מאגר נתונים. ציון מודול חושב כממוצע לא משוקלל של ערכי ביטוי סטנדרטיים עבור גני המודול המיוצגים. AUROC, דיוק ממוצע ו-FDR של מבחן Welch דווחו כמדדי ניידות (portability), ולא כהערכות של ביצועים אבחנתיים קליניים.

מאגרי נתונים קליניים גדולים של ביצועים (benchmark) ומאגרי הפרעות ex vivo
שני מאגרי נתונים של דם שלם שימשו כבנצ'מרקים קליניים ולא כקוהורטות גילוי. ב-GSE63990, דגימות הוקצו מהמטא-נתונים של מצב הזיהום שהופקדו לזיהום נשימתי נגיפי (n = 117), זיהום נשימתי חיידקי (n = 73), או מחלה לא זיהומית (n = 90); דגימות ללא אחת מהתוויות החד-משמעיות הללו הוצאו מהמחקר18. ב-GSE40012, שדות האבחנה שהופקדו מופו לדלקת ריאות שפעת A (n = 39), דלקת ריאות חיידקית ללא שפעת (n = 61), תסמונת תגובה דלקתית סיסטמית (SIRS) ללא דלקת ריאות (n = 40), ביקורות בריאות (n = 36), או דלקת ריאות חיידקית/שפעת מעורבת (n = 14)19. דגימות מעורבות של חיידקים/שפעת תוארו אך הוצאו מהשוואות הבנצ'מרק הבינאריות.

GSE53543 מכיל 196 פרופילי PBMC ex vivo מ-98 אנשים. כל נבדק תרם דגימה אחת של מדיום בלבד ודגימה אחת שנחשפה ל-rhinovirus 16 למשך 24 h; מזהי הנבדקים אישרו 98 זוגות שלמים. מדד הייחוס הראשי דיווח על AUROC על פני 98 הדגימות המגורות ו-98 הדגימות שאינן מגורות, מכיוון ש-AUROC הוא מדד להפרדת דירוגים. הצמדת הנבדקים נשמרה במטא-דאטה ושימשה בניתוח רגישות מזווג של הפרשי ציונים. ניסוי זה נותח בנפרד מזיהומים קליניים טבעיים ולא שימש לתמיכה בטענות לאבחון קליני.

מטריצות סדרות GEO גולמיות הורדו עבור GSE63990, GSE40012 ו-GSE53543. נעשה שימוש ב-GPL571 עבור GSE63990, ב-GPL6947 עבור GSE40012 וב-GPL10558 עבור GSE53543. פרובים מופו לסמלים מאושרים על ידי HGNC, ומיפויים כפולים צומצמו על ידי ביטוי חציוני. נעשה שימוש במטריצות מנורמלות שהופקדו. כלל אחוזון ה-95 הכללי הוביל לביצוע טרנספורמציית log₂(x + 1) רק עבור מטריצות בסולם שאינו לוגריתמי. GSE53543 כבר עבר טרנספורמציית log₂, נורמליזציה שאינה תלויה בדירוג (rank-invariant), והתאמה ליום העיבוד על ידי החוקרים המקוריים, ולכן לא הוחלה טרנספורמציית לוגเพิ่มเติม. לאחר הסרת גנים עם יותר מ-20% ערכים חסרים והשלמת הערכים החסרים שנותרו באמצעות החציוני, כל גן עבר סטנדרטיזציית z על פני כל הדגימות בתוך מערך הנתונים שלו. שכבת הייחוס הכילה 470 דגימות דם שלם קליניות ו-196 דגימות PBMC ex vivo.

כיול חתימות ייחוס
מודולי האף והדם של העוגן כולים כיול מול שלוש קבוצות ייחוס לא משוקללות. קבוצת ה-33-mRNA הרשמית של Pandya הועתקה מטבלת השלמה 1 של דוח המסווג המקורי5. קבוצת ההשוואה של Andres-Terre כללה 33 גנים מכווני-אינטרפרון שנבחרו מחתימת הרב-נגיף המדווחת3. קבוצת ההשוואה של Hallmark כללה תת-קבוצת ליבה של 33 גנים של אינטרפרון-אלפא המקושרת לקבוצת MSigDB HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE25,26. רשימות גנים מלאות עבור שלוש קבוצות הייחוס מופיעות בנתוני השלמה 1. ציוני ייחוס אלו אינם משחזרים את המסווגים המשוקללים המקוריים. עבור כל סט נתונים, חישוב הציון בוצע כממוצע לא משוקלל של ציוני ה-z הזמינים לכל גן; נדרשו לפחות שלושה גנים מיוצגים, ומספר הגנים המיוצגים דווח. השוואות הכיול היו נגיפי מול חיידקי, נגיפי מול לא-זיהומי, נגיפי מול חיידקי-או-לא-זיהומי, נגיפי מול בריא/ביקורת, וחיידקי מול בריא/ביקורת, כאשר הקבוצות הנדרשות היו זמינות. AUROC ודיוק ממוצע פותרו כמדדי כיול. ערכי P של מבחן Welch הותאמו באמצעות הליך Benjamini–Hochberg על פני כל השילובים התקפים של סט נתונים-השוואה-מודול בטבלת הכיול.

תיקוף אורכי עצמאי
מאגרי הנתונים הזוגיים של השלב החריף לעומת השלב בשעת השחרור, GSE97741 ו-GSE97742, שימשו אך ורק לצורך תיקוף אורכי27. דגימות שסומנו במטא-נתונים המופקדים כזיהום בודד ב-RSV (RSVsi) או ב-rhinovirus (hRV) הרכיבו את הניתוח העיקרי; זיהומים משולבים של RSV (RSVco) נשמרו רק בפלט המשלים. תוויות של שלב חריף ושחרור חולצו מכותרות הדגימות. דגימות הותאמו לפי מאגר נתונים, מדור, קבוצת נגיפים ומזהה נבדק, ורק נבדקים עם שתי נקודות הזמן נשמרו. הקבוצה המשולבת הראשית כללה 38 זוגות של RSVsi ו-30 זוגות של hRV (68 זוגות למדור).

לא נעשה שימוש בבחירת גנים, זיקוק מודולים או כיוונון סף עבור GSE97741 או GSE97742. מערכי נתונים אלו שומרו לצורך תיקוף חיצוני. מזהי הגששים מופו לסמלי HGNC מאושרים, וסמלים כפולים אוחדו לפי חציון הביטוי. אותם נהלי כלל של חוקית טרנספורמציה לוגריתמית לאחוזון ה-95, סינון ערכים חסרים, השלמת חציונים וסטנדרטיזציית z לכל גן בתוך מערך הנתונים הוחלו לפני חישוב ציוני המודולים הקבועים של GSE117827.

עבור כל רקמה ומודול, ציוני השלב החריף והשלב לאחר השחרור הוצמדו לפי נבדק וקבוצת נגיף. ההפרש בין השלב החריף לשלב השחרור חושב עבור כל זוג. מדד Cohen dz חושב כהפרש הממוצע של הזוגות חלקי סטיית התקן של המדגם. דווחו מבחני t לצמדים דו-זנביים ומבחני Wilcoxon signed-rank דו-זנביים, יחד עם AUROC להפרדה בין הציונים בשלב החריף לעומת שלב השחרור. ערכי Benjamini–Hochberg FDR חושבו עבור כל 20 מבחני ה-t לצמדים התקפים בפלט האורכי המלא (שני סטים של נתונים, שני מקורות למודולים וחמישה סיכומי קבוצות נגיפים שהוגדרו מראש).

ניתוח מדרג סימפטומים וניתוח פוסט-הוק
לאחר שנקבעה השיוּך למודולים, גילויים של picornavirus ללא תסמינים ששמרו בנפרד ב-GSE117827 שימשו אך ורק לניתוח מדרג סימפטומים. הניקוד הקליני הסודרי היה 0 עבור ביקורות שליליות לווירוס, 1 עבור גילויים של picornavirus ללא תסמינים, ו-2 עבור זיהום עם תסמינים. מתאם Spearman שימש להערכת המגמה הסודרית, בעוד שמבחן Kruskal–Wallis העריך הבדלים כלליים בין שלוש הקבוצות. מבחני Mann–Whitney U פוסט-הוק דו-זנביים השוו בין שלושת זוגות הקבוצות. תיקון Benjamini–Hochberg הוחל בנפרד בכל מדור על משפחת שלושת ההשוואות הזוגיות שלו.

העשרה פונקציונלית
גנים של מודול האף והדם נותחו באמצעות Enrichr דרך gseapy, תוך שימוש בספריות MSigDB Hallmark 2020, Reactome 2022 ו-GO Biological Process 202325,26,28,29,30,31Enrichr השתמשה במסגרת הייצוג-יתר (over-representation) הסטנדרטית שלה, המבוססת על מבחן הדיוק של פישר (Fisher's exact test). תיקון Benjamini–Hochberg כפי שדווח בספריות P ערכים < 0.05 נחשבו למשמעותיים. שמונת המונחים המשמעותיים ביותר לכל מודול בשלוש הספריות שנבדקו דורגו לפי ערך מתואם P ערך. תוצאות ההעשרה שימשו לפרשנות בלבד.

ניתוחי חוסן, תוכנית סמנים ושונות
ניתוחי חוסן בדקו האם התוצאות תלויות בגודל המודול או בבחירה מקרית. הוערכו גדלי מודולים של 10, 25, 50, 100 ו-200 גנים. עבור ניתוח ה-null של גנים אקראיים, היקום הזכאי כלל גנים מקודדי חלבון של HGNC המיוצגים במטריצת GSE117827 המעובדת. נדגמו חמש מאות קבוצות של 50 גנים ללא החלפה באמצעות seed אקראי של NumPy בערך 20260622. בחירה חוזרת בשיטת Bootstrap הוגבלה ל-1,000 הגנים המקודדי חלבון בעלי השפעה חיובית שדורגו במקום הגבוה ביותר בניתוח העוגן המקורי עבור כל מדור. בכל דגימה חוזרת, הגנים המקודדי חלבון החיוביים דורגו לפי ערך P דו-צדדי של Welch עולה, ולאחר מכן לפי הפרש ממוצע יורד. 50 הגנים המובילים נבחרו. יציבות הגנים חושבה כמספר הבחירות חלקי 100. 20 הגנים עם תדירות הבחירה הגבוהה ביותר בכל מדור הוצגו.

ציוני תוכניות-סמנים שימשו כעזרים תיאוריים ולא כהערכות של פלקציות תאים. נבחנו שש תוכניות נבחרות: אפיתליאלית (EPCAM, KRT8, KRT18, KRT19, MUC1, KRT5, KRT14, SCGB1A1, FOXJ1), מונוציטים/מקרופאגים (LYZ, LST1, S100A8, S100A9, FCGR3A, FCGR1A, CD14, MS4A7, CTSS), נויטרופילים (S100A8, S100A9, MPO, ELANE, CEACAM8, FCGR3B, OLFM4, MMP8), T/NK (CD3D, CD3E, TRAC, NKG7, GNLY, PRF1, GZMB, KLRD1, IL7R), B/פלזמה (MS4A1, CD79A, CD79B, MZB1, JCHAIN, IGHG1, SDC1), ואינטרפרון מיאלואידי (SIGLEC1, IFI27, IFI44L, ISG15, MX1, OAS1, RSAD2, IFIT3). ציון כל תוכנית חושב כממוצע של ערכי ה-z הזמינים לכל גן, כאשר נדרשו לפחות שלושה גנים מיוצגים. ערכי P של Spearman הותאמו באמצעות הליך Benjamini–Hochberg על פני כל משפחת המתאמים של מערך-נתונים-מודול-תוכנית. ערך eta-squared חד-כיווני חושב כסכום הריבועים בין הקבוצות חלקי סכום הריבועים הכולל עבור כל זוג מודול-גורם. שורות שחסר בהן הגורם הרלוונטי הוצאו מחישוב זה. ניתוח זה היה תיאורי ולא הותאם עבור גורמים במתאם הדדי.

שחזוריות
כל הניתוחים בוצעו באמצעות זרימות עבודה מתוסכננות ב-Python 3.12.13, עם חבילות התוכנה והגרסאות המפורטות ב-טבלת החומרים. בהליכים אקראיים נעשה שימוש בזרע (seed) קבוע של 20260622. מטריצות ביטוי ציבוריות מ-GEO עובדו באמצעות מבנה פרויקט עקבי שהפריד בין קלטים גולמיים, נתונים מעובדים, פלטים סטטיסטיים, טבלאות ואיורים. הגדרות מודולים, רשומות אוצרות דגימות, הערכות גודל אפקט, סטטיסטיקות תיקוף, תוצאות העשרה, ניתוחי חוסן ונתוני מקור של איורים נשמרו כדי לאפשר אימות עצמאי. קוד הניתוח, מפרטי התלות ונתונים נגזרים תומכים זמינים כפי שמתואר בהצהרת זמינות הנתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בדיקת ביצועים בשיטת anchor-step הפרידה בין השפעות גנטיות ספציפיות לרקמה לבין השפעות גנטיות רב-רקמתיות (pan-tissue)
מטריצת ה-anchor המטופלת של GSE117827 הכילה 27,685 גנים מאושרים על ידי HGNC. הניגודיות (contrast) הנחית הראשית כללה 15 דגימות של נשאי זיהום סימפטומטיים ו-6 דגימות ביקורת שליליות לוירוס; הניגודיות של הדם כללה 13 נשאי זיהום סימפטומטיים ו-6 ביקורות (טבלה 1). מכיוון שקוהורט קטן זה אינו יכול לתמוך בגילוי יציב של גן בודד, הוא שימש כ-anchor למדגמים מזווגים ממדורים שונים. היציבות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הלקח העיקרי הוא תפעולי: יש להתחיל מהמדגם של המדור הספציפי, ולא מהמטריצה המאוחדת הגדולה ביותר. GSE117827 הוא קטן, אך העיצוב הצמוד שלו מאפשר השוואה ישירה בין הנזל לדם במסגרת מחקר אחד. המתאם האפסי כמעט של ההשפעה ברמת הגן מראה שרשימת דירוג מאוחדת של כל הרקמות הייתה מסתירה מבנה מדורי משמעותי. לכן, עיצוב של מודולים נפרדים היה הגיוני ומוצדק יותר. ביצועיהם החיצוניים והאורכיים תומכים בפעילות תגובת מאכסנית הניתנת לשחזור ברמת המודול, ולא ברשימת גנים אוניברסלית.

ניידות ברמת הגן וניידות ברמת המודול הן שונו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים כספיים או לא כספיים הרלוונטיים לעבודה זו.

תודות

המחברים מודים לחוקרים ולמשתתפים במחקרי ה-GEO הציבוריים שננתחו מחדש בעבודה זו. אף אדם נוסף לא עמד בקריטריונים לכתיבה. מחקר זה לא קיבל מענק ספציפי מכל סוכנות מימון במגזר הציבורי, המסחרי או ללא מטרות רווח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סט גנים של Andres-Terre למשפיעי אינטרפרון רב-ויראלייםAndres-Terre et al.משווה של 33 גנים; Supplementary Data 1משווה לא משוקלל המכוון לאינטרפרון, שנערך מתוך החתימה הרב-ויראלית המדווחת; רשימת הגנים המלאה מופיעה ב-Supplementary Data 1.
EnrichrMa'ayan Laboratoryנגישה ב-18 באוגוסט 2026; RRID:SCR_001575משאב לייצוג-יתר של סטים של גנים, נגיש דרך gseapy.
Gene Expression OmnibusNational Center for Biotechnology InformationGEO; RRID:SCR_005012מאגר טרנסקריפטום ציבורי ששימש לגישה למסדי הנתונים שנותחו.
Gene OntologyGene Ontology ConsortiumGO Biological Process 2023; RRID:SCR_002811ספריית אנוטציה פונקציונלית ששימשה דרך Enrichr.
GPL10558NCBI GEOGPL10558פלטפורמה עבור GSE53543 ויחידת הוולידציה של GSE38900 הכוללת 36 דגימות.
GPL23126NCBI GEOGPL23126פלטפורמת ביטוי עבור GSE117827.
GPL24539NCBI GEOClariom_D_Human.na36.hg38.
probeset.csv		אנוטציית Clariom D Human na36, hg38 ששימשה למיפוי אשכולות טרנסקריפטים עבור GSE117827.
GPL571NCBI GEOGPL571אנוטציית פלטפורמה שהוחלה על GSE63990.
GPL6884NCBI GEOGPL6884פלטפורמה עבור יחידת הוולידציה של דם מלא עבור RSV הכוללת 138 דגימות מ-GSE38900.
GPL6947NCBI GEOGPL6947אנוטציית פלטפורמה שהוחלה על GSE40012.
GSE117827NCBI GEOGSE117827מסד נתונים עיגון ראשוני של דגימות מזוהות של סווabst נחיר ודם מלא.
GSE152075NCBI GEOGSE152075מסד נתונים חיצוני לוולידציה של דרכי נשימה עליונות עבור SARS-CoV-2.
GSE156063NCBI GEOGSE156063מסד נתונים חיצוני לוולידציה של דרכי נשימה עליונות עבור SARS-CoV-2.
GSE171110NCBI GEOGSE171110מסד נתונים חיצוני לוולידציה של דם מלא עבור SARS-CoV-2.
GSE38900NCBI GEOGSE38900; GPL10558 and GPL6884וולידציה חיצונית של דם מלא ל-RSV שנותחה כיחידות פלטפורמה של 36 ו-138 דגימות שנורמלו בנפרד.
GSE40012NCBI GEOGSE40012מדד השוואה קליני של דלקת ריאות מ-influenza A, דלקת ריאות חיידקית, SIRS וביקורת בריאה.
GSE41374NCBI GEOGSE41374מסד נתונים חיצוני לוולידציה של שטיפות נחיר עבור RSV.
GSE53543NCBI GEOGSE53543מדד השוואה של הפרעה ב-rhinovirus ב-PBMC ex vivo בצמדים, הכולל 98 נבדקים ו-196 דגימות.
GSE63990NCBI GEOGSE63990מדד השוואה קליני של דם מלא לווירוסים, חיידקים ומצבים לא זיהומיים.
GSE97741NCBI GEOGSE97741מסד נתונים לוולידציה אורךית של דם מלא: שלב חריף לעומת שלב השחרור.
GSE97742NCBI GEOGSE97742מסד נתונים לוולידציה אורךית של נזלת נחירית: שלב חריף לעומת שלב השחרור.
gseapygseapy developersגרסה 1.3.1ממשק Python ששימש לשאילתות ב-Enrichr.
HGNC gene symbol resourceHUGO Gene Nomenclature Committeeנגישה ב-18 באוגוסט 2026; RRID:SCR_002827משאב לנורמליזציה מאושרת של סמלי גנים וסיווג מקודדי חלבון.
MatplotlibMatplotlib development teamגרסה 3.11.1יצירת איורים.
MSigDB Hallmark gene setsBroad InstituteHallmark 2020; RRID:SCR_016863ספריית העשרה מסוג Hallmark הנגישה דרך Enrichr.
MSigDB Hallmark interferon-alpha response gene setBroad InstituteHALLMARK_INTERFERON_ALPHA_
RESPONSE; תת-קבוצה של 33 גנים ב-Supplementary Data 1		משווה לא משוקלל של אינטרפרון-אלפא; תת-הקבוצה המדויקת מופיעה ב-Supplementary Data 1.
NumPyNumPy developersגרסה 2.5.2מיחשוב נומרי ודגימה אקראית עם זרע (seed).
pandaspandas development teamגרסה 3.0.5עיבוד נתונים טבלאיים.
Pandya 33-mRNA host-response gene setPandya et al.Supplementary Table 1; Supplementary Data 1סט רשמי של 33 גנים שדורג כמשווה לא משוקלל.
PythonPython Software Foundationגרסה 3.12.13סביבת ניתוח חישובית.
ReactomeReactomeReactome 2022; RRID:SCR_003485ספריית העשרת מסלולים הנגישה דרך Enrichr.
scikit-learnscikit-learn developersגרסה 1.9.0חישובי AUROC ודיוק ממוצע (average-precision).
SciPySciPy developersגרסה 1.18.0מבחני Welch, paired t, Wilcoxon, Mann–Whitney ומבחני קורלציה.
SeabornSeaborn development teamגרסה 0.13.2גרפיקה סטטיסטית.
statsmodelsstatsmodels developersגרסה 0.14.6כלי עזר סטטיסטיים.

מקורות

  1. Zaas AK, et al. Gene expression signatures diagnose influenza and other symptomatic respiratory viral infections in humans. Cell Host Microbe. 2009;6(3):207-17.
  2. Woods CW, et al. A host transcriptional signature for presymptomatic detection of infection in humans exposed to influenza H1N1 or H3N2. PLoS One. 2013;8(1):e52198.
  3. Andres-Terre M, et al. Integrated, multi-cohort analysis identifies conserved transcriptional signatures across multiple respiratory viruses. Immunity. 2015;43(6):1199-211.
  4. Herberg JA, et al. Diagnostic test accuracy of a 2-transcript host RNA signature for discriminating bacterial vs viral infection in febrile children. JAMA. 2016;316(8):835-45.
  5. Pandya R, et al. A machine learning classifier using 33 host immune response mRNAs accurately distinguishes viral and non-viral acute respiratory illnesses in nasal swab samples. Genome Med. 2023;15(1):64.
  6. Ioannidis I, et al. Plasticity and virus specificity of the airway epithelial cell immune response during respiratory virus infection. J Virol. 2012;86(10):5422-36.
  7. Mejias A, et al. Whole blood gene expression profiles to assess pathogenesis and disease severity in infants with respiratory syncytial virus infection. PLoS Med. 2013;10(11):e1001549.
  8. Blanco-Melo D, et al. Imbalanced host response to SARS-CoV-2 drives development of COVID-19. Cell. 2020;181(5):1036-45.e9.
  9. Hadjadj J, et al. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science. 2020;369(6504):718-24.
  10. Mick E, et al. Upper airway gene expression reveals suppressed immune responses to SARS-CoV-2 compared with other respiratory viruses. Nat Commun. 2020;11(1):5854.
  11. Yoshida M, et al. Local and systemic responses to SARS-CoV-2 infection in children and adults. Nature. 2022;602(7896):321-7.
  12. Jamali MC, et al. Respiratory infections by human metapneumovirus: epidemiological evidence and treatment prospects. Res J Pharm Technol. 2026;19(8):3905-12. doi:10.52711/0974-360X.2026.00549.
  13. Gao G, Lin R, Ma D. Human metapneumovirus: pathogenesis, epidemiology, diagnostic technologies, and potential intervention strategies. Virol J. 2025;22(1):376.
  14. Lim FY, et al. homeRNA self-blood collection enables high-frequency temporal profiling of presymptomatic host immune kinetics to respiratory viral infection: a prospective cohort study. EBioMedicine. 2025;112:105531.
  15. Johnson WE, Li C, Rabinovic A. Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics. 2007;8(1):118-27.
  16. Leek JT, et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics. 2012;28(6):882-3.
  17. Yu J, et al. Host gene expression in nose and blood for the diagnosis of viral respiratory infection. J Infect Dis. 2019;219(7):1151-61.
  18. Tsalik EL, et al. Host gene expression classifiers diagnose acute respiratory illness etiology. Sci Transl Med. 2016;8(322):322ra11.
  19. Parnell GP, et al. A distinct influenza infection signature in the blood transcriptome of patients with severe community-acquired pneumonia. Crit Care. 2012;16(4):R157.
  20. Edgar R, Domrachev M, Lash AE. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Res. 2002;30(1):207-10.
  21. Barrett T, et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Res. 2013;41(D1):D991-5.
  22. Tweedie S, et al. Genenames.org: the HGNC and VGNC resources in 2021. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D939-46.
  23. Welch BL. The generalization of Student's problem when several different population variances are involved. Biometrika. 1947;34(1-2):28-35.
  24. Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J R Stat Soc Series B Stat Methodol. 1995;57(1):289-300.
  25. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-50.
  26. Liberzon A, et al. The Molecular Signatures Database Hallmark Gene Set Collection. Cell Syst. 2015;1(6):417-25.
  27. Do LAH, et al. Host transcription profile in nasal epithelium and whole blood of hospitalized children under 2 years of age with respiratory syncytial virus infection. J Infect Dis. 2018;217(1):134-46.
  28. Ashburner M, et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-9.
  29. The Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D325-34.
  30. Gillespie M, et al. The Reactome pathway knowledgebase 2022. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D687-92.
  31. Kuleshov MV, et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1):W90-7.
  32. Schoggins JW, et al. A diverse range of gene products are effectors of the type I interferon antiviral response. Nature. 2011;472(7344):481-5.
  33. Schneider WM, Chevillotte MD, Rice CM. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annu Rev Immunol. 2014;32:513-45.
  34. Perng YC, Lenschow DJ. ISG15 in antiviral immunity and beyond. Nat Rev Microbiol. 2018;16(7):423-39.
  35. Schioppa T, et al. Molecular basis for CCRL2 regulation of leukocyte migration. Front Cell Dev Biol. 2020;8:615031.
  36. Avila Cobos F, et al. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 2020;11(1):5650.
  37. Maden SK, et al. Challenges and opportunities to computationally deconvolve heterogeneous tissue with varying cell sizes using single-cell RNA-sequencing datasets. Genome Biol. 2023;24(1):288.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טרנסקריפטומות של רירית האףטרנסקריפטומות של דםזרימת עבודה חישוביתניתוח ביטוי גניםקהלי מחקר של זיהומים נגיפייםתיקוף ביומרקריםחסינות מודולים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.