מחקר חישובי זה מציג זרימת עבודה המודעת-מדורה (compartment-aware) להשוואת ביצועים (benchmarking) של טרנסקריפטומים ציבוריים של נגיפי נשימה, ומראה כי תגובות המאכסן באף ובדם מציגות התאמה מוגבלת ברמת הגן, אך מניבות מודולים ספציפיים למדורה, הניתנים לשחזור ובעלי פרשנות ביולוגית, על פני מערכי נתונים עצמאיים, השוואות קליניות, התאוששות לאורך זמן ובדיקות חוסן.
מאמר מחקר
השוואה ביצועית מודעת-מדורים של טרנסקריפטומים של נגיפי נשימה עבור מודולים של תגובת מאכסן באף ובדם: מחקר חישובי
במאמר זה
סיכום
תקציר
טרנסקריפטומים ציבוריים של נגיפי נשימה הם בעלי ערך לחקר תגובות המארח, אך הבדלים במקור הרקמה, בהגדרת הביקורות ובמבנה המחקר עלולים להטעות ניתוחים מאוחדים. פיתחנו זרימת עבודה חישובית המודעת למדורים (compartment-aware) כדי לקבוע אם ניתן לזהות פעילות עקבית של תגובת המארח תוך שימור ההקשר הביולוגי של האף והדם. קבוצת ילדים מצומדת מ-GSE117827 שימשה כסט נתונים עוגן, והכללה של טרנסקריפטומים ממטיילי אף ומדם מלא מזיהום סימפטומטי ב-picornavirus, זיהום סימפטומטי ב-respiratory syncytial virus, זיהוי אסימפטומטי של picornavirus וביקורות שליליות לנגיפים. לאחר סינון לפי ועדת שמות הגנים של HUGO (HGNC), נותחו 27,685 גנים. מודולים נפרדים של 50 גנים מקודדי חלבון לאף ולדם הוגדרו מהתגובות החיוביות המובילות וננעלו לפני הערכה חיצונית. השפעות ברמת הגן באף ובדם היו כמעט בלתי תלויות (Pearson r = 0.015), והמודולים חלקו שישה גנים עם חפיפת דירוג חקירתית (Jaccard index = 0.064). עם זאת, המודול של האף הפריד בין זיהום לביקורות בקבוצות עצמאיות של דרכי נשימה עליונות, עם שטחים תחת עקומת מאפיין תגובה (AUROCs) של 0.749, 0.693 ו-0.609, בעוד שהמודול של הדם השיג AUROCs של 0.832, 0.924 ו-0.870 בקבוצות דם חיצוניות. בנתוני זיהומים טבעיים לאורכיים, ציונים תואמים ירדו משלב המחלה החריפה ועד השחרור, עם דלתות מצומדות של 0.436 לדגימות אף ו-0.330 לדם. שלושה סטים של נתוני ייחוס נוספים הכוללים 666 דגימות חיצוניות, יחד עם ביקורות של גנים אקראיים, סריקות גודל מודול, יציבות ב-bootstrap, מתאמי תוכנית-סמן וחלוקת שונות, הגדירו את החוסן והמגבלות של זרימת העבודה. סט 33 ה-messenger ribonucleic acid (mRNA) של Pandya נותר חזק יותר להבחנה בין נגיפי לטרבליירי, בעוד שהמודול של הדם עלה גם בדלקת ריאות חיידקית. ממצאים אלו תומכים במודולים ספציפיים למדורים כציוני פעילות של תגובת מארח הניתנים לשימוש חוזר לצורך השוואת קבוצות ומעקב אחר התאוששות, ולא כסמנים ביולוגיים אוניברסליים לכל הרקמות או כמסווגי פתוגנים עצמאיים.
מבוא
חתימות טרנסקריפטומיות של המאכסן משמשות באופן נרחב לסיווג תסמונות זיהומיות ולהשוואת תגובות חיסוניות בין פתוגנים שונים1,2,3,4,5. נגיפי נשימה מפעילים לעיתים קרובות גנים מושפעי-אינטרפרון (ISGs), מתווכי דלקת ומסלולי הצגת אנטיגן חופפים6,7,8,9,10. מחקרים זוגיים ואורכיים מהעת האחרונה מראים גם כי תגובות מקומיות בדרכי הנשימה ותגובות סיסטמיות עשויות להיבדל בתזמון, בהרכב התאי ובעוצמה11. סוגיה זו חורגת מעבר לשפעת, נגיף הסינציטיום הנשימתי (RSV), רינווירוס ו-SARS-CoV-2. מטפנומווירוס אנושי נותר גורם חשוב למחלות נשימה, אך הספרות העוסקת בתגובת המאכסן ובהתערבויות טיפוליות עדיין נמצאת בשלבי פיתוח12,13. תצפיות אלו על זיהומי נגיפי נשימה מדגישות עוד יותר את ההבדלים בין תגובות מאכסן מקומיות בדרכי הנשימה לבין תגובות סיסטמיות14. עבור מחקרים חישוביים של יחסי מאכסן-נגיף, השאלה המעשית היא לפיכך לא רק אם קיימת תגובה, אלא האם ניתן להשתמש מחדש בנתונים ציבוריים באמצעות זרימת עבודה שקופה השומרת על ההקשר הרקמתי ומניבה ציוני תגובת-מאכסן הניתנים לשחזור.
רוב מאגרי הנתונים הציבוריים של טרנסקריפטום נגיפי נשימה לא תוכננו לצורך הסקה נקייה בין נגיפים שונים או בין רקמות שונות. מקור הרקמה, העיתוי, החומרה, הגיל, הגדרת הביקורת והפלטפורמה משתנים לעיתים קרובות במקביל. מאגרי נתונים של ביטוי ברזולוציה גבוהה רגישים גם הם לווריאציות טכניות ולווריאציות ברמת המחקר שאינן רצויות15,16. לכן, ניתוח מאוחד (pooled analysis) עלול לחשוף חתימה חזקה של אינטרפרון או תגובה דלקתית תוך טשטוש מקורה. דגימות מאף לוכדות ביולוגיה חיסונית של אפיתל וריריות, בעוד שדם שלם משקף תגובות לוקוציטיות סיסטמיות. התייחסות למדגמים ממדורים אלו כניתנים להחלפה הופכת את חישוב הניקוד לפשוט, אך את פרשנותו לקשה.
בנינו את הניתוח סביב GSE117827, קוהורט מצומד של נזלת-דם מאותו מחקר, במקום אוסף הגילוי הגדול ביותר שזמין17. הקוהורט קטן, אך הוא מפחית משתנים מתערבים בין מחקרים כאשר משווים את גדלי האפקט של הנזלת והדם. הוא כולל זיהום סימפטומטי בפיקורנאווירוס, זיהום סימפטומטי ב-RSV, זיהוי א-סימפטומטי של פיקורנאווירוס ובקרות שליליות לווירוס. לכן השתמשנו בו רק כעוגן עבור מודולים נפרדים הספציפיים למדורים. השיוך למודול נקבע לפני הבדיקה החיצונית. יציבות הבחירה של הקוהורט הקטן נבחנה באמצעות דגימה חוזרת של בוטסטראפ מרובד, ערכי אפס של גנים אקראיים ואנליזות רגישות לגודל המודול.
הוספנו שכבת ביסוס (benchmarking) עם משוואים חיידקיים ולא-זיהומיים. GSE63990 מכיל דגימות של דם מלא ממחלה נשימתית חריפה המסומנות כויראליות, חיידקיות או לא-זיהומיות18. GSE40012 מכיל דגימות של דלקת ריאות קהילתית חמורה, תסמונת תגובה דלקתית סיסטמית (SIRS) וביקורות בריאות19. קוהורטות אלו בוחנות האם מודול מסוים משקף פעילות כללית של תגובת המארח או ספציפיות לסוג הפתוגן. GSE53543 נותח בנפרד כביסוס להפרעה של ריינווירוס בתאי דם לבנים מונונוקלאיים (PBMC) ex vivo. הוא מודד את התגובתיות של הלוקוציטים תחת גירוי מבוקר, אך אינו שקול לזיהום טבעי.
הנחת היסוד שלנו היא שמרנית במכוון. איננו מנסים להוכיח חתימה אנטי-ויראלית אוניברסלית מנתונים ציבוריים הטרוגניים. במקום זאת, אנו בוחנים האם תהליך עבודה מודע למדור (compartment-aware workflow) יכול להפיק ציוני מודול שנותרים שימושיים לאחר בדיקה חיצונית. השימוש המיועד הוא משלים למסווגים אבחנתיים כגון Pandya 33-mRNA. מודולים אלו מדרגים את פעילות התגובה של המארח באף ובדם על פני קהלי מחקר, התאוששות ומדרגי תסמינים. הם אינם נועדו לקבוע את סוג הפתוגן.
פרוטוקול
מחקר זה ניתח מחדש נתונים מזוהים במידע כללי שזמינים לציבור, ולא כלל גיוס חדש, התערבות או איסוף דגימות. לפיכך, לא נדרשו אישור אתי מוסדי או הסכמה מודעת חדשה עבור ניתוח משני זה. אישור אתי והסכמה מודעת למחקרים המקוריים דווחו על ידי מחוללי הנתונים הרלוונטיים.
מבנה המחקר ולוגיקת זרימת העבודה
ביצענו מחקר ביו-אינפורמטיקה רטרוספקטיבי המבוסס על נתונים ציבוריים, תוך שימוש במאגרי נתונים שהופקדו ב-Gene Expression Omnibus20,21. לא הופקו דגימות חולים חדשות, ניסויי תרביות תאים, מודלים של בעלי חיים או תיקוף במעבדה (wet-lab). זרימת העבודה התבססה על עיצוב של "עוגן תחילה" (anchor-first). GSE117827 שימש להערכת גודל האפקט, בניית מודולים, בדיקת הלימה בין מדורים (cross-compartment concordance) וניתוח גרדיאנט התסמינים. מאגרי נתונים עצמאיים הוכנסו למחקר רק לאחר שנקבעה החברות במודול. זרימת העבודה כללה עיגון של מדורים זוגיים, מיפוי ל-HGNC וסינון של גנים מקודדי חלבון, בנייה נפרדת של מודולים לאף ולדם, תיקוף לרוחב הזמן ותיקוף תואם-רקמה, השוואה לבנצ'מרקים קליניים וניתוחי חסינות (robustness analyses). ניתוחים מאששים כללו את הבדיקות הנעולות התואמות-רקמה והבדיקות הלונגיטודיות. ניתוחי חפיפת הגנים, גרדיאנט התסמינים, תוכנית הסמנים וניתוחי השונות היו גששיים או תיאוריים.
עוגן קוהורט וניגוד ראשוני
GSE117827 מכיל פרופילים של ביטוי מתוך מטשבי אף ודם מלא של 26 ילדים: 9 מקרי picornavirus סימפטומטיים, 5 זיהויי picornavirus א-סימפטומטיים, 6 מקרי RSV סימפטומטיים, ו-6 ביקורות א-סימפטומטיות שליליות לנגיף17. בשני מקרי RSV היו דגימות דם חסרות. לכן, תכנון העוגן המלא הכיל 50 דגימות, והניגוד הראשוני של נגועים מול ביקורות הכיל 40 דגימות לאחר החרגת זיהויי picornavirus א-סימפטומטיים מבניית המודולים. עבור הניגוד הראשוני, דגימות של picornavirus סימפטומטי ו-RSV סימפטומטי סומנו כנגועות, ודגימות א-סימפטומטיות שליליות לנגיף סומנו כביקורות. זיהויי picornavirus א-סימפטומטיים לא טופלו כביקורות מכיוון שזיהוי נגיפי ללא תסמינים הוא נבדל ביולוגית מבריאות שלילית לנגיף. דגימות אלו הופרשו מבניית המודולים ושימשו מאוחר יותר לניתוח מדרג תסמינים.
מיפוי גששים ועיבוד מקדים
מדגם GSE117827 פירפיל על GPL23126. מזהי אשכולות תמלילים מופו לסמלי גנים באמצעות קובץ האנוטציה Clariom D Human na36, hg38 שהופץ דרך פלטפורמת GEO GPL24539. רק סמלים מאושרים על ידי HGNC נשמרו22. גששי בקרה, גששי ERCC, אשכולות תמלילים שלא מופו וסמלים שאינם מאושרים הוסרו. מספר אשכולות תמלילים המופים לאותו סמל מאושר אוחדו באמצעות חציון הביטוי. לאחר הסינון והאיחוד, 27,685 גנים היו זמינים לניתוח העוגן. טרנספורמציית log₂(x + 1) הוחלה רק כאשר האחוזון ה-95 של מטריצת הביטוי עלה על 50, מה שמעיד על סולם עוצמה שאינו לוגריתמי. גנים עם יותר מ-20% ערכים חסרים הוסרו; ערכים חסרים שנותרו הוחלפו בחציון הפנימי של הגן. לאחר מכן, כל גן נסטנדר על פני כל הדגימות באותו סט נתונים כ- z = (x − mean)/sample standard deviation (ddof = 1). לגנים עם שונות אפס הוקצה ערך סטנדרטי של 0. בניית המודולים הוגבלה לרשומות המסווגות כגנים מקודדי חלבון בסט המלא של HGNC.
ניתוח גודל אפקט ובניית מודולים
מדגמי תאי אפ and דם נותחו בנפרד. מדגמי נגיף סימפטומטיים הושוו לקבוצות ביקורת שליליות לנגיף באמצעות הפרשי ממוצעים סטנדרטיים של Hedges g ומבחני Welch דו-זנביים23. Hedges g חושב כהפרש הממוצעים בין הקבוצה המודבקת לקבוצת הביקורת, חלקי סטיית התקן המאוחדת, ובכפל בתיקון למדגמים קטנים 1 − 3/(4df − 1), כאשר df = ninfected + ncontrol − 2. מבחני Welch בוצעו עם שונויות לא שוות. שיעורי גילוי שגוי (FDR) לפי Benjamini–Hochberg חושבו עבור כל הגנים שנבחנו בכל מדגם24. מכיוון ששום גן מקודד לחלבון לא עמד בשילוב הקשיח שנקבע מראש של FDR < 0.05 ו-Hedges g > 0.8 בעקבת העוגן (anchor cohort) הקטנה, גנים בעלי אפקט חיובי דורגו ראשית לפי ערך P עולה של מבחן Welch דו-זנבי, ולאחר מכן לפי Hedges g יורד, כאשר סמל הגן שימש כקובע סופי במקרה של תיקו. 50 הגנים המובילים הרכיבו כל מודול ראשוני. חמישים גנים נבחרו מראש כגודל מודול בינוני השומר על רוחב ביולוגי תוך הגבלת אובדן של גנים חסרים בין פלטפורמות שונות. גודל מודול זה לא הותאם ל-AUROC חיצוני. ניתוחי רגישות באמצעות 10, 25, 50, 100 ו-200 גנים הניבו את אותה תוצאה איכותנית של הפרדת עוגן. המטרה הייתה הדירות ברמת המודול, ולא גילוי של גן בודד.
הלימה בין מדגמים (Cross-compartment concordance)
הערכות Hedges g של דגימות אף ודם הותאמו לפי גן והושוו באמצעות מתאמי פירסון וספירמן. החפיפה בין 50 המודולים המובילים באף לבין 50 המודולים המובילים בדם סוכמה על ידי מספר החפיפה ומדד ג'קארד (Jaccard index). גנים חופפים פ ursprüngלשו כמועמדים ניסיוניים לחפיפת דרגות בין מדגמים, ולא כסמנים ביולוגיים (biomarkers) שמורים ומאומתים.
תיקוף חיצוני תואם-רקמה
תיקוף של ציון המודול בוצע באמצעות מאגרי נתונים ציבוריים עצמאיים עם קבוצות מקור ניתנות לפירוש. תיקוף של דרכי הנשימה העליונות כלל דגימות של שטיפת אף של RSV מ-GSE41374 ואת מאגרי הנתונים של SARS-CoV-2 GSE152075 ו-GSE156063. תיקוף של דם כלל את GSE171110 ושתי יחידות GSE38900 שנורמלו בנפרד: GPL10558 (36 דגימות; 28 RSV ו-8 ביקורות) ו-GPL6884 (138 דגימות; 107 RSV ו-31 ביקורות). עבור כל מאגר נתונים חיצוני, גששים (probes) מופו לסמלי HGNC, וסמלים כפולים אוחדו לפי חציון הביטוי. אותם כללי טרנספורמציה, סינון ערכים חסרים, השלמת חציון וסטנדרטיזציית z לכל גן ששימשו עבור מאגר העוגן הוחלו בתוך כל מאגר נתונים. ציון מודול חושב כממוצע לא משוקלל של ערכי ביטוי סטנדרטיים עבור גני המודול המיוצגים. AUROC, דיוק ממוצע ו-FDR של מבחן Welch דווחו כמדדי ניידות (portability), ולא כהערכות של ביצועים אבחנתיים קליניים.
מאגרי נתונים קליניים גדולים של ביצועים (benchmark) ומאגרי הפרעות ex vivo
שני מאגרי נתונים של דם שלם שימשו כבנצ'מרקים קליניים ולא כקוהורטות גילוי. ב-GSE63990, דגימות הוקצו מהמטא-נתונים של מצב הזיהום שהופקדו לזיהום נשימתי נגיפי (n = 117), זיהום נשימתי חיידקי (n = 73), או מחלה לא זיהומית (n = 90); דגימות ללא אחת מהתוויות החד-משמעיות הללו הוצאו מהמחקר18. ב-GSE40012, שדות האבחנה שהופקדו מופו לדלקת ריאות שפעת A (n = 39), דלקת ריאות חיידקית ללא שפעת (n = 61), תסמונת תגובה דלקתית סיסטמית (SIRS) ללא דלקת ריאות (n = 40), ביקורות בריאות (n = 36), או דלקת ריאות חיידקית/שפעת מעורבת (n = 14)19. דגימות מעורבות של חיידקים/שפעת תוארו אך הוצאו מהשוואות הבנצ'מרק הבינאריות.
GSE53543 מכיל 196 פרופילי PBMC ex vivo מ-98 אנשים. כל נבדק תרם דגימה אחת של מדיום בלבד ודגימה אחת שנחשפה ל-rhinovirus 16 למשך 24 h; מזהי הנבדקים אישרו 98 זוגות שלמים. מדד הייחוס הראשי דיווח על AUROC על פני 98 הדגימות המגורות ו-98 הדגימות שאינן מגורות, מכיוון ש-AUROC הוא מדד להפרדת דירוגים. הצמדת הנבדקים נשמרה במטא-דאטה ושימשה בניתוח רגישות מזווג של הפרשי ציונים. ניסוי זה נותח בנפרד מזיהומים קליניים טבעיים ולא שימש לתמיכה בטענות לאבחון קליני.
מטריצות סדרות GEO גולמיות הורדו עבור GSE63990, GSE40012 ו-GSE53543. נעשה שימוש ב-GPL571 עבור GSE63990, ב-GPL6947 עבור GSE40012 וב-GPL10558 עבור GSE53543. פרובים מופו לסמלים מאושרים על ידי HGNC, ומיפויים כפולים צומצמו על ידי ביטוי חציוני. נעשה שימוש במטריצות מנורמלות שהופקדו. כלל אחוזון ה-95 הכללי הוביל לביצוע טרנספורמציית log₂(x + 1) רק עבור מטריצות בסולם שאינו לוגריתמי. GSE53543 כבר עבר טרנספורמציית log₂, נורמליזציה שאינה תלויה בדירוג (rank-invariant), והתאמה ליום העיבוד על ידי החוקרים המקוריים, ולכן לא הוחלה טרנספורמציית לוגเพิ่มเติม. לאחר הסרת גנים עם יותר מ-20% ערכים חסרים והשלמת הערכים החסרים שנותרו באמצעות החציוני, כל גן עבר סטנדרטיזציית z על פני כל הדגימות בתוך מערך הנתונים שלו. שכבת הייחוס הכילה 470 דגימות דם שלם קליניות ו-196 דגימות PBMC ex vivo.
כיול חתימות ייחוס
מודולי האף והדם של העוגן כולים כיול מול שלוש קבוצות ייחוס לא משוקללות. קבוצת ה-33-mRNA הרשמית של Pandya הועתקה מטבלת השלמה 1 של דוח המסווג המקורי5. קבוצת ההשוואה של Andres-Terre כללה 33 גנים מכווני-אינטרפרון שנבחרו מחתימת הרב-נגיף המדווחת3. קבוצת ההשוואה של Hallmark כללה תת-קבוצת ליבה של 33 גנים של אינטרפרון-אלפא המקושרת לקבוצת MSigDB HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE25,26. רשימות גנים מלאות עבור שלוש קבוצות הייחוס מופיעות בנתוני השלמה 1. ציוני ייחוס אלו אינם משחזרים את המסווגים המשוקללים המקוריים. עבור כל סט נתונים, חישוב הציון בוצע כממוצע לא משוקלל של ציוני ה-z הזמינים לכל גן; נדרשו לפחות שלושה גנים מיוצגים, ומספר הגנים המיוצגים דווח. השוואות הכיול היו נגיפי מול חיידקי, נגיפי מול לא-זיהומי, נגיפי מול חיידקי-או-לא-זיהומי, נגיפי מול בריא/ביקורת, וחיידקי מול בריא/ביקורת, כאשר הקבוצות הנדרשות היו זמינות. AUROC ודיוק ממוצע פותרו כמדדי כיול. ערכי P של מבחן Welch הותאמו באמצעות הליך Benjamini–Hochberg על פני כל השילובים התקפים של סט נתונים-השוואה-מודול בטבלת הכיול.
תיקוף אורכי עצמאי
מאגרי הנתונים הזוגיים של השלב החריף לעומת השלב בשעת השחרור, GSE97741 ו-GSE97742, שימשו אך ורק לצורך תיקוף אורכי27. דגימות שסומנו במטא-נתונים המופקדים כזיהום בודד ב-RSV (RSVsi) או ב-rhinovirus (hRV) הרכיבו את הניתוח העיקרי; זיהומים משולבים של RSV (RSVco) נשמרו רק בפלט המשלים. תוויות של שלב חריף ושחרור חולצו מכותרות הדגימות. דגימות הותאמו לפי מאגר נתונים, מדור, קבוצת נגיפים ומזהה נבדק, ורק נבדקים עם שתי נקודות הזמן נשמרו. הקבוצה המשולבת הראשית כללה 38 זוגות של RSVsi ו-30 זוגות של hRV (68 זוגות למדור).
לא נעשה שימוש בבחירת גנים, זיקוק מודולים או כיוונון סף עבור GSE97741 או GSE97742. מערכי נתונים אלו שומרו לצורך תיקוף חיצוני. מזהי הגששים מופו לסמלי HGNC מאושרים, וסמלים כפולים אוחדו לפי חציון הביטוי. אותם נהלי כלל של חוקית טרנספורמציה לוגריתמית לאחוזון ה-95, סינון ערכים חסרים, השלמת חציונים וסטנדרטיזציית z לכל גן בתוך מערך הנתונים הוחלו לפני חישוב ציוני המודולים הקבועים של GSE117827.
עבור כל רקמה ומודול, ציוני השלב החריף והשלב לאחר השחרור הוצמדו לפי נבדק וקבוצת נגיף. ההפרש בין השלב החריף לשלב השחרור חושב עבור כל זוג. מדד Cohen dz חושב כהפרש הממוצע של הזוגות חלקי סטיית התקן של המדגם. דווחו מבחני t לצמדים דו-זנביים ומבחני Wilcoxon signed-rank דו-זנביים, יחד עם AUROC להפרדה בין הציונים בשלב החריף לעומת שלב השחרור. ערכי Benjamini–Hochberg FDR חושבו עבור כל 20 מבחני ה-t לצמדים התקפים בפלט האורכי המלא (שני סטים של נתונים, שני מקורות למודולים וחמישה סיכומי קבוצות נגיפים שהוגדרו מראש).
ניתוח מדרג סימפטומים וניתוח פוסט-הוק
לאחר שנקבעה השיוּך למודולים, גילויים של picornavirus ללא תסמינים ששמרו בנפרד ב-GSE117827 שימשו אך ורק לניתוח מדרג סימפטומים. הניקוד הקליני הסודרי היה 0 עבור ביקורות שליליות לווירוס, 1 עבור גילויים של picornavirus ללא תסמינים, ו-2 עבור זיהום עם תסמינים. מתאם Spearman שימש להערכת המגמה הסודרית, בעוד שמבחן Kruskal–Wallis העריך הבדלים כלליים בין שלוש הקבוצות. מבחני Mann–Whitney U פוסט-הוק דו-זנביים השוו בין שלושת זוגות הקבוצות. תיקון Benjamini–Hochberg הוחל בנפרד בכל מדור על משפחת שלושת ההשוואות הזוגיות שלו.
העשרה פונקציונלית
גנים של מודול האף והדם נותחו באמצעות Enrichr דרך gseapy, תוך שימוש בספריות MSigDB Hallmark 2020, Reactome 2022 ו-GO Biological Process 202325,26,28,29,30,31Enrichr השתמשה במסגרת הייצוג-יתר (over-representation) הסטנדרטית שלה, המבוססת על מבחן הדיוק של פישר (Fisher's exact test). תיקון Benjamini–Hochberg כפי שדווח בספריות P ערכים < 0.05 נחשבו למשמעותיים. שמונת המונחים המשמעותיים ביותר לכל מודול בשלוש הספריות שנבדקו דורגו לפי ערך מתואם P ערך. תוצאות ההעשרה שימשו לפרשנות בלבד.
ניתוחי חוסן, תוכנית סמנים ושונות
ניתוחי חוסן בדקו האם התוצאות תלויות בגודל המודול או בבחירה מקרית. הוערכו גדלי מודולים של 10, 25, 50, 100 ו-200 גנים. עבור ניתוח ה-null של גנים אקראיים, היקום הזכאי כלל גנים מקודדי חלבון של HGNC המיוצגים במטריצת GSE117827 המעובדת. נדגמו חמש מאות קבוצות של 50 גנים ללא החלפה באמצעות seed אקראי של NumPy בערך 20260622. בחירה חוזרת בשיטת Bootstrap הוגבלה ל-1,000 הגנים המקודדי חלבון בעלי השפעה חיובית שדורגו במקום הגבוה ביותר בניתוח העוגן המקורי עבור כל מדור. בכל דגימה חוזרת, הגנים המקודדי חלבון החיוביים דורגו לפי ערך P דו-צדדי של Welch עולה, ולאחר מכן לפי הפרש ממוצע יורד. 50 הגנים המובילים נבחרו. יציבות הגנים חושבה כמספר הבחירות חלקי 100. 20 הגנים עם תדירות הבחירה הגבוהה ביותר בכל מדור הוצגו.
ציוני תוכניות-סמנים שימשו כעזרים תיאוריים ולא כהערכות של פלקציות תאים. נבחנו שש תוכניות נבחרות: אפיתליאלית (EPCAM, KRT8, KRT18, KRT19, MUC1, KRT5, KRT14, SCGB1A1, FOXJ1), מונוציטים/מקרופאגים (LYZ, LST1, S100A8, S100A9, FCGR3A, FCGR1A, CD14, MS4A7, CTSS), נויטרופילים (S100A8, S100A9, MPO, ELANE, CEACAM8, FCGR3B, OLFM4, MMP8), T/NK (CD3D, CD3E, TRAC, NKG7, GNLY, PRF1, GZMB, KLRD1, IL7R), B/פלזמה (MS4A1, CD79A, CD79B, MZB1, JCHAIN, IGHG1, SDC1), ואינטרפרון מיאלואידי (SIGLEC1, IFI27, IFI44L, ISG15, MX1, OAS1, RSAD2, IFIT3). ציון כל תוכנית חושב כממוצע של ערכי ה-z הזמינים לכל גן, כאשר נדרשו לפחות שלושה גנים מיוצגים. ערכי P של Spearman הותאמו באמצעות הליך Benjamini–Hochberg על פני כל משפחת המתאמים של מערך-נתונים-מודול-תוכנית. ערך eta-squared חד-כיווני חושב כסכום הריבועים בין הקבוצות חלקי סכום הריבועים הכולל עבור כל זוג מודול-גורם. שורות שחסר בהן הגורם הרלוונטי הוצאו מחישוב זה. ניתוח זה היה תיאורי ולא הותאם עבור גורמים במתאם הדדי.
שחזוריות
כל הניתוחים בוצעו באמצעות זרימות עבודה מתוסכננות ב-Python 3.12.13, עם חבילות התוכנה והגרסאות המפורטות ב-טבלת החומרים. בהליכים אקראיים נעשה שימוש בזרע (seed) קבוע של 20260622. מטריצות ביטוי ציבוריות מ-GEO עובדו באמצעות מבנה פרויקט עקבי שהפריד בין קלטים גולמיים, נתונים מעובדים, פלטים סטטיסטיים, טבלאות ואיורים. הגדרות מודולים, רשומות אוצרות דגימות, הערכות גודל אפקט, סטטיסטיקות תיקוף, תוצאות העשרה, ניתוחי חוסן ונתוני מקור של איורים נשמרו כדי לאפשר אימות עצמאי. קוד הניתוח, מפרטי התלות ונתונים נגזרים תומכים זמינים כפי שמתואר בהצהרת זמינות הנתונים.
תוצאות
בדיקת ביצועים בשיטת anchor-step הפרידה בין השפעות גנטיות ספציפיות לרקמה לבין השפעות גנטיות רב-רקמתיות (pan-tissue)
מטריצת ה-anchor המטופלת של GSE117827 הכילה 27,685 גנים מאושרים על ידי HGNC. הניגודיות (contrast) הנחית הראשית כללה 15 דגימות של נשאי זיהום סימפטומטיים ו-6 דגימות ביקורת שליליות לוירוס; הניגודיות של הדם כללה 13 נשאי זיהום סימפטומטיים ו-6 ביקורות (טבלה 1). מכיוון שקוהורט קטן זה אינו יכול לתמוך בגילוי יציב של גן בודד, הוא שימש כ-anchor למדגמים מזווגים ממדורים שונים. היציבות הוערכה ברמת המודול באמצעות דגימה חוזרת בשיטת bootstrap, בדיקת השערת אפס של גנים אקראיים, תיקוף חיצוני ואנליזות רגישות לגודל המודול.
| מקור | קבוצה | מצב | ניגודיות ראשונית | n |
| דם | RSV | מודבק | כן | 4 |
| דם | picornavirus אסימפטומטי | משני | לא | 5 |
| דם | picornavirus סימפטומטי | מודבק | כן | 9 |
| דם | ביקורת שלילית לנגיף | ביקורת | כן | 6 |
| נזאלי | RSV | מודבק | כן | 6 |
| נזאלי | picornavirus אסימפטומטי | משני | לא | 5 |
| נזאלי | picornavirus סימפטומטי | מודבק | כן | 9 |
| נזאלי | ביקורת שלילית לנגיף | ביקורת | כן | 6 |
טבלה 1: עיצוב העוגנים של GSE17827 לאחר אוצרות ניגוד ראשונית. התפלגות הדגימות במדגמי דם ונזל במערך העוגנים הזוגי לאחר אוצרות ניגוד ראשונית. דגימות של נגיף הסינציטיום הנשימתי (RSV) תסמינתי ופיקורנא-וירוס תסמינתי סווגו כנגועים ונכללו בניגוד הראשוני, בעוד שביקורות שליליות לווירוס סווגו כביקורות ונכללו בניגוד הראשוני. דגימות של פיקורנא-וירוס ללא תסמינים הוגדרו כמשניות והוצאו מבניית המודול; הן שימשו רק בניתוח גראדיאנט התסמינים הגשש. בשני מקרי RSV היו חסרות דגימות דם, מה שהוביל לארבע דגימות דם ושש דגימות נזל של RSV.
מתוך 27,685 הגנים המשותפים, אומדני Hedges g של האף והדם היו כמעט חסרי מתאם (Pearson r = 0.015; איור 1). תוצאה זו התקבלה במסגרת מחקר אחד והיא פחות חשופה להבדלים בין-מחקריים מאשר השוואה מאוחדת בין קהלות. הענן המרכזי הצפוף מראה שרוב הגנים לא הראו דפוסי שינוי דומים בשני המדגמים. הגנים החופפים המודגשים היוו חריגים בראש שתי רשימות הדירוג. תבנית זו תומכת בבנייה נפרדת של מודול לאף ומודול לדם.
איור 1גודלי אפקט ברמת הגנים בדגימות אף ודם בקוהורט העוגן הזווגי GSE117827. גדרים ג' הערכים משווים בין זיהום סימפטומטי לבין ביקרות שליליות לנגיף עבור 27,685 גנים. הערכות מהאף (15 נגועים, 6 ביקרות) מוצגות על ציר ה-x, והערכות מהדם (13 נגועים, 6 ביקרות) מוצגות על ציר ה-y. הצללה של תאי דבש (Hexagonal-bin shading) מציינת את מספר הגנים בכל תא. נקודות אדומות מציינות את ששת הגנים המשותפים בין 50 המודולים המובילים באף ובדם. פירסון (Pearson) נראה כי לא סופק טקסט לתרגום. אנא שלח את הטקסט המדעי שברצונך לתרגם מאנגלית לעברית. = 0.015. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
בניית המודול הניבה חפיפה קטנה המתרכזת באינטרפרון
50 המודולים המובילים של הנזל והדם חלקו שישה גנים: ISG15, ACRBP, IFIT1, RSAD2, CCRL2 ו-XAF1 (מדד ג'קארד = 0.064; טבלה 2; איור 2). ISG15, IFIT1, RSAD2 ו-XAF1 תואמים לביולוגיה אנטי-ויראלית הקשורה לאינטרפרון32,33,34ניתן לפרש את תפקידו של CCRL2 בצורה טובה יותר בהקשר של נדידת לוקוציטים דלקתית.35ל-ACRBP אין תפקיד אנטי-ויראלי מבוס. כל ששת הגנים מדווחים למען השקיפות, אך איש מהם אינו מוצג כסמן ביולוגי (biomarker) מאומת חוצה-רקמות. ערכי ה-FDR של גנים בודדים לא היו מובהקים בקוהורט העוגן הקטן. לפיכך, המסקנה העיקרית נשענת על תיקוף ברמת מודול נעולה, ולא על רשימת החפיפה.
| גן | Nasal Hedges g | Nasal FDR | Blood Hedges g | Blood FDR | פירוש |
| ISG15 | 2.215 | 0.213 | 1.369 | 0.42 | גן אנטי-ויראלי המופעל על ידי אינטרפרון; חפיפה גשית |
| ACRBP | 1.69 | 0.205 | 1.748 | 0.429 | אין תפקיד אנטי-ויראלי מבוס; נשמר לצורך שקיפות |
| IFIT1 | 1.875 | 0.213 | 1.35 | 0.42 | גן אנטי-ויראלי המופעל על ידי אינטרפרון; חפיפה גששית |
| RSAD2 | 1.63 | 0.213 | 1.532 | 0.42 | גן אנטי-ויראלי המופעל על ידי אינטרפרון; חפיפה גשית |
| CCRL2 | 1.396 | 0.217 | 1.782 | 0.42 | הקשר של נדידת לוקוציטים דלקתית; אינו ספציפי לווירוס |
| XAF1 | 1.603 | 0.26 | 1.47 | 0.42 | גורם אפופטוזיס הקשור לאינטרפרון; חפיפה גשית |
טבלה 2: חפיפה חקרנית מלאה בין המודולים בעלי הדירוג הגבוה ביותר בנזל ובדם. כל ששת הגנים המשותפים מדווחים עם ערכי Hedges g בנזל ובדם וערכי FDR ברמת הגן. כל ששת הגנים נחשבים למועמדים לחפיפת דירוג חקרנית כיוון שערכי ה-FDR ברמת הגן לא היו מובהקים בקוהורט העוגן הקטן. ACRBP נשמר לצורך שקיפות למרות היעדר תפקיד אנטי-ויראלי מבוס. אף אחד מששת הגנים אינו מוצג כסמן ביולוגי אוניברסלי מתוקף; הראיה העיקרית מבוססת על תיקוף חיצוני ברמת המודול.
איור 2גודלי אפקט של ששת הגנים המחקריים בעלי חפיפה בין דם לאף. מדגמי אף ודם של Hedges ג' הערכות מוצגות עבור ACRBP, CCRL2, IFIT1, ISG15, RSAD2 ו-XAF1 ב-GSE17827. ערכים חיוביים מעידים על ביטוי גבוה יותר בזיהום סימפטומטי מאשר בביקורות שליליות לווירוס. החפיפה המלאה מוצגת למען השקיפות; ערכי ה-FDR של גנים בודדים לא היו מובהקים, וגנים אלו אינם מוצגים כסמנים ביולוגיים אוניברסליים מתוקפים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
העשרה תפקודית סיפקה אימות ביולוגי לתוכן המודולים
שני המודולים היו מועשרים במסלולי אינטרפרון ואנטי-ויראליים, אם כי הרכב הגנים ועוצמת ההעשרה היו שונים (איור 3). מוצגים שמונת המונחים המשמעותיים ביותר לכל מודול. עבור המודול הנחיר, המונחים המובילים היו Hallmark interferon-gamma response (ערך P מתוקנן = 2.23 × 10⁻24), Hallmark interferon-alpha response (ערך P מתוקנן = 1.40 × 10⁻2), Reactome interferon-alpha/beta signalling (ערך P מתוקנן = 3.64 × 10⁻19), ו-GO defense response to virus (ערך P מתוקנן = 5.47 × 10⁻15). מודול הדם הראה את אותה ביולוגיה רחבה בעוצמת העשרה נמוכה יותר: interferon-alpha response (ערך P מתוקנן = 3.87 × 10⁻6), Reactome interferon-alpha/beta signaling (ערך P מתוקנן = 5.70 × 10⁻6), interferon-gamma response (ערך P מתוקנן = 8.89 × 10⁻6), ו-defense response to virus (ערך P מתוקנן = 1.07 × 10⁻4). תוצאות אלו תומכות בעקביות ביולוגית מבלי להרmeiע לדירוגי גנים זהים במדורים השונים.
איור 3מונחי העשרה נבחרים עבור המודולים של האף והדם. ניתוח ייצוג-יתר (Over-representation analysis) בוצע באמצעות Enrichr עם מאגרי Hallmark 2020, Reactome 202 ו-GO Biological Process 2023. שמונה המונחים בעלי ערכי ה-Benjamini–Hochberg-adjusted הנמוכים ביותר P הערכים עבור כל מודול מוצגים. אורך העמודה מייצג −log10(מותאם) P ערך). הפאנלים השמאלי והימני מציגים את מודולי האף והדם, בהתאמה. המונחים מוצגים באותיות קטנות (sentence case). ניתוח העשרה לא שינה את השיוך למודול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
מודולים נעולים נבחנו בתיקוף חיצוני תואם-רקמה
המודול הנחרי הנעול הגיע לערכי AUROC של 0.749 ב-GSE41374, 0.693 ב-GSE152075, ו-0.609 ב-GSE156063 (טבלה 3; איור 4). המודול הדמי הנעול הגיע לערכי AUROC של 0.832 ב-GSE1710, 0.924 ביחידה GPL1058 של GSE3890, ו-0.870 ביחידה GPL684. ביצועי העוגן הפנימי הושמטו מכיוון שהם מוטים באופן אופטימי בשל אופן בנייתם. ערכי AUROC חיצוניים נחשבים כסיכומי ניידות. הם אינם מבססים רגישות קלינית, סגוליות או מוכנות לאבחון.
| קוהורט | דגימה/נגיף | מודול | מספר חיוביים (n) | מספר שליליים (n) | גנים מיוצגים | AUROC | דיוק ממוצע | Welch-test FDR |
| GSE152075 | SARS-CoV-2 דרכי נשימה עליונות | נזאלי | 430 | 54 | 50 | 0.693 | 0.935 | 2.20 × 10⁻⁴ |
| GSE156063 | SARS-CoV-2 דרכי נשימה עליונות | נזאלי | 93 | 10 | 49 | 0.609 | 0.51 | 1.38 × 10⁻² |
| GSE1710 | SARS-CoV-2 דם מלא | דם | 4 | 10 | 50 | 0.832 | 0.959 | 7.94 × 10⁻⁴ |
| GSE38900-GPL1058 | RSV דם מלא | דם | 28 | 8 | 50 | 0.924 | 0.979 | 7.94 × 10⁻⁴ |
| GSE3890-GPL684 | RSV דם מלא | דם | 107 | 31 | 49 | 0.87 | 0.962 | 3.47 × 10⁻¹⁵ |
| GSE41374 | RSV שטיפה נזאלית | נזאלי | 76 | 10 | 50 | 0.749 | 0.951 | 2.63 × 10⁻² |
טבלה 3: תיקוף חיצוני של ציון המודול בתוך רקמה תואמת. המודול האפי של האף שננעל נבדק ב-GSE41374, GSE152075 ו-GSE156063, והמודול האפי של הדם שננעל נבדק ב-GSE1710 וביחידות הפלטפורמה GPL10558 ו-GPL6884 של GSE3890. הטבלה מדווחת על מספר הדגימות החיוביות והשליות, הגנים המיוצגים במודול, AUROC, דיוק ממוצע ו-FDR של מבחן Welch. ביצועי העוגן הפנימי הושמטו. AUROC ודיוק ממוצע מדווחים כסיכומי ניידות ולא כהערכות של ביצועי אבחון קליניים.
איור 4ניתן להעביר את ניקוד המודולים (module-score portability) באופן חיצוני בין רקמות תואמות. ערכי AUROC מוצגים עבור המודול הנחרי ב-GSE41374 (76 RSV, 10 ביקורות), GSE152075 (430 SARS-CoV-2, 54 ביקורות), ו-GSE156063 (93 SARS-CoV-2, 10 ביקורות), ועבור מודול הדם ב-GSE17110 (4 SARS-CoV-2, 10 ביקורות), GSE38900-GPL1058 (28 RSV, 8 ביקורות), ו-GSE3890-GPL684 (107 RSV, 31 ביקורות). הציונים הם ממוצעים לא משוקללים של ערכי z עבור כל גן המיוצג. הקו המקווקו מציין AUROC = 0.5. הערכים הם סיכומי נתירות (portability summaries), ולא הערכות לאבחון קליני. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
תיקוף אורך (Longitudinal validation) בדק האם הציונים יורדים במהלך ההחלמה
מערכי הנתונים הנלווים GSE9741/GSE9742 סיפקו סביבת תיקוף עצמאית של זיהום טבעי עם דגימות משלב המחלה החריפה ומשלב השחרור מילדים מאושפזים27. דגימות אלו לא שימשו כנתוני גילוי עבור קבוצת ביקורת בריאה. הן שימשו כדי להעריך האם ציוני מודולים המבוססים על עוגנים (anchor-derived) ירדו מהשלב החריף של המחלה ועד לשחרור מבית החולים.
עבור קבוצת השילוב שנקבעה מראש של זיהום בודד ב-RSV ו-rhinovirus, נותחו 68 נבדקים מזווגים בכל רקמה (טבלה 4; איור 5). המודול של הדם ירד מהשלב של המחלה החריפה ועד לשחרור בדם (mean delta = 0.30; Cohen dz = 0.740; paired-test FDR = 1.98 × 10⁻7; AUROC = 0.765). המודול הנחרי ירד גם הוא בדגימות מהנזלת (nasopharyngeal samples) (mean delta = 0.436; Cohen dz = 0.477; paired-test FDR = 3.06 × 10⁻4; AUROC = 0.679). מסלולים מזווגים וטעויות התקן שלהם מראים כי הירידה ברמת הקבוצה לא נבעה ממספר קטן של ערכים קיצוניים לא מזווגים.
| סט נתונים | מקור דגימה | מודול | התאמת רקמה | n זוגות | דלתא ממוצעת של שחרור אקוטי | Cohen dz | AUROC | FDR של מבחן מזווג |
| GSE9741 | דם | דם | כן | 68 | 0.30 | 0.740 | 0.765 | 1.98 × 10⁻⁷ |
| GSE9741 | דם | נזאלי | לא | 68 | 0.479 | 0.721 | 0.75 | 3.19 × 10⁻⁷ |
| GSE97742 | נזופרינחלי | דם | לא | 68 | 0.361 | 0.914 | 0.845 | 9.42 × 10⁻¹⁰ |
| GSE9742 | נזופרינחלי | נזאלי | כן | 68 | 0.436 | 0.47 | 0.679 | 3.06 × 10⁻⁴ |
טבלה 4: תיקוף אורך רב עצמאי של השלב החריף לעומת השלב לאחר השחרור. הטבלה מציגה את מספר הזוגות השלמים, את הפרש הציונים הממוצע (שלב חריף פחות שלב שחרור), את Cohen dz, את ה-AUROC, ואת ה-FDR של המבחן הזוגי עבור המודולים הקבועים ב-GSE9741 וב-GSE9742. דלתא חיובית מעידה על ציון מודול גבוה יותר במהלך מחלה חריפה. ערכי ה-FDR של המבחן הזוגי הם ערכי P של מבחן t זוגי דו-זנבי המתוקננים לפי Benjamini–Hochberg, אשר חושבו על פני כל 20 מבחני ה- t הזוגיים התקינים בפלט האורכי המלא.
איור 5שינויים צמדיים במדדי המודול מהשלב של מחלה חריפה ועד לשחרור. (A) ציוני מודול-דם בדם מלא (GSE9741). (B) ציוני מודול-אפי (Nasal-module) בדגימות מהנזל והלוע (GSE97742). כל פאנל מכיל 68 זוגות נבדקים מלאים: 38 זיהומים בודדים ב-RSV ו-30 זיהומים ברינווירוס. קווים דקים מחברים מדידות תואמות של נבדקים. נקודות כתומות מציינות את ממוצעי הקבוצות, ופסים כתומים מציינים את השגיאה התקנית של הממוצע. מבחן זוגי דו-זנבי ת' בוצעו מבחנים ו-Wilcoxon signed-rank tests; תיקון Benjamini–Hochberg FDR הוחל על 20 הזוגות האורכיים התקפים ט בדיקות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
הבדיקות בין-מדוריות חשפו ניואנס מועיל. המודול של הדם שהוחל על דגימות מפיתום האף הניב AUROC של 0.845, למרות שגדלי האפקט של האף והדם בנפרד היו תואמים באופן חלש בעוגן. בחינה של מסלולים מזווגים הראתה ירידה עקבית בציון ולא התהפכות של התפלגות התיוגים. לפיכך, התוצאה אינה מהווה ראיה לכך שאותם גנים בודדים דומיננטיים בשני הרקמות. היא מעידה על כך שניתן לסכם תוכנית דלקתית/אינטרפרונית מתואמת באמצעות קבוצות גנים שונות אך חופפות חלקית. הספציפיות למדור היא החזקה ביותר ברמת דירוג הגנים ואינה מוחלטת ברמת המסלול או הציון.
בדיקת התנהגות במדרג סימפטומים באמצעות זיהויי נשאי וירוס אסימפטומטיים שהוצאו מהמדגם
זיהויי picornavirus אסימפטומטיים ב-GSE17827 הוצאו מבניית המודול כדי למנוע את הכללתם בקבוצת הביקורת הראשית. קבוצה זו ששמרה בצד שימשה לאחר מכן כבדיקה ביולוגית. בשני המדורים, ציוני המודול עלו לאורך הקבוצות המסודרות של ביקורות שליליות לנגיף, זיהוי picornavirus אסימפטומטי וזיהום סימפטומטי (איור 6A,B).
איור 6ציוני המודולים לאורך מדרג התסמינים שהושמט. (A) מודול נזאלי: 6 ביקורות שליליות לנגיף, 5 זיהויי פיקורנא-וירוס א-סימפטומטיים, ו-15 זיהומים סימפטומטיים. (B) מודול דם: 6 בקרות שליליות לנגיפים, 5 זיהוים של picornavirus ללא תסמינים, ו-13 זיהומים עם תסמינים. הנקודות מייצגות דגימות בודדות. קווי המרכז מציינים חציונים; התיבות מקיפות את האחוזונים ה-25 עד ה-75; והשערים (whiskers) נמתחים לערכים הקיצוניים ביותר בטווח של 1.5 פעמים הטווח הבינוני. התוויות מדווחות על השוואות post-hoc דו-זנריות באמצעות מבחן Mann–Whitney U עם תיקון Benjamini–Hochberg עבור שלוש השוואות לכל מדור. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
המודול הנזאלי נמצא במתאם עם ציון התסמינים הסדרני (Spearman rho = 0.818, P = 3.28 × 10⁻7; Kruskal-Wallis P = 1.57 × 10⁻4). המודול של הדם הראה מדרג דומה (rho = 0.861, P = 6.89 × 10⁻8; Kruskal-Wallis P = 1.92 × 10⁻4). לאחר תיקון בתוך כל משפחה של שלושה השוואות, זיהום תסמיני נבדל מקבוצות הביקורת ומגילויים אסימפטומטיים בשני המדגמים. גילויים אסימפטומטיים לא נבדלו מביקורות שליליות לנגיף (nasal FDR = 0.792; blood FDR = 0.082). לפיכך, המודולים עקבו אחר פעילות תגובת המארח התסמיתי באופן ברור יותר מאשר גילוי נגיפי בלבד.
מדדים קליניים הגדירו את הגבול בין תגובת המארח לבין סגוליות הפתוגן
מדדים קליניים הגדירו את ההבחנה בין פעילות של תגובת המארח לבין סיווג הפתוגן (טבלה 5; איור 7). ב-GSE6390, המודול הנזאלי הניב ערכי AUROC של 0.782 עבור מחלה נגיפית לעומת חיידקית ו-0.791 עבור מחלה נגיפית לעומת מחלה שאינה זיהומית. מודול הדם הניב ערכי AUROC של 0.678 ו-0.753, בהתאמה. מדד השוואת ה-3-mRNA של Pandya הציג ביצועים טובים יותר, עם ערכי AUROC של 0.867 ו-0.852, בהתאמה. תוצאה זו צפויה עבור סט שתוכנן להבחנה בין נגיפי ללא-נגיפי, ומראה כי אין להציג את מודולי העוגן כסיווגים אבחנתיים חלופיים.
| סט נתונים | ניגודיות | עיגון נחיריי | קיבוע דם | mRNA של Pandya 3 | Andres-Terre ISG | סימן היכר של אינטרפרון-אלפא |
| GSE6390 | נגיפי לעומת חיידקיים | 0.782 | 0.678 | 0.867 | 0.833 | 0.831 |
| GSE6390 | נגיפי לעומת לא-מדבקים | 0.791 | 0.753 | 0.852 | 0.851 | 0.848 |
| GSE4012 | דלקת ריאות נגיפית לעומת דלקת ריאות חיידקית | 0.755 | 0.789 | 0.893 | 0.867 | 0.872 |
| GSE40012 | דלקת ריאות נגיפית לעומת SIRS | 0.897 | 0.907 | 0.985 | 0.965 | 0.956 |
| GSE40012 | דלקת ריאות נגיפית לעומת בריא | 0.804 | 0.986 | 0.923 | 0.906 | 0.891 |
| GSE40012 | דלקת ריאות חיידקית לעומת בריאות | 0.476 | 0.917 | 0.465 | 0.391 | 0.378 |
| GSE53543 | PBMCs שעברו גרייה על ידי rhinovirus ex vivo לעומת PBMCs ללא גרייה | 1 | 0.957 | 1 | 1 | 1 |
טבלה 5: מדד AUROC עבור מודולי עוגן ומערכי ייחוס של תגובה של המאכסן. GSE63990 ו-GSE40012 הם קוהורטות קליניות של דם מלא. GSE53543 הוא ניסוי הפרעה של PBMC ex vivo הכולל 98 נבדקים מזווגים, ומדווח בנפרד מהקוהורטות הקליניות הטבעיות. מערכי הייחוס דורגו כממוצעי גנים לא משוקללים ולא כסיווגים המשוקללים המקוריים שלהם. ערכי AUROC מדווחים כמדדי השוואה (benchmarking) ולא כהערכות של ביצועים דיאגנוסטיים קליניים.
איור 7בדיקת ביצועים (benchmarking) של AUROC עבור מודולי עוגן ומערכי ייחוס של תגובת מאכסן. השורות מייצגות ניגודים (contrasts) שהוגדרו מראש ב-GSE6390, GSE4012 ו-GSE53543; העמודות מייצגות את שני מודולי העוגן ושלוש קבוצות הייחוס ללא שקלול. GSE53543 מסומן כ-PBMCs שעברו גרייה על ידי rhinovirus לעומת PBMCs שלא עוברו גרייה, ומוצג בנפרד מקבוצות המחקר הקליניות הטבעיות. המשווה של ה-Hallmark מסומן כ-Hallmark interferon-alpha. ערכי התאים מציינים AUROCs ששימשו להשוואת ביצועי השיטות (benchmarking) ואין לפרשם כהערכות של ביצועים אבחנתיים קליניים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
GSE4012 חידד גבול זה. מדד ההשוואה של Pandya הגיע לערכי AUROC של 0.893 עבור דלקת ריאות נגיפית לעומת חיידקית, ו-0.985 עבור דלקת ריאות נגיפית לעומת SIRS. מודול הדם הפריד דלקת ריאות על ידי שפעת A מבקרות בריאות (AUROC = 0.986) ומ-SIRS (AUROC = 0.907), אך הוא הפריד גם דלקת ריאות חיידקית מבקרות בריאות (AUROC = 0.917). לפיכך, מודול הדם מודד פעילות דלקתית מערכתית רחבה ופעילות הקשורה לאינטרפרון. הוא אינו ספציפי לנגיפים, וציון גבוה אינו יכול להגדיר את סוג הפתוגן.
בקרת ה-ex vivo של PBMC נפרדת ב-GSE53543, המודול הנזאלי והמשווים של האינטרפרון הגיעו ל-AUROC של 1.00 עבור PBMC שעברו גרייה על ידי rhinovirus לעומת PBMC בתווך בלבד; המודול של הדם הגיע ל-AUROC של 0.957. כל 98 הנבדקים תרמו תנאים זוגיים. תוצאה מבוקרת זו תומכת בתגובתיות של התוכניות המדורגות לגרייה על ידי rhinovirus. היא אינה מעריכה ביצועים אבחוניים קליניים.
בדיקות חסינות בחנו את גודל המודול, חלופות אקראיות ויציבות הבחירה
ההפרדה של העוגנים נותרה ללא שינוי עבור 10, 25, 50, 100 ו-20 הגנים בעלי הדירוג הגבוה ביותר (איור 8A). ערכי AUROC פנימיים אלו אינם מהווים תיקוף חיצוני, אך הם מראים כי התוצאה האיכותנית לא הייתה תלויה בבחירה של בדיוק 50 גנים. ב-50 סטים אקראיים של 50 גנים, חציוני ה-AUROC של השערת האפס היו 0.489 עבור האף ו-0.705 עבור הדם; האחוזונים ה-99 המתאימים היו 0.72 ו-0.872 (איור 8B). המודולים שנצפו עלו על התפלגויות אפס אלו. תדרי הבחירה בשיטת Bootstrap היו מפוזרים ולא מרוכזים ברשימה אחת קבועה (איור 8C). ממצא זה משקף ישירות את מדגם העוגנים הקטן. הוא תומך באות אגרגטיבי יציב, תוך שזהירות מלהתייחס לכל גן שנבחר כקבוע.
איור 8ניתוחי חוסן של גודל מודול, גנים אקראיים ובוטסטראפ (bootstrap). (Aערכי AUROC עוגן עבור גודלי מודולים של 10, 25, 50, 10 ו-20 גנים; ערכים אלו מייצגים בדיקות רגישות פנימיות.Bהפצות AUROC מ-50 קבוצות אקראיות של 50 גנים מקודדי חלבון שנדגמו ללא החלפה מתוך הגנים המיוצגים ב-GSE17827 (seed = 2026062). נקודות כתומות מציינות את ערכי ה-AUROC שנצפו במודול. קווים אופקיים בתוך כל כינור מציינים את האחוזון ה-25, את החציון ואת האחוזון ה-75.C(בחירה מחדש באמצעות Bootstrap הוגבלה ל-1,00 הגנים המקודדים לחלבון בעלי האפקט החיובי שדורגו במקום הגבוה ביותר בניתוח העוגן (anchor analysis) המקורי עבור כל מדור. העמודות מציגות את 20 הגנים בעלי תדירות הבחירה הגבוהה ביותר למדור; תדירות הבחירה חושבה כמספר הבחירות חלקי 10. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
תוכנית סמנים ואנליזות שונות הבהירו מהן המדדים שבעקבותיהם נקבעו הציונים
במהלך GSE4012, GSE53543, ו-GSE6390, שני המודולים הראו את המתאם העקבי ביותר עם תוכנית האינטרפרון המיאלואידית (איור 9A). המתאמים של המודול הנחריים היו 0.812, 0.878 ו-0.82; המתאמים של מודול הדם היו 0.517, 0.843 ו-0.74. חלוקת השונות הייתה תיאורית (טבלה 6; איור 9B). עבור מודול הדם, המצב והקבוצה המפורטת הסבירו שונות רבה יותר (eta-squared = 0.282 ו-0.250, בהתאמה) מאשר מערך הנתונים (0.06), סוג הדגימה (0.026) או קבוצת המקור (0.025). עבור המודול הנחריים, הקבוצה המפורטת והמצב הסבירו גם הם שונות רבה יותר מאשר מערך הנתונים, סוג הדגימה או קבוצת המקור. לפיכך, המצב הביולוגי והקבוצה המפורטת היוו חלקים גדולים יותר משונות ציוני המודולים מאשר מערך הנתונים או סוג הדגימה, אם כי השפעות לא-אפסיות של מערך הנתונים וההרכב נותרות מגבלה בשימוש חוזר בנתונים ציבוריים של bulk.
איור 9מתאמי תוכנית-סמן וחלוקת שונות תיאורית. (Aמתאמי Spearman בין ציוני מודולים לבין ציונים של שש תוכניות-סמן ב-GSE4012, GSE53543 ו-GSE6390. תוכניות דרשו לפחות שלושה גנים מיוצגים. P הערכים הותאמו בכל המתאמים בין מערכי הנתונים, המודולים והתוכניות. תאים ריקים מציינים שילובים שלא היו זמינים או שלא ניתן היה להעריך אותם לאחר יישום דרישות הגנים והדגימות.Bאטא-ריבוע בדרך אחת (η²2; סכום הריבועים בין-קבוצתי/סכום הריבועים הכולל) עבור מצב, קבוצה מפורטת, סט נתונים, סוג דגימה וקבוצת מקור. הניתוח כלל 934 ציוני מודול-דם ו-1,469 ציוני מודול-אף, והוא תיאורי ולא סיבתי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
| מודול | גורם | Eta-squared | מספר דגימות (n) |
| Anchor blood | מצב | 0.282 | 934 |
| Anchor blood | קבוצה מפורטת | 0.25 | 934 |
| Anchor blood | סט נתונים | 0.06 | 934 |
| Anchor blood | סוג דגימה | 0.026 | 934 |
| Anchor blood | קבוצת מקור | 0.025 | 934 |
| Anchor nasal | קבוצה מפורטת | 0.17 | 1469 |
| Anchor nasal | מצב | 0.13 | 1469 |
| Anchor nasal | סט נתונים | 0.021 | 1469 |
| Anchor nasal | סוג דגימה | 0.06 | 1469 |
| Anchor nasal | קבוצת מקור | 0.02 | 1469 |
טבלה 6: חלוקת שונות תיאורית של ציוני מודולים. שורה אחת מוקצית לכל זוג מודול-גורם, עם ה-eta-squared וגודל המדגם המתאימים. ה-eta-squared חושב כסכום הריבועים בין-קבוצתי חלקי סכום הריבועים הכולל לאחר החרגת שורות שחסר בהן ציון המודול או הגורם הרלוונטי. הגורמים נבחנו באופן פרטני; לפיכך, הניתוח הוא תיאורי, אינו מתקן עבור גורמים בעלי מתאם הדדי, ואין לפרש אותו באופן סיבתי.
זמינות נתונים:
כל מערכי הנתונים הטרנסקריפטומיים שניתחו במחקר זה זמינים לציבור במאגר Gene Expression Omnibus תחת מספרי גישה GSE17827, GSE41374, GSE152075, GSE156063, GSE1710, GSE3890, GSE9741, GSE97742, GSE63990, GSE4012, ו-GSE53543. הנתונים שנגזרו מהניתוח ועליהם מתבסו האיורים והטבלאות המרכזיים, וכן קוד הניתוח, זמינים מהמחבר המקשר על פי בקשה סבירה. במחקר זה לא נעשה שימוש בנתונים מוגבלים או בנתונים חדשים ברמת המשתתף.
דיון
הלקח העיקרי הוא תפעולי: יש להתחיל מהמדגם של המדור הספציפי, ולא מהמטריצה המאוחדת הגדולה ביותר. GSE117827 הוא קטן, אך העיצוב הצמוד שלו מאפשר השוואה ישירה בין הנזל לדם במסגרת מחקר אחד. המתאם האפסי כמעט של ההשפעה ברמת הגן מראה שרשימת דירוג מאוחדת של כל הרקמות הייתה מסתירה מבנה מדורי משמעותי. לכן, עיצוב של מודולים נפרדים היה הגיוני ומוצדק יותר. ביצועיהם החיצוניים והאורכיים תומכים בפעילות תגובת מאכסנית הניתנת לשחזור ברמת המודול, ולא ברשימת גנים אוניברסלית.
ניידות ברמת הגן וניידות ברמת המודול הן שונות. מודול הדם הציג ביצועים טובים בדגימות אורך מהנזון הפארינגיאלי (AUROC 0.845), למרות התאמה חלשה בין גדלי האפקט האינדיבידואליים באף ובדם. המסלולים הזוגיים לא הראו היפוך תויות. הסבר סביר יותר הוא יתירות של מסלולים: פעילות דלקתית ופעילות אינטרפרון מתואמות יכולות להסתכם על ידי תתי-קבוצות שונות של גנים במדורים שונים6,7,8,9,10,11,32,33,34. זו הסיבה לכך שאנו מתארים את המודולים כמודעים למדור (compartment-aware) ולא כבלעדיים למדור. הדירוגים המדויקים שונים, אך רכיב משותף ברמת המסלול נותר ניתן לזיהוי. פרופילי Bulk מערבבים גם שינויים בביטוי עם שינויים בהרכב התאים. מתאמי תוכנית-סמן (Marker-program correlations) יכולים לסמן בעיה זו, אך הם אינם יכולים לספק מנגנונים ברזולוציית תא36,37.
מדדי הייחוס הקליניים מגדירים גבול שני. מדדי ההשוואה של Pandya עבור 33-mRNA ואינטרפרון היו חזקים יותר להבחנה בין זיהומים ויראליים לבקטריאליים. מודולי העיגון עונים על שאלה שונה: עד כמה דגימה מבטאת תוכנית של תגובת מאחס חריפה? מודול הדם עלה גם בדלקת ריאות בקטריאלית. לכן, יש לפרש אותו כציון רחב של פעילות דלקתית/אינטרפרונית סיסטמית, ולא כמסווג ספציפי לנגיפים. ציון גבוה עשוי לתמוך בהשוואת קבוצות, מעקב אחר תגובה או תיאור של מצב דלקתי, אך הוא אינו יכול לזהות את הפתוגן. החשיבות הקלינית הגוברת של נגיפים כגון human metapneumovirus מחזקת עוד יותר את הצורך בתיקוף מגוון-פתוגנים ותואם-רקמה, במקום הסקה מתוך קבוצת נגיפים מצומצמת12,13.
ששת הגנים החופפים הם גנים גששניים. ל-ISG15, IFIT1, RSAD2 ו-XAF1 יש תפקידים סבירים הקשורים לאינטרפרון32,33,34; CCRL2 קשור לנדידת לוקוציטים דלקתית35; עבור ACRBP אין פרשנות אנטי-ויראלית מבוססת. העובדה שמדובר בקוהורט קטן וערכי FDR לא מובהקים ברמת הגן מונעים טענות חזקות יותר. החדשנות המתודולוגית טמונה במקומות אחרים: עוגן מזווג באותו מחקר, מודולים ספציפיים לתאים סגורים, בדיקות חיצוניות תואמות רקמה, ניתוח התאוששות מזווג, ביסוס מול השוואה קלינית, ובדיקות מפורשות של אקראיות, גודל, bootstrap, סמנים ושונות. היררכיית ראיות זו מספקת מסגרת שמרנית לפרשנות התוצאות.
מספר מגבלות נותרו. קוהורט העוגן מכיל רק 15 דגימות אף מזוהמות ו-6 דגימות אף של ביקורת, וכן 13 דגימות דם מזוהמות ו-6 דגימות דם של ביקורת. תוצאות Bootstrap מאשרות כי השיוך של גנים בודדים אינו יציב לחלוטין. RSV סימפטומטי ו-picornavirus אוחדו, ולכן השפעות העוגן אינן ספציפיות לנגיף. קוהורטים חיצוניים נבדלים בגיל, בפלטפורמה, בחומרת המחלה, בתזמון ובהגדרת הביקורת. GSE53543 הוא מחקר הפרעה (perturbation) מזווג ex vivo. GSE63990 ו-GSE40012 מספקים משוואים קלינייםים שימושיים אך ללא דגימות מזווגות של אף ודם. עומס נגיפי, משך התסמינים, צורך בחמצן וחומרת המחלה לא היו זמינים באופן עקבי. עיצוב פרוספקטיבי חזק יותר יאסוף מטשתי אף ודם מאותם משתתפים בנקודות זמן תואמות, עם מדידות עומס נגיפי ותסמינים, משוואים חיידקיים וכאלה שאינם נגועים בנגיף סימפטומטי, ותיקוף ברזולוציית תאים11,14,36,37.
לסיכום, טרנסקריפטומים ציבוריים עדכניים תומכים במודולים של פעילות תגובת מאכסן הניתנים לשחזור באף ובדם כאשר ההקשר הרקמתי נשמר. הם אינם תומכים בחתימה גנטית רב-רקמתית (pan-tissue) שניתן להחליף ביניהן. העוגן הזוגי הראה התאמה מועטה ברמת הגן, בעוד שציוני המודולים הננעלים הועברו בתוך רקמות תואמות ופחתו במהלך ההחלמה. תגובת מודול הדם בדלקת ריאות חיידקית והביצועים העדיפים של מסווג מבוסס בהבחנה בין נגיף לחיידק מגדירים את השימוש המיועד: מודולים אלו מתארים את פעילות תגובת המאכסן ותומכים בהשוואת קבוצות (benchmarking) שקופה; הם אינם מסווגי פתוגנים עצמאיים. קוד הניתוח והנתונים הנגזרים זמינים כפי שמתואר בהצהרת זמינות הנתונים (Data Availability statement) כדי לתמוך באימות עצמאי ובשימוש חוזר בזרימת העבודה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים כספיים או לא כספיים הרלוונטיים לעבודה זו.
תודות
המחברים מודים לחוקרים ולמשתתפים במחקרי ה-GEO הציבוריים שננתחו מחדש בעבודה זו. אף אדם נוסף לא עמד בקריטריונים לכתיבה. מחקר זה לא קיבל מענק ספציפי מכל סוכנות מימון במגזר הציבורי, המסחרי או ללא מטרות רווח.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סט גנים של Andres-Terre למשפיעי אינטרפרון רב-ויראליים | Andres-Terre et al. | משווה של 33 גנים; Supplementary Data 1 | משווה לא משוקלל המכוון לאינטרפרון, שנערך מתוך החתימה הרב-ויראלית המדווחת; רשימת הגנים המלאה מופיעה ב-Supplementary Data 1. |
| Enrichr | Ma'ayan Laboratory | נגישה ב-18 באוגוסט 2026; RRID:SCR_001575 | משאב לייצוג-יתר של סטים של גנים, נגיש דרך gseapy. |
| Gene Expression Omnibus | National Center for Biotechnology Information | GEO; RRID:SCR_005012 | מאגר טרנסקריפטום ציבורי ששימש לגישה למסדי הנתונים שנותחו. |
| Gene Ontology | Gene Ontology Consortium | GO Biological Process 2023; RRID:SCR_002811 | ספריית אנוטציה פונקציונלית ששימשה דרך Enrichr. |
| GPL10558 | NCBI GEO | GPL10558 | פלטפורמה עבור GSE53543 ויחידת הוולידציה של GSE38900 הכוללת 36 דגימות. |
| GPL23126 | NCBI GEO | GPL23126 | פלטפורמת ביטוי עבור GSE117827. |
| GPL24539 | NCBI GEO | Clariom_D_Human.na36.hg38. probeset.csv | אנוטציית Clariom D Human na36, hg38 ששימשה למיפוי אשכולות טרנסקריפטים עבור GSE117827. |
| GPL571 | NCBI GEO | GPL571 | אנוטציית פלטפורמה שהוחלה על GSE63990. |
| GPL6884 | NCBI GEO | GPL6884 | פלטפורמה עבור יחידת הוולידציה של דם מלא עבור RSV הכוללת 138 דגימות מ-GSE38900. |
| GPL6947 | NCBI GEO | GPL6947 | אנוטציית פלטפורמה שהוחלה על GSE40012. |
| GSE117827 | NCBI GEO | GSE117827 | מסד נתונים עיגון ראשוני של דגימות מזוהות של סווabst נחיר ודם מלא. |
| GSE152075 | NCBI GEO | GSE152075 | מסד נתונים חיצוני לוולידציה של דרכי נשימה עליונות עבור SARS-CoV-2. |
| GSE156063 | NCBI GEO | GSE156063 | מסד נתונים חיצוני לוולידציה של דרכי נשימה עליונות עבור SARS-CoV-2. |
| GSE171110 | NCBI GEO | GSE171110 | מסד נתונים חיצוני לוולידציה של דם מלא עבור SARS-CoV-2. |
| GSE38900 | NCBI GEO | GSE38900; GPL10558 and GPL6884 | וולידציה חיצונית של דם מלא ל-RSV שנותחה כיחידות פלטפורמה של 36 ו-138 דגימות שנורמלו בנפרד. |
| GSE40012 | NCBI GEO | GSE40012 | מדד השוואה קליני של דלקת ריאות מ-influenza A, דלקת ריאות חיידקית, SIRS וביקורת בריאה. |
| GSE41374 | NCBI GEO | GSE41374 | מסד נתונים חיצוני לוולידציה של שטיפות נחיר עבור RSV. |
| GSE53543 | NCBI GEO | GSE53543 | מדד השוואה של הפרעה ב-rhinovirus ב-PBMC ex vivo בצמדים, הכולל 98 נבדקים ו-196 דגימות. |
| GSE63990 | NCBI GEO | GSE63990 | מדד השוואה קליני של דם מלא לווירוסים, חיידקים ומצבים לא זיהומיים. |
| GSE97741 | NCBI GEO | GSE97741 | מסד נתונים לוולידציה אורךית של דם מלא: שלב חריף לעומת שלב השחרור. |
| GSE97742 | NCBI GEO | GSE97742 | מסד נתונים לוולידציה אורךית של נזלת נחירית: שלב חריף לעומת שלב השחרור. |
| gseapy | gseapy developers | גרסה 1.3.1 | ממשק Python ששימש לשאילתות ב-Enrichr. |
| HGNC gene symbol resource | HUGO Gene Nomenclature Committee | נגישה ב-18 באוגוסט 2026; RRID:SCR_002827 | משאב לנורמליזציה מאושרת של סמלי גנים וסיווג מקודדי חלבון. |
| Matplotlib | Matplotlib development team | גרסה 3.11.1 | יצירת איורים. |
| MSigDB Hallmark gene sets | Broad Institute | Hallmark 2020; RRID:SCR_016863 | ספריית העשרה מסוג Hallmark הנגישה דרך Enrichr. |
| MSigDB Hallmark interferon-alpha response gene set | Broad Institute | HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_ RESPONSE; תת-קבוצה של 33 גנים ב-Supplementary Data 1 | משווה לא משוקלל של אינטרפרון-אלפא; תת-הקבוצה המדויקת מופיעה ב-Supplementary Data 1. |
| NumPy | NumPy developers | גרסה 2.5.2 | מיחשוב נומרי ודגימה אקראית עם זרע (seed). |
| pandas | pandas development team | גרסה 3.0.5 | עיבוד נתונים טבלאיים. |
| Pandya 33-mRNA host-response gene set | Pandya et al. | Supplementary Table 1; Supplementary Data 1 | סט רשמי של 33 גנים שדורג כמשווה לא משוקלל. |
| Python | Python Software Foundation | גרסה 3.12.13 | סביבת ניתוח חישובית. |
| Reactome | Reactome | Reactome 2022; RRID:SCR_003485 | ספריית העשרת מסלולים הנגישה דרך Enrichr. |
| scikit-learn | scikit-learn developers | גרסה 1.9.0 | חישובי AUROC ודיוק ממוצע (average-precision). |
| SciPy | SciPy developers | גרסה 1.18.0 | מבחני Welch, paired t, Wilcoxon, Mann–Whitney ומבחני קורלציה. |
| Seaborn | Seaborn development team | גרסה 0.13.2 | גרפיקה סטטיסטית. |
| statsmodels | statsmodels developers | גרסה 0.14.6 | כלי עזר סטטיסטיים. |
מקורות
- Zaas AK, et al. Gene expression signatures diagnose influenza and other symptomatic respiratory viral infections in humans. Cell Host Microbe. 2009;6(3):207-17.
- Woods CW, et al. A host transcriptional signature for presymptomatic detection of infection in humans exposed to influenza H1N1 or H3N2. PLoS One. 2013;8(1):e52198.
- Andres-Terre M, et al. Integrated, multi-cohort analysis identifies conserved transcriptional signatures across multiple respiratory viruses. Immunity. 2015;43(6):1199-211.
- Herberg JA, et al. Diagnostic test accuracy of a 2-transcript host RNA signature for discriminating bacterial vs viral infection in febrile children. JAMA. 2016;316(8):835-45.
- Pandya R, et al. A machine learning classifier using 33 host immune response mRNAs accurately distinguishes viral and non-viral acute respiratory illnesses in nasal swab samples. Genome Med. 2023;15(1):64.
- Ioannidis I, et al. Plasticity and virus specificity of the airway epithelial cell immune response during respiratory virus infection. J Virol. 2012;86(10):5422-36.
- Mejias A, et al. Whole blood gene expression profiles to assess pathogenesis and disease severity in infants with respiratory syncytial virus infection. PLoS Med. 2013;10(11):e1001549.
- Blanco-Melo D, et al. Imbalanced host response to SARS-CoV-2 drives development of COVID-19. Cell. 2020;181(5):1036-45.e9.
- Hadjadj J, et al. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science. 2020;369(6504):718-24.
- Mick E, et al. Upper airway gene expression reveals suppressed immune responses to SARS-CoV-2 compared with other respiratory viruses. Nat Commun. 2020;11(1):5854.
- Yoshida M, et al. Local and systemic responses to SARS-CoV-2 infection in children and adults. Nature. 2022;602(7896):321-7.
- Jamali MC, et al. Respiratory infections by human metapneumovirus: epidemiological evidence and treatment prospects. Res J Pharm Technol. 2026;19(8):3905-12. doi:10.52711/0974-360X.2026.00549.
- Gao G, Lin R, Ma D. Human metapneumovirus: pathogenesis, epidemiology, diagnostic technologies, and potential intervention strategies. Virol J. 2025;22(1):376.
- Lim FY, et al. homeRNA self-blood collection enables high-frequency temporal profiling of presymptomatic host immune kinetics to respiratory viral infection: a prospective cohort study. EBioMedicine. 2025;112:105531.
- Johnson WE, Li C, Rabinovic A. Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics. 2007;8(1):118-27.
- Leek JT, et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics. 2012;28(6):882-3.
- Yu J, et al. Host gene expression in nose and blood for the diagnosis of viral respiratory infection. J Infect Dis. 2019;219(7):1151-61.
- Tsalik EL, et al. Host gene expression classifiers diagnose acute respiratory illness etiology. Sci Transl Med. 2016;8(322):322ra11.
- Parnell GP, et al. A distinct influenza infection signature in the blood transcriptome of patients with severe community-acquired pneumonia. Crit Care. 2012;16(4):R157.
- Edgar R, Domrachev M, Lash AE. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Res. 2002;30(1):207-10.
- Barrett T, et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Res. 2013;41(D1):D991-5.
- Tweedie S, et al. Genenames.org: the HGNC and VGNC resources in 2021. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D939-46.
- Welch BL. The generalization of Student's problem when several different population variances are involved. Biometrika. 1947;34(1-2):28-35.
- Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J R Stat Soc Series B Stat Methodol. 1995;57(1):289-300.
- Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-50.
- Liberzon A, et al. The Molecular Signatures Database Hallmark Gene Set Collection. Cell Syst. 2015;1(6):417-25.
- Do LAH, et al. Host transcription profile in nasal epithelium and whole blood of hospitalized children under 2 years of age with respiratory syncytial virus infection. J Infect Dis. 2018;217(1):134-46.
- Ashburner M, et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-9.
- The Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D325-34.
- Gillespie M, et al. The Reactome pathway knowledgebase 2022. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D687-92.
- Kuleshov MV, et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1):W90-7.
- Schoggins JW, et al. A diverse range of gene products are effectors of the type I interferon antiviral response. Nature. 2011;472(7344):481-5.
- Schneider WM, Chevillotte MD, Rice CM. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annu Rev Immunol. 2014;32:513-45.
- Perng YC, Lenschow DJ. ISG15 in antiviral immunity and beyond. Nat Rev Microbiol. 2018;16(7):423-39.
- Schioppa T, et al. Molecular basis for CCRL2 regulation of leukocyte migration. Front Cell Dev Biol. 2020;8:615031.
- Avila Cobos F, et al. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 2020;11(1):5650.
- Maden SK, et al. Challenges and opportunities to computationally deconvolve heterogeneous tissue with varying cell sizes using single-cell RNA-sequencing datasets. Genome Biol. 2023;24(1):288.