מחקר זה מציג מערכת סימולציה של סביבה חופית באמצעות מודל עכברים, במטרה להעריך כמותית את שיעור השימור ואת היעילות הפוטו-פרוטקטיבית של קרמי הגנה מהשמש תחת גורמי עקה סביבתיים מורכבים, הכוללים קרינה אולטרה-סגולה, טבילה במי מלח, שטיפה על ידי גלים וייבוש ברוח. מערכת זו משמשת ככלי סינון פרה-קליני ואינה מחליפה ניסויים קליניים סטנדרטיים.
מאמר שיטה
מערכת סימולציה של חוף הים בעכברים In Vivo להערכת יעילות ועמידות של קרמי הגנה מהשמש
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הקרינה فوق סגולה (UV) היא גורם סביבתי עיקרי שגורם לזקנת העור, לכוויות שמש ולפציעות עור חריפות הנגרמות מהקרינה. קרם הגנה הוא השיטה הנפוצה ביותר להגנה מפני קרינה, אך שיטות הערכת היעילות הנוכחיות אינן מצליחות לדמות באופן מדויק את הסביבות החופיות המורכבות, או מציגות עלות גבוהה ומגבלות אתיות. המחקר הנוכחי מציג מערכת חדשנית לבדיקת יעילות במודל חופי מותאם, בשילוב עם מודל עכברורי חי להערכה כמותית של יעילות ועמידות של קרמי הגנה תחת גורמי לחץ סביבתיים מורכבים. התא המותאם במיוחד משלב קרינת UV ניתנת לשליטה, שטיפה במים מלוחים עם גלים מותאמים ומנגנוני ייבוש ברוח. עקירת שיער בלב/ס עכברים טופלו בקרמים שונים למניעת שיזוף ותיכפו למחזור ימי סימולציה סטנדרטי של 120 דקות. קצב השימור של הקרמים נמדד באמצעות דימות פלואורסצנטי, בעוד שהיעילות הפוטופרוטקטיבית נבדקה על ידי המטוקסילין ואאוזין (H&E)&ה) צביעה למדידת עובי האפידרמיס והפרמיה הדלקתית. התוצאות הראו שהשיטה מסוגלת להבחין ביעילות בין ביצועיהם של קרמים שונים למניעת שיזוף. בפרט, קרם שיזוף עם הגנה מוגברת ועמיד במים הציג את שיעור השימור הגבוה ביותר וסיפק את ההגנה הטובה ביותר מפני נזק על-סגול וסביבתי. פרוטוקול זה מציע אלטרנטיבה לשקילות טרום-קלינית, זולה, ניתן לשחזור גבוה ואותית, לחקירת מוצרים להגנת העור בתנאים קיצוניים מדומים, ומשמש כשלב חקר מקדים ולא כהחלפה מאומתת לבדיקת SPF א obligatorית על בני אדם.
מבוא
קרינת על-סגול (UV), ובפרט UVA ו-UVB, היא הגורם העיקרי להזדקנות פוטו-דרמטית של העור, כוויות שמש ופגיעות עור חריפות המושרות על ידי קרינת UV1,2,3. השימוש במסנן מקרי שמש הוא האסטרטגיה הנפוצה ביותר להפחתת השפעות מזיקות אלו4,5. לפיכך, הערכה מדויקת של יעילות מסנני מקרי שמש היא בעלת חשיבות קריטית הן למחקר דרמטולוגי והן לתעשיית הקוסמטיקה.
כיום, השיטות העיקריות לבדיקת יעילות מסנני קרינה כוללות ניתוחים מכשירים in vitro וניסויים קליניים בבני אדם6,7. שיטות in vitro, כגון ספקטרופוטומטריה של UV על פלטות קוורץ או עור מלאכותי, הן חסכוניות ובעלות הדירות גבוהה8,9. עם זאת, הן אינן מצליחות לדמות את הדינמיקה המורכבת של יצירת שכבת מסנן הקרינה, עמידות למים ועמידות מפני שטיפה על עור חי. לעומת זאת, ניסויים קליניים בבני אדם, המודדים את מינון האריתמה המינימלי (MED) על גבם של מתנדבים, נחשבים ל"תקן הזהב" לקביעת מקדם הגנה מהשמש (SPF) בהתאם להנחיות של הארגון הבינלאומי לתקינה (ISO) (SPF: ISO 24444, עמידות למים: ISO 16217) והנחיות ה-FDA10,11,12,13,14. למרות מהימנותם, ניסויים קליניים הם יקרים, גוזלים זמן, כפופים לשונות אינדיבידואלית משמעותית ומוגבלים מאוד על ידי שיקולים אתיים, במיוחד כאשר בוחנים תחת תנאים סביבתיים קיצוניים או פוטנציאלית מזיקים.
מגבלה משמעותית של טכניקות ההערכה הקיימות היא חוסר היכולת לדמות באופן מקיף סביבות חוף מעשיות. במהלך פעילויות בחוף הים, קרמי הגנה עוברים תהליך פירוק סינרגטי הכולל טבילה במי ים בעלי מליחות גבוהה ושטיפה על ידי גלים15,16. גורמים אלו פוגעים באופן דרסטי ביציבות ההיצמדות ובמשך ההגנה של המוצרים שנמרחו. כדי להתגבר על מגבלות אלו, מחקר זה מציג מערכת בדיקה חדשנית לסימולציית סביבת חוף המשתמשת במודל עכברים מסוג BALB/c. מערכת זו משלבת מספר פרמטרים סביבתיים מרכזיים—כולל עוצמת UV, מליחות מי הים, טמפרטורת המים, כוח הגלים ומהירות הרוח—בתוך פלטפורמה אחת בעלת יכולת בקרה גבוהה. באמצעות שילוב חומרה זו עם דימוי פלואורסצנציה כמותי וניתוח היסטולוגי, הפרוטוקול מאפשר הערכה מדויקת הן של שיעור השרידות של קרם ההגנה והן של היעילות ההגנתית הפיזיולוגית. שיטה זו מספקת פתרון אמין, זול ויעיל להערכת ביצועי קרמי הגנה בתרחישים ימיים מעשיים ומורכבים.
פרוטוקול
כל השיטות שכוללות בעלי חוליות בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות ולרשותomite על ידי ועדת טיפול ובריאות בעלי החיים והאתייקה של מכון גואנדונג לאידי למחקר ביוטכנולוגי בעמ., ת.ז. LDSW2025050-4.
1. הכנת תא החוף היבשה הסימולציה
- הרכיבו את תא הבדיקה, שכולל תיבה מתכתית שקופה ובהרmetic (מימדים: אורך 40 ס"מ, × רוחב 30 ס"מ × עם פתחי גישה לבעלי חיים (גובה 30 ס"מ)
- התקנת יחידת סימולציה של קרני UV: התקן נורות UV (6 וואט) בחלק העליון של התא, כדי להשיג עוצמה מקרבת של 2 מ"וואט/סמ"ר2זה מדמה אור יום חזק ממוצע בשעת הظهרים בקרבת הים.
אזהרה: קרינה על-סגולית מסוכנת לעיניים ולעור. יש להבטיח שהמיכל סגור לחלוטין, ולבשר משקפי 보호 ובגדים מגינים מתאימים בעת הפעלת יחידת ה-UV. - הטמיעו את יחידת הסביבה המימית. ממלאים את מיכל המים המובנה במים מלוחים מלאכותיים.
- הכן את מים הים על ידי התמוסס מלח ים מסחרי במים מזוקקים ביחס של 1 ק"ג (± 0.05 ק"ג) מלח ל-30 ליטר (± 0.5 ליטר) מים. הגדר את בקר הטמפרטורה של המים כדי לשמור על טמפרטורה קבועה של 25 °C (± 1 °ג).
- הפעילו את יוצר הגלים בזרימת מים של כ-10 ליטר לדקה כדי למדל את החיכוך המכאני של גלים חופיים מתונים.
- הצבו את מאוורר הזרם כדי לכוון את זרימת האוויר לאורך אזור החזקה של החיה. כיילו את זרימת האוויר ל-35 רגל מעוקב לדקה (CFM) כדי למדל רוח חוף.
- חברו את כל הרכיבים לממשק בקרה מרכזי. לפני הבדיקה, הזינו את פרמטרי הסביבה הרצויים למערכת הבקרה ותקנו אותם באמצעות מכשירי המדידה המתאימים.
הערה: בצע אימות ראשוני זה באמצעות מד-עוצמת UV דיגיטלי ידני חיצוני, מד חום עמיד במים ומד רוח, תוך וידוא שעוצמת ה-UV (2 מ"וואט/סמ"ר)2), טמפרטורת המים (25 °C) ותנופת רוח (35 CFM) תואמים את נקודות ההגדרה המבוקשות לפני תחילת הניסויים הביולוגיים. - במהלך הניסוי, הפעילו או כבו את מנורות ה-UV, מיצר הגלים ואת ניקוז המים דרך הממשק לביצוע מדויק של שלבי ההשריה וההעלאה לסירוגין.
2. הכנת מודל החיה
- החזק בוגר בלב/ס עכברים (שמשקלם כ-20 גרם עד 25 גרם) בתנאים סטנדרטיים והנח אותם להסתגל במשך שבוע אחד לפני הניסוי.
- הרדמו את העכברים לזמן קצר באמצעות איזופלורן 1.5% דרך הנשמה כדי למזער את הלחץ. הסירו את השיער מגב העכברים בעזרת מכשיר להסרת שיער של בעלי חיים.
- בהמשך, חללו קרם מוסס כימי מסחרי באופן אחיד על העור הגב של העכברים. לאחר 3 עד 5 דקות, הסירו בזהירות את השיער בעזרת גזה רטובה וחמה.
אזהרה: קרמים כימיים להסרת שיער ופורמאלדהיד-פראמשתמשים בהיסטולוגיה הם חומרים רעילים ומגרים. יש להתייחס אליהם באזור מאוורר היטב תוך כדי עטיפת כפפות מגן. ביטול: יש להשליך את כל הפסולת הכימית (פורמאלדהיד-פרה) והפסולת הביולוגית (נבלות ורקמות של בעלי חיים) ליבушки ייעודיות לפסולת ביולוגית מסוכנת ולפסולת כימית, בהתאם ממש לדרישות המוסדיות והמקומיות. - החזיקו את העכברים שהוסר מהם השיער עוד 2 ימים כדי לאפשר החלמה. לפני הניסוי, בדקו ויזואלית את העור הגב כדי לאשר את העדרו המוחלט של אדמומיות או חוסר נוחות מההליך הסרת השיער.
- ציירו צלב על העור הגלוי בחלק העליון של הגב בעזרת מחוגה שחורה כדי לחלק את האזור לארבעה רבעים מובחנים (רבעים 1 עד 4).
3. יישום קרם הגנה והטיפול הקדם-טיפולי
- הכן את קרמי הגנה ניסיוניים. בחר באופן אקראי שלושה קרמי הגנה מסחריים: A, B ו-C.
- החליקו את קרם ההגנה על אזורי היעד באמצעות 20 μL מיקרופיפטה, ופזרו את התערובת באופן אחיד בעזרת אצבע כפופה סטרילית במחזורים קלים במשך 10 שניות, כדי להבטיח היווצרות סרט אחיד באופן הבא:
הערה: ודאו שהלחץ המופעל על ידי קצה האצבע נשאר אחיד בכל הרבעים. פיזור לא אחיד או לחץ מוגזם עלולים להוביל לעובי סרט לא קבוע, מה שיפג באופן ישיר ביכולת השחזור של הערכת ההשמדה הבאה. - רבעון 1 (שמאלה למעלה): הוסיפו 20 מ"ג/סמ"ר2 של קרם הגנה A.
- רבעון 2 (ימין עליון): הוסיפו 20 מ"ג/סמ"ר2 של קרם הגנה B.
- רבע 3 (שמאל-למטה): הוסיפו 20 מ"ג/סמ"ר2 של קרם הגנה C.
- רבע 4 (ימין-למטה): להשאיר ללא טיפול (בקרת לא מוגנת).
- הניחו את העכברים במצב מנוחה למשך 5 דקות, כדי להבטיח שהקרם הגנות מתפזר באופן אחיד ויציב על העור הגב.
4. הערכת שימור קרם הגנה מפני השמש
- תערבבו סמן פלואורסצנטי בטוח (0.01% ב/ב Sulfo Cy7) בקרם הגנה A, בקרם הגנה B ובקרם הגנה C.
- החליקו את חומרי ההגנה השמשיים המסומנים פלואורסצנטית על העור הדורסלי של העכברים כמתואר בסעיף 3.
- צלם את תמונת הפלואורסצנציה ההתחלתית (F0) של העור הדורסאלי באמצעות בתוך גוף חי מערכת דימות פלואורסצנציה
הערה: ודאו שהפרמטרים של הדמיה, כולל זמן חשיפה ומישור המיקוד, נשארים קבועים לחלוטין עבור כל חיה. צילום של בסיסי (F0) שאינו מדויק יבטל את החישוב הסופי של קצב שימור הג'ל הגונן. - הכניסו את העכברים למדור הבדיקה. כבו את נורות ה-UV והגיבו את טמפרטורת המים ל-25 °C.
- העלה את רמת המים ופעל את יוצר הגלים כך שעורביים יעברו שלב של 30 דקות של שחייה, תוך ודיא שהראש שלהם נשאר מעל פני המים בצורה בטוחה.
- בהמשך, כבו את יוצר הגלים והורידו את רמת המים כדי לחשוף פלטפורמה מתכתית עם מדרגות בתוך המיכל, כדי לאפשר לעכברים לנוח בביטחה על הפלטפורמה למשך 30 דקות (שלב היציאה מהמים).
- חזור על שלב השריפה למשך 30 דקות ושלב היציאה מהמים למשך 30 דקות, למחזור שני (בסך הכול 120 דקות).
- צלם את תמונת הפלואורסצנציה לאחר החשיפה (F1) באמצעות ה- בגוף חי מערכת הדמיה
- חשבו את רמת ההמיצות באמצעות הנוסחה:
רמת שמרור = (F1 / F0) × 100% (1) - חשבו את עוצמת הפלורסצנציה היחסית באמצעות הנוסחה:
עוצמת פלואורסצנציה = (F1(X) / F1(A)) × 100% (2)
כאשר F0 הוא עוצמת הפלורסצנציה הבסיסית, F1 הוא עוצמת הפלורסצנציה לאחר הניסוי, F1(A) הוא עוצמת הפלורסצנציה לאחר הניסוי באזור שטופל בקרם הגנה A, ו-F1(X) הוא עוצמת הפלורסצנציה לאחר הניסוי באזור שטופל בקרם הגנה B או C.
הערה: יש לוודא כי מנורות ה-UV נשארות כבויות במהלך ניסוי מעקב הפלורסנציה, על מנת למנוע כיבוי של הפלורסנציה על ידי קרינת UV. זמן החשיפה הכולל הוא 120 דקות, ודא למעקב מתמיד אחר החיה' קצב נשימה וסטטוס פעילות לאורך שלב הצלילה כדי לאשר את היעדרם של סימני דחק או עייפות.
5. זיהוי יעילות הגנתית מפני אור
- החל את קרמי הגנה סטנדרטיים (ללא פלואורסצנציה) על גב העכברים כמתואר בסעיף 3.
- הצבו חתיכת שטח שחור, חוסם UV, על אזור הצוואר העליון של העכבר כשליטה פנימית חסומה מפני קרני UV. רשמו את תנאי העור הבסיסיים דרך צילום מקרוסקופי
הערה: יש ללחוץ חזק על שולי הטייפ כדי למנוע חדירת מים או התנתקות בלתי מזוהה במהלך שלב שטיפת הגל. אם הטייפ יתנתק, אזור הבקרה הפנימי ייפגעו עקב חשיפה ל-UV ולמים, מה שיסבך את קו הבסיס ההיסטולוגי. - החשיפו את העכברים לתוכנית מחזור המים זהה המתוארת בסעיף 4, עם הפעלת יחידת סימולציית UV: הגבירו את רמת המים למשך 30 דקות (שלב שטיפה), הורידו את רמת המים למשך 30 דקות (שלב ייבוש), וחזרו על מחזור שני (סה"כ 120 דקות).
- הוצא את העכברים מהמיכל ורשום את נוכחותם של אדמומיות, הורדת שכבת העור או הקשחה של העור בעזרת צילום מקרוסקופי.
הערה: בהתבסס על ממדי התא (40 ס"מ × 30 ס"מ × 30 ס"מ) והחיות' המרחב הפעיל ביחס למקור האור, המינון המצטבר של קרינת UV שסופק במהלך מחזור של 120 דקות מוערך ב-2.5 J/cm².2מינונים סביב רמה זו מפעילים ביעילות עיבוי אפידרמי מדיד ודלקת חדה, תוך ויתור על ביטחון העכברים ושימור מחמירים של גבולות הרווחה של בעלי החיים3. - בסופה של הניסוי, להרג את העכברים בצורה הומנית על ידי שבר צוואר תחת הרדמה עמוקה באיזופלוראן, בהתאם לדקדוקי האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית (AVMA) להרגת בעלי חיים, על מנת לאסוף רקמות עור לצורך הערכה היסטולוגית עוקבת. לקלף את רקמות העור הדורסליות מארבעת הרבעים והאזור המוגן על ידי הסרט.
- תקבעו את הרקמות ב-4% פורמאלדהיד למשך 24 שעות, ולאחר מכן בצעו דילול סטנדרטי, שטיפה בפרפין והכנת مقاطיע.
- הبقיעו את הפרפינונים בהמטוקסילין ואאוזין (H&E)&ה). דהפרפיניזו את התחומים בזילן, השקו באמצעות תמונות אתנול בריכוזים יורדות, צבעו בהמטוקסילין למשך 5 דקות, שטפו במים נטפחים, צבעו בספוגן למשך דקה אחת, השקו, והרכיבו באמצעות מדיום הר��ה רזינתי.
- צפו בחלקי התחומים המוכתמים תחת מיקרוסקופ אור. מדדו את עובי האפידרמיס והעריכו את רמת דלקת העור על ידי ספירת תאי הדלקת המטיליים.
הערה: עוצמת קרינת ה-UV שסופקה במהלך המחזור מספיקה לעורר איריתמה חדה לצורך הערכת יעילות, אך נותרת בתוך הסף האנכי, הלא מזיק, כפי שנראה בעכברים שלא הראו שום סימן של נזק סיסטמי חמור והמשיכו בפעילות הפיזית הרגילה לאחר מחזור הבדיקה.
6. ניתוח סטטיסטי
- בצעו ניתוח סטטיסטי באמצעות GraphPad Prism 9.5. ביארו משתנים כמותיים כממוצע ± סטיית תקן. השתמשו ב-ANOVA חד-כיווני עם מבחן טקי’s מבחן事后 עבור השוואות בין קבוצות מרובות. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ- *p < 0.05, **p < 0.01, ו-ns מציין חוסר מובהקות (p > 0.05).
תוצאות
אפיון סביבתי של מערכת הבדיקה
לפני ההערכה in vivo, כוילו הפרמטרים הפיזיקליים של תא סימולציית חוף הים כדי להבטיח נאמנות סביבתית גבוהה. יחידת סימולציית ה-UV השתמשה במנורה של 6 W הפולטת ספקטרום רחב בטווח של 300 עד 420 nm עם אורך גל שיא של 340 nm. התפלגות ספקטרלית ספציפית זו מבטיחה פליטת UVA דומיננטית המלווה בחלק רלוונטי ביולוגית של UVB, אשר משקפת ביעילות את ספקטרום העל-סגול הטיפוסי של אור שמש טבעי בשעת צהריים המגיע לפני השטח של כדור הארץ17. מחולל הגלים פעל בקצב זרימה של 10 L/min, היוצר מאמץ גזירה נוזלי קל הדומה לשטיפה עדינה של גלי חוף. בנוסף, יחידת זרימת האוויר סיפקה מהירות רוח קבועה של 35 CFM, המתורגמת למהירות רוח של כ-3 עד 4 m/s מעל אזור הבדיקה. נתון זה תואם לבריזה קלה (סולם בופורט 3) האופיינית לתנאים מטאורולוגיים של חוף הים18. שילוב פרמטרים אלו משחזר באופן מהימן את הגורמים המלחיצים המכניים והסביבתיים המחזוריים הנחווים במהלך פעילויות טיפוסיות בחוף הים.
הערכת שימור קרם הגנה
ראשית, הורכב מכשיר לסימולציית חוף הים. כפי שמוצג ב-איור 1A, המערכת מורכבת בעיקר ממאוורר, מערכת הקרנה של UV, מיכל מי ים מדומים ומערכת בקרה, המשמשים בהתאמה לייבוש ברוח, הקרנת UV, טבילה במי ים ובקרה מרכזית. לאחר הנחת העכברים במכשיר והפעלת המערכת, סומללו בהצלחה תנאי שלבי הטבילה והחשיפה על החוף (איור 1B). בהתבסס על הגדרה זו, בחנו תחילה את שימור קרם ההגנה תחת תנאים אלו. בתחילה, נמרחו על עור הגב של העכברים קרמי הגנה מסחריים A, B ו-C, המסומנים במדד פלואורסצנטי. לאחר מכן, העכברים הוכנסו למחזור חילופין במכשיר הסימולציה, שהורכב מ-30 min של טבילה (סימולציית שחייה) ו-30 min של שלב חשיפה (סימולציית שיזוף על החוף). לאחר 2 h, בעקבות מחזור מלא של גלים ורוח, נמדדה הפלואורסצנציה שנותרה על העור באמצעות הדמיה in vivo. כפי שמוצג ב-איור 2A–B, בהשוואה למצב לפני הסימולציה, בכל קבוצות קרמי ההגנה נצפתה ירידה בעוצמת הפלואורסצנציה, מה שמעיד כי אפקט השטיפה של גלי מי הים גורם להסרה של כמות משמעותית של קרם ההגנה. ביניהם, הרביע שטופל בקרם הגנה C שימר כמות פלואורסצנציה גבוהה יחסית, קרם הגנה B הראה שיעור שימור בינוני, וקרם הגנה A הראה את שיעור השימור הנמוך ביותר (איור 2C). הדבר מעיד כי לקרמי הגנה C ו-B יש יכולות שימור חזקות יותר יחסית. נתונים אלו מאשרים כי המכשיר שלנו יכול להבחין באופן כמותי בין העמידות של פורמולציות שונות תחת עקה סביבתית מורכבת.
יעילות פוטופרוטקטיבית
כדי לחקור לעומק את השפעות ההגנה מפני קרינת UV של קרמי השמש הללו בסביבה מדמה של חוף ים, בוצעו תצפיות מאקרוסקופיות של העור הגבי של עכברים. כפי שמוצג ב- איורים 3A ו-3B, בקבוצת הביקורת ללא הגנה נצפתה פגיעה מושרית UV, שאופיינה באריתמה בולטת, אדמומיות וכוויות שמש. לעומת זאת, באזורים שטופלו בקרמי הגנה נרשמה הקלה משמעותית בתסמיני כוויות השמש. יתרה מכך, ניתוח היסטולוגי שימוש ב-H&בוצע צביעת E ו- היה עקבי עם התצפיות המקרוסקופיות שהוזכרו לעיל (איור 4A–B). כאשר הביקורת ללא ההגנה נחשפה לסימולטור של סביבת חוף, נצפתה העבייה משמעותית של האפידרמיס וחדירה ניכרת של תאי דלקת (איור 4Cנצפו בדרמיס, מה שמוכיח שמערכת הבדיקה הסימולטורית של סביבת חוף משחזרת ביעילות כוויות שמש בעור בסביבת חוף מעשית. יישום של קרמי הגנה מהשמש הפחית באופן משמעותי שינויים פתולוגיים אלו. באופן בולט, עובי האפידרמיס וחדירת תאי דלקת לרקמת העור שטופלה ב-Sunscreen C היו דומים להפליא לאלה של ביקרת הפנים המוגנת מפני UV שנחשפה לאותו מאמץ סביבתי. נתון זה מעיד על כך ש-Sunscreen C מספק את אפקט ההגנה האופטימלי בסביבה הימית הסימולטורית, ככל הנראה בשל שיעור השימור הגבוה שלו ותכונות הפוטופרוטקציה המובנות שבו.
איור 1: סקירה כללית של מערכת הבדיקה המדמה סביבת חוף הים. (A) תרשים סכמטי של המכשיר. (B) עכברים בתוך תא הבדיקה. תא הבדיקה המותאם אישית משלב התקן להקרנת UV, מיכל מים עם מחולל גלים ומאוורר נשיפה, ובכך מדמה ביעילות סביבת חוף הים מעשית. אין בעיות זכויות יוצרים הקשורות לאיור זה כיוון שהוא הופק על ידי המחברים. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח פלואורסצנציה של שימור קרם הגנה. (A) תמונות פלואורסצנציה מייצגות של עור הגב של העכבר לפני ואחרי הניסוי שנמשך 120 דקות. (B) ניתוח כמותי של שימור הפלואורסצנציה. (C) ניתוח עוצמת פלואורסצנציה יחסית. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 5). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן post-hoc של Tukey. *p < 0.05, **p < 0.01. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מראה מאקרוסקופי של עור עכבר לאחר חשיפה סביבתית. (A) תמונות מאקרוסקופיות מייצגות של עור הגב של העכבר לאחר חשיפה של 120 דקות לסביבת חוף ים מדומית. (B) תצפיות מוגדלות מקומית המראות הופעת אריתמה וקילוף באזור הבקרה ללא הגנה בהשוואה לאזורים המוגנים על ידי קרם הגנה ולבקרה פנימית מוגנת UV (Normal). אנא לחץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4הערכה היסטולוגית של יעילות הפוטו-פרוטקציה. (A) H מייצג&חתכים צבועים ב-H&E של עור גבי השגב של עכבר מאזורי טיפול שונים לאחר חשיפה לסביבה. קווי סימון מזהים את גבולות האפידרמיס שנמדד. סרגל קנה מידה = 250 µm. (Bניתוח כמותי של עובי האפידרמיס בכל אזור ייעודי.C) הערכה כמותית של ספירות תאי דלקת יחסיים (%). ביקורת פנימית מוגנת מקרינת UV (נורמלי) הוגדרה כקו הבסיס (100%). הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (n = 5). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA חד-כיווני, ולאחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
דיון
במחקר זה, פותחה ותוקפה בהצלחה מערכת בדיקה סימולטיבית רב-גורמית של סביבת חוף השילבה מודל עכברי חי. מעבר לאספקת מכשיר חדשני, פרוטוקול משולב זה מאפשר הערכה דינמית של עמידות קרם הגנה ויעילותו בפני פגיעה מפוטו-פרוטקציה תחת גורמי סטרס סביבתיים סינרגטיים. על ידי גישור הפער בין בדיקות in vitro מפושטות לבין ניסויים קליניים מורכבים בבני אדם, שיטה זו מקריבה פלטפורמה פרה-קלינית מקיפה להבנת האופן שבו פורמולציות למחסום העור מתפקדות בתנאים ימיים מעשיים.
היתרון העיקרי של פרוטוקול זה על פני שיטות קונבנציונליות הוא הנאמנות הסביבתית הגבוהה שלו. בדיקות עמידות סטנדרטיות למים כוללות בדרך כלל טבילה סטטית במים בתוך גיגית מעבדה19. לעומת זאת, המערכת שלנו משלבת את החיכוך המכני של פעולת הגלים, את העקה האוסמוטית של מי ים בעלי מליחות גבוהה, את אפקט האידוי של הרוח וקרינת UV רציפה. גורמים אלה פועלים באופן סינרגטי כדי לפרק את שכבת קרם ההגנה, ובכך מספקים מבחן מאמץ קפדני וריאליסטי הרבה יותר. יש לציין כי במהלך הערכת שימור הפלואורסצנציה, מנורות ה-UV כובו כדי למנוע כיבוי (quenching) של הפלואורופור. כתוצאה מכך, בדיקה ספציפית זו מעריכה עמידות פיזית מפני שטיפה מכנית ועקה אוסמוטית, אך חסרה את גורם הפירוק הכימי המושרה על ידי UV. כדי לפצות על כך, ההערכה ההיסטולוגית העוקבת בוצעה כאשר מודול ה-UV היה פעיל, מה שסיפק הערכה הוליסטית של היעילות המעשית. התוצאות הדגימו בבירור שבעוד שכל קרמי ההגנה סיפקו הגנה בסיסית כלשהי, שיעור השימור (איור 2) וההגנה ההיסטולוגית התואמת (איור 4) השתנו באופן משמעותי בהתאם לעמידות הפורמולציה לכוחות דינמיים משולבים אלה.
השימוש בעכברי BALB/c מספק פלטפורמה מצוינת in vivo המתחשבת במשתנים ביולוגיים כגון הפרשת סבום, איבוד מים דרך האפידרמיס ותנועה דינמית של העור, שדגמי עור מלאכותיים אינם יכולים לשחזר. מנת ה-UV שניתנה במהלך מחזור של 120 דקות נשלטה בקפידה כדי להשרות ביעילות כוויות שמש חריפות באזור העור החשוף ללא גרימת רעילות סיסטמית או נזק חמור, תוך שמירה קפדנית על הגבולות האתיים עבור עכברי BALB/c. יתרה מכך, על ידי חלוקת גבו של עכבר בודד לארבעה רבעים, ביטלנו את השונות הביולוגית הבין-אינדיבידואלית, מה שאפשר השוואות זוגיות מדויקות ביותר בין פורמולציות שונות של קרמי הגנה מהשמש.
שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא הבטחת ההחלמה המלאה של עור העכבר לאחר הסרת השיער, שכן כל גירוי בסיסי יעוות את התוצאות ההיסטולוגיות. יתרה מכך, יישום אחיד של שכבת קרם ההגנה, כיול יציב של הפרמטרים הסביבתיים לפני הבדיקה, ותזמון מדויק של שלבי הטבילה וההוצאה חיוניים להבטחת הדירות גבוהה בין סדרות. באשר לפתרון בעיות, עשויות להופיע מספר בעיות צפויות. אם נצפה פיזור לא אחיד של קרם ההגנה, יש לכייל מחדש את נפח הפפיטה ולהבטיח תנועה מעגלית עדינה. אם האדמומיות כתוצאה מהסרת השיער נמשכת, יש להאריך את תקופת ההחלמה, או להוציא מהניסוי את בעלי החיים המושפעים. כדי למנוע עייפות של בעלי החיים במהלך הטבילה, יש לנטר בקפדנות את פעילותם ולהבטיח שפלטפורמת המנוחה נגישה באופן מלא במהלך שלב הטבילה.
מגבלה של מודל זה היא ההבדל האנטומי והפיזיולוגי בין עור עכברים לעור אנושי (למשל, צפיפות זקיקי השערה ועובי האפידרמיס). עור עכברים מתאפיין בצפיפות גבוהה יותר של זקיקי שערה ובאפידרמיס דק יותר, דבר שעשוי לשנות את היווצרות שכבת קרם ההגנה. השקיעות הרבות של זקיקי השערה עשויות לשמש כמיקרו-מאגרים, מה שעשוי להסב יתרון למשמרות מכניות של מסנני קרינה המבוססים על חלקיקים (אנאורגניים) לעומת פורמולציות אורגניות גרידא. בעוד שזהו כלי השוואה חסון לסריקת פורמולציות, ניסויים קליניים בבני אדם נותרים הכרחיים לצורך סימון ה-SPF הסופי. יישומים עתידיים של מערכת זו הם רחבים. מעבר למסנני קרינה, ניתן להתאים מכשיר זה להערכת העמידות של קוסמטיקה טופית אחרת, קרמי מחסום, תחבושות לפצעים ואפילו טקסטיל המגן מפני קרינת UV בתנאי סביבה קשים. שילוב מערכת זו מייעל את ה-R&תהליך ה-D, המציע לכימיקוסים קוסמטיים ולחוקרים בתחום הדרמטולוגיה שיטת סריקה מהירה, חסכונית ואתית לפני המעבר לניסויים בבני אדם.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
תודות
עבודה זו נתמכה במימון מפרויקט חדשנות המדע והטכנולוגיה במימון עצמי של פושאן (מספר 2220001004842).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אוסין | מקלין | 770427 | משמש ל-H&צביעת E |
| אתנול | מקליין | E809059 | משמש עבור H&צביעת E |
| קרם להסרת שיער | Veet | TMG-001 | משמש להסרת שיער דקיק |
| המטוקסילין | מקלין | H810910 | משמש עבור H&צביעת E |
| Image J | משמש לניתוח תמונות | ||
| מערכת דימות בחי (In vivo) | PerkinElmer | IVIS Lumina III | משמש לזיהוי שימור פלואורסצנציה |
| איסופלורן | RWD Life Science | R510-22-10 | משמש להרדמת עכברים |
| פאראפורמאלדהיד | Biosharp | BL539A | משמש לקיבוע רקמות עור |
| מגרד/מכשיר גילוח (Shaver) | Chemmole | CM700015 | משמש להסרת מרבית השיער |
| נתרן כלוריד | מקלין | S805285 | משמש לייצור מי ים סימולטיים |
| Sulfo Cy7 | Ruixibio | R-Z54515 | משמש לסימון קרם הגנה |
| מנורת UV | Kanfu Lighting Technology | T5-6W | משמש לאספקת קרני על-סגול |
| קסילן | מקליין | X821391 | משמש עבור H&צביעת E |
מקורות
- RK Gupta, L Parvadiya, K Dudhat. Advancements in skin cancer prevention and treatment: harnessing technology, natural therapies, and emerging diagnostic approaches. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2025; 5: 1-54.
- Q Gao, C Xu, M Tan, et al. Hydrogel-based therapies for photoaging: current advances and future perspectives. J Cosmet Dermatol. 2025; 6: e70295.
- Hong S, Peng Z, Wu M, et al. Human-hair-derived natural particles as multifunctional sunscreen for effective UV protection. ACS nano. 2023; 17(15): 14943-14953.
- S Lautenschlager, HC Wulf, MR Pittelkow. Photoprotection. Lancet. 2007; 9586: 528-37.
- E Biba. Protection: the sunscreen pill. Nature. 2014; 7527: S124-5.
- M Pelizzo, E Zattra, P Nicolosi, et al. In vitro evaluation of sunscreens: an update for the clinicians. ISRN Dermatol. 2012; 352135.
- S Bielfeldt. Performance metrics of sunscreen formulations: in vitro and in vivo techniques. Curr Probl Dermatol. 2021; 124-132.
- J Akrman, L Kubác, H Bendová, et al. Quartz plates for determining sun protection in vitro and testing the photostability of commercial sunscreens. Int J Cosmet Sci. 2009; 2: 119-29.
- DL Lott, J Stanfield, RM Sayre, et al. Uniformity of sunscreen product application: a problem in testing, a problem for consumers. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2003; 1: 17-20.
- SM Tuchayi, Z Wang, J Yan, et al. Sunscreens: misconceptions and misinformation. J Invest Dermatol. 2023; 8: 1406-1411.
- A Breneman, DV Belsito. Sun protection factor testing: a call for an in vitro method. Cutis. 2022; 2: E15-e17.
- U Osterwalder, JC Hubaud, E Perroux-David, et al. Sun-protection factor of zinc-oxide sunscreens: SPF(in vitro) too low compared to SPF(in vivo)-a brief review. Photochem Photobiol Sci. 2024; 10: 1999-2009.
- International Organization for Standardization. ISO 24444:2019 Cosmetics — Sun protection test methods — In vivo determination of the sun protection factor (SPF). Geneva: ISO; 2019.
- International Organization for Standardization. ISO 16217:2020 Cosmetics — Sun protection test methods — Water resistance percentage. Geneva: ISO; 2020.
- G Ruiz-Gutiérrez, A Rodríguez-Romero, A Tovar-Sánchez, et al. Analysis and modeling of sunscreen ingredients’ behavior in an aquatic environment. Oceans. 2022; 3: 340-363.
- JK Saxe, L Mullins, R Jones, et al. Influence of sunscreen formulation on the transfer of mineral and organic ultraviolet filters from skin to seawater in simulated ocean bathing tests. Int J Cosmet Sci. 2023; 84-92.
- D’orazio, J, Jarrett S, Amaro-Ortiz A, et al. UV radiation and the skin. Int J Mol Sci. 2013; 14(6): 12222-12248.
- Met Office. Beaufort wind force scale [Internet]. Exeter: Met Office. Available from: https://weather.metoffice.gov.uk/guides/coast-and-sea/beaufort-scale
- K Geoffrey, A Mwangi, S Maru. Sunscreen products: rationale for use, formulation development and regulatory considerations. Saudi Pharmaceutical Journal. 2019; 7: 1009-1018.
הדפסות חוזרות והרשאות
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב