מאמר שיטה

פרוטוקול מבוסס תבניות תרבית תאים (Inserts) להקמה של מודל In Vitro רב-תאיות מפושט של מחסום דם-גידול עבור גרורות סרטן השד במוח

5 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73693

⸱

21 באוקטובר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Breast Oncology and Surgery, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2State Key Laboratory of Medical Proteomics, Dalian Institute of Chemical Physics, 3Department of Pathology, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מבסס מודל פשוט של מחסום דם-גידול (BTB) רב-תאי in vitro, המשלב תרבית משותפת ב-Transwell וספרואידים של גידולים בתלת-ממד, ובכך מספק פלטפורמה רלוונטית פיזיולוגית לחקר גרורות של סרטן השד במוח ולסריקת טיפולים ממוקדים.

תקציר

טיפולים יעילים עבור גרורות של סרטן השד במוח (BCBM) נותרו מוגבלים, בעיקר משום שמחסום הדם-גידול (BTB) מגביל את כניסתם של חומרי כימותרפיה וסוכנים ממוקדים רבים אל נגעים גרורתיים במערכת העצבים המרכזית. כדי לדגמן מאפיינים נבחרים של מיקרו-סביבה מורכבת זו במעבדה (in vitro), מחקר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי להקמה של מודל BTB תלת-ממדי רב-תאי ומפושט. השיטה כוללת שלושה שלבים מרכזיים. ראשית, מוקם מדור של מחסום דם-מוח (BBB) באמצעות תבניות תרבית תאים (inserts) עם גודל נקבים של 0.4 μm. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של מוח אנושי (HBMECs) נזרעים בצד הבסיסלי של הממברנה נקבובית, ויום אחד לאחר מכן, אסטרוציטים אנושיים (HA) ו- תאי מיקרוגליה אנושיים HMC3 (HMC3) נזרעים בצד האפיקלי. תוך שימוש בתאי SK-BR-3 כדוגמה, תאי סרטן השד גודלים בשיטת טיפת התלייה (hanging drop) ליצירת ספרואידים גידוליים תלת-ממדיים אחידים ובעלי צורה סדירה לאחר 3 ימי תרבית. הספרואידים מועברים לאחר מכן לצד האפיקלי של ממברנה נקבובית מצופה במטריצה של ממברנה בסיסית, המספקת הפרדה פיזית תוך שהיא מאפשרת תקשורת כימית בין תאי המחסום לספרואידים הגידוליים במהלך תרבית משותפת (co-culture). פלטפורמה זו מאפשרת בקרה מדויקת על לוח הזמנים הניסויי ומייצרת שינויים מורפולוגיים ובסמנים של אסטרוציטים העקביים עם תגובה ריאקטיבית פרי-גידולית, תוך שהיא מאפשרת הערכה של שלמות מחסום האנדותל וחדירות פארא-צלולרית.

מבוא

גרורות במוח הן סיבוך נפוץ בשלבים המאוחרים של גידולים ממאירים מוצקים שונים, כולל סרטן השד וסרטן הריאות1,2. הפרוגנוזה שלהם גרועה ביותר, ואפשרויות הטיפול מוגבלות1,2. במערכת העצבים המרכזית הבריאה, מחסום הדם-מוח (BBB) הוא ממשק דינמי ומסווג מאוד הנוצר בעיקר על ידי תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של המוח המחוברים בצמימות, בעוד ששלמותו ותפקודו נתמכים על ידי קרום הבסיס הווסקולרי ואינטראקציות מתואמות עם פריציטים, אסטרוציטים, נוירונים, מיקרוגליה, תאים משוערת אוליגודנדרוציטים ומרכיבים אחרים של היחידה הנוירו-וסקולרית3. באמצעות צמי못 בין תאי האנדותל ובעזרת תאי גלייה פריפריאליים, הוא מגביל בקפדנות את כניסתן של חומרים חיצוניים למערכת העצבים המרכזית4. ברגע שתאי סרטן השד התפשטו והתנחלו במוח, נגעי הגרורות במוח מתרחבים, היפוקסיה מקומית עולה, אותיות דלקתיות מתעצמות והיחידה הנוירו-וסקולרית (NVU) עוברת עיצוב מחדש, ובכך נבנה בהדרגה מחסום הדם-גידול (BTB)5. למרות שהחדירות המקומית של ה-BTB גבוהה מזו של ה-BBB, הבדלים בחדירות למולקולות בגדלים שונים, יחד עם פרפוזיה לא אחידה של הדם, מובילים להצטברות דלה של תרופות בגידולי מוח6. לכן, הבנת הביולוגיה של ה-BTB ופיתוח אסטרטגיות הובלה המסוגלות לחצות מחסום זה הפכו לסדרי עדיפויות חשובים בנוירו-אונקולוגיה.

עד כה, המאפיינים ומכניזמי התעתוק של מחסום הדם-מוח (BTB) תוארו באופן חלקי בלבד, ואפשרויות טיפול תרופתי יעילות עבור גרורות של סרטן השד במוח (BCBM) נותרות מוגבלות בפרקטיקה הקלינית. אתגר אחד הוא הזמינות המוגבלת של דגימות קליניות המופקות מגרורות מוחיות, יחד עם הזמינות המוגבלת והאפיון התפקודי הבלתי מלא של מודלי BTB קיימים. מודלים של בעלי חיים in vivo, ובמיוחד מודלים של עכברים7,8, נותרים נפוצים במחקר על BTB. עם זאת, למודלים אלו יש מגבלות, כולל הבדלים בין מינים, תפוקה נמוכה ואתגרים בסטנדרטיזציה ובשחזור, אשר עלולים לעכב מחקרים מכניסטיים ופיתוח תרופות9,10. בנוסף, מודלי BTB in vitro עכשוויים משתמשים בדרך כלל בתרביות משותפות (co-cultures) של תאי גידול ותאים הקשורים למחסום במערכות של סבבים להשקעת תאים (cell culture insert systems) או שבבים מיקרופלואידיים.

מודלים קיימים אלו חסרים לעיתים קרובות את המבנה התלת-ממדי של גידולים, ולכן הם מוגבלים ביכולתם לשחזר מאפיינים מרחביים הרלוונטיים לגרורות במוח, כולל מפלגי צפיפות תאים, אזורים היפוקסיים/נמקייים, דיפוזיה מולקולרית מוגבלת והתפלגות תאית הטרוגנית11,12. כדי להכניס רכיב גידולי תלת-ממדי מוגדר, השתמשנו במודל ספרואידים שהוא פשוט, ניתן לשחזור ותואם ליישומי סריקה. על בסיס זה, פיתחנו מדור BBB אנושי רב-תאי מפושט in vitro ושילבנו אותו עם ספרואידים של גידול כדי לבנות מודל BTB מפושט (איור 1A) הלוכד מאפיינים מבניים ותאיים נבחרים של המיקרו-סביבה של גרורות במוח. המודל קל לתפעול, תומך במדידות כמותיות של המחסום, ומאפשר ויזואליזציה של שינויים מרחביים באוכלוסיות של אסטרוציטים ומיקרוגליה הקשורים לגידול.

פרוטוקול זה מפרט את השלבים הקריטיים, החל מהכנת תאים וזריעתם ועד ליצירת ספרואידים גידוליים, ציפוי במטריצה של קרום הבסיס, הכנת ביקורת תואמת והעברת הספרואידים, ובכך מספק זרימת עבודה סטנדרטית לבניית מודל BTB פשוט זה.

פרוטוקול

מחקר זה נערך בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים השני של אוניברסיטת דליאן לרפואה (מספר אישור JW2026-019-01). כל הנתונים הקשורים לחולים עוברו באופן אנונימי לפני הניתוח. כלי המחקר המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מודל מחסום דם-מוח (BBB)

  1. דרישות כלליות
    1. בצע את כל הפעולות במCב laminar-flow סטרילי והקפד על טכניקת עבודה אספטית.
    2. השתמש במכניסי תרבית תאים (inserts) של 12 בארות עם ממברנות PET בעלות גודל נקבים של 0.4 µm ושטף ממברנה אפקטיבי של 1.12 cm2.
  2. ציפוי קולגן מסוג I
    1. הוסף 1–2 mL של תמיסת ציפוי קולגן מסוג I לכל בקבוק או צלחת תרבית ופזר אותה באופן אחיד על פני השטח התחתון.
    2. הוסף 200 µL ו-800 µL של תמיסות ציפוי לצדדים האפיקליים והבסאליים של כל מכניס תרבית תאים, בהתאמה. נעער בעדינות את הצלחת כדי להבטיח מגע מלא עם הממברנה תוך מניעת היווצרות בועות מתחתיה.
    3. דגור את הכליים והמכניסים המצופים ב-37 °C עם 5% CO₂ למשך שעה אחת. הסר את תמיסת הציפוי ושטוף פעמיים עם PBS.
    4. שמור את הבקבוקים, הצלחות ומכניסי תרבית התאים המצופים ב-37 °C עם 5% CO₂ והשתמש בהם תוך 3 ימים. שטוף פעם אחת עם PBS מיד לפני השימוש.
    5. צפה כלי תרביות של HBMEC ו-HA בקולגן מסוג I לפני תרבית התאים. תאי HMC3-RFP אינם דורשים ציפוי קולגן מסוג I.
  3. הכנת תמיסת ציפוי קולגן מסוג I
    1. המס 60 µL של חומצה אצטית גלציאלית ב-50 mL של מים אולטרה-טהורים וקרר את התמיסה ב-4 °C.
      זהירות: חומצה אצטית גלציאלית היא חומר קורוזיבי. טפל בה במנדף כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, חלוק מעבדה והגנה על העיניים. השלף את פסייפסיי חומצה אצטית בהתאם לנהלי פינוי הפסולת הכימית של המוסד.
    2. סנן את התמיסה דרך מסנן מזרק של 0.22 µm, הוסף 500 µL של קולגן מסוג I (9.45 mg/mL), ערבב היטב ושמור ב-4 °C עד לשימוש.
  4. הכנת התאים
    1. תרבת תאי HBMEC, HA ו-HMC3-RFP עד להגעה ל-80%–90% קונפלואנציה (confluence) לפני השימוש.
      זהירות: יש להתייחס לקווי תאים ממקור אנושי וחומרים הקשורים לרקמה אנושית כאל חומרים בעלי פוטנציאל לסיכון ביולוגי. פעל לפי נהלי הבטיחות הביולוגית של המוסד ולבש ציוד מגן אישי מתאים. פנה חומרי תרבית מזוהמים כפסולת ביולוגית מסוכנת.
  5. זריעת HBMECs ביום 0
    1. נתק את תאי ה-HBMECs באמצעות פרוטאזה רקומביננטית דמוית טריפסין (1×), סבב את התאים בצנטריפוגה וסבב מחדש (resuspend) את המשקע כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים.
    2. קבע את צפיפות התאים וכוון את התרחיף כך ש-120 µL יכילו 1.5 × 105 HBMECs עבור כל מכניס תרבית תאים.
    3. הפוך את הצלחת והעבר 120 µL מתרחיף ה-HBMEC אל הצד הבסאלי של הממברנה הנקובה. הימנע מהיווצרות בועות אוויר במהלך הזריעה (איור 1B).
    4. כסה את הבארות, השאר את צלחת 12-הבארות הפוכה, ודגור למשך 6 שעות.
    5. החזר את הצלחת למצב זקוף, הוסף 200 µL ו-800 µL של מצע תרבית ECM מלא לתאים העליונים והתחתונים, בהתאמה, והמשך בדגירה.
  6. זריעת תאי HA ו-HMC3-RFP ביום 1
    1. נתק תאי HA באמצעות פרוטאזה רקומביננטית דמוית טריפסין (1×) ותאי HMC3-RFP באמצעות 0.25% trypsin-EDTA. סבב בצנטריפוגה וסבב מחדש את שני סוגי התאים בנפרד.
    2. קבע את צפיפויות התאים ושלב 2.0 × 105 תאי HA עם 4.0 × 103 תאי HMC3-RFP עבור כל מכניס תרבית תאים.
    3. סבב את התאים המעורבבים בצנטריפוגה, השלך את העילוי (supernatant) וסבב מחדש את המשקע ב-200 µL של מצע מעורב מלא (מצע AM מלא : מצע MEM מלא = 5:1). הוסף את תרחיף ה-200 µL באופן אחיד לתא העליון תוך הימנעות מבועות אוויר (איור 1B). 
    4. הוסף 800 µL של מצע תרבית ECM מלא לתא התחתון, שמור את הצלחת במצב זקוף בדגירה, והחלף את המצע מדי יום.

2. הכנה של ספרואידים גידוליים תלת-ממדיים

  1. הכנת תאי SK-BR-3
    1. יש לתרבית תאי SK-BR-3 עד להגעה ל-80%–90% התמזגות (confluence) לפני המעבר ליצירת ספרואידים.
    2. נתקו תאי SK-BR-3 באמצעות trypsin-EDTA בריכוז 0.25%, צנטריפוגו את התאים, ותלו את המשקע כדי לקבל סספנזיה של תאים בודדים.
    3. קבעו את צפיפות התאים והתאימו את הסספנזיה כך שכל 30 µL הטיפה מכילה 2 × 104 תאים.
  2. הכנת טיפות תלויות
    1. הפוך צלחת לתרבית תאים של 10 ס"מ וחלוק את 30 µL טיפות של תרחיף התאים על מכסה הצלחת. יש להניח כ-20 טיפות על כל מכסה.
    2. החליפו את תחתית הצלחת והפכו במהירות את הצלחת המורכבת (איור 1Bהכינו את הטיפות מחדש אם הן מטפטפות מהמכסה או מאבדות את צורתן.
  3. תרבית ספרואידים
    1. הוסיפו 5 מ"ל של PBS לצלחית והניחו אותה באינקובטור. אין להפריע לצלחית במהלך יומיים הראשונים של התרבית.
    2. לתרבית ארוכת טווח, הוסף 10 µL של מצע גידול מלא לכל טיפה מדי יומיים.
    3. הוסיפו מצע מהקצה של כל טיפה באמצעות חוד הפ pipette והימנעו ממגע עם הספרואידים של הגידול.

3. הכנה של מודל פשוט למחסום דם-גידול (BTB)

  1. הכנת חומרים
    1. יש לצפות את כלי תרבית התאים הנדרשים ואת תבתי תרבית התאים (ממברנת PET, גודל נקבים 0.4 µm) ב-collagen type I ולשמור אותם באינקובטור עד לשימוש.
    2. יש לחתוך את הקצוות של טיפי פפית של 200 µL בעזרת מספריים ולסטריליז את הטיפים המותאמים באמצעות אוטוקלב.
  2. הקמת המודל
    1. יום 0–1: בניית מודל ה-BBB והכנת ספרואידים של גידול כפי שמתואר לעיל.
    2. יום 2: הפשרה של מטריצת קרומי הבסיס על קרח. יש להסיר את מצע התרבית משתי התאים ולשטוף את שתי התאים ב-PBS.
    3. הוסף 800 µL של מצע ECM מלא לתא התחתון ו-30 µL של מטריצת קרומי בסיס מופשרת לתא העליון. פזור את מטריצת קרומי הבסיס באופן אחיד על פני הממברנה הנקבובית.
    4. דגור את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות, ולאחר מכן הוסף 200 µL של מצע מלא מעורב (AM:MEM = 5:1) באיטיות לאורך הדופן הצדדית של התא העליון. החזר את הפלטה לאינקובטור (איור 1B).
    5. שמור את מטריצת קרומי הבסיס על קרח ועבוד במהירות. השתמש בטיפ פפית מקורר מראש בעת שאיבת מטריצת קרומי הבסיס.
  3. בקרת מטריצת קרומי בסיס תואמת ללא ספרואידים
    1. הכן תבתי בקרה תוך שימוש באותו נפח של מטריצת קרומי בסיס (30 µL), הרכב מצע, שלבי שטיפה, זמני דגירה ולוח זמנים יומי להחלפת מצע כפי שנעשה בתנאי ה-BTB, אך השמט את העברת ספרואידי הגידול ביום 3. כך, הבקרה התואמת נבדלת מתנאי ה-BTB בנוכחות או בהיעדר ספרואידים של גידול, ולא בחשיפה למטריצת קרומי הבסיס או בטיפול בה.
  4. העברת ספרואידים של גידול ביום 3
    1. בדוק את ספרואידי הגידול תחת מיקרוסקופ אנכי ואשר שהם בעלי צורה סדירה ושיצרו ספרואידים דחוסים.
    2. שאב את ספרואידי הגידול לתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL באמצעות טיפ פפית קצוץ ושטוף אותם פעמיים ב-PBS. טפל בספרואידים בעדינות כדי למנוע פגיעה בהם.
    3. החלף את המצע בתא התחתון והסר את מצע התרבית מהתא העליון.
    4. העבר חמישה ספרואידים של גידול לכל תא עליון באמצעות טיפ פפית קצוץ.
    5. הוסף 200 µL של מצע תרבית מלא מעורב (AM:MEM = 5:1) לתא העליון ונער בעדינות את הפלטה כדי למנוע מהספרואידים לגעת זה בזה או להתמזג (איור 1B).
    6. שמור את הפלטה באינקובטור והחלף את המצע מדי יום.
  5. איסוף דגימות
    1. אסוף דגימות ביום 7 לצורך ניסויים המשך, או התאם את זמן האיסוף לפי דרישות הניסוי.

4. מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אנדותליאלית (TEER)

  1. הכנת האלקטרודות
    1. טענו במלואם את מד ה-TEER והטבילו את אלקטרודות ה-chopstick באתנול 75% למשך 15 דקות.
      זהירות: אתנול הוא חומר דליק. הרחיקו את האתנול 75% מלהבות גלויות, ניצוצות ומקורות הצתה אחרים, וטפלו בו בהתאם לנהלי הבטיחות הכימית של המוסד.
    2. חשפו את קבינת הבטיחות הביולוגית לאור על-סגול למשך 30 דקות לצורך עיקור. אין לחשוף את האלקטרודות ישירות לקרינת על-סגול.
    3. הוציאו את האלקטרודות מהאתנול, השרו אותן ב-PBS למשך 15 דקות, וייבשו אותן בתנאים סטריליים.
  2. השראה של תאי ה kultur (inserts)
    1. הוציאו את הפלטה בעלת 12 הבארים המכילה את ה-inserts של תרבית התאים מהאינקובטור והמתינו 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני המדידה.
  3. מדידת התנגדות
    1. הכינו insert של תרבית תאים נטול תאים (blank) עם 200 µL ו-800 µL של אותו מצע גידול מלא בתאים בתא העליון והתא התחתון, בהתאמה.
    2. הכניסו בעדינות את אלקטרודות ה-chopstick לאורך קצה ה-insert של תרבית התאים מבלי לגעת בממברנה נקבובית או בתחתית הבאר.
    3. שטפו את האלקטרודות ב-PBS וייבשו אותן. מדדו כל insert המכיל תאים באמצעות אותו הליך ורשמו את ההתנגדות כ-R₍measured₎.
  4. חישוב TEER
    1. חשבו את ערך ההתנגדות החשמלית הטרנס-אנדותליאלית (TEER) באמצעות הנוסחה הבאה13:
      TEER (Ω·cm²) = (R(measured) − R(blank) × S    (1.1)
    2. R(measured) היא ההתנגדות על פני הממברנה נקבובית המכילה את שכבת התאים (Ω); R(blank) היא ההתנגדות על פני ממברנה נקבובית נטולת תאים (Ω); ו-S הוא שטח הממברנה האפקטיבי (cm2). שטח הממברנה האפקטיבי ששימש במחקר זה הוא 1.12 cm2.

5. בדיקת חדירות פרא-צלולית באמצעות FITC-dextran (בכיוון אפיקלי-לבזאלי)

  1. הכנת FITC-dextran
    1. הכינו תמיסת עבודה של FITC-dextran (4 kDa) בריכוז 2 mg/mL לפני הניסוי והגנו עליה מפני אור.
  2. פרשנות של כיוון המבחן
    1. פרשו את המבחן הנוכחי כקריאה של שלמות המחסום הפרא-צלולרי (paracellular) מהצד האפיקלי לבזאלי, מכיוון שתאי HBMECs צמודים לפני הבזאלית של הממברנה, בעוד שאסטרוציטים, מיקרוגליה וספרואידים של גידולים תופסים את המדור האפיקלי.
      הערה: למחקרים המיועדים לדמות חשיפה סיסטמית, הכניסו FITC-dextran או תרכובת בדיקה למדור התחתון/בזאלי הפונה לאנדותל, ואספו דגימות מהמדור העליון/אפיקלי תוך שימוש בסכימת דגימה ובחישוב Papp שתוקפו בנפרד.
  3. שטיפה והשקה
    1. הסִירו את כל מצע התרבית משני המדורים. הוסיפו 400 µL ו-1 mL של מצע DMEM בזאלי ללא גלוקוז שחומם מראש למדורים העליון והתחתון, בהתאמה, שטפו בעדינות פעם אחת, והשליכו את המצע.
    2. הוסיפו 400 µL ו-1 mL של מצע DMEM בזאלי ללא גלוקוז טרי שחומם מראש למדורים העליון והתחתון, בהתאמה. השקו ב-37 °C עם 5% CO₂ למשך 15 דקות ולאחר מכן שאבו את כל הנוזל.
  4. מדידת חדירות
    1. הוסיפו 200 µL של תמיסת עבודה של FITC-dextran בריכוז 2 mg/mL לצד האפיקלי ו-800 µL של מצע DMEM בזאלי ללא גלוקוז למדור התחתון. דגרו ב-37 °C עם 5% CO₂ למשך 30 דקות בחושך.
    2. אספו 100 µL של מצע מהמדור התחתון של כל אינסרט ניסויי לאחר 30 דקות. העבירו שלוש מנות מכל אינסרט לפלטה שחורה בעלת 96 בארות והגנו עליהן מפני אור.
  5. הכנת עקומת סטנדרט של FITC-dextran
    1. הכינו סטנדרטים של FITC-dextran בריכוזים של 0, 0.5, 1.0 ו-1.5 mg/mL. הוסיפו 100 µL מכל סטנדרט לפלטה שחורה בעלת 96 בארות בשלוש חזרות והגנו על הפלטה מפני אור.
  6. מדידת פלואורסצנציה וחישוב Papp
    1. מדדו את עוצמת הפלואורסצנציה באמצעות קורא מיקרופלט רב-תפקודי באורך גל עירור של 492 nm ובאורך גל פליטה של 520 nm. רשמו את הנתונים וחשבו את מקדם החדירות הנראה (Papp) באמצעות המשוואות הבאות14.
    2. ראשית, בצעו התאמה ליניארית של ריכוזי תמיסות הסטנדרט של FITC-dextran (C) אל מול עוצמות הפלואורסצנציה המתאימות (A) כדי ליצור עקומת סטנדרט:
       A = kC + b    (1.2)
    3. כאן, k מייצג את השיפוע של עקומת הסטנדרט, ו-b מייצג את נקודת החיתוך.
    4. לאחר מכן, הציבו את עוצמת הפלואורסצנציה של הדגימה (At) שנמדדה בזמן t במשוואת עקומת הסטנדרט כדי לקבל את ריכוז ה-FITC-dextran (Ca) בצד הבזולטרלי בזמן t. לאחר מכן, הציבו את Ca בנוסחה הבאה כדי לחשב את Papp (cm/s):
    5. Papp = (Ca × Va)/(t × S × C0)  (1.3)
    6. כאן, Va הוא הנפח הבזולטרלי הכולל (mL); t הוא זמן החדירה (s); S הוא השטח האפקטיבי של הממברנה הנקבית (cm2); ו-C₀ הוא הריכוז ההתחלתי בצד האפיקלי.

6. צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. קיבוע, שטיפה וחדירה (Permeabilization)
    1. הסר את כל מצע התרבית מההכנסות (inserts) של תרבית התאים, שטוף פעמיים עם PBS, ושאב את כל הנוזל שנותר.
    2. הוסף 200 µL ו-800 µL של 4% paraformaldehyde לתאים העליונים והתחתונים, בהתאמה, וקבע את התאים למשך לילה ב-4 °C.
      זהירות: Paraformaldehyde הוא חומר מסוכן ויש לטפל בו במנדף כימי מאושר תוך כדי לבישת כפפות, חלוק מעבדה והגנה על העיניים. אסוף את הפסולת של ה-paraformaldehyde בנפרד והשמד אותה בהתאם לנהלי הפסולת המסוכנת של המוסד.
    3. הסר את ה-paraformaldehyde והוסף 200 µL ו-800 µL של PBS לתאים העליונים והתחתונים, בהתאמה. שטוף על שייקר שלוש פעמים למשך 5 min בכל פעם.
    4. הוסף 200 µL ו-800 µL של 0.5% nonionic surfactant לתאים העליונים והתחתונים, בהתאמה, ובצע חדירה (permeabilize) למשך 10 min בטמפרטורת החדר.
    5. הסר את תמיסת ה-nonionic surfactant ושטוף עם PBS שלוש פעמים למשך 5 min בכל פעם.
  2. חיתוך הממברנה וחסימה (Blocking)
    1. הפוך את ההכנסות של תרבית התאים על מכסה של צלחת תרבית תאים, חתוך בזהירות את הממברנות נקביות לאורך הקצה באמצעות סכין מנתחים (scalpel), והעבר אותן לפלטה של 24 בארות.
    2. הוסף 200 µL של 3% BSA ב-PBS כדי לכסות כל ממברנה ובצע חסימה למשך 90 min בטמפרטורת החדר. במידת הצורך, חתוך את הממברנות לחלקים קטנים יותר לצביעה נפרדת.
  3. דגירה עם נוגדן ראשוני
    1. דלל את הנוגדנים הראשוניים עם מדלל נוגדנים סטנדרטי והוסף מספיק תמיסה כדי לכסות לחלוטין כל ממברנה.
    2. הוסף מים אולטרה-טהורים לבארות הריקות שמסביב כדי להפחית אידוי ודגור את הדגימות למשך לילה ב-4 °C. השתמש בדגימות ללא נוגדן ראשוני ספציפי כביקורות שליליות.
    3. הסר את תמיסת הנוגדן הראשוני למחרת ושטוף את הממברנות עם 1 mL של PBS על שייקר שלוש פעמים למשך 10 min בכל פעם.
  4. צביעה בנוגדן שני וב-DAPI
    1. דלל את הנוגדנים השניים עם מדלל נוגדני פלואורסצנציה בתנאים מוגנים מאור, כסה את הממברנות לחלוטין, ודגור למשך 90 min בטמפרטורת החדר. שטוף עם PBS שלוש פעמים למשך 10 min בכל פעם תוך הגנה מאור.
    2. הוסף תמיסות צביעה DAPI מוכנות לשימוש כדי לכסות את הממברנות ודגור למשך 15 min בטמפרטורת החדר. שטוף עם PBS שלוש פעמים למשך 10 min בכל פעם תוך הגנה מאור.
  5. הבהרה (Clearing), הרכבה ודימות
    1. הוסף נפח מתאים של ריאגנט להבהרת תרביות תאים בתלת-ממד כדי לכסות את הממברנות ודגור למשך 15 min בטמפרטורת החדר תחת תנאים מוגנים מאור.
    2. העבר את הממברנות לעל על דגלי זכוכית באמצעות פינצטה אופתלמית, הוסף תווך הרכבה למניעת דהייה (antifade mounting medium), והרכב את הדגימות תחת תנאים מוגנים מאור. בצע תצפית ודימות של הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקת לייזר.

7. דיווח סטטיסטי

  1. עבור ההשוואות התפקודיות, n = 3 מציין שלושה כפילויות ביולוגיות בלתי תלויות לכל תנאי, וכל כפילות ביולוגית נחשבה כיחידה הניסויית. נקודות נתונים בודדות עבור כל שלוש הכפילויות הביולוגיות. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. ביצוע השוואות באמצעות מבחני t של Student הבלתי מזווגים בעלי שני זנבות, עם ערכי t ו-p מדויקים.

figure-protocol-1
איור 1: איור סכמטי וזרימת העבודה של בניית מודל ה-BTB. (A) תאי HBMECs נזרעו בצד הבסאלי של ממברנת המאסף (insert) נקבובית לתרבית תאים, בעוד שתאי HA ותאי HMC3-RFP פוזרו בצד האפיקלי. שכבה של מטריצת ממברנה בסיסית שימשה להפרדה בין הספרואידים של הגידול לבין מדור תאי המחסום. עבור ביקורת תואמת ללא ספרואידים, נעשה שימוש באותה שכבת מטריצה של ממברנה בסיסית ובאותו טיפול, אך ללא ספרואידים של גידול. (B) המספרים המעוגלים בחלק העליון מציינים את ימי התרבית התואמים. בניית ה-BBB והכנת ספרואידי הגידול בוצעו בו-זמנית. לאחר הוספת שכבה של מטריצת ממברנה בסיסית למשטח העליון של מאסף תרבית התאים, הועברו ספרואידי הגידול לתא העליון באמצעות קצה של פ pipette קטוע. מודל ה-BTB תוחזק לאחר מכן בתרבית למשך עד שבוע לפני איסוף הדגימות. ניתן בדרך כלל לאסוף דגימות ביום ה-7 לניסויים הבאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

בביקורת ה-BBB התואמת ללא ספרואידים, עליה הונחה כמות זהה של מטריצת קרומב בסיס (basement membrane matrix), אותי HMC3-RFP היו מפוזרים באופן רחב יחסית על פני שכבת התאים האפיקלית (איור 2). בתנאי ה-BTB, תמונות סוף-הניסוי הראו אותי HMC3-RFP בעיקר באזורים שלא כוסו על ידי ספרואידים של גידול, עם אות חלש יותר מתחת לספרואידים ובאזורים הסמוכים להם באופן מיידי (איור 2). נתונים אלו מדגימים קשר מרחבי בין נוכחותם של ספרואידים של גידול לבין התפלגות תאי HMC3-RFP בסוף הניסוי. מכיוון שהתפלגות ה-HMC3-RFP הבסיסית לפני הכנסת הספרואידים ומעקב תאי אורכי לא נבחנו, הנתונים הנוכחיים אינם מבססים הגירה פעילה של מיקרוגליה, דחייה או דחיקה מונעת-גידול.

גם האסטרוציטים הראו הבדלים באות המרקר ובמורפולוגיה בתנאי ה-BTB (איור 2). בהשוואה לביקורת התואמת ללא ספרואידים/מטריצת ממבס, תמונות מייצגות הצביעו על פלואורסצנציית GFAP חזקה יותר הן באזורים סביב הספרואיד (peri-spheroid) והן באזורים מרוחקים (distal). אסטרוציטים בשולי הספרואיד הראו גופי תא מוגדלים, שלוחות עבות ומוארכות יותר, ושלוחות המכוונות לעבר קצה הספרואיד (איור 2). מאפייני נקודת קצה אלו עקביים עם פנוטיפ דמוי אסטרוציט ריאקטיבי, אך הם אינם מבססים כשלעצמם תוכנית ספציפית של אסטרוגליוזיס ריאקטיבית או את המנגנון העומד בבסיסה. מבנים אסטרוציטיים פרי-טומורליים דומים מורפולוגית נצפו בחתכי רקמה של גרורות של סרטן שד במוח אנושי, שם הצביעה האימונופלואורסצנטית הראתה מאפיינים העקביים עם אסטרוגליוזיס ריאקטיבית פרי-טומורלית (איור 3A). כדי לאפיין הלאה מאפיינים אסטרוציטיים הקשורים ל-AQP4, בוצעה צביעת אימונופלואורסצנציה ל-AQP4 במודל BBB התואם ללא ספרואידים ובאזורים המרוחקים וסביב הספרואיד של מודל ה-BTB (איור 3B). תמונות מייצגות של מודל ה-BBB, האזור המרוחק של מודל ה-BTB והאזור סביב הספרואיד הסמוך לספרואידי הגידול מוצגות בשורה הראשונה, השנייה והשלישית, בהתאמה (איור 3B). בתוך מודל ה-BTB, אסטרוציטים סביב הספרואיד הראו הבדלים מורפולוגיים בהשוואה לאסטרוציטים מרוחקים. יחד, התצפיות המורפולוגיות ותצפיות ה-GFAP/AQP4 תומכות בעיצוב מחדש (remodeling) אסטרוציטי הקשור לספרואיד הגידול בתוך מודל זה; את הדמיון לרקמת חולה יש לפרש כדמיון פנוטיפי ולא כראיה לכך שהמודל משחזר באופן מלא אסטרוגליוזיס פרי-טומורלית אנושית.

כדי להעריך שינויים בארגון הצמתים האנדותליאליים הקשורים לספרואידים של גידולים, ביצענו צביעה אימונופלוורסצנטית של חלבון הצמתים המהודקים ZO-1 בשכבת ה-HBMEC הבסיסית של מודלים פשוטים של BBB ו-BTB, תוך שימוש בתנאים תואמים ללא ספרואידים ועם ספרואידים, ששניהם כוסו בכמויות שוות של מטריקס ממבנה בסיסי. הדמיה קונפוקלית התמקדה באזור התואם לספרואידים של הגידול (איור 4A). בביקורת התואמת ללא ספרואידים, אותות ZO-1 בין תאי HBMEC הראו התפלגות קוית ורציפה יחסית עם גבולות בין-תאיים מוגדרים בבירור. בתנאי BTB, הפלוורסצנציה של ZO-1 באזורים התואמים לספרואידים של הגידול נראתה דלילה יותר, עם שיבוש מוקדי ואי-רציפות (איור 4A). תמונות סוף-ניסוי אלה עקביות עם אובדן מקומי של ארגון הצמתים המהודקים. עם זאת, ללא סממנים מולקולריים ספציפיים נוספים ל-BTB או ניסויי הפרעה מכניסטיים, הנתונים הנוכחיים אינם יכולים להבדיל בין עיצוב מחדש ספציפי של BTB לבין פגיעה אנדותליאלית לא ספציפית הקשורה לגידול או פריצה של המחסום.

ברמה התפקודית, מדידת TEER ובדיקות חדירות של FITC-dextran בוצעו בו-זמנית ביום 7 בביקורת תואמת של מטריצת קרום בסיס ללא ספרואידים ובמצב BTB המכיל ספרואידים (איור 4B). ערכים בודדים מכל שלושת החזרים הביולוגיים הבלתי תלויים מוצגים כנקודות פיזור באיור 4B, כאשר נתוני סיכום מוצגים כממוצע ± SD. ערך ה-TEER של מצב ה-BTB (106.0 ± 9.5255 Ω·cm2, n = 3 חזרים ביולוגיים בלתי תלויים) היה נמוך מזה של הביקורת התואמת (168.0 ± 5.1325 Ω·cm2, n = 3 חזרים ביולוגיים בלתי תלויים). באופן עקבי, מקדם החדירות הגלוּי (Papp) שנמדד בבדיקת FITC-dextran מהצד האפיקלי לבסאלי היה גבוה יותר במצב ה-BTB (5.851 ± 1.2080 × 10⁻3 cm/s, n = 3 חזרים ביולוגיים בלתי תלויים) מאשר בביקורת התואמת (2.656 ± 1.0937 × 10⁻3 cm/s, n = 3 חזרים ביולוגיים בלתי תלויים). מבחני t של Student לא מזווגים דו-זנביים הראו הבדלים מובהקים סטטיסטית [TEER: t(4) = 9.920, p = 0.0006; Papp: t(4) = 3.395, p = 0.0274] (איור 4B). בתצורה ניסיונית זו, הירידה התואמת בהתנגדות החשמלית והעלייה בחדירות FITC-dextran מדגימות פגיעה בשלמות המחסום בנוכחות ספרואידים של גידול. מדידות אלו לבד אינן קובעות מנגנון ספציפי של עיצוב מחדש מ-BBB ל-BTB, ואין לפרש את בדיקת ה-FITC-dextran מהצד האפיקלי לבסאלי כניסוי פיזיולוגי להולכת תרופות מדם לגידול.

figure-results-1
איור 2: צביעה אימונופלואורסצנטית במודל BTB. תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של צביעת Pan-CK ו-GFAP בשכבות התאים האפייקליות של ביקורת BBB תואמת ללא ספרואידים ומודל BTB, כאשר שניהם מצופים בכמויות שוות של מטריצת קרומי בסיס, כולל הצגת אות ה-HMC3-RFP. העמודה הראשונה מציגה איורים סכמטיים, והריבוע השחור מציין את אזור הצפייה עבור דימוי קונפוקאלי. השורה הראשונה מראה את הביקורת התואמת ללא ספרואיד (No Spheroid); השורה השנייה מראה אזורים רחוקים מספרואידי הגידול במודל BTB (Distal Region); והשורה השלישית מראה אזורים סמוכים לספרואידי הגידול במודל BTB (Peri-spheroid Region). חצים מצביעים על אזורים המראים מאפיינים מורפולוגיים של אסטרוציטים העקביים עם פנוטיפ ריאקטיבי. גרעיני התאים נצבעו ב-DAPI (כחול), תאי גידול סומנו ב-pan-cytokeratin (Pan-CK; ירוק), מיקרוגליה המבטאת RFP מוצגת באדום, וצביעת GFAP מוצגת בצבע ציאן. Scale bar = 100 µm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 3צביעה אימונופלואורסצנטית חושפת מאפיינים מורפולוגיים העולים בקנה אחד עם אסטרוגליוזיס ריאקטיבי פרי-גידולי במודל ה-BTB. (A) חתכים של רקמת מוח ממטופלים עם גרורות של סרטן השד במוח הוכפפו ל-H&צביעה ל-E. מבנים אסטרוציטיים בממשק שבין רקמת הגידול לבין פרנכימת המוח או כלי דם הראו מאפיינים מורפולוגיים התואמים לאסטרוגליוזיס תגובתי פרי-גידולי. חצים שחורים מצביעים על אזורים מייצגים. צביעה אימונופלואורסצנטית הראתה בנוסף מאפיינים מורפולוגיים אסטרוציטיים התואמים לפנוטיפ תגובתי; החץ האדום מדגיש אזור מייצג. סריגי קנה מידה: 50 µm עבור ה-H&תמונות הצבועות ב-E בשורה הראשונה, 10 µm עבור ה-H&תמונות צבועות ב-E בשורה השנייה, ו- 50 µm עבור תמונות האימונופלואורסנציה בשורה השלישית. (ב) צביעה אימונופלואורסצנטית ל-AQP4 בוצעה במודל BBB תואם ללא ספרואידים, ובאזורים הדיסטליים והפרי-ספרואידיים של מודל ה-BTB. השורה הראשונה מציגה תמונות נציגות של מודל ה-BBB, השורה השנייה מציגה תמונות נציגות של האזור הדיסטלי במודל ה-BTB, והשורה השלישית מציגה תמונות נציגות של האזור הפרי-ספרואידי הסמוך לספרואידי הגידול. חצים מצביעים על שינויים מורפולוגיים באסטרוציטים באזור הפרי-ספרואידי. גרעינים נצבעו ב-DAPI ומוצגים בכחול, בעוד ש-AQP4 מוצג בצהוב. סרגל קנה מידה = 100 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 4: מאפיינים תפקודיים של מודל ה-BTB. (A) צביעת אימונופלואורסצנציה של ZO-1 בשכבת התאים האנדותליאלית הבסיסית של מודלי ה-BBB וה-BTB, כאשר שניהם מכוסים בכמות שווה של מטריצת קרום הבסיס. העמודה הראשונה מציגה דיאגרמות סכמטיות, כאשר תיבות שחורות מציינות את האזורים שנבחרו לדימיון קונפוקאלי. השורה הראשונה מציגה תמונות מייצגות של שכבת התאים הבסיסית במודל ה-BBB ללא ספרואידים של גידול (No Spheroid), והשורה השנייה מציגה תמונות מייצגות של שכבת התאים הבסיסית במודל ה-BTB עם ספרואידים של גידול (With Spheroid). החץ האדום מדגיש אזור בעל פלואורסצנציה דלילה של ZO-1 וניתוקים מוקדיים. הגרעינים נצבעו ב-DAPI ומוצגים בכחול, בעוד ש-ZO-1 מוצג בירוק. סרגל קנה מידה = 50 µm. (B) ערכי TEER ומקדמי חדירות גלוים (Papp) של FITC-dextran (4 kDa) של ביקרת BBB תואמת ללא ספרואידים (No Spheroid) ומצב ה-BTB (With Spheroid), שניהם מכוסים בכמות שווה של מטריצת קרום הבסיס. n = 3 חזרות ביולוגיות עצמאיות לכל תנאי. נקודות נתונים בודדות עבור כל שלוש החזרות הביולוגיות מוצגות, ונתוני סיכום מוצגים כממוצע ± SD. ערכי ה-Papp של FITC-dextran התקבלו בכיוון מהחלק האפיקלי לבסיס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

מודל ספרואיד שימש להחדרת רכיב גידול תלת-ממדי המספק ארגון מרחבי ומגבלות דיפוזיה שאינן קיימות בתרביות תאי גידול דו-ממדיות קונבנציונליות. פשטותו והדירותו הופכות אותו למתאים גם לזרימות עבודה המכוונות לסריקה. הספרואידים שולבו עם מדור מחסום אנושי תלת-תאי המכיל תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של המוח, אסטרוציטים ומיקרוגליה, כדי לבנות מודל in vitro פשוט ומולטי-צלולרי של מחסום המוח המטמירי (BTB). המערכת קלה לתפעול, תואמת לתרביות במבנה של מספר בארות ולמדידות כמותיות של המחסום (איור 1), ומאפשרת ויזואליזציה של מורפולוגיית התאים וההתפלגות המרחבית באמצעות צביעת אימונופלורסצנציה. השינויים האסטרוציטיים שנצפו הקשורים ל-GFAP/AQP4 והדמיון המורפולוגי שלהם לאסטרוציטים פרי-גידוליים ברקמת גרורות של סרטן השד במוח, תומכים ברלוונטיות של המודל לחקר אינטראקציות נבחרות בין גידול, גליה ואנדותל5, אם כי ממצאים אלו אינם קובעים שקילות למחסום BTB אנושי מלא.

שיטת הטיפה התלויה (hanging-drop) שימשה ליצירת ספרואידים של גידול, אשר גודלו בתרבית משותפת עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של המוח האנושי, אסטרוציטים אנושיים ומיקרוגליה אנושית, כדי להקים פלטפורמה רב-תאית פשוטה של מחסום המוח-גידול (in vitro BTB) לאבונדם. בתנאים שנבדקו, ספרואידים של גידול היו קשורים לירידה ב-TEER, עלייה בחדירות של FITC-dextran מהצד האפיקלי לבסלי, שינוי בארגון של ZO-1, ושינויים מורפולוגיים ובסמנים של אסטרוציטים. מדידות TEER וחדירות הן גישות מקובלות להערכת שלמות המחסום במערכות מחסום in vitro13,14. ממצאים אלו מדגימים פגיעה במחסום ועיצוב מחדש של גליות הקשורה לספרואידים של גידול בתוך מערכת מוגדרת זו. עם זאת, פלטפורמה זו של BTB אינה מבססת טרנספורמציה מלאה מ-BBB ל-BTB, נדידה פעילה של מיקרוגליה, או מנגנון מולקולרי ספציפי של עיצוב מחדש של ה-BTB. לפיכך, מומלץ לראות בפלטפורמה זו מודל ניסיוני נגיש להצבת היפותזות ולמחקרים מבוקרים של אינטראקציות בין גידול, גליות ואנדותל, כאשר נדרשים בדיקות הובלה עם כיווניות מתאימה בעת מידול של הובלת תרופות סיסטמית.

למודל מפושט זה יש מספר מגבלות חשובות. ראשית, הוא אינו מכיל את היחידה הנוירו-וסקולרית המלאה או את המיקרו-סביבה של הגידול במוח. פריציטים, נוירונים, קרום בסיס/מטריצה חוץ-תאית שלמה פיזיולוגית ותאי מערכת חיסון במחזור הדם חסרים. פריציטים הם רגולטורים חשובים של תפקוד הנוירו-וסקולרי ותפקוד המחסום15,16,17, אך שילובם במודל אנושי סטנדרטי in vitro נותר מאתגר בשל הזמינות המוגבלת והשונות בין סדרות של פריציטים אנושיים ראשוניים. לכן, אין לתאר מודל זה כ-BTB אנושי מלא, אלא כפלטפורמה ניסיונית מפושטת. שנית, המחקר הנוכחי משתמש ב-SK-BR-3 כשורת תאים בודדת של סרטן השד. לפיכך, לא ניתן להכליל את הפנוטיפים שנצפו על הביולוגיה של BCBM באופן כללי. תיקוף עם תתי-סוגים נוספים של סרטן השד, מודלים בעלי טרופיזם למוח, וספרואידים או אורגנואידים של BCBM המופקים מחולים יהיה חשוב לביסוס ההכללה והרלוונטיות למטופלים. שלישית, הנתונים הנוכחיים של HMC3-RFP הם תצפיות בנקודת סיום ואינם פותרים האם הדפוס המרחבי נובע מנדידה פעילה, הישרדות דיפרנציאלית או התפלגות קיימת מראש. דימיון תאי חיים אורך-חוץ (Longitudinal live-cell imaging) יידרש כדי להבחין בין אפשרויות אלו. רביעית, נתוני ה-ZO-1, TEER ו-FITC-dextran מעידים על פגיעה במחסום אך אינם מבחינים בין רמיodeling ספציפי ל-BTB לבין פגיעה אנדותליאלית לא ספציפית; נדרשים אפיון מולקולרי נוסף ובקרות מכניסטיות. חמישית, מכיוון ש-HBMECs נזרעים על הפנים הבסאלית של הממברנה בתצורה זו, בדיקת FITC-dextran מאפיקלי לבסאלי שדווחה היא מדד לשלמות המחסום ולא בדיקת הובלה פיזיולוגית מדם לגידול. מחקרים של הובלה מערכתית צריכים להחדיר סמן או תרופה לתא התחתון/בסאלי הפונה לאנדותל ולתקף את ההובלה לעבר התא העליון/אפיקלי של הגידול. לבסוף, המדידות הפונקציונליות הנוכחיות התבססו על שלוש חזרות ביולוגיות עצמאיות לכל תנאי. למרות שעיצוב זה מבחין בין שחזור ביולוגי לטכני, הגדלת מספר החזרות הביולוגיות העצמאיות תחזק עוד יותר את הערכת השחזוריות. שילוב של שיפורים אלו, כולל פריציטים וחומרים המופקים מחולים, עשוי להגביר בהדרגה את הרלוונטיות הפיזיולוגית והתרגומית של הפלטפורמה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט הרפורמה החינוכית של מחוז Liaoning (JG24DB110), פרויקט תוכנית ההנחיה לחיים ובריאות של Dalian (2025ZDJH01PT101), תוכנית 1+X של בית החולים השני של אוניברסיטת Dalian Medical (2024LCJSYL07), והקרן המאוחדת של המכון לפיזיקה כימית ב-Dalian, האקדמיה הסינית למדעים, ואוניברסיטת Dalian Medical (DMU-2&DICP UN202509).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Trypsin-EDTA 0.25% (1×) (לניתוק תאי HMC3-RFP)NCM BiotechC100C1משמש לניתוק תאי HMC3-RFP במהלך הכנת התאים.
מבחנות צנטריפוגה 1.5 mLJet BiofilCFT001015משמשות לאיסוף, שטיפה וטיפול בספרואידים של גידולים.
פלטת תרבית תאים בעלת 12 בארותJet BiofilTCP011012משמשת להחזקת אינסרטים (inserts) לתרבית תאים של 12 בארות במהלך בניית מודל BBB/BTB.
ריאגנט להבהרה של תרביות תאים בתלת-ממד (3D)Thermo FisherV11326משמש להבהרת ממברנות של תרביות תאים צבועות לפני סגירה (mounting) ודימיון קונפוקאלי.
נוגדן משני anti-rabbit מסומן ב-Alexa Fluor 488ProteintechRGAR002נוגדן משני פלואורסצנטי המשמש לזיהוי אימונופלואורסצנטי של נוגדנים ראשוניים משפנפן.
נוגדן משני anti-mouse מסומן ב-Alexa Fluor 647ProteintechRGAM005נוגדן משני פלואורסצנטי המשמש לזיהוי אימונופלואורסצנטי של נוגדנים ראשוניים מעכבר.
מדלל נוגדניםSolarbioA1800משמש לדילול נוגדנים ראשוניים לצביעה אימונופלואורסצנטית.
מדיום סגירה למניעת דהייה (Anti-fade mounting medium)SolarbioS2100משמש לסגירת ממברנות צבועות ולהפחתת דהיית הפלואורסצנציה במהלך הדימיון.
תוסף לצמיחת אסטרוציטים (AGS)ScienCell1852תוסף המשמש לתרבית של אסטרוציטים אנושיים.
מדיום אסטרוציטים (AM)ScienCell1801מדיום תרבית המשמש לאסטרוציטים אנושיים וכמרכיב של המדיום המעורב בתא העליון.
צלחת לתרבית תאיםServicebioCCD-100משמשת לתרבית תאים שגרתית ולהכנת ספרואידים של גידולים בשיטת הטיפה התלויה (hanging-drop).
קולגן סוג I (Collagen Type I)Corning354249משמש לציפוי כלי תרבית ואינסרטים לתרבית תאים לפני זריעת התאים.
זכוכית כיסוי (Coverslips)Citotest10212450Cמשמשות לסגירה ולהכנה למיקרוסקופיה.
תמיסת צביעה DAPIServicebioG1012-10MLמשמשת לצביעה נגדית של הגרעין במהלך צביעה אימונופלואורסצנטית.
DMEM בסיסי (1×)GibcoC11995500BTמשמש כמדיום בסיסי במבחן חדירות של FITC-dextran.
תוסף לצמיחת תאי אנדותל (ECGS)ScienCell1052תוסף המשמש לתרבית של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של המוח האנושי.
מדיום תאי אנדותל (ECM)ScienCell1001מדיום תרבית המשמש ל-HBMECs ולתא התחתון של מודל BBB/BTB.
סרום עגל 태טאי (FBS)GibcoA5669701תוסף סרום המשמש במדיות תרבית תאים מלאות.
Dextran מסומן ב-FITC (MW 4,000)BeyotimeST2930-50mgסמן פלואורסצנטי המשמש להערכת חדירות פארא-צלולית וחישוב Papp.
מדלל נוגדנים פלואורסצנטייםSolarbioA1840משמש לדילול נוגדנים משניים פלואורסצנטיים לצביעה אימונופלואורסצנטית.
חומצה אצטית גלציאליתSigma27225משמשת להכנת תמיסת הציפוי של קולגן סוג I.
HAHuman astrocyteNAמרכיב אסטרוציטרי להערכת תגובות מורפולוגיות ומסמנים הקשורים לגידול
HBMECHuman brain microvascular endothelial cellsNAמרכיב מחסום אנדותלי של BBB/BTB
HMC3-RFPRFP-labeled human microglial cell line HMC3NAמרכיב מיקרוגליאלי למעקב פלואורסצנטי
MatrigelCorning354230מטריצת ממבס השמשת כשכבה מפרידה בין ספרואידים של גידולים למדור תאי המחסום.
מדיום מלא MEM (עם NEAA) (10)Procell SystemPM150410Bמדיום המשמש כמרכיב של מדיום תרבית מעורב בתא העליון.
שקופיות מיקרוסקופCitotest188105משמשות לסגירת ממברנות צבועות שחולצו לצורך דימיון קונפוקאלי.
נוגדן עכבר anti-human GFAPEMD MilliporeMAB360-25μLנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי GFAP באסטרוציטים על ידי אימונופלואורסצנציה.
פראפורמלהידServicebioG1101-500MLמשמשת לקיבוע תאים לפני צביעה אימונופלואורסצנטית.
אבקת PBS (סליין עם בופר פוספט)ServicebioG0002-2Lמשמשת לשטיפה, השוואה ושלבי הכנה לאורך הפרוטוקול.
תמיסת פניצילין-סטרפטומייסין (P/S)ServicebioG4003-100MLתוסף אנטיביוטי המשמש במדיות תרבית תאים מלאות.
פיפטהEppendorf3123000250משמשת לטיפול בנוזלים לאורך תרבית התאים והנהלי המבחן.
טיפים לפיפטהMWM Bio800201משמשים לטיפול שגרתי בנוזלים; טיפים עם קצה קטוע (cut-off) משמשים להעברת ספרואידים של גידולים.
נוגדן פוליקלונלי שפנפן anti-human PAN-CKMedChemExpressHY-P81164נוגדן ראשוני המשמש לזיהוי תאי גידול על ידי אימונופלואורסצנציה.
נוגדן שפנפן anti-human ZO-1Proteintech21773-1-APנוגדן ראשוני המשמש להערכת ארגון צומת הדסקים (tight-junction) אנדותלי על ידי אימונופלואורסצנציה.
SK-BR-3Human breast cancer cell lineNAמרכיב ספרואיד של גידול לבניית BTB
אינסרט לפלטת תרבית רקמה (0.4 μm, ממברנת PET), פלטות 12 בארותJet BiofilTCS016012אינסרט נקבובי לתרבית תאים המשמש לבניית מודל co-culture של BBB/BTB.
מד התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית (TEER)MillicellERS-2משמש למדידת התנגדות חשמלית דרך אינסרט תרבית התאים כמדד לשלמות המחסום.
TrypLE Express (1×) (לניתוק תאי HBMECs ו-HA)Gibco12605-010משמש לניתוק תאי HBMECs ותאי HA במהלך הכנת התאים.

מקורות

  1. Park M, et al. Breast cancer metastasis: mechanisms and therapeutic implications. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6806. doi:10.3390/ijms23126806.
  2. Wang R, et al. The clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 2019;19(1):1091. doi:10.1186/s12885-019-6311-z.
  3. McConnell HL, Mishra A. Cells of the blood-brain barrier: an overview of the neurovascular unit in health and disease. Methods Mol Biol. 2022;2492:3–24.
  4. Dong X. Current strategies for brain drug delivery. Theranostics. 2018;8(6):1481–1493.
  5. Gril B, et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nat Commun. 2018;9(1):2705. doi:10.1038/s41467-018-05030-w.
  6. Pitz MW, Desai A, Grossman SA, Blakeley JO. Tissue concentration of systemically administered antineoplastic agents in human brain tumors. J Neurooncol. 2011;104(3):629–638.
  7. Adkins CE, et al. Characterization of passive permeability at the blood-tumor barrier in five preclinical models of brain metastases of breast cancer. Clin Exp Metastasis. 2016;33(4):373–383.
  8. Lockman PR, et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin Cancer Res. 2010;16(23):5664–5678.
  9. Song H-T, et al. Rat model of metastatic breast cancer monitored by MRI at 3 tesla and bioluminescence imaging with histological correlation. J Transl Med. 2009;7:88. doi:10.1186/1479-5876-7-88.
  10. Miarka L, Valiente M. Animal models of brain metastasis. Neurooncol Adv. 2021;3(Suppl 5):v144–v156.
  11. Kim J-H, et al. Inflammatory mammary carcinoma with metastasis to the brain and distant organs in a spayed Shih Tzu dog. J Vet Diagn Invest. 2011;23(5):1079–1082.
  12. Wiese DA, Thaiwong T, Yuzbasiyan-Gurkan V, Kiupel M. Feline mammary basal-like adenocarcinomas: a potential model for human triple-negative breast cancer (TNBC) with basal-like subtype. BMC Cancer. 2013;13:403. doi:10.1186/1471-2407-13-403.
  13. Srinivasan B, et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 2015;20(2):107–126.
  14. Harding IC, et al. Developing a transwell millifluidic device for studying blood-brain barrier endothelium. Lab Chip. 2022;22(23):4603–4620.
  15. Liu X, et al. The role of neurovascular unit damage in the occurrence and development of Alzheimer’s disease. Rev Neurosci. 2019;30(5):477–484.
  16. Nikolakopoulou AM, et al. Pericyte loss leads to circulatory failure and pleiotrophin depletion causing neuron loss. Nat Neurosci. 2019;22(7):1089–1098.
  17. Bell RD, et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 2010;68(3):409–427.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

גרורות סרטן השדמודל in vitroתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של המוחשיתוף-תרבית של אסטרוציטיםתאי מיקרוגליהספרואידים של גידולשיטת טיפת התלייהחדירות פאראצלולרית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.